尿激酶原是一种特异性溶血栓药物，具有良好的市场前景。目前，已经能够通过基因重 组技术在多种基因工程细胞如大肠杆菌、哺乳动物、酵母、昆虫等细胞生产尿激酶原。在尿 激酶原的生产过程中产品的纯化技术非常重要，是决定产品质量、影响生产成本和效益的关 键步骤。
公开文献报道的尿激酶原的纯化技术，如Avgennos G.C.等(1990)用快流速磺酸型琼 脂糖凝胶珠(S-Sepharose Fast Flow)阳离子交换色谱、对氨基苯甲脒亲和色谱、磺酸型阳 离子交换快速蛋白质液相色谱(mono-S FPLC)、第二次对氨基苯甲脒亲和色谱四步法从CHO基 因工程细胞培养物中纯化人尿激酶原，但是该四步方法在实际应用中操作比较繁琐，延长了 生产操作时间，而且纯化的尿激酶原总产率仅为40％。按此方法进行放大工业化生产，势必 受到限制。
另外如专利申请“溶血栓新药——重组人尿激酶原的纯化工艺”(申请国：中国，公开号： CN1164536A，公开日1997年11月12日)公开了一种对CHO基因工程细胞培养液中重组人尿 激酶原的四步纯化工艺，包含：第一步羧甲基径向阳离子交换色谱法(CM-径向阳离子交换色 谱法)、第二步微孔高硅玻璃珠(MPG)吸附色谱法、第三步S-200型葡聚糖聚丙烯酰氨高效凝 胶(Sephacryl S-200HR)色谱法和第四步对氨基苯甲脒亲和色谱法。该纯化方法采用的CM- 径向阳离子交换色谱填料不能在线清洗消毒，使用寿命短，而且刚性差，结构不规则，装填 色谱柱比较麻烦，不利于放大；另外，该纯化方法的收率较低，仅有50％，用于大规模工业 生产不够理想。

本发明旨在解决动物细胞表达的尿激酶原的大规模纯化问题。
为此，本发明提供了一种用Streamline-SP扩张床色谱、Sephacryl S-200凝胶色谱、 对氨基苯甲脒Sepharose Fast Flow亲和色谱和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱 法等，从哺乳动物工程细胞培养上清中大量纯化基因工程产品的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
A.用阳离子交换Streamline-SP扩张床色谱从工程细胞培养上清中回收重组人尿激酶 原；
B.用Sephacryl S-200凝胶色谱进一步纯化上述A收集的尿激酶原粗产品；
C.用对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱法除去粗产品中的尿激酶；
D.用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱除去重组人尿激酶原中残留细胞DNA。
本发明还提供了优选的工艺条件：
其中步骤A优选的工艺条件是指：将收集的细胞培养上清，调pH至5.5～6.8。色谱柱 先用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5～6.8)冲洗并平衡3～5个柱体积，然后加 细胞培养上清，流速30～60ml/分钟，直至上清液全部通过色谱柱，再用同种缓冲液冲洗色 谱柱，并用检测器监测色谱柱流出液，直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.005～0.015mol/L 磷酸盐缓冲液(pH5.5～6.8)和0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(含0.8～1.2mol/L氯化 钠，pH6.8～7.8)进行梯度洗脱吸附在色谱柱上的尿激酶原，收集洗脱蛋白吸收峰组分。
步骤A更优选的工艺条件是：收集的细胞培养上清，调pH至6.4。色谱柱先用0.005mol/L 磷酸盐缓冲液(pH6.4)冲洗并平衡3～5个柱体积，然后加细胞培养上清，流速40ml/分钟， 直至上清液全部通过色谱柱，再用同种缓冲液冲洗色谱柱，并用检测器监测色谱柱流出液， 直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.4)和0.005mol/L磷酸 盐缓冲液(含1.0mol/L氯化钠，pH7.0)进行梯度洗脱吸附在色谱柱上的尿激酶原，收集洗 脱蛋白吸收峰组分。
其中步骤B优选的工艺条件是指：将Sephacryl S-200凝胶色谱柱置于4℃并与一台制 备型高效液相色谱仪相连，用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(含0.2～0.6mol/L氯化钠， pH6.8～7.8)平衡1～2个柱体积；A收集的尿激酶原通过进样管上样，流速10～40ml/分钟， 紫外检测波长280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
步骤B更优选的工艺条件是：将Sephacryl S-200凝胶色谱柱置于4℃并与一台制备型 高效液相色谱仪相连，用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(含0.5mol/L氯化钠，pH7.4)平衡1～ 2个柱体积；A收集的尿激酶原通过进样管上样，流速20ml/分钟，紫外检测波长280nm，收 集蛋白吸收主峰流出液。
其中步骤C优选的工艺条件是指：将对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱柱进 液管与蠕动泵相连，置于4℃，用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(含0.2～0.6mol/L氯 化钠，pH6.8～7.8)平衡3～5个柱体积，将色谱柱出口与紫外检测器连接，将蠕动泵进液 管插入B收集液中，用紫外检测器监测流出液，收集穿过蛋白吸收峰流出液。
步骤C更优选的工艺条件是：将对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱柱进液管 与蠕动泵相连，置于4℃，用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(含0.5mol/L氯化钠，pH7.0)平 衡3～5个柱体积，将色谱柱出口与紫外检测器连接，将蠕动泵进液管插入B收集液中，用紫 外检测器监测流出液，收集穿过蛋白吸收峰流出液。
其中步骤D优选的工艺条件是指：将DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱置于 4℃，进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测器相连，用0.005～0.010mol/L Tris-HCl缓 冲液平衡3～5个柱体积，用Tris溶液将步骤C收集的穿过液的pH调至7.5～8.5后上柱， 用紫外检测器在280nm波长下监测蛋白吸收值，收集蛋白质吸收穿过液，得到纯的重组人尿 激酶原。
步骤D更优选的工艺条件是：将DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱置于4℃， 进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测器相连，用0.005mol/L Tris-HCl缓冲液平衡3～5 个柱体积，用1mol/L Tris溶液将步骤C收集的穿过液的pH调至8.2后上柱，用紫外检测器 在280nm波长下监测蛋白吸收值，收集蛋白质吸收穿过液，得到纯的重组人尿激酶原。
为了达到更好的实验效果，优选的方法是在步骤C和D之间还包括步骤E：用阳离子交 换Streamline-SP固定床色谱柱浓缩尿激酶原，浓缩可达10～15倍左右，大大方便了后续操 作。
步骤E优选的工艺条件是：将Streamline-SP固定床色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵 相连，出口端与紫外检测器相连，用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5～6.8)平衡 色谱柱3～5个柱体积，第C步下来的样品稀释后，用NaOH调pH至5.5～6.8后，上柱，随 后用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(含0.2～0.6mol/L氯化钠，pH6.8～7.8)洗脱，并 收集洗脱蛋白吸收峰。
步骤E更优选的工艺条件是：将Streamline-SP固定床色谱柱置于4℃，进液管与蠕动 泵相连，出口端与紫外检测器相连，用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.4)平衡色谱柱3～ 5个柱体积，第C步下来的样品稀释后，用NaOH调pH至6.4后，上柱，随后用0.005mol/L 磷酸盐缓冲液(含0.5mol/L氯化钠，pH7.0)洗脱，并收集洗脱蛋白吸收峰。
本发明所采用的纯化方法，培养液上清不需要离心或过滤，即可直接上柱，并且该纯化 方法处理量大，流速快，可以节省操作步骤，节约成本，提高收率，适合于大规模生产；另 外，所采用的分离介质便于装填色谱柱，而且操作简便，易于清洗消毒。经上述方法分离纯 化的尿激酶原产品可以达到SFDA对生物制品的要求，并且回收率达到70％以上，优于以往的 尿激酶原产品纯化方法。

为了进一步说明本发明，以下列举实施本发明的具体实施例。
实施例一
尿激酶原基因的克隆和表达载体的构建
(参见中国专利：重组人糖基化尿激酶原的制备方法，公告号CN1062016C，公告日： 2001年2月14日)
采用肉豆寇酯(PMA)诱导Detroit 562细胞，提取细胞总RNA，构建cDNA文库，通过筛 选获得了含有编码尿激酶基因片段的阳性克隆株，得到人尿激酶原全长cDNA基因并克隆至 pUC19质粒，获得了PMM-UK重组质粒；
从pMM-UK质粒DNA中，分离pro-UK cDNA并插入中间载体1pSV2-pro-UK中得到可 表达尿激酶原的重组质粒pSV2-pro-UK；
从pSV2-dhfr载体中得到内含SV40增强子和二氢叶酸还原酶基因，将此片段插入pXMT 载体中，从而获得中间载体pMTSV-dhfr；
从pSV2-pro-UK中得到含SV40增强子和全长尿激酶原cDNA，并将该片段插入 PMTSV-dhfr中间载体中，即可获得可表达尿激酶原的载体pMTsv-du。
实施例二
转染和筛选高效表达的CHO工程细胞
将20-40μg pMTSV-du质粒DNA通过磷酸钙共沉淀法转染CHO-dhfr-细胞，先用HAT 选择培养基筛选，10大后换成含1-3×10-8M MTX的选择培养基进行dhfr和MTX双重筛选， 并对表达有尿激酶原活性的阳性转化细胞经多次亚克隆和MTX加压扩增基因，锌离子诱导， 最终筛选到能高效表达尿激酶原的细胞株。
实施例三
CHO工程细胞的培养和放大
CHO工程细胞由方瓶(单层贴壁培养)一转瓶(单层贴壁培养)一搅拌瓶(多孔微载体培养)一5L Celligen反应器(多孔微载体培养)一30L Biostat UC反应器(多孔微载体培养)逐级放大培养。 由于细胞能在长满细胞的载体和空载体之间自动转移，每级放大培养时，先在更大规模的反 应器中预先加入适量培养基和经过处理的多孔微载体，长满细胞的多孔微载体通过管道直接 近人下一级反应器中。控制pH为7.0±0.5，DO为7％-40％，温度为37.0±0.1℃，搅拌转速 为70r/min-90r/min.多孔微载体的浓度为2g/L-g/L培养基。采用批式换液连续培养方式，每 天通过细胞截留系统换液1-1.2个工作体积，将微载体截留在反应器中，收获含产品的上清并 加入新鲜培养基。
实施例四
用色谱纯化法纯化重组人尿激酶原
A.收集50升工程细胞培养上清，用HCl调pH至6.4。色谱柱先用0.005mol/L磷酸盐 缓冲液(pH6.4)冲洗并平衡3～5个柱体积，然后加细胞培养上清，流速40ml/分钟，直至 上清液全部通过色谱柱，再用同种缓冲液冲洗色谱柱，并用检测器监测色谱柱流出液，直至 紫外吸收值≤0.005，然后改用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.4)和0.005mol/L磷酸盐缓 冲液(含1.0mol/L氯化钠，pH7.0)进行梯度洗脱吸附在色谱柱上的尿激酶原，收集洗脱蛋 白吸收峰组分。
B.将Sephacryl S-200凝胶色谱柱置于4℃并与一台制备型高效液相色谱仪相连，用 0.005mol/L磷酸盐缓冲液(含0.5mol/L氯化钠，pH7.0)平衡1～2个柱体积；A收集的尿 激酶原通过进样管上样，流速20ml/分钟，紫外检测波长280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
C.将对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱柱进液管与蠕动泵相连，置于4℃， 用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(含0.5mol/L氯化钠，pH7.0)平衡3～5个柱体积，将色谱柱 出口与紫外检测器连接，将蠕动泵进液管插入B收集液中，用紫外检测器监测流出液，收集 穿过蛋白吸收峰流出液。
D.将DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连， 出口端与紫外检测器相连，用0.005mol/L Tris-HCl缓冲液平衡3～5个柱体积，用Tris溶 液将步骤C收集的穿过液的pH调至8.2后上柱，用紫外检测器在280nm波长下监测蛋白吸收 值，收集蛋白质吸收穿过液，得到纯的重组人尿激酶原。
实施例五
用色谱纯化法纯化重组人尿激酶原
A.收集100升工程细胞培养上清，用HCl调pH至6.0。色谱柱先用0.008mol/L磷酸盐 缓冲液(pH6.0)冲洗并平衡3～5个柱体积，然后加细胞培养上清，流速40ml/分钟，直至 上清液全部通过色谱柱，再用同种缓冲液冲洗色谱柱，并用检测器监测色谱柱流出液，直至 紫外吸收值≤0.005，然后改用0.008mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)和0.008mol/L磷酸盐缓 冲液(含1.2mol/L氯化钠，pH7.6)进行梯度洗脱吸附在色谱柱上的尿激酶原，收集洗脱蛋 白吸收峰组分。
B.将Sephacryl S-200凝胶色谱柱置于4℃并与一台制备型高效液相色谱仪相连，用 0.008mol/L磷酸盐缓冲液(含0.2mol/L氯化钠，pH7.6)平衡1～2个柱体积；A收集的尿 激酶原通过进样管上样，流速20ml/分钟，紫外检测波长280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
C.将对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱柱进液管与蠕动泵相连，置于4℃， 用0.008mol/L磷酸盐缓冲液(含0.2mol/L氯化钠，pH7.6)平衡3～5个柱体积，将色谱柱 出口与紫外检测器连接，将蠕动泵进液管插入B收集液中，用紫外检测器监测流出液，收集 穿过蛋白吸收峰流出液。
D.将DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连， 出口端与紫外检测器相连，用0.01mol/L Tris-HCl缓冲液平衡3～5个柱体积，用Tris溶液 将步骤C收集的穿过液的pH调至7.8后上柱，用紫外检测器在280nm波长下监测蛋白吸收值， 收集蛋白质吸收穿过液，得到纯的重组人尿激酶原。
实施例六
用色谱纯化法纯化重组人尿激酶原
A.收集200升工程细胞培养上清，用HCl调pH至5.8。色谱柱先用0.012mol/L磷酸盐 缓冲液(pH5.8)冲洗并平衡3～5个柱体积，然后加细胞培养上清，流速60ml/分钟，直至 上清液全部通过色谱柱，再用同种缓冲液冲洗色谱柱，并用检测器监测色谱柱流出液，直至 紫外吸收值≤0.005，然后改用0.012mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.8)和0.012mol/L磷酸盐缓 冲液(含0.8mol/L氯化钠，pH6.8)进行梯度洗脱吸附在色谱柱上的尿激酶原，收集洗脱蛋 白吸收峰组分。
B.将Sephacryl S-200凝胶色谱柱置于4℃并与一台制备型高效液相色谱仪相连，用 0.012mol/L磷酸盐缓冲液(含0.4mol/L氯化钠，pH6.8)平衡1～2个柱体积；A收集的尿 激酶原通过进样管上样，流速40ml/分钟，紫外检测波长280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
C.将对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱柱进液管与蠕动泵相连，置于4℃， 用0.012mol/L磷酸盐缓冲液(含0.4mol/L氯化钠，pH6.8)平衡3～5个柱体积，将色谱柱 出口与紫外检测器连接，将蠕动泵进液管插入B收集液中，用紫外检测器监测流出液，收集 穿过蛋白吸收峰流出液。
D.将DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连， 出口端与紫外检测器相连，用0.008mol/L Tris-HCl缓冲液平衡3～5个柱体积，用Tris溶 液将步骤C收集的穿过液的pH调至8.2后上柱，用紫外检测器在280nm波长下监测蛋白吸收 值，收集蛋白质吸收穿过液，得到纯的重组人尿激酶原。
实施例七
用色谱纯化法纯化重组人尿激酶原
A.收集200升工程细胞培养上清，用HCl调pH至5.5。色谱柱先用0.01mol/L磷酸盐 缓冲液(pH5.5)冲洗并平衡3～5个柱体积，然后加细胞培养上清，流速45ml/分钟，直至 上清液全部通过色谱柱，再用同种缓冲液冲洗色谱柱，并用检测器监测色谱柱流出液，直至 紫外吸收值≤0.005，然后改用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5)和0.01mol/L磷酸盐缓冲 液(含0.8mol/L氯化钠，pH7.5)进行梯度洗脱吸附在色谱柱上的尿激酶原，收集洗脱蛋白 吸收峰组分。
B.将Sephacryl S-200凝胶色谱柱置于4℃并与一台制备型高效液相色谱仪相连，用 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(含0.3mol/L氯化钠，pH7.5)平衡1～2个柱体积；A收集的尿激 酶原通过进样管上样，流速30ml/分钟，紫外检测波长280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
C.将对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱柱进液管与蠕动泵相连，置于4℃， 用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(含0.3mol/L氯化钠，pH7.5)平衡3～5个柱体积，将色谱柱 出口与紫外检测器连接，将蠕动泵进液管插入B收集液中，用紫外检测器监测流出液，收集 穿过蛋白吸收峰流出液。
E.将Streamline-SP固定床色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测 器相连，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5)平衡色谱柱3～5个柱体积，第C步下来的样 品稀释后，用NaOH调pH至5.5后，上柱，随后用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(含0.3mol/L 氯化钠，pH7.5)洗脱，并收集洗脱蛋白吸收峰。
D.将DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连， 出口端与紫外检测器相连，用0.010mol/L Tris-HCl缓冲液平衡3～5个柱体积，用Tris溶 液将步骤C收集的穿过液的pH调至7.5后上柱，用紫外检测器在280nm波长下监测蛋白吸收 值，收集蛋白质吸收穿过液，得到纯的重组人尿激酶原。
实施例八
用色谱纯化法纯化重组人尿激酶原
A.收集150升工程细胞培养上清，用HCl调pH至6.4。色谱柱先用0.012mol/L磷酸盐 缓冲液(pH6.4)冲洗并平衡3～5个柱体积，然后加细胞培养上清，流速50ml/分钟，直至 上清液全部通过色谱柱，再用同种缓冲液冲洗色谱柱，并用检测器监测色谱柱流出液，直至 紫外吸收值≤0.005，然后改用0.012mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.4)和0.012mol/L磷酸盐缓 冲液(含1.2mol/L氯化钠，pH7.8)进行梯度洗脱吸附在色谱柱上的尿激酶原，收集洗脱蛋 白吸收峰组分。
B.将Sephacryl S-200凝胶色谱柱置于4℃并与一台制备型高效液相色谱仪相连，用 0.012mol/L磷酸盐缓冲液(含0.2mol/L氯化钠，pH7.8)平衡1～2个柱体积；A收集的尿 激酶原通过进样管上样，流速40ml/分钟，紫外检测波长280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
C.将对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱柱进液管与蠕动泵相连，置于4℃， 用0.012mol/L磷酸盐缓冲液(含0.2mol/L氯化钠，pH7.8)平衡3～5个柱体积，将色谱柱 出口与紫外检测器连接，将蠕动泵进液管插入B收集液中，用紫外检测器监测流出液，收集 穿过蛋白吸收峰流出液。
E.将Streamline-SP固定床色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测 器相连，用0.012mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.4)平衡色谱柱3～5个柱体积，第C步下来的 样品稀释后，用NaOH调pH至6.4后，上柱，随后用0.012mol/L磷酸盐缓冲液(含0.2mol/L 氯化钠，pH7.8)洗脱，并收集洗脱蛋白吸收峰。
D.将DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连， 出口端与紫外检测器相连，用0.01mol/L Tris-HCl缓冲液平衡3～5个柱体积，用Tris溶液 将步骤C收集的穿过液的pH调至8.0后上柱，用紫外检测器在280nm波长下监测蛋白吸收值， 收集蛋白质吸收穿过液，得到纯的重组人尿激酶原。
实施例九
用色谱纯化法纯化重组人尿激酶原
A.收集150升工程细胞培养上清，用HCl调pH至6.8。色谱柱先用0.005mol/L磷酸盐 缓冲液(pH6.8)冲洗并平衡3～5个柱体积，然后加细胞培养上清，流速50ml/分钟，直至 上清液全部通过色谱柱，再用同种缓冲液冲洗色谱柱，并用检测器监测色谱柱流出液，直至 紫外吸收值≤0.005，然后改用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)和0.005mol/L磷酸盐缓 冲液(含1.2mol/L氯化钠，pH7.0)进行梯度洗脱吸附在色谱柱上的尿激酶原，收集洗脱蛋 白吸收峰组分。
B.将Sephacryl S-200凝胶色谱柱置于4℃并与一台制备型高效液相色谱仪相连，用 0.005mol/L磷酸盐缓冲液(含0.5mol/L氯化钠，pH7.0)平衡1～2个柱体积；A收集的尿 激酶原通过进样管上样，流速35ml/分钟，紫外检测波长280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
C.将对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱柱进液管与蠕动泵相连，置于4℃， 用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(含0.5mol/L氯化钠，pH7.0)平衡3～5个柱体积，将色谱柱 出口与紫外检测器连接，将蠕动泵进液管插入B收集液中，用紫外检测器监测流出液，收集 穿过蛋白吸收峰流出液。
E.将Streamline-SP固定床色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测 器相连，用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)平衡色谱柱3～5个柱体积，第C步下来的 样品稀释后，用NaOH调pH至6.8后，上柱，随后用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(含0.5mol/L 氯化钠，pH7.0)洗脱，并收集洗脱蛋白吸收峰。
D.将DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连， 出口端与紫外检测器相连，用0.005mol/L Tris-HCl缓冲液平衡3～5个柱体积，用Tris溶 液将步骤C收集的穿过液的pH调至8.2后上柱，用紫外检测器在280nm波长下监测蛋白吸收 值，收集蛋白质吸收穿过液，得到纯的重组人尿激酶原。