一种肿瘤抗原PSA的CTL识别表位肽及其应用 |
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| 申请号 | CN201610483235.X | 申请日 | 2016-06-24 | 公开(公告)号 | CN106119231A | 公开(公告)日 | 2016-11-16 |
| 申请人 | 安徽未名细胞治疗有限公司; | 发明人 | 唐奇; 冯振卿; 许国贞; 刘振云; 朱进; 唐小军; 蒯兴旺; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种PSA来源的抗 肿瘤 CTL表位肽，为九肽，其 氨 基酸序列为Cys‑Ala‑Leu‑Pro‑Glu‑Arg‑Pro‑Ser‑Leu。本发明还包括上述肽在制备肿瘤 治疗 性DC‑CIK中的应用。本发明所制备的特异性的DC‑CIK细胞对 前列腺癌 细胞LNCap显示出一定的杀伤率，可用于制备前列腺癌特异性自体免疫细胞的制备。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种特异性肿瘤抗原PSA的CTL识别表位肽，其特征在于，所述CTL识别表位肽为九肽，其氨基酸序列为Cys-Ala-Leu-Pro-Glu-Arg-Pro-Ser-Leu。 |
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| 说明书全文 | 一种肿瘤抗原PSA的CTL识别表位肽及其应用技术领域[0001] 本发明涉及表位肽技术领域，尤其涉及一种特异性肿瘤抗原PSA的CTL识别表位肽及其应用，还涉及一种肿瘤抗原PSA特异性DC细胞的制备方法及其应用，以及一种肿瘤抗原 PSA特异性DC-CIK细胞的制备方法及其应用。 背景技术[0002] 前列腺特异抗原(Prostate Specific Antigen，PSA)是由前列腺腺泡和导管的上皮细胞分泌的一种单链糖蛋白，在功能上属于类激肽释放酶的一种丝氨酸蛋白酶，参与精 液的液化过程。PSA作为前列腺癌的特异性标志物，PSA是前列腺特异抗原，对前腺癌的诊断 特异性达90～97％。被认为是最有价值的前列癌的肿瘤标志物，被广泛应用于前列腺癌的 筛选、诊断及治疗后的监测。被认为是具有较强免疫原性的肿瘤抗原之一。 [0003] 近几年来，过继性细胞治疗(Adoptive cell therapy，ACT)因其巨大的优势成为目前肿瘤治疗中最有效的方法之一。肿瘤过继免疫疗法是将自身或异体的抗肿瘤效应细胞 的前体细胞，在体外采用IL-2、抗CD3单抗，特异性多肽等激活剂进行诱导、激活和扩增，然 后转输给肿瘤患者，提高患者抗肿瘤免疫力，以达到治疗和预防复发的目的。常见的有：① LAK细胞：用高浓度IL-2激活病人自体或正常供者的外周血单个核细胞；②TIL细胞：从切除 的瘤组织或癌性胸腹水中分离淋巴细胞，体外经IL-2诱导激活和扩增；③CD3AK细胞：用抗 CD3单抗辅以小剂量IL-2激活外周血单个核细胞；④CTL细胞：用特异性多肽抗原体外诱导 CTL克隆。 [0004] CTL(cytotoxic T-lymphocyte，CTL)细胞免疫传输疗法是利用自身静脉血的淋巴细胞，在体外通过靶细胞抗原和淋巴因子的诱导，分化扩增成具有强大杀伤力的CTL细胞， 再经静脉回输体内，从而有效的发挥免疫效应，达到清除病毒和杀伤肿瘤细胞的作用。CTL 疗法可连续杀伤靶细胞，具有高效性；具有抗原特异性；具有自身MHC限制性。是目前肿瘤全 身治疗的最佳手段之一，具有巨大的临床潜力。 [0005] 然而，目前在诱导特异DC-CIK细胞的抗原仍有待改进，缺乏能够高效刺激肿瘤特异性DC-CIK的CTL表位多肽抗原。 发明内容[0006] 基于背景技术存在的技术问题，本发明目的在于提供一种特异性肿瘤抗原PSA的CTL识别表位肽。 [0007] 本发明目的还在于提供上述特异性肿瘤抗原PSA的CTL识别表位肽的应用。 [0008] 本发明目的还在于提供一种肿瘤抗原PSA特异性DC细胞的制备方法。 [0009] 本发明目的还在于提供一种肿瘤抗原PSA特异性DC-CIK细胞的制备方法。 [0010] 本发明目的还在于提供上述肿瘤抗原PSA特异性DC细胞和DC-CIK细胞的应用。 [0011] 为实现上述目的，本发明采取如下技术方案： [0012] 本发明提出的一种特异性肿瘤抗原PSA的CTL识别表位肽，所述CTL识别表位肽为九肽，其氨基酸序列如下：Cys-Ala-Leu-Pro-Glu-Arg-Pro-Ser-Leu。 [0013] 上述特异性肿瘤抗原PSA的CTL识别表位肽采用固相合成法进行合成。基本流程如下：首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体Wang树脂上，然后脱 掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接至固相载体上；其次将第二个氨基被Fmoc基团保护 的氨基酸的羧基缩合剂活化，活化后的第二个氨基酸羧基再与已接在固相载体的第一个氨 基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述 的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割得到目的 肽，再经HPLC纯化，其纯度大于90％。 [0014] 本发明还提出的上述特异性肿瘤抗原PSA的CTL识别表位肽在制备具有PSA表达的肿瘤治疗性多肽疫苗的应用。 [0015] 优选地，上述特异性肿瘤抗原PSA的CTL识别表位肽在制备前列腺治疗性多肽疫苗中的应用，尤其对前列腺癌细胞LNCap具有杀伤力。 [0016] 本发明还提出的一种肿瘤抗原PSA特异性DC细胞的制备方法，采用上述特异性肿瘤抗原PSA的CTL识别表位肽加入DC细胞进行培养得到。 [0017] 本发明还提出的上述肿瘤抗原PSA特异性DC细胞的制备方法得到的特异性DC细胞在制备治疗前列腺癌药物中的应用。 [0018] 本发明还提出的一种肿瘤抗原PSA特异性DC-CIK细胞的制备方法，采用上述特异性肿瘤抗原PSA的CTL识别表位肽进行诱导得到。 [0019] 本发明还提出的上述肿瘤抗原PSA特异性DC-CIK细胞的制备方法得到的特异性DC-CIK细胞在制备治疗前列腺癌药物中的应用。 [0020] 本发明巧妙利用目前诊断前列腺癌最敏感的指标-PSA在前列腺癌中呈现高表达。PSA是由前列腺上皮细胞产生的一种大分子糖蛋白，它具有极高的组织器官特异性，而在正 常组织中表达很低，从而采用理论和实验相结合的方法筛选得到肿瘤相关抗原的表位肽， 所得表位肽未见文献报道，为研制基于抗原PSA的肿瘤疫苗或肿瘤特异性CTL细胞的制备提 供理论基础，并为后续多价的抗原肽疫苗构建奠定基础。 附图说明 [0021] 图1为本发明提出的一种特异性肿瘤抗原PSA的CTL识别表位肽的质谱分析图。 [0022] 图2为本发明实施例1所得P1、P2、P3……P20各自诱导得到的特异性CTL细胞分泌INF-γ的能力对比图。 [0023] 图3为本发明实施例1所得P3、P4、P11、P16各自诱导得到的特异性CTL细胞对前列腺癌细胞LNCap杀伤能力对比图。 [0024] 图4为由本发明提出的一种特异性肿瘤抗原PSA的CTL识别表位肽所制备得到的特异性CTL细胞免疫细胞群的流式细胞仪检测数据的统计分析图。 具体实施方式[0025] 下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。 [0026] 实施例1：合成表位肽 [0027] 采用理论与实践相结合的方法，根据抗原的一级结构，综合运用免疫信息学手段，运用SYFPEITHI、BIMAS、NetCTL、WAPP和EpiJen综合对PSA的抗原CTL表位进行预测分析，选 取评分前20的多肽序列进行试验筛选，一次命名为P1、P2、P3……P20。 [0028] 基本流程如下：首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体Wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接至固相载体上；其次将第二个氨 基被Fmoc基团保护的氨基酸的羧基缩合剂活化，活化后的第二个氨基酸羧基再与已接在固 相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基 的二肽。重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度， 最后切割得到目的表位肽粗品。将目的表位肽粗品经HPLC纯化得到目的表位肽精肽，其纯 度大于90％，质谱分析证实其分子量符合理论值。 [0029] 本发明提出的一种特异性肿瘤抗原PSA的CTL识别表位肽采用Fmoc固相合成法进行合成，所述CTL识别表位肽为九肽，编号为P11，其氨基酸序列如下：Cys-Ala-Leu-Pro- Glu-Arg-Pro-Ser-Leu。对P11进行质谱分析，其质谱分析结果如图1所示，可以证实其分子 量为996.26g/mol，符合理论值。 [0030] 上述所得P11和其余19个表位肽，可用于制备具有PSA表达的肿瘤治疗性多肽疫苗，其应用实验如下： [0031] 1、上述CTL识别表位肽诱导特异性CTL细胞、IFN-γ分泌及对肿瘤靶细胞的杀伤实验检测：抽取患者的外周血经密度梯度离心分离，获得PBMCs，添加细胞因子培养DC细胞和 CTL细胞，进一步采用DC细胞负载本发明的PSA表位肽，与CTL共培养刺激特异的CTL扩增，进 一步在体外采用ELISA和LDH实验检测特异的CTL在特异抗原刺激下INF-γ的分泌及对前列 腺癌细胞LNCap的杀伤作用。 [0032] 具体方法如下： [0033] (I)、PBMC的分离与诱导： [0034] 1)将50ml抗凝处理的外周血，2000rpm离心10min； [0035] 2)收集上层血浆冻存，用PBS(pH＝7.4)稀释剩下的血细胞； [0036] 3)将稀释的血细胞加入到等体积的淋巴分离液液面上； [0037] 4)20℃离心20min，关闭离心机刹车； [0038] 5)离心后，分为四层，用吸嘴玻璃滴管吸取白膜层(即第二层)； [0039] 6)取出的白膜层用PBS洗涤两遍； [0040] 7)将细胞以2～5×106/mL接种到6孔板内，2h后，回收未贴壁的细胞，用预包被anti-CD3IgG和anti-CD28IgG的培养板进行激活培养； [0041] 8)贴壁的细胞加入GM-CSF和IL-4刺激培养5天诱导成DC细胞，第三天半换液； [0042] 9)第5天，收集DC细胞，将10μg实施例1所得目的表位肽精肽加入DC细胞中，1h后，将DC细胞与激活的T细胞共培养，同时加入IL2及IL-15； [0043] 10)继续培养5天后，得到抗原特异的CTL细胞进行细胞因子分泌及对肿瘤细胞的杀伤实验。 [0044] (II)、IFN-γ细胞因子分泌检测：Human IFN-gamma Platinum ELISA(IFN-γELISA检测试剂盒，eBioscience公司)检测CTL细胞分泌的IFN-γ，步骤如下： [0045] 1)将CTL细胞去除细胞因子培养24h后，接种到96孔板内； [0046] 2)细胞中加入刺激对应的多肽再次刺激24h后，离心去除细胞，收集细胞上清； [0047] 3)采用ELISA检测上清中IFN-γ的表达，选择IFN-γ分泌较多的CTL表位肽进行杀伤实验。 [0048] 结果如图2所示，P11和P3、P4、P16负载的DC细胞均能够较好诱导出特异性CTL细胞，分泌较高量的IFN-γ。 [0049] (III)、肿瘤细胞杀伤实验：采用乳酸脱氢酶(LDH)释放检测法，使用CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(细胞毒性检测试剂盒，Promega公司)进行LDH试 验检测细胞杀伤能力。步骤如下： [0050] 1)设立检测培养板(100μL/孔) [0051] a.设立实验组：以PSA阳性表达的前列腺癌细胞LNCap为靶细胞，按效应细胞和靶细胞比为5:1、10:1、20:1加入上述特性CTL细胞 [0052] b.设立效应细胞自发释放组 [0053] c.设立靶细胞自发释放组 [0054] d.设立靶细胞最大释放组 [0055] e.设立背景对照组 [0056] 2)细胞裂解及收获上清 [0057] a.37℃5％CO2共培养5h [0058] b.靶细胞最大释放组中加入裂解液，45min后，所有的孔，250g/min离心收集上清 [0059] 3)LDH检测 [0060] a.转移50μL上清至另一个96孔板 [0061] b.每孔加入50μL稀释的底物混合物，室温避光孵育30min [0062] c.每孔添加50μL终止液 [0063] d.在490nm下检测吸光值OD [0064] 细胞杀伤率计算公式如下： [0065] 杀伤率(％)＝[(OD实验组-OD效应细胞自发释放组-OD靶细胞自发释放组)/(OD靶细胞最大释放组-OD靶细胞自发释放组)]×100％ [0066] 结果如图3所示，图3为本发明实施例1所得P3、P4、P11、P16各自诱导得到的特异性CTL细胞对前列腺癌细胞LNCap杀伤能力对比图；由图3可知，P11诱导的CTL细胞对肿瘤细胞 LNCap杀伤效果最好。 [0067] 2、采用流式分析获得的特异CTL中各种免疫细胞所占的百分比。由图4可知，本发明由P11制备获得的免疫细胞群中含有大量的CTL细胞，同时也含有一定比例的NKT细胞，即 该免疫细胞群具有较好的免疫活性，具有强大的杀伤特定肿瘤细胞的能力。 [0068] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。 |
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