蛋白激酶和/或磷酸酶活性的基于SERS的单步实时检测

申请号 CN200880127723.0 申请日 2008-12-23 公开(公告)号 CN101970996A 公开(公告)日 2011-02-09
申请人 加利福尼亚大学董事会; 发明人 陈帆青; 刘刚; 乔纳森·A·埃尔曼;
摘要 本 发明 提供用于检测和/或定量一种或多种激酶和/或 磷酸 酶的存在和/或活性的新型组合物和方法。在一些实施方式中,本发明提供用于检测激酶和/或磷酸酶活性的器件,其中所述器件包括包含增强 拉曼散射 的特征的拉曼活性表面,所述表面连接有多种激酶和/或磷酸酶底物分子。
权利要求

1.检测激酶和/或磷酸酶活性的器件,所述器件包括:
拉曼活性表面,其包括增强拉曼散射的特征;
所述表面连接有至少一种激酶和/或磷酸酶底物分子。
2.权利要求1的器件,其中所述表面连接有多种激酶和/或磷酸酶底物分子。
3.权利要求2的器件,其中所述激酶底物分子选自小分子、脂质和肽。
4.权利要求2的器件,其中所述磷酸酶底物分子选自磷酸化的小分子、磷酸化的脂质和磷酸化的肽。
5.权利要求3的器件,其中所述激酶底物分子选自核苷酸、糖、多糖、聚合物和脂质。
6.权利要求3的器件,其中所述磷酸酶底物分子选自磷酸化的核苷酸、磷酸化的糖、磷酸化的多糖、磷酸化的聚合物和磷酸化的脂质。
7.权利要求2的器件,其中所述激酶和/或磷酸酶底物分子为肽。
8.权利要求7的器件,其中所述肽为用于选自如下的激酶的底物:丝酸激酶、苏氨酸激酶、组氨酸激酶和酪氨酸激酶。
9.权利要求7的器件,其中所述肽为用于Src酪氨酸激酶的底物。
10.权利要求2的器件,其中所述多种肽包括至少5种不同的肽。
11.权利要求2的器件,其中所述多种肽包括至少10种不同的肽。
12.权利要求2的器件,其中所述多种肽包括至少100种不同的肽。
13.权利要求2的器件,其中所述肽的长度为约5~约50个氨基酸。
14.权利要求10的器件,其中所述肽定位使得来自每种肽的信号能够与来自其它种类肽的信号区别。
15.权利要求2的器件,其中所述增强拉曼散射的特征包括选自纳米级锥体、纳米级点、纳米级纤维纳米管、纳米、纳米空穴、纳米蝶形结、纳米碗、纳米月牙状物和纳米夹饼的多重纳米级特征。
16.权利要求2的器件,其中所述增强拉曼散射的特征包括选自金属、基于的材料、聚合物、石英材料、液晶材料、金属化物材料、盐晶和半导体材料的材料。
17.权利要求2的器件,其中所述增强拉曼散射的特征包括选自贵金属、贵金属合金、贵金属复合物的材料。
18.权利要求2的器件,其中所述增强拉曼散射的特征包括选自金、金合金、、银合金、铜合金、铂、铂合金、CdSe半导体、CdS半导体、覆盖有ZnS的CdSe、磁性胶体材料、ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs的材料。
19.权利要求2的器件,其中所述增强拉曼散射的特征包括金和/或银。
20.权利要求2的器件,其中所述特征的中心距为约25nm~约0.5μm。
21.权利要求2的器件,其中所述特征的中心距为约75~约150nm。
22.权利要求2的器件,其中所述增强拉曼散射的特征具有约10nm~约200nm的尺寸。
23.权利要求2的器件,其中所述增强拉曼散射的特征具有约25nm~约150nm的尺寸。
24.权利要求1的器件,其中所述拉曼活性表面构成微流体室或者设置在微流体室中。
25.权利要求1的器件,其中所述表面连接有多种激酶和/或磷酸酶底物分子。
26.权利要求25的器件,其中所述多种激酶和/或磷酸酶底物分子包括至少5个种类。
27.权利要求25的器件,其中所述多种激酶和/或磷酸酶底物分子包括至少10个种
类。
28.权利要求24的器件,其中所述室的容积小于约1μL。
29.权利要求1的器件,其中:
所述拉曼活性表面包括金纳米锥体;
所述激酶底物分子包括多种蛋白激酶和/或磷酸酶底物;和
所述拉曼活性表面构成微流体室或者设置在微流体室中。
30.检测和/或定量样品中激酶和/或磷酸酶活性的方法,所述方法包括:
使所述样品与包括激酶和/或磷酸酶底物序列的分子接触;和
通过检测所述肽的拉曼散射光谱的变化检测所述分子的磷酸化或脱磷酸化。
31.权利要求30的方法,其中所述激酶底物分子选自小分子、脂质和肽。
32.权利要求30的方法,其中所述磷酸酶底物分子选自磷酸化的小分子、磷酸化的脂质和磷酸化的肽。
33.权利要求30的方法,其中所述激酶底物分子选自核苷酸、糖、多糖、聚合物和脂质。
34.权利要求30的方法,其中所述磷酸酶底物分子选自磷酸化的核苷酸、磷酸化的糖、磷酸化的多糖、磷酸化的聚合物和磷酸化的脂质。
35.权利要求30的方法,其中所述激酶底物分子为肽。
36.权利要求30的方法,其中所述激酶底物分子为用于选自如下的激酶的底物:丝氨酸激酶、苏氨酸激酶、组氨酸激酶和酪氨酸激酶。
37.权利要求35的方法,其中所述激酶底物为用于SRC酪氨酸激酶的肽底物。
38.权利要求30的方法,其中所述激酶底物分子连接到包括增强拉曼散射的特征的拉曼活性表面。
39.权利要求38的方法,其中所述表面连接有多种激酶和/或磷酸酶底物分子。
40.权利要求39的方法,其中所述多种激酶和/或磷酸酶底物分子包括至少5个种类。
41.权利要求39的方法,其中所述多种激酶和/或磷酸酶底物分子包括至少10个种
类。
42.权利要求39的方法,其中所述多种激酶和/或磷酸酶底物分子包括至少100个种类。
43.权利要求39的方法,其中所述激酶和/或磷酸酶底物分子定位使得来自每种激酶和/或磷酸酶底物的信号能够与来自其它激酶底物的信号区别。
44.权利要求2的方法,其中所述增强拉曼散射的特征包括选自纳米级锥体、纳米级点、纳米级纤维、纳米管、纳米角、纳米空穴、纳米蝶形结、纳米碗、纳米月牙状物和纳米夹饼的多重纳米级特征。
45.权利要求38的方法,其中所述增强拉曼散射的特征包括金属或半导体材料。
46.权利要求38的方法,其中所述增强拉曼散射的特征包括选自贵金属、贵金属合金、贵金属复合物的材料。
47.权利要求38的方法,其中所述增强拉曼散射的特征包括选自金、金合金、银、银合金、铜、铜合金、铂、铂合金、CdSe半导体、CdS半导体、覆盖有ZnS的CdSe、磁性胶体材料、ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs的材料。
48.权利要求38的方法,其中所述增强拉曼散射的特征包括金和/或银。
49.权利要求38的方法,其中所述特征的中心距为约25~约500nm。
50.权利要求38的方法,其中所述特征的中心距为约25nm~约150nm。
51.权利要求38的方法,其中所述增强拉曼散射的特征具有约20nm~约200nm的尺
寸。
52.权利要求38的方法,其中所述增强拉曼散射的特征具有约75nm~约150nm的尺
寸。
53.权利要求38的方法,其中所述拉曼活性表面构成微流体室或设置在微流体室中。
54.权利要求38的方法,其中所述室的容积小于约1μL。
55.权利要求38的方法,其中:
所述拉曼活性表面包括金纳米锥体;
所述激酶底物分子包括多种酪氨酸激酶底物;和
所述拉曼活性表面构成微流体室或设置在微流体室中。
56.在一个或多个样品中检测激酶和/或磷酸酶活性的系统,所述系统包括:
权利要求1~29中任一项的器件;和
设置为测量所述器件的一个或多个区域的表面增强拉曼光谱的拉曼检测探针。
57.权利要求56的系统,其中器件和/或所述拉曼检测探针设置在定位器中。
58.权利要求61的系统,其中所述器件设置在x-y扫描样品台上。
59.权利要求61的系统,其中所述拉曼检测探针包括激光传送纤维、物镜、长通滤光器和拉曼散射光收集纤维。
60.权利要求56的系统,其中所述系统还包括:控制数据采集位置的控制计算机。
61.筛选用于激酶和/或磷酸酶活性调节剂的样品的方法,所述方法包括:
使权利要求1~29中任一项的器件与含有一种或多种测试试剂的测试样品接触;
当所述激酶和/或磷酸酶底物磷酸化或脱磷酸化时进行SERS测量以检测拉曼散射光谱的变化,其中拉曼光谱变化的抑制表明测试试剂是激酶或磷酸酶活性的抑制剂
62.权利要求57的方法,其中所述测试样品包括测试试剂库。
63.权利要求62的方法,其中所述测试样品包括含有至少50种不同测试试剂的测试试剂库。
64.制备用于检测激酶和/或磷酸酶活性的表面的方法,所述方法包括:
将激酶和/或磷酸酶底物分子的阵列沉积在第一表面上;
使所述激酶和/或磷酸酶底物分子的阵列与包括多个增强拉曼散射的特征的SERS表面接触,其中所述接触是在将所述激酶和/或磷酸酶底物分子从所述第一表面转移到所述SERS表面以形成用于检测激酶和/或磷酸酶活性的表面的条件下。
65.权利要求64的方法,其中所述激酶和/或磷酸酶底物分子带有官能团或者具有官能团的连接物,其与SERS表面反应以形成共价连接。
66.权利要求64的方法,其中所述SERS表面在软平版印刷基底上形成。
67.权利要求66的方法,其中所述软平版印刷基底包括PDMS芯片。
68.权利要求64的方法,还包括将所述SERs表面设置在微流体结构中或者将所述
SERs表面附着到微流体结构上以形成邻近该SERS表面的孔。
69.权利要求72的方法,其中所述孔具有1μL或更低的容积。
70.权利要求64的方法,其中所述激酶和/或磷酸酶底物分子的阵列包括约20~约
500nm的在点之间的间隔。
71.权利要求64的方法,其中形成所述激酶和/或磷酸酶底物分子的阵列的点具有约
20~约500nm的特征尺寸。
72.权利要求64的方法,其中所述阵列包括至少5种不同的激酶底物分子。
73.权利要求64的方法,其中所述激酶底物分子选自小分子、脂质和肽。
74.权利要求64的方法,其中所述磷酸酶底物分子选自磷酸化的小分子、磷酸化的脂质和磷酸化的肽。
75.权利要求64的方法,其中所述激酶底物分子选自核苷酸、糖、多糖、聚合物和脂质。
76.权利要求64的方法,其中所述磷酸酶底物分子选自磷酸化的核苷酸、磷酸化的糖、磷酸化的多糖、磷酸化的聚合物和磷酸化的脂质。
77.权利要求64的方法,其中所述激酶和/或磷酸酶底物分子为肽。
78.权利要求64的方法,其中激酶底物为用于选自如下的激酶的肽底物:丝氨酸激酶、苏氨酸激酶、组氨酸激酶和酪氨酸激酶。
79.权利要求77的方法,其中所述肽为用于Src酪氨酸激酶的底物。
80.权利要求77的方法,其中所述肽的长度为约5~约50个氨基酸。
81.权利要求77的方法,其中所述肽定位使得来自每种肽的信号能够与来自其它种类肽的信号区别。
82.权利要求64的方法,其中所述增强拉曼散射的特征包括选自纳米级锥体、纳米级点、纳米级纤维、纳米管、纳米角、纳米空穴、纳米蝶形结、纳米碗、纳米月牙状物和纳米夹饼的多重纳米级特征。
83.权利要求64的方法,其中所述增强拉曼散射的特征包括金属或半导体材料。
84.权利要求64的方法,其中所述增强拉曼散射的特征包括选自贵金属、贵金属合金、贵金属复合物的材料。
85.权利要求64的方法,其中所述增强拉曼散射的特征包括选自金、金合金、银、银合金、铜、铜合金、铂、铂合金、CdSe半导体、CdS半导体、覆盖有ZnS的CdSe、磁性胶体材料、ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs的材料。
86.权利要求64的方法,其中所述增强拉曼散射的特征包括金和/或银。
87.权利要求642的方法,其中所述特征的中心距为约25nm~约400nm。
88.权利要求64的方法,其中所述特征的中心距为约75nm~约150nm。
89.权利要求64的方法,其中所述增强拉曼散射的特征具有约20nm~约200nm的尺
寸。
90.权利要求64的方法,其中所述增强拉曼散射的特征具有约75nm~约150nm的尺
寸。
91.制造纳米锥体表面的方法,所述方法包括:
提供能照相平版印刷的表面;
使所述表面与第一等离子体接触以产生纳米级氧化物岛阵列;
蚀刻所述表面以形成纳米柱阵列;
除去在构成所述纳米柱阵列的所述纳米柱上的氧化物层;
蚀刻所述纳米柱阵列以形成纳米锥体阵列。
92.权利要求91的方法,其中所述方法还包括使所述纳米锥体阵列金属化
93.权利要求91的方法,其中所述能照相平版印刷的表面包括或锗表面。
94.权利要求91的方法,其中所述能照相平版印刷的表面包括选自ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs的材料。
95.权利要求91的方法,其中所述第一等离子体包括HBr和O2的混合物。
96.权利要求91的方法,其中所述蚀刻所述表面以形成纳米柱阵列包括通过HBr等离子体进行蚀刻。
97.权利要求91的方法,其中所述氧化物岛层通过SF6等离子体蚀刻除去。
98.权利要求91的方法,其中所述蚀刻所述纳米柱阵列以形成纳米锥体阵列包括通过HBr等离子体进行蚀刻。
99.权利要求93的方法,其中所述金属化包括将金属层沉积在所述纳米锥体阵列上,其中所述金属包括选自贵金属、贵金属合金和贵金属复合物的金属。
100.权利要求93的方法,其中所述金属化包括将金属层沉积在所述纳米锥体阵列上,其中所述金属包括选自金、金合金、银、银合金、铜、铜合金、铂、铂合金、CdSe半导体、CdS半导体、覆盖有ZnS的CdSe、磁性胶体材料、ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs的材料。
101.纳米锥体阵列,所述阵列包括其上具有多个纳米锥体的表面,其中所述纳米锥体具有平均小于约100nm的特征尺寸和小于约500nm的平均特征间间隔。
102.权利要求101的纳米锥体阵列,其中所述纳米锥体具有平均小于约50nm的特征尺寸和小于约100nm的平均特征间间隔。
103.权利要求101的纳米锥体阵列,其中所述表面包括选自贵金属、贵金属合金和贵金属复合物的金属。
104.权利要求101的纳米锥体阵列,其中所述表面包括选自金、金合金、银、银合金、铜、铜合金、铂、铂合金、CdSe半导体、CdS半导体、覆盖有ZnS的CdSe、磁性胶体材料、ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs的材料。

说明书全文

蛋白激酶和/或磷酸酶活性的基于SERS的单步实时检测

[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2007年12月31日提交的USSN 61/018,286和2008年1月18日提交的USSN 61/022,115的优先权和权益,为此将这两者的全部内容引入本文作为参考。
[0003] 对于在联邦政府支持的研究和开发下进行的发明的权利的声明
[0004] 本工作部分受到来自美国能源部的Grant No:DE-AC02-05CH11231的支持。美国政府在本申请中具有一定的权利。

技术领域

[0005] 本发明涉及诊断和筛选器件领域。具体地说,在一些实施方式中,本发明提供激酶和/或磷酸酶检测系统,其包括与包含增强拉曼光谱信号纳米级特征的表面连接的一种或多种激酶和/或磷酸酶底物。

背景技术

[0006] 将磷酸根基团(磷酸基团,phosphate group)添加到蛋白或从蛋白除去对于真核细胞内信号的传输来说是重要的,因此,蛋白磷酸化和脱磷酸化(去磷酸化)调节许多不同的细胞过程。正常细胞生长以由协调的细胞内信号的复合组构成的紧密调节的信号转导通路为特征,所述信号调整或改变细胞活性(例如生长、增殖、凋亡等)。相反,瘤(neoplasms)以去调节的(deregulated)细胞生长为特征。此外,恶性瘤具有侵入正常的组织以及转移到远离原始瘤的身体部位并且在所述身体部位处生长的能。认为在许多癌细胞中观察到的去调节的细胞生长的病因学涉及在控制细胞生长、分裂、分化和凋亡的信号通路中的异常变化。
[0007] 在瘤形成的许多方面蛋白激酶和/或磷酸酶已经作为重要的细胞调节蛋白出现。在导致正常细胞信号通路中断的初始事件中经常发生在蛋白激酶和/或磷酸酶介导的信号过程中的遗传突变。蛋白激酶是将磷酸根基团共价地连接到在蛋白中发现的典型地酪酸、丝氨酸或苏氨酸残基的侧链的酶,而磷酸酶是除去这种磷酸根基团的酶。磷酸化改变重要的信号蛋白的活性。通过控制这些蛋白的活性,激酶和/或磷酸酶控制大部分细胞过程,包括但不限于代谢、转录、细胞周期进展、细胞骨架重组、细胞运动、凋亡和分化。
[0008] 随着人类基因组序列的完成,估计有在基因组中编码的大约500种蛋白激酶(Manning等(2002)Science 298:19 12-1934;Daucey and Sausville(2003)Nature Rev.Drug Discov.2:296-313)。这占所有人类基因的约1.7%(Manning等(2002)Science 298:
19 12-1934)。30种已知肿瘤抑制基因中的大部分和超过100种显性癌基因是蛋白激酶
(Futreal等(2001)Nature 409:850-852)。这种类型基因中的体细胞突变在大量的人类癌症中起作用。因此,蛋白激酶提供了干预癌症的潜在药物目标的丰富来源。
[0009] 虽然激酶/磷酸酶蛋白家族代表新型药物目标的丰富来源,但是用于确定化合物亲和性的发展中的分析是非常有问题的。目前用于蛋白激酶和/或磷酸酶调节剂(例如,抑制剂或激动剂)的高通量筛选分析测量蛋白或肽底物的磷酸酯(磷酸根)的引入或者损32 33
失。大部分建立的用于分析蛋白激酶/磷酸酶调节剂的方法是放射分析,其中用 P或 P标记ATP的γ磷酸酯(磷酸根)。当在磷转移酶反应期间激酶将γ磷酸酯(磷酸根)转
移到蛋白底物的羟基时,该蛋白变成用同位素共价地标记。相反地,当磷酸酶除去标记的磷酸酯(磷酸根)时,该蛋白失去同位素标记。从标记的ATP除去该蛋白并且确定放射性蛋白的量。由于劳动密集的分离步骤和使用的大量放射性,这种分析在高通量形式中的适应是有问题的。
[0010] 能够较高通量的供选择的放射分析是SPA或闪烁迫近分析。在这种分析中,当标记的底物与浸渍有闪烁剂的珠子结合时该珠子发光。这种分析受到放射性平和肽底物效率的限制。
[0011] 大部分非放射性分析使用识别激酶反应产物即磷酸肽的抗体。结合分析使用用酶催化发光读出器检测的抗体。这些方法受到试剂可用性、孔涂布以及多个清洗和培育步骤的限制。

发明内容

[0012] 在一些实施方式中,本发明涉及用于检测和/或定量样品中一种或多种激酶和/或磷酸酶的存在和/或活性的筛选系统。在一些实施方式中,所述系统包括对连接到增强拉曼光谱学中的信号的底物的目标激酶和/或磷酸酶具有高特异性的激酶和/或磷酸酶底物。在一些实施方式中,所述底物是包括增强SERS测量中的信号的纳米级特征的底物。
[0013] 因此,在一些实施方式中,提供用于检测激酶和/或磷酸酶活性的器件。该器件典型地包括拉曼活性表面,该拉曼活性表面包括增强拉曼散射的特征,其中所述表面连接有至少一种激酶和/或磷酸酶底物分子。在一些实施方式中,所述表面连接有多种激酶底物(例如,小分子、脂质、肽等)和/或磷酸酶底物分子(例如,磷酸化的小分子、磷酸化的脂质、磷酸化的肽等)。在一些实施方式中,所述激酶底物分子包括,但不限于,核苷酸、糖、多糖、聚合物和脂质,而所述磷酸酶底物分子包括,但不限于,磷酸化的核苷酸、磷酸化的糖、磷酸化的多糖、磷酸化的聚合物和磷酸化的脂质。在一些实施方式中,所述激酶底物包括用于丝氨酸激酶、苏氨酸激酶、组氨酸激酶、和/或酪氨酸激酶的肽底物。在一些实施方式中,所述底物是用于Src酪氨酸激酶的肽底物。在各种实施方式中,所述多种肽包括至少3种,优选至少约5种,更优选至少约10、100、500、1000、2000或5000种不同的肽。在一些实施方式中,所述肽的长度为约5~约50个氨基酸。在一些实施方式中,所述肽可定位使得来自每种肽的信号能够与来自其它种类肽的信号区别。在各种实施方式中,增强拉曼散射的特征包括选自纳米级锥体、纳米级点、纳米级纤维纳米管、纳米、纳米空穴、纳米蝶形结(弓形交叉,bowtie)、纳米碗、纳米月牙状物和纳米夹饼(nanoburger)的多种(多重)纳米级特征。在一些实施方式中,增强拉曼散射的特征包括选自金属、基于的材料、聚合物、石英材料、液晶材料、金属化物材料、盐晶和半导体材料的材料。在一些实施方式中,增强拉曼散射的特征包括选自贵金属、贵金属合金、贵金属复合物的材料。在一些实施方式中,增强拉曼散射的特征包括选自金、金合金、、银合金、铜合金、铂、铂合金、CdSe半导体、CdS半导体、覆盖有ZnS的CdSe、磁性胶体材料、ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs的材料。在一些实施方式中,所述特征的中心距为约25nm、50nm或50nm到约0.5μm、300nm、200nm或150nm。在一些实施方式中,增强拉曼散射的特征具有约10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、40nm或50nm到约200nm、150nm、100nm或75nm的尺寸。在各种实施方式中,所述表面连接有多种激酶和/或磷酸酶底物分子(例如,至少2种,优选至少5或10种,更优选至少20、50或100种不同的种类)。在一些实施方式中,所述器件包括包含金纳米锥体的拉曼活性表面;所述激酶底物分子包括多种蛋白激酶和/或磷酸酶底物;和所述拉曼活性表面构成(包括,comprises)微流体室或者设置在微流体室中。
[0014] 还提供检测和/或定量样品中激酶或磷酸酶活性的方法。所述方法典型地包括:使所述样品与包括激酶和/或磷酸酶底物序列的分子接触;和通过检测所述肽的拉曼散射光谱的变化检测所述分子的磷酸化。在一些实施方式中,所述表面连接有多种激酶底物(例如,小分子、脂质、肽等)和/或磷酸酶底物分子(例如,磷酸化的小分子、磷酸化的脂质、磷酸化的肽等)。在一些实施方式中,所述激酶底物分子包括,但不限于,核苷酸、糖、多糖、聚合物和脂质,而磷酸酶底物分子包括,但不限于,磷酸化的核苷酸、磷酸化的糖、磷酸化的多糖、磷酸化的聚合物和磷酸化的脂质。在一些实施方式中,所述激酶底物包括用于丝氨酸激酶、苏氨酸激酶、组氨酸激酶和/或酪氨酸激酶的肽底物。在一些实施方式中,所述底物是用于Src酪氨酸激酶的肽底物。在各种实施方式中,所述多种肽包括至少3种,优选至少约5种,更优选至少约10、100、500、1000、2000或5000种不同的肽。在一些实施方式中,所述肽的长度为约5~约50个氨基酸。在一些实施方式中,所述肽可定位使得来自每种肽的信号能够与来自其它种类肽的信号区别。在各种实施方式中,增强拉曼散射的特征包括选自纳米级锥体、纳米级点、纳米级纤维、纳米管、纳米角、纳米空穴、纳米蝶形结、纳米碗、纳米月牙状物和纳米夹饼的多种纳米级特征。在一些实施方式中,增强拉曼散射的特征包括选自金属、基于碳的材料、聚合物、石英材料、液晶材料、金属氧化物材料、盐晶和半导体材料的材料。在一些实施方式中,增强拉曼散射的特征包括选自贵金属、贵金属合金、贵金属复合物的材料。在一些实施方式中,增强拉曼散射的特征包括选自金、金合金、银、银合金、铜、铜合金、铂、铂合金、CdSe半导体、CdS半导体、覆盖有ZnS的CdSe、磁性胶体材料、ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs的材料。在一些实施方式中,所述特征的中心距为约25nm、50nm或50nm到约0.5μm、
300nm、200nm或150nm。在一些实施方式中,增强拉曼散射的特征具有约10nm、15nm、20nm、
25nm、30nm、40nm或50nm到约200nm、150nm、100nm或75nm的尺寸。在各种实施方式中,所述表面连接有多种激酶和/或磷酸酶底物分子(例如,至少2种,优选至少5或10种,更优选至少20、50或100种不同的种类)。在一些实施方式中,所述器件包括包含金纳米锥体的拉曼活性表面;所述激酶底物分子包括多种蛋白激酶和/或磷酸酶底物;和所述拉曼活性表面构成微流体室或者设置在微流体室中。
[0015] 还提供用于检测在一个或多个样品中激酶和/或磷酸酶活性的系统。在各种实施方式中,所述系统包括:如本文所述的用于检测激酶和/或磷酸酶活性的器件(例如,包括增强拉曼散射的特征的拉曼活性表面,其中所述表面连接有至少一种激酶和/或磷酸酶底物分子);和设置以测量该器件的一个或多个区域的表面增强拉曼光谱的拉曼检测探针。在一些实施方式中,所述器件和/或拉曼检测探针设置在定位器(位置控制器)中。在一些实施方式中,所述器件设置在x-y扫描样品台上。在一些实施方式中,所述拉曼检测探针包括激光传送纤维、物镜、长通滤光器和拉曼散射光收集纤维。在各种实施方式中,所述系统可进一步包括控制数据采集位置的控制计算机。
[0016] 在一些实施方式中,提供筛选用于激酶和/或磷酸酶活性的调节剂的样品的方法。所述方法典型地包括:接触本文所述的用于检测激酶和/或磷酸酶活性的器件(例如,包括增强拉曼散射的特征的拉曼活性表面,其中所述表面连接有至少一种激酶和/或磷酸酶底物分子);当所述激酶和/或磷酸酶底物进行磷酸化或脱磷酸化时进行SERS测量以检测拉曼散射光谱的变化,其中拉曼光谱变化的抑制表明测试试剂是激酶和/或磷酸酶活性的抑制剂。在一些实施方式中,所述测试样品包括测试试剂库。在一些实施方式中,所述测试样品包括包含至少10种或至少20种,优选至少50种或至少100种,更优选至少200种、300种、400种或500种,且最优选至少1000种或至少5000种不同的测试试剂的测试试剂库。
[0017] 在各种实施方式中,提供制备用于检测激酶和/或磷酸酶活性的表面的方法,所述方法包括:将激酶和/或磷酸酶底物分子阵列沉积在第一表面上;使所述激酶和/或磷酸酶底物分子阵列与包括多个增强拉曼散射的特征的SERS表面接触,其中所述接触是在将所述激酶和/或磷酸酶底物分子从所述第一表面转移到所述SERS表面以形成用于检测激酶和/或磷酸酶活性的表面的条件下。在一些实施方式中,所述激酶和/或磷酸酶底物分子带有官能团或者具有官能团的连接物,其与SERS表面反应以形成共价连接。在一些实施方式中,在软平版印刷基底(例如,PDMS芯片)上形成SERS表面。在一些实施方式中,所述方法还包括将所述SERS表面设置在微流体结构中或者将所述SERS表面附着到微流体结构上以形成邻近该SERS表面的孔。在一些实施方式中,所述孔具有1μL或更低,或者
0.5μL或更低,或者0.25μL或更低的容积。在一些实施方式中,所述激酶和/或磷酸酶底物分子阵列包括约20~约500nm的点之间的间隔。在一些实施方式中,形成所述激酶和/或磷酸酶底物分子阵列的点具有约20~约500nm的特征尺寸。在一些实施方式中,所述阵列包括至少3种,优选至少约5种,更优选至少约10、20、30、40或50种,和最优选至少100、
500、1,000、2,000或5,000种不同的底物。在一些实施方式中,所述激酶底物分子选自小分子、脂质和肽。在一些实施方式中,所述磷酸酶底物分子选自磷酸化的小分子、磷酸化的脂质和磷酸化的肽。在一些实施方式中,所述激酶底物分子选自核苷酸、糖、多糖、聚合物和脂质。在一些实施方式中,所述磷酸酶底物分子选自磷酸化的核苷酸、磷酸化的糖、磷酸化的多糖、磷酸化的聚合物和磷酸化的脂质。在一些实施方式中,所述激酶和/或磷酸酶底物分子为肽。在一些实施方式中,所述激酶底物包括用于丝氨酸激酶、苏氨酸激酶、组氨酸激酶和/或酪氨酸激酶的肽底物。在一些实施方式中,所述底物是用于Src酪氨酸激酶的肽底物。在一些实施方式中,所述肽的长度为约5~约50个氨基酸。在一些实施方式中,所述肽可定位使得来自每种肽的信号能够与来自其它种类肽的信号区别。在各种实施方式中,增强拉曼散射的特征包括选自纳米级锥体、纳米级点、纳米级纤维、纳米管、纳米角、纳米空穴、纳米蝶形结、纳米碗、纳米月牙状物和纳米夹饼的多种纳米级特征。在一些实施方式中,增强拉曼散射的特征包括选自金属、基于碳的材料、聚合物、石英材料、液晶材料、金属氧化物材料、盐晶和半导体材料的材料。在一些实施方式中,增强拉曼散射的特征包括选自贵金属、贵金属合金和贵金属复合物的材料。在一些实施方式中,增强拉曼散射的特征包括选自金、金合金、银、银合金、铜、铜合金、铂、铂合金、CdSe半导体、CdS半导体、覆盖有ZnS的CdSe、磁性胶体材料、ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs的材料。在一些实施方式中,所述特征的中心距为约25nm、50nm或50nm到约0.5μm、300nm、200nm或150nm。在一些实施方式中,增强拉曼散射的特征具有约10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、40nm或50nm到约200nm、150nm、100nm或75nm的尺寸。
[0018] 还提供用于制造纳米锥体表面的方法。所述方法典型地包括:提供能照相平版印刷(能光刻)的表面;使所述表面与第一等离子体接触以产生纳米级氧化物岛阵列;蚀刻所述表面以形成纳米柱阵列;除去在构成所述纳米柱阵列的纳米柱上的氧化物层;和蚀刻所述纳米柱阵列以形成纳米锥体阵列。在一些实施方式中,所述方法还包括使所述纳米锥体阵列金属化。在一些实施方式中,所述能照相平版印刷的表面包括或锗表面。在一些实施方式中,所述能照相平版印刷的表面包括选自ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs的材料。在一些实施方式中,所述第一等离子体包括HBr和O2的混合物。在一些实施方式中,蚀刻所述表面以形成纳米柱阵列包括通过HBr等离子体进行蚀刻。在一些实施方式中,所述氧化物岛层通过SF6等离子体蚀刻除去。在一些实施方式中,蚀刻所述纳米柱阵列以形成纳米锥体阵列包括通过HBr等离子体进行蚀刻。在一些实施方式中,所述金属化包括将金属层沉积在所述纳米锥体阵列上,其中所述金属包括选自贵金属、贵金属合金和贵金属复合物的金属。在一些实施方式中,所述金属化包括将金属层沉积在所述纳米锥体阵列上,其中所述金属包括选自金、金合金、银、银合金、铜、铜合金、铂、铂合金、CdSe半导体、CdS半导体、覆盖有ZnS的CdSe、磁性胶体材料、ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs的材料。
[0019] 还提供纳米锥体阵列。所述纳米锥体阵列可用于产生拉曼活性表面。在各种实施方式中,所述阵列包括其上具有多个纳米锥体的表面,其中所述纳米锥体具有平均小于约100nm的特征尺寸和小于约500nm的平均特征间间隔。在各种实施方式中,所述纳米锥体具有平均小于约50nm的特征尺寸和小于约100nm的平均特征间间隔。在一些实施方式中,所述表面包括选自贵金属、贵金属合金和贵金属复合物的金属。在一些实施方式中,所述表面包括选自金、金合金、银、银合金、铜、铜合金、铂、铂合金、CdSe半导体、CdS半导体、覆盖有ZnS的CdSe、磁性胶体材料、ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs的材料。
[0020] 定义
[0021] “激酶”是催化磷酸根基团(例如,从ATP或其它分子)转移到目标分子如肽或其它激酶底物的分子。
[0022] “激酶底物”是指可通过激酶进行磷酸化或者在一些情况下进行脱磷酸化的分子。
[0023] “磷酸酶”是催化磷酸根基团从目标分子如肽或其它磷酸酶底物转移从而导致该底物的部分或完全脱磷酸化的分子。
[0024] “磷酸酶底物”是指可以通过磷酸酶进行部分或完全脱磷酸化的分子。
[0025] “阵列”是指在固体载体(例如,表面)上不同种类分子的集合。在一些实施方式中,不同种类的分子位于载体的不同区域,即它们是空间定址的。
[0026] 术语“阵列特征”是指主要包括单种分子的阵列的基本上邻接的域(例如,阵列上的点)。
[0027] “拉曼活性底物”是指适合用于表面增强拉曼光谱学(SERs)的底物。在一些实施方式中,所述拉曼活性底物包括增强拉曼散射信号的纳米级特征。
[0028] 关于激酶底物阵列使用的术语“多种激酶底物”表示所述阵列含有在不同位置的至少两种不同的激酶底物(例如,不同的肽)。类似的“多种磷酸酶底物”表示所述阵列含有在不同位置的至少两种不同的磷酸酶底物(例如,不同的肽)。在一些实施方式中,底物可为激酶和磷酸酶底物两者。附图说明
[0029] 图1A-1D说明通过激酶(例如SRC)的蛋白磷酸化(例如,酪氨酸磷酸化)的检测图解。图1A:说明用于Src激酶(SEQ ID NO:1)的底物肽。其具有10个氨基酸,包括在N末端的半胱氨酸残基和邻近C末端的酪氨酸残基。图1B:底物肽的磷酸化。在肽通过Src激酶磷酸化之后在酪氨酸残基上的羟基被带负电的磷酸根基团取代。图1C:在增强散射Au表面上的磷-肽(phosphor-peptide)折叠。磷-酪氨酸残基的负电荷被吸引更接近亲电
子的Au表面,其中拉曼散射增强是更强的。图1D:计算的相对SERS增强因子相对于酪氨酸残基到Au表面的距离。酪氨酸残基越接近Au表面,则可获得越强的SERS信号,反之亦然。
[0030] 图2A-2D显示通过Src激酶的酪氨酸的酪氨酸磷酸化的SERs光谱。图2A显示磷酸化和未磷酸化的底物的SERs光谱。图2B显示通过纯化Src激酶的实时酪氨酸磷酸化。
-1
1004cm 归因于酪氨酸残基的苯环呼吸模式。随着越来越多的肽磷酸化,酪氨酸拉曼峰变得越来越强,表明由于磷酸根基团的负电荷引起的肽折叠。图2C显示时间分辨的磷酸化水平-1
或者1004cm 峰增强。检测极限为10μL容积中10pM Src激酶,这给出亚-飞(毫微微)
摩尔激酶检测灵敏度。图2C显示实时抑制实验。该图显示对于单位点阻断(single site blocking)和双位点阻断抑制剂酶的磷酸化水平相对于抑制剂浓度。这两种抑制剂的IC50浓度分别为44nM和20nM。
[0031] 图3A-3D显示抑制药物筛选数据。图3A显示在与10nM Src激酶和不同浓度的Src抑制剂I反应20分钟之后的最终光谱。图3B显示在与10nM Src激酶和Src抑制剂I
反应中的随时间推移的磷酸化水平。图3C显示在对于各种抑制剂浓度反应20分钟之后的最终磷酸化水平。在数据的S形拟合之后,Src抑制剂I的IC50浓度为约50nM。图3D显
示在与10nM Src激酶和AMP-PNP但没有ATP的反应中随时间推移的磷酸化水平。
[0032] 图4A-4D显示在粗细胞溶解产物(裂解物)中实时的酪氨酸磷酸化检测。图4A显示在引入野生型3T9小鼠成纤维细胞的粗溶解产物之后肽的实时SERS光谱。图4B显示在引入转染有病毒Src蛋白的3T9小鼠成纤维细胞的粗溶解产物之后肽的实时SERS光谱。
图4C显示时间分辨的磷酸化水平。酪氨酸磷酸化水平在Src+细胞中惊人地提高。图4D
显示不同类型的3T9细胞的磷酸化水平。
[0033] 图5,板A-E显示抑制药物筛选数据。
[0034] 图6说明纳米锥体阵列。
[0035] 图7说明制造纳米锥体阵列的方案。
[0036] 图8示意性地说明制造包括多个纳米级特征的表面的方案。
[0037] 图9示意性地说明制造SERs激酶检测基底的方法。
[0038] 图10示意性地说明用于在纳米锥体基底上检测激酶活性的SERS检测系统。
[0039] 图11示意性地说明自动SERs检测系统的一种设置。

具体实施方式

[0040] 本发明提供用于研究/表征蛋白/肽底物与激酶(使蛋白磷酸化的酶)和/或磷酸酶(使蛋白部分或完全脱磷酸化的酶)的相互作用的新型组合物和方法。令人惊讶的发现是,在合适的条件下,拉曼光谱学可用于有效地检测和/或定量目标分子例如激酶和/或磷酸酶底物的磷酸化(或脱磷酸化)(参见,例如图1A和1B)。磷酸化反应之前和之后肽的说明性拉曼光谱如图2A所示。如该图所示,激酶底物(在这种情况下为肽)的磷酸化导致若干拉曼峰的强度改变,一些峰移位并且新的峰出现。明显地,可使用拉曼光谱学检测激酶底物的磷酸化。类似地,也可使用拉曼光谱学检测磷酸化的底物的脱磷酸化。因此,在一些实施方式中,本发明提供包括一种或多种激酶和/或磷酸酶底物分子的检测组合物和/或检测系统,所述底物分子例如为可通过激酶磷酸化和/或通过磷酸酶脱磷酸化的分子,所述激酶和/或磷酸酶底物分子连接(例如化学结合)到在表面上的一种或多种纳米颗粒,或者更优选到一种或多种纳米级特征,其中所述纳米颗粒或者一种或多种纳米级特征起到增强拉曼光谱学中产生的信号的作用。
[0041] 在各种实施方式中,特别在所述激酶和/或磷酸酶底物连接到表面(例如,拉曼活性表面)上的一种或多种纳米级特征时,不同的激酶和/或磷酸酶底物分子可定位在所述底物上的不同位置,从而形成用于检测一种或多种激酶和/或磷酸酶和/或定量一种或多种激酶和/或磷酸酶的活性的阵列。
[0042] 图1C说明激酶底物(例如,肽)在拉曼活性表面例如增强散射金表面上的磷酸化。磷酸化残基(这种情况下为酪氨酸)的负电荷被吸引更接近亲电子的金表面,其中拉曼散射增强更强,从而改善拉曼信号。如图1D所示,磷酸化残基离金表面越近,则可获得越强的SERS信号,反之亦然(例如对于脱磷酸化的检测)。
[0043] 因此,包括连接的激酶和/或磷酸酶底物阵列的表面特别是拉曼活性表面提供用于实时筛选一种或多种激酶和/或磷酸酶的存在和/或活性、和/或一种或多种激酶和/或磷酸酶的动力学的定量的有效工具。所述激酶和/或磷酸酶底物阵列也可容易地用于筛选一种或多种测试试剂(例如,化学药品库)的激酶和/或磷酸酶抑制剂(或激动剂)活
性。
[0044] 因此,在各种实施方式中,本文所述的激酶/磷酸酶筛选系统可用于快速和有效地筛选上调(upregulate)激酶和/或磷酸酶活性的激酶和/或磷酸酶抑制剂药物(超过50%的癌症药物是激酶抑制剂药物)或试剂。在一些实施方式中,所述激酶/磷酸酶分析也可用于例如医生和医院职员的对于癌症的个人化的分子诊断
[0045] 拉曼活性表面,例如包括增强拉曼光谱学信号的纳米级特征的表面,特别适合用作本文所述SERs激酶底物阵列的阵列表面。虽然许多纳米级特征(例如,纳米棒、纳米柱、纳米线、纳米管、纳米盘、纳米月牙状物、纳米级点、纳米级纤维、纳米管、纳米角、纳米空穴、纳米蝶形结、纳米碗、纳米月牙状物和纳米夹饼以及其它纳米等离子体激元增强的纳米结构)非常适合用于增强拉曼信号,但是在一些实施方式中,纳米锥体的阵列用作阵列表面。在一些实施方式中,本发明还提供制备纳米级锥体阵列的成批制造方法(参见,例如图7)。
所述方法过程与常规的集成电路制造方法相容,所以可以立刻以非常高的产率并且大量地制造纳米锥体阵列。此外,可使用光刻法将阵列图案化。所述纳米级金锥体阵列含有大量的相邻的锥体之间的10nm以下(低于10nm)的间隙,和跨越所述小间隙的电磁相互耦合产生非常高的局部场增强,并且拉曼散射信号可增强几十个数量级。其它设计的SERS纳米结构例如纳米点也可图案化为SERS微阵列。
[0046] 还认识到,虽然对于检测底物的磷酸化描述了各种方法和组合物,但是它们也可用于检测底物的脱磷酸化和/或底物的磷酸化程度。
[0047] I.用于SERS激酶/磷酸酶分析的激酶/磷酸酶底物
[0048] 基本上任何可通过激酶磷酸化和/或通过磷酸酶脱磷酸化的分子可用作本文所述方法和组合物中的激酶/磷酸酶底物。虽然蛋白/肽构成了用于激酶和磷酸酶的最大底物类型,但是许多其它激酶和/或磷酸酶底物也是已知的。这种底物包括,但不限于,各种糖(例如,己糖、葡萄糖、果糖、甘露糖等)、核苷酸/核酸、乙酸酯、丁酸酯、脂肪酸、二氢鞘氨醇、二酰基甘油、神经酰胺等。作为说明,许多激酶和它们的酶委员会编号(EC编号),和作为暗示,激酶底物,显示在表1中。认识到,对于即使不是全部激酶底物也是大部分激酶底物来说,存在相应的磷酸酶。
[0049] 表1.说明性的激酶和相应的酶委员会编号(EC编号)
[0050]
[0051]
[0052]
[0053]
[0054] 对于大量激酶和/或磷酸酶,底物和/或底物共有序列是已知的。已经证明这些共有序列内的许多残基为重要的识别元素并且这些基序的非常简单性使它们在蛋白激酶和/或磷酸酶和它们底物的研究中是有用的。基于共有基序的短合成寡肽典型地是用于蛋白激酶/磷酸酶活性分析的优异底物。下表2总结了有关各种良好研究的蛋白激酶的特异性基序的一些已知数据,以及特异蛋白中已知磷酸化位点的实例。更广泛的列表可以在Pearson和Kemp(1991)Meth.EnzymoL,200:68-82中发现,其引入本文作为参考。
[0055] 表2.显示一些公知激酶的识别基序和底物序列。在磷酸受体(phosphoacceptor)残基下面划线,可在特定残基处可互换地起作用的氨基酸通过斜划线(/)分开,并且不表现为强烈有助于识别的残基通过“X”表示。
[0056]
[0057]
[0058] 其它说明性的蛋白激酶底物在表3中显示。
[0059] 表3.说明性的蛋白激酶底物
[0060]
[0061]
[0062] 和许多激酶底物是可商购的。因此,例如,表4列出可由BioMol,International Lp获得的许多激酶底物。
[0063] 表4.说明性的可商购的激酶底物。可由BioMol,International Lp获得。
[0064]
[0065]
[0066]
[0067] 在一些实施方式中,优选的激酶底物包括,但不限于,用于组氨酸激酶、丝氨酸激酶、苏氨酸激酶和酪氨酸激酶和/或相应磷酸酶的底物。用于这些激酶的许多底物是本领域技术人员所公知的。此外,用于鉴别这些底物的方法是公知的。因此,例如,程序PREDIKIN可用于基于蛋白激酶催化域的基本(原始)序列预测丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的底物。底物预测的规则是基于与在已知天然底物中通过定向肽库实验发现的那些类似的序列和通过使用Insight II软件包(Accelrys)模拟。PREDIKIN详细描述于Ross等(2003)Proc.Natl.Acad Sci.,USA,100(1):74-79中,其引入本文作为参考。用于识别其它激酶底物的类似程序是本领域技术人员所公知的。
[0068] 此外,许多筛选系统是已知的并且可用于识别激酶底物。在一种方法中,例如,抗磷酸酪氨酸抗体用于筛选酪氨酸-磷酸化cDNA表达库(参见,例如Lock等(1998)EMBO12
J.17(15):4346-4357,其引入本文作为参考)。另一方法在体内利用以“轻”( C标记的)
13
或“重”( C标记的)酪氨酸标记蛋白。这种在细胞培养方法中的稳定同位素标记使得能够明确识别酪氨酸激酶底物,因为得自真实底物的肽在质谱实验中产生独特的特征(参见,例如Ibarrola等(2004)J.Biol.Chem.,279(16):15805-15813,其引入本文作为参考)。这些方法容易自动化并且服从高通量筛选系统(HTS)。
[0069] 而且,如上所述,许多底物是已知的并且它们的识别无需筛选。因此,例如,许多酪氨酸激酶底物和相关的磷酸化位点如表5所示。
[0070] 表5.说明性的酪氨酸激酶底物
[0071]底物 磷酸化位点 底物 磷酸化位点
KDR Tyr996 PLCg Tyr771/775
STAT3 Tyr705 T细胞激活抗原 Tyr217
cdc2 Tyr15 T细胞受体ζ链 Tyr152
JAK1 Tyr1022/1023 ERK5 Tyr215/220
KDR Tyr1054/1059 GSK3 Tyr284
桩蛋白 Tyr31 JNK1 Tyr190
Pyk2 Tyr402 TrkC Tyr705
Shc Tyr317 锌指蛋白145 Tyr70
STAT1 Tyr701 TIF Tyr495
TrkA Tyr490 c-Kit(Y900) 64
TrkA Tyr785 PTP1B Tyr66
Trk2 Tyr1054/1055 SHP-2(Try542) 63
Zap70 Tyr493 PI3K Tyr688
STAT6 Tyr641 Src Tyr416
HER2 Tyr1248 c-FGR Tyr412
STAT5 Tyr694 EGFR Tyr1173
CTD Tyr ER a Tyr537
FAK Tyr577 IRS1 Tyr891
STAT4 Tyr693 IRS2 Tyr766
PDGFR Tyr775 JAK2 Tyr1008
STAT2 Tyr690 PTEN Tyr315
JAK1 Tyr1023 c-Cb1 Tyr700
肝糖原合酶 Tyr637 发动蛋白I/II Tyr231
NLK-1 Tyr181 P62Dok Tyr398
PDGFR Tyr771 R-Ras Tyr66
信号转导蛋白 Tyr160 PTEN Tyr336
TLE2 Tyr226 VEGFR1 Tyr1213
β-肾上腺素能受体 Tyr350 VEGFR2 Tyr1212
CSBP1 Tyr182 Zap70 Tyr319
双皮质素 Tyr345 c-Cb1 Tyr774
HER2 Tyr1248 Met Tyr1349
胰岛素受体前体 Tyr992 Met Tyr1356
HEK8 Tyr596 VEGFR2 Tyr801
Met Tyr1253 FcγRIIB Tyr292
MBP Tyr117/124 Ret Tyr905
[0072]
[0073] 在各种实施方式中,用于蛋白/肽激酶和/或磷酸酶的底物典型地长度为约4个氨基酸至最高达约200、100或50个氨基酸,更优选约4个氨基酸或6个氨基酸至最高达约30、40或50个氨基酸,最优选约4、6或8个氨基酸至最高达约16、20、25、30、35或40个氨基酸。在一些实施方式中,所述激酶底物包括一个磷酸化位点。在一些实施方式中,所述激酶底物包括超过一个磷酸化位点(例如,至少2、3、4、5、6、8、10、12或20个磷酸化位点)。
在一些实施方式中,所述底物包括在天然底物中磷酸化位点的每侧上发现的1、2、3、4、5、8或10个氨基酸。
[0074] 如所述的,对于基本上任意激酶,也存在相应的磷酸酶(例如,在相同或不同的位点使底物脱磷酸化)。在一些实施方式中,激酶可以在底物上的一个位点作为激酶和在该底物的不同位点和/或在不同底物上作为磷酸酶。因此,在各种实施方式中,激酶底物也可作为磷酸酶底物。
[0075] 此外,底物可通过酶或其它化学方法进行改性以例如向现有底物添加或从现有底物除去额外的化学官能团或化学结构。因此,在一些实施方式中,在构成底物的残基的一个或多个上进行各种化学改性(例如,乙酰化、封端(阻断)、酰胺化、甲酰化、磺化、甲基化等)。在一些实施方式中,所述底物可包括一种或多种非自然存在的氨基酸残基(例如,2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙胺酸(β-氨基丙酸)、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、
2,4二氨基丁酸、链素、2,2′-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、氨酸等)。
[0076] 上述激酶和/或磷酸酶底物意为说明性的而不是限制性的。使用本文中提供的教导,对于本领域技术人员来说,其它激酶底物将容易地可应用于本文中所述的方法、组合物和器件。
[0077] II.制造用于SERS激酶/磷酸酶分析阵列的表面
[0078] 在各种实施方式中,将激酶和/或磷酸酶底物连接到一种或多种纳米颗粒和/或构成表面优选拉曼活性表面的纳米级特征。在一种说明性的方法中,提供包括纳米锥体(纳米锥体阵列)的表面。首先,在单晶硅晶片的表面上生长100-500nm厚的多晶硅层。然后用HBr和O2的混合物的等离子体处理该晶片的表面小于10秒。在该步骤中,在多晶硅表面上形成纳米级氧化物岛阵列。第三,然后例如通过HBr等离子体蚀刻晶片表面10~20秒以形成纳米柱阵列。然后通过例如SF6等离子体蚀刻除去该氧化物岛层。然后,通过例如HBr等离子体蚀刻具有纳米柱图案的多晶硅表面约1~2分钟。自然地在所述晶片表面上形成多晶硅纳米锥体图案。在表面金属化之后,所述纳米锥体阵列可用作SERS基底。工艺流程如图7所示。在需要纳米柱而不是纳米锥体时,可减少或消除最终的蚀刻。
[0079] 在一些实施方式中,可使用Liu和Lee(2005)在Appl.Phys.Letts.,87:074101中所述的方法成批地制造包括纳米级特征的表面,该文献引入本文作为参考。
[0080] 在这种方法中,使用常规的平版印刷术和蚀刻方法例如在硅或玻璃基底上制造纳米结构。选择最佳的原版(母本,master copy),并且将可重复的基于PDMS的软平版印刷术(软刻蚀)与在复制的纳米结构上的简单金属沉积一起应用,这容许在聚合物基底上经济地大量生产相同的SERS活性位点。由于用于形成纳米孔SERS结构的金属薄膜(例如,Ag或Au)的沉积阻挡激发光源以拾取来自PDMS聚合物基底的额外拉曼信号,从而避免来自该聚合物基底的拉曼信号的背景噪音
[0081] 在图8中示意性地说明该方法。如图所示,在作为PDMS SERs基底的原版的硅上制造纳米孔(参见板块(a))。将抗静摩擦涂层施加在纳米孔的原版上(参见板块(b))。使用PDMS聚合物进行纳米孔的软平版印刷术(板块c)。所述表面使用氧等离子体处理(板
块d),随后使用障板选择性地沉积用于SERS活性位点的薄膜金属(例如,Ag)层(板块e),和将所得SERs结构集成到玻璃微流体通道中(板块f)。
[0082] 如在各种实施方式中所述的,用于在纳米结构化PDMS基底上选择性薄膜金属沉积的简单障板法提供与基于玻璃的微流体通道阵列芯片结合的有效集成解决方案(参见,例如图8、9和10)。
[0083] 在各种其它实施方式中,可利用在表面例如硅(参见,例如Liu和Green(2004)J.Mater.Chem.14:1526)或者聚合物(参见,例如Lu等(2005)Nano Lett.5:5)上装配纳米颗粒的已知方法以及电子束制造的纳米颗粒阵列(参见,例如Liao等(1981)Chem.Phys.Lett.82:355)。在一些实施方式中,所述纳米颗粒可以预形成并且静电地、热地、离子地或化学地固定在下面的表面上。在各种实施方式中,所述纳米颗粒可包括纳米柱、纳米棒、纳米锥体、纳米线、纳米球、纳米月牙状物、纳米角、纳米管、纳米四脚体(纳米四角锥体,nanotetrepods)、单层或多层纳米盘等。
[0084] 在各种实施方式中,所述纳米特征的尺寸为约10nm~约200nm,更优选约20nm~约100nm,还更优选约30nm~约50或80nm。在各种实施方式中,纳米特征之间的平均间隔为约2nm~约100nm,还更优选约4nm~约50或80nm。在一个说明性实施方式中,所述纳米级特征具有约35-45nm的平均尺寸(例如,直径)和约40~约50nm的平均间隔。在一些实施方式中,所述纳米级特征具有约10、15、20或25nm至约100、150、200、250、300、350、
400、450或500nm的中心距。在一些实施方式中,所述特征的中心距为约50或75nm至约
100nm、150nm或200nm。
[0085] 在各种实施方式中,当引入到微流体室中时,室容积可小于约10μl或1μl或100nL,优选小于约10nL或1nL,还更优选小于约0.1nL或0.01nL。
[0086] 上述方法和实施方式意为说明性的而不是限制性的。使用本文提供的教导,本领域技术人员可制造包括纳米级特征的其它表面。
[0087] 虽然包括纳米级特征(例如纳米锥体)的拉曼活性表面在本文中作为包括金的表面说明,将认识到所述表面可由其它材料制造。这种材料包括例如贵金属、贵金属合金、贵金属复合物、贵金属硝酸盐、贵金属氧化物等。
[0088] 在一些实施方式中,所述拉曼活性表面由金属或半导体材料组成。合适的材料包括,但不限于,金属(例如,金、银、铜、钨、铂、、锰等,或者它们的氧化物、氮化物或合金)、半导体材料(例如,CdSe、CdS和覆盖有ZnS的CdS或CdSe等)、多层金属和/或金属合金、和/或金属氧化物或氮化物、聚合物、碳纳米材料、磁性(例如,铁磁体)材料等。在一些实施方式中,材料包括如下的一种或多种:钨、钽、铌、Ga、Au、Ag、Cu、Al、Ta、Ti、Ru、Ir、Pt、Pd、Os、Mn、Hf、Zr、V、Nb、La、Y、Gd、Sr、Ba、Cs、Cr、Co、Ni、Zn、Ga、In、Cd、Rh、Re、W、Mo以及它们的氧化物、氮化物、合金和/或混合物和/或烧结物。在本发明实践中有用的其它材料包括,但不限于,ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs、GaAs等。
[0089] III.将激酶/磷酸酶底物连接至纳米颗粒或拉曼活性基底和图案化
[0090] 激酶和/或磷酸酶底物可通过本领域技术人员所公知的许多方法的任一种连接到存在于表面(例如拉曼活性表面)上的纳米颗粒或者特征。例如,在一些情况下,激酶和/或磷酸酶底物可简单地吸附在表面上。
[0091] 然而,为了使分析中激酶和/或磷酸酶底物与激酶/磷酸酶的接触机会(接近,access)最大化,经常希望将激酶和/或磷酸酶底物直接(例如,通过官能团)或者通过连接物共价连接到表面上纳米级特征的纳米颗粒。
[0092] 例如,在一些实施方式中,依靠形成共价键的金-硫醇反应,使用在底物(例如,肽)末端的半胱氨酸基团,将激酶和/或磷酸酶底物束缚到金纳米级特征上以将该底物连接到金表面。在各种实施方式中,阵列表面和/或激酶和/或磷酸酶底物可用例如胺、羧基、烷基、烯基(alkyene group)、羟基或其它官能团衍生化,因此所述肽(或其它底物)可以直接连接到所述表面或者通过连接物偶联。在其它实施方式中,所述表面可以例如用胺、羧基或其它官能团进行官能化用于连接到激酶和/或磷酸酶底物。
[0093] 合适的连接物包括,但不限于,含有两个或更多个反应性位点的异双官能(heterobifunctional)或同双官能(homobifunctional)分子,所述反应性位点各自可与相应的结合配对物(激酶/磷酸酶底物、表面、或其上的官能团等)形成共价键。适合结合(连接)这样的部分的连接物是本领域技术人员所公知的。例如,蛋白分子可容易地通过许多连接物的任一种进行连接,所述连接物包括但不限于肽连接物、直链或支链碳链连接物、或者杂环碳连接物。异双官能交联试剂例如N-乙基来酰亚胺的活性酯已经被广泛用于将蛋白连接到其它部分(参见,例如Lerner等(1981)Proc.Nat.Acad.Sci.(USA),
78:3403-3407;Kitagawa 等 (1976)J.Biochem.,79:233-236;Birch 和 Lennox(1995)Monoclonal Antibodies:Principles and Applications,第四章,Wiley-Liss,N.Y.等)。
[0094] 在一些实施方式中,激酶和/或磷酸酶底物可利用生物素/抗生物素蛋白相互作用结合到表面。在一些实施方式中,生物素或抗生物素蛋白,例如具有光不稳定的保护基团的生物素或抗生物素蛋白,可固定到表面和/或激酶/磷酸酶底物。在带有相应的抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素或生物素的所需激酶和/或磷酸酶底物的存在下辐射所述表面导致该底物与所述表面偶联。
[0095] 在表面和/或激酶和/或磷酸酶底物带有反应性基团或衍生化以带有反应性基团时,许多偶联方法是容易可用的。因此,例如,游离的氨基受与本领域技术人员公知的广泛多种的羧基活化的连接物延展(扩展,extensions)的酰化反应。连接物延展可以在该阶段进行以产生末端活化的基团例如活性酯、异氰酸酯、马来酰亚胺等。例如,肽或氨基衍生化的表面与二羧酸例如对苯二甲酸的同双官能N-羟基琥珀酰亚胺酯的一端的反应将产生稳定的N-羟基琥珀酰亚胺酯封端连接物加合物,其对于结合到胺是有用的。还可用异双官能试剂例如马来酰亚氨基链烷酸N-羟基琥珀酰亚胺酯完成连接物延展以产生用于随后结合到硫醇基的末端马来酰亚氨基。氨基封端的连接物可用异双官能硫醇化试剂进行延展,该硫醇化试剂反应以在一端形成酰胺键和在另一端形成游离或受保护的硫醇基。本领域中公知的这种类型的硫醇化试剂的一些实例为2-亚氨基硫杂环戊烷(2-IT)、琥珀酰亚胺基乙酰基硫代丙酸酯(SATP)和琥珀酰亚氨基2-吡啶基二硫代丙酸酯(SPDP)。然后在去保护之后,初始的硫醇基可用于与马来酰亚氨基或溴乙酰化部分形成硫醇醚或者直接与金表面相互作用。在各种实施方式中,氨基,例如氨基封端连接物的氨基,可以例如通过在酸的存在下与金属亚硝酸盐反应而转化为重氮基,因此该物质转化为重氮盐,其然后与合适的亲核部分是反应性的,所述亲核部分例如,但不限于肽的酪氨酸残基等。用于转化为这种重氮盐的合适的氨基封端连接物的实例包括,但不限于,芳族胺(苯胺),和还可包括氨基己酸酯以及以上所提及的类似物质。这种苯胺可容易地通过代入可用的羟基和N-保护的氨基酸之间的偶联反应而获得,如上所述,在相应的氨基酸中所述氨基由芳族胺即苯胺组成,所述合适地被保护的胺例如作为N-乙酰基或N-三氟乙酰基被保护的胺然后使用现有技术中公知的方法进行去保护。重氮盐的其它合适胺前体将是有机合成领域中的技术人员联想到的。
[0096] 另外的有利类型的异双官能连接物为混合的活性酯/酰基氯例如琥珀酰亚氨基-氧羰基-丁酰氯。所述连接物的更加反应性的酰基氯末端优先将氨基或羟基例如在所述肽上的氨基或羟基酰化以直接产生N-羟基琥珀酰亚胺基酯连接物加合物。
[0097] 在本发明中有用的又一类型末端活化基团为基。醛基可通过如下产生:将游离羟基(例如,在肽或者衍生化的纳米月牙状物上)与烷基或芳基酸偶联,所述烷基或芳基酸在ω位置(远端)用被掩蔽的醛基如缩醛基团例如1,3-二氧戊环-2-基或1,3-二氧六环-2-基部分取代,随后使用本领域中公知的方法使所述基团去掩蔽。在各种实施方式中,在ω位置用被保护的羟基例如乙氧基部分取代的烷基或芳基羧酸可用于偶联反应,随后进行该羟基的去保护和与试剂例如重铬酸吡啶盐在合适的溶剂优选二氯甲烷中进行温和的氧化以得到相应的醛。产生醛封端的物质的其它方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。
[0098] 在各种实施方式中,多种激酶和/或磷酸酶底物连接到拉曼活性表面(例如,包含纳米级特征的表面)。在各种实施方式中,至少5种,优选至少10种,更优选至少20、50或100种和最优选至少100、500、1000、10000、50000或100000种不同的激酶和/或磷酸酶底物连接到表面。
[0099] 在一些实施方式中,所述表面提供激酶和/或磷酸酶底物的高密度阵列。在各种2
实施方式中,这样的阵列可包含至少100或至少200个不同的底物/cm,优选至少300、400、
2
500或1000个不同的底物/cm 和更优选至少1500、2000、4000、10000、或50000或100,000
2
个不同的底物/cm。
[0100] 以高密度在表面上图案化分子的方法是本领域技术人员所公知的。这种方法包括例如使用本质上为点打印机的高密度微阵列打印机(参见,例如Heller(2002)Annu Rev Biomed Eng.4:129-153)。其它微阵列打印机利用“请求式”压电小滴产生器(例如,喷墨打印机)(参见,例如美国专利No.6,395,562;6,365,378;6,228,659和5,338,688以及WO公布WO 95/251116和WO/2003/028868,其引入本文作为参考)。其它方法涉及原位重新合成(参见,例如Fodor等(1991)Science,251:767-773和美国专利6,269,846、6,271,957和6,480,324,其引入本文作为参考)。许多阵列打印机是可商购的(参见,例如来自TM
Aurora Biomed的VERSA Mini Spot-printing Workstation、来自Bio-Rad的BioOdyssey TM
Calligrapher MiniArrayer、来 自 Genetix的 QArray、来 自Genomic Solutions 的BioRobotics MicroGrid、来自Genomic Solutions的OmniGrid Accent等)。
[0101] 激酶和/或磷酸酶底物可使用如上所述方法直接在拉曼活性表面(例如,纳米柱或纳米锥体阵列)上图案化。或者,激酶和/或磷酸酶底物可在不同的表面例如载玻片上图案化,然后通过如下转移到拉曼活性表面上:使所述拉曼活性表面与打印阵列接触从而将所述激酶和/或磷酸酶底物分子从之前打印的表面转移到拉曼活性表面(参见,例如,图9)。
[0102] IV.分析格式和样品传递
[0103] 在各种实施方式中,许多不同的激酶分析格式是预期的。例如,当期望在样品中检测和/或定量单一种类的激酶和/或磷酸酶时,可提供包含单一种类激酶和/或磷酸酶底物的拉曼活性表面。在一些实施方式中,所述表面可划分以应用于在不同的位置的不同样品。在其它实施方式中,期望检测和/或定量不同的激酶和/或磷酸酶,和可提供包括多种激酶和/或磷酸酶底物的表面。在一些实施方式中,多种类的表面可划分以同时检测不同的样品。
[0104] 在一些实施方式中,包括一种或超过一种激酶和/或磷酸酶底物的任意表面可任选地包括一种或多种阳性对照和/或阴性对照。在一些实施方式中,阴性对照包括一种或多种与激酶底物和/或磷酸酶相同种类的分子,但是缺少用于特定激酶/磷酸酶和/或预期在分析中存在的任意激酶/磷酸酶的磷酸化位点。在一些实施方式中,阳性对照包括一种或多种与激酶和/或磷酸酶底物相同种类的分子,但是含有用于已知存在于分析中的激酶和/或磷酸酶的磷酸化位点。在一些实施方式中,阳性或阴性对照可包括与所述表面上激酶和/或磷酸酶底物不同种类的分子。
[0105] 本文所述的激酶和/或磷酸酶分析可以在许多不同样品的任一个上进行。例如,在用于识别激酶抑制剂的筛选系统中,包含所关注激酶的细胞/细胞系和/或其溶解产物或者合适的缓冲系统可接触/被施用一种或多种测试化合物。可筛选由此产生的样品的激酶活性,从而识别哪些测试化合物是有效的例如作为激酶抑制剂和/或磷酸酶激动剂,以及它们抑制/激动(agonize)哪种激酶/磷酸酶。
[0106] 在各种诊断实施方式中,确定生物样品中激酶和/或磷酸酶的存在、和/或浓度、和/或活性。所述生物样品可包括基本上任何需要分析的生物材料。这样的生物材料包括,但不限于,生物流体例如血液或血液成分(blood fractions)、淋巴、脑脊液、精液、尿、口腔液等,组织样品,细胞样品,组织或器官活组织检查或抽吸物,组织学标本等。
[0107] 在一些实施方式中,粗细胞溶解产物可以直接施加到SERS微阵列上并且在培育期间进行测量。为了确保测量中含水样品的一致溶液高度,微流体反应室可以与SERS微阵列结合。通过微流体通道将样品引入到反应室中。总样品容积可减少到亚微升容积。
[0108] 在各种实施方式中,将生物样品(例如,细胞溶解产物或其衍生物)施加到包含激酶和/或磷酸酶底物的拉曼活性表面。在一些实施方式中这可以通过使样品流过包含/包括拉曼活性表面的微流体室来完成。在一些实施方式中,将所述微室安装在用于纳米颗粒可视化的具有暗视野照明的倒置拉曼显微镜上的热板(例如,在37℃)上。激发激光聚焦在拉曼活性表面的各区域上,例如通过显微术物镜。通过相同的物镜收集SERS信号并且通过分光计分析。
[0109] V.检测和自动化的检测系统
[0110] 可能用于拉曼光谱学的许多检测装置是本领域中已知的并且可使用任意已知的拉曼检测装置。拉曼检测装置的非限制性实例公开于美国专利6,002,471中。在该实例中,激发束通过532nm(纳米)波长的Nd:YAG激光器或者365nm波长的Ti:蓝宝石激光器产生。可使用脉冲激光束或连续激光束。激发束通过共焦光学器件和显微镜物镜,并且可聚焦到连接有生物分子目标物的基底上。可通过与用于光谱解离的单色器结合的显微镜物镜和共焦光学器件收集拉曼发射光目标。所述共焦光学器件可包括二向性滤光器、屏障滤光片、共焦小孔、透镜、和用于减少背景信号的镜子的组合。可使用标准的全视野光学器件以及共焦光学器件(参见,例如图10)。
[0111] 可通过拉曼检测器检测拉曼发射信号。所述检测器可包括与用于信号的计数和数字化的计算机接口崩光电二极管。在将分析目标物阵列时,光学检测系统可设计为检测拉曼信号并且将该拉曼信号定位在芯片或网格的特定位置。例如,可将发射光引导至CCD(电荷耦合器件)照相机或者能够在检测视野内同时测量来自多个像素或多组像素的光发射的其它检测器。
[0112] 拉曼检测装置的其它实例公开在例如美国专利No.5,306,403中,包括以单光子计数模式运行的配有砷化镓光电倍增管(RCA Model C31034或Burle Industries Model C3103402)的Spex Model 1403双光栅分光光度计。激发源为来自SpectraPhysics,Model166的514.5nm线氩离子激光器和氪离子激光器的647.1nm线(Innova 70,Coherent)。
[0113] 各种激发源包括,但不限于,337nm的氮激光器(Laser Science Inc.)和325nm的氦-镉激光器(Liconox)(美国专利No.6,174,677)。激发束可利用带通滤波器(Corion)进行光谱纯化并且可使用6倍物镜(Newport,Model L6X)聚焦在基底140上。所述物镜通过使用全息光束分离器(Kaiser Optical Systems,Inc.,Model HB 647-26N18)产生用于激发束和发射的拉曼信号的直角几何形态可用于激发指示器和收集拉曼信号两者。全息陷波滤波器(Kaiser Optical Systems,Inc.)可用于减少瑞利散射辐射。可选择的拉曼检测器包括,但不限于,配有红色增强的强化电荷耦合器件(RE-ICCD)检测系统(Princeton Instruments)的ISA HR-320光谱仪。可使用其它类型的检测器,例如电荷注射器件、光电二极管阵列或光电晶体管阵列。
[0114] 在一些实施方式中,使用具有真色成像照相机和分光计的暗视野显微术系统获取激酶和/或磷酸酶底物的散射图像和光谱。在一个说明性的实施方式中,所述显微术系统由如下组成:配有暗视野聚光器(1.2<NA<1.4)的Carl Zeiss Axiovert 200倒置显微镜(Carl Zeiss,Germany)、真色数字照相机(CoolSNAP cf,Roper Scientific,NJ)以及具有1024×256像素冷却光谱仪CCD照相机(Roper Scientific,NJ)的300mm焦距和300凹槽/mm单色器(Acton Research,MA)。
[0115] 一个检测系统示意性地如图11所示。如图所示,检测系统包括x-y扫描样品台、拉曼检测探针、分光光度计和控制计算机。所述拉曼检测探针包括激光传送纤维、物镜、长通滤光器和拉曼散射光收集纤维。SERS微阵列芯片安装在扫描台上,和当所述台扫描和数据获取通过控制计算机而同步时,通过固定的拉曼检测探针测量在各点处的肽的SERS信号。
[0116] VI.试剂盒
[0117] 在另一实施方式中,本发明提供用于本文所述方法的实践的试剂盒。所述试剂盒典型地包括包含多种所述的激酶和/或磷酸酶底物的SERs阵列。在一些实施方式中,可提供所述SERs阵列装在微流体室中,例如作为用于SERs分析器件的微流体盒的组件。
[0118] 在各种实施方式中,所述试剂盒任选地包括用于收集和/或处理生物样品的器件(例如,注射器、拭子等)和或试剂(例如,稀释剂和/或缓冲剂)。
[0119] 此外,所述试剂盒任选地包括提供用于本文所述方法的实践的指导(即,规程)的标记和/或指示材料。在一些实施方式中,所述指示材料描述使用本文所述的一种或多种器件检测和/或定量激酶和/或磷酸酶的存在或活性。
[0120] 虽然指示材料典型地包括书面或印刷材料,但是它们不限于此。能够储存这样的指示并将它们传达给终端用户的任意介质是本发明所预期的。这样的介质包括,但不限于,电子储存介质(例如,磁盘、磁带、盒式磁盘(带)、芯片),光学介质(例如,CD ROM)等。这样的介质可包括提供这样的指示材料的互联网网址。
[0121] 实施例
[0122] 提供如下实施例以说明,而不是限制要求保护的发明。
[0123] 实施例1
[0124] SERs微阵列的制造和使用
[0125] 纳米锥体SERS基底的制造
[0126] 从单晶硅晶片开始,将300nm厚的多晶硅薄层沉积在硅晶片的抛光顶面上。可使用照相平版印刷术(光刻法)将在所述多晶硅表面上图案化微米级器件。在图案化之后,在等离子体辅助的反应性离子蚀刻器中蚀刻所述硅晶片。制备纳米锥体SERS基底的蚀刻方法不同于常规硅膜蚀刻中使用的那些。首先,通过使用SF6等离子体蚀刻10秒剥离多晶硅膜上的天然(native)氧化物层。接下来,使O2和HBr气体的混合物在RF等离子体蚀刻室中流动7秒以限定在多晶硅膜顶部上的纳米级氧化物岛。这些纳米级氧化物岛通过同时的蚀刻和氧化过程产生。所述氧化物岛的平均直径为约20nm并且相邻氧化物岛之间的间隔距离取决于O2和HBr的混合比。然后所述多晶硅膜通过纯HBr等离子体蚀刻10~20秒以形成短的纳米柱阵列。由于纳米级氧化物岛起到蚀刻掩模的作用,所述纳米柱蚀刻具有优异的方向性。随后,通过SF6等离子体蚀刻除去所述氧化物岛层并且暴露硅纳米柱。最后,具有纳米柱图案的多晶硅表面通过HBr等离子体各向同性地蚀刻1~2分钟。在所述晶片表面上形成多晶硅纳米锥体图案。在使用50~80nm金或银薄膜进行表面金属化之后,所述纳米锥体阵列准备好用作SERS基底。该工艺流程图如图7所示。
[0127] 纯化细胞Src激酶的检测
[0128] 首先使用纯化的p60细胞Src激酶测试和校准Src激酶SERS探针。在37℃下与10nM Src激酶的反应中记录实时肽SERS光谱。在磷酸化反应的10分钟内苯环呼吸峰
-1 -1 -1
1004cm 的强度显著增加。磷酸化水平定义为1004cm 与1260cm 之间的峰强度的标准化-1
比。1260cm 峰与半胱氨酸残基有关并且其强度在整个反应期间的变化可以忽略。反应前的初始磷酸化水平定义为一致的(一,unity)并且在与10nM Src激酶反应之后增加至超过6倍。用各种浓度的Src激酶表征反应中的实时磷酸化水平。磷酸化率(rate)取决于
激酶浓度。对于高浓度Src激酶下,磷酸化水平在7左右饱和,并且最小可检测的浓度高于
10pM。可使用Michaelis-Maten模型计算不同浓度下Src激酶的反应常数。
[0129] 激酶抑制剂的检测
[0130] 激酶抑制是干扰细胞信号通路的最有效和直接的方式,并且许多癌症治疗基于激酶抑制剂。使用肽-接合纳米探针分析测试不同的Src激酶抑制剂。测试添加抑制剂PP2、PP3和SU5656的Src激酶的磷酸化水平。随着抑制剂浓度的增加,磷酸化水平显著下降。分别表征三种抑制剂的IC50浓度。
[0131] 粗细胞溶解产物中激酶的检测
[0132] 溶解各种3T9小鼠成纤维细胞并且在除去膜碎片之后将细胞溶解产物与肽-纳米颗粒结合物直接混合。在引入细胞溶解产物之前和之后监控单个纳米颗粒上的SERS光谱。野生型3T9细胞溶解产物中的Src磷酸化显示出温和的水平,而在Src转染3T9细胞溶解
产物中,磷酸化水平变成3倍高。还进行了类似抑制剂测试。在添加有各种浓度抑制剂的条件下培养野生型和Src转染的3T9细胞。
[0133] 为了进一步确认肽-接合纳米探针不在无关样品Src缺陷细胞系中产生假的结果,使用SYC细胞溶解产物。在野生型、Src敲除和抑制剂处理的SYC细胞溶解产物中进行磷酸化测量。即使在溶解产物中可存在许多其它活性激酶,但由于纳米探针的高特异性,不含Src样品也不会产生可观的磷酸化水平。
[0134] SERS光谱学
[0135] 使用具有拉曼分光计的显微术系统以从单个纳米月牙状物获得拉曼散射光谱。所述系统由配有数字照相机的Carl Zeiss Axiovert 200倒置显微镜(Carl Zeiss,Germany)和具有1024×256像素冷却光谱仪CCD照相机(Roper Scientific,NJ)的300mm焦距单色器(Acton Research,MA)组成。785nm半导体激光器在我们的实验中用作拉曼散射的激发源,并且所述激光束通过40×物镜聚焦在纳米月牙状物上。激发功率通过光度计(Newport,CA)测量为~0.8mW。然后通过相同的光路由长通滤光器收集拉曼散射光并且通过所述分光计进行分析。
[0136] 肽合成
[0137] 将401mg(0.277mmol)Rink Amide AM聚苯乙烯树脂(负载0.69mmol/g)加入12mL烧结注射器中并用N-甲基吡咯烷(NMP)(4mL)溶胀。通过用1∶2∶2哌啶/NMP/
CH2Cl2溶液(3mL)处理30分钟除去Fmoc保护基团,过滤所述树脂并且用NMP(3×3mL)和
CH2Cl2(3×3mL)洗涤。为了负载氨基酸残基,使所述树脂经历偶联(结合,coupling)条件的重复循环,随后进行洗涤(5×3mL NMP,5×3mL CH2Cl2),Fmoc去保护[用1∶2∶2哌
啶/NMP/CH2Cl2溶液(3mL)处理30分钟]且再次用NMP(5×3mL)和CH2Cl2(5×3mL)洗涤。
通过如下负载第一氨基酸残基:将Fmoc-Cys(Trt)-OH(1.17g,2.00mmol)、PyBOP(1.04g,
2.00mmol)和HOBt(270mg,2.00mmol)在1∶1NMP/CH2Cl2(2mL)中的预先形成的溶液添加到所述树脂上,并且所得浆料在手腕作用的振荡器上搅拌5分钟,随后加入i-Pr2EtN(0.55mL,
4.0mmol)。使反应进行5小时。然后过滤所述树脂,洗涤(5×3mLNMP,5×3mL CH2Cl2)并且在高真空下干燥。确定Cys的负载为0.60mmol/g(78%产率)。通过方法A或方法B实
现连续的偶联。方法A由如下组成:加入Fmoc-保护的氨基酸在NMP/CH2Cl2(1∶1,2mL)中的预先形成的溶液,随后加入i-Pr2EtN(0.55mL,4.0mmol)。使反应进行至少4小时。方法B由如下组成:使所述树脂经历合适受保护酸的0.4M溶液,其已经通过用在DMF(2mL)中的DIC(130μL,0.84mmol)和HOBt(108mg,0.800mmol)培育10分钟而预活化。使该偶联进行4小时。在每次偶联之后,过滤所述树脂并且洗涤(NMP:5×3mL,CH2Cl2:5×3mL),随后除去Fmoc保护基团。在最终氨基酸残基的偶联和去保护之后,通过使所述树脂经历Fmoc-S-Ava-OH(272mg,0.800mmol)的0.4M溶液而添加氨基戊酸连接物,其已经通过用NMP(1mL)中的DIC(120μL,0.80mmol)和HOBt(108mg,0.800mmol)培育10分钟而预活化。
使所述偶联进行整夜。过滤所述树脂并洗涤(5×3mL NMP,5×3mL CH2Cl2),除去Fmoc保护基并且再次洗涤所述树脂。使反应进行6小时,再一次重复偶联过程并且使反应进行整夜。通过用94∶2∶2∶2的TFA/三异丙基硅烷/H2O/乙烷二硫醇的溶液(3mL)培育2
小时将基底与所述树脂切割开,使用预备的C18反相HPLC(CH3CN/H2O-0.1%TFA,5~95%
50分钟,20mL/分钟,220/254/280nm检测100分钟,tR=24.3分钟)进行纯化并且冻干。
MS(MALDI),对于C78H116N19O17S的计算的m/z:1622.85,测得:m/z 1623.90。
[0138] 通过磷酸酶脱磷酸化过程的检测方案与激酶检测中的类似,但是以相反的方向。磷酸酶底物肽具有通过活性磷酸酶除去的磷酸根基团。在这种情况下,所述底物肽上的脱磷酸化位点将失去负电荷并且从SERS基底表面离开,拉曼散射增强将变得较弱,导致衰退的光谱峰。
[0139] 应该理解,本文所述的实施例和实施方案仅用于说明的目的,本领域技术人员将想到根据其的各种改进或变化并且所述各种改进或变化包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请的全部内容为了全部目的由此引入作为参考。
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