尖吻蝮蛇血凝酶-C |
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| 申请号 | CN201510042881.8 | 申请日 | 2013-02-21 | 公开(公告)号 | CN104593344A | 公开(公告)日 | 2015-05-06 |
| 申请人 | 北京康辰药业股份有限公司; | 发明人 | 孙狄; 王锡娟; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种尖吻蝮蛇血凝酶-C，其是从尖吻蝮蛇蛇毒中分离得到的一种血凝酶，分子量29213.4D，等电点5.7。该酶由α、β两条链构成，链间由二硫键连接，其中α链具有SEQ ID No.1所示的 氨 基酸序列，β链具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明尖吻蝮蛇血凝酶为丝氨酸蛋白酶。本发明丝氨酸蛋白酶是用以下纯化方法获得，包括通过 硫酸 铵分级沉淀预处理去除不溶物及杂蛋白，再通过两次阴离子交换柱层析，收集活性洗脱峰，经 透析 、 超滤 浓缩及脱盐后即得高纯度蛇毒血凝酶，其比活 力 不低于40U/mg蛋白，HPLC分析纯度可达95%以上，以蛇毒原料重量计纯化收得率为0.4%－0.5%。 | ||||||
| 权利要求 | 1.蝮蛇血凝酶-C，该酶由α、β两个亚基构成，其中α亚基具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；β亚基具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。 |
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| 说明书全文 | 尖吻蝮蛇血凝酶-C技术领域[0002] 本发明涉及一种丝氨酸蛋白酶，具体地说是一种蛇毒血凝酶-C，本发明还涉及其分离纯化方法。 背景技术[0003] 据国内外文献的报导，在蝮亚科（Crotalinae）蛇毒中多存在一类与血液凝固相关的蛋白酶，通常称之为“类凝血酶”（thrombin-like enzyme, 简称：TLC）。类凝血酶与凝血酶（thrombin）的作用相似，可以使血浆中纤维蛋白原转化为纤维蛋白而“凝固”。迄今已经发现现已在30多种蛇毒中含有类凝血酶成分，并有20余种得到分离纯化，其中有10余种类凝血酶的全部或部分氨基酸序列得到阐明。已发现的TLC分子量多在29～45kD之间，大多数为酸性糖蛋白。 [0004] 在以往已经发现的蛇毒TLC中，蛋白质一级结构多为单链。其代表产品“立芷雪”（Reptilase）是由巴西矛头蝮蛇（Bothrops atrox）蛇毒中分离出的凝血酶，该酶前体由255个氨基酸构成，N端有24个氨基酸形成的引导肽，活性酶含231氨基酸，相对分子量39～43kD，为单链糖蛋白。翟宁等（上海医药工业研究院&浙江海正药业）2005年报道：从皖南五步蛇（Agkistrodon acutus）中分离到一种“类凝血酶”，具有凝血作用。SDS－PAGE显示为单链，还原和非还原电泳分子量分别为59.25kD和52.58kD，显示存在链内二硫键，比活为41.5/u/mg，苯甲基磺酰氟（PMSF）可导致该酶不可逆失活。 [0005] 近十多年来的研究发现在蝮亚科蛇毒TLC中也存在双链分子结构，链间由二硫键连接。Xin Cheng等（中国科技大学）1999年报导：从五步蛇（Agkistrodon acutus）中分离到一种“类凝血酶”，命名为“Agkisacutacin”。该蛋白由两条肽链构成，α-亚基分子量15kD，β-亚基分子量14kD。Agkisacutacin能够水解纤维蛋白原中的α链。肖昌华（中科院昆明动物研究所）2004年从五步蛇（Agkistrodon acutus）中分离到两种“类凝血酶”，均为双链分子结构。凝血酶Ⅰ的A亚基含有132个氨基酸，分子量16kD；B亚基含有123个氨基酸，分子量14kD，酶比活性为：160U/mg。凝血酶Ⅱ的A亚基含有122个氨基酸，分子量 15kD；B亚基含有120个氨基酸，分子量13kD, 酶比活性为：70U/mg。该两种TLC经药理实验证明：均具有止血功效。唐松山2004年从五步蛇（Agkistrodon acutus）中分离到一种“类凝血酶”，具有凝血作用。该酶由17kD和15kD两个亚基组成，等电点5.9。 [0006] 本发明阐述从我国的广西尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutu)蛇毒中分离得到一种新的蛇毒血凝酶――尖吻蝮蛇血凝酶-C。 发明内容[0007] 本发明的目的在于提供一种蛇毒血凝酶，其是从尖吻蝮蛇蛇毒中分离得到的一种类凝血酶-C。 [0008] 本发明的另一个目的在于提供一种分离纯化上述血凝酶的方法。 [0009] 本发明血凝酶-C是从中国尖吻蝮蛇（Agkistrodon acutus）蛇毒中分离得到的血凝酶。该酶具有如下特征：①酶蛋白含252个氨基酸，分子量为29213.4D，等电点pI为5.7。②由α、β两条链构成，链间由二硫键连接。③α链含129个氨基酸，分子量为14661.7D，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；β链含123个氨基酸，分子量为14551.7D，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。④酶活性可被苯甲基磺酰氟（PMSF)完全抑制，表明其是一种丝氨酸蛋白酶。 [0010] 本发明还提供上述血凝酶的纯化方法，其包括如下步骤：1）、蛇毒经硫酸铵分级沉淀预处理； 2）、将预处理后的蛇毒溶液上经预平衡的DEAE－Sephrose FF阴离子交换层析柱，用 0.01M pH7.0～7.5的PBS洗柱，再用含0.02和0.06M NaCl的0.01M pH7.0～7.5的 PBS分段洗脱，收集0.06M NaCl第一个洗脱峰； 3）、将上述洗脱液适当浓缩后透析或经多次稀释超滤去除NaCl； 4）、将透析后的溶液再次上经预平衡的DEAE－Sephrose FF层析柱，用0.01M pH7.0～ 7.5 的PBS洗柱，再用含0.05M NaCl的0.01M pH7.0～7.5 的PBS洗脱，收集0.05M NaCl洗脱的第二个洗脱峰； 5）、将上述洗脱液适当浓缩后用蒸馏水透析或采用Sephadex-G25柱脱盐。 [0011] 其中，步骤1）蛇毒预处理的方法是将蛇毒用适量预冷的0.01M pH7.0～7.5 PBS溶解，离心收集上清液，硫酸铵分级沉淀，收集70%硫酸铵沉淀，沉淀经PBS悬浮溶解后进行透析(透析袋截留分子量为7,000D~10,000D)，或采用切向流超滤（膜截留分子量为5,000D～10,000D）方法，将悬浮溶解液反复多次稀释、超滤浓缩脱盐。通过预处理可以去除不溶的杂质以及部分杂蛋白，并降低溶液离子强度。 [0012] 具体地说，可通过如下步骤进行蛇毒的预处理：称取蛇毒若干克，用蛇毒重量5~10倍体积预冷的0.01M pH7.0～7.5 的PBS于4~8℃的层析柜中搅拌溶解30~60分钟，向溶解液中缓慢添加硫酸铵至50％饱和度，静置2－4小时，之后于4~8℃、5,000~10,000g离心10~30分钟。收集离心上清液，再向离心上清液中缓慢加入硫酸铵至70％饱和度，静置过夜，次日于4~8℃、5,000~10,000g离心10~30分钟。取离心沉淀加适量0.01M pH7.0～ 7.5的PBS悬浮溶解得溶解液。将溶解液倾入透析袋(截留分子量为7,000D~10,000D)，在层析柜中4~8℃对0.01M pH7.0～7.5的 PBS透析12~24小时，期间更换溶液2~4次；或将溶解液用分子截留值为5,000~10,000D的超滤膜经反复多次加入PBS进行稀释超滤浓缩脱盐。 [0013] 如上所述，透析步骤（取决于溶液体积）可采用切向流超滤（膜截留分子量为5,000~10000D）方法代替，通过PBS稀释、超滤浓缩，再稀释、再超滤浓缩的方式以去除小分子多肽和脱盐降低溶液离子强度。 [0014] 其中，步骤2）和步骤4）可采用0.01M pH7.0～7.5 的PBS预平衡DEAE－Sephrose FF层析柱，然后上样。 [0015] 其中，步骤3）和步骤5）的目的均是去除溶液中存在的NaCl。小体积洗脱液可直接进行透析，大体积洗脱液可通过PBS稀释、超滤浓缩，再稀释、再超滤浓缩的方式以浓缩蛋白并脱去NaCl。最终被纯化的酶浓缩液可直接采用Sephadex-G25柱脱盐。 [0017] 经本发明方法纯化的血凝酶比活力不低于40U/mg蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）一条带，还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（还原SDS-PAGE）两条带；HPLC分析纯度95%以上。以蛇毒原料重量计，本法纯化收得率为0.4%－0.5%。 [0018] 本发明血凝酶具有凝集活性，可制成各种止血药物，例如经适当稀释到规定酶活单位，再添加冻干保护剂（明胶或人血白蛋白等），经病毒膜过滤，冷冻干燥制成医用注射冻干粉针，用于外科手术中止血，以及各种临床出血症状。也可制成创伤外用止血贴剂、粉剂或液体喷雾剂。本发明提供一种新的血凝酶，扩大血凝酶种类，提高蛇毒利用率。附图说明 [0019] 图1 显示纯化后的血凝酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）为一条带（箭头所示）。 [0020] 图2 显示纯化后的血凝酶-C经还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（RD-SDS-PAGE）为两条带（箭头所示），其中M为蛋白分子量标准，1为纯化后的血凝酶-C。 [0021] 图3 显示纯化后的血凝酶-C的HPLC分析结果。 具体实施方式[0023] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 [0024] 本发明中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。本发明中类似“用蛇毒重量10倍体积预冷的”表述，其中的重量和体积的单位分别是g和ml。 [0025] 实施例1 蛇毒血凝酶-C的纯化取20g尖吻蝮蛇蛇毒干粉（批号：20061001，购自广西蛇毒研究所），用蛇毒重量10倍体积预冷的0.01M pH7.4 的磷酸钠盐缓冲液（PBS）于4℃的层析柜中搅拌溶解60分钟，于 4℃、10000g离心10分钟，收集上清液。离心沉淀再次加入蛇毒重量5倍体积预冷的0.01M pH7.4 的PBS搅拌洗涤，再次离心。合并两次离心上清液。在搅拌条件下向离心上清液中缓慢加入硫酸铵至50%饱和度，待硫酸铵完全溶解后再持续搅拌20分钟，4℃下静置4小时，使蛋白沉淀完全。之后将该溶液于4℃、10000g离心20分钟，收集上清液。在搅拌条件下向该上清液中缓慢加入硫酸铵,使硫酸铵饱和度升至70%。待硫酸铵彻底溶解完全，继续搅拌20分钟，4℃静置过夜。次日于4℃、10000g下离心20分钟。弃去上清液，收集沉淀蛋白。沉淀蛋白用80ml 0.01M pH7.4 的PBS溶解后装入透析袋（分子量截至值为10000D）中，用0.01M pH7.4的 PBS进行缓慢搅拌透析，期间每6小时换液一次，共换液3次。透析完成后取出透析液（105ml）。 [0026] 将DEAE-Sephrose FF填料装至Φ3.5cm×30cm柱中，用0.01M 的PBS(pH7.4)平衡柱，待用。 [0027] 将透析液上样到柱上，用0.01M pH7.4 的PBS洗柱。用含0.02M NaCl的0.01M pH7.4的PBS洗脱，再用含0.06M NaCl的0.01M pH7.4 的PBS洗脱，收集洗脱的第一个峰。用含1M NaCl的0.01M pH7.4 的PBS洗柱再生。用0.01M pH7.4 的PBS平衡柱，平衡后待用。 [0028] 经酶活测定（参照附录 或 方法）和电泳分析，目的物出现在0.06M NaCl溶液的洗脱峰中（176ml）。将该洗脱液倾入透析袋中，用0.01M pH7.4 的PBS于4℃透析，期间每6小时更换溶液一次，共换液3次。 [0029] 将透析液上样到柱上，用0.01M pH7.4 的PBS冲洗柱。用含0.05MNaCl的0.01M pH7.4 的PBS洗脱，收集洗脱的第二个峰（145ml）。用含1MNaCl的0.01M pH7.4 的PBS洗柱再生。用0.01M pH7.4 的PBS平衡柱，平衡后待用。 [0030] 经酶活测定（参照附录 或 方法）和电泳分析，目的物出现在0.05M NaCl溶液的第二个洗脱峰中。测定溶液蛋白质浓度为0.64mg/ml。该溶液用无离子水进行透析16小时，期间换液3次。 [0031] 透析溶液中总蛋白质含量为93mg，直接冷冻干燥。冻干粉测定酶比活力为48U/mg蛋白，最终收率0.47%。 PAGE为一条带（见图1），还原SDS－PAGE为两条带（见图2），其分子量分别大致为15kD和14.5kD。HPLC分析纯度97.3％（见图3及表1）。等电聚焦电泳测定该酶等电点pI为5.7。 [0032] 表1 HPLC定量结果采用DENOVO法测定其氨基酸序列，确定两条带的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。α链（SEQ ID No.1）含129个氨基酸，分子量为14661.7Dalton；β链（SEQ ID No.2）含123个氨基酸，分子量为14551.7Dalton。完整血凝酶-C分子量为 29213.4Da。α链和β链间由二硫键连接。 [0033] 实施例2 蛇毒血凝酶-C的纯化取50g尖吻蝮蛇蛇毒干粉（批号：20061101，购自广西蛇毒研究所），用蛇毒重量10倍体积预冷的0.01M pH7.4 的PBS于4℃的层析柜中搅拌溶解60分钟，于4℃、10000g离心10分钟，收集上清液。离心沉淀再次加入蛇毒重量5倍体积预冷的0.01M pH7.4 的PBS搅拌悬浮，再次离心。合并两次离心上清液。在搅拌条件下向离心上清液中缓慢加入硫酸铵至 50%饱和度，待硫酸铵完全溶解后再持续搅拌20分钟，4℃下静置4小时，使蛋白沉淀完全。 之后将该溶液于4℃、10000g离心20分钟，收集上清液。 [0034] 在搅拌条件下向该上清液中缓慢加入硫酸铵,使硫酸铵饱和度升至70%。待硫酸铵彻底溶解完全，继续搅拌20分钟，4℃下静置过夜。次日于4℃、10000g下离心20分钟。弃去上清液，收集沉淀蛋白。沉淀蛋白用200ml的0.01M pH7.4 的PBS溶解，装入透析袋中，用0.01M pH7.4 的PBS进行搅拌透析，每6小时换液一次，共换液3次。透析完成后取出透析液（223ml）。 [0035] DEAE-Sephrose FF填料装至Φ5cm×30cm柱中，用 pH7.4的 0.01M磷酸钠盐缓冲液平衡柱后。将透析液上样。用0.01M pH7.4 的PBS洗柱。用含0.02M氯化钠的0.01M pH7.4 的PBS洗脱。再用含0.06M氯化钠的0.01M pH7.4 的PBS洗脱，收集洗脱的第一个峰（395ml）。用含1M氯化钠的0.01M pH7.4 的PBS洗柱。用0.01M pH7.4 的PBS平衡柱，平衡后待用。 [0036] 经酶活测定（参照附录 或 方法）和电泳分析，目的物出现在0.06M NaCl溶液的洗脱峰中。将该洗脱液倾入透析袋中，用0.01M pH7.4的PBS于4℃透析，期间每6小时换液一次，共换液3次。 [0037] 将透析液上样至柱上。用0.01M pH7.4 的PBS洗柱。用含0.05M NaCl的0.01M pH7.4 的PBS脱柱，收集洗脱的第二个峰（375ml）。用含1M氯化钠的0.01M pH7.4 的PBS洗柱再生。用0.01M pH7.4 的PBS平衡柱。平衡后待用。 [0038] 将该洗脱液倾入透析袋中，用0.01M pH7.4的PBS于4℃透析，期间每6小时换液一次，共换液3次。透析溶液中总蛋白质含量为230mg，直接进行冷冻干燥。冻干粉酶比活力为50U/mg蛋白，最终收率0.46%。PAGE和还原SDS－PAGE以及HPLC色谱图与实施例1相一致，HPLC分析纯度98.1％。 [0039] 实施例3 蛇毒血凝酶-C的纯化称取100克尖吻蝮蛇蛇毒干粉（批号20061101，购自广西蛇毒研究所）用1升预冷的 0.01M pH7.4 的PBS于4－8℃的层析柜中搅拌溶解60分钟， 4℃10000g离心20分钟，收集上清液。离心沉淀再次加入蛇毒重量5倍体积预冷的0.01M pH7.4 的PBS搅拌悬浮，再次离心。合并两次离心上清液。在搅拌条件下向离心上清液中缓慢加入硫酸铵至50%饱和度，待硫酸铵完全溶解后再持续搅拌20分钟，4℃下静置4小时，使蛋白沉淀完全。之后将该溶液于4℃、10000g离心20分钟，收集上清液。在搅拌条件下向该上清液中缓慢加入硫酸铵,使硫酸铵饱和度升至70%。待硫酸铵彻底溶解完全，继续搅拌20分钟后停止搅拌， 4℃静置过夜。次日于4℃、10000g离心20分钟。弃去上清液，收集沉淀蛋白。沉淀蛋白用 400ml的pH7.4的0.01M磷酸钠盐缓冲液溶解，装入透析袋中，用0.01M pH7.4的PBS进行透析，每6小时换液一次，共换液3次。透析完成后取出透析液。 [0040] DEAE-Sephrose FF填料装至Φ7cm×30cm柱中，用 0.01M pH7.4 的PBS平衡柱后。将透析液上样。用0.01M pH7.4 的PBS洗柱。用含0.02MNaCl的0.01M pH7.4 的PBS洗脱，再用含0.06MNaCl的0.01M pH7.4 的PBS洗脱。收集洗脱的第一个峰（876ml）。用含1MNaCl的0.01M pH7.4 的PBS洗柱再生，用0.01M pH7.4 的PBS平衡柱，平衡后待用。 [0041] 经酶活测定（参照附录 或 方法）和电泳分析，目的物出现在0.06M NaCl溶液的2 洗脱峰中。用Millipore Pellicon 2 切向流超滤器（0.1Mcut off 5k膜）将洗脱液超滤浓缩至200ml，再加入预冷的1升0.01M pH7.4的PBS，再超滤至200ml。该超滤浓缩过程循环3次。 [0042] 将超滤浓缩液上样至柱上，用含0.05MNaCl的0.01M pH7.4 的PBS洗脱。收集0.05M NaCl溶液的第二个洗脱峰（810ml）。用含1M NaCl的0.01M pH7.4 的PBS洗柱再生，用0.01M pH7.4 的PBS平衡柱，平衡后待用。 2 将洗脱液用Millipore Pellicon 2 切向流超滤器（0.1Mcut off 5k膜）超滤浓缩至 200ml。将该浓缩液上样至Sephadex-G25柱上，用无离子水洗柱脱盐，收集洗脱峰230ml。 测定该溶液中总蛋白为503mg，比活力为47U/mg蛋白，最终收率0.5%。 [0043] 脱盐收集液PAGE和还原SDS－PAGE以及HPLC色谱图与实施例1相一致。HPLC纯度达97.5％。 [0044] 按脱盐收集液体积加入1%甘露醇、0.5%明胶作为冻干保护剂。滤液分装西林瓶后进行冷冻干燥。 [0045] 实施例4 蛇毒血凝酶-C的丝氨酸蛋白属性实验将实施例1中分离得到的血凝酶-C冻干粉用无离子水溶解，并稀释至酶活性为1U/ml。 [0046] 用生理盐水配制1％的牛纤维蛋白原（Sigma公司）溶液。 [0047] 用异丙醇溶解苯甲基磺酰氟（PMSF，Merck公司），溶液浓度为4mg/ml。 [0048] 实验操作步骤如下：（1） 取1%牛纤维蛋白原溶液2ml，37℃下恒温5分钟。 [0049] （2） 取三支小试管，分别标注1#、2#、3#，每管加入200μl血凝酶溶液。 [0050] （3） 分别向1#试管加入10μl蒸馏水，2#试管加入10μl异丙醇，3#试管加入10μl PMSF，于37℃水浴保温5分钟。 [0051] （4） 按试管编号顺序分别单独进行凝集试验观察。向试管中加入恒温好的1％牛纤维蛋白原溶液200μl，立即计时，同时轻轻摇动混匀，于37℃水浴中静置，观察试管中凝集反应的情况。以溶液白色絮团终止计时。 [0052] 结果见表2表2、PMSF对凝集时间的影响 试管号 1%纤维蛋白原溶液 血凝酶溶液1U/ml 考查内容 凝集时间 1# 200μl 200μl 10μl蒸馏水56秒 2# 200μl 200μl 10μl异丙醇58秒 3# 200μl 200μl 10μl PMSF >600秒 根据表一中的实验结果，得出以下结论：①100ppm浓度的PMSF完全抑制了该血凝酶活性，证明该尖吻蝮蛇血凝酶为丝氨酸蛋白酶。②微量异丙醇对本凝集反应无影响。 [0053] 附录尖吻蝮蛇血凝酶单位定义及活性测定方法 ①牛纤维蛋白原测定法 取生理盐水配制的1.0％牛纤维蛋白原（Sigma公司）溶液1ml置小试管中，37±0.5℃水浴保温3分钟，加入37±0.5℃预热的待测酶溶液1ml，立即计时，纤维蛋白原溶液在120±30秒内振摇出现白色絮团，则该酶溶液为1U/ml。 [0054] ②标准人血浆测定法 取标准人血浆1ml置小试管中，置37℃±0.5℃水浴中预热3分钟，加入37±0.5℃预热的待测酶溶液1ml，立即计时，人血浆在60±20秒内振摇出现白色絮团，则该酶溶液为1U/ml。 [0055] 注：测定未知高酶活性溶液时需用无离子水进行稀释，直至达到1U/ml用于测定；其稀释倍数即为每毫升原酶溶液中的酶活单位数。 |
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