一种靶向性抗肿瘤融合蛋白质ALA的制备和应用 |
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| 申请号 | CN201710037174.9 | 申请日 | 2017-01-18 | 公开(公告)号 | CN107200784A | 公开(公告)日 | 2017-09-26 |
| 申请人 | 中国药科大学; | 发明人 | 刘秀峰; 刘吉华; 吴娟娟; 沈辰; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种靶向性融合蛋白ALA的制备方法及其应用，所述融合蛋白的制备包括：化学合成包含尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)的ATF区、以及可以被特异性酶切的连接肽段和东亚钳蝎抗 肿瘤 肽AGAP的基因序列，将这一序列通过限制性内切酶位点插入到表达载体上获得重组子。将该重组子转化到毕赤 酵母 中，筛选获得表达菌。将该菌接种培养，经甲醇诱导表达，收集 发酵 液，Ni2+离子亲和层析分离后获得目的融合蛋白ALA。该融合蛋白可以特异性结合到uPAR高表达的肿瘤细胞表面并在肿瘤组织中被uPA酶解，条件性释放出AGAP多肽从而发挥抗肿瘤作用，对正常的uPAR低表达细胞无毒，可在制备靶向抗肿瘤药物中应用。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种靶向性抗肿瘤融合蛋白ALA，其特征在于，所述融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构：uPAR特异性靶向蛋白-连接肽-抗肿瘤肽；其中所述uPAR特异性靶向蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，其中所述抗肿瘤肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。 |
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| 说明书全文 | 一种靶向性抗肿瘤融合蛋白质ALA的制备和应用技术领域背景技术[0002] 尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)在恶性肿瘤细胞表面高表达，成为评价肿瘤恶性 化程度及预后的标准之一，也成为一个重要的抗癌药物靶点。肿瘤侵袭转移是一个多步骤、 多环节的复杂过程，主要包括以下几个步骤：肿瘤细胞周围细胞外基质及基底膜的降解、肿 瘤细胞的粘附与迁移、肿瘤细胞的增殖和血管生成。细胞外基质及基底膜的降解主要由纤溶 酶原激活剂系统及金属蛋白酶系统两个基质降解酶系统完成。借助于uPAR，肿瘤细胞将其分 泌的或细胞外的uPA浓集于细胞表面；uPA与uPAR特异性结合后，多条通路被激活，从而 发挥其在肿瘤演进中的多种功能。这些功能主要包括两方面：一是细胞内的多种信号通路被 活化，包括癌基因表达的上调、刺激细胞粘附、调节化学趋化及MAPK通路的激活；二是细 胞外的蛋白水解作用。pro-uPA被激活为uPA，与uPAR结合的uPA大大增强了激活纤溶酶原 为纤溶酶的活性。纤溶酶能够降解细胞外基质中的多种糖蛋白(如：纤连蛋白、层连蛋白等) 以及蛋白多糖分子中的蛋白核心。此外，纤溶酶还能激活基质金属蛋白酶系统中的前胶原酶、 弹性蛋白酶和前基质水解酶等，促进胶原、弹性蛋白以及其它基质蛋白成分的降解。细胞外 基质及基底膜的降解，使得肿瘤细胞能够穿过基底膜进入血管，而产生肿瘤转移。 [0003] ATF是uPA的氨基末端片段，包括1-47位氨基酸的生长因子结构域和48-134位氨基酸 的Kringle结构域。ATF包含了所有与uPAR结合的结构域，但不包括激活尿激酶型纤溶酶原 激活物系统的催化结构域，它能够与uPAR高特异性的结合解离常数约为0.2nM。因此，ATF 不仅能够靶向在肿瘤细胞表面高表达的uPAR，而且能够与uPA竞争性的结合uPAR，抑制肿 瘤环境中尿激酶型纤溶酶原激活物系统的过度活化。 [0004] 东亚钳蝎镇痛抗肿瘤肽(analgesic-antitumor peptide，AGAP)是由刘岩峰等人于2003年从 东亚钳蝎蝎毒中提取的一种多肽，为单一肽链的单纯碱性多肽，等电点大于10。含有碱性氨 基酸，还富含疏水性氨基酸。实验证明AGAP具有良好的抗肿瘤作用，然而AGAP在蝎毒中 的含量较低以及繁琐的分离纯化工艺很难满足药物开发的需要，近年来利用基因工程技术制 备蛋白质的研究有望能够突破这一瓶颈。 发明内容[0005] 本发明的目的在于提高抗肿瘤药物的靶向性，降低药物毒副作用，提供一种靶向性抗肿 瘤融合蛋白及其制备方法，以及该融合蛋白在抗肿瘤药物中的应用。 [0006] 本发明提供的一种靶向性抗肿瘤融合蛋白ALA，其氨基酸序列为SEQ ID NO：4。编码上 述融合蛋白的基因，其核苷酸序列为：SEQ ID NO：5。一种质粒，含有上述融合蛋白的核苷 酸序列。它是将编码ALA的核苷酸片段克隆至真核表达载体后获得的重组子。一种毕赤酵母 菌工程菌，含有上述的重组载体。是将重组子转化至毕赤酵母菌中，构建的表达ALA融合蛋 白的工程菌。 [0007] 一种靶向性抗肿瘤融合蛋白ALA，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。 [0008] 编码所述的靶向性抗肿瘤融合蛋白ALA的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。 [0009] 所述的靶向性抗肿瘤融合蛋白ALA，N端由尿激酶型纤溶酶原激活剂的1-135位氨基酸 组成，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。 [0010] 所述的靶向性抗肿瘤融合蛋白ALA，连接肽氨基酸序列为SEQ ID NO：3。 [0011] 含有所述的如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的表达质粒。 [0012] 含有所述质粒的表达融合蛋白质ALA的工程菌。 [0013] 一种制备所述的融合蛋白质ALA的方法，包括如下步骤： [0014] (1)将SEQ ID NO：5所示的基因连接到毕赤酵母过表达载体上，获得重组子； [0015] (2)将重组子电转化到毕赤酵母菌中，构建毕赤酵母工程菌； [0016] (3)将工程菌接种在含博莱霉素的YPD培养基中，在28℃、250r条件下，摇床培养16-18 小时，接种1％至表达培养基中28℃、250r摇瓶培养16-18小时，至OD600为2-6，加入甲 醇使终浓度为1％，诱导表达24小时，5000g，离心5min，收集上清； [0017] (4)将收集到的上清置于平衡缓冲液中进行透析过夜； [0018] (5)将平衡好的上清液过Ni柱，利用含有咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集250mM 咪唑浓度下的蛋白洗脱液； [0019] (6)将收集到的蛋白洗脱液用磷酸盐缓冲液透析去除其它杂质，得到有活性的ALA融合 蛋白。 [0020] 所述的靶向性融合蛋白ALA在制备抗肿瘤药物中的应用。 [0021] 所述的肿瘤为有uPAR受体表达的肿瘤。 [0023] 在本发明的靶向性抗肿瘤融合蛋白质ALA中，尿激酶的EGF样区和Kringle区合称为 ATF，ATF区可以靶向性结合到肿瘤细胞中高表达的尿激酶受体上。融合蛋白质ALA的连接 肽中含有酶切位点，可以被肿瘤组织中的酶切割，从而发挥抗肿瘤肽的抑瘤作用，而对尿激 酶受体不表达或低表达的正常细胞无毒，具有成为理想的靶向性抗肿瘤融合蛋白的潜力。 [0024] 有益效果：与现有技术相比，本发明所提供的靶向性抗肿瘤融合蛋白质ALA可在抗肿瘤 药物中应用。实验证实该融合蛋白质对包括大肠癌SG-7901细胞、肺癌A549细胞、乳腺癌 MDA-MB231细胞等肿瘤细胞系均有明显的抑制作用，而对无uPAR受体的HEK293和L029 细胞则无明显抑制作用。附图说明 [0025] 图1显示用于表达融合蛋白的重组质粒构建示意图。 [0026] 图2显示融合蛋白亲和层析纯化分步洗脱图。其中1：Marker；2：发酵液上清；3：穿 过部分；4：0mM咪唑洗脱；5，6：20mM咪唑洗脱；7，8：50mM咪唑洗脱；9，10：100mM 咪唑洗脱；11，12：200mM咪唑洗脱；13，14：250mM咪唑洗脱；15，16：500mM咪唑洗脱。 [0027] 图3是纯化后融合蛋白的检测结果图：图3A为融合蛋白纯化后的SDS-PAGE图，3B为 Western Blot结果图。 [0028] 图4是融合蛋白抑制细胞增殖实验结果图：4A为融合蛋白对4种肿瘤细胞的生长抑制结 果图；4B为融合蛋白对两种正常细胞株生长的影响图。 [0029] 图5是融合蛋白体内制肿瘤生长曲线图：A为融合蛋白对肺癌A549细胞裸 鼠移植瘤的生长抑制作用图；B为融合蛋白对乳腺癌MDA-MB231细胞裸鼠移 图；C为融合蛋白对胃癌SGC-7901细胞裸鼠移植瘤的生长 抑制作用图。 具体实施方式[0030] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说 明本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。 [0031] 实施例1：靶向性融合蛋白质ALA重组表达载体和工程菌的构建 [0032] A.重组表达载体构建：按照前文SEQ ID NO：5所述核酸序列，合成基因序列，上下游 分别引入EcoR 1和Xba1的酶切位点，合成序列直接克隆入南京金斯瑞公司提供的PUC-57 空载体中，并热击转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR鉴定筛选阳性克隆株，阳性克隆株扩大 培养，提取质粒DNA，利用NcoI、EcoRI双酶切本质粒和pPICAa-A空质粒，回收目的片段 和pPICAa-A载体粘性末端片段，在T4DNA连接酶(Takara)的存在下将目的片段插入到同 样酶切的质粒空载体中，得到重组表达载体，命名为pPICAaA-ALA，并转化至大肠杆菌DH5 α，进菌落PCR挑选出阳性克隆进行测序。结果表明，测序结果与预期完全一致。质粒构建 示意图见图1。 [0033] B.融合蛋白表达工程菌的构建：本发明使用的宿主菌为毕赤酵母菌株X-33是Invitrogen 公司的产品。将上述构建好的重组表达载体pPICAaA-ALA，大量提取后，用Sac1单酶切线 性化备用。制备毕赤酵母感受态细胞，将备好的线性化重组表达载体通过电击转化转入到毕 赤酵母感受态细胞中。28℃孵育半小时后，将电击后的混合物涂在含博莱霉素的YPD平板中， 28℃培养3天，筛选阳性克隆。-80℃下保存备用。 [0034] 实施例2：ATF-AGAP融合蛋白的诱导表达及产物纯化 [0035] (1)将工程菌接种在含博莱霉素的YPD培养基中，在28℃、250r条件下，活化培养16-18 小时； [0036] (2)以1％接种量接种至BMGY培养基中，28℃、250r摇瓶培养16-18小时，至OD600 为2-6； [0037] (3)离心收集菌体，用BMMY培养基重悬，加入终浓度为1％的甲醇，诱导表达24小时， 5000g，离心5min，收集上清； [0038] (4)融合蛋白C末端带有His-tag标签，因此采用GE公司的Ni-NTA镍柱纯化，按试剂 盒说明书进行Ni2+亲和色谱纯化。用含不同浓度咪唑(0mM、20mM、50mM、100mM、 200mM、250mM和500mM)的缓冲液洗脱目的蛋白。将不同咪唑浓度下洗脱的样品经12％的 SDS-PAGE电泳分离，Western Blot分析鉴定目的蛋白与Ni柱的结合情况，以及不同洗脱部 位(图2)。合并目的蛋白洗脱部位，SDS-PAGE检测其纯度达到了90％以上，分子量大小与 理论分子量相符(图3)，重组蛋白得率为4mg/L发酵液。 [0039] 实施例3：融合蛋白体外对肿瘤细胞增殖的抑制作用 [0040] 通过MTT细胞毒性测定法在4种肿瘤细胞系中进行融合蛋白的体外抗肿瘤活性的测定。 人肺癌细胞A549(ATCC#CCL-185)、乳腺癌细胞MDA-MB-231(ATCC#HTB-26)、乳腺癌细 胞MCF-7(ATCC#HTB-22)和胃癌细胞SGC-7901，分别将培养后的细胞用胰蛋白酶消化，调 整细胞密度为105个/mL。96孔板中，每孔加入100μL稀释后的细胞悬浮液。将铺好细胞的 平板放置于在37℃，5％CO2的培养箱中培养过夜，样品组分别加入融合蛋白至终浓度为10 μM，空白对照组中只加入相应体积的培养基。将细胞与测试蛋白孵育作用48小时，更换新 鲜培养基，每孔分别加入20ml MTT溶液(5mg/ml)，并在37℃在5％CO2中继续培养3 小时。弃掉含有MTT溶液的培养基，每孔加入100μl DMSO使甲瓒晶体充分溶解。混匀后， 测定570nm处的吸收值(reference波长690nm)。图4A结果显示：融合蛋白能有效的抑制胃 癌、肺癌、乳腺癌细胞的增殖。在48小时，10uM浓度下，对SG-7901抑制率达到33％， 对肺癌A549抑制率达到48％，对乳腺癌MCF-7抑制率达到54％，对乳腺癌MDA-MB-231抑 制率达到67％。 [0041] 实施例4：融合蛋白对2种正常细胞增殖的影响 [0042] 调整HEK293和LO29细胞浓度，以每孔5000个细胞的密度接种于96孔细胞培养板，37℃下培养过夜后加入终浓度为10uM的融合蛋白，设置3个平行复孔，对照组加入相应体 积的PBS溶液。孵育48小时后，更换新鲜培养基，每孔分别加入20ml MTT溶液(5mg/ml)， 并在37℃在5％CO2中继续培养3小时。弃掉含有MTT溶液的培养基，每孔加入100μl DMSO使甲瓒晶体充分溶解。混匀后，测定570nm处的吸收值(reference波长690nm)。图 4B结果显示： ALA对于HEK293和LO29细胞的生长抑制率在10％以下。表明ALA对于正 常的(uPAR-/-)细胞不存在明显毒性效应。 [0043] 实施例5：融合蛋白：对人肺癌A549细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用 [0044] 选取4-6周龄的雌性BALB/c裸鼠20只，每只接种1×105个非小细胞肺癌A549细胞 于裸鼠背部皮下。待瘤块长至50-100mm3大小，将成瘤的小鼠随机分为2组，每组8只。 [0045] 通过腹腔注射给药，每两天给药一次，连续给药14天，对照组给予相应的 PBS。给药后每2天测量一次肿瘤大小，根据公式V＝0.5*a*b2计算肿瘤体积(a 为肿瘤长径，b为肿瘤短径)，绘制肿瘤生长曲线。结果见图5A，给药30天后 给药组肿瘤体积约为对照组的50％，显著小于对照组，**与对照组相比P<0.01。 [0046] 实施例7：融合蛋白：对人乳腺癌MDA-MB231细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用[0047] 选取4-6周龄的雌性BALB/c裸鼠20只，每只接种5×106个细胞于裸鼠 背部皮下。待瘤块长至50-100mm3大小，将成瘤的小鼠随机分为2组，每组8 只。通过腹腔注射给药，每两天给药一次，连续给药14天，对照组给予相应的 PBS。给药后每2天测量一次肿瘤大小，根据公式V＝0.5*a*b2计算肿瘤体积(a 为肿瘤长径，b为肿瘤短径)，绘制肿瘤生长曲线。结果见图5C，给药30天后 给药组肿瘤体积显著小于对照组，抑制率为34％，*与对照组相比P< 0.05。 [0048] 实施例6：融合蛋白：对人胃癌SGC-7901细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用[0049] 取对数生长期的人胃癌SGC-790细胞，胰酶消化后离心收集细胞，用生理 盐水调整细胞密度至1×106/mL，选取4-6周龄的雌性BALB/c裸鼠20只，每 只接种1×105个细胞于3 裸鼠背部皮下。待瘤块长至50-100mm 大小，将成瘤的 小鼠随机分为2组，每组8只。通过腹腔注射给药，每两天给药一次，连续给药 14天，对照组给予相应的PBS。给药后每2天测量一次肿瘤大小，根据公式 V＝0.5*a*b2计算肿瘤体积(a为肿瘤长径，b为肿瘤短径)，绘制肿瘤生长曲线。 结果见图5B，给药30天后给药组肿瘤体积显著小于对照组，抑制率为64％，** 与对照组相比P<0.01。 |
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