用于治疗前列腺癌的组合物和疫苗

申请号 CN201480046124.1 申请日 2014-08-21 公开(公告)号 CN105517566A 公开(公告)日 2016-04-20
申请人 库瑞瓦格股份公司; 发明人 卡尔-约瑟夫·卡伦; 马里奥拉·福廷-姆莱泽科; 乌尔丽克·格纳德-福格特; 托马斯·兰德尔;
摘要 本 发明 涉及组合物,所述组合物包含至少一种编码能够在 哺乳动物 中诱发(适应性)免疫反应的 抗原 的组合的mRNA,其中所述抗原选自由以下组成的组:PSA( 前列腺特异性抗原 )、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原)、MUC1(黏蛋白1)和PAP(前列腺酸性 磷酸 酶)。本发明还涉及 疫苗 ,所述疫苗包含至少一种编码此种抗原组合的mRNA,并且涉及所述组合物(用于制备疫苗)和/或所述疫苗用于诱发(适应性)免疫反应以用于 治疗 前列腺癌 (PCa),优选地前列腺腺癌,局部限制性前列腺癌,局部晚期前列腺癌,转移的前列腺癌,去势抵抗性( 激素 难治性)前列腺癌,转移的去势抵抗性前列腺癌和非转移的去势抵抗性前列腺癌,和与其相关的 疾病 或病症的用途。最后,本发明涉及 试剂 盒 ,尤其是具有多个部分的试剂盒,其包含所述组合物和/或所述疫苗。
权利要求

1.组合物,所述组合物包含至少一种mRNA,其中所述至少一种mRNA编码以下抗原
·STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原);
·PSA(前列腺特异性抗原),
·PSMA(前列腺特异性膜抗原),
·PSCA(前列腺干细胞抗原);
·PAP(前列腺酸性磷酸酶),和
·MUC1(黏蛋白1),
或其片段,并且其中所述至少一种mRNA是单顺反子的、双顺反子的或多顺反子的。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中所述抗原或其片段中的每个由单独的mRNA编码。
3.根据权利要求1所述的组合物,其中STEAP、PSA、PSMA、PSCA、PAP和MUC1或其片段由一种mRNA编码。
4.根据权利要求1所述的组合物,其中所述抗原或其片段由至少一种双顺反子和/或多顺反子mRNA编码。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物,其中至少一种mRNA,优选地至少两种
mRNA,更优选地至少三种mRNA,甚至更优选地至少四种mRNA,甚至更优选地至少五种mRNA,或甚至更优选地至少六种mRNA,各自包含至少一种编码序列,所述编码序列选自与SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17或87的RNA序列相同或至少80%相同的RNA序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物,其中至少一种mRNA包含编码序列,所述编码序列包含与SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17或87的RNA序列相同或至少80%相同的RNA序列或由其组成。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物,其中所述至少一种mRNA是修饰的mRNA,尤其是稳定化的mRNA。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物,其中,相比于野生型mRNA的编码区的G/C含量,所述至少一种mRNA的编码区的G/C含量增加,相比于野生型mRNA的编码的基酸序列,所述至少一种mRNA的编码的氨基酸序列优选地没有被改变。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物,其中至少一种mRNA包含编码序列,所述编码序列包含与SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、82、83、84或85的RNA序列相同或至少80%相同的RNA序列或由其组成。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物,其中所述至少一种mRNA包含5'帽结构和/或3’UTR包含聚腺苷酸尾,所述聚腺苷酸尾优选具有10至200,10至100,40至80或50至70个腺苷核苷酸,和/或3’UTR包含聚胞苷酸尾,所述聚胞苷酸尾优选地具有10至200,10至
100,20至70,20至60或10至40个胞嘧啶核苷酸。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物,其中所述至少一种mRNA包含3’UTR,所述3’UTR包含(在5’至3’方向上)以下元件:
a)来源于α-球蛋白基因如人α-球蛋白基因的3’UTR的中心α-复合物结合部分的3’-UTR,优选地根据SEQ ID NO:69的3’-UTR:
b)聚腺苷酸尾,其优选地由10至200、10至100、40至80或50至70个腺苷核苷酸组成,和c)聚胞苷酸尾,其优选地由10至200、10至100、20至70、20至60或10至40个胞嘧啶核苷酸组成。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物,所述组合物包含六种mRNA,其中每种mRNA编码不同的抗原,所述抗原选自由以下组成的组:STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原)、PSA(前列腺特异性抗原)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、PAP(前列腺酸性磷酸酶)和MUC1(黏蛋白1),并且其中优选地每种mRNA包含RNA序列,所述RNA序列与选自根据SEQ ID NO:1、4、7、10、13和16的RNA序列的RNA序列相同或至少80%相同。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物,其中所述至少一种mRNA包含3’UTR,所述3’UTR包含(在5’至3’方向上)以下元件:
a)聚腺苷酸尾,所述聚腺苷酸尾优选地由10至200,10至100,40至80或50至70个腺苷核苷酸组成,
b)聚胞苷酸尾,所述聚胞苷酸尾优选地由10至200,10至100,20至70,20至60或10至40个胞嘧啶核苷酸组成,和
c)组蛋白茎-环。
14.根据权利要求13所述的组合物,其中所述组蛋白茎-环由完全或部分反向互补的两个相邻序列的分子内配对形成。
15.根据权利要求13至14中任一项所述的组合物,其中所述组蛋白茎-环中的环的长度为3至15个碱基,优选为3至10,3至8,3至7,3至6,4至5或4个碱基。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的组合物,其中形成所述组蛋白茎-环中的茎区的序列的长度为5至10个碱基,优选为5至8个碱基。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的组合物,其中所述至少一种mRNA的3’UTR包含至少一种组蛋白茎-环,所述组蛋白茎-环选自以下式(I)或(II):
式(I)(不具有茎分界元件的茎-环序列):
式(II)(具有茎分界元件的茎-环序列):
其中:
茎1或茎2分界元件N1-6是1至6,优选地2至6,更优选地2至5,甚至更优选地3至5,最优选地4至5或5个N的连续序列,其中每个N彼此独立地选自:选自A、U、T、G和C的核苷酸,或其核苷酸类似物;
茎1[N0-2GN3-5]与元件茎2反向互补或部分反向互补,并且是5至7个核苷酸的连续序列;
其中N0-2是0至2,优选地0至1,更优选地1个N的连续序列,其中每个N彼此独立地选自:
选自A,U,T,G和C的核苷酸或其核苷酸类似物;
其中N3-5是3至5,优选地4至5,更优选地4个N的连续序列,其中每个N彼此独立地选自:
选自A、U、T、G和C的核苷酸或其核苷酸类似物,并且
其中G是苷或其类似物,并且可以任选地被胞苷或其类似物代替,前提是其在茎2中的互补核苷酸胞苷被鸟苷代替;
环序列[N0-4(U/T)N0-4]位于元件茎1和茎2之间,并且是3至5个核苷酸,更优选地4个核苷酸的连续序列;
其中每个N0-4彼此独立地是0至4,优选地1至3,更优选地1至2个N的连续序列,其中每个N彼此独立地选自:选自A、U、T、G和C的核苷酸或其核苷酸类似物;并且
其中U/T表示尿苷,或任选地胸苷;
茎2[N3-5CN0-2]与元件茎1反向互补或部分反向互补,并且是5至7个核苷酸的连续序列;
其中N3-5是3至5,优选地4至5,更优选地4个N的连续序列,其中每个N彼此独立地选自:
选自A、U、T、G和C的核苷酸或其核苷酸类似物;
其中N0-2是0至2,优选地0至1,更优选地1个N的连续序列,其中每个N彼此独立地选自:
选自A、U、T、G和C的核苷酸或其核苷酸类似物;并且
其中C是胞苷或其类似物,并且可以任选地被鸟苷或其类似物代替,前提是其在茎1中的互补核苷酸鸟苷被胞苷代替;
其中
茎1和茎2能够彼此碱基配对
形成反向互补序列,其中碱基配对可以发生在茎1和茎2之间,或
形成部分反向互补序列,其中不完全的碱基配对可以发生在茎1和茎2之间。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的组合物,其中所述至少一种组蛋白茎-环选自以下式(Ia)或(IIa)中的至少一种:
式(Ia)(不具有茎分界元件的茎-环序列):
式(IIa)(具有茎分界元件的茎-环序列):
19.根据权利要求13至18中任一项所述的组合物,其包含根据SEQ ID NO:25至66的组蛋白茎环核苷酸序列中的任一个,优选根据SEQ ID NO.70的核苷酸序列,并且最优选根据SEQ ID NO.71的RNA序列。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物,其中所述至少一种mRNA包含至少一种与根据SEQ ID NO:19至24的RNA序列中任一个的RNA序列相同或至少80%相同的mRNA。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的组合物,所述组合物包含六种mRNA,其中每种mRNA编码不同的抗原,所述抗原选自由以下组成的组:STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原)、PSA(前列腺特异性抗原)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、PAP(前列腺酸性磷酸酶)和MUC1(黏蛋白1)并且每种mRNA与选自根据SEQ ID NO:19、20、21、22、23或24的RNA序列的RNA序列相同或至少80%相同。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的组合物,所述组合物包含六种mRNA,其中一种mRNA编码PSA并且与SEQ ID NO:19相同或至少80%相同,一种mRNA编码PSMA并且与SEQ ID NO:20相同或至少80%相同,一种mRNA编码PSCA并且与SEQ ID NO:21相同或至少80%相同,一种mRNA编码STEAP并且与SEQ ID NO:22相同或至少80%相同,一种mRNA编码PAP并且与SEQ ID NO:23相同或至少80%相同并且一种mRNA编码MUC1并且与SEQ ID NO:24相同或至少80%相同。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物,其中所述至少一种mRNA与一种或多种聚阳离子复合,优选地与鱼精蛋白或oligofectamine复合,最优选地与鱼精蛋白复合。
24.根据权利要求23所述的组合物,其中所述至少一种mRNA与所述一种或多种聚阳离子的N/P比为约0.1至10,包括约0.3至4,约0.5至2,约0.7至2和约0.7至1.5。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的组合物,其包含:至少一种与一种或多种聚阳离子复合的mRNA和至少一种游离mRNA。
26.根据权利要求25所述的组合物,其中所述复合的mRNA与所述游离mRNA相同。
27.根据权利要求25或26所述的组合物,其中所述复合的mRNA与所述游离mRNA的摩尔比选自约0.001:1至约1:0.001的摩尔比,包括约1:1的比率。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的组合物,其中所述组合物另外地包含至少一种佐剂。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的组合物,其中所述至少一种佐剂选自由以下组成的组:
阳离子或聚阳离子化合物,包括阳离子或聚阳离子肽或蛋白质,包括鱼精蛋白,核仁蛋白,精胺或亚精胺,聚-L-赖氨酸(PLL),聚-精氨酸,碱性多肽,细胞渗透性肽(CPP),包括HIV结合肽,Tat,HIV-1 Tat(HIV),Tat 衍生的肽,穿透肽,VP22衍生的或类似物肽,HSV VP22(单纯疱疹),MAP,KALA或蛋白质转导结构域(PTD,PpT620,富脯氨酸的肽,富精氨酸的肽,富赖氨酸的肽,MPG-肽,Pep-1,L-低聚物,降素肽,触衍生的肽(尤其是来自果蝇触角的),pAntp,pIsl,FGF,乳蛋白,转运素,Buforin-2,Bac715-24,SynB,SynB(1),pVEC,hCT衍生的肽,SAP,鱼精蛋白,精胺,亚精胺,或组蛋白,阳离子多糖,包括脱乙酰壳多糖,聚凝胺,阳离子聚合物,包括聚乙烯亚胺(PEI),阳离子脂质,包括DOTMA:1-(2,3-二油酰基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵,DMRIE,二-C14-脒,DOTIM,SAINT,DC-Chol,BGTC,CTAP,DOPC,DODAP,DOPE:二油酰磷脂酰乙醇胺,DOSPA,DODAB,DOIC,DMEPC,DOGS:双十八烷基酰胺甘氨酰精胺,DIMRI:双十四酰氧基丙基二甲基羟乙基溴化铵,DOTAP:二油酰-3-(三甲胺基)丙烷,DC-6-
14:O,O-双十四烷酰基-N-(-三甲胺基乙酰基)二乙醇胺氯化物,CLIP1:外消旋-(2,3-双十八烷氧基丙基)(2-羟乙基)-二甲基氯化铵,CLIP6:外消旋-2(2,3-双十六烷氧基丙基-氧基甲氧基)乙基三甲基铵,CLIP9:外消旋-2(2,3-双十六烷氧基丙基-氧基琥珀酰氧基)乙基-三甲基铵,oligofectamine,或阳离子或聚阳离子聚合物,包括改性聚氨基酸,包括-氨基酸-聚合物或反向的聚酰胺,改性聚乙烯,包括PVP(聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶)),改性丙烯酸酯,包括pDMAEMA(聚(二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)),改性酰胺胺,包括pAMAM(聚(酰胺胺)),改性聚β氨基酯(PBAE),包括二胺末端改性1,4丁二醇二丙烯酸酯-共-5-氨基-
1-戊醇聚合物,树状聚合物,包括聚丙胺树状聚合物或pAMAM系树状聚合物,聚亚胺,包括PEI:聚(乙烯亚胺),聚(丙烯亚胺),聚烯丙胺,糖主链系聚合物,包括环糊精系聚合物,葡聚糖系聚合物,脱乙酰壳多糖,等,烷主链系聚合物,如PMOXA-PDMS共聚物,等,由一种或多种选自如之前提及的阳离子聚合物的阳离子嵌段和一种或多种亲或疏水嵌段(例如聚乙二醇)的组合组成的嵌段聚合物;

阳离子或聚阳离子蛋白质或肽,其选自具有以下总式(III)的以下蛋白质或肽:(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x,其中l+m+n+o+x=8-15,并且l、m、n或o可以彼此独立地是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的任何数,前提是Arg、Lys、His和Orn的总含量占寡肽的所有氨基酸的至少50%;并且Xaa可以是任何选自天然(=天然存在的)或非天然氨基酸的氨基酸,除了Arg、Lys、His或Orn之外;并且x可以是选自0、1、2、3或4的任何数,前提是Xaa的总含量不超过寡肽的所有氨基酸的50%;或
核酸,所述核酸具有式(IV):GlXmGn,其中:G是鸟苷,尿嘧啶或鸟苷或尿嘧啶的类似物;
X是鸟苷,尿嘧啶,腺苷,胸苷,胞嘧啶或上述核苷酸的类似物;l是1至40的整数,其中当l=1时,G是鸟苷或其类似物,当l>1时,至少50%的核苷酸是鸟苷或其类似物;m是整数并且至少是3;其中当m=3时,X是尿嘧啶或其类似物,当m>3时,出现至少3个连续的尿嘧啶或尿嘧啶的类似物;n是1至40的整数,其中当n=1时,G是鸟苷或其类似物,当n>1时,至少50%的核苷酸是鸟苷或其类似物;

核酸,所述核酸具有式(V):ClXmCn,其中:C是胞嘧啶,尿嘧啶或胞嘧啶或尿嘧啶的类似物;X是鸟苷,尿嘧啶,腺苷,胸苷,胞嘧啶或上述核苷酸的类似物;l是1至40的整数,其中当l=1时,C是胞嘧啶或其类似物,当l>1时,至少50%的核苷酸是胞嘧啶或其类似物;m是整数并且至少是3;其中当m=3时,X是尿嘧啶或其类似物,当m>3时,出现至少3个连续的尿嘧啶或尿嘧啶的类似物;n是1至40的整数,其中当n=1时,C是胞嘧啶或其类似物,当n>1时,至少
50%的核苷酸是胞嘧啶或其类似物。
30.疫苗,所述疫苗包含根据权利要求1至29中任一项所述的组合物。
31.根据权利要求30所述的疫苗,其中根据权利要求1至29中任一项所述的组合物引起适应性免疫反应。
32.根据权利要求30或31所述的疫苗,其中所述疫苗还包含药用载体。
33.根据权利要求30至32中任一项所述的疫苗,其中所述组合物的至少一种mRNA被单独地施用于受试者。
34.根据权利要求1至29中任一项所述的组合物,其用作疫苗,所述疫苗用于治疗前列腺癌(PCa),优选地前列腺腺癌,局部限制性前列腺癌,局部晚期前列腺癌,转移的前列腺癌,去势抵抗性(激素难治性)前列腺癌,转移的去势抵抗性前列腺癌和非转移的去势抵抗性前列腺癌,和与其相关的疾病或病症。
35.六种mRNA的组合用于治疗前列腺癌的用途,其中每种mRNA编码一种抗原,所述抗原选自由以下组成的组:STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原)、PSA(前列腺特异性抗原)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、PAP(前列腺酸性磷酸酶)和MUC1(黏蛋白1)。
36.根据权利要求35所述的用途,其中
一种mRNA包含编码序列,所述编码序列编码PSA并且包含与SEQ ID NO:2、3或82的RNA序列相同或至少80%相同的RNA序列或由其组成;
一种mRNA包含编码序列,所述编码序列编码PSMA并且包含与SEQ ID NO:5、6或83的RNA序列相同或至少80%相同的RNA序列或由其组成;
一种mRNA包含编码序列,所述编码序列编码PSCA并且包含与SEQ ID NO:8、9或84的RNA序列相同或至少80%相同的RNA序列或由其组成;
一种mRNA包含编码序列,所述编码序列编码STEAP并且包含与SEQ ID NO:11、12或85的RNA序列相同或至少80%相同的RNA序列或由其组成;
一种mRNA包含编码序列,所述编码序列编码PAP并且包含与SEQ ID NO:14或15的RNA序列相同或至少80%相同的RNA序列或由其组成;
一种mRNA包含编码序列,所述编码序列编码MUC1并且包含与SEQ ID NO:17、18或87的RNA序列相同或至少80%相同的RNA序列或由其组成。
37.根据权利要求35或36中任一项所述的用途,其中至少一种mRNA在3’UTR区中包含组蛋白茎-环。
38.根据权利要求35至37中任一项所述的用途,其中每种mRNA包含与根据SEQ ID NO:
19至24的RNA序列中的不同的一个相同或至少80%相同的RNA序列。
39.根据权利要求35至38中任一项所述的用途,包含六种mRNA,其中一种mRNA编码PSA并且与SEQ ID NO:19相同或至少80%相同,一种mRNA编码PSMA并且与SEQ ID NO:20相同或至少80%相同,一种mRNA编码PSCA并且与SEQ ID NO:21相同或至少80%相同,一种mRNA编码STEAP并且与SEQ ID NO:22相同或至少80%相同,一种mRNA编码PAP并且与SEQ ID NO:23相同或至少80%相同并且一种mRNA编码MUC1并且与SEQ ID NO:24相同或至少80%相同。
40.根据权利要求35至39中任一项所述的用途,其中所述六种mRNA中的每种被分开施用。
41.根据权利要求35至40中任一项所述的用途,其中所述mRNA通过皮内注射施用。
42.根据权利要求35至41中任一项所述的用途,其中所述治疗由以下辅助:辅助疗法,例如前列腺手术,放疗,激素疗法和/或化疗。
43.试剂盒,优选地具有多个部分的试剂盒,其包含根据权利要求1至29中任一项所述的组合物,和/或根据权利要求30至33中任一项所述的疫苗,和任选地用于增溶的液体载体和任选地技术说明书,所述技术说明书具有关于所述活性组合物和/或所述疫苗的施用和剂量的信息。
44.根据权利要求43所述的试剂盒,其中所述试剂盒是具有多个部分的试剂盒并且所述试剂盒的各部分包含至少一种mRNA,所述mRNA优选地编码不同的选自权利要求1中所限定的抗原的抗原,所述具有多个部分的试剂盒的所有部分形成在前权利要求的组合物或疫苗。
45.根据权利要求43或44所述的试剂盒,其中所述试剂盒包含:含有六种mRNA的至少两个部分。
46.根据权利要求43至45中任一项所述的试剂盒,其中全部六种mRNA都以冻干形式被提供在分开的部分中。
47.根据权利要求43至46中任一项所述的试剂盒,其中所述试剂盒包含乳酸林格氏液作为一部分。
48.根据权利要求43至47中任一项所述的试剂盒,其中所述试剂盒包含六个部分,各部分包含所述六种mRNA中的一种。

说明书全文

用于治疗前列腺癌的组合物和疫苗

发明领域

[0001] 本发明涉及组合物,所述组合物包含至少一种编码能够在哺乳动物中诱发(适应性)免疫反应的抗原的组合的mRNA,其中所述抗原选自由以下组成的组:PSA(前列腺特异性抗原)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原)、MUC1(黏蛋白1)和PAP(前列腺酸性磷酸酶)。本发明还涉及疫苗,所述疫苗包含至少一种编码此种抗原组合的mRNA,并且涉及所述组合物(用于制备疫苗)和/或所述疫苗用于诱发(适应性)免疫反应以用于治疗前列腺癌(PCa),优选地前列腺腺癌,局部限制性前列腺癌,局部晚期前列腺癌,转移的前列腺癌,去势抵抗性(激素难治性)前列腺癌,转移的去势抵抗性前列腺癌和非转移的去势抵抗性前列腺癌,和与其相关的疾病或病症的用途。最后,本发明涉及试剂盒,尤其是涉及具有多个部分的试剂盒(kit of parts),所述试剂盒包含所述组合物和/或所述疫苗。
[0002] 发明背景
[0003] 目前,在全世界发达国家中,前列腺癌是男性中第二常见的被诊断的癌症并且是第四靠前的癌症相关死亡的原因。有效的祛病治疗形式在变弱,并且目前仅可用于局部疾病。在激素难治性(去势抵抗性;去势难治性)前列腺癌中,无药剂被证明延长存活超过约1年(参见例如Pavlenko,M.,A.K.Roos等(2004)."A phase I trial of DNA vaccination with a plasmid expressing prostate-specific antigen in patients with hormone-refractory prostate cancer(在患有激素难治性前列腺癌的患者中利用表达前列腺特异性抗原的质粒进行DNA接种的I期试验)."Br J Cancer 91(4):688-94.)。在一些高度发达的西方国家(如美国),前列腺癌目前甚至分别是美国(参见例如Jemal,A.,R.Siegel等(2006)."Cancer statistics,2006(癌症统计,2006)."CA Cancer J Clin 56(2):106-30.)和欧洲(参见例如Thomas-Kaskel,A.K.,C.F.Waller等(2007)."Immunotherapy with dendritic cells for prostate cancer(利用树突细胞的用于前列腺癌的免疫疗法)."Int J Cancer 121(3):467-73)男性中最常见的被诊断的恶性肿瘤并且是第三靠前的癌症相关死亡的原因。大部分被诊断的肿瘤是腺癌,其最初以依赖激素的方式增生。
[0004] 前列腺癌是这样的疾病,其中癌症在前列腺(男性生殖系统中的腺体)中成长。其在前列腺细胞变异并且开始失去控制地增殖时发生。与正常对应物相比被证明由前列腺细胞过表达的典型的抗原尤其有抗原如PSA、PSMA、PAP、PSCA、HER-2和Ep-CAM。这些前列腺癌细胞可以从前列腺扩散(转移)至身体的其他部分,尤其是骨和淋巴结。前列腺癌会引起疼痛,排尿困难,勃起功能障碍和其他症状。典型地,前列腺癌最常在五十岁以上的男性中发展,五十岁以上的男性代表了最常见的患者群体。然而,即使确定将是可能的,但在大部分情况中前列腺癌仍然是未被发现的。前列腺癌的确定典型地通过身体检查或通过血液筛选试验如PSA(前列腺特异性抗原)测试产生。当怀疑是前列腺癌时,此癌症典型地通过去除一前列腺(活检)并且将其在显微镜下检查来确认。可以进行进一步的测试如X射线和骨扫描来确定前列腺癌是否已经扩散。
[0005] 前列腺癌的治疗仍然是未解决的挑战。常规治疗方法可以应用于治疗前列腺癌,如手术,放射疗法,激素疗法,偶尔地化疗,质子疗法,或这些的一些组合。然而,男性的年龄和基础健康以及扩散的程度,显微镜下的外观,以及癌症对初步治疗的反应在该疾病的结果确定中是重要的。因为前列腺癌是典型地在老年男性中被诊断的疾病,所以很多人在缓慢进展的前列腺癌可以扩散或引起症状前将死于其他病因。这使得治疗选择困难。是否以治愈目的治疗局部的前列腺癌(包含在前列腺内的肿瘤)的决定在预期的在患者存活和生活品质方面的有利和有害作用之间被权衡。
[0006] 然而,以上治疗方法,如手术、放射疗法、激素疗法和化疗等,都有严重的限制。例如,手术去除前列腺,或前列腺切除术,是用于早期前列腺癌或对放疗不起反应的癌症的常见疗法。其可能引起显著改变生活品质的神经损伤。最常见的严重并发症有排尿控制丧失和阳痿。然而,即使可以成功去除前列腺癌,前列腺癌在整个生物体内的扩散仍然是未解决的问题。
[0007] 放射疗法常用于前列腺癌治疗。其可以替代手术用于早期癌症,并且其也可以用于前列腺癌的晚期阶段以治疗令人痛苦的骨转移瘤。当单独的放射疗法较不可能治愈癌症时,放射治疗也可以与激素疗法组合以用于中间险疾病。然而,放射疗法也具有高的风险并且由于破坏患者的免疫系统而常导致免疫防御的完全丧失。此外,放射疗法被典型地局部应用于癌症生长部位并且因此不能避免上述的前列腺癌扩散到整个生物体的问题。如果全身应用,则放射疗法可能导致对细胞和免疫系统的严重破坏。
[0008] 对于前列腺癌,化疗被认为是一种有效性较低的类型的治疗,因为甚至仅有非常少的患者对此类疗法有反应。然而,一些具有转移的前列腺癌的患者(反应者)可能受益于化疗。反应率为约20%并且因此化疗将在肿瘤复发并且激素疗法失败的治疗期间起作用。然而,化疗典型地仅是缓解性的而不能导致前列腺癌在患者中完全消除。典型的化疗剂包括环磷酰胺(cyclophosphamid)、多柔比星(doxorubicin)、5-氟脲嘧啶(5-fluoruracil)、阿霉素(adriamycin)、舒拉明(suramin)和其他药剂,然而,这些中没有一种导致明显更长的患者存活。在更新的研究(2004年发表于New England Journal of Medicine)中,显示接受每三周一次的药剂多西他赛(docetaxel)的剂量的患者具有中值2.5个月的更长存活(Tannock IF等Docetaxel plus prednisone or mitoxantrone plus prednisone for advanced prostate cancer(多西他赛加泼尼松或米托蒽醌加泼尼松用于晚期前列腺癌).N Engl J Med.2004Oct 7;351(15):1502-12)。
[0009] 激素疗法典型地使用药物或激素疗法与手术的组合来阻止前列腺癌细胞获得二氢睾(DHT),二氢睾酮是一种在前列腺中产生并且为前列腺癌细胞生长和扩散所需的激素。阻断DHT通常导致前列腺癌停止生长并且甚至萎缩。然而,激素疗法很少治愈前列腺癌,因为最初对激素疗法有反应的癌症典型地在一至两年后变得有抗性。例如缓解性的雄激素剥夺疗法可以在多达80%的患者中产生缓解,但是在15-20个月后,肿瘤细胞变得对激素不敏感并且不依赖雄激素的前列腺癌发展。在此情况中,治疗选择很少,因为化疗具有的效有限(见以上)。因此通常在癌症已经自前列腺扩散时使用激素疗法。其也可以被给予进行放射疗法或手术以帮助防止其癌症复发的某些男性。
[0010] 基于III期试验的中间分析的结果(ClinicalTrials.gov ID NCT00887198),乙酸阿比特龙(Abiraterone acetate)/泼尼松(prednisone)在欧洲和美国被批准用于治疗患有去势难治性前列腺癌的未接受过化疗(chemonaive)的患者,因为其相比于安慰剂/泼尼松对照,显著延长无进展存活及其他第二端点。虽然存在提高整体存活的趋势,但该差异在统计学上并不显著(Ryan C.J.等(2013).Abiraterone in metastatic prostate cancer without previous chemotherapy(阿比特龙在之前没有进行化疗的转移的前列腺癌中).N Engl J Med.Jan 10;368(2):138-48.)。
[0011] 患者一发展出其疾病症状,就推荐开始化疗(优选地利用多西他赛)。在此情况中,另外的治疗选项有对令人痛苦的骨转移瘤进行放射或利用寻骨(bone-seeking)放射性同位素如锶-89或钐-153或镭223-氯化物(alpharadin)来治疗。
[0012] 在该疾病在利用多西他赛的治疗期间进展后,继续治疗,新的抗激素剂恩杂鲁胺(enzalutamide)(Scher H.I.等(2012).Increased survival with enzalutamide in prostate cancer after chemotherapy(在化疗后的前列腺癌中利用恩杂鲁胺提高存活).N Engl J Med.Sep 27;367(13):1187-97),乙酸阿比特龙/泼尼松(de Bono,J.S.等(2011).Abiraterone and increased survival in metastatic prostate cancer(阿比特龙和在转移的前列腺癌中的增加的存活).N.Engl.J.Med.364:1995-2005),或新的紫杉烷卡巴他赛(cabazitaxel)/泼尼松(Yap等(2011).The changing therapeutic landscape of castration-resistant prostate cancer(去势抵抗性前列腺癌的改变的治疗前景).Nat Rev Clin Oncol.8:597-610)是进一步被批准的治疗选项,其在III期试验中已经显示存活益处-然而这些治疗中没有一个能够产生长期存活并且化疗剂具有相当大的副作用。迫切地需要能够延长可用治疗的作用而不增加较大毒性的新的治疗选项。
[0013] 作为一种方法,以上讨论的用于器官限制性(organ-confined)前列腺癌的标准疗法,包括根治性前列腺切除术或放射疗法如外部(光束)照射和近距离放射疗法在某些情况下也可以结合新辅助或辅助激素疗法(参见例如Totterman,T.H.,A.Loskog等(2005)."The immunotherapy of prostate and bladder cancer(前列腺和膀胱癌的免疫疗法)."BJU Int 96(5):728-35.)。虽然这些疗法在短期内相对有效,但很大部分(30-40%)的最初具有局部疾病的患者将最终复发。对于转移的前列腺癌,主要的疗法是雄激素剥夺。虽然这通常导致细胞减少和缓解,但进展至激素难治性疾病典型地在14-20个月内发生。在化疗领域已经报道了很多针对晚期不依赖雄激素的前列腺癌的临床研究。仅最近的两个试验揭示了化疗或多或少地提高患有激素难治性(去势抵抗性)疾病的患者的总体存活。
[0014] 综上所述,标准技术如以上提及的手术、放射疗法、激素疗法、偶尔地化疗、质子疗法等,如果单独应用,并不表现出适用于有效治疗前列腺癌(PCa)。一种改进的治疗方式可以因此包括此种标准技术(但是要与其他方法相结合)。根据本发明,提议适应性免疫系统作为用于前列腺癌(PCa)的治疗或补充治疗的方法。
[0015] 如本领域中已知的,免疫系统在多种疾病的治疗和预防中发挥重要作用。根据现阶段的知识,哺乳动物提供多种机制以通过识别并杀死例如肿瘤细胞来保护生物体。对于本发明来说,这些肿瘤细胞需要被检测到并与生物体的正常(健康)细胞和组织相区别。
[0016] 脊椎动物如人的免疫系统由多种类型的蛋白质、细胞、器官和组织组成,这些蛋白质、细胞、器官和组织在精巧且动态的网络中相互作用。作为此复杂的免疫反应的部分,脊椎动物系统随时间而适应于更有效地识别特定的病原体或肿瘤细胞。适应过程产生免疫记忆并允许在未来遭遇时甚至更有效的保护。该适应性或获得性免疫过程形成接种策略的基础。
[0017] 适应性免疫系统是抗原特异性的并且需要在被称为抗原递呈的过程期间识别特定的“自我”或“非我”抗原。抗原特异性允许产生这样的反应,所述反应适合特定的病原体或病原体感染的细胞或肿瘤细胞。在身体中通过所谓的“记忆细胞”来保持发动这些特制的反应的能力。当病原体感染身体超过一次时,则这些特定的记忆细胞被用于快速地将其消灭。适应性免疫系统因此允许更强的免疫反应以及免疫记忆,其中每种病原体或肿瘤细胞被一种或多种特征抗原“记得”。
[0018] 脊椎动物中的适应性免疫系统的主要组件主要包括细胞平上的淋巴细胞和分子水平上的抗体。淋巴细胞作为适应性免疫系统的细胞组件包括B细胞和T细胞,其来源于骨髓中的造血干细胞。B细胞参与体液反应,而T细胞参与细胞介导的免疫反应。B细胞和T细胞两者都带有识别特定靶标的受体分子。T细胞仅在抗原(例如病原体的小片段)已被加工并与被称为主要组织相容性复合物(MHC)分子的“自我”受体结合地递呈之后识别“非我”靶标,如病原靶结构。与此对比,B细胞抗原特异性受体是B细胞表面上的抗体分子,并且在其表面上的抗体与特异的外源抗原结合时同样识别病原体。此抗原/抗体复合物被B细胞吸收并通过蛋白水解被加工成肽。然后,B细胞将这些抗原肽展示在其表面MHC II类分子上。MHC和抗原的此种组合吸引匹配的辅助T细胞,T细胞释放淋巴因子并激活B细胞。然后,当激活的B细胞开始分裂时,其后代分泌数百万拷贝的识别该抗原的抗体。这些抗体在血浆和淋巴中循环,与表达所述抗原的病原体或肿瘤细胞结合并将其标记为通过补体激活毁灭或通过吞噬细胞摄入和毁灭。作为适应性免疫系统的细胞组件,细胞毒性T细胞(CD8+)还可以形成CTL-应答。细胞毒性T细胞(CD8+)可以识别来自内源病原体的肽和由MHC I类分子结合的自我抗原。CD8+-T细胞通过释放细胞毒性蛋白质来执行其杀伤功能。
[0019] 免疫系统的机制可以因此形成多种疾病的祛病疗法的靶标。适合的方法通常是基于施用佐剂以引起先天免疫反应或是基于施用抗原或免疫原以引起适应性免疫反应。因为抗原通常是基于病原体的特定组分(例如表面蛋白质)或其片段,所以同样预期向患者施用核酸(之后是所需多肽、蛋白质或抗原的表达)。
[0020] 目前,去势抵抗性前列腺癌是仅有的其中被设计成引起特异性免疫反应的主动免疫疗法已经基于在整体存活方面的显著延长而被批准的癌症适应证。Sipuleucel-T一种由用由前列腺癌相关抗原PAP和佐剂GM-CSF组成的融合蛋白脉冲处理的(pulsed)自体抗原递呈细胞组成的主动免疫疗法,已被证明在招募512名患者的III期试验中在患有无症状的或最小症状的去势抵抗性前列腺癌的患者中相比于安慰剂延长存活达中值4.1个月(25.8vs 21.7mo;p=0.03)。基于这些结果,sipuleucel-T已在2010年被FDA批准用于治疗该患者群体(Kantoff,P.,Higano,C.,Shore,N.,Berger,E.R.,Small,E.J.等(2010).Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer(用于去势抵抗性前列腺癌的Sipuleucel-T免疫疗法).N.Engl.J.Med.363:411-422)。
[0021] 作为另一个实例,在Noguchi等(2003)和(2004)(参见例如Noguchi,M.,K.Itoh等(2004)."Phase I trial of patient-oriented vaccination in HLA-A2-positive patients with metastatic hormone-refractory prostate cancer(在患有转移的激素难治性前列腺癌的HLA-A2阳性患者中的患者定向接种的I期试验)."Cancer Sci 95(1):77-84;和Noguchi,M.,K.Kobayashi等(2003)."Induction of cellular and humoral immune responses to tumor cells and peptides in HLA-A24positive hormone-refractory prostate cancer patients by peptide vaccination(通过肽接种在HLA-A24阳性激素难治性前列腺癌患者中引起对肿瘤细胞和肽的细胞和体液免疫反应)."Prostate 57(1):80-92.)中已经进行了基于已知前列腺相关抗原的接种研究。Noguchi等(2003)和(2004)进行了两个I期研究,其中在转移的激素抵抗性(去势抵抗性)前列腺癌患者中接种的多肽试验显示对所选的靶标的增加的细胞以及体液免疫反应。该接种策略是安全的,被良好耐受的,并且没有较大的毒性作用。还观察到前列腺特异性抗原(PSA)水平的稳定或下降并且仅一名患者显示骨转移瘤消失。使其难以用于临床应用的该方法的主要限制在于需要事先了解患者的HLA单体型以及前列腺癌细胞的肽表达。
[0022] 近来其他的一些方法利用基于细胞的接种策略,例如在接种策略中使用不同抗原或使用载有不同抗原或其片段的树突细胞。根据一个实例,已在临床试验中利用用重组人PSA脉冲处理的自体树突细胞测试了前列腺癌患者的接种(参见例如Barrou,B.,G.Benoit等(2004)."Vaccination of prostatectomized prostate cancer patients in biochemical relapse,with autologous dendritic cells pulsed with recombinant human PSA(生化复发中的前列腺切除的前列腺癌患者的接种,利用用重组人PSA脉冲处理的树突细胞)."Cancer Immunol Immunother 53(5):453-60)。作为用载有PSCA和PSA肽的树突细胞接种晚期前列腺癌患者的结果,10个患者中的5个显示针对至少一种抗原的免疫反应(参见例如Thomas-Kaskel,A.K.,R.Zeiser等(2006)."Vaccination of advanced prostate cancer patients with PSCA and PSA peptide-loaded dendritic cells induces DTH responses that correlate with superior overall survival(用载有PSCA和PSA肽的树突细胞接种晚期前列腺癌患者引起与优异的整体存活相关的DTH反应)."Int J Cancer 119(10):2428-34.)。
[0023] 在另一个实例中,Murphy等(1996)在相应的I期试验中利用两种HLA-A*0201PSMA表位进行了前列腺癌患者的接种以比较基于单独的肽的接种和基于经脉冲处理的DC的接种。结果显示,如果患者被用经脉冲处理的DC接种,则更多的患者对所述接种有反应。该研究显示基于载有肽或蛋白质的DC的接种至少在一些情况中导致可检测的免疫反应以及暂时性PSC下降或稳定(参见例如Murphy,G.,B.Tjoa等(1996)."Phase I clinical trial:T-cell therapy for prostate cancer using autologous dendritic cells pulsed with HLA-A0201-specific peptides from prostate-specific membrane antigen(I期临床试验:使用用来自前列腺特异性膜抗原脉冲处理的自体树突细胞的用于前列腺癌的T细胞疗法)."Prostate 29(6):371-80)。
[0024] 前列腺癌患者的接种也可以利用载于树突细胞上的肽的组合(例如利用载有肽混合物(cocktail)的树突细胞)进行(参见例如Fuessel,S.,A.Meye等(2006)."Vaccination of hormone-refractory prostate cancer patients with peptide cocktail-loaded dendritic cells:results of a phase I clinical trial(利用载有肽混合物的树突细胞接种激素难治性前列腺癌患者:I期临床试验的结果)."Prostate 66(8):811-21)。所述混合物包含来自以下的肽:PSA、PSMA、存活蛋白,Prostein和Trp-p8(瞬时感受器电位p8)。还利用激素难治性前列腺癌的基于树突细胞的多表位免疫疗法进行了临床试验(参见例如Waeckerle-Men,Y.,E.Uetz-von Allmen等(2006)."Dendritic cell-based multi-epitope immunotherapy of hormone-refractory prostate carcinoma(激素难治性前列腺癌的基于树突细胞的多表位免疫疗法)."Cancer Immunol Immunother 55(12):1524-
33)。Waeckerle-Men,Y.,E.Uetz-von Allmen等(2006)测试了利用来自PSCA、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、PSMA和PSA的肽的激素难治性前列腺癌的接种。
[0025] 虽然利用抗原性蛋白或肽(例如当载于树突细胞上时)的接种是诱发免疫反应的常用方法,但是免疫或接种也可以基于核酸的使用以便将所需的遗传信息结合到细胞中。通常,已经发展了多种方法用于将核酸引入到细胞中,如磷酸转染,聚戊二烯转染,原生质体融合,电穿孔,显微注射和脂转染,其中脂转染已经尤其被证明是合适的方法。
[0026] 前列腺癌的接种治疗可以,例如,基于将来源于自体肿瘤的总mRNA转染到DC中(参见例如Heiser,A.,D.Coleman等(2002)."Autologous dendritic cells transfected with prostate-specific antigen RNA stimulate CTL responses against metastatic prostate tumors(用前列腺特异性抗原RNA转染的自体树突细胞刺激针对转移的前列腺肿瘤的CTL反应)."J Clin Invest 109(3):409-17.)。该策略的优点在于靶向多种HLA I类和II类患者特异性肿瘤相关抗原(TAA)而不需要事先进行HLA分型。此外,该策略甚至还靶向间质抗原,因为mRNA获得自外科样品而不是获得自肿瘤细胞系。作为一个实例,Heiser等开发了基于DC的免疫治疗方案,其中用编码PSA的mRNA转染DC。所述接种被良好耐受并且引起增加的对PSA的T细胞反应。然而,此种基于DC的抗前列腺癌疫苗表现为产生强的T细胞反应,其可能伴随有临床反应,但是后者的频率仍然不能让人满意。
[0027] DNA也可以用作接种策略中的核酸以将所需的遗传信息结合到细胞中。例如,DNA病毒可以用作DNA载体。由于其感染性,此种病毒实现非常高的转染率。所用的病毒被遗传修饰以致在被转染的细胞中不形成功能性感染颗粒。例如,在Eder等(2000)的研究中使用表达PSA的重组痘病毒进行I期试验。作者证明了在所选的患者中的对PSA的T细胞免疫反应并且还证明了血清PSA稳定化(参见例如Eder,J.P.,P.W.Kantoff等(2000)."A phase I trial of a recombinant vaccinia virus expressing prostate-specific antigen in advanced prostate cancer(在晚期前列腺癌中表达前列腺特异性抗原的重组牛痘病毒的I期试验)."Clin Cancer Res 6(5):1632-8.)。由来自所述重组病毒的高免疫原性肽触发的炎性反应可以增强外源蛋白的免疫原性。然而,所显示的是,免疫系统降低重组病毒的复制并且因此限制临床结果。虽然重组疫苗已经显示了免疫原性并且在若干试验中显示了肿瘤反应的证据,但这些结果需要被进一步证实以用于进一步的临床测试。
[0028] 根据另一种方法,激素难治性前列腺癌患者的接种利用表达PSA的DNA质粒进行(参见例如Pavlenko,M.,A.K.Roos等(2004)."A phase I trial of DNA vaccination with a plasmid expressing prostate-specific antigen in patients with hormone-refractory prostate cancer(在患有激素难治性前列腺癌的患者中的利用表达前列腺特异性抗原的质粒的DNA接种的I期试验)."Br J Cancer 91(4):688-94)。Garcia-Hernandez等(2007)显示利用编码STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原)的质粒或病毒样复制子的治疗性和预防性接种延长了肿瘤攻击小鼠的存活(参见例如Garcia-Hernandez Mde,L.,A.Gray等(2007)."In vivo effects of vaccination with six-transmembrane epithelial antigen of the prostate:a candidate antigen for treating prostate cancer(利用前列腺的六跨膜上皮抗原的接种的体内效果:用于治疗前列腺癌的候选抗原)."Cancer Res 67(3):1344-51)。最近,STEAP被鉴定为晚期人前列腺癌的指示蛋白,其高度地过表达于人前列腺癌中。其功能目前是未知的。
[0029] 然而,在使用DNA作为遗传信息的载体时,不可能排除引入的基因或病毒基因的不受控的增殖的风险,这例如是由于潜在的重组事件。这还导致DNA通过例如重组被插入到宿主细胞基因组的完整基因中,结果是该基因可以被突变并因此完全或部分地失活或所述基因可能产生错误信息。换言之,对细胞关键的基因产物的合成可能被完全抑制或备选地表达改变的或错误的基因产物。所述DNA可以例如被整合到参与细胞生长调节的基因中。在此情况中,宿主细胞可能变得退化并且导致癌或肿瘤形成。此外,如果要表达被引入到细胞中的DNA,则需要相应的DNA载体包含强启动子,如病毒CMV启动子。将此种启动子整合到处理的细胞的基因组中可能导致有害的细胞中基因表达调节的改变。使用DNA作为引入免疫反应的试剂(例如作为疫苗)的另一个风险是在受治疗的患者中产生病原性抗DNA抗体,从而引起(可能是致命的)免疫反应。
[0030] 因此,为了有效地刺激免疫系统从而允许前列腺癌(PCa)的治疗同时避免由于基于DNA的组合物所致的引入的基因不受控传播的问题,已经开发了基于RNA的抗原组合物。WO 2009/046975提供了一种组合物,所述组合物包含至少一种RNA,所述至少一种RNA编码至少两种、三种或四种(优选地不同的)抗原,所述抗原选自由以下组成的组:PSA(前列腺特异性抗原;也被称为KLK3或激肽释放酶-3)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、PSCA(前列腺干细胞抗原)和STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原)。
[0031] 虽然在上述组合物中的抗原的组合相当大地增加前列腺癌患者群体中反应者的数量,然而还存在无反应的受试者,其不能获益于任何本领域已知的方法。考虑到前列腺癌的高发病率和增加的死亡率,因此强烈需要进一步的备选的或改进的治疗方案。
[0032] 因此,本发明的一个目的是提供用于通过刺激免疫系统来治疗前列腺癌(PCa)的组合物或疫苗。
[0033] 本发明的目的通过所要求保护的主题而得以解决。
[0034] 发明概述
[0035] 该目的通过本发明的主题、尤其是包含至少一种mRNA的组合物而得以解决,其中所述至少一种mRNA编码以下抗原:
[0036] ·STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原(Six Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate));
[0037] ·PSA(前列腺特异性抗原),
[0038] ·PSMA(前列腺特异性膜抗原),
[0039] ·PSCA(前列腺干细胞抗原);
[0040] ·PAP(前列腺酸性磷酸酶),和
[0041] ·MUC1(黏蛋白1),
[0042] 或其片段或变体。
[0043] 惊人地,已经发现,由如包含在根据本发明的组合物中的至少一种mRNA编码的上述组的抗原、抗原蛋白或抗原肽的特定组合能够有效地刺激(适应性)免疫系统以允许治疗前列腺癌(PCa),优选地前列腺腺癌,局部限制性前列腺癌,局部晚期前列腺癌,转移的前列腺癌,去势抵抗性(激素难治性)前列腺癌,转移的去势抵抗性前列腺癌和非转移的去势抵抗性前列腺癌,和与其相关的疾病或病症。不论根据本发明的抗原组合是作为一种单个组合物应用还是通过分开施用个体抗原来应用,都可以实现对以上提及的疾病的治疗的有利效果。因此,任何本文所述的抗原组合(例如以六种单独的mRNA制剂的形式)都可以实现完全相同的用途并实现所需的效果。预期针对此种接种策略的响应者(responder)的数目与其他方法相比显著增加。本文中,术语抗原、抗原蛋白或抗原肽可以同义地使用。在本发明的语境中,发明的组合物还应当被理解为是这样的组合物,其能够由于所述组合物中含有的至少一种组分或更准确地说,由于由所述组合物的至少一种组分所编码的至少一种抗原,即通过编码如上所定义的抗原的至少一种mRNA而引起免疫反应,优选如本文中所定义的适应性免疫反应。根据本发明,所述抗原的组合,不论是分开施用(例如同时)还是作为一种单个组合物施用,都能够诱发所需的免疫反应。分开施用可以表示不同的mRNA基本上同时,例如在10分钟内或在延长的时间(例如超过30分钟)的时间内时间交错。
[0044] 以下,将说明根据本发明的抗原的组合(通过对包含编码所述抗原的组合的至少一种mRNA的组合物的描述)。理解的是,根据本发明的至少一种mRNA表征为如本文所述的特征,而不管其是作为一种单个组合物施用还是以分开的制剂的形式(例如被制成六种单独的mRNA,其各自编码一种抗原并且被分开(例如同时)施用)施用。
[0045] 在前列腺癌细胞中的大量过表达的抗原中,本发明具体选择了PSA、PSMA、PSCA、STEAP、PAP和MUC1。根据本发明,这些抗原被鉴定为代表免疫疗法的可能靶标。根据本发明,以上抗原中的一种或多种由所述至少一种mRNA提供的至少一种ORF/编码区/编码序列编码。关于这点,信使RNA典型地是单链RNA,其由(至少)若干个结构元件组成,例如任选的5’UTR区,任选的位于上游的核糖体结合位点,之后的编码区,任选的3’UTR区,其之后可以是聚-A尾(和/或聚-C尾)。根据本发明,所述组合物包含至少一种mRNA,所述至少一种mRNA编码以上限定的至少六种抗原。其中,一种mRNA可以编码一种或多种抗原,只要组合物因而提供如上所限定的至少六种抗原。所述组合物的至少一种mRNA可以因此包含超过一个ORF/编码区/编码序列,其中所述组合物总体上包含至少一种编码区以用于如上所限定的至少六种抗原中的每一种。备选地,用于所述至少六种抗原中的每一种的编码区可以位于所述组合物的分开的mRNA上。以下提供对于所述至少一种mRNA的更优选的实施方案:
[0046] 由所述组合物的至少一种mRNA编码的一种抗原是PSA。在本发明的语境中,“PSA”是“前列腺特异性抗原”并且可以在文献中被同义地称为KLK3(激肽释放酶-3)。前列腺特异性抗原(PSA)是33kDa蛋白质并且是雄激素调节的激肽释放酶样丝酸蛋白酶,其专由良性和恶性的所有类型的前列腺组织的上皮细胞产生。特别地,PSA由正常前列腺上皮细胞高表达并且代表前列腺癌中被最佳表征的肿瘤相关抗原之一。在生理学上,其以高浓度存在于精液中并且功能是将负责精液凝结的高分子量蛋白质切割成较小的多肽。该作用导致凝块液化。PSA也存在于血清中并且可以通过单克隆免疫放射测定或单克隆放射免疫测定可靠地测量。目前PSA是最广泛用于筛查、诊断和监测前列腺癌的肿瘤标记物。特别地,一些用于检测血清PSA的免疫测定在临床上被广泛使用。最近,已经开发出用于血清中的PSA mRNA的反转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)测定。
[0047] 在本发明的语境中,编码PSA(前列腺特异性抗原)的至少一种mRNA的优选的序列可以包含编码如在登录号NP_001639.1下保存的PSA的氨基酸序列(图31;SEQ ID NO:76)的序列或如在登录号NM_001648下保存的序列。优选地,所述至少一种mRNA包含如在图2、3或27任一中所示的编码序列(SEQ ID NO:2、3或82)。更优选地,所述至少一种mRNA包含如图1或19中所示的序列(SEQ ID NO:1或19)或由其组成。根据另一个优选的实施方案,所述组合物的至少一种mRNA可以备选地编码选自如在登录号NP_001639.1下保存的或如图31中所示的PSA序列(SEQ ID NO:76)的片段、变体或表位的PSA抗原序列或可以包含如在登录号NM_
001648下保存的或如图1、2、3、19或27任一中所示的序列(SEQ ID NO:1、2、3、19或82)的片段或变体。
[0048] PSMA是由所述组合物的至少一种mRNA编码的另一种抗原。在本发明的语境中“PSMA”是“前列腺特异性膜抗原”并且可以被同义地称作FOLH1(叶酸水解酶1)或“PSM”。PSMA是100kDa的II类跨膜糖蛋白,其中PSMA表达主要限于前列腺组织,但是在脑、唾液腺、小肠和肾细胞癌中已经观察到可检测水平的PSMA mRNA(Israeli等,1993,Cancer Res53:
227-230)。PSMA高表达于大部分原发性和转移前列腺癌中,但是也表达于大部分正常上皮内瘤形成样品中(Gao等(1997),如上)。特别地,PSMA高表达于前列腺癌细胞和非前列腺实体瘤新血管系统中并且是抗癌成像和治疗剂的靶标。PSMA充当小分子底物的谷氨酸羧肽酶(GCPII),所述小分子底物包括叶酸,抗癌药甲氨蝶呤,和神经肽N-乙酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酸。在前列腺癌中,PSMA表达已被证明与疾病进展相关,其中在激素难治性和转移性的疾病中表达水平最高。PSMA的细胞定位是胞质和/或膜。PSMA被认为是前列腺癌(PCa)的生物标记物并且其作为成像和治疗靶标的用途被大量研究。
[0049] 在本发明的语境中,编码PSMA(前列腺特异性膜抗原)的至少一种mRNA的优选的序列可以包含编码如在登录号NP_004467.1下保存的PSMA的氨基酸序列(图32;SEQ ID NO:77)的序列或如在登录号NM_004476下保存的序列。优选地,其包含如图5、6或28中任一所示的编码序列(SEQ ID NO:5、6或83)。更优选地,所述至少一种mRNA包含如图4或20中所示的序列(SEQ ID NO:4或20)或由其组成。根据另一个优选的实施方案,所述组合物的至少一种mRNA可以备选地编码选自如在登录号NP_004467.1下保存的或如图32中所示的PSMA序列(SEQ ID NO:77)的片段、变体或表位的PSMA抗原序列,或可以包含如在登录号NM_004476下保存的或如图4、5、6、20或28中任一所示的序列(SEQ ID NO:4、5、6、20或83)的片段或变体。
[0050] 由根据本发明的组合物的至少一种mRNA编码的另一种抗原是PSCA。在本发明的语境中“PSCA”是“前列腺干细胞抗原”。PSCA广泛地过表达于所有阶段的前列腺癌中,包括高级前列腺上皮内瘤形成(PIN),雄激素依赖性和雄激素不依赖性前列腺肿瘤。PSCA基因显示与干细胞抗原-2(糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的细胞表面抗原的Thy-I/Ly-6家族的成员)的30%同源性,并且编码123个氨基酸的蛋白质,所述蛋白质具有氨基末端信号序列,羧基末端GPI-锚定序列,和多个N-糖基化位点。PSCA mRNA表达在雄激素依赖性和雄激素不依赖性前列腺癌异种移植物中都被高度上调。原位mRNA分析将PSCA表达定位至基细胞上皮(前列腺的推定的干细胞区室)。流式细胞分析证明PSCA主要表达于细胞表面上并且被GPI连接固定。荧光原位杂交分析将PSCA基因定位至染色体8q24.2(超过80%的前列腺癌中的等位基因增加区)。PSCA可以被用作前列腺癌标记物以区分恶性前列腺癌,正常前列腺和非恶性瘤形成。例如,PSCA以非常高的水平表达于与良性前列腺增生(BPH)相关的前列腺癌中。
[0051] 在本发明的语境中,编码PSCA(前列腺干细胞抗原)的至少一种mRNA的优选的序列可以包含编码如在登录号O43653.1下保存的PSCA的氨基酸序列(图33;SEQ ID NO:78)的序列或如在登录号NM_005672下保存的序列。优选地,其包含如图8、9或29中任一所示的编码序列(SEQ ID NO:8、9或84)。更优选地,所述至少一种mRNA包含如图7或21中所示的序列(SEQ ID NO:7或21)或由其组成。根据另一个优选的实施方案,所述组合物的至少一种mRNA可以备选地编码选自如在登录号O43653.1下保存的或如图33中所示的PSCA序列(SEQ ID NO:78)的片段、变体或表位的PSCA抗原序列,或可以包含如在登录号NM_005672下保存的或如图7、8、9、21或29中任一所示的序列(SEQ ID NO:7、8、9、21或84)的片段或变体。
[0052] 此外,STEAP由根据本发明的组合物的至少一种mRNA编码。在本发明的语境中,“STEAP”是“前列腺的六跨膜上皮抗原”并且可以同义地被称为STEAP1。STEAP或STEAP-1是新的细胞表面蛋白并且主要表达于人前列腺组织和其他常见的恶性肿瘤(包括前列腺癌、膀胱癌、结肠癌和卵巢癌)和尤因肉瘤(Ewing's sarcoma)中,表明其可以几乎充当通用的肿瘤抗原。特别地,STEAP高表达于原发性前列腺癌中,在正常组织中的表达有限。在Kaplan Meier分析中,骨髓样品中的STEAP阳性与新的转移瘤情况下的存活高度相关(p=0.001)。
[0053] 在本发明的语境中,编码STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原)(或STEAP1)的至少一种mRNA的优选的序列可以包含编码如在登录号NP_036581.1下保存的STEAP的氨基酸序列(图34;SEQ ID NO:79)的序列或如在登录号NM_012449下保存的序列。优选地,其包含如图11、12或30中任一所示的编码序列(SEQ ID NO:11、12或85)。更优选地,所述至少一种mRNA包含如图10或22中所示的序列(SEQ ID NO:10或22)或由其组成。根据另一个优选的实施方案,所述组合物的至少一种mRNA可以备选地编码选自如在登录号NP_036581.1下保存的或如图34中所示的STEAP序列(SEQ ID NO:79)的片段、变体或表位的STEAP抗原序列,或可以包含如在登录号NM_012449下保存的或如图10、11、12、22或30中任一所示的序列(SEQ ID NO:10、11、12、22或85)的片段或变体。
[0054] 此外,根据本发明的组合物的至少一种mRNA编码PAP。“PAP”是“前列腺酸性磷酸酶”并且可以被同义地称作例如PSAP(前列腺特异性酸性磷酸酶)或ACPP(酸性磷酸酶,前列腺)。PAP是一种酶,其由前列腺的上皮细胞分泌并且催化正磷酸单酯转化为醇和正磷酸盐。>95%的正常成人前列腺组织样品(包括邻近肿瘤的正常组织)以及>95%的原发性腺癌,强烈表达PAP。除了前列腺以外,可以在一些正常人组织(例如肾、、睾丸、结肠、胰腺)中检测到PAP表达,但是表达水平低约1-2个数量级,并且PAP通常被认为是组织特异性前列腺抗原,其高表达于正常和恶性前列腺细胞两者中。此外已经证明,PAP高度表达于前列腺癌骨转移瘤中并且可以在该疾病的成骨细胞期中起成因作用。PAP已被证明在患者中引发长期CD4+和CD8+T-细胞反应,包括CTL反应。用PAP刺激的自体抗原递呈细胞治疗前列腺癌患者导致提高的存活和良好的安全性特征。
[0055] 在本发明的语境中,编码PAP的至少一种mRNA的优选的序列可以包含编码如在登录号NP_001090.2下保存的PAP的氨基酸序列(图35;SEQ ID NO:80)的序列,或如在登录号NM_001099.4下保存的序列。优选地,其包含如图14或15中任一所示的编码序列(SEQ ID NO:14或15)。更优选地,所述至少一种mRNA包含如图13或23中所示的序列(SEQ ID NO:13或23)或由其组成。根据另一个优选的实施方案,所述组合物的至少一种mRNA可以备选地编码选自如在登录号NP_001090.2下保存的或如图35中所示的PAP序列(SEQ ID NO:80)的片段、变体或表位的PAP抗原序列,或可以包含如在登录号NM_001099.4下保存的或如图13、14、15或23中所示的序列(SEQ ID NO:13、14、15或23)的片段或变体。
[0056] 最后,MUC1由根据本发明的组合物的至少一种mRNA编码。“MUC1”是“黏蛋白1”并且可以被同义地称作例如CD227或DF3。MUC1是大的粘性糖蛋白,其正常地表达于腺体上皮细胞的腔表面上。其在正常上皮细胞中的功能是润滑和保护上皮细胞。在很多人恶性肿瘤(包括前列腺癌)中,MUC1的表达常常增加,不再限于腔表面并且表征为异常糖基化。MUC1表达于约60%的原发性前列腺癌和90%的淋巴结转移瘤中。此外,86%的MUC1阳性原发性前列腺肿瘤的Gleason评分≥7,支持与更具有侵略性的疾病的相关性。人前列腺癌的基因表达特征分析(profiling)也显示MUC1高表达于具有攻击性临床病理特征和提高的复发风险的子群中。已经发现,MUC-1的过表达和低表达都会增加前列腺癌进展的风险。MUC1已被证明具有免疫原性并且已被描述为在患者中引起包含CD8+CTL和IgM抗体的特异性免疫反应。使用不同接种方法的针对MUC1的接种与患有晚期非小细胞肺癌的患者中的II期试验中的临床益处的趋势相关并且表现为被良好耐受。在前列腺癌中使用相同疫苗的针对MUC1的接种与一些患者中PSA倍增时间的延长相关。(Bilusic,M.等(2011)Immunotherapy in prostate cancer:emerging strategies against a formidable foe(前列腺癌的免疫疗法:针对强大敌人的新兴策略).Vaccine.29:6485-6497;Dreicer,R.等(2009).MVA-MUC1-IL2vaccine immunotherapy(TG4010)improves PSA doubling time in patients with prostate cancer with biochemical failure(在生化失败的情况下MVA-MUC1-IL2疫苗免疫疗法(TG4010)提高患有前列腺癌的患者中的PSA倍增时间).Invest New Drugs.27:379-386,Sangha,R.和North,S.(2007).L-BLP25:a MUC1-targeted peptide vaccine therapy in prostate cancer(L-BLP25:前列腺癌中的MUC1靶向肽疫苗疗法).Expert Opin Biol Ther.7:1723-1730)。
[0057] 在本发明的语境中,编码MUC1的至少一种mRNA(优选地mRNA)的优选的序列可以包含编码如在登录号AAA60019.1下保存的MUC1的氨基酸序列(图36;SEQ ID NO:81),如图37中显示的截短的氨基酸序列(SEQ ID NO:86;MUC15×VNTR)的序列,或所述至少一种mRNA可以包含如在登录号J05582.1下保存的序列。优选地,其包含如图17、18或38中任一所示的编码序列(SEQ ID NO:17、18或87)。更优选地,所述至少一种mRNA包含如图16或24中所示的序列(SEQ ID NO:16或24)或由其组成。根据另一个优选的实施方案,所述组合物的至少一种mRNA可以备选地或另外地编码选自如在登录号AAA60019.1下保存的或如图36或37中所示的MUC1序列(SEQ ID NO:81或86)的片段、变体或表位的MUC1抗原序列,或可以包含如在登录号J05582.1下保存的或如图16、17、18、24或38中所示的序列(SEQ ID NO:16、17、18、24或87)的片段或变体。
[0058] 当在本发明的语境中提及抗原或其片段或变体时,理解的是,所述提及涉及由本发明中提供的一种或多种mRNA序列编码的抗原或肽。此外,如上所定义的由根据本发明的组合物的至少一种mRNA编码的抗原,抗原蛋白或抗原肽可以包含这些序列的片段或变体。这样的片段或变体可以典型地包含在核酸水平上或在氨基酸水平上,相对于整个野生型序列,与以上提及的抗原、抗原蛋白或抗原肽或序列或其编码核酸序列之一具有至少5%、
10%、20%、30%、40%、50%、60%、优选至少70%、更优选地至少80%、同样更优选至少
85%、甚至更优选至少90%并且最优选至少95%或甚至97%的序列同源性的序列。
[0059] 在本发明的语境中,抗原、抗原蛋白或抗原肽的“片段”可以包括如上所限定的抗原、抗原蛋白或抗原肽的序列,其关于其氨基酸序列(或其编码的核酸序列),相比于原始的(天然的)蛋白质的氨基酸序列(或其编码的核酸序列),在N端、在C端和/或在序列内被截短。此种截短可以因此发生在氨基酸水平上或相应地发生在核酸水平上。关于如以上所限定的此种片段的序列同源性可以因此优选地涉及如以上所限定的整个抗原、抗原蛋白或抗原肽或此种抗原、抗原蛋白或抗原肽的整个(编码)核酸序列。
[0060] 在本发明的语境中,抗原、抗原蛋白或抗原肽的片段还可以包括长度为约6至约20或甚至更多个氨基酸的如以上所限定的抗原、抗原蛋白或抗原肽的序列,例如如由MHC I类分子加工和递呈的片段,其长度优选为约8至约10个氨基酸,例如8、9或10(或甚至6、7、11或12个氨基酸),或如由MHC II类分子加工和递呈的片段,其长度优选为约13个或更多个氨基酸,例如13、14、15、16、17、18、19、20或甚至更多个氨基酸,其中这些片段可以选自所述氨基酸序列的任何部分。这些片段典型地以由肽片段和MHC分子组成的复合物的形式被T-细胞识别,即所述片段典型地不以其天然形式被识别。
[0061] 如本文所限定的抗原、抗原蛋白或抗原肽的片段还可以包含所述抗原、抗原蛋白或抗原肽的表位。在本发明的语境中,表位(也被称为"抗原决定簇")典型地是位于如本文所限定的(天然)抗原、抗原蛋白或抗原肽的外表面上的片段,其优选地具有5至15个氨基酸,更优选地具有5至12个氨基酸,甚至更优选地具有6至9个氨基酸,其可以被抗体或B-细胞受体识别,即以其天然形式被识别。此种抗原、抗原蛋白或抗原肽的表位还可以选自任何本文提及的此种抗原、抗原蛋白或抗原肽的变体。关于这点,抗原决定簇可以是构象的或不连续的表位,其由如本文所限定的抗原、抗原蛋白或抗原肽的区段组成,所述区段在如本文所限定的抗原、抗原蛋白或抗原肽的氨基酸序列中是不连续的但是在三维结构中却在一起,或由单个多肽链组成的连续的或线形的表位。因此,在该语境中,尤其优选的是,所述抗原、抗原蛋白或抗原肽的片段包含所述抗原的至少一个表位。
[0062] 如以上所限定的抗原、抗原蛋白或抗原肽的“变体”可以由根据本发明的组合物的至少一种mRNA编码,其中编码如以上所限定的抗原、抗原蛋白或抗原肽的至少一种mRNA的核酸被交换。由此,可以生成这样的抗原、抗原蛋白或抗原肽,所述抗原、抗原蛋白或抗原肽的氨基酸序列与原始序列的区别在于一个或多个突变,如一个或多个取代的、插入的和/或缺失的氨基酸。优选地,这些片段和/或变体与全长的天然抗原或抗原蛋白相比具有相同的生物学功能或特异活性,例如其特异性抗原性质。
[0063] 根据本发明的组合物的至少一种mRNA还可以编码如以上所限定的抗原或抗原蛋白,其中编码的氨基酸序列与其生理序列相比包含保守氨基酸置换。这些编码的氨基酸序列及其编码核苷酸序列尤其落在如以上所限定的术语变体之下。来源于同一类别的氨基酸彼此交换的置换被称为保守置换。特别地,这些是具有脂肪族侧链,带正电或带负电的侧链,在侧链中具有芳族基团的氨基酸,或侧链可以进入氢桥(例如具有羟基官能的侧链)的氨基酸。这意味着,例如,具有极性侧链的氨基酸被另一个具有同样的极性侧链的氨基酸替代,或,例如,表征为疏水侧链的氨基酸被另一个具有同样的疏水侧链的氨基酸置换(例如丝氨酸(苏氨酸)被苏氨酸(丝氨酸)置换或亮氨酸(异亮氨酸)被异亮氨酸(亮氨酸)置换)。插入和置换尤其在对三维结构不产生改变或不影响结合区域的那些序列位置处是可能的。
插入或缺失对三维结构的改变可以容易地例如使用CD谱(圆二色谱)确定(Urry,1985,Absorption,Circular Dichroism and ORD of Polypeptides(多肽的吸收、圆二色性和ORD):Modern Physical Methods in Biochemistry,Neuberger等(ed.),Elsevier,Amsterdam)。
[0064] 此外,可以由根据本发明的组合物的至少一种mRNA编码的如以上所限定的抗原、抗原蛋白或抗原肽的变体还可以包含那些序列,其中所述至少一种mRNA的核酸根据遗传密码的简并性交换而不导致相应的抗原、抗原蛋白或抗原肽的氨基酸序列的改变,即,在以上含义内,氨基酸序列或至少其部分与原始序列相比可以没有一个或多个突变的差异。
[0065] 此外,可以由根据本发明的组合物的至少一种mRNA编码的如以上所限定的抗原、抗原蛋白或抗原肽的变体还可以包含那些对应于如本文所限定的RNA序列的DNA序列并且还包含对应于如本文所限定的DNA序列的RNA序列。本领域技术人员熟悉RNA序列到DNA序列的翻译(反之亦然)或熟悉互补链序列的产生(即通过用T残基替换U残基和/或通过构建关于给定序列的互补链)。
[0066] 为了确定两个序列(核酸序列,例如如本文所限定的RNA或mRNA序列,或氨基酸序列,优选其编码的氨基酸序列,例如如以上所限定的抗原、抗原蛋白或抗原肽的氨基酸序列)相同程度的百分数,可以将所述序列对齐以便随后彼此相比。因此,例如可以将间隙(gap)插入到第一序列的序列中并且可以比较在第二序列的相应位置处的组件。如果第一序列中的位置被与在第二序列中的位置处的相同的组件所占据,则这两个序列在该位置处是相同的。两个序列相同程度的百分数是相同位置的数目除以位置总数的函数。两个序列相同程度的百分数可以使用数学算法确定。可以使用的数学算法的一个优选的而非限制性的实例是Karlin等(1993),PNAS USA,90:5873-5877或Altschul等(1997),Nucleic Acids Res.,25:3389-3402的算法。此种算法被集成在BLAST程序中。该程序能够鉴定在一定程度上与本发明的序列相同的序列。
[0067] 如本文中所使用的,术语“组合物”是指至少一种mRNA和任选地其他赋形剂。术语“组合物”因此包含编码如以上所限定的抗原的mRNA(mRNA种类)的任意混合物,而不管所述mRNA是单顺反子的、双顺反子的还是多顺反子的。在本发明的含义内,术语“组合物”还指由多顺反子RNA组成的实施方案,所述多顺反子RNA编码如以上所限定的全部六种抗原。优选地,所述组合物包含至少六种不同的mRNA种类,其中每种mRNA种类编码以上抗原中的一种。术语“组合物”优选地涉及与至少一种其他合适的物质在一起的至少一种mRNA。通常,所述组合物可以是药物组合物,其被设计成用于医学领域。因此,所述组合物典型地包含至少一种另外的赋形剂,所述赋形剂是药用的并且可以例如选自载体、赋形剂(vehicle)等。所述“组合物”可以是液体或无水组合物。如果组合物是液体的,则其将优选是所述至少一种RNA的水溶液或分散液。如果“组合物”是无水组合物,则其将典型地是至少一种mRNA的冻干的组合物。如本文中使用的,术语“组合物”还指与另外的活性成分组合的本发明的至少一种mRNA。优选地,所述组合物是免疫刺激组合物,即这样的组合物,所述组合物包含至少一种组分,所述组分能够诱发免疫反应或者由所述组分可衍生出能够诱发免疫反应的组分。关于这点,所述免疫反应可以是适应性和/或先天免疫系统的结果。
[0068] 根据本发明的组合物包含编码如以上所限定的至少六种抗原的至少一种mRNA,因为发现所述抗原的特定组合能够有效地刺激(适应性)免疫系统,由此允许治疗前列腺癌(PCa)。
[0069] 总的说来,本发明的目的通过提供一种组合物而得以解决,所述组合物包含编码如本文所限定的新的抗原组合的至少一种mRNA。
[0070] 在优选的实施方案中,所述组合物包含六种抗原(PSA、PSMA、PSCA、STEAP、PAP和MUC1),所述六种抗原由六种单顺反子的mRNA编码,这些mRNA中的每一种编码选自限定的抗原组的不同抗原。备选地,组合物可以包含单顺反子、双顺反子和/或多顺反子mRNA的组合,其中六种抗原中的超过一种由双或多顺反子mRNA编码。根据本发明,预期编码如本文所限定的全部六种抗原的单顺反子、双顺反子或多顺反子mRNA的任意组合,例如三个双顺反子mRNA,其各自编码以上六种抗原中的两个,或两个双顺反子和两个单顺反子mRNA。
[0071] 根据优选的实施方案,组合物包含至少一种mRNA,其包含至少一种编码序列,所述编码序列选自与SEQ ID NO:2、5、8、11、14或17(或87)的RNA序列相同或至少80%相同的mRNA序列。甚至更优选地,组合物包含六种mRNA,其中每种mRNA中的编码序列与根据SEQ ID NO:2、5、8、11、14和17(或87)的RNA序列之一相同或至少80%相同。
[0072] 在优选的实施方案中,本发明组合物的至少六种抗原中的每种可以由一种(单顺反子)mRNA编码。换言之,本发明的组合物可以包含六种(单顺反子)mRNA,其中这六种(单顺反子)mRNA中的每种可以仅编码一种如以上所限定的抗原。
[0073] 在更优选的实施方案中,所述组合物包含六种mRNA,其中分别地,一种mRNA编码PSA,一种mRNA编码PSMA,一种mRNA编码PSCA,一种mRNA编码STEAP,一种mRNA编码PAP,并且一种mRNA编码MUC1,或其片段或变体。
[0074] 在甚至更优选的实施方案中,所述组合物包含六种mRNA和任选地另外的赋形剂,其中一种mRNA编码PSA并且包含与SEQ ID NO:2相同或至少80%相同的编码序列,一种mRNA编码PSMA并且包含与SEQ ID NO:5相同或至少80%相同的编码序列,一种mRNA编码PSCA并且包含与SEQ ID NO:8相同或至少80%相同的编码序列,一种mRNA编码STEAP并且包含与SEQ ID NO:11相同或至少80%相同的编码序列,一种mRNA编码PAP并且包含与SEQ ID NO:14相同或至少80%相同的编码序列,并且一种mRNA编码MUC1并且包含与SEQ ID NO:17(或
87)相同或至少80%相同的编码序列(或这些序列中的每种的片段或变体)。
[0075] 在甚至更优选的实施方案中,所述组合物包含六种mRNA,其中分别地,一种mRNA编码PSA并且包含根据SEQ ID NO:2的编码序列,一种mRNA编码PSMA并且包含根据SEQ ID NO:5的编码序列,一种mRNA编码PSCA并且包含根据SEQ ID NO:8的编码序列,一种mRNA编码STEAP并且包含根据SEQ ID NO:11的编码序列,一种mRNA编码PAP并且包含根据SEQ ID NO:
14的编码序列,并且一种mRNA编码MUC1并且包含根据SEQ ID NO:17(或87)的编码序列或其片段。
[0076] 根据本发明,所述组合物的至少一种mRNA可以优选地包含在3’UTR区中的组蛋白茎-环。优选地,所述组合物包含六种mRNA,其中每种mRNA包含如本文所限定的组蛋白茎-环。
[0077] 根据另一个尤其优选的实施方案,本发明的组合物可以包含(至少)一种双顺反子或甚至多顺反子mRNA,即带有根据本发明的六种抗原中的两种以上的编码序列的(至少)一种mRNA。所述(至少)一种双顺反子或甚至多顺反子mRNA的两种以上抗原的此种编码序列可以通过至少一种IRES(内部核糖体进入位点)序列分开,如以下限定的。因此,术语“编码两种以上抗原”可以非限制性地表示所述(至少)一种(双顺反子或甚至多顺反子)mRNA可以编码例如以上提及的抗原中的至少两种、三种、四种、五种或六种(优选不同的)抗原或其在以上定义内的片段或变体。更优选地,非限制性地,所述(至少)一种(双顺反子或甚至多顺反子)mRNA可以编码例如以上提及的抗原中的至少两种、三种、四种、五种或六种(优选不同的)抗原或其在以上定义内的片段或变体。关于这点,如以上所限定的所谓的IRES(内部核糖体进入位点)序列可以充当唯一的核糖体结合位点,但是其也可以用于提供编码若干蛋白质的如以上所限定的双顺反子或甚至多顺反子mRNA,所述mRNA将被彼此独立地核糖体翻译。根据本发明可以使用的IRES序列的实例是来自以下的那些:小RNA病毒(例如FMDV),瘟病毒(CFFV),脊髓灰质炎病毒(PV),脑心肌炎病毒(ECMV),疫病毒(FMDV),丙肝病毒(HCV),古典猪瘟病毒(CSFV),小鼠膜白斑病毒(MLV),猿免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痹病毒(CrPV)。
[0078] 根据另一个尤其优选的实施方案,本发明的组合物可以包含如以上所限定的至少一种单顺反子mRNA和如以上所限定的至少一种双顺反子或甚至多顺反子mRNA的混合物。所述至少一种单顺反子mRNA和/或所述至少一种双顺反子或甚至多顺反子mRNA优选地编码在以上定义内的不同的抗原或其片段或变体。然而,所述至少一种单顺反子mRNA和所述至少一种双顺反子或甚至多顺反子mRNA还可以优选地编码(部分地)选自以上提及的抗原的相同的抗原,前提是本发明的组合物整体上提供如以上所限定的六种抗原。通过提供一种或多种所述抗原的多个拷贝,可以提高所述一种或多种抗原的相对蛋白量,即可以调节六种抗原中的每种的量之间的比率。这样的实施方案还可以例如对向需要其的患者交错、例如时间相关的施用本发明的组合物有利。如本文所限定的本发明的此种组合物的组分,尤其是编码根据本发明的至少六种抗原的特定组合的不同mRNA,可以被例如包含在具有多个部分的试剂盒(的不同部分)中,或者可以例如作为根据本发明的不同组合物的组分分开施用。
[0079] 在该语境中,尤其优选的是,所述至少六种抗原中的每种由不同的mRNA编码并且被包含在试剂盒的不同部分中。编码所述至少六种抗原中的一种的各mRNA优选地作为如本文所限定的不同组合物的组分分开施用。针对本发明的组合物所公开的全部实施方案适用于包含编码不同抗原的mRNA的此种组合。
[0080] 优选地,所述组合物的编码六种抗原中的至少一种的至少一种mRNA典型地包含约50至约20000,或100至约20000个核苷酸,优选地约250至约20000个核苷酸,更优选地约500至约10000,甚至更优选地约500至约5000的长度。
[0081] 根据一个实施方案,所述组合物的编码六种抗原中的至少一种的至少一种mRNA可以是修饰的RNA的形式,其中可以将如本文所限定的任何修饰引入到所述组合物的至少一种mRNA中。如本文所限定的修饰优选地导致本发明的组合物的稳定化的至少一种mRNA。
[0082] 根据第一个实施方案,本发明的组合物的至少一种mRNA可以因此作为“稳定化的mRNA"被提供,也就是说作为基本上耐受体内降解(例如通过核酸外切酶或核酸内切酶)的mRNA被提供。此种稳定化可以例如通过本发明的组合物的至少一种mRNA的修饰的磷酸主链来实现。在本发明方面,主链修饰是这样的修饰,其中mRNA中所含的核苷酸的主链的磷酸酯被化学修饰。可以优选用于这方面的核苷酸包括例如硫代磷酸酯修饰的磷酸主链,优选地磷酸主链中所含的至少一个磷酸被硫原子代替。稳定化的mRNA还可以包括,例如:非离子型磷酸酯类似物,如,例如,烷基和芳基膦酸酯,其中带电荷的磷酸氧被烷基或芳基代替,或磷酸二酯和烷基磷酸三酯,其中带电荷的氧残基以烷基化形式存在。此种主链修饰典型地包括,但不限于,来自由以下组成的组的修饰:甲基膦酸酯,氨基磷酸酯和硫代磷酸酯(例如胞苷-5'-O-(1-硫代磷酸酯))。
[0083] 本发明的组合物的至少一种mRNA可以另外地或备选地还包含糖修饰。在本发明方面,糖修饰是至少一种mRNA的核苷酸的糖的化学修饰并且典型地包括,但不限于,选自由以下组成的组的糖修饰:2'-脱氧-2'-氟-寡核糖核苷酸(2'-氟-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸,2'-氟-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸),2'-脱氧-2'-脱氨寡核糖核苷酸(2'-氨基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸,2'-氨基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸),2'-O-烷基寡核糖核苷酸,2'-脱氧-2'-C-烷基寡核糖核苷酸(2'-O-甲基胞苷-5'-三磷酸,2'-甲基尿苷-5'-三磷酸),2'-C-烷基寡核糖核苷酸,及其异构体(2'-阿糖胞苷-5'-三磷酸,2'-阿糖尿苷-5'-三磷酸),或叠氮三磷酸酯(2'-叠氮-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸,2'-叠氮-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸)。
[0084] 本发明的组合物的至少一种mRNA可以另外地或备选地还包含至少一种基修饰,所述碱基修饰优选地适用于与未改变的,即天然的(=自然的)mRNA序列相比显著增加由所述至少一种mRNA序列编码的至少一种蛋白质的表达。在此情况中,显著意味着与天然mRNA序列的表达相比,蛋白表达增加了至少20%,优选地至少30%、40%、50%或60%,更优选地至少70%、80%、90%或甚至100%并且最优选地至少150%、200%或甚至300%以上。在本发明方面,具有此种碱基修饰的核苷酸优选地选自由以下组成的碱基修饰的核苷酸的组:2-氨基-6-氯嘌呤核糖核苷-5'-三磷酸,2-氨基腺苷-5'-三磷酸,2-硫代胞苷-5'-三磷酸,
2-硫代尿苷-5'-三磷酸,4-硫代尿苷-5'-三磷酸,5-氨基烯丙基胞苷-5'-三磷酸,5-氨基烯丙基尿苷-5'-三磷酸,5-溴胞苷-5'-三磷酸,5-溴尿苷-5'-三磷酸,5-碘胞苷-5'-三磷酸,
5-碘尿苷-5'-三磷酸,5-甲基胞苷-5'-三磷酸,5-甲基尿苷-5'-三磷酸,6-氮胞苷-5'-三磷酸,6-氮尿苷-5'-三磷酸,6-氯嘌呤核糖核苷-5'-三磷酸,7-脱氮腺苷-5'-三磷酸,7-脱氮苷-5'-三磷酸,8-氮腺苷-5'-三磷酸,8-叠氮腺苷-5'-三磷酸,苯并咪唑-核糖核苷-5'-三磷酸,N1-甲基腺苷-5'-三磷酸,N1-甲基鸟苷-5'-三磷酸,N6-甲基腺苷-5'-三磷酸,O6-甲基鸟苷-5'-三磷酸,假尿苷-5'-三磷酸,或嘌呤霉素-5'-三磷酸,黄苷-5'-三磷酸。尤其优选的是选自由以下组成的碱基修饰的核苷酸的组的碱基修饰用核苷酸:5-甲基胞苷-5'-三磷酸,7-脱氮鸟苷-5'-三磷酸,5-溴胞苷-5'-三磷酸,和假尿苷-5'-三磷酸。
[0085] 根据另一个实施方案,本发明的组合物的至少一种mRNA同样可以通过引入另外的含有其核糖或碱基部分的修饰的修饰的核苷酸而被修饰(并且优选地被稳定化)。通常,本发明的组合物的至少一种mRNA可以包含任何天然的(=自然存在的)核苷酸,例如鸟苷、尿嘧啶、腺苷和/或胞嘧啶或其类似物。在这点上,核苷酸类似物被定义为自然存在的核苷酸的非天然存在的变体。因此,类似物是化学衍生的核苷酸,其具有非天然存在的官能团,所述官能团被优选地添加至自然存在的核苷酸或自其除去或取代核苷酸的自然存在的官能团。因此,自然存在的核苷酸的各组分都可以被修饰,即碱基组分、糖(核糖)组分和/或形成mRNA序列的主链的磷酸组分(见以上)。鸟苷、尿嘧啶、腺苷和胞嘧啶的类似物包括,但不限于,例如通过乙酰化、甲基化、羟基化等被在化学上改变的任何自然存在的或非自然存在的鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷或胞嘧啶,包括1-甲基-腺苷、1-甲基-鸟苷、1-甲基-肌苷、2,2-二甲基-鸟苷、2,6-二氨基嘌呤、2'-氨基-2'-脱氧腺苷、2'-氨基-2'-脱氧胞苷、2'-氨基-2'-脱氧鸟苷、2'-氨基-2'-脱氧尿苷、2-氨基-6-氯嘌呤核糖核苷、2-氨基嘌呤-核糖核苷、2'-阿糖腺苷、2'-阿糖胞苷、2'-阿糖尿苷、2'-叠氮-2'-脱氧腺苷、2'-叠氮-2'-脱氧胞苷、2'-叠氮-2'-脱氧鸟苷、2'-叠氮-2'-脱氧尿苷、2-氯腺苷、2'-氟-2'-脱氧腺苷、2'-氟-2'-脱氧胞苷、2'-氟-2'-脱氧鸟苷、2'-氟-2'-脱氧尿苷、2'-氟胸苷、2-甲基-腺苷、2-甲基-鸟苷、2-甲基-硫代-N6-异戊烯基(isopenenyl)-腺苷、2'-O-甲基-2-氨基腺苷、2'-O-甲基-2'-脱氧腺苷、2'-O-甲基-2'-脱氧胞苷、2'-O-甲基-2'-脱氧鸟苷、2'-O-甲基-2'-脱氧尿苷、2'-O-甲基-5-甲基尿苷、2'-O-甲基肌苷、2'-O-甲基假尿苷、2-硫代胞苷、2-硫代-胞嘧啶、3-甲基-胞嘧啶、4-乙酰基-胞嘧啶、4-硫代尿苷、5-(羧基羟基甲基)-尿嘧啶、5,6-二氢尿苷、5-氨基烯丙基胞苷、5-氨基烯丙基-脱氧-尿苷、5-溴尿苷、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-羧基甲基氨基(amono)甲基-尿嘧啶、5-氯-阿糖-胞嘧啶、5-氟-尿苷、5-碘尿苷、5-甲氧基羰基甲基-尿苷、5-甲氧基-尿苷、5-甲基-2-硫代-尿苷、6-氮胞苷、6-氮尿苷、6-氯-7-脱氮-鸟苷、6-氯嘌呤核糖核苷、6-巯基-鸟苷、6-甲基-巯基嘌呤-核糖核苷、7-脱氮-2'-脱氧-鸟苷、7-脱氮腺苷、7-甲基-鸟苷、8-氮腺苷、8-溴-腺苷、8-溴-鸟苷、8-巯基-鸟苷、8-氧代鸟苷、苯并咪唑-核糖核苷、β-D-甘露糖苷-queosine、二氢-尿嘧啶、肌苷、N1-甲基腺苷、N6-([6-氨基己基]氨基甲酰基甲基)-腺苷、N6-异戊烯基-腺苷、N6-甲基-腺苷、N7-甲基-黄苷、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、嘌呤霉素、Queosine、尿嘧啶-5-氧基乙酸、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、Wybutoxosine、黄苷和木糖(xylo)-腺苷。此种类似物的制备是本领域技术人员例如自美国专利4,373,071、US 4,401,796、US 4,415,732、US 4,458,066、US 4,500,707、US 4,668,777、US 4,973,679、US 5,047,524、US 5,132,418、US 5,153,319、US 5,262,530和5,700,642可知的。在如上所述的类似物的情况中,根据本发明尤其优选的可以是增加本发明组合物的mRNA的免疫原性和/或不干扰已被引入的mRNA的进一步修饰的那些类似物。
[0086] 根据特别的实施方案,本发明的组合物的至少一种mRNA可以包含脂质修饰。此种脂质修饰的mRNA典型地包含编码如以上所限定的六种抗原中的至少一种的如本文所限定的mRNA。此种脂质修饰的mRNA典型地还包含至少一种与所述mRNA共价相连的接头和至少一种与相应的接头共价相连的脂质。备选地,脂质修饰的mRNA包含如本文所限定的(至少一种)mRNA和与所述mRNA共价相连(在没有接头的情况下)的至少一种(双功能)脂质。根据第三备选方案,脂质修饰的mRNA包含如本文所限定的mRNA,与所述mRNA共价相连的至少一种接头,和与相应的接头共价相连的至少一种脂质,并且同样与所述mRNA共价相连(在没有接头的情况下)的至少一种(双功能)脂质。
[0087] 本发明的组合物的至少一种mRNA中所含的脂质(与其复合或共价连接)典型地是优选自身具有生物学活性的脂质或亲脂性残基。此种脂质优选地包括天然物质或化合物如,例如,维生素,例如α-生育酚(维生素E),包括RRR-α-生育酚(之前被称为D-α-生育酚),L-α-生育酚,外消旋D,L-α-生育酚,维生素E琥珀酸酯(VES),或维生素A及其衍生物,例如视黄酸,视黄醇,维生素D及其衍生物,例如维生素D及其麦角固醇前体,维生素E及其衍生物,维生素K及其衍生物,例如维生素K和相关的醌或植醇化合物,或类固醇,如胆汁酸,例如胆酸,脱氧胆酸,脱氢胆酸,可的松,洋地黄毒苷(digoxygenin),睾酮,胆固醇或硫代胆固醇。另外的在本发明范围内的脂质或亲脂性残基包括,但不限于,聚亚烷基二醇(Oberhauser等,Nucl.Acids Res.,1992,20,533),脂肪族基团如,例如,C1-C20-链烷,C1-C20-链烯烃或C1-C20-链烷醇化合物等,如,例如,十二烷二醇,十六烷醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等,EMBO J,1991,10,111;Kabanov等,FEBS Lett.,1990,259,327;Svinarchuk等,Biochimie,1993,75,49),磷脂如,例如,磷脂酰甘油,二酰基磷脂酰甘油,磷脂酰胆碱,二棕榈酰磷脂酰胆碱,二硬脂酰磷脂酰胆碱,磷脂酰丝氨酸,磷脂酰乙醇胺,二-十六烷基-rac-甘油,鞘脂,脑苷脂,神经节苷脂,或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸盐(Manoharan等,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651;Shea等,Nucl.Acids Res.,1990,18,
3777),聚胺或聚亚烷基二醇,如,例如,聚乙二醇(PEG)(Manoharan等,Nucleosides&Nucleotides,1995,14,969),六乙二醇(HEG),棕榈精或棕榈酰基残基(Mishra等,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229),十八胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇残基(Crooke等,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923),并且还有蜡,萜烯,脂环烃,饱和和单-或聚-不饱和脂肪酸残基等。
[0088] 本发明的组合物的至少一种mRNA可以同样被稳定化以防止mRNA在体内通过不同途径降解。本领域中已知的是,mRNA或体内RNA的不稳定性和(快速)降解通常可以代表基于RNA的组合物的应用中的严重问题。RNA的这种不稳定性典型地是由于降解RNA的酶,"RNA酶"(核糖核酸酶)所致,其中污染有此种核糖核酸酶有时可以完全降解在溶液中的RNA。因此,mRNA在细胞的细胞质中的天然降解被非常精细地调节并且RNA酶污染通常可以在使用所述组合物前通过特殊处理(尤其是利用焦酸二乙酯(DEPC))除去。在这点上,天然降解的多种机制是现有技术中已知的,其同样可以被利用。例如,末端结构典型地对体内的mRNA非常重要。例如,在自然存在的mRNA的5'端通常存在所谓的"帽结构"(修饰的鸟苷核苷酸),并且在3'端典型地存在多至200个腺苷核苷酸的序列(所谓的聚-A尾)。
[0089] 本发明的组合物的至少一种mRNA因此可以通过添加所谓的"5'帽"结构而被稳定以避免被RNA酶降解。在这点上,特别优选的是m7G(5')ppp(5'(A,G(5')ppp(5')A或G(5')ppp(5')G作为5'帽"结构。然而,只有在以下情况下才引入此种修饰,即在本发明的组合物的mRNA的5'端还没有引入修饰,例如脂质修饰,或者所述修饰不干扰所述(未修饰的或化学修饰的)mRNA的免疫原性。
[0090] 根据另一个优选的实施方案,本发明的组合物的至少一种mRNA可以在3'端包含典型地约10至200个腺苷核苷酸,优选地约10至100个腺苷核苷酸,更优选地约40至80个腺苷核苷酸或甚至更优选地约50至70个腺苷核苷酸的聚-A尾。
[0091] 根据另一个优选的实施方案,本发明的组合物的至少一种mRNA可以在3'端包含典型地约10至200个胞嘧啶核苷酸,优选地约10至100个胞嘧啶核苷酸,更优选地约20至70个胞嘧啶核苷酸或甚至更优选地约20至60或甚至10至40个胞嘧啶核苷酸的聚-C尾。
[0092] 根据本发明的至少一种mRNA优选地包含或编码至少一个组蛋白茎-环。在本发明的语境中,此种组蛋白茎-环通常(不管其是否是组蛋白茎环)典型地来源于组蛋白基因并且包含两个相邻的完全或部分反向互补的序列的分子内碱基配对,由此形成茎-环。茎-环可以出现在单链DNA中,或更通常地,出现在RNA中。
[0093] 在本申请的语境中,组蛋白茎-环序列可以被其DNA或其对应的RNA序列描述。因此,在本申请的通篇,任何对组蛋白茎-环序列(其在本文中由DNA序列(例如SEQ ID NO:37至66和70)表示)的提及还包括相应的RNA序列。这尤其适用于包含在根据本发明的至少一种mRNA中的组蛋白茎-环序列。因此,通过提及限定组蛋白茎-环的具体DNA序列,相应的RNA序列也被限定。
[0094] 该结构也被称为发夹或发夹环并且通常由在连续序列内的茎和(末端)环组成,其中所述茎由两个相邻的完全或部分反向互补的序列形成,所述两个相邻的完全或部分反向互补的序列被间隔以某种程度上作为间隔区的短序列,所述短序列构成茎-环结构的环。所述两个相邻的完全或部分反向互补的序列可以被定义为例如茎环元件茎1和茎2。当这两个相邻的完全或部分反向互补的序列,例如茎环元件茎1和茎2,彼此形成碱基配对,从而产生在其由位于连续序列上的茎环元件茎1和茎2之间的短序列形成的末端结尾处包含未配对的环的双链核酸序列区段时,形成茎环。所述未配对的环因此典型地表示不能够与这些茎环元件中的任一个碱基配对的核酸区域。所得的棒棒糖形结构是许多RNA二级结构的关键构件。茎-环结构的形成因此取决于产生的茎和环区域的稳定性,其中第一先决条件典型地是存在能够回折于其自身上以形成配对的双链的序列。配对的茎环元件的稳定性由其包含的错配或凸起的长度、数量(少量的错配典型地是可忍受的,尤其是在长的双链区段中)和配对区域的碱基组成确定。在本发明的语境中,可以想到的环长度为3至15个碱基,而更优选的环长度是3-10个碱基,更优选是3至8,3至7,3至6个碱基或甚至更优选是4至5个碱基,并且最优选是4个碱基。形成组蛋白茎-环中的茎区的序列典型地具有5至10个碱基,更优选地5至8个碱基的长度,其中优选地所述碱基中的至少一个表示错配,即不进行碱基配对。
[0095] 在本发明的语境中,组蛋白茎-环典型地来源于组蛋白基因(例如来自组蛋白家族H1、H2A、H2B、H3、H4的基因)并且包含两个相邻的完全或部分反向互补的序列的分子内碱基配对,由此形成茎-环。典型地,组蛋白3'UTR茎-环是参与组蛋白mRNA的核胞质转运和胞质中的稳定性和翻译效率的调节的RNA元件。后生动物组蛋白基因的mRNA缺少聚腺苷酸化和聚-A尾,代替地,3'端加工发生在该高度保守的茎-环和下游约20个核苷酸处的嘌呤富集区域(组蛋白下游元件,或HDE)之间的位点处。所述组蛋白茎-环被31kDa茎-环结合蛋白(SLBP–也被称为组蛋白发夹结合蛋白,或HBP)结合。本发明优选地采用此种组蛋白茎-环结构并且结合其他序列元件和结构,所述序列元件和结构并不天然地出现(意指在未转化的活的生物体/细胞中)在组蛋白基因中,但是根据本发明被结合以提供人工的异源核酸。因此,发现组蛋白茎-环结构与不出现在组蛋白基因或后生动物组蛋白基因中并且分离自编码除组蛋白以外的蛋白质的基因的操作和/或调节序列区域(影响转录和/或翻译)的其他异源序列元件的人工(非天然)组合,提供有利效果。因此,本发明的一个实施方案包括组蛋白茎-环结构与不出现在后生动物组蛋白基因中的聚腺苷酸序列或表示聚腺苷酸化信号的序列(编码区的3’-端)的组合。根据本发明的另一个优选实施方案,此处提供组蛋白茎-环结构与编码区的组合,所述编码区编码如以上所限定的根据本发明的至少一种抗原,所述编码区优选地不出现在后生动物组蛋白基因中(编码区和组蛋白茎环序列是异源的)。
[0096] 组蛋白茎环因此是如本文所述的茎-环结构,其(如果优选功能限定)显示/保持与其天然结合伙伴茎-环结合蛋白(SLBP–也被称为组蛋白发夹结合蛋白,或HBP)结合的性质。
[0097] 在优选的实施方案中,组蛋白茎环序列不来源于小鼠组蛋白。更具体地,所述组蛋白茎环序列不可以来源于小鼠组蛋白基因H2A614。并且,根据本发明的至少一种mRNA既不可以包含小鼠组蛋白茎环序列也不可以包含小鼠组蛋白基因H2A614。此外,根据本发明的至少一种mRNA不可以包含茎-环加工信号,更具体地,小鼠组蛋白加工信号,并且最具体地,不可以包含小鼠茎环加工信号H2kA614,即使所述至少一种mRNA包含至少一种哺乳动物组蛋白基因。然而,所述至少一种哺乳动物组蛋白基因不可以是WO 01/12824的Seq.ID No.7。
[0098] 如以上所限定的至少一种mRNA优选地包含编码如以上所限定的抗原或其片段、变体或衍生物的编码区;和包含至少一个组蛋白茎-环的3’UTR。当所述至少一种mRNA除了以上限定的抗原外还编码另外的肽或蛋白质时,则所述编码的肽或蛋白质优选不是如以上所限定的组蛋白、报告蛋白和/或标记或选择蛋白。所述至少一种mRNA的3’UTR优选地还包含如本文所限定的聚腺苷酸和/或聚胞苷酸序列。3’UTR的单个元件可以以任何次序从5’至3’沿所述至少一种mRNA的序列出现在其中。此外,还可以包含如本文所述的另外的元件,如如本文所限定的稳定化序列(例如来源于球蛋白基因的UTR的)、IRES序列等。所述各元件还可以在根据本发明的至少一种mRNA中重复至少一次(尤其是在双顺反子或多顺反子构建体中),优选地两次以上。例如,所述单个元件可以如下次序存在于所述至少一种mRNA中:
[0099] 5’–编码区–组蛋白茎-环–聚腺苷酸/(C)序列–3’;或
[0100] 5’–编码区–聚腺苷酸/(C)序列–组蛋白茎-环–3’;或
[0101] 5’–编码区–组蛋白茎-环–聚腺苷酸化信号–3’;或
[0102] 5’–编码区–聚腺苷酸化信号–组蛋白茎-环–3’;或
[0103] 5’–编码区–组蛋白茎-环–组蛋白茎-环–聚腺苷酸/(C)序列–3’;或[0104] 5’–编码区–组蛋白茎-环–组蛋白茎-环–聚腺苷酸化信号–3’;或
[0105] 5’–编码区–稳定化序列–聚腺苷酸/(C)序列–组蛋白茎-环–3’;或
[0106] 5’–编码区–稳定化序列–聚腺苷酸/(C)序列–聚腺苷酸/(C)序列–组蛋白茎-环–3’;等。
[0107] 关于这点,尤其优选的是–如果所述至少一种mRNA除了以上限定的抗原外还编码另外的肽或蛋白质–则所编码的肽或蛋白质优选地不是组蛋白、报告蛋白(例如荧光素酶、GFP、EGFP、β-半乳糖苷酶,尤其是EGFP)和/或标记或选择蛋白(例如α-球蛋白、半乳糖激酶和黄嘌呤:鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT))。
[0108] 在优选的实施方案中,根据本发明的mRNA不包含报告基因或标记基因。优选地,根据本发明的mRNA不编码例如,荧光素酶;绿色荧光蛋白(GFP)及其变体(如eGFP、RFP或BFP);α-球蛋白;次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT);β-半乳糖苷酶;半乳糖激酶;碱性磷酸酶;分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP))或抗性基因(如针对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素和zeocin的抗性基因)。在优选的实施方案中,根据本发明的mRNA不编码荧光素酶。在另一个实施方案中,根据本发明的mRNA不编码GFP或其变体。
[0109] 在另外的优选的实施方案中,根据本发明的mRNA不编码来源于病毒,优选地来源于属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的家族的病毒的蛋白质(或蛋白质的片段)。优选地,所述mRNA不编码来源于流感病毒(更优选地A型流感病毒)的蛋白质。优选地,根据本发明的mRNA不编码选自由以下组成的组的A型流感蛋白质:血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、M1、M2、NS1、NS2(NEP:核外运蛋白)、PA、PB1(碱性聚合酶1)、PB1-F2和PB2。在另一个优选的实施方案中,根据本发明的mRNA不编码卵清蛋白(OVA)或其片段。优选地,根据本发明的mRNA不编码A型流感蛋白质或卵清蛋白。
[0110] 根据一个优选的实施方案,根据本发明的至少一种mRNA包含至少一个优选根据以下式(I)或(II)中的至少一个的组蛋白茎-环序列:
[0111] 式(I)(不具有茎分界元件的茎-环序列):
[0112]
[0113] 式(II)(具有茎分界元件的茎-环序列):
[0114]
[0115] 其中:
[0116] 茎1或茎2分界元件N1-6是1至6,优选地2至6,更优选地2至5,甚至更优选地3至5,最优选地4至5或5个N的连续序列,其中每个N彼此独立地选自:选自A、U、T、G和C的核苷酸,或其核苷酸类似物;
[0117] 茎1[N0-2GN3-5]与元件茎2反向互补或部分反向互补,并且是5至7个核苷酸的连续序列;
[0118] 其中N0-2是0至2,优选地0至1,更优选地1个N的连续序列,其中每个N彼此独立地选自:选自A、U、T、G和C的核苷酸或其核苷酸类似物;
[0119] 其中N3-5是3至5,优选地4至5,更优选地4个N的连续序列,其中每个N彼此独立地选自:选自A、U、T、G和C的核苷酸或其核苷酸类似物,并且
[0120] 其中G是鸟苷或其类似物,并且可以任选地被胞苷或其类似物代替,前提是其在茎2中的互补核苷酸胞苷被鸟苷代替;
[0121] 环序列[N0-4(U/T)N0-4]位于元件茎1和茎2之间,并且是3至5个核苷酸,更优选地4个核苷酸的连续序列;
[0122] 其中每个N0-4彼此独立地是0至4,优选地1至3,更优选地1至2个N的连续序列,其中每个N彼此独立地选自:选自A、U、T、G和C的核苷酸或其核苷酸类似物;并且
[0123] 其中U/T表示尿苷,或任选地胸苷;
[0124] 茎2[N3-5CN0-2]与元件茎1反向互补或部分反向互补,并且是5至7个核苷酸的连续序列;
[0125] 其中N3-5是3至5,优选地4至5,更优选地4个N的连续序列,其中每个N彼此独立地选自:选自A、U、T、G和C的核苷酸或其核苷酸类似物;
[0126] 其中N0-2是0至2,优选地0至1,更优选地1个N的连续序列,其中每个N彼此独立地选自:选自A、U、T、G或C的核苷酸或其核苷酸类似物;并且
[0127] 其中C是胞苷或其类似物,并且可以任选地被鸟苷或其类似物代替前提是其在茎1中的互补核苷酸鸟苷被胞苷替代;
[0128] 其中
[0129] 茎1和茎2能够彼此碱基配对从而形成反向互补的序列,其中碱基配对可以发生在茎1和茎2之间,例如通过核苷酸A和U/T或G和C的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对或通过非沃森-克里克碱基配对例如摆动(wobble)碱基配对,反向沃森-克里克碱基配对,Hoogsteen碱基配对,反向Hoogsteen碱基配对,或者能够彼此碱基配对从而形成部分反向互补的序列,其中不完全的碱基配对可以发生在茎1和茎2之间,这基于以下,即一个茎中的一个或多个碱基在另一个茎的反向互补序列中不具有互补碱基。
[0130] 在以上语境中,摆动碱基配对典型地是两个核苷酸之间的非沃森-克里克碱基配对。在本发明的语境中可用的四种主要的摆动碱基对是鸟苷-尿苷、肌苷-尿苷、肌苷-腺苷、肌苷-胞苷(G-U/T、I-U/T、I-A和I-C)和腺苷-胞苷(A-C)。
[0131] 因此,在本发明的语境中,摆动碱基是如上所述的与另外的碱基形成摆动碱基对的碱基。因此,非沃森-克里克碱基配对,例如摆动碱基配对,可以出现在根据本发明的至少一种mRNA中的组蛋白茎-环结构的茎中。
[0132] 在以上语境中,在通过茎1和茎2的碱基配对形成的茎-环序列的茎-结构中,部分反向互补序列包含最多2个,优选地仅一个错配。换言之,茎1和茎2优选地能够彼此在茎1和茎2的整个序列上(完全)碱基配对(100%可能的正确的沃森-克里克或非沃森-克里克碱基配对),由此形成反向互补序列,其中各碱基具有其正确的沃森-克里克或非沃森-克里克碱基下垂物(pendant)作为互补结合伙伴。备选地,茎1和茎2优选地能够彼此在茎1和茎2的整个序列上部分碱基配对,其中至少约70%、75%、80%、85%、90%或95%的100%可能的正确的沃森-克里克或非沃森-克里克碱基配对被正确的沃森-克里克或非沃森-克里克碱基配对占据,并且最多约30%、25%、20%、15%、10%或5%的剩余的碱基是未配对的。
[0133] 根据优选的实施方案,如本文所限定的至少一种mRNA的至少一个组蛋白茎-环序列(具有茎分界元件)具有约15至约45个核苷酸的长度,优选地约15至约40个核苷酸的长度,优选地约15至约35个核苷酸的长度,优选地约15至约30个核苷酸的长度并且甚至更优选地约20至约30个核苷酸的长度并且最优选地约24至约28个核苷酸的长度。
[0134] 根据另一个优选的实施方案,如本文所限定的至少一种mRNA的至少一个组蛋白茎-环序列(不具有茎分界元件)具有约10至约30个核苷酸的长度,优选地约10至约20个核苷酸的长度,优选地约12至约20个核苷酸的长度,优选地约14至约20个核苷酸的长度并且甚至更优选地约16至约17个核苷酸的长度并且最优选地约16个核苷酸的长度。
[0135] 根据另一个优选的实施方案,根据本发明的至少一种mRNA可以包含至少一个根据以下具体式(Ia)或(IIa)中的至少一个的组蛋白茎-环序列:
[0136] 式(Ia)(不具有茎分界元件的茎-环序列):
[0137]
[0138] 式(IIa)(具有茎分界元件的茎-环序列):
[0139]
[0140] 其中:
[0141] N、C、G、T和U是如以上所限定的。
[0142] 根据第一方面的另一个更特别优选的实施方案,所述至少一种mRNA可以包含或编码至少一个根据以下具体式(Ib)或(IIb)中的至少一个的组蛋白茎-环序列:
[0143] 式(Ib)(不具有茎分界元件的茎-环序列):
[0144]
[0145] 式(IIb)(具有茎分界元件的茎-环序列):
[0146]
[0147] 其中:
[0148] N、C、G、T和U是如以上所限定的。
[0149] 根据甚至更优选的实施方案,根据本发明的至少一种mRNA可以包含至少一个根据以下具体式(Ic)至(Ih)或(IIc)至(IIh)中的至少一个的组蛋白茎-环序列,其备选地被显示为其茎-环结构和代表组蛋白茎-环序列的线形序列:
[0150] 式(Ic):(不具有茎分界元件的后生动物和原生动物组蛋白茎-环共有序列):
[0151]
[0152] (线形序列)(SEQ ID NO:25)
[0153] 式(IIc):(具有茎分界元件的后生动物和原生动物组蛋白茎-环共有序列):
[0154]
[0155] (线形序列)(SEQ ID NO:26)
[0156] 式(Id):(不具有茎分界元件)
[0157]
[0158] (线形序列)(SEQ ID NO:27)
[0159] 式(IId):(具有茎分界元件)
[0160]
[0161] (线形序列)(SEQ ID NO:28)
[0162] 式(Ie):(不具有茎分界元件的原生动物组蛋白茎-环共有序列)
[0163]
[0164] (线形序列)(SEQ ID NO:29)
[0165] 式(IIe):(具有茎分界元件的原生动物组蛋白茎-环共有序列)
[0166]
[0167] (线形序列)(SEQ ID NO:30)
[0168] 式(If):(不具有茎分界元件的后生动物组蛋白茎-环共有序列)
[0169]
[0170] (线形序列)(SEQ ID NO:31)
[0171] 式(IIf):(具有茎分界元件的后生动物组蛋白茎-环共有序列)
[0172]
[0173] (线形序列)(SEQ ID NO:32)
[0174] 式(Ig):(不具有茎分界元件的脊椎动物组蛋白茎-环共有序列)
[0175]
[0176] (线形序列)(SEQ ID NO:33)
[0177] 式(IIg):(具有茎分界元件的脊椎动物组蛋白茎-环共有序列)
[0178]
[0179] (线形序列)(SEQ ID NO:34)
[0180] 式(Ih):(不具有茎分界元件的人组蛋白茎-环共有序列(Homo sapiens))
[0181]
[0182] (线形序列)(SEQ ID NO:35)
[0183] 式(IIh):(具有茎分界元件的人组蛋白茎-环共有序列(Homo sapiens))
[0184]
[0185] (线形序列)(SEQ ID NO:36)
[0186] 其中在各以上式(Ic)至(Ih)或(IIc)至(IIh)中:
[0187] N、C、G、A、T和U是如以上所限定的;
[0188] 各个U可以被T代替;
[0189] 茎元件1和2中的各个(高度)保守的G或C可以被其互补核苷酸碱基C或G代替,前提是其在相应的茎中的互补核苷酸并行地被其互补核苷酸代替;和/或
[0190] G、A、T、U、C、R、Y、M、K、S、W、H、B、V、D和N是如下表中所限定的核苷酸碱基:
[0191]简写 核苷酸碱基 备注
G G 鸟嘌呤
A A 腺嘌呤
T T 胸腺嘧啶
U U 尿嘧啶
C C 胞嘧啶
R G或A 嘌呤
Y T/U或C 嘧啶
M A或C 氨基
K G或T/U 酮(Keto)
S G或C 强(3H键)
W A或T/U 弱(2H键)
H A或C或T/U 不是G
B G或T/U或C 不是A
V G或C或A 不是T/U
D G或A或T/U 不是C
N G或C或T/U或A 任何碱基
* 存在或不存在 碱基可以存在或不存在
[0192] 关于这点,尤其优选的是,根据以上式(I)或(Ia)至(Ih)或(II)或(IIa)至(IIh)中的至少一个的组蛋白茎-环序列选自自然存在的组蛋白茎环序列,更特别优选的是选自原生动物或后生动物组蛋白茎-环序列,并且甚至更特别优选的是选自脊椎动物并且最优选的是选自哺乳动物组蛋白茎-环序列尤其是选自人组蛋白茎-环序列。
[0193] 根据尤其是优选的实施方案,根据具体式(I)或(Ia)至(Ih)或(II)或(IIa)至(IIh)中的至少一个的组蛋白茎-环序列是这样的组蛋白茎-环序列,其在各核苷酸位置处包含出现频率最高的核苷酸,或出现频率最高的或出现频率第二高的后生动物和原生动物、原生动物、后生动物、脊椎动物和人中的自然存在的组蛋白茎-环序列的核苷酸。关于这点,尤其优选的是,所有核苷酸中的至少80%,优选至少85%,或最优选至少90%对应于自然存在的组蛋白茎-环序列的出现频率最高的核苷酸。
[0194] 在另一个特别的实施方案中,根据以上具体式(I)或(Ia)至(Ih)中的至少一个的组蛋白茎-环序列选自以下组蛋白茎-环序列(不具有茎-分界元件):
[0195] VGYYYYHHTHRVVRCB(SEQ ID NO:37,根据式(Ic))
[0196] SGYYYTTYTMARRRCS(SEQ ID NO:38,根据式(Ic))
[0197] SGYYCTTTTMAGRRCS(SEQ ID NO:39,根据式(Ic))
[0198] DGNNNBNNTHVNNNCH(SEQ ID NO:40,根据式(Ie))
[0199] RGNNNYHBTHRDNNCY(SEQ ID NO:41,根据式(Ie))
[0200] RGNDBYHYTHRDHNCY(SEQ ID NO:42,根据式(Ie))
[0201] VGYYYTYHTHRVRRCB(SEQ ID NO:43,根据式(If))
[0202] SGYYCTTYTMAGRRCS(SEQ ID NO:44,根据式(If))
[0203] SGYYCTTTTMAGRRCS(SEQ ID NO:45,根据式(If))
[0204] GGYYCTTYTHAGRRCC(SEQ ID NO:46,根据式(Ig))
[0205] GGCYCTTYTMAGRGCC(SEQ ID NO:47,根据式(Ig))
[0206] GGCTCTTTTMAGRGCC(SEQ ID NO:48,根据式(Ig))
[0207] DGHYCTDYTHASRRCC(SEQ ID NO:49,根据式(Ih))
[0208] GGCYCTTTTHAGRGCC(SEQ ID NO:50,根据式(Ih))
[0209] GGCYCTTTTMAGRGCC(SEQ ID NO:51,根据式(Ih))
[0210] 此外,关于这点,根据具体式(II)或(IIa)至(IIh)中的一个的以下组蛋白茎-环序列(具有茎分界元件)是尤其优选的:
[0211] H*H*HHVVGYYYYHHTHRVVRCBVHH*N*N*(SEQ ID NO:52,根据式(IIc))
[0212] M*H*MHMSGYYYTTYTMARRRCSMCH*H*H*(SEQ ID NO:53,根据式(IIc))
[0213] M*M*MMMSGYYCTTTTMAGRRCSACH*M*H*(SEQ ID NO:54,根据式(IIc))
[0214] N*N*NNNDGNNNBNNTHVNNNCHNHN*N*N*(SEQ ID NO:55,根据式(IIe))
[0215] N*N*HHNRGNNNYHBTHRDNNCYDHH*N*N*(SEQ ID NO:56,根据式(IIe))
[0216] N*H*HHVRGNDBYHYTHRDHNCYRHH*H*H*(SEQ ID NO:57,根据式(IIe))
[0217] H*H*MHMVGYYYTYHTHRVRRCBVMH*H*N*(SEQ ID NO:58,根据式(IIf))
[0218] M*M*MMMSGYYCTTYTMAGRRCSMCH*H*H*(SEQ ID NO:59,根据式(IIf))
[0219] M*M*MMMSGYYCTTTTMAGRRCSACH*M*H*(SEQ ID NO:60,根据式(IIf))
[0220] H*H*MAMGGYYCTTYTHAGRRCCVHN*N*M*(SEQ ID NO:61,根据式(IIg))
[0221] H*H*AAMGGCYCTTYTMAGRGCCVCH*H*M*(SEQ ID NO:62,根据式(IIg))
[0222] M*M*AAMGGCTCTTTTMAGRGCCMCY*M*M*(SEQ ID NO:63,根据式(IIg))
[0223] N*H*AAHDGHYCTDYTHASRRCCVHB*N*H*(SEQ ID NO:64,根据式(IIh))
[0224] H*H*AAMGGCYCTTTTHAGRGCCVMY*N*M*(SEQ ID NO:65,根据式(IIh))
[0225] H*M*AAAGGCYCTTTTMAGRGCCRMY*H*M*(SEQ ID NO:66,根据式(IIh))
[0226] 根据另一个优选的实施方案,根据本发明的组合物的至少一种mRNA包含至少一个组蛋白茎-环序列,其显示与根据具体式(I)或(Ia)至(Ih)或(II)或(IIa)至(IIh)中的至少一个的组蛋白茎-环序列中的保守核苷酸或与自然存在的组蛋白茎-环序列的至少约80%,优选地至少约85%,更优选地至少约90%,或甚至更优选地至少约95%的序列同一性(没有达到100%)。
[0227] 特别优选的组 蛋白 茎-环序 列是 根据SEQ I D NO:70的 序列CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA或更优选地根据SEQ ID NO:70的核酸序列的相应的RNA序列:
[0228] CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCA(SEQ ID NO:71)。
[0229] 在优选的实施方案中,组蛋白茎环序列不包含环序列5’-UUUC-3’。更具体地,组蛋白茎环分别不包含茎1序列5’-GGCUCU-3’和/或茎2序列5’-AGAGCC-3’。在另一个优选的实施方案中,茎环序列不包含环序列5’-CCUGCCC-3’或环序列5’-UGAAU-3’。更具体地,茎环分别不包含茎1序列5’-CCUGAGC-3’或不包含茎1序列5’-ACCUUUCUCCA-3’和/或茎2序列5’-GCUCAGG-3’或5’-UGGAGAAAGGU-3’。并且,茎环序列优选地不来源于哺乳动物胰岛素受体3’-未翻译区。并且,优选地,根据本发明的至少一种mRNA可以不包含组蛋白茎环加工信号,尤其是不包含来源于小鼠组蛋白基因H2A614基因(H2kA614)的那些。
[0230] 优选地,根据本发明的组合物的至少一种mRNA不包含由以下组成的组的组分中的一个或两个或至少一个或除了一个以外的全部或全部:编码核酶(优选地自剪接核酶)的序列,病毒核酸序列,组蛋白茎-环加工信号,尤其是来源于小鼠组蛋白H2A614基因的组蛋白-茎环加工序列,Neo基因,失活的启动子序列和失活的增强子序列。甚至更优选地,根据本发明的至少一种mRNA不包含核酶,优选自剪接核酶,和由以下组成的组中的一个:Neo基因,失活的启动子序列,失活的增强子序列,组蛋白茎-环加工信号,尤其是来源于小鼠组蛋白H2A614基因的组蛋白-茎环加工序列。因此,在优选的模式中,mRNA可以既不包含核酶(优选自剪接核酶),也不包含Neo基因或,备选地,既不包含核酶(优选自剪接核酶),也不包含任何抗性基因(例如通常用于选择的)。在另一个优选的模式中,本发明的至少一种mRNA可以既不包含核酶(优选自剪接核酶)也不包含组蛋白茎-环加工信号,尤其是来源于小鼠组蛋白H2A614基因的组蛋白-茎环加工序列
[0231] 备选地,根据本发明的组合物的至少一种mRNA任选地包含聚腺苷酸化信号,其在本文中被定义为通过特殊的蛋白因子(例如切割和聚腺苷酸化特异因子(CPSF),切割刺激因子(CstF),切割因子I和II(CF I和CF II),聚腺苷酸聚合酶(PAP))将聚腺苷酸化输送至(转录的)mRNA的信号。关于这点,共有聚腺苷酸化信号是优选的,包含NN(U/T)ANA共有序列。在尤其优选的方面,聚腺苷酸化信号包含以下序列中的一个:AA(U/T)AAA或A(U/T)(U/T)AAA(其中尿苷通常存在于RNA中而胸苷通常存在于DNA中)。在一些实施方案中,根据本发明的至少一种mRNA中使用的聚腺苷酸化信号不对应于U3snRNA,U5,来自人基因G-CSF的聚腺苷酸化加工信号,或SV40聚腺苷酸化信号序列。特别地,以上聚腺苷酸化信号不与任何抗生素抗性基因(或任何其他报告基因,标记基因或选择基因)组合,尤其是不与抗性neo基因(新霉素磷酸转移酶)组合。并且在根据本发明的至少一种mRNA中,任何以上的聚腺苷酸化信号优选地不与来自小鼠组蛋白基因H2A614的组蛋白茎环或组蛋白茎环加工信号组合。
[0232] 根据另一个实施方案,本发明的组合物的至少一种mRNA可以通过改变mRNA(优选所述至少一种mRNA的编码区)的G/C含量而被修饰,并因此被稳定化。
[0233] 在本发明的特别优选的实施方案中,相比于其具体的野生型mRNA(即未修饰的mRNA)的编码区的G/C含量,本发明的组合物的至少一种mRNA的编码区的G/C含量被改变,尤其是被增加。优选地,所述至少一种mRNA编码的氨基酸序列相比于所述具体的野生型mRNA编码的氨基酸序列没有改变。本发明的组合物的至少一种mRNA的此种改变是基于这样的事实,即要被翻译的任何mRNA区的序列对于所述mRNA的有效翻译是重要的。因此,不同核苷酸的组成和序列是重要的。特别地,具有增加的G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量的序列比具有增加的A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量的序列更稳定。根据本发明,mRNA的密码子因此有别于相应的野生型mRNA,同时保持翻译的氨基酸序列,以致其包含增加量的G/C核苷酸。根据若干密码子编码同一种氨基酸的事实(所谓的遗传密码的简并性),可以确定对于稳定性来说更优选的密码子(所谓的备选密码子选择)。取决于所述至少一种mRNA要编码的氨基酸,所述mRNA序列相比于其野生型序列存在多种改变的可能性。在由仅包含G或C核苷酸的密码子编码的氨基酸的情况中,不需要改变密码子。因此,Pro的密码子(CCC或CCG),Arg的密码子(CGC或CGG),Ala的密码子(GCC或GCG)和Gly的密码子(GGC或GGG)不需要改变,因为不存在A或U。与此对比,包含A和/或U核苷酸的密码子可以通过置换成编码相同氨基酸但不包含A和/或U的其他密码子而被改变。这些的实例是:Pro的密码子可以由CCU或CCA改变成CCC或CCG;Arg的密码子可以由CGU或CGA或AGA或AGG改变成CGC或CGG;Ala的密码子可以由GCU或GCA改变成GCC或GCG;Gly的密码子可以由GGU或GGA改变成GGC或GGG。在其他情况中,虽然不能将A或U核苷酸从密码子中排除,然而可能的是通过使用包含较低含量的A和/或U核苷酸的密码子而降低A和U含量。这些的实例是:Phe的密码子可以由UUU改变成UUC;Leu的密码子可以由UUA、UUG、CUU或CUA改变成CUC或CUG;Ser的密码子可以由UCU或UCA或AGU改变成UCC、UCG或AGC;Tyr的密码子可以由UAU改变成UAC;Cys的密码子可以由UGU改变成UGC;His的密码子可以由CAU改变成CAC;Gln的密码子可以由CAA改变成CAG;Ile的密码子可以由AUU或AUA改变成AUC;Thr的密码子可以由ACU或ACA改变成ACC或ACG;Asn的密码子可以由AAU改变成AAC;Lys的密码子可以由AAA改变成AAG;Val的密码子可以由GUU或GUA改变成GUC或GUG;Asp的密码子可以由GAU改变成GAC;Glu的密码子可以由GAA改变成GAG;终止密码子UAA可以改变成UAG或UGA。另一方面,在Met的密码子(AUG)和Trp的密码子(UGG)的情况中,不可能改变序列。以上列出的置换可以被单独地或以所有可能的组合用于使本发明的组合物的至少一种mRNA的G/C含量相比于其具体的野生型mRNA(即原序列)增加。因此,例如,存在于野生型序列中的Thr的所有密码子可以被改变成ACC(或ACG)。优选地,然而,例如,使用以上置换可能性的组合:
[0234] 原序列(野生型mRNA)中编码Thr的所有密码子置换成ACC(或ACG)和
[0235] 原来编码Ser的所有密码子置换成UCC(或UCG或AGC);原序列中编码Ile的所有密码子置换成AUC和
[0236] 原来编码Lys的所有密码子置换成AAG和
[0237] 原来编码Tyr的所有密码子置换成UAC;原序列中编码Val的所有密码子置换成GUC(或GUG)和
[0238] 原来编码Glu的所有密码子置换成GAG和
[0239] 原来编码Ala的所有密码子置换成GCC(或GCG)和
[0240] 原来编码Arg的所有密码子置换成CGC(或CGG);原序列中编码Val的所有密码子置换成GUC(或GUG)和
[0241] 原来编码Glu的所有密码子置换成GAG和
[0242] 原来编码Ala的所有密码子置换成GCC(或GCG)和
[0243] 原来编码Gly的所有密码子置换成GGC(或GGG)和
[0244] 原来编码Asn的所有密码子置换成AAC;原序列中编码Val的所有密码子置换成GUC(或GUG)和
[0245] 原来编码Phe的所有密码子置换成UUC和
[0246] 原来编码Cys的所有密码子置换成UGC和
[0247] 原来编码Leu的所有密码子置换成CUG(或CUC)和
[0248] 原来编码Gln的所有密码子置换成CAG和
[0249] 原来编码Pro的所有密码子置换成CCC(或CCG);等。优选地,相比于编码如本文所限定的抗原、抗原蛋白或抗原肽的野生型mRNA或其片段或变体的编码区的G/C含量,本发明的组合物的至少一种mRNA的编码区的G/C含量增加至少7%,更优选地至少15%,尤其是优选地至少20%。根据具体实施方案,编码如本文所限定的抗原、抗原蛋白或抗原肽的区域或其片段或变体或野生型mRNA序列的整个序列中的可置换密码子中的至少5%,10%,20%,30%,40%,50%,60%,更优选地至少70%,甚至更优选地至少80%,并且最优选地至少
90%,95%或甚至100%被置换,由此增加所述序列的GC/含量。关于这点,尤其优选的是,相比于野生型序列,增加本发明的组合物的至少一种(m)RNA的G/C含量至最大(即100%的可置换密码子),尤其是在蛋白的编码区中。根据本发明,本发明的组合物的至少一种mRNA的进一步优选的改变是基于这样的发现,即翻译效率也取决于tRNA在细胞中的不同出现频率。因此,如果所谓的“稀有密码子”以增加的程度存在于本发明的组合物的至少一种mRNA中,则与在编码相对“常见的”tRNA的密码子的情况中相比,相应的改变的至少一种mRNA序列被翻译的程度显著较差。根据本发明,在本发明的组合物的改变的至少一种mRNA中,编码所述抗原的区域相比于野生型mRNA的相应区域被改变,以致编码在细胞中相对稀有的tRNA的至少一个野生型序列密码子被换成编码在所述细胞中相对常见且带有与所述相对稀有的tRNA相同的氨基酸的tRNA的密码子。通过此改变,本发明的组合物的至少一种mRNA的序列被改变,以致对于常出现的tRNA可用的密码子被插入。换言之,根据本发明,通过此改变,在所有情况下,可以将编码在细胞中相对稀有的tRNA的所有野生型序列的密码子换成编码在细胞中相对常见且在所有情况下带有与所述相对稀有的tRNA相同的氨基酸的tRNA的密码子。哪种tRNA在细胞中相对常见地出现以及与此对比,哪种tRNA在细胞中相对稀有地出现,是本领域技术人员已知的;参见例如Akashi,Curr.Opin.Genet.Dev.2001,11(6):660-
666。使用最频繁出现的tRNA的特别的氨基酸的密码子,例如使用最频繁出现在(人)细胞中的tRNA的Gly密码子,是特别优选的。根据本发明,尤其优选的是将本发明的组合物的所述改变的至少一种mRNA中的连续的增加的(尤其是被最大化的)G/C含量与“常见的”密码子相结合,而不改变由所述mRNA的编码区编码的蛋白质的氨基酸序列。此优选的实施方案允许提供被特别有效地翻译和稳定化(改变)的本发明的组合物的至少一种mRNA。如上所述的本发明的组合物的改变的至少一种mRNA的确定(增加的G/C含量;tRNA的交换)可以使用在WO 
02/098443中说明的计算机程序进行-所述专利文献的公开内容完整地结合在本发明中。使用此计算机程序,借助于遗传密码或其简并性可以改变任何所需mRNA的核苷酸序列,以致产生最大G/C含量,结合使用编码在细胞中尽可能频繁出现的tRNA的密码子,相比于未改变的序列,由所述改变的至少一种mRNA编码的氨基酸序列优选地没有改变。备选地,还可能的是,相比于原序列,仅改变G/C含量或仅有密码子选择。Visual Basic 6.0(使用的开发环境:Microsoft Visual Studio Enterprise 6.0,带Servicepack 3)中的源代码也被描述于WO 02/098443中。在本发明的另一个优选的实施方案中,本发明的组合物的至少一种(m)RNA的核糖体结合位点的周围的A/U含量相比于其具体的野生型mRNA的核糖体结合位点的周围的A/U含量增加。此改变(核糖体结合位点附近增加的A/U含量)提高核糖体与所述至少一种mRNA结合的效率。核糖体与核糖体结合位点(Kozak序列:GCCGCCACCAUGG(SEQ ID NO:
67),AUG形成起始密码子)的有效结合又具有有效翻译所述至少一种mRNA的作用。根据本发明的另一个实施方案,本发明的组合物的至少一种mRNA可以关于潜在的不稳定序列元件而被改变。特别地,相比于具体的野生型mRNA,此至少一种mRNA的编码区和/或5'和/或3'未翻译区可以被改变以使其不包含不稳定序列元件,所述改变的至少一种mRNA的编码的氨基酸序列优选地相比于其具体的野生型mRNA不被改变。已知的是,例如,在真核RNA序列中存在不稳定序列元件(DSE),信号蛋白与其结合并调节体内的RNA酶促降解。为了进一步稳定所述改变的至少一种mRNA,任选地在编码如本文所限定的抗原、抗原蛋白或抗原肽的区域中,可以因此进行相比于野生型mRNA的相应区域的一种或多种此种改变,以致其中不包含或基本不包含不稳定序列元件。根据本发明,也可以通过此种改变将存在于未翻译区(3'-和/或
5'-UTR)中的DSE从本发明的组合物的至少一种mRNA中排除。此种不稳定序列例如是富AU序列(AURES),其出现在许多不稳定的RNA的3 '-UTR区段中( Caput等 ,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1986,83:1670至1674)。因此,优选地,相比于野生型mRNA,本发明的组合物的至少一种mRNA被改变以致所述至少一种mRNA不包含此种不稳定序列。这也适用于被可能的核酸内切酶识别的那些序列基序,例如序列GAACAAG,其包含在编码运蛋白受体的基因的3'-UTR区段中(Binder等,EMBO J.1994,13:1969至1980)。也优选在本发明的组合物的至少一种mRNA中除去这些序列基序。并且根据本发明,优选地,本发明的组合物的至少一种mRNA具有改变形式的如以上所限定的至少一种IRES和/或改变形式的至少一种5'和/或3'稳定化序列,例如用以增强核糖体结合或允许位于本发明的组合物的至少一种(双顺反子或甚至多顺反子)mRNA上的不同编码抗原的表达。
[0250] 根据本发明,本发明的组合物的至少一种mRNA还优选地具有至少一个5'和/或3'稳定化序列。5’和/或3’未翻译区中的这些稳定化序列具有增加至少一种mRNA在胞质中的半衰期的作用。这些稳定化序列可以与自然存在的序列(出现在病毒、细菌和真核生物中)具有100%序列同源性,但也可以是部分或完全合成的。例如来自人(Homo sapiens)或爪蟾(Xenopus laevis)的β-球蛋白基因的未翻译序列(UTR)可以作为可以在本发明中用于稳定化的mRNA的稳定化序列的实例被提及。稳定化序列的另一个实例具有通式(C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC(SEQ ID NO:68),其包含在编码α-球蛋白、α(I)-胶原蛋白、15-脂加氧酶或酪氨酸羟化酶的非常稳定的mRNA的3’UTR中(参见Holcik等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997,94:2410至2414)。当然,此种稳定化序列可以单独使用或彼此组合使用并且也可以与其他本领域技术人员已知的稳定化序列组合使用。本发明的组合物的至少一种mRNA因此优选地作为球蛋白UTR(未翻译区)-稳定化的mRNA存在,尤其是作为α-球蛋白UTR-稳定化的mRNA存在。优选地,所述组合物的至少一种mRNA包含来源于α-球蛋白基因(如人α-球蛋白基因)的3’UTR的中心α-复合物结合部分的3’-UTR中的稳定化序列,优选地根据SEQ ID No.69的稳定化序列:
[0251] α-球蛋白基因的3’UTR的中心α-复合物结合部分(在本文中也被称为“muag”)[0252] GCCCGAUGGGCCUCCCAACGGGCCCUCCUCCCCUCCUUGCACCG(SEQ ID NO.69)
[0253] 然而,碱基的置换、添加或消除优选地利用本发明的组合物的至少一种mRNA,使用用于制备本发明的组合物的至少一种mRNA的DNA基质,通过已知的定向诱变技术或利用寡核苷酸连接策略进行(见例如Maniatis等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆:实验室手册),Cold Spring Harbor Laboratory Press,3rd ed.,Cold Spring Harbor,NY,2001)。在此种方法中,为了制备所述至少一种mRNA,可以在体外对相应的DNA分子进行转录。该DNA基质优选地包含适用于体外转录的启动子,例如T7或SP6启动子,其之后是所需的用于要制备的至少一种mRNA的核苷酸序列和体外转录的终止信号。形成所关心的至少一种mRNA的基质的DNA分子可以通过发酵增殖及随后作为可在细菌中复制的质粒的部分的分离来制备。可被提及为适用于本发明的质粒有例如质粒pT7Ts(GenBank编号U26404;Lai等,Development 1995,121:2349至2360), 系列,例如 (GenBank编
号X65300;来自Promega)和pSP64(GenBank编号X65327);也参见Mezei和Storts,
Purification of PCR Products(PCR产物的纯化):Griffin和Griffin(ed.),PCR 
Technology:Current Innovation,CRC Press,Boca Raton,FL,2001。
[0254] 本发明的组合物的至少一种mRNA的稳定同样可以通过以下方式进行:将所述至少一种mRNA与阳离子化合物,尤其是聚阳离子化合物,例如(聚)阳离子肽或蛋白质缔合或复合或结合。特别地,使用鱼精蛋白、核仁蛋白、精胺或亚精胺作为对所述mRNA的聚阳离子的核酸结合蛋白是特别有效的。此外,使用其他阳离子肽或蛋白质,如聚-L-赖氨酸或组蛋白,同样是可能的。此用于稳定RNA的方法被描述于EP-A-1083232,所述专利文献的公开内容通过引用完整地结合于此。可用于稳定本发明的组合物的mRNA的另外的优选的阳离子物质包括阳离子多糖,例如脱乙酰壳多糖,聚凝胺(polybrene),聚乙烯亚胺(PEI)或聚-L-赖氨酸(PLL)等。本发明的组合物的至少一种mRNA与阳离子化合物,例如阳离子蛋白质或阳离子脂质(例如作为脂质系复合试剂的oligofectamine)的缔合或复合优选地增加作为药物活性成分存在的至少一种mRNA向待治疗的细胞或待治疗的生物体中的转移。在本文的公开内容中,关于本发明的组合物的至少一种mRNA的稳定作用还提及的是复合(complexation),其同样适应于RNA的稳定化。
[0255] 根据另一个特别优选的实施方案,所述组合物的至少一种mRNA可以另外地或备选地编码分泌信号肽。此种信号肽是典型地显示约15至30个氨基酸的长度并且优选地位于编码的肽的N端的序列,但不限于其。如本文所限定的信号肽优选地允许将由所述组合物的至少一种mRNA编码的抗原、抗原蛋白或抗原肽运输至限定的细胞区室,优选地运输至细胞表面、内质网(ER)或核内体-溶酶体区室。如本文所限定的分泌信号肽序列的实例包括,但不限于,经典的或非经典的MHC-分子的信号序列(例如MHC I和II分子的信号序列,例如MHC I类分子HLA-A*0201的信号序列),如本文所限定的细胞因子或免疫球蛋白的信号序列,如本文所限定的免疫球蛋白或抗体的恒定链的信号序列,Lamp1、Tapasin、Erp57、Calretikulin、钙联接蛋白及其他膜相关蛋白或与内质网(ER)或核内体-溶酶体区室相关的蛋白质的信号序列。尤其优选地,根据本发明可以使用MHC I类分子HLA-A*0201的信号序列。
[0256] 任何以上改变都可以适用于本发明的组合物的至少一种mRNA,并且进一步适用于如在本发明的语境中使用的任何(m)RNA,并且可以(如果合适或需要)以任意组合彼此结合,前提是,这些改变的组合在各自的RNA中不互相干扰。本领域技术人员将因此能够进行选择。
[0257] 根据优选的实施方案,所述组合物包含如本文所述的已经被改变的至少一种mRNA,所述至少一种mRNA包含至少一个编码序列,所述编码序列选自与SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、82、83、84或85的RNA序列相同或至少80%相同的RNA序列。甚至更优选地,所述组合物包含六种mRNA,其中每种mRNA中的编码序列与根据SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、82、
83、84或85的RNA序列之一相同或至少80%相同。
[0258] 在优选的实施方案中,本发明的组合物的六种抗原中的每种可以由一种(单顺反子)mRNA编码。换言之,本发明的组合物可以包含六种(单顺反子)mRNA,其中这六种(单顺反子)mRNA中的每种可以仅编码一种如以上所限的抗原。
[0259] 在甚至更优选的实施方案中,所述组合物包含六种mRNA,其各自已经如本文所述的那样被改变,其中,分别地,一种mRNA编码PSA,一种mRNA编码PSMA,一种mRNA编码PSCA,一种mRNA编码STEAP,一种mRNA编码PAP并且一种mRNA编码MUC1或其片段或变体。
[0260] 在甚至更优选的实施方案中,所述组合物包含六种mRNA和任选地另外的赋形剂,其中一种mRNA编码PSA并且包含与SEQ ID NO:3或82相同或至少80%相同的编码序列,一种mRNA编码PSMA并且包含与SEQ ID NO:6或83相同或至少80%相同的编码序列,一种mRNA编码PSCA并且包含与SEQ ID NO:9或84相同或至少80%相同的编码序列,一种mRNA编码STEAP并且包含与SEQ ID NO:12或85相同或至少80%相同的编码序列,一种mRNA编码PAP并且包含与SEQ ID NO:15相同或至少80%相同的编码序列,并且一种mRNA编码MUC1并且包含与SEQ ID NO:18相同或至少80%相同的编码序列(或这些序列中每个的片段或变体)。
[0261] 在一个实施方案中,所述组合物包含至少一种mRNA,其与SEQ ID NO:1、4、7、10、13或16的RNA序列相同或至少80%相同。甚至更优选地,所述组合物包含六种mRNA,其中每种mRNA与根据SEQ ID NO:1、4、7、10、13或16的RNA序列之一相同或至少80%相同。
[0262] 在甚至更优选的实施方案中,所述组合物包含六种mRNA和任选地另外的赋形剂,其中一种mRNA编码PSA并且与SEQ ID NO:1相同或至少80%相同,一种mRNA编码PSMA并且与SEQ ID NO:4相同或至少80%相同,一种mRNA编码PSCA并且与SEQ ID NO:7相同或至少80%相同,一种mRNA编码STEAP并且与SEQ ID NO:10相同或至少80%相同,一种mRNA编码PAP并且与SEQ ID NO:13相同或至少80%相同,并且一种mRNA编码MUC1并且与SEQ ID NO:16相同或至少80%相同(或这些序列中每个的片段或变体)。
[0263] 根据本发明的另一个优选的实施方案,上述组合物的至少一种mRNA包含在3’UTR区中的组蛋白茎-环。优选地,所述组合物包含六种mRNA,其中各mRNA包含如本文所限定的组蛋白茎-环。
[0264] 在优选的实施方案中,所述组合物包含六种mRNA和任选地另外的赋形剂,其中一种mRNA编码PSA并且与SEQ ID NO:19相同或至少80%相同,一种mRNA编码PSMA并且与SEQ ID NO:20相同或至少80%相同,一种mRNA编码PSCA并且与SEQ ID NO:21相同或至少80%相同,一种mRNA编码STEAP并且与SEQ ID NO:22相同或至少80%相同,一种mRNA编码PAP并且与SEQ ID NO:23相同或至少80%相同,并且一种mRNA编码MUC1并且与SEQ ID NO:24相同或至少80%相同(或这些序列中每个的片段或变体)。
[0265] 根据另一个实施方案,根据本发明的组合物可以包含佐剂以便增强所述组合物的免疫刺激性质。关于这点,佐剂可以被理解为适于支持根据本发明的组合物的施用和递送的任何化合物。此外,此种佐剂可以,但不限于,启动或增加先天免疫系统的免疫反应,即非特异性免疫反应。换言之,当施用时,根据本发明的组合物典型地由于由本发明的组合物中包含的至少一种mRNA所编码的至少六种抗原所致而启动适应性免疫反应。此外,根据本发明的组合物可以由于向其加入的如本文所限定的佐剂所致而产生(支持性)先天免疫反应。
[0266] 此种佐剂可以选自技术人员已知的并且适合于本发明的情况(即支持在哺乳动物中诱发免疫反应)的任何佐剂。优选地,所述佐剂可以选自由以下组成的组(但不限于):TDM,MDP,胞壁酰基二肽,普流尼克类(pluronics),明矾溶液,氢氧化,ADJUMERTM(聚磷腈);磷酸铝凝胶;来自藻类的葡聚糖;algammulin;氢氧化铝凝胶(明矾);高蛋白质吸附氢氧化铝凝胶;低粘度氢氧化铝凝胶;AF或SPT(角鲨烷(5%),Tween 80(0.2%),普流尼克L121(1.25%),磷酸缓冲盐水,pH 7.4的乳液);AVRIDINETM(丙烷二胺);BAY R1005TM((N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰氨基-b-D-吡喃葡糖基)-N-十八烷基-十二烷酰基-酰胺氢乙酸酯(hydroacetate));CALCITRIOLTM(1-α,25-二羟基-维生素D3);磷酸钙凝胶;CAPTM(磷酸钙纳米粒);霍乱全毒素,霍乱-毒素-A1-蛋白质-A-D-片段融合蛋白,霍乱毒素的B亚基;CRL 
1005(嵌段共聚物P1205);含细胞因子的脂质体;DDA(二甲基双十八烷基溴化铵);DHEA(脱氢表雄酮);DMPC(双十四烷酰基磷脂酰胆碱);DMPG(双十四烷酰基磷脂酰甘油);DOC/明矾络合物(脱氧胆酸钠盐);弗氏完全佐剂;弗氏不完全佐剂;γ菊糖;Gerbu佐剂(以下各项的混合物:i)N-乙酰基葡糖胺基-(P1-4)-N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-谷氨酸(GMDP),ii)二甲基双十八烷基氯化铵(DDA),iii)锌-L-脯氨酸盐络合物(ZnPro-8);GM-CSF);GMDP(N-乙酰基葡糖胺基-(b1-4)-N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酸);咪喹莫特(imiquimod)(1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺);ImmTherTM(N-乙酰基葡糖胺基-N-乙酰基胞壁酰基-L-Ala-D-异Glu-L-Ala-甘油二棕榈酸酯);DRV(制备自脱水-再水合囊泡的免疫脂质体);干扰素-γ;白介素-1β;白介素-2;白介素-7;白介素-12;ISCOMSTM;
ISCOPREP 7.0.3.TM;脂质体;LOXORIBINETM(7-烯丙基-8-氧代鸟苷);LT口服佐剂(大肠杆菌不稳定肠毒素-原毒素);任何组成的微球和微粒;MF59TM;(角鲨烯-水乳液);MONTANIDE ISA51TM(纯化的不完全弗氏佐剂);MONTANIDE ISA 720TM(可代谢的油性佐剂);MPLTM(3-Q-去酰基(desacyl)-4'-单磷酰基脂质A);MTP-PE和MTP-PE脂质体((N-乙酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-(羟基磷酰氧基))-乙基酰胺,一钠盐);MURAMETIDETM(Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3);MURAPALMITINETM和D-MURAPALMITINETM(Nac-Mur-L-Thr-D-异GIn-sn-甘油二棕榈酰基);NAGO(神经氨酸酶-半乳糖氧化酶);任何组成的纳米球或纳米粒;NISV(非离子表面活性剂小泡);PLEURANTM(β-葡聚糖);PLGA,PGA和PLA(乳酸和乙醇酸的均聚物和共聚合物;微球/纳米球);普流尼克L121TM;PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯);PODDSTM(类蛋白微球);聚亚乙基氨基甲酸酯衍生物;
聚-rA:聚-rU(聚腺苷酸-聚尿苷酸复合物);聚山梨酸酯80(Tween 80);蛋白脂质卷(protein cochleate)(Avanti Polar Lipids,Inc.,Alabaster,AL);STIMULONTM(QS-21);
Quil-A(Quil-A皂苷);S-28463(4-氨基-otec-二甲基-2-乙氧基甲基-1H-咪唑并[4,5c]喹啉-1-乙醇);SAF-1TM("Syntex佐剂制剂");Sendai脂蛋白体和含Sendai的脂质基质;Span-
85(脱水山梨醇三油酸酯);Specol(Marcol 52、Span 85和Tween 85的乳液);角鲨烯或(2,6,10,15,19,23-六甲基二十四烷和2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,
18,22-二十四碳六烯(tetracosahexane));硬脂酰酪氨酸(十八烷基酪氨酸盐酸盐);
(N-乙酰基葡糖胺基-N-乙酰基胞壁酰基-L-Ala-D-异Glu-L-Ala-二棕榈酰基
丙基酰胺);苏氨酰基-MDP(TermurtideTM或[thr 1]-MDP;N-乙酰基胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酸);Ty颗粒(Ty-VLP或病毒样颗粒);Walter-Reed脂质体(含有吸附在氢氧化铝上的脂质A的脂质体),和脂肽,包括Pam3Cys,尤其是铝盐,如Adju-phos,Alhydrogel,Rehydragel;乳液,包括CFA,SAF,IFA,MF59,Provax,TiterMax,Montanide,Vaxfectin;共聚物,包括Optivax(CRL1005),L121,Poloaxmer4010)等;脂质体,包括Stealth,脂质卷,包括BIORAL;来源于植物的佐剂,包括QS21,Quil A,Iscomatrix,ISCOM;适用于共刺激的佐剂,包括番茄素,生物聚合物,包括PLG,PMM,菊糖;来源于微生物的佐剂,包括罗莫肽(Romurtide),DETOX,MPL,CWS,甘露糖,CpG核酸序列,CpG7909,人TLR 1-10的配体,鼠TLR 
1-13的配体,ISS-1018,IC31,咪唑并喹啉,聚肌胞(Ampligen),Ribi529,IMOxine,IRIVs,VLPs,霍乱毒素,热不稳定毒素,Pam3Cys,Flagellin,GPI锚定物,LNFPIII/Lewis X,抗微生物肽,UC-1V150,RSV融合蛋白质,cdiGMP;以及适用作拮抗剂的佐剂,包括CGRP神经肽。
[0267] 合适的佐剂还可以选自阳离子或聚阳离子化合物,其中所述佐剂优选地在将本发明的组合物的至少一种mRNA与阳离子或聚阳离子化合物复合后制得。如本文所限定的所述组合物的至少一种mRNA与阳离子或聚阳离子化合物的缔合或复合优选地向所述组合物的至少一种mRNA提供辅助性质并给予稳定效应。特别优选的阳离子或聚阳离子化合物选自阳离子或聚阳离子肽或蛋白质,包括鱼精蛋白,核仁蛋白,精胺或亚精胺,或其他阳离子肽或蛋白质,如聚-L-赖氨酸(PLL),聚-精氨酸,碱性多肽,细胞渗透性肽(CPP),包括HIV结合肽,Tat,HIV-1Tat(HIV),Tat衍生的肽,穿透肽,VP22衍生的或类似物肽,HSV VP22(单纯疱疹),MAP,KALA或蛋白质转导结构域(PTD,PpT620,富脯氨酸的肽,富精氨酸的肽,富赖氨酸的肽,MPG-肽(s),Pep-1,L-低聚物,降钙素肽,触角(Antennapedia)衍生的肽(尤其是来自果蝇(Drosophila)触角的),pAntp,pIsl,FGF,乳铁蛋白,转运素(Transportan),Buforin-2,Bac715-24,SynB,SynB(1),pVEC,hCT衍生的肽,SAP,鱼精蛋白,精胺,亚精胺,或组蛋白。进一步优选的阳离子或聚阳离子化合物可以包括阳离子多糖,例如脱乙酰壳多糖,聚凝胺,阳离子聚合物,例如聚乙烯亚胺(PEI),阳离子脂质,例如DOTMA:1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵,DMRIE,二-C14-脒,DOTIM,SAINT,DC-Chol,BGTC,CTAP,DOPC,DODAP,DOPE:二油酰磷脂酰乙醇-胺,DOSPA,DODAB,DOIC,DMEPC,DOGS:双十八烷基酰胺甘氨酰精胺,DIMRI:双十四酰-氧基丙基二甲基羟乙基溴化铵,DOTAP:二油酰氧基-3-(三甲胺基)丙烷,DC-6-14:O,O-双十四烷酰基-N-(-三甲胺基乙酰基)二乙醇胺氯化物,CLIP1:外消旋-(2,3-双十八烷氧基丙基)(2-羟乙基)-二甲基氯化铵,CLIP6:外消旋-2(2,3-双十六烷氧基丙基-氧基甲氧基)乙基三甲基铵,CLIP9:外消旋-2(2,3-双十六烷氧基丙基-氧基琥珀酰氧基)乙基-三甲基铵,oligofectamine,或阳离子或聚阳离子聚合物,例如改性聚氨基酸,如-氨基酸-聚合物或反向的聚酰胺等,改性聚乙烯,如PVP(聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶))等,改性丙烯酸酯,如pDMAEMA(聚(二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯))等,改性酰胺胺如pAMAM(聚(酰胺胺))等,改性聚β氨基酯(PBAE),如二胺末端改性1,4丁二醇二丙烯酸酯-共-5-氨基-1-戊醇聚合物等,树状聚合物(dendrimer),如聚丙胺树状聚合物或pAMAM系树状聚合物等,聚亚胺,如PEI:聚(亚乙基亚胺),聚(亚丙基亚胺)等,聚烯丙胺,糖主链系聚合物,如环糊精系聚合物,葡聚糖系聚合物,脱乙酰壳多糖等,烷主链系聚合物,如PMOXA-PDMS共聚物等,由一种或多种阳离子嵌段(例如选自如上所述的阳离子聚合物的)和一种或多种亲水或疏水嵌段(例如聚乙二醇)的组合组成的嵌段聚合物;等。
[0268] 此外,可以通过与所述组合物的至少一种mRNA复合而用作佐剂的优选的阳离子或聚阳离子蛋白质或肽可以选自具有以下总式(III)的以下蛋白质或肽:(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x,其中l+m+n+o+x=8-15,并且l、m、n或o可以彼此独立地是选自0、1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的任何数,前提是Arg、Lys、His和Orn的总含量占寡肽的所有氨基酸的至少50%;并且Xaa可以是选自天然(=自然存在的)或非天然氨基酸的任何氨基酸,除了Arg、Lys、His或Orn以外;并且x可以是选自0、1、2、3或4的任何数,前提是Xaa的总含量不超过寡肽的所有氨基酸的50%。关于这点,特别优选的低聚精氨酸是例如Arg7、Arg8、Arg9、Arg7、H3R9、R9H3、H3R9H3、YSSR9SSY、(RKH)4、Y(RKH)2R等。
[0269] 在佐剂组分中RNA与阳离子或聚阳离子化合物的比率可以基于整个RNA复合物的氮/磷酸比(N/P-比)(即阳离子或聚阳离子化合物的带正电的(氮)原子与核酸的带负电的磷酸原子之比)计算。例如,如果RNA显示碱基的统计分布,则1μg RNA典型地包含约3nmol磷酸残基。此外,1μg肽典型地包含约x nmol氮残基,这取决于碱性氨基酸的分子量和数量。当示例地对(Arg)9(分子量1424g/mol,9个氮原子)进行计算时,1μg(Arg)9包含约700pmol(Arg)9和因此700x 9=6300pmol碱性氨基酸=6.3nmol氮原子。对于约1:1RNA/(Arg)9的质量比,可以计算得约2的N/P比。当示例地对鱼精蛋白(分子量约4250g/mol,21个氮原子,当使用来自鲑鱼的鱼精蛋白时)进行计算时,在约2:1的质量比以及2μg RNA的情况下,对于所述RNA将要计算得6nmol磷酸;1μg鱼精蛋白包含约235pmol鱼精蛋白分子并且因此包含235x 21=4935pmol碱性氮原子=4.9nmol氮原子。对于约2:1RNA/鱼精蛋白的质量比,可以计算得约0.81的N/P比。对于约8:1RNA/鱼精蛋白的质量比,可以计算得约0.2的N/P比。在本发明的语境中,关于复合物中的RNA:肽之比,N/P-比优选为约0.1-10,优选为约0.3-4,并且最优选为约0.5-2或0.7-2,并且最优选为约0.7-1.5。
[0270] 在优选的实施方案中,所述组合物以两个分开的步骤获得以便获得根据本发明的至少一种mRNA的有效免疫刺激效果和有效翻译两者。其中,所谓的“佐剂组分”通过在第一步中将佐剂组分的至少一种mRNA与阳离子或聚阳离子化合物以特定比率复合以形成稳定的复合物而制备。关于这点,重要的是,在与mRNA复合后,佐剂组分中不剩余或仅剩余可忽略的小量的游离阳离子或聚阳离子化合物。因此,佐剂组分中的mRNA与阳离子或聚阳离子化合物之比典型地在这样的范围内进行选择:mRNA被完全复合并且在组合物中不剩余或仅剩余可忽略的小量的游离阳离子或聚阳离子化合物。优选地,佐剂组分的比率,即mRNA与阳离子或聚阳离子化合物之比选自以下范围:约6:1(w/w)至约0,25:1(w/w),更优选地约5:1(w/w)至约0,5:1(w/w),甚至更优选地约4:1(w/w)至约1:1(w/w)或约3:1(w/w)至约1:1(w/w),并且最优选地约3:1(w/w)至约2:1(w/w)的比率。
[0271] 根据优选的实施方案,在第二步中将编码根据本发明的抗原的至少一种mRNA添加至所述佐剂组分的复合的mRNA以便形成本发明的(免疫刺激)组合物。其中,本发明的至少一种mRNA作为不与其他化合物复合的游离mRNA(即mRNA)被添加。在添加前,所述至少一种游离mRNA不是复合的并且在加入佐剂组分后将优选地不进行任何可检测的或明显的复合反应。这是由于佐剂组分中阳离子或聚阳离子化合物与上述至少一种mRNA的强力结合所致。换言之,当编码根据本发明的至少一种抗原的至少一种游离mRNA被添加至所述“佐剂组分”时,优选地不存在或基本不存在可以与所述至少一种游离mRNA形成复合物的游离的阳离子或聚阳离子化合物。因此,本发明的组合物的至少一种游离mRNA的有效翻译在体内是可能的。其中,所述至少一种游离mRNA可以以单顺反子、双顺反子或多顺反子mRNA(即带有一种或多种蛋白质的编码序列的mRNA)出现。双顺反子或甚至多顺反子mRNA中的此种编码序列可以通过例如如本文所限定的至少一种IRES序列分离。
[0272] 在特别优选的实施方案中,包含在本发明的组合物中的至少一种游离mRNA可以与本发明的组合物的佐剂组分的至少一种mRNA相同或不同,这取决于治疗的具体要求。甚至更优选地,包含在本发明的组合物中的至少一种游离mRNA与本发明的免疫刺激组合物的佐剂组分的至少一种mRNA相同。
[0273] 在特别优选的实施方案中,所述组合物包含至少一种mRNA,其中至少一种mRNA编码如以上所限定的抗原,并且其中所述mRNA部分作为游离mRNA并且部分作为复合的mRNA地存在于所述组合物中。优选地,编码如以上所限定的一种或多种抗原的至少一种mRNA是如上所述地复合的并且之后添加作为游离mRNA的同样的至少一种mRNA,其中优选地,在加入游离mRNA组分时,用于与所述mRNA复合的化合物不以游离形式存在于所述组合物中。
[0274] 本发明的组合物中的第一组分(即佐剂组分,其包含与阳离子或聚阳离子化合物复合的至少一种mRNA或由其组成)与第二组分(即至少一种游离mRNA)之比可以根据特定疗法的具体要求进行选择。典型地,这样选择本发明的组合物的佐剂组分与至少一种游离mRNA之比(佐剂组分:游离RNA)以致由于所述佐剂组分而引起先天免疫系统的显著刺激。关联地,这样选择所述比率以致可以在体内提供显著量的至少一种游离mRNA,从而导致表达的蛋白质(例如如以上所限定的抗原)在体内的有效翻译和浓缩。优选地,本发明的组合物中的佐剂组分中的mRNA:游离mRNA的比率选自以下范围:约5:1(w/w)至约1:10(w/w),更优选地约4:1(w/w)至约1:8(w/w),甚至更优选地约3:1(w/w)至约1:5(w/w)或1:3(w/w),并且最优选地本发明的组合物中的佐剂组分中的mRNA:游离mRNA的比率选自约1:1(w/w)的比率。
[0275] 另外地或备选地,第一组分(即佐剂组分,其包含与阳离子或聚阳离子化合物复合的至少一种mRNA或由其组成)与第二组分(即至少一种游离mRNA)之比可以基于整个mRNA复合物的氮/磷酸比(N/P-比)计算。在本发明的语境中,关于所述复合物中的RNA:肽之比,N/P-比优选为约0.1-10,优选为约0.3-4,并且最优选为约0.5-2或0.7-2,并且最优选为约0.7-1.5。
[0276] 另外地或备选地,本发明的组合物中的第一组分(即佐剂组分,其包含与阳离子或聚阳离子化合物复合的至少一种mRNA或由其组成)与第二组分(即至少一种游离mRNA)之比还可以基于两种mRNA彼此(即与阳离子或聚阳离子化合物复合的佐剂组分的mRNA和第二组分的至少一种游离mRNA)的摩尔比来选择。典型地,佐剂组分的mRNA与第二组分的至少一种游离mRNA的摩尔比可以这样选择,以致所述摩尔比满足以上(w/w)和/或N/P-限定。更优选地,佐剂组分的mRNA与第二组分的至少一种游离mRNA的摩尔比可以例如选自以下摩尔比:约0.001:1、0.01:1、0.1:1、0.2:1、0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1:
0.9、1:0.8、1:0.7、1:0.6、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2、1:0.1、1:0.01、1:0.001等或选自任何由以上数值中的任意两个形成的范围,例如选自约0.001:1至1:0.001的范围,包括以下范围:约0.01:1至1:0.001、0.1:1至1:0.001、0.2:1至1:0.001、0.3:1至1:0.001、0.4:1至1:
0.001、0.5:1至1:0.001、0.6:1至1:0.001、0.7:1至1:0.001、0.8:1至1:0.001、0.9:1至1:
0.001、1:1至1:0.001、1:0.9至1:0.001、1:0.8至1:0.001、1:0.7至1:0.001、1:0.6至1:
0.001、1:0.5至1:0.001、1:0.4至1:0.001、1:0.3至1:0.001、1:0.2至1:0.001、1:0.1至1:
0.001、1:0.01至1:0.001,或以下范围:约0.01:1至1:0.01、0.1:1至1:0.01、0.2:1至1:
0.01、0.3:1至1:0.01、0.4:1至1:0.01、0.5:1至1:0.01、0.6:1至1:0.01、0.7:1至1:0.01、
0.8:1至1:0.01、0.9:1至1:0.01、1:1至1:0.01、1:0.9至1:0.01、1:0.8至1:0.01、1:0.7至1:
0.01、1:0.6至1:0.01、1:0.5至1:0.01、1:0.4至1:0.01、1:0.3至1:0.01、1:0.2至1:0.01、1:
0.1至1:0.01、1:0.01至1:0.01,或包括以下范围:约0.001:1至1:0.01、0.001:1至1:0.1、
0.001:1至1:0.2、0.001:1至1:0.3、0.001:1至1:0.4、0.001:1至1:0.5、0.001:1至1:0.6、
0.001:1至1:0.7、0.001:1至1:0.8、0.001:1至1:0.9、0.001:1至1:1、0.001至0.9:1、0.001至0.8:1、0.001至0.7:1、0.001至0.6:1、0.001至0.5:1、0.001至0.4:1、0.001至0.3:1、
0.001至0.2:1、0.001至0.1:1,或以下范围:约0.01:1至1:0.01、0.01:1至1:0.1、0.01:1至
1:0.2、0.01:1至1:0.3、0.01:1至1:0.4、0.01:1至1:0.5、0.01:1至1:0.6、0.01:1至1:0.7、
0.01:1至1:0.8、0.01:1至1:0.9、0.01:1至1:1、0.001至0.9:1、0.001至0.8:1、0.001至0.7:
1、0.001至0.6:1、0.001至0.5:1、0.001至0.4:1、0.001至0.3:1、0.001至0.2:1、0.001至
0.1:1等。
[0277] 甚至更优选地,佐剂组分的mRNA与第二组分的至少一种游离mRNA的摩尔比可以例如选自约0.01:1至1:0.01的范围。最优选地,佐剂组分的至少一种mRNA与第二组分的至少一种游离mRNA的摩尔比可以例如选自约1:1的摩尔比。以上关于(w/w)和/或N/P比的任何限定也可以适用。
[0278] 合适的佐剂还可以选自具有式(IV)的核酸:GlXmGn,其中:G是鸟苷、尿嘧啶或鸟苷或尿嘧啶的类似物;X是鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述核苷酸的类似物;l是1至40的整数,其中当l=1时,G是鸟苷或其类似物,当l>1时,至少50%的核苷酸是鸟苷或其类似物;m是整数并且至少是3;其中当m=3时,X是尿嘧啶或其类似物,当m>3时,出现至少3个连续的尿嘧啶或尿嘧啶的类似物;n是1至40的整数,其中当n=1时,G是鸟苷或其类似物,当n>1时,至少50%的核苷酸是鸟苷或其类似物。
[0279] 其他合适的佐剂还可以选自具有式(V)的核酸:ClXmCn,其中:C是胞嘧啶、尿嘧啶或胞嘧啶或尿嘧啶的类似物;X是鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述核苷酸的类似物;l是1至40的整数,其中当l=1时,C是胞嘧啶或其类似物,当l>1时,至少50%的核苷酸是胞嘧啶或其类似物;m是整数并且至少是3;其中当m=3时,X是尿嘧啶或其类似物,当m>3时,出现至少3个连续的尿嘧啶或尿嘧啶的类似物;n是1至40的整数,其中当n=1时,C是胞嘧啶或其类似物,当n>1时,至少50%的核苷酸是胞嘧啶或其类似物。
[0280] 根据另一个方面,本发明可以提供疫苗,所述疫苗是基于编码至少以上限定的抗原PSMA、PSA、PSCA、STEAP、PAP和MUC-1的至少一种mRNA,优选地至少六种不同的mRNA种类。因此,本发明的疫苗是基于与如以上所限定的的组合物相同的组分。其中,可以提及限定本发明组合物的以上公开内容。然而,本发明的疫苗可以以在物理上分开的形式提供并且可以通过分开的施用步骤来施用。如果mRNA组分由一个单个的组合物提供,则本发明的疫苗可以对应于本发明的组合物。然而,本发明的疫苗可以例如在物理上分开提供。例如,可以这样提供所述mRNA种类以致提供两个分开的组合物,其可以各自包含编码三种不同抗原的至少一种mRNA种类(例如三种不同的mRNA种类),所述两个分开的组合物可以被合并也可以不被合并。并且,本发明的疫苗可以是三种不同组合物的组合,所述组合物各自包含至少一种编码以上六种抗原中的两种的mRNA。或者,所述疫苗可以作为至少一种mRNA(优选地六种mRNA)的组合被提供,所述mRNA各自编码以上限定的六种抗原中的一个。所述疫苗可以在其使用前被组合以提供一个单个的组合物,或可以这样使用所述疫苗以致需要超过一次施用来施用编码以上限定的六种不同抗原的不同mRNA种类。如果所述疫苗包含编码以上限定的六种抗原的至少一种mRNA分子,典型地至少两种、三种、四种、五种或六种mRNA分子,则其可以例如通过单一一次施用(组合所有mRNA种类),通过两次分开的施用(例如每次施用施用编码以上六种抗原中的三种的mRNA分子),通过三次,四次,五次或六次施用(在所有mRNA种类编码以上限定的六种抗原中的一种并且被设置成在物理上分开的情况下)被施用。因此;
被设置成分开的实体(包含一种mRNA种类)或组合的实体(包含超过一种mRNA种类)的、编码以上限定的六种抗原(和任选地另外的抗原)的单顺反子、双顺反子或多顺反子mRNA的任意组合被理解为是根据本发明的疫苗。根据本发明的疫苗的特别优选的实施方案,根据本发明的每种抗原被设置成被分开施用的单独的(单顺反子)mRNA。
[0281] 与根据本发明的组合物一样,所述疫苗的实体可以以液体和或无水(例如冻干)形式提供。其可以包含另外的组分,尤其是允许另外的顾及其药物用途的组分。本发明的疫苗或本发明的组合物可以例如另外地包含药用载体和/或另外的辅助物质和添加剂和/或佐剂。
[0282] 本发明的疫苗或组合物典型地包含安全且有效的量的编码如以上所限定的抗原的如以上所限定的组合物的至少一种mRNA。如本文中所使用的,"安全且有效的量"表示足以显著引起前列腺癌(PCa),优选地前列腺腺癌,局部限制性前列腺癌,局部晚期前列腺癌,转移的前列腺癌,去势抵抗性(激素难治性)前列腺癌,转移的去势抵抗性前列腺癌和非转移的去势抵抗性前列腺癌和与其相关的疾病或病症的积极改变的如以上所限定的组合物或疫苗的至少一种mRNA的量。然而,同时,"安全且有效的量"足够小从而避免严重的副作用,即允许益处和风险之间的切合实际的关系。对这些界限的确定典型地在切合实际的医学判断的范围内。关于本发明的疫苗或组合物,表述"安全且有效的量"优选地表示适于以这样的方式刺激适应性免疫系统以致不产生过度的或破坏性的免疫反应而且优选地此种免疫反应也不低于可测水平的mRNA的量(并且因此,编码的抗原的量)。如以上所限定的组合物或疫苗的至少一种mRNA的此种"安全且有效的量"还可以根据mRNA的类型(例如单顺反子、双顺反子或甚至多顺反子mRNA)进行选择,因为与使用等量的单顺反子RNA相比,双顺反子或甚至多顺反子mRNA可以导致编码的抗原的显著更高的表达。此外,如以上所限定的组合物或疫苗的至少一种mRNA的"安全且有效的量"将根据治疗的具体病症以及治疗的患者的年龄和身体状态、病症的严重度、治疗的持续时间、相伴的治疗的性质、所用的具体药用载体的性质和类似因素在陪伴的医生的知识和经验内变化。根据本发明,根据本发明的疫苗或组合物作为药物组合物或疫苗可以用于人并且还可以用于兽医用途。
[0283] 在优选的实施方案中,根据本发明的所述组合物、疫苗或具有多个部分的试剂盒的至少一种mRNA以冻干形式提供。优选地,至少一种冻干mRNA在施用前在有利地基于水性载体的合适的缓冲液(例如作为优选的林格氏液的乳酸林格氏液(Ringer-Lactate solution)、磷酸缓冲液)中被重构。在优选的实施方案中,根据本发明的组合物、疫苗或具有多个部分的试剂盒包含六种mRNA,其以冻干形式分开提供(任选地与至少一种另外的添加剂一起)并且优选地在其使用前在合适的缓冲液(如乳酸林格氏液)中分开重构从而允许单独地施用六种(单顺反子)mRNA中的每种。
[0284] 根据本发明的疫苗或组合物可以典型地包含药用载体。如本文中所使用的,表述"药用载体"优选地包括本发明的组合物或疫苗的液体或非液体基质(basis)。如果以液体形式提供本发明的组合物或疫苗,则载体将是水,典型地无致热原水;等张盐水或缓冲的(水)溶液,例如磷酸、柠檬酸等缓冲溶液。特别地,对于本发明的组合物或疫苗的注射,可以使用水或优选地使用缓冲液,更优选地使用含水缓冲液,所述缓冲液含有钠盐,优选地至少50mM的钠盐,钙盐,优选地至少0,01mM的钙盐,和任选地盐,优选地至少3mM的钾盐。根据优选的实施方案,钠盐、钙盐和任选地钾盐可以其卤化物(例如氯化物、碘化物或溴化物)形式,其氢氧化物,碳酸盐,碳酸氢盐或硫酸盐等形式存在。非限制性地,钠盐的实例包括例如NaCl、NaI、NaBr、Na2CO3、NaHCO3、Na2SO4,任选的钾盐的实例包括例如KCl、KI、KBr、K2CO3、KHCO3、K2SO4,而钙盐的实例包括例如CaCl2、CaI2、CaBr2、CaCO3、CaSO4、Ca(OH)2。此外,上述阳离子的有机阴离子可以含在缓冲液中。根据更优选的实施方案,如以上所限定的适用于注射用途的缓冲液可以包含选自氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl2)和任选地氯化钾(KCl)的盐,其中除了氯化物以外还可以存在另外的阴离子。CaCl2也可以被另一种盐如KCl代替。典型地,注射缓冲液中的盐以至少50mM氯化钠(NaCl),至少3mM氯化钾(KCl)和至少0,01mM氯化钙(CaCl2)的浓度存在。相对于具体的参比介质,注射缓冲液可以是高渗的、等渗的或低渗的,即相对于具体的参比介质,所述缓冲液可以具有更高的、相同的或更低的盐含量,其中优选地可以使用上述盐的这样的浓度,所述浓度由于渗透或其他浓度效应而不会导致细胞损伤。参比介质是例如在“体内”方法中出现的液体如血液、淋巴液、胞液或其他体液,或例如在“体外”方法中可以用作参比介质的液体,如常见缓冲液或液体。此种常见缓冲液或液体是技术人员已知的。乳酸林格氏液作为液体基质是特别优选的。
[0285] 然而,也可以使用适用于施用于人的一种或多种相容的固体或液体填充剂或稀释剂或包封化合物。如本文中所使用的,术语"相容的"表示本发明的组合物或疫苗的成分能够与所述至少一种mRNA以这样的方式混合,以致不发生在典型的使用条件下将显著降低本发明的组合物或疫苗的药物有效性的相互作用。当然,药用载体、填充剂和稀释剂必须具有足够高的纯度和足够低的毒性以使其适用于施用于要被治疗的人。可用作药用载体、填充剂的化合物或其成分的一些实例是糖,如,例如,乳糖、葡萄糖、海藻糖和蔗糖淀粉,如,例如,玉米淀粉或铃薯淀粉;右旋糖;纤维素及其衍生物,如,例如,羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、乙酸纤维素;粉末状的黄蓍胶;麦芽;明胶;牛脂;固体助流剂,如,例如,硬脂酸、硬脂酸镁;硫酸钙;植物油,如,例如,花生油籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和来自可可(theobroma)的油;多元醇,如,例如,聚丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇;藻酸。
[0286] 原则上由本发明的组合物或疫苗的施用方式来确定药用载体的选择。本发明的组合物或疫苗可以例如全身或局部施用。全身施用的途径通常包括,例如,透皮、口服、肠胃外途径、包括皮下、静脉内、肌肉内、动脉内、皮内和腹膜内注射和/或鼻内施用途径。局部(local)施用的途径通常包括,例如,局部(topical)施用途径,但也包括皮内、透皮、皮下或肌肉内注射或病变内、颅内、肺内、心脏内和舌下注射。更优选地,疫苗可以通过皮内、皮下或肌肉内途径施用,优选地通过注射施用,所述注射可以是无针注射和/或针注射。
[0287] 在优选的实施方案中,本发明的组合物或疫苗通过快速注射(jet injection)施用,快速注射是无针注射的一种具体形式。如本文中使用的,“快速注射”是指这样的无针注射方法,其中迫使含有所述至少一种mRNA,根据本发明的组合物或疫苗,以及任选地,另外的合适的赋形剂的流体通过孔口,由此产生超细的高压液流,其能够穿透哺乳动物的皮肤,并且根据注射设置,穿透皮下组织或肌肉组织。原则上,所述液流在皮肤中形成孔,所述液流被推动通过所述孔而进入靶组织。优选地,快速注射被用于根据本发明的组合物或疫苗的皮内、皮下或肌肉内注射。在优选的实施方案中,快速注射被用于所述组合物或疫苗的肌肉内注射。在另一个优选的实施方案中,快速注射被用于所述组合物或疫苗的皮内注射。
[0288] 组合物/疫苗因此优选地被制成液体或固体形式。本发明的组合物或疫苗的合适的施用量可以通过常规实验利用动物模型来确定。这样的模型包括,但不限于,兔、绵羊、小鼠、大鼠、狗和非人灵长类动物模型。优选的用于注射的单位剂型包括无菌水溶液,生理盐水或其混合物。此种溶液的pH应当被调至约7.4。适用于注射的载体包括水凝胶、用于受控或延迟释放的装置、聚乳酸和胶原基质。适用于局部施用的药用载体包括适用于洗剂、霜剂、凝胶等中的那些。如果要经口施用本发明的组合物或疫苗,则片剂、胶囊等是优选的单位剂型。用于制备可用于口服施用的单位剂型的药用载体在现有技术中是已知的。其选择将取决于次要考虑因素如口味、成本和可存储性,其对于本发明来说不是重要的,并且本领域技术人员可以不费力地进行所述选择。
[0289] 本发明的疫苗或组合物还可以包含一种或多种辅助物质以进一步增加免疫原性。由此优选地实现如以上所限定的组合物或疫苗的至少一种mRNA和辅助物质(其可以任选地与如上所述的本发明的疫苗或组合物一起制备(或单独制备))的协同作用。取决于辅助物质的不同类型,在这方面可以考虑多种机制。例如,容许树突细胞(DC)成熟的化合物,例如脂多糖、TNF-α或CD40配体形成第一类合适的辅助物质。通常,可能的是使用任何以"危险信号"的方式影响免疫系统的试剂(LPS、GP96等)或允许由根据本发明的免疫刺激佐剂产生的免疫反应以靶向方式被增强和/或影响的细胞因子(如GM-CFS)作为辅助物质。特别优选的辅助物质是细胞因子,如单核因子、淋巴因子、白介素或趋化因子,其除了通过编码的至少六种抗原引入适应性免疫反应,还促进先天免疫反应,如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-
6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-
33、INF-α、IFN-β、INF-γ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、LT-β或TNF-α、生长因子如hGH。优选地,此种增加免疫原性的试剂或化合物被分开提供(不与本发明的疫苗或组合物制备在一起)并单独施用。
[0290] 可以包含在本发明的疫苗或组合物中的另外的添加剂有乳化剂,如,例如,Tween;湿润剂,如,例如,十二烷基硫酸钠;着色剂调味剂,药物载体;成片剂;稳定剂;抗氧化剂
防腐剂
[0291] 本发明的疫苗或组合物还可以另外地包含已知由于其与人Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10的结合亲和性(作为配体)或由于其与鼠Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12或TLR13的结合亲和性(作为配体)而具有免疫刺激性的任何另外的化合物。
[0292] 关于这点,可以添加至本发明的疫苗或组合物的另一类化合物可以是CpG核酸,尤其是CpG-RNA或CpG-DNA。CpG-RNA或CpG-DNA可以是单链CpG-DNA(ss CpG-DNA)、双链CpG-DNA(dsDNA)、单链CpG-RNA(ss CpG-RNA)或双链CpG-RNA(ds CpG-RNA)。CpG核酸优选是CpG-RNA的形式,更优选是单链CpG-RNA(ss CpG-RNA)的形式。CpG核酸优选地包含至少一个或多个(促有丝分裂)胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸序列(CpG基序)。根据第一优选的备选方案,包含在这些序列中的至少一个CpG基序,即CpG基序的C(胞嘧啶)和G(鸟嘌呤)是未甲基化的。任选地包含在这些序列中的所有其他胞嘧啶或鸟嘌呤可以是甲基化的或未甲基化的。然而,根据另一个优选的备选方案,CpG基序的C(胞嘧啶)和G(鸟嘌呤)也可以以甲基化形式存在。
[0293] 优选地,以上化合物与包含编码至少以上限定的六种抗原的至少一种mRNA的(本发明的)以上组合物或疫苗分开制备和施用。
[0294] 根据本发明的另一个方面,可以根据本发明使用本发明的组合物或本发明的疫苗(用于制备药物,所述药物)用于治疗前列腺癌(PCa),优选地前列腺腺癌,局部限制性前列腺癌,局部晚期前列腺癌,转移的前列腺癌,去势抵抗性(激素难治性)前列腺癌,转移的去势抵抗性前列腺癌和非转移的去势抵抗性前列腺癌和与其相关的疾病或病症。
[0295] 根据本发明的另一个方面,包含编码如本文所限定的抗原的至少一种mRNA的本发明的疫苗或本发明的组合物可以用于治疗前列腺癌(PCa),优选地前列腺腺癌,局部限制性前列腺癌,局部晚期前列腺癌,转移的前列腺癌,去势抵抗性(激素难治性)前列腺癌,转移的去势抵抗性前列腺癌和非转移的去势抵抗性前列腺癌,和与其相关的疾病或病症。
[0296] 关于这点,同样包括在本发明中的是治疗前列腺癌(PCa),优选地前列腺腺癌,局部限制性前列腺癌,局部晚期前列腺癌,转移的前列腺癌,去势抵抗性(激素难治性)前列腺癌,转移的去势抵抗性前列腺癌和非转移的去势抵抗性前列腺癌,和与其相关的疾病或病症的方法,所述方法是通过向需要其的受试者施用药物有效量的本发明的疫苗,或药物有效量的本发明的组合物。此种方法典型地包含任选的制备本发明的组合物或本发明的疫苗的第一步和包括将(药物有效量的)本发明的组合物或本发明的疫苗施用于需要其的患者。需要其的受试者将典型地是雄性哺乳动物。在本发明的语境中,哺乳动物优选地选自包含以下的组(而不限于):例如山羊、牛、猪、狗、猫、驴、猴、猿、啮齿动物如小鼠、仓鼠、兔,以及特别地,人,其中所述哺乳动物典型地患有前列腺癌(PCa),优选地前列腺腺癌,局部限制性前列腺癌,局部晚期前列腺癌,转移的前列腺癌,去势抵抗性(激素难治性)前列腺癌,转移的去势抵抗性前列腺癌和非转移的去势抵抗性前列腺癌,和与其相关的疾病或病症。
[0297] 具体地,根据本发明的组合物或疫苗对于在进展性疾病的情况下治疗患有去势难治性转移的前列腺腺癌的受试者具有有益效果。典型地,所述受试者已经经受手术阉割或雄激素抑制疗法(包括促性腺激素释放激素(GNRH)激动剂或拮抗剂)。优选地,受试者在进展性疾病的情况下被治疗,甚至是在至少一种二线抗激素操作(例如抗雄激素)后。更优选地,选择血清睾酮水平<50ng/dL或<1.7nmol/dL的受试者。疾病进展可以例如表征为两次连续的PSA上升(隔至少1周测量),导致与最低点相比至少50%的增加,并且PSA>2ng/ml。所述疾病的进展也可以通过本领域已知的方式通过放射线学来评估。
[0298] 此外,根据本发明组合物或疫苗对于之前遭受前列腺癌并且之后经受前列腺切除术的受试者的(新辅助)治疗具有有益效果。
[0299] 本发明还涉及本发明的组合物或编码如本文所限定的抗原的至少一种mRNA(用于制备本发明的疫苗,所述疫苗)优选地用于用于在哺乳动物中引发免疫反应,优选地用于治疗前列腺癌(PCa),更优选地前列腺腺癌,局部限制性前列腺癌,局部晚期前列腺癌,转移的前列腺癌,去势抵抗性(激素难治性)前列腺癌,转移的去势抵抗性前列腺癌和非转移的去势抵抗性前列腺癌,和与其相关的疾病或病症的用途。
[0300] 类似地,本发明还涉及本发明的疫苗本身或编码如本文所限定的抗原的至少一种mRNA用于在哺乳动物中诱发适应性免疫反应,优选地用于治疗前列腺癌(PCa),优选地前列腺腺癌,局部限制性前列腺癌,局部晚期前列腺癌,转移的前列腺癌,去势抵抗性(激素难治性)前列腺癌,转移的去势抵抗性前列腺癌和非转移的去势抵抗性前列腺癌,和与其相关的疾病或病症的用途。
[0301] 前列腺腺癌,局部限制性前列腺癌,局部晚期前列腺癌,转移的前列腺癌,去势抵抗性(激素难治性)前列腺癌,转移的去势抵抗性前列腺癌和非转移的去势抵抗性前列腺癌和/或激素难治性前列腺癌,和与其相关的疾病或病症的预防或治疗,可以通过施用根据本发明的抗原的组合(以本发明的组合物的形式或以本发明的疫苗的形式)以诱发免疫反应来进行。用于针对如本文所限定的至少六种抗原的组合对受试者进行免疫的免疫方案典型地包括一系列单一剂量或多个剂量的本发明的组合物或本发明的疫苗。如本文中所使用的,单一剂量分别指初始/第一剂量、第二剂量或任何进一步的剂量,其被优选地施用以“加强(boost)”免疫反应。关于这点,各单一剂量包括施用根据本发明的全部至少六种抗原,其中两个单一剂量的施用间隔可以在至少一天,优选地2、3、4、5、6或7天,到至少一周,优选地2、3、4、5、6、7或8周的范围内变化。单一剂量之间的间隔可以是不变的或可以在免疫方案的过程内变化,例如所述间隔可以在起初较短而随着方案的进行越来越长。取决于单一剂量的总数和单一剂量之间的间隔,所述免疫方案可以延续一段时间,其优选地持续至少一周,更优选地数周(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周),甚至更优选地数月(例如3、4、5、6、7、
8、9、10、11、12、18或24个月)。每个单一剂量包括施用如本文所限定的全部的至少六种抗原并且可以因此包括至少一次,优选地1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次注射。在施用根据本发明的组合物的情况下,单一剂量典型地包括一次注射。在所述疫苗包含编码相应的根据本发明的抗原的单独的mRNA制剂的情况下,单一剂量施用期间进行的注射的最小数目对应于单独的疫苗组分的数目。在某些实施方案中,单一剂量的施用可以包括对各疫苗组分(例如包含编码例如根据本发明的六种抗原中的一种的mRNA的特定mRNA制剂)进行超过一次注射。例如,可以将疫苗的个体组分的总体积的部分注射到不同身体部分中,从而包括超过一次注射。在更具体的实例中,包含各自被施用至两个不同的身体部分中的六种单独的mRNA制剂的疫苗的单一剂量包括十二次注射。典型地,单一剂量包含施用所有疫苗组分所需的所有注射,其中单一组分可以涉及超过一次注射,如上所述。在根据本发明的疫苗的单一剂量的施用包括超过一次注射的情况下,注射基本上同时进行,即典型地以时间交错的方式,在医生进行单一注射步骤所需的时间内,一个接一个地。因此,单一剂量的施用优选地延续数分钟,例如2、3、4、5、10、15、30或60分钟的时间。
[0302] 前列腺腺癌,局部限制性前列腺癌,局部晚期前列腺癌,转移的前列腺癌,去势抵抗性(激素难治性)前列腺癌,转移的去势抵抗性前列腺癌和非转移的去势抵抗性前列腺癌和/或激素难治性前列腺癌,和与其相关的疾病或病症的预防或治疗,可以通过以本发明的组合物的形式或以本发明的疫苗的形式同时(即一次性地或以时间交错的方式,例如作为具有多个部分的试剂盒,所述各部分包含优选编码不同抗原的至少一种mRNA)施用根据本发明的抗原的组合进行。优选地,分开施用各抗原,即各抗原被施用于要治疗的受试者身体的不同的部分或区域(优选同时地或在相同的短的时间范围内分别地)。在优选的实施方案中,个体mRNA被施用分布在受试者的四肢(即左/右臂和腿)上。优选地,(全部至少一种mRNA的)施用发生在一小时内,更优选地在30分钟内,甚至更优选地在15、10、5、4、3或2分钟内或甚至在1分钟内。
[0303] 对于施用,优选地可以使用如以上所限定的任何施用途径。例如,一种可以通过基于由本发明的组合物的至少一种mRNA编码的至少六种(特别选择的)抗原诱发或增强适应性免疫反应来治疗前列腺癌(PCa),优选地前列腺腺癌,局部限制性前列腺癌,局部晚期前列腺癌,转移的前列腺癌,去势抵抗性(激素难治性)前列腺癌,转移的去势抵抗性前列腺癌和非转移的去势抵抗性前列腺癌,和与其相关的疾病或病症。本发明的组合物和/或本发明的疫苗的施用可以在另一个如本文所限定的本发明的组合物和/或本发明的疫苗的施用之前发生、与其同时发生和/或在其之后发生,所述另一个如本文所限定的本发明的组合物和/或本发明的疫苗可以另外地包含编码不同的抗原的mRNA的另一种组合,其中由本发明的组合物的至少一种mRNA编码的各抗原可以优选地适于治疗前列腺癌(PCa),优选地前列腺腺癌,局部限制性前列腺癌,局部晚期前列腺癌,转移的前列腺癌,去势抵抗性(激素难治性)前列腺癌,转移的去势抵抗性前列腺癌和非转移的去势抵抗性前列腺癌,和与其相关的疾病或病症。关于这点,如本文所限定的治疗还可以包括调节与前列腺癌(PCa),优选地前列腺腺癌,局部限制性前列腺癌,局部晚期前列腺癌,转移的前列腺癌,去势抵抗性(激素难治性)前列腺癌,转移的去势抵抗性前列腺癌和非转移的去势抵抗性前列腺癌,和与其相关的疾病或病症相关联的疾病。
[0304] 根据另一个实施方案,本发明还包括本发明的组合物或编码如本文所限定的抗原的至少一种mRNA(用于制备(本发明的)疫苗的用途,所述疫苗)用于调节,优选地诱发或增强,如以上所限定的哺乳动物中的免疫反应,更优选地治疗前列腺癌(PCa),优选地前列腺腺癌,局部限制性前列腺癌,局部晚期前列腺癌,转移的前列腺癌,去势抵抗性(激素难治性)前列腺癌,转移的去势抵抗性前列腺癌和非转移的去势抵抗性前列腺癌,或与其相关的疾病或病症,和/或支持其治疗的用途。关于这点,根据本发明的前列腺癌(PCa)治疗可以被辅助以已知的常规前列腺癌疗法,如手术、放射疗法、激素疗法,间断性化疗,质子疗法中的任一种方法或任意组合方法,或其与使用如本文所限定的本发明的组合物的疗法的任意组合。也可以在本文中所限定的任何其他实施方案中预期对前列腺癌(PCa)治疗的支持。因此,本发明的组合物或疫苗在利用任何以上治疗方法的辅助疗法(尤其是结合前列腺手术,激素(例如抗雄激素),和/或化疗)中的任何用途在本发明的范围内。
[0305] 本发明的组合物或编码如本文所限定的抗原的至少一种mRNA或本发明的疫苗的施用可以在时间交错的治疗中进行。时间交错的治疗可以是例如在前列腺癌(PCa),优选地前列腺腺癌,局部限制性前列腺癌,局部晚期前列腺癌,转移的前列腺癌,去势抵抗性(激素难治性)前列腺癌,转移的去势抵抗性前列腺癌和非转移的去势抵抗性前列腺癌,和与其相关的疾病或病症的常规治疗之前、与其同时和/或在其之后施用本发明的组合物或编码如本文所限定的抗原的至少一种mRNA或本发明的疫苗,例如通过在适于治疗前列腺癌(PCa),优选地前列腺腺癌,局部限制性前列腺癌,局部晚期前列腺癌,转移的前列腺癌,去势抵抗性(激素难治性)前列腺癌,转移的去势抵抗性前列腺癌和非转移的去势抵抗性前列腺癌,和与其相关的疾病或病症的治疗剂的疗法或施用之前、与其同时和/或在其之后施用本发明的药物或本发明的组合物或疫苗。此种时间交错的治疗可以使用例如如以下所限定的试剂盒,优选地具有多个部分的试剂盒进行。
[0306] 关于这点,尤其优选的是,本发明的组合物或本发明的疫苗的施用在前列腺切除术(新辅助治疗)之前和任选额外地之后进行。
[0307] 时间交错的治疗可以另外地或备选地还包括以这样的形式施用本发明的组合物或疫苗,优选地施用编码如以上所限定的抗原的至少一种mRNA,其中优选地形成本发明的组合物或疫苗的部分的编码如以上所限定的抗原的至少一种mRNA与优选地形成相同的本发明的组合物或疫苗的别的编码如以上所限定的抗原的至少一种mRNA平行施用、在其之前施用或在其之后施用。优选地,(全部至少一种mRNA的)施用发生在一小时内,更优选地在30分钟内,甚至更优选地在15、10、5、4、3或2分钟内或甚至在1分钟内。此种时间交错的治疗可以使用例如如以下所限定的试剂盒,优选地具有多个部分的试剂盒进行。
[0308] 在优选的实施方案中,本发明的组合物或疫苗重复施用,其中每次施用优选地包括根据本发明的至少一种mRNA的单独施用。在每个施用的时间点,可以将所述至少一种mRNA施用多于一次(例如2次或3次)。在本发明的特别优选的实施方案中,在每个时间点施用六种mRNA(各自编码一种如以上所限定的抗原),其中每种mRNA通过注射施用两次,由此导致分布在四肢上的十二次注射。
[0309] 根据最后的实施方案,本发明还提供试剂盒,尤其是具有多个部分的试剂盒,所述试剂盒包含本发明的组合物,和/或本发明的疫苗,任选地用于增溶的液体载体和任选地具有关于本发明的组合物和/或本发明的疫苗的施用和剂量的信息的技术说明书。所述技术说明书可以包含关于本发明的组合物和/或本发明的疫苗的施用和剂量的信息。此种试剂盒,优选地具有多个部分的试剂盒,可以被例如应用于任何以上提及的应用或用途,优选地用于至少一种本发明的组合物(用于制备本发明的药物(优选疫苗)的用途,所述药物(优选疫苗))用于治疗前列腺癌(PCa),优选地前列腺腺癌,局部限制性前列腺癌,局部晚期前列腺癌,转移的前列腺癌,去势抵抗性(激素难治性)前列腺癌,转移的去势抵抗性前列腺癌和非转移的去势抵抗性前列腺癌,和与其相关的疾病或病症的用途。所述试剂盒还可以被应用于至少一种本发明的组合物(用于制备本发明的疫苗的用途,所述疫苗)用于治疗前列腺癌(PCa),优选地前列腺腺癌,局部限制性前列腺癌,局部晚期前列腺癌,转移的前列腺癌,去势抵抗性(激素难治性)前列腺癌,转移的去势抵抗性前列腺癌和非转移的去势抵抗性前列腺癌,和与其相关的疾病或病症的用途,其中本发明的组合物)和/或疫苗由于所编码的至少六种抗原而能够在哺乳动物中诱发或增强免疫反应,如以上所限定的。此种试剂盒还可以被应用于至少一种本发明的组合物(用于制备本发明的药物(优选疫苗)的用途,所述药物(优选疫苗))用于调节,优选地用于诱发,例如引起或增强,如以上所限定的哺乳动物中的免疫反应,和优选地支持前列腺癌(PCa),优选地前列腺腺癌,局部限制性前列腺癌,局部晚期前列腺癌,转移的前列腺癌,去势抵抗性(激素难治性)前列腺癌,转移的去势抵抗性前列腺癌和非转移的去势抵抗性前列腺癌,和与其相关的疾病或病症的治疗的用途。具有多个部分的试剂盒,作为试剂盒的特定形式,可以在试剂盒的不同部分中包含一种或多种相同或不同的本发明的组合物和/或一种或多种相同或不同的本发明的疫苗。具有多个部分的试剂盒还可以在试剂盒的不同部分中包含(例如一种)本发明的组合物,(例如一种)本发明的疫苗和/或编码如以上所限定的抗原的至少一种mRNA,例如试剂盒的各部分包含至少一种编码优选地不同的抗原的mRNA。此外,两种类型的具有多个部分的试剂盒的组合是可能的。例如当预期时间交错的治疗时,例如当在体内的相同的治疗期间使用本发明的组合物、本发明的疫苗和/或编码如以上所限定的抗原的至少一种mRNA的不同制剂和/或增加其浓度时,可以使用具有多个部分的试剂盒。当预期或需要(例如由于技术原因)分开制备或施用本发明的组合物的抗原中的至少一种(即分部分地),但仍要实现例如不同抗原在体内的组合出现时,也可以使用具有多个部分的试剂盒。特别地,预期作为试剂盒的特定形式的具有多个部分的试剂盒,其中所述试剂盒的各部分包含至少一种优选地不同的如以上所限定的抗原,具有多个部分的试剂盒的所有部分形成如本文所限定的本发明的组合物或本发明的疫苗。这样的特定的具有多个部分的试剂盒可以尤其是合适的,例如如果不同抗原被分开地制备成试剂盒的不同部分,而之后被在一起一次性地或以时间交错的方式施用至需要其的哺乳动物。在后一种情况中,此种试剂盒的不同部分的全部施用典型地发生在短的时限内,以致全部抗原在试剂盒的最后一部分施用后的大致相同的时间出现在哺乳动物中。在优选的实施方案中,所述试剂盒包含至少两个部分,所述至少两个部分包含根据本发明的六种mRNA。优选地,全部六种mRNA被设置在试剂盒的分开的部分中,其中所述mRNA优选地是被冻干的。更优选地,所述试剂盒还包含用于溶解所述至少一种mRNA的载体作为一部分,所述载体优选地是乳酸林格氏液。任何以上试剂盒都可以用于如以上所限定的治疗。
[0310] 本发明的优点
[0311] 本发明提供用于治疗前列腺癌(PCa)的组合物,其中所述组合物包含至少一种mRNA,所述至少一种mRNA编码能够在哺乳动物中诱发(适应性)免疫反应的至少六种抗原,其中所述抗原选自由以下组成的组:PSA(前列腺特异性抗原),PSMA(前列腺特异性膜抗原),PSCA(前列腺干细胞抗原),STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原),PAP(前列腺碱性磷酸酶)和MUC1(黏蛋白1)。此种组合物允许前列腺癌(PCa)的有效治疗或使用常规疗法时的补充治疗。其通过使用mRNA作为治疗方法的途径还避免了引入的DNA序列不受控传播的问题。本发明的组合物中所用的mRNA相对于DNA表达系统在例如免疫反应、免疫或接种方面具有另外的相当大的优势。这些优势尤其包括引入到细胞中的mRNA不被整合到基因组中。这避免了该基因突变的风险,否则所述基因可能被完全或部分失活或产生错误信息。其还避免了使用DNA作为诱发免疫反应的试剂(例如作为疫苗)的其他风险,如在已经引入了外源DNA的患者中引入病原体抗-DNA抗体,从而引起(可能是致命的)免疫反应。与此对比,还未检测到抗-RNA抗体。
[0312] 附图
[0313] 以下附图意在进一步说明本发明。其不意在将本发明的主题限于其。
[0314] 图1:显示编码PSA(前列腺特异性抗原)(=KLK3)的mRNA序列KLK3(GC)-muag-A64-C30(SEQ ID NO:1)。所述mRNA包含以下序列元件:
[0315] 针对稳定化和更好的密码子使用的GC优化的序列
[0316] 在3’端的~64个腺苷(聚-A-尾),在3’端的~30个胞嘧啶(聚-C-尾)。
[0317] 图2:显示根据SEQ ID NO:2的编码PSA(前列腺特异性抗原)(=KLK3)的野生型编码序列,即不具有GC优化的序列的编码PSA(前列腺特异性抗原)的编码序列(CDS)。
[0318] 图3:显示根据SEQ ID NO:3的编码PSA(前列腺特异性抗原)(=KLK3)的GC优化的编码序列。
[0319] 图4:显示编码PSMA(前列腺特异性膜抗原)(=FOLH1)的mRNA序列FOLH1(GC)-muag-A64-C30(SEQ ID NO:4)。所述mRNA包含以下序列元件:
[0320] 针对稳定化和更好的密码子使用的GC优化的序列
[0321] 在3’端的~64个腺苷(聚-A-尾),在3’端的30个胞嘧啶(聚-C-尾)。
[0322] 图5:显示根据SEQ ID NO:5的编码PSMA(前列腺特异性膜抗原)(=FOLH1)的野生型编码序列,即不具有GC优化的序列的编码PSMA(前列腺特异性膜抗原)(=FOLH1)的编码序列(CDS)。
[0323] 图6:显示根据SEQ ID NO:6的编码PSMA(前列腺特异性膜抗原)(=FOLH1)的GC优化的编码序列。
[0324] 图7:显示编码PSCA(前列腺干细胞抗原)的mRNA序列PSCA(GC)-muag-A64-C30(SEQ ID NO:7)。所述mRNA包含以下序列元件:
[0325] 针对稳定化和更好的密码子使用的GC优化的序列
[0326] 在3’端的~64个腺苷(聚-A-尾),在3’端的30个胞嘧啶(聚-C-尾)。
[0327] 图8:显示根据SEQ ID NO:8的编码PSCA(前列腺干细胞抗原)的野生型编码序列,即不具有GC优化的序列的编码PSCA(前列腺干细胞抗原)的编码序列(CDS)。
[0328] 图9:显示根据SEQ ID NO:9的编码PSCA(前列腺干细胞抗原)的GC优化的编码序列。
[0329] 图10:显示编码STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原)的mRNA序列STEAP(GC)-muag-A64-C30(SEQ ID NO:10)。所述mRNA包含以下序列元件:
[0330] 针对稳定化和更好的密码子使用的GC优化的序列
[0331] 在3’端的~64个腺苷(聚-A-尾),在3’端的30个胞嘧啶(聚-C-尾)。
[0332] 图11:显示根据SEQ ID NO:11的编码STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原)的野生型编码序列,即不具有GC优化的序列的编码STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原)的编码序列(CDS)。
[0333] 图12:显示根据SEQ ID NO:12的编码STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原)的GC优化的编码序列。
[0334] 图13:显示编码PAP(前列腺碱性磷酸酶)的mRNA序列PAP(GC)-muag-A64-C30(SEQ ID NO:13)。所述mRNA包含以下序列元件:
[0335] 针对稳定化和更好的密码子使用的GC优化的序列
[0336] 在3’端的~64个腺苷(聚-A-尾),在3’端的30个胞嘧啶(聚-C-尾)。
[0337] 图14:显示根据SEQ ID NO:14的编码PAP(前列腺碱性磷酸酶)的野生型编码序列,即不具有GC优化的序列的编码PAP(前列腺碱性磷酸酶)的编码序列(CDS)。
[0338] 图15:显示根据SEQ ID NO:15)的编码PAP(前列腺碱性磷酸酶)的GC优化的编码序列。
[0339] 图16:显示编码MUC1(黏蛋白1)的mRNA序列RNActive MUC15xVNTR(GC)-muag-A64-C30(SEQ ID NO:16;R1715)。所述mRNA包含以下序列元件:
[0340] 针对稳定化和更好的密码子使用的GC优化的序列
[0341] 在3’端的~64个腺苷(聚-A-尾),在3’端的30个胞嘧啶(聚-C-尾)。
[0342] 图17:显示根据SEQ ID NO:17的编码MUC1(黏蛋白1)的野生型编码序列,即不具有GC优化的序列的编码MUC1(黏蛋白1)的编码序列(CDS)。
[0343] 图18:显示根据SEQ ID NO:18的编码MUC1(黏蛋白1)的GC优化的编码序列。
[0344] 图19:显示mRNA序列PSA(GC)-muag-A64-C30-组蛋白SL(SEQ ID NO:19)。所述mRNA包含以下序列元件:
[0345] 5’-CAP,根据SEQ ID NO:3的编码PSA的针对稳定化和更好的密码子使用进行了GC优化的编码序列,3’-UTR中的根据SEQ ID No.69的稳定化序列“muag”,在3’端的~64个腺苷(聚-A-尾),在3’端的~30个胞嘧啶(聚-C-尾);和根据SEQ ID NO.71的组蛋白茎-环序列。
[0346] 图20:显示mRNA序列PSMA(GC)-muag-A64-C30-组蛋白SL(SEQ ID NO:20)。所述mRNA包含以下序列元件:
[0347] 根据SEQ ID NO:6的编码PSMA的针对稳定化和更好的密码子使用进行了GC优化的编码序列,3’-UTR中的根据SEQ ID No.69的稳定化序列“muag”,在3’端的~64个腺苷(聚-A-尾),在3’端的~30个胞嘧啶(聚-C-尾);和根据SEQ ID NO.71的组蛋白茎-环序列。
[0348] 图21:显示mRNA序列CAP-PSCA(GC)-muag-A64-C30-组蛋白SL(SEQ ID NO:21)。所述mRNA包含以下序列元件:
[0349] 根据SEQ ID NO:9的编码PSCA的针对稳定化和更好的密码子使用进行了GC优化的编码序列,3’-UTR中的根据SEQ ID No.69的稳定化序列“muag”,在3’端的~64个腺苷(聚-A-尾),在3’端的~30个胞嘧啶(聚-C-尾);和根据SEQ ID NO.71的组蛋白茎-环序列。
[0350] 图22:显示mRNA序列STEAP1(GC)-muag-A64-C30-组蛋白SL(SEQ ID NO:22)。所述mRNA包含以下序列元件:
[0351] 根据SEQ ID NO:12的编码STEAP的针对稳定化和更好的密码子使用进行了GC优化的编码序列,3’-UTR中的根据SEQ ID No.69的稳定化序列“muag”,在3’端的~64个腺苷(聚-A-尾),在3’端的~30个胞嘧啶(聚-C-尾);和根据SEQ ID NO.71的组蛋白茎-环序列。
[0352] 图23:显示mRNA序列PAP(GC)-muag-A64-C30-组蛋白SL(R2251)(SEQ ID NO:23)。所述mRNA包含以下序列元件:
[0353] 5’-CAP,根据SEQ ID NO:15的编码PAP的针对稳定化和更好的密码子使用进行了GC优化的编码序列,3’-UTR中的根据SEQ ID No.69的稳定化序列“muag”,在3’端的~64个腺苷(聚-A-尾),在3’端的~30个胞嘧啶(聚-C-尾);和根据SEQ ID NO.71的组蛋白茎-环序列。
[0354] 图24:显示mRNA序列CAP-MUC15×VNTR(GC)-muag-A64-C30-组蛋白SL(R2312)(SEQ ID NO:24)。所述mRNA包含以下序列元件:
[0355] 根据SEQ ID NO:18的编码MUC1的针对稳定化和更好的密码子使用进行了GC优化的编码序列,3’-UTR中的根据SEQ ID No.69的稳定化序列“muag”,在3’端的~64个腺苷(聚-A-尾),在3’端的~30个胞嘧啶(聚-C-尾);和根据SEQ ID NO.71的组蛋白茎-环序列。
[0356] 图25:显示通过ELISPOT检测PAP特异性细胞免疫反应。在第1、5、8、12和15天,给C57BL/6小鼠接种32μg  (PAP(GC)-muag-A64-C30;SEQ ID NO:13)。在最后一次接种后的第5天,进行对来自接种的小鼠和对照小鼠的脾细胞中的IFN-γ分泌的离体ELISpot分析。在平板上用PAP衍生的肽(预测的MHC-I类表位)或用对照肽刺激细胞。图表显示个体小鼠的单个数据点。
[0357] 图26:显示通过ELISPOT检测MUC1特异性细胞免疫反应。在第1、5、8、12和15天,给C57BL/6小鼠接种32μg (MUC15xVNTR(GC)-muag-A64-C30;SEQ ID NO:16;R1715)。在最后一次接种后的第6天,进行对来自接种的小鼠和对照小鼠的脾细胞中的IFN-γ分泌的离体ELISpot分析。在平板上用MUC1衍生的肽(预测的MHC-I类表位)或用对照肽刺激细胞。图表显示个体小鼠的单个数据点。
[0358] 图27:显示根据SEQ ID NO:82的编码PSA(前列腺特异性抗原)(=KLK3)的GC优化的编码序列。
[0359] 图28:显示根据SEQ ID NO:83的编码PSMA(前列腺特异性膜抗原)(=FOLH1)的GC优化的编码序列。
[0360] 图29:显示根据SEQ ID NO:84的编码PSCA(前列腺干细胞抗原)的GC优化的编码序列。
[0361] 图30:显示根据SEQ ID NO:85的编码STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原)的GC优化的编码序列。
[0362] 图31:显示根据SEQ ID NO:76的PSA NP_001639.1的蛋白序列。
[0363] 图32:显示根据SEQ ID NO:77的PSMA(FOLH1)NP_004467.1的蛋白序列。
[0364] 图33:显示根据SEQ ID NO:78的PSCA O43653.1的蛋白序列。
[0365] 图34:显示根据SEQ ID NO:79的STEAP NP_036581.1的蛋白序列。
[0366] 图35:显示根据SEQ ID NO:80的PAP NP_001090.2的蛋白序列。
[0367] 图36:显示根据SEQ ID NO:81的如在登录号AAA60019.1(J05582.1)下保存的MUC1的蛋白序列。
[0368] 图37:显示根据SEQ ID NO:86的MUC15xVNTR的蛋白序列。
[0369] 图38:显示根据SEQ ID NO:87的编码MUC1的野生型编码序列,即不具有GC优化的编码序列的编码MUC1的全长编码序列(CDS)。实施例
[0370] 以下实施例意在进一步说明本发明。其不意在将本发明的主题限于其。
[0371] 1.制备编码质粒:
[0372] 在以下实验中,对应于各自mRNA序列并编码以下抗原的DNA序列被分别制备并被用于体外转录和转染实验:
[0373] ·PSA(前列腺特异性抗原),
[0374] ·PSMA(前列腺特异性膜抗原),
[0375] ·PSCA(前列腺干细胞抗原),
[0376] ·STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原),
[0377] ·PAP(前列腺碱性磷酸酶),和
[0378] ·MUC1(黏蛋白1)。
[0379] 由此,对应于天然抗原编码mRNA的DNA序列(包含对应于根据图2、5、8、11、14和17,即SEQ ID NO:2、5、8、11、14和17的RNA序列的编码序列的序列)为了更好的密码子使用而被GC优化,从而获得包含对应于根据图27、28、29、30、15和18,即SEQ ID NO:82、83、84、85、15和18的RNA序列的编码序列的序列。然后,将编码序列转移到GC优化的构建体(CureVac GmbH,Tübingen,Germany)中,所述构建体已经用聚-A-尾和聚-C-尾修饰(A64-C30,分别地)。最终的构建体和相应的mRNA被分别命名为:
[0380] KLK3/PSA(GC)-muag-A64-C30(SEQ ID NO:1),
[0381] FOLH1/PSMA(GC)-muag-A64-C30(SEQ ID NO:4),
[0382] PSCA(GC)-muag-A64-C30(SEQ ID NO:7),
[0383] STEAP(GC)-muag-A64-C30(SEQ ID NO:10),
[0384] PAP(GC)-muag-A64-C30(SEQ ID NO:13),和
[0385] MUC1-5xVNTR(GC)-muag-A64-C30(SEQ ID NO:16)。
[0386] 最终的构建体分别包含对应于根据如图1、4、7、10、13和16中所示的序列的RNA序列(SEQ ID NO:1、4、7、10、13和16)的序列,其包含以下序列元件:
[0387] 针对稳定化和更好的密码子使用的GC优化的序列
[0388] 在3’端的~70个腺苷(聚-A-尾),在3’端的30个胞嘧啶(聚-C-尾)。
[0389] 备选地,将GC优化的CDS序列转移到GC优化的构建体中,所述构建体已经用聚-A-尾、聚-C-尾和根据SEQ ID NO:70的组蛋白-茎-环序列修饰。
[0390] 最终的构建体和相应的RNA被分别命名为:
[0391] KLK3/PSA(GC)-muag-A64-C30-组蛋白SL(SEQ ID NO:19),
[0392] FOLH1/PSMA(GC)-muag-A64-C30-组蛋白SL(SEQ ID NO:20),
[0393] PSCA(GC)-muag-A64-C30-组蛋白SL(SEQ ID NO:21),
[0394] STEAP(GC)-muag-A64-C30-组蛋白SL(SEQ ID NO:22),
[0395] PAP(GC)-muag-A64-C30-组蛋白SL(SEQ ID NO:23),和
[0396] MUC1-5xVNTR(GC)-muag-A64-C30-组蛋白SL(SEQ ID NO:24)。
[0397] 最终的构建体分别包含对应于根据如图19、20、21、22、23和24中所示的序列的RNA序列(SEQ ID NO:19、20、21、22、23和24)的序列,其包含以下序列元件:
[0398] 针对稳定化和更好的密码子使用的GC优化的序列
[0399] 在3’端的~70个腺苷(聚-A-尾),在3’端的30个胞嘧啶核苷酸(聚-C-尾)和根据SEQ ID NO:71的组蛋白茎-环序列。
[0400] 2.体外转录:
[0401] 基于实施例1中获得的重组质粒DNA,通过体外转录制备mRNA序列。因此,将重组质粒DNA线性化并且随后使用T7RNA聚合酶进行体外转录。然后,DNA模板通过DNA酶I消化而降解,并将mRNA通过LiCl沉淀回收并进一步通过HPLC提取( CureVac GmbH,Tübingen,Germany)清洁。
[0402] 3.与鱼精蛋白复合
[0403] 通过以比率(1:2)(w/w)将鱼精蛋白添加至编码根据本发明的抗原的各mRNA使所述mRNA与鱼精蛋白复合(佐剂组分)。孵育10分钟后,添加被用作提供抗原的mRNA的相同量的游离mRNA。
[0404] 4.制备mRNA疫苗和诱导抗原特异性细胞毒性抗体和抗原特异性细胞毒性T-细胞:
[0405] 4.1制备mRNA疫苗:
[0406] 所述mRNA疫苗分别由编码PAP的GC优化的mRNA(SEQ ID NO:13)或编码MUC1的GC优化的mRNA(SEQ ID NO:16)组成。通过以比率(1:2)(w/w)将鱼精蛋白添加至所述mRNA将所述mRNA与鱼精蛋白复合(佐剂组分)。孵育10min后,添加被用作提供抗原的mRNA的相同量的游离mRNA。
[0407] 将得到的组合物溶解在80%(v/v)乳酸林格氏液中。
[0408] 4.2接种
[0409] 给C57BL/6小鼠皮内接种32μg的如以上4.1中所述的一种mRNA疫苗。对照小鼠通过皮内注射缓冲液(乳酸林格氏液)来处理。接种包括五次免疫,其中每周2次免疫。在完成接种循环后5天或6天分析免疫反应。
[0410] 4.3ELISPOT–检测CTL(细胞毒性T细胞)反应
[0411] 为了检测CTL(细胞毒性T细胞)反应,可以在单细胞水平使用ELISPOT技术来可视化对响应于特定刺激的IFN-γ分泌的分析。
[0412] 在最后一次接种后5或6天,分离来自接种有如以上4.1中所述的mRNA疫苗的小鼠和对照小鼠的脾细胞,然后将其转移到涂覆有IFN-γ捕获抗体的96孔ELISPOT平板中。然后在37℃使用以下肽将细胞刺激24小时:
[0413]MUC1衍生的肽 连接蛋白衍生的肽(对照)
SAPDNRPAL(SEQ ID NO:72) FEQNTAQP(SEQ ID NO:73)
[0414]PAP衍生的肽 PSMA衍生的肽(对照)
VSIWNPILL(SEQ ID NO:74) SAVKNFTEI(SEQ ID NO:75)
[0415] 在孵育期后,将细胞从平板中洗出,并且使用生物素化的针对鼠IFN-γ的二抗并且之后使用链霉亲和素-AKP来检测由所述细胞分泌的IFN-γ。使用BCIP/NBT底物将斑点可视化并且使用自动化ELISPOT读数计(Immunospot Analyzer,CTL Analyzers LLC)计数。
[0416] 结果:
[0417] 皮内接种编码MUC1和PAP的mRNA构建体两者导致抗原特异性CD8+T-细胞的活化,如由ELISpot中IFN-γ的分泌所证明的。
[0418] 5.临床试验:
[0419] 5.1.制备本发明的疫苗
[0420] 根据本发明的mRNA疫苗由6种单独的、分开配制的GC优化的mRNA组成,所述mRNA分别编码KLK3/PSA(SEQ ID NO:19),FOLH1/PSMA(SEQ ID NO:20),PSCA(SEQ ID NO:21),STEAP(SEQ ID NO:22),PAP(SEQ ID NO:23)或MUC1(SEQ ID NO:24)。通过以比率(1:2)(w/w)将鱼精蛋白添加至各mRNA将所述mRNA与鱼精蛋白复合(佐剂组分)。孵育10min后,添加相同量的被用作提供抗原的mRNA的游离mRNA。在复合后,将各个制剂化的mRNA分开冻干。将mRNA溶解在乳酸林格氏液中以用于重构。本发明的疫苗的六种组分中的每一种包含编码根据本发明的六种抗原中的一种的被制剂化且被冻干的mRNA。
[0421] 本发明的疫苗的组分:
[0422] 组分1:与鱼精蛋白以比率(1:2)(w/w)复合的160μg编码KLK3/PSA的mRNA(SEQ ID NO:19)(佐剂组分)和160μg编码KLK3/PSA的mRNA(SEQ ID NO:19)
[0423] 组分2:与鱼精蛋白以比率(1:2)(w/w)复合的160μg编码FOLH1/PSMA的mRNA(SEQ ID NO:20)(佐剂组分)和160μg编码FOLH1/PSMA的mRNA(SEQ ID NO:20)
[0424] 组分3.与鱼精蛋白以比率(1:2)(w/w)复合的160μg编码PSCA的mRNA(SEQ ID NO:21)(佐剂组分)和160μg编码PSCA的mRNA(SEQ ID NO:21)
[0425] 组分4:与鱼精蛋白以比率(1:2)(w/w)复合的160μg编码STEAP的mRNA(SEQ ID NO:22)(佐剂组分)和160μg编码STEAP的mRNA(SEQ ID NO:22),
[0426] 组分5:与鱼精蛋白以比率(1:2)(w/w)复合的160μg编码PAP的mRNA(SEQ ID NO:23)(佐剂组分)和160μg编码PAP的mRNA(SEQ ID NO:23)
[0427] 组分6:与鱼精蛋白以比率(1:2)(w/w)复合的160μg编码MUC1的mRNA(SEQ ID NO:24)(佐剂组分)和160μg编码MUC1的mRNA(SEQ ID NO:24)
[0428] 各组分被冻干并且用乳酸林格氏液重构以用于注射。
[0429] 5.2.II期临床试验(支持性研究):
[0430] 在根本性的前列腺切除术(新辅助治疗)前的6周时间内接受了4次利用根据实施例5.1制备的本发明的mRNA疫苗的接种或在手术前在不进行接种的情况下被观察的具有中度或高度风险前列腺癌的患者中进行开放标签、随机化II期试验,所述试验包括任选地使用注射设备(喷射注射)。经由常规皮内注射治疗的患者接受320μg的根据实施例5.1.的各种mRNA。本发明的疫苗的各组分被注射在2个分开的注射位点(160μg mRNA/注射位点)中。通过喷射注射进行注射的患者仅接受一半的剂量(其中所述剂量对应于160μg/本发明的疫苗的组分),其也被注射在2个分开的注射位点(80μg mRNA/注射位点)。患者在第1、2、3和5周接受接种。这些患者在第4次接种后的至少1周但不晚于2周(第6或7周)进行根本性的前列腺切除术。在前列腺切除术后,患者任选地再接受2次利用本发明的疫苗的接种。
[0431] 5.3.IIb期临床试验:
[0432] 在具有转移的去势难治性前列腺癌的患者中进行具有开放标签安全性引入(lead-in)的I/II期随机化双盲安慰剂对照多中心研究。
[0433] 在手术去势或促性腺素释放激素(GNRH)激动剂或拮抗剂治疗后以及在至少一种二线抗激素操作后具有无症状或最小症状疾病进展的患者接受根据实施例5.1.制备的本发明的疫苗或安慰剂(以2:1比率,便于本发明的疫苗武器)。
[0434] 在第1、2、3、5、7、9、12、15、18和24周的第1天实施利用本发明的疫苗的治疗,然后每6周实施一次直至第一次接种后12个月,然后每3个月实施一次。
[0435] 在6名患者中进行安全性引入。
[0436] 治疗实施:
[0437] 在每个接种时间点,将6种疫苗组分中的每种在同一天单独地施用,每个组分2次每次200μL的皮内(i.d.)注射,总计12次注射。
[0438] 结果:
[0439] 作为所述研究的安全性引入比例的结果,可以证明的是本发明的疫苗在83%的患者中具有免疫原性并且引起细胞和/或体液免疫反应。
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