前尿激酶突变体

本发明涉及在溶解血栓治疗中使用的新型前尿激酶。

前尿激酶(pro-UK)是一种单链型的丝氨酸蛋白酶前体，该前 体受纤维蛋白溶酶(plasmin)的激活而形成双链尿激酶(UK)。前尿 激酶和尿激酶都可将纤维蛋白溶酶酶原活化或转化为活性纤维蛋白 溶酶，它降解存在于纤维蛋白凝块中的一系列血浆蛋白。因此，前 尿激酶和尿激酶已用于血栓栓塞的治疗。

这种治疗方式可产生一些不良的副作用。前尿激酶和尿激酶都 能引起非特异性的纤维蛋白溶酶酶原活化，从而导致纤维蛋白、纤 维蛋白原降解(纤维蛋白原溶解作用)，以及血小板和血管壁的部 分溶解，和出血素质的降低。在以低剂量使用时，前尿激酶比尿激 酶更具有选择性，即特异性地使纤维蛋白溶酶原激活，这是因为前 尿激酶仅激活结合了纤维蛋白的纤维蛋白溶酶原，而尿激酶激活任 何纤维蛋白溶酶原。但是，为了确保血栓溶解的效果需要使用高剂 量时，前尿激酶就丧失了其低剂量时的特异性。

前尿激酶具有一些特性，使它既类似“非活性”酶原也类似 “活性”酶。一方面，前尿激酶的酶原特征包括在血浆中的惰性行 为，不能形成十二烷基硫酸钠-稳定抑制剂复合物，以及相对抵抗 二异丙基氟磷酸(DFP)或Glu-Gly-Arg氯甲基酮的抑制作用，这些 都是尿激酶的有效抑制剂。前尿激酶具有的激活纤维蛋白溶酶原活 性也比尿激酶低200倍。

另一方面，前尿激酶的酶活性包括其作用于合成底物和纤维蛋 白溶酶酶原的可测量的内在活性(intrinsic activity)，其活性比 其他丝氨酸蛋白酶酶原(如胰蛋白酶原或糜蛋白酶)高出104.0-4.3倍。 在作用于纤维蛋白溶酶酶原时前尿激酶的米氏常数(Km)也比尿激酶 低，并且在纤维蛋白片段E2存在下，已证明前尿激酶不必激活为尿 激酶形式而有作用于纤维蛋白酶原的完全活性。

尽管其具有用作血栓溶解剂的潜力，但当以治疗剂量给药时， 前尿激酶的高的内在酶活性可引起如上所述的不希望出现的非特异 性全身纤维蛋白溶酶酶原激活。因此用前尿激酶进行血栓溶解治疗 仍伴有有害的副作用。

发明概述

本发明是基于下列发现：可以设计突变型前尿激酶，使天然前 尿激酶中存在的不合需要的、内在的、非特异的酶活性降低，但在受 纤维蛋白(片段Y或E2)启动(激活)的能力方面至少与天然前尿激酶 具有同样的效果，并可将纤维蛋白溶酶酶原转化为纤维蛋白溶酶， 以及在转化为双链尿激酶之后，保留溶解血栓的活性。因此，当给 患者施用时，这些突变型前尿激酶比天然前尿激酶能产生更低的非 特异性纤维蛋白溶酶酶原激活作用以及出血并发症。

与天然前尿激酶相比，这些突变型前尿激酶是优良的血栓溶解 药剂，因为它们受纤维蛋白激活的程度与天然前尿激酶相同。因此 具有相同的纤维蛋白溶解效率，但比天然前尿激酶具有大得多的对 于结合纤维蛋白的纤维蛋白溶酶酶原的特异性，因为它们在血浆中 确实是惰性的。由于其惰性行为，结果在给患者施用这些突变型前 尿激酶时，可比天然前尿激酶使用更高，更有效验的剂量。

因此，本发明的特征在于一种有溶解血栓活性的前尿激酶突变 体，它具有天然前尿激酶的氨基酸序列，其中该序列有一个突变位 点。当给患者施用时，该突变促使前尿激酶突变体比天然前尿激酶 诱导出更低的纤维蛋白原溶解作用和非特异性纤维蛋白溶酶酶原激 活作用。该突变优选是由一个新的氨基酸替代在天然前尿激酶的氨 基酸序列中存在的一个常规天然氨基酸，这种替代发生后导致突变 型前尿激酶具有的内在活性比天然前尿激酶至少低10倍，并且在给 患者施用时，与天然前尿激酶相比，在纤维蛋白溶酶激活后基本上 具有相同的纤维蛋白激活作用以及血栓溶解活性。

本文中使用的术语“天然”是指一种天然存在或野生型形式的 蛋白质，或者是指在天然存在的蛋白质中的一种天然存在或野生型 形式的氨基酸。一种“新”氨基酸是指天然蛋白质内通常不定位于 给定位点上的氨基酸。本文中使用的术语“突变”包括用单一新氨 基酸替代一个天然氨基酸，或者是两个或多个新氨基酸替代两个或 多个天然氨基酸。

具体地说，突变可以是一个新氨基酸替代天然前尿激酶的可塑 性环(第297位氨基酸至313位氨基酸)中的一个天然氨基酸。例如， 可用新氨基酸(如丙氨酸或组氨酸)替代Lys300，Gly299和/或Glu301。另 外，可用新氨基酸(如丙氨酸或组氨酸)替代Lys313，或用如甘氨酸 替代Tyr306。

另外，突变可以是用一个新氨基酸替代Ala175，并用第二个新 氨基酸替代Tyr187，从而在突变型前尿激酶中形成一个酶原三联体 (Zymogen triad)。例如，该新氨基酸可以是丝氨酸，而第二个新氨 基酸可以是组氨酸。本发明的特征还在于组合突变，例如导入两个 突变而形成酶原三联体，还包括用第三个新氨基酸替代Lys300，以及 用第四个新氨基酸替代Glu301。这样一种突变型具有诸如以丝氨酸作 为新氨基酸，组氨酸作为第二个新氨基酸，丙氨酸或组氨酸作为第 三个新氨基酸，以及丙氨酸作为第四个新氨基酸的突变。

本发明的特征还在于一种DNA分子，例如，一种重组DNA分子， 该分子编码本文中描述的任何突变型前尿激酶。这些突变可以包括 单个或双个或多个替代。本发明还包括一种用上述的DNA分子转化 的细胞，例如一种哺乳动物、细菌或酵母细胞。本发明的特征还在 于一种制备本文中描述的突变型前尿激酶的方法，该方法包括用编 码一种突变型前尿激酶的DNA分子转化一种细胞，培养该细胞，以 及表达该突变体，并分离该突变体。

另外，本发明描述了治疗患者的血栓栓塞的方法，该方法包括 给患者施用使血栓溶解的量的本文描述的任何前尿激酶突变体。本 文中使用的术语“使血栓溶解的量”是指裂解患者的纤维蛋白凝块 而不会诱导全身出血的所需的前尿激酶突变体的量。

从下文的中详细描述以及从权利要求可容易地看到本发明的其 他特征和优点。

发明详述

首先简要地描述附图

图1图解表示前尿激酶的氨基酸结构，显示可塑性环和各种特 定氨基酸。

图2a是用计算机绘制的“非活性”构型的前尿激酶的三维空间 结构(3-D)模型，该模型显示了活性位点(Ser356，His204和Asp255，红 色 )，以及不与Asp355(绿色 )发生相互作用的所谓“可塑性 环”(蓝色 )的Lys300和Lys313(黄色 )。

图2b是用计算机绘制的“活性”构型的前尿激酶的3-D模型。 该模型显示了活性位点(Ser356，(His204以及Asp255，红色 )，以 及与Asp355(绿色 )发生相互作用的所谓“可塑性环”(蓝色 ) 的Lys300和Lys313(黄色 )。

图2c是用计算机绘制的双链尿激酶的3-D模型，该模型显示了 活性位点(Ser356，His204和Asp255，红色 )，Asp355(绿色 )，以 及被切割的新氨基末端残基Ile159(紫色 )。

图3显示了所谓的包括Ser356，His204和Asp255的“电荷传递系统 (charge relay system)”和位于Asp355和Ile159之间一个“盐桥”。

图4描述了适用于制造本发明的前尿激酶突变体的寡核苷酸定 位诱变的方式。

图5是双顺反子mRNA表达载体pED的概要图，该载体适用于在哺 乳动物细胞中表达前尿激酶突变体。

突变型前尿激酶的研制

至今还未测出尿激酶和前尿激酶的三维空间(“3-D”)结构。 但是，已知前尿激酶/尿激酶的B链(它是蛋白酶区)分别与胰蛋白酶 和胰凝乳蛋白酶及其前体胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原具有显著的 同源性，它们的3-D结构都是采用X-射线晶体照相方法而得知的。 由于这些分子的同源性大于30％，因而前尿激酶/尿激酶与这些分 子进行主链排列时核心残基的距离约在1.0或更小范围内。因此， 预测得的前尿激酶/尿激酶结构是可靠的。

氨基酸序列“同源性”是指两个或多个氨基酸序列之间的相似 性或百分等同率。可以采用例如序列分析软件(例如，WI，Madison， 威斯康星大学，遗传计算机组的序列分析软件包)测出两个给定蛋 白质的同源性。同源性百分值是由完全匹配或者含有保守的氨基酸 替代的序列(例如由另一个类似的氨基酸替代一个氨基酸，结果导 致得到的蛋白质的特性和活性发生很少或几乎不发生变化)来确定 的。

基于前尿激酶/尿激酶与胰蛋白酶(原)和胰凝乳蛋白酶(原)结 构同源性，以及前尿激酶的纤维蛋白特异性是由纤维蛋白E2片段的 选择性启动介导的这一发现(Liu & Gurewich，Biochemistry，31： 6311-6317(1992)，该E2片段诱导Glu-血纤维蛋白溶酶原上特定 构型变化)而设计前尿激酶突变体。为了设计前尿激酶突变体，申 请人根据分别以胰凝乳蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶的多肽主链的空间 坐标，以及弹性蛋白酶和胰蛋白酶(原)的结构，研究出前尿激酶/ 尿激酶的蛋白酶区(B-链)的3-D结构计算机模型。申请人还使用 了两个制作分子模型的程序，一个是CHARMM，这是一个将大分子的 能量最低化以及进行动力学计算的程序，该程序是由哈佛大学化学 系研制的，并描述于Brooks等人，J.Comp.Chem.，4：187-217 (1983)。另一个程序是QUANTAR，它是由Silicon Graphics，Inc. (San Francisco，CA，USA)研制的。

如图1、2a和2b所示，该模型清楚地显示了前尿激酶B链(蛋白 酶链)的三维空间结构。该模型是由两个亚区组建而成，这两个亚 区是与胰凝乳蛋白酶(原)的结构相似的β-管形结构，并且该模型 具有下列特征。该B链上每个原子的空间坐标已被明确限定。位于 分子表面的Ile159共价连接到其A链的130-158肽上。前尿激酶的 “活化区”含有三个序列(氨基酸位点297-313，344-353以及376 -383)。序列297-313形成其可塑性比胰凝乳蛋白酶原或胰蛋白酶 的类似环更小但更不稳定的“可塑性环”(图2a和2b中的蓝 )。 当该可塑性环处于某一种构型时，该环中Lys300(黄色 )的带ε -正电氨基团与Asp355(绿色 )的带负电荷羧基团发生作用。这 一相互作用把活性位点Ser356几乎推入到理想位置，在这里Ser356的 羟基所处位置最有利于在电荷传递系统(charge relay system)内发 生相互作用，该电荷传递系统包含另外两个重要的活性位点残基： 一个组氨酸和一个天冬氨酸(图2a和2b中红色)。Lys313(黄色 )也 从另一方向与Asp355发生作用。因此，这时主要形成了前尿激酶蛋白 酶区的活性位点和底物结合袋，没有转变为双链形式。但是，由于 这种“活性构型”出现的概率仅为0.5％，因而未切割的单链尿激 酶的活性仅为活性双链形式活性的约0.5％。

如图2c和3所示，在双链形式中，被切割的Ile159新的氨基基团 (图2c中紫色 )与Asp355(绿色 ，图2c)一起形成稳定的“盐 桥(salt bridge)”，它可使活化区稳定，并使整个分子活化。另一 种可选情况，如果有外来力量作用，如来自于结合E2片段的血纤维 蛋白溶酶酶原的作用，使“可塑性”环的活性构型(图2c中黄色 ) 稳定，则未切割的前尿激酶单链形式也可以完全活化。

另外，前尿激酶模型并不包括胰凝乳蛋白酶原中的所谓“酶原 三联体(zymogen triad)”(由Asp194，His40以及Ser32形成的氢键网)， 因为该三联体并不存在于天然前尿激酶中。在前尿激酶中，胰凝乳 蛋白酶原三联体的His40和Ser32分别由Tyr187和Ala175替代。该“酶原 三联体”对于使胰凝乳蛋白酶原的一个活性位点区的非活性构型 (含氧阴离子孔)是重要的。

利用该模型，申请人在前尿激酶和尿激酶的蛋白酶区域内选择 和制作了特异的氨基酸替代模型，从而设计出特定的前尿激酶突变 体，然后构建、表达并定性这些突变体。下文中描述了四种类型的 突变，这些突变方式可以达到使非特异性血纤维蛋白溶酶酶原激活 降低并完全保留血栓溶解活性的预期目的。

前尿激酶的Lys300的定点突变

利用X-射线晶体学技术进行研究曾帮助人们解释了为什么大 多数蛋白酶的单链酶原形式“没有”活性，并且怎样裂解一个单键 会诱导出具全部活性的酶的形成。但是前尿激酶比其他大多数酶原 具有更大的内在活性，但是它比单链组织血纤维蛋白溶酶原激活因 子(SC-t-PA)活性要低。具体来说，胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶 原仅为其相应的活化双链酶形式活性的约10-6。SC-t-PA具有双 链t-PA活性的约10-1.5。前尿激酶具有其双链衍生物UK活性的约 10-2.3。

丝氨酸蛋白酶原激活为活性酶的一个主要方面是该酶原的新氨 基末端α-氨基基团移动进该酶原的表面小袋，在其中该基团与一 个天冬氨酸形成一个所谓的“盐桥”，该天冬氨酸在该蛋白质的活 性位点中在氨基酸序列上与丝氨酸相毗邻。图3用图解方法显示了 发生的这一系列事件。该盐桥是在双链尿激酶的新氨基末端(Ile159 的正电荷α-氨基，或前尿激酶中的相应基团，与天冬氨酸残基 (Asp355)的侧链的负电荷羧基基团之间形成的离子键或静电作用。

该盐桥的形成导致丝氨酸羟基旋转至一个新位置，该位置上最 有利于在电荷传递或质子转移系统内发生相互作用(这是催化反应 的关键)，并由三个主要活性位点残基形成：His，Asp和Ser(图2a -2c(红色 )和3)。该盐桥的形成也使含有三个序列(297-313， 344-353和376-383)的、被称为前尿激酶的“活化区”的区域稳定。

在非活性的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原中，X-射线晶体衍 射图没有反映出这些活化区域，这归因于这些区域空间位置不固定， 容易摇摆不定。这些区域围绕着底物结合袋，这就可以解释为什么 酶原不与底物结合。在激活的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶中，正如 Huber等人，在Acct.Chem.Res.，11：114-122(1978)描述的， 这些区域是固定的并且在X-射线晶体衍射图中可明显地看到。

正如Heckel等人，J.Comp.Aided Mol.Des.，2：7-14(1988) 和Peterson等人，Biochem.，29：3451-57(1990)描述，在SC-t -PA中，带正电荷的Lys416的ε-氨基(编号按t-PA)通过Asp477 (编号按t-PA)而显示出代用盐桥的作用，将活性位点Ser478(编 号按t-PA)几乎推入到理想位置。在前尿激酶中，在相同于SC-t -PA中的Lys416位置上有一个Lys300(编号按前尿激酶)。前尿激酶 Lys300的带正电荷的ε-氨基被假定是尿激酶的新末端Ile159α- 氨基的代用物。但是，有一个邻接的Glu301，看来它可以降低其影 响。在Asn302残基上有一个糖基化位点，在邻近的Ser303残基上有一 个磷酸化位点。这种排列可以解释前尿激酶高的(相对于胰凝乳蛋 白酶原)内在活性的部分(相对于SC-t-PA)来源。

基于这些考虑，申请人已对一组突变进行分类，其中，Lys300 和/或其周围残基突变为几种不同类型的氨基酸残基，以便调节该 位点和Asp355(编号按前尿激酶)之间的电子作用，从而尽可能多地 降低天然前尿激酶的内在活性，但保留其纤维蛋白启动能力和天然 前尿激酶的双链形式活性。下列编号为1-5的前尿激酶突变体描述 了该组突变体。这些突变体是采用下文中描述的定点诱导技术和基 因表达技术制备的。

突变体1：Lys300→Ala

用中性氨基酸丙氨酸(Ala)替代前尿激酶中的Lys300，这种替代 不会影响该分子的折叠，但被设计用来消除300位和As355之间的盐 桥而降低内在活性。一旦设计完成计算机模型，就按下文描述制备 和检测该突变体。结果显示，该突变体没有可检测到的内在活性， 因此它在血浆中是非常稳定的。在以大于10mg/ml的浓度保温24小 时以上时没有诱导血纤维蛋白原降解。这一稳定性比天然前尿激酶 在体外诱导血浆血纤维蛋白原降解50％时使用的浓度至少高出10倍。 这种突变体的双链形式时的活性(在血纤维蛋白溶酶激活之后)被降 低(为尿激酶活性的33％)，其受血纤维蛋白E2片段启动后活性也降 低(为前尿激酶活性的40％)。

突变体2：Lys300→His

作为第二种可选择方案，用组氨酸(His)替代前尿激酶模型中 的Lys300。组氨酸能够在pH低于6.5时获得一个氢离子变成带正电荷， 但没有象赖氨酸中的ε-氨基电荷一样强。在前尿激酶模型中， His300的咪唑基团被包裹在分子内部，处于比在外面时更低的能量 状态，因为咪唑基相当疏水。由于它面向Asp355，这使咪唑基带有 正电荷，这就使局部环境呈酸性。因此，在Asp355和His300之间存在 一个弱盐桥，使His300的行为类似于弱Lys300。由于His的静电荷依据 局部环境而定，并且如下文中描述的该His300定位于可塑性环区域 (297-313)，因而该调制子(E2片段)仍调节前尿激酶的内在活性。 基于Lys300→Ala的资料以及His相对于Lys的特性，突变体2的内在活 性也应该比天然前尿激酶的相应活性低10倍，但比突变体1的活性 要高。但是，应该保留双链型活性以及纤维蛋白激活能力，并应该 比突变体1高，但比天然前尿激酶低。

突变体3：Gly299→His/Lys300→Ala

在前尿激酶模型中，在前尿激酶的主链上的Gly299羰基基团的 氧与Asp355形成一个氢键。在胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原中也存在 上述键结构。当在模型中用His替代Gly299时，在His299和Asp355之间 形成了一个强盐桥，其强度大于His300和Asp355之间形成的桥，因此， 阻止了该盐桥的形成。His299的局部环境受活性位点、底物结合袋 或其他内部区域变化的影响大于受前尿激酶的可塑性环构象变化的 影响。相反，His300突变体(突变体2)应该有相反的行为，即它应 该更多地受环区域构象变化的调节。基于His相对于Gly的特性，突 变体3的内在活性和双链型活性应该比突变体2高2倍。但是，其纤 维蛋白激活能力应比突变体2降低20％以上，但要比突变体1高。

突变体4：Lys300→Ala/Glu301→Ala

如果以一个中性丙氨酸替代带正电荷的Lys300，则Glu301的负电 荷变得太强以致于不能吸引Ile159的α-氨基从而避免它与Asp355发 生相互作用。这导致活化的突变体1双链型(UK)溶解血栓能力降低。 因此，通过用中性丙氨酸替代Lys300和Glu301而设计成双重突变来解 决这个问题。根据模型，以及相对于Lys和Glu的中性Ala的特性， 突变体4应该具有几乎相同于突变体1的特性，但是它的双链型活性 应比突变体1高出2倍。

突变体5：Lys300→His/Glu301→Ala

该突变体是突变体2和突变体4的结合物。基于Ala300前尿激酶 突变体1的特性，带正电荷残基(300)对于激发单链的内在活性和双 链型活性是重要的。因此，该双重突变体，突变体5在内在活性和 纤维蛋白激发能力方面应该相似于突变体2，但其双链型活性应该 更高。

突变体1-5显示了怎样可将内在活性，双链型活性，以及纤维 蛋白激发能力相对于天然前尿激酶进行调整。这些调整可采用定点 诱变和结构模型技术在真正的前尿激酶突变体上完成。这些突变体 基本上达到三个目的(1)降低了血纤维蛋白原的降解(低内在活性)， (2)未改变纤维蛋白启动能力(保留了纤维蛋白启动能力)以及(3)在 血纤维蛋白溶酶激活之后具有相当于天然前尿激酶的活性(双链型 活性)。因此，这些突变体具有较高的治疗用途。

前尿激酶的可塑性环的定点诱变

对内在活性起着关键作用的前尿激酶的另一结构就是由297- 313位氨基酸形成的所谓的“可塑性环”(图1，图2a和2b(蓝 ))， 在所有丝氨酸蛋白酶和它们的酶原中该环是最混乱或摇摆不定的区 域。该区域提供了酶/酶原功能调节的机制。

该环在胰凝乳蛋白酶中被裂解，但在t-PA和前尿激酶中，一 种Lys416/300突变体涉及内在活性。基于前尿激酶/尿激酶模型，鉴别 出了该环的一个明确的“活性”构型(图2b中的蓝 )，在天然前 尿激酶中，该“活性”构型与其他各种“非活性”构型处于动力学 平衡中。在“活性”构型中，该环上仅有的带正电残基Lys300被定 位于面朝该分子的里面，从而与Asp355(绿色 )一起形成盐桥， 结果导致产生一个全活性催化位点。与之相比，在“非活性”构型 中，该环(图2a的蓝色 )被向上翻转使Lys300正电荷不与Asp355 (绿色 )排成一直线，从而使酶原失活。

所观察到的前尿激酶的活性表明了该平衡偏向于非活性构型， 仅0.5％处于活性构型，这与前尿激酶的内在活性相对于其活性双 链形式(UK)的百分数相一致。

起初的研究证明，在可塑性环中，三个带负电残基(Glu301， Asp305和Glu310)的侧链总是定位于环上与Lys300相反的一边。当带 负电的残基的侧链被约束在该分子的外面时，则极有可能Lys300的 ε-氨基将与Asp355形成盐桥。换句话说，当三个带负电残基被约 束在该分子的外面时，有利于活性构型形成。

当前尿激酶与结合了E2片段的Glu-血纤维蛋白溶酶原发生相 互作用时，来自于E2片段-Glu-血纤维蛋白溶酶原复合体的外部 静电作用力，通过吸引该分子外的三个带负电侧链(Glu301，Asp305和 Glu310)而使活性构型稳定。因此，Lys300被定位于面对该分子里面的 位置上并且与Asp355形成盐桥。结果，前尿激酶在没有转化为双链 形式的情况下被完全活化。

可以进一步提高该环的可塑性的使可塑性环定位诱变方法将使 产生“活性”构型的可能性降低至低于0.5％。如果该突变体在转 变为双链形式之后保留相似的双链型活性，并且与天然前尿激酶相 比保留相似的纤维蛋白激活能力，则它将是一种能达到三种预期目 的的优良的激活子。这样一种突变体在血浆中具有较低的内在活性， 但在纤维蛋白(E2片段)存在下以及在双链形式时是完全活化的。

基于这些考虑，申请人划分出了第二组突变体，这组突变体降 低了“活化”构型存在的概率，但保留了可被E2片段-Glu-血纤 维蛋白溶酶原复合体诱导“活性”构型的特性，以及双链型活性。 这组突变体可用下面编号为6的前尿激酶突变体来描述。

突变体6：Tyr306→Gly

基于前尿激酶的内在活性是“活性”和“非活性”构型之间平 衡的函数这一概念，则环可塑性的提高应可降低内在活性。因此， 设计了一种Tyr306→Gly突变体，其中该环的β-转角结构被打破从 而提高了它的可塑性。因此，该突变体应具有降低了的内在活性， 但应仍保存E2片段激发作用、双链活性和血纤维蛋白激活作用。因 此，突变体6会有较好的治疗作用。

前尿激酶的Lys313定点突变

前尿激酶的Lys313是尿激酶的新末端α-氨基基团的另一个替 代物。如图1和2b所示，Lys313(黄色 )的行为可以象Lys300，与 Asp355(绿色 )一起形成一个盐桥，这样能导致前尿激酶的内在 活性提高。Lys313与Asp355的相互作用是受可塑性环的运动的调节的。 因此，这种相互作用的消除将进一步降低前尿激酶的内在活性。基 于这些考虑，申请人已设计了下列突变体7和8。

突变体7：Lys313→Ala

如图1和2b所示，Lys313(图2b的黄色 )定位于可塑性环 (图1的297-313，图2b的蓝色 )的末端以及靠近于Asp355(绿色 )处。与Lys300相似，Lys313的ε-氨基正电荷具有作为尿激酶的 新末端α-氨基的替代物的作用并与Asp355形成一个盐桥，该盐桥 方向与Lys300形成的盐桥方向相反。有利的是，该突变体没有影响 双链尿激酶的活性，因为当新的末端氨基(Ile159)被产生而通过竞 争与双链尿激酶中的Asp355形成另一个盐桥时就打破了该盐桥。

与之相反，由于在双链型中存在Lys300和Asp355之间的电荷作用 并且这种电荷作用对双链型的活性起作用，因而Lys300确实影响双 链型的活性。类似地，在SC-t-PA的相应的氨基酸位置上也有一 个Lys残基，已证明该残基与其高内在活性相关。

突变体8：Lys313→His

在该突变体中，用His替代Lys313，该His比Lys具有更低的正电 荷。基于类似于上文中描述的有关突变体2的基本原理，设计该突 变体用于校正突变体7。

突变体7和8应比天然前尿激酶具有更低的内在活性，因为它们 阻止了与Lys313形成盐桥，但其内在活性应高于突变体1和2。它们 的双链型活性应基本上相同于天然UK(双链型)。它们的纤维蛋白激 活能力也被保留了，并近似于天然前尿激酶。因此，这些突变体在 临床上也有用途。

在前尿激酶中定点突变形成一个“酶原三联体”

胰凝乳蛋白酶和胰凝乳蛋白酶原的X-射线结构证明，由“酶 原三联体”(由Asp194，His40和Ser32组成，编号是用胰凝乳蛋白酶编 号)氢键网的形成对于胰凝乳蛋白酶原活性位点区域(含氧阴离子裂 口)非活性构型的稳定是重要的。但是，申请人发现在前尿激酶或t -PA中未出现酶原三联体。在前尿激酶中，胰凝乳蛋白酶原三联体 的His40和Ser32是分别由Tyr187和Ala175代表的。该缺失的三联体也对 前尿激酶或t-PA的更高的内在活性起作用。

作为设计具有所需特性的前尿激酶突变体的另一种可选择的方 法，在天然前尿激酶中制造“酶原三联体”可降低它的内在活性， 而不会影响其溶解血栓活性所需的其他功能。

突变体9：Ala175→Ser/Tyr187→His

设计这种双重突变体，以便在前尿激酶中导入类似于在胰凝乳 蛋白酶原中存在的“酶原三联体”。这种突变应降低前尿激酶的内 在活性，但并不影响E2片段的激活作用，以及双链型的活性。因此， 这种突变体也应达到上述的三个目标，并可用作为血栓溶解剂。

联合突变

申请人已经发现，前尿激酶的内在活性依赖于几个不同的分子 内相互作用，这些相互作用包括(1)在单链型中作为尿激酶的新末 端α氨基的替代物的Lys300或Lys313；2)缺乏“酶原三联体”；以及3) 可塑性环(297-313)活性构型的较低可塑性和较高出现概率。因此， 仅基于一方面的突变不能最大程度地消除内在活性，这种突变正在 损伤而没有消除双链型活性以及纤维蛋白激活能力，而这是血栓溶 解活性所需要的。但是，影响两种或多种这些分子相互作用的多重 突变可以获得一种最合适的前尿激酶突变体。基于这些考虑，申请 人已经设计一组联合突变体，由下列突变体10-17进行描述。

突变体10-17的所有突变体都有一个人工酶原三联体，这可以 减少内在活性，并且大多数将Lys313中和或使其最小程度地带有正 电荷，以便阻止或减弱盐桥的形成，这也可以减少内在活性。同样， 这些联合突变体中有几种也使Lys300中和或使之带有较少正电荷。 Tyr306→Gly的突变通过提供更多的可塑性而降低了可塑性环活性构 型出现的概率，并且Glu301→Ala的突变阻碍了Ile159和Asp355之间的 相互作用，于是保留了双链型活性。 突变体10：Ala175→Ser/Tyr187→His/Lys313→Ala 突变体11：Ala175→Ser/Tyr187→His/Tyr306→Gly 突变体12：Ala175→Ser/Tyr187→His/Lys313→His 突变体13：Ala175→Ser/Tyr187→His/Tyr306→Gly/Lys313-

      Ala 突变体14：Ala175→Ser/Tyr187→His/Lys300→Ala/Glu301→

      Ala/Lys313→Ala 突变体15：Ala175→Ser/Tyr187→His/Lys300→His/Glu301→

      Ala/Lys313→Ala 突变体16：Ala175→Ser/Tyr187→His/Lys300→Ala/Glu301→

      Ala/Lys313→His 突变体17：Ala175→Ser/Tyr187→His/Lys300→His/Glu301→

      Ala/Lys313→His

所有这些突变体最令人满意的是应该完成三个计划目标：(1) 在血浆中具有低内在活性和高稳定性，(2)不改变其纤维蛋白激发 能力以及显著高的纤维蛋白特异性，以及(3)在血纤维蛋白溶酶激 活之后与天然前尿激酶相比具有相等的双链型活性。因此，这些突 变体应该在比天然前尿激酶更高的剂量时高效地溶解血栓栓塞块而 没有诱导出血并发症。而且，它们应该可用作为药物以阻止闭合的 纤维蛋白栓塞形成。因为它们在没有纤维蛋白的血浆中是非常惰性 的，因而是十分安全的。因此，这些突变体有高的治疗功效。

前尿激酶突变体的制备

针对寡聚核苷酸的诱变

适用于制备本文中描述的前尿激酶突变体的定点诱变的一种类 型是寡聚核苷酸定点诱变，这种方法可使现有DNA序列，即天然前 尿激酶，发生特异性变化。编码天然前尿激酶的基因已被完全定性 并可从例如Dr.David Dichek(NIH)和Dr.Paolo Sarmientos (Primm，Milano，Italy)处得到。在ATCC的保藏号为DNA57329或 细菌/噬菌体57328。还可从NIH计算机数据库Protein Identity Resource中以UKHU名称得到。前尿激酶的氨基酸序列显示于图1中。

通过合成序列中含有所需突变的一个寡核苷酸引物，将该引物 与含有天然序列的模板进行杂交，并用T4DNA聚合酶延伸之，可以 完成寡核苷酸定点诱变。由于在寡核苷酸中存在突变，得到的产物 因而是一个含有一个错配的异质双链分子。在例如大肠杆菌细胞中 修复该错配后该突变就被固定下来。该方法的详细描述参见例如 Ausubel等人(eds.)，Current Protocols in Molecular Biology， Chapter 8.1(Greene Pubishing Associates 1989，Supp.13)， 引入本文作为参考。

这种定点诱变方法的基础是使用一种DNA模板，该模板含有少 量替代胸腺嘧啶的尿嘧啶残基(图4)。该含有尿嘧啶的DNA是在大肠 杆菌dut-ung-菌株中产生的。在该dut-ung-组合突变体中，脱氧尿苷 掺入到DNA中替代胸苷并且没有被除去。于是，可将含有待改变的 序列的载体在dut-ung-宿主中生长以便制备含有尿嘧啶的DNA模板用 于定点诱变。如图4所示，将经突变的寡核苷酸引物与该DNA模板退 火，并用T4 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶处理以便产生双链环状分子。

该寡核苷酸引物应该是高质量的，即是从不完整DNA合成中产 生的低分子量杂质中纯化出来的。在某些情况下，尤其是对于大于 40个核苷酸的寡核苷酸，用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化是必要的。

在以体外反应为特点的定点诱变方法中，无法将含有尿嘧啶的 DNA模板与正常模板分开。由于在该模板中dUMP与TMP具有相同的编 码潜力，因而尿嘧啶不是诱变性的。此外，在该模板中尿嘧啶的存 在不是DNA体外合成的抑制因素。因而，该DNA可用作产生互补链的 模板，该互补链含有所需的DNA序列变化，但是仅含有TMP而不含有 dUMP残基。

在完成体外反应之后，通过尿嘧啶N-糖基化酶的作用，或者 通过将体外反应的未进行分离的产物导入到野生型(dut+ung+)大肠 杆菌细胞中而从该模板链中除去尿嘧啶。用糖基化酶处理释放尿嘧 啶，在该模板链中产生致死的脱嘧啶(AP)位点。于是该模板链的生 物学活性丧失，并且其子代大多数是从感染性互补链产生的，该互 补链含有所需的变化。这导致高效率地产生突变DNA(通常为50％)， 并由此可采用DNA序列分析法筛选出突变DNA。

如Smith，Ann.Rev.Genet.，19：423-463(1986)的描述，已 经开发出采用引物延伸高效率地产生突变体而进行体外诱变的几种 方案。本文描述的方案是一种简单的定点诱变方案，适用于一种特 定的含尿嘧啶的模板，用该方案可快速和高效地回收突变DNA，原 始方法可参见Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：488- 492(1985)，和Kunkel等人，Meth.Enzymol.，154：367-382(1987) 的描述，所有这些都引入本文作为参考。原则上，这样的模板可应 用到大多数其他方案中。

将前尿激酶基因连接到质粒M13mp18的HindIII/XbaI位点，将 该质粒转化到大肠杆菌中，分离单链DNA，并完成如上所述的寡核 苷酸定点诱变，即可以产生突变体1。

前尿激酶突变体DNA的表达

一旦获得了带有所需突变的前尿激酶，则必须将其克隆到合适 的表达载体中。然后必须将该载体导入到一个细胞系(例如细菌， 哺乳动物细胞或酵母)中，以便表达前尿激酶突变体。该突变体可 从培养基或从酵母细胞中回收，然后纯化。这些技术都是分子生物 学领域内普通技术人员熟知的，并在，例如Ausubel等人(eds.)， Current Protcols in Molecular Biology，Chapters 9和16，见 上文；以及Sambrook，Fritsch，和Maniatis，Molecular Cloning (2nd ed.)，Chapter 16(Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中有详细描述，所有这些都引入本文作为参考。

有几种方法可将前尿激酶突变体基因导入到哺乳动物细胞中。 一种方法包括将一种载体转染到中国仓鼠卵巢(“CHO”)细胞中。 在该方案中，用一种选择性标记与该突变型前尿激酶一起共转染， 使该基团稳定地整合到宿主细胞染色体中，并且随后被扩增。CHO 细胞系统是优选的，这是因为它能在长时期内产生大量突变型前尿 激酶。例如CHO DXB11或CHO DG44细胞系可从Columbia大学的Lawr- ence Chasin处获得。细胞系CHO GRA可从Genetics Institute Ran- dall Koufman处获得。

另一种表达方法包括将含有突变DNA的载体转染到PET-19B大 肠杆菌表达系统(Novagen，Madison，WI)中。例如，在定点诱变之 后，将编码突变体1(Lys300→Ala)的DNA进行测序以确保发生突变， 然后连接到一种高效大肠杆菌基因表达系统PET-19B(Novagen， Madison，WI)的NdeI/XhaI位点上，并转化到大肠杆菌中。将转化 的大肠杆菌培养，并在对数生长期加入诱导剂IPTG而诱导前尿激酶 突变体的表达。

将载体导入哺乳动物细胞系时，也需通过选择出宿主染色体内 的高拷贝数的转染DNA而增加所需蛋白质(例如突变型前尿激酶) 的表达。使被转染的DNA进行共扩增可导致由该转染DNA编码的蛋白 质的表达提高100-1000倍。在文献中已经描述了20个以上可选择 和可扩增的基因，但用转染的二氢叶酸还原酶基因进行氨甲喋呤选 择和扩增已获得很多经验和最大成功。例如采用共扩增方法通过氨 甲喋呤抗性选择，可用二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞获得突变型 前尿激酶基因的高水平表达。

利用CHO细胞表达载体进行扩增

用pED系列的双顺反子载体可使一种靶基因在稳定转染的细胞 中进行高水平表达(图5)。这些载体携带一个克隆序列以便于一个 靶基因(例如突变型前尿激酶基因)插入，其后跟随着可选择和可扩 增的标记基因，即二氢叶酸还原酶(“DHFR”)。根据其在无核苷培 养基上的生长能力，可选择出用合适载体转化的DHFR缺陷型CHO细 胞。随后在逐渐增加浓度的作为DHFR功能的一种强抑制剂的氨甲喋 呤存在下进行周期性选择，结果导致被整合的DNA扩增并使所需基因 产物的表达提高。图5中显示的pED载体描述于Kaufman等人，Nucl. Acids.Res.，19：4485-4490(1991)中，该文献引入本文作为参考。

可以利用电穿孔，磷酸钙，或脂质体介导的技术(详细内容参 见Current Protocols in Molecular Biology)，将合适载体(例如 pED)中的突变型前尿激酶和DHFR基因转染到CHO细胞中。对于CHO DXB11细胞，优选的是用磷酸钙处理之后接着用甘油休克。然后将 转染的细胞置于选择性培养基中，并在生长几天之后，挑取含大约 500个细胞的大的健康集落进行扩增。扩增之前将选择出的集落在 分开的平板上生长。

在扩增稳定的转染子之前，应该用Southern分析法分析细胞 DNA，或用突变型前尿激酶的功能检测方法分析RNA，以确保细胞中 已整合入所需的突变型前尿激酶基因。然后将选出的细胞置于氨甲 喋呤溶液中，这一步提高了选择水平，因为氨甲喋呤是DHFR的一种 强抑制剂。通过将细胞平分到该培养基中，选出能制造高水平DHFR 的细胞。一般来说这一步是通过提高转染的DHFR基因的拷贝数来完 成的。与此同时，与DHFR基因共转染的突变型前尿激酶基因的拷贝 数也提高。用越来越高水平的氨甲喋呤选择出有最高拷贝数的DHFR 基因的细胞，并因此有最高拷贝数的所需突变型前尿激酶基因的细 胞。当细胞在20-80μM氨甲喋呤中生长时，细胞应含有500-2000 拷贝的转染的突变型前尿激酶基因。 前尿激酶突变体的提取和纯化

在突变型前尿激酶由诸如哺乳动物或细菌细胞系表达之后，必 须从培养基中提取并纯化。对于酵母细胞培养物的情况，首先必须 用例如加玻璃珠的机械破碎法打碎酵母细胞，以便产生含有突变型 前尿激酶的细胞提取物。从细胞培养基或细胞提取物中纯化活性突 变型前尿激酶的操作一般包括步骤1)液/液相萃取或起始过滤步骤， 2)疏水亲和层析，3)抗体亲和层析，以及4)凝胶过滤层析。这些步 骤是分子生物学领域内普通技术人员熟知的，详见Current Proto- cols in Molecular Biology，Chapter 10。

用超声处理法裂解含有前尿激酶突变体1的大肠杆菌细胞，由 于在带有一个肠激酶切割位点(DDDDK)的前尿激酶的N-末端的前头 插入了聚-His，因而可将裂解液加到Nickel亲和层析柱上。将纯 化的前尿激酶突变体与固定化的肠激酶一起保温，在Nickel亲和柱 上进行重复层析而移去N-末端聚-His。按照Winkler&Blaber， Biochemistry，25：4041-4045(1986)，以及Orsini等人，Eur.J. Biochem.，195：691-697(1991)描述，将样品进一步通过S-Seph- arose，羟磷灰石，Sephacryl S-200以及在折叠之后苯甲酸脒层 析而进一步纯化。用二异丙基氟磷酸(DFP)处理除去少量杂质UK。

前尿激酶突变型分析

如在突变型1中所做的，将前尿激酶突变体的特性与大肠杆菌 产生的rec-pro-UK(重组前尿激酶)进行比较。检测内在活性，在 早期时E2片段激发的Glu-血纤维蛋白溶酶原激活作用以及在血浆 环境中对血纤维蛋白溶酶激活以及凝块裂解的敏感性，以便测定出 可用少量前尿激酶突变体获得的分析概况，这种概况可预测该突变 体在体内作为血栓溶解剂时怎样起作用。 内在活性检测

这些检测法是基于S2444，尿激酶的一种合成底物，的水解和 Glu-血纤维蛋白溶酶原的活化反应的动力学分析。

S2444水解：在室温以及0.05M磷酸钠，0.15M NaCl，0.2％ BSA以及0.01％吐温80(PH7.8)中，将4.0nM的尿激酶或1.0μM的 前尿激酶突变体1与一定浓度范围(0.03，0.06，0.12，0.18，0.24， 0.3，0.6，1.2，1.8和2.4mM)和S2444一起保温。在一个微滴板读 数器中以490nm作参照波长在410nm(410/490nm)时测出线性OD 值随着时间的增长而测出反应速率。突变体1显示几乎没有S2444水 解活性。

Glu-血纤维蛋白溶酶原激活：在一个微滴板读数器(Dynatech MR5000)中，在选定的波长410nm以及参照波长490nm(410/490 nm)处测出反应混合物的OD随时间的增长值而获得Glu-血纤维蛋白 溶酶原激活的时间-光吸收值曲线。该反应混合物含有S2251(1.5 mM)，Glu-血纤维蛋白溶酶原(1.0，1.5，2.5，3.5，4.5，5.5， 7.5和10.0μM)以及尿激酶(0.2nM)或前尿激酶突变体1(5.0nM)。 反应物被配制于0.05M磷酸钠，0.15M NaCl，0.2％BSA，0.01％ 吐温-80，pH7.8溶液中，并在室温下保温。突变体1显示约4IU/ mg的血纤维蛋白溶酶原激活活性，该活性仅为天然前尿激酶活性 1％，天然前尿激酶的活性为约400IU/mg。 由纤维蛋白E2片段激活血纤维蛋白溶酶原的分析

用微滴板读数器，以490nm作参照波长，在410nm(410/490 nm)测出反应混合物的OD值随时间增长值，即可决定在E-2片段存 在下前尿激酶突变体1对Glu-血纤维蛋白溶酶原的激活。该反应混 合物含有1.5mM S2251(一种血纤维蛋白溶酶的合成底物)，Glu- 血纤维蛋白溶酶原(1.0，2.0，4.0&8.0μM)，5.0μM的E-2片段， 以及1.0nM的前尿激酶突变体1，0.05M磷酸钠，0.15M NaCl， 0.2％BSA，0.01％吐温80，室温下pH7.8。在纤维蛋白E-2片段存 在下由突变体1对血纤维蛋白溶酶原的激活仅为天然前尿激酶的 40％。天然前尿激酶血纤维蛋白溶酶原激活在纤维蛋白E2片段存在 时比没有纤维蛋白激发时高出250倍。 血纤维蛋白溶酶敏感性检测

血纤维蛋白溶酶敏感性检测是由Lys-血纤维蛋白溶酶激活前 尿激酶突变体的动力学研究。在1.2mM S2444存在下，在0.05M Tris·HCl，0.15M NaCl，0.01M CaCl2和0.01％吐温80，pH7.4 于室温下将一定范围内浓度(0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0， 1.2，1.4，2.5，3.5&5.0μM)的前尿激酶突变体1与Lys-血纤维 蛋白溶酶(0.1nM)保温足够长时间。将同样范围浓度的前尿激酶突 变体在没有血纤维蛋白溶酶时与S2444一起保温作为对照。在对照 条件下0.1nM血纤维蛋白溶酶对S2444的水解没有直接的影响。用 一个微滴板读数器(MR5000；Dynatech Laboratories，Inc.，Al- exandria，VA)以490nm作为参照波长，在410nm时检测OD值随时 间的增长(410/490nm)而测出从前尿激酶突变体1产生的尿激酶的 量。发现，突变体1具有类似于天然前尿激酶的血纤维蛋白溶酶敏 感性，它具有2.44μM的KH以及3.04nanoM/分钟的Kcato 血浆血纤维蛋白原溶解活性检测

在37℃时将前尿激酶突变体1(0-100μg/ml)或前尿激酶(0- 10μg/ml)在1.0ml的贮存血浆中保温6、16或24小时，其后加入 0.2ml的抑蛋白酶肽(10,000KIU/ml)，采用凝血酶-凝块方法测 出在给定时间之后留下的血浆血纤维蛋白原。突变体1具有比天然 前尿激酶低约100倍的血浆血纤维蛋白原溶解活性，即1.0μg/ml的 天然前尿激酶在6小时之内将裂解50％的9.0μg/ml的血纤维蛋白原， 而突变体1需达到100μg/ml才能获得同样效果。 血纤维蛋白凝块溶解分析        

按照Gurewich等人，Clin.Invest.，73：1731(1980)的描述， 从0.25ml血浆中制备125I-标记的凝块。在3ml血浆中用一定范围浓 度的前尿激酶突变体1(10，20，30，40，70和80μg/ml)或t-PA (5，10，30，50，75，100和150ng/ml)以及t-PA和前尿激酶突变 体的组合物进行凝块溶解试验。根据释放的放射性活性对溶解反应 进行定量，并以相对于时间的占完全溶解时值的百分数表示。突变 体1纤维蛋白凝块溶解活性是天然前尿激酶的50％，即200U/ml天 然前尿激酶在6小时内将溶解一个凝块(1cm3)，而同样量的突变体 1在12小时内才能获得同样效果。 前尿激酶突变体的治疗用途

以相同于前尿激酶和尿激酶的方式，将前尿激酶突变体作为血 栓溶解剂给药。将突变型前尿激酶与药物学上可接受的载体(例如 盐水)进行混合，并通过血管内(例如，静脉内或动脉内)或皮下注 射而给药。注射的前尿激酶突变体为约20-60mg的一九团，或以 40-80mg/小时的速率进行静脉注射。由于前尿激酶突变体比天然 前尿激酶具有大得多的血浆稳定性，以及低得多的诱导非特异性血 纤维蛋白溶酶原激活的可能性，可以使用更高的剂量，例如高至 200mg/小时进行输注。

                       其他实施方式

其他实施方式包含于下列权利要求书内

                         序列表

(1)一般资料：

  (i)申请人：Liu，Jian-Ning

             Gurewich，Victor

  (ii)发明名称：前尿激酶突变体

  (iii)序列数：1

  (iv)通信地址：

    (A)收件人：Fish & Richardson

    (B)街道：225 Frankin Street

    (C)城市：Boston

    (D)州：Massachusetts

    (E)国家：U.S.A.

    (F)邮编：02110-2804

(v)计算机可读形式：

   (A)介质类型：3.5＂Diskette，1.44Mb

   (B)计算机：IBM PS/2 Model 50Z或55SX

   (C)操作系统：MS-DOS(Version 5.0)

   (D)软件：Word Perfect(Version 5.1)

(vi)现在的申请资料：

   (A)申请号：

   (B)申请日：

   (C)分类：

(vii)以前的申请资料：

   (A)申请号：08/087,163

   (B)申请日：1993年7月2日

(viii)代理人/代理机构资料：

   (A)名称：Fasse，J.Peter

   (B)登记号：32,983

   (C)参考/档案号：04353/003WO1

(ix)电信号码：

   (A)电话：(617)542-5070

   (B)传真：(617)542-8907

   (C)电传：200154 (2)SEQ ID NO：1的资料

(i)序列特征：

   (A)长度：411

   (B)类型：氨基酸

   (C)链型：

   (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQID NO：1： Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Asn Cys Asp Cys Leu Asn Gly

              5                  10                  15 Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile His Trp Cys Asn

         20                  25                  30 Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gln His Cys Glu Ile Asp Lys Ser Lys

     35                  40                  45 Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly Lys Ala Ser Thr

 50                  55                  60 Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser Ala Thr Val Leu  65                  70                  75                  80 Gln Gln Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu Gln Leu Gly Leu

             85                  90                  95 Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg Arg Arg Pro Trp

        100                 105                 110 Cys Tyr Val Gln Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gln Glu Cys Met Val

    115                 120                 125 His Asp Cys Ala Asp Gly Lys Lys Pro Ser Ser Pro Pro Glu Glu Leu

130                 135                 140 Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg Phe Lys Ile Ile 145                 150                 155                 160 Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala Ala Ile

            165                 170                 175 Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys Gly Gly Ser

        180                 185                 190 Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys Phe Ile Asp

    195                 200                 205 Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg Ser Arg Leu

210                 215                 220 Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu Asn Leu Ile 225                 230                 235                 240 Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His Asn Asp Ile

            245                 250                 255 Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gln Pro Ser

        260                 265                 270 Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro Gln

    275                 280                 285 Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Asn Ser Thr

290                 295                 300 Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val Lys Leu Ile 305                 310                 315                 320 Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu Val Thr

            325                 330                 335 Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys Thr Asp Ser Cys

        340                 345                 350 Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gln Gly Arg Met

    355                 360                 365 Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Leu Lys Asp

370                 375                 380 Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro Trp Ile Arg 385                 390                 395                 400 Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu

            405                 410