修饰的血纤维蛋白溶酶原激活剂

本发明涉及生产由类生长因子区域（GFD）改变的，单链尿激酶（scuPA）所衍生的糖基化的血纤维蛋白溶酶原激活剂（以下亦称为GASGAs）的方法。更为具体地说，本发明涉及生产GASGAs的方法，包括将uPA基因从人类基因库中取出，插入到一个表达载体，修饰质粒并改变uPA基因的GFD，将由此获得的质粒载体引入动物细胞以产生转化体，并且从该转化的动物细胞中重获经GFD改变、scuPA衍生的糖基化的血纤维蛋白溶酶原激活剂。

本发明的另一个目的是生产具有经类生长因子区域（GFD）改变的人尿血纤维蛋白溶酶原激活剂衍生物。更为具体地说，本发明所产生的为具有人类scu-PA序列，（参照例如EP-A-92182中所公开的uPA序列）中的第9至50氨基酸之间的区域的，特别是具有第9至45氨基酸的，尤其为第19至32氨基酸之间的区域的，经改变的单链或双链的人类尿血纤维蛋白溶酶原激活剂衍生物。

尿激酶（uPA）为一种血纤维蛋白溶酶原激活剂，可从人尿中获得，用于治疗多种血栓形成或栓塞疾病。尿激酶的生产主要是基于从人尿中提纯酶的方法。随着细胞培养技术的发展，及专一性的抗尿激酶抗体（单克隆以及多克隆抗体）的获得而成为现实，从而明确了uPA为细胞产生的pro-uPA的激活产物（参见Wun等著，J.Biol.Chem.257，7262-7268（1982）;Nielsen等著，Biochemi-stry    21，6410-6415（1982））。Pro-uPA为单链蛋白质，而uPA为双链蛋白质。将pro-uPA转变成为uPA需要将pro- uPA的一根单肽链劈开（参见Verde等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81;4727-4731（1984）;Günzler等著，Hoppe    S.Zschrp.physiol.Chem.363，1155-1165，1982）。单链pro-uPA的专一性断开使其专一性活性提高50倍，该断开需要蛋白水解酶，诸如胰蛋白酶或血纤维蛋白酶的作用。尤其是血纤维蛋白溶酶即使在体内也显示出与此转化具有相关性。

非活性形式的血纤维蛋白溶酶原激活剂已由C.Nolan等于1977年证实存在于胚胎肾细胞培养物中（参见Biochim    Biophys    Acta    1977;496∶384-400）。该种物质已被该文作者认为是尿激酶的前激活剂形式，可被胰蛋白酶激活而不改变其分子量，而且一旦被激活后，又可被抗人尿激酶的兔抗体所抑制。利用苯甲脒葡聚糖亲和层析可将该非活性的“前激活剂”与活性的形式分离开。StoppelliM.P.等人对跨越自氨基酸残基1位至135位的uPA氨基末端片段（ATF）的分离及定性记述进行了描述（参见：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1985，82，4939-4943）。如欧洲专利40238所述，单链的血纤维蛋白溶酶原激活剂的分子量大约为56，000，在血纤维蛋白平板上显示的专一活性为40，000-50，000    CTA单位/毫克，并对血纤维蛋白具有高亲和性。公开号为92182的欧洲专利申请涉及用DNA重组技术制备尿激酶衍生物的方法。该欧洲专利揭示，特别地对由原核生物宿主（大肠杆菌）中的DNA重组技术而获得的低分子量的尿激酶（30，000道尔顿左右）的提纯及定性进行了记述。

公开号为154272的欧洲专利申请揭示了一种从动物细胞中生产糖基化的单链尿激酶的方法，该方法采用从已建立的人类肾细胞衍生系的mRNA获得的cDNA，通过cDNA重组技术以实现。Riccio等人（参见：Nucl.Acid    Res.，1985，13，2759-2771）对人类uPA基因的克隆进行了描述。该编码区域可细分为由十个内含 了分隔成的十一个外显子。他们曾报导，在该蛋白质中的功能区域可经重新处理得到不同的外显子，或外显子群。更为重要的是，他们发现绝大多数由外显子IV合成的10位至50位的氨基酸序列与表皮生长因子（EGF）及α型转化因子之间存在某种程度的同源性。

该类生长因子区域似乎包含在蛋白质（uPA/scu-PA）的识别中，并与细胞膜专一性受体相连结（参见：Stoppelli等著，Proc.Natl.Acad.Sci，USA（1985）82，4939-4943及Appella等著，J.Biol.Chem.，1987，262，4437-4440）。

类似于本发明（GASGAs）衍生物的GFD改变的尿激酶为scu-PA/uPA衍生物，其中的蛋白质GFD已通过阎姆椒ǘ谋浯佣竦帽萿PA具有延长持续作用的新的衍生物。该延长作用既可通过体外测试也可通过体内实验而被证实（尤其是可推测在人体内活性的常用动物体中进行实验）。考虑到uPA在体内的短暂的半衰期，对具有本发明的化合物性质的需要，对于本技术领域的人员是显而易见的。

本发明的另一类化合物，特征在于在这类化合物中，特别是在“天然”GFD的靠近上游处或上游处插入了一个或多个GFD序列的拷贝。

目前所知的，在某个专一的序列中对蛋白质进行修饰的方法，包括“直接”蛋白质修饰法，例如通过化学手段，及“间接”蛋白质修饰法，例如通过基因工程对蛋白质的编码区域进行处理。化学修饰法包括对“天然”scu-PA或u-PA使用衍化剂对9位至50位氨基酸，特别是9位至45位的氨基酸，尤其是10位至32位氨基酸之间的区域中的一个或多个氨基酸功能进行衍生化。这些衍生剂本身则为已知的，例如，对于碱性氨基酸，如赖氨酸或精氨酸，可采用与氨基形成酰胺键或其它有机键的试剂，诸如乙酸酐，1，2-环己二酮及苯甲酰甲醛 （phenylglioxal），而对于酸性氨基酸，诸如天冬氨酸，酯化反应可作为最惯常使用的衍生化方法。在必要的情况下，应同时用已知的保护剂对蛋白质上的不稳定功能团进行保护，和选择性反应一起结合进行。

然而，一个十分优越的修饰法则为对蛋白编码区域的基团工程的方法，特别是编码蛋白质GF区域的DNA及/或mRNA编码区域，即编码9至50位氨基酸、特别是9至45位氨基酸，尤其是19至32位氨基酸之间氨基酸序列的编码区域，进行的基团工程方法，以对最终蛋白质进行修饰，使之不与其专一受体诸如，单核细胞u937上的细胞受体相连（参见：Stoppelli    M.P.等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，4939-4943，1985）。

优化的修饰方法是使uPA编码基因组DNA的1027碱基对与1784碱基对之间的部分进行的基因工程修饰（假定mRNA转录起始位点为碱基对1）。

对“天然”蛋白质的联结区域的编码区域基团工程修饰法可在基因组DNA或cDNA中进行。这些方法包括使核酸序列发生定位缺失、突变及插入至核酸顺序。这些修饰法的主要结果为导致scu-PA或uPA的受体连结能力的减弱，同时保持其酶作用能力不变。有时，甚而常常修饰作用的结果是在经修饰的蛋白的顺序中出现一个新的氨基酸。比如，当缺失发生在内含子C（即，uPA基因的外显子Ⅲ及Ⅳ之间的内含子）中PstⅠ位点和内含子D（即，外显子Ⅳ及Ⅴ之间的内含子）中的BglⅡ位点之间时，得到的GASGA中缺失了自Ser9至Asp45的氨基酸序列，同时，在该位置导入了一个新的氨基酸，即酪氨酸，在氨基酸缺少之后，经三联体编码而引起了一个结接过程。

本发明的一个优化的实施例，该修饰方法的特征为一个包括使 相应于uPA基因组或cDNA或杂交的uPA基因组DNA-cDNA中的外显子Ⅳ所相应的区域发生缺失的方法。当在基因组序列上完成该步骤时，有可能，有时甚至很容易将内含子区域上相对地靠近外显子Ⅳ的DNA序列切掉。可用若干种已知的方法使之实现。其中的一个优选的方法的特征为，在含有位于启动子下游整个的uPAORF的载体中，将单一的限制性位点导入围绕外显子Ⅳ两旁的内含子中，从而获得两个载体衍生物，它们的区别仅在于新的位点出现于内含子C或内含子D中。在这两个新位点，同样也在该区域中的第三个位点（这对于两个质粒是常见的）进行限制性消化，并重新连结得到的质粒片段，在各其它质粒中产生一种新的质粒，其中内含子C中新位点的上游区域已经与内含子D中的新位点下游的区域相熔合，也就是说，获得了相应于uPA    GFD的全部区域实际上已经失去的序列。另外，更为优化的方法包括，用已知的技术，将uPA编码区域的内含子C中的PstⅠ位点转化成SalⅠ位点，并将内含子D中的BglⅡ位点转化成为XhoⅠ，用合适的限制性酶使这两个位点之间的区域缺失，并将两片段互相连接而产生一个新的uPA编码序列，可编码成GASGA衍生物，其中丝氨酸9至天冬氨酸45之间的氨基酸序列之间被一个酪氨酸单元所取代。进一步叙述则为，产生的质粒失去丝氨酸至赖氨酸23之间的氨基酸序列，及Phe25至Asp45之间的序列，而原先由密码子TAC编码的Tyr24则由因ORF上的外显子Ⅲ与外显子Ⅴ的熔合而产生的TAT密码子编码的Tyr酪氨酸残基所取代。上述的步骤最好在含有uPA    ORF（开放的阅读框架）的载体上进行，以便直接获得GASGA的表达载体。或者，也可以通过使含有在外显子Ⅳ下游按上述方法导入的单一位点（例如：XhoⅠ位点）的编码uPA的质粒，谕庀宰英舻纳嫌魏拖掠畏⑸洗蟮腄NA部分在缺失，然后，将重新导入了一部分缺失序 列而不含有外显子Ⅳ的片段进行置换而与这些序列重联而获得缺失突变体。更为具体地叙述则为，将含uPAORF及如上述的单一限制位点的载体用专一于导入在外显子Ⅳ下游的单一位点（例如XhoⅠ）的酶进行处理，并用另一种专一于另一个位于外显子Ⅳ上游的独特位点（例如，已存在于内含子B，即位于外显子Ⅳ之前的内含子中的HindⅢ位点）的酶进行处理。所获得的失去了外显子Ⅲ和Ⅳ的质粒片段，通过合适的粘性末端或平头末端相连接成以一个片段，并以专属的定位只含有外显子Ⅲ（但不含外显子Ⅳ）以保持阅读框架的正确。所获得的载体为GASGA表达载体，编码本发明的GASGA衍生物的蛋白质。在该方法的一个优化的实施例中，从uPA基因中衍生的含有ORF的uPA表达载体，通过在位于内含子D（图3）的BglⅡ位点处插入XhoⅠ位点而将之置换，接着用XhoⅠ及HindⅢ进行消化的方法进行修饰。得到并分离了含有原有质粒的绝大部分但又缺少相应于外显子Ⅲ及Ⅳ的序列的DNA片段。

该片段与自内含子B跨跃至内含子C的HindⅢ-SalⅠ片段相连（因而含有外显子Ⅲ），而获得一个GASGA表达载体。

本发明的uPA编码序列在正确的定向码上缺乏相应于外显子Ⅳ的DNA序列，因而可以编码本发明的GASGA蛋白质。上述的该HindⅢ-SalⅠ片段是通过在将一个SalⅠ连接于含有外显子Ⅲ的由PstⅠ处理含基因源的uPA编码序列的载体而获得的一个PstⅠ碎片的末端上后，用HindⅢ消化而得到。所获得的表达载体所编码的GASGA，失去自Ser9至Lys23及自Phe25至Asp45的氨基酸，且其中由TAC密码子编码的Tyr24已经被来源于外显子Ⅲ与外显子Ⅴ的ORF的融合的TAT密码子编码的Tyr所代替。

如上所述，也可通过在“天然”uPA的GFD中进行插入，使uPA受体的连续能力显著下降或彻底丧失，从而获得本发明的 uPA衍生物。其中较为优化的方法，包括通过基因工程的方法对uPA编码基因或cDNA或uPA基因/cDNA杂交体进行修饰。事实上。众所周知基因诱变可利用多种物理及化学试剂而实现，例如采用电离射线，紫外线或DNA前体类似物。不过，较佳的方法是采用基因工程的方法，直接对编码序列进行修饰，例如在M13-衍生载体中进行定位诱变（参见：P.Carter著《用M13载体进行的改进的寡核苷酸定位诱变》，Nucl.Acid    Research    1985，13，4431）或用多聚酶链反应的方法（PCR）。编码序列既可在将被转染的同一个载体或在不同的载体上进行修饰，随后将一个适合的片段转移至转染载体中。这些操作的具体安排取决于所涉及的特定的酶作用底物以及本领域技术人员的惯常的实践。

在与uPA受体连结包含的uPA编码的有关的部分的DNA序列中存在有限制性位点（ScaⅠ）。在既不中止蛋白转译也不改变阅读框架的情况下，有可能使之打开并插入一段延伸的DNA。最好在该DNA延伸部分中包含一个新的限制性位点以加强对所获得的突变体的鉴别。

加入的碱基对数可为3对，或其几倍数。既可一步地将所需长度的DNA延伸部分直接插入，也可以采用多步骤方法例如首先插入一段较长的延伸部分，然后用限制性酶切减短至所需的长度。

得到的编码序列可以编码带有改变了的uPA受体的连结区域的蛋白质，例如这是因为诸如在与连结有关的那段氨基酸残基的间隔中引入拐弯、或其积水性（hydropaticity    profile）的改变或同时借助这两种作用，使“原始”uPA二级结构的β片、α螺旋发生变化。

概要地说，采取了以下的步骤：

-用ScaⅠ进行部分或全部消化，使含有人类uPA基因的表达载体开链;

-用已知序列的DNA联结子插入一个新的限制性位点：

-修饰该限制性位点以获得一个具有3对或几倍于3对的碱基对插入物;

-在携带对选择剂的抗性的质粒存在下，将该载体转染哺乳动物细胞;

-选择抗性克隆，并使这些细胞在培养基中产生GASGAs;

-收集培养基、并从中提纯蛋白质。

按照本发明的方法，可以通过在uPA编码序列中将在1027碱基对与1784碱基对之间的uPA    DNA区域的一个、二个或多个复制物（replica）插入，最好采用原来的1027至1784碱基对的GFD编码区域（实际上即为外显子Ⅳ），从而在“天然”scu-PA或uPA中插入多个GF区域。我们期望这些具有多GF区域的GASGAs衍生物比天然分子具有更强的uPA受体连结的选择能力。

编码具有改变的GF区域的GASGAs的载体（不再具有与uPA受体连结的能力）属于以下称之为“EO”的系列之中，而含有多个GFD的GASGAs表达载体属于按含有的GFD单位的数目而区别的在以下为“E2”、“E3”、“E4”等系列之中。在以下还要对GASGAs相应地进行定名。本发明包含了GASGAs衍生物及其丧失了或显著减弱了与uPA受体连结能力的等位基因形式。可以通过对“天然”scu-PA及/或PA，或最好对uPA编码区域进行修饰，并将此经修饰的序列在哺乳动物细胞中表达，从而获得所述的等位基因形式。此外，本发明的GF区域改变的血纤维蛋白溶酶原激活剂，具有其他的经修饰的区域，这些区域最好能用血纤维蛋白溶酶劈开。具有一个被修饰区域以使之更难以转换成uPA的scu-PA衍生血纤维蛋白溶酶原激活剂的例子，如欧洲专利申请200451号所述的Lys135、Lys136及Arg156、Lys158 经修饰的衍生物，或如欧洲专利申请第210279号所述的Lys137、Phe157经修饰的衍生物。

这些化合物借助在cDNA序列或相应DNA顺序上进行定位突变而得以修饰，被修饰的区域位于9至50位氨基酸之间，较理想为9至45位氨基酸之间，而最理想为19至32位氨基酸之间。将得到的编码序列插入一个表达载体中，并用之转化合适的动物细胞，以产生所需的GFD改变的血纤维蛋白溶酶原衍生物。

这些也具有通常用血纤维蛋白溶酶型酶进行酶切的区域的经修饰的，产生一定的抵抗蛋白酶切的抵抗力的GFD改变的、scu-PA衍化的血纤维蛋白溶酶原激活剂，与GFD未经改变的原始化合物具有增长的作用期，及/或在较低剂量给药时达到同等效果。

这种改变的方法和次序可能不是决定性的，它保持着使uPA接受体不被结合的面貌。特别是，在血纤维蛋白溶酶敏感区域发生突变后，可以引入GFD突变，反之亦然，GFD突变体亦可在血纤维蛋白溶酶敏感区域的突变之前引入GFD突变。本发明的一个实施例中采用的含uPA编码区域的人类基因组源的DNA片段，是在合适载体中自人类基因库获得，诸如按照已知的技术，先用该基因本身的一部分所代表的合适的DNA探针，或根据已知编码序列而制成的具有适当长度的合成DNA片段所代表的合适的DNA探针或cDNA或mRNA衍生化探针对基因库进行筛选，而后在噬菌体λ或装备型质粒（cosmid）中制备该基因库。

通常情况下，该uPA编码片段是由克降DNA经部分SmaⅠ消化而获得的7.3千对碱基的片段。这类DNA片段在以下的说明书及权利要求书中将被称作“开放的阅读框架”（ORF），即指包括uPAmRNA的转录-转译单元的，可以被内含子隔断的，最好包括5′及3′非转译区域或其与转译效率或mRNA稳定性相关的部分的 基因组DNA序列。ORF的较理想的例子为上述的被10个内含子隔断的序列。

本发明的方法所采用的表达载体可为用转染真核细胞特别是哺乳动物细胞的任何已知载体。然而，它们必须包含一个可以调节mRNA转译的序列，诸如，一个启动区及多腺苷酸化的位点。有时，还包括复制的真核细胞源。特别是，启动区域可以是已知的可用于动物细胞基因工程任何启动子区域。异源启动子可以取自哺乳动物细胞的病毒，诸如还原病毒（例如RSV）、SV40（早晚可行）及腺病毒（早晚可行）。另一方面，采用动物或人类来源可调节的启动区，通过物理、化学或生物学诱导物对之诱导使转录超过一般的水平。这些可调节的启动子取自于小鼠或人类。金属硫因（metallothioneins）Ⅰ及Ⅱ。

热震荡（heat    shock）蛋白质等等，可参阅诸如Hamer等著《真核病毒载体》Y.Gluzman出版，1983，7-12，Mayo等著《细胞》（cell）29，99-108（1982）及Korin等著《自然》（Nature），308，513-519（1984）。

除那些可调节启动子之外，还发现人类uPA启动子区域或其衍生物，在哺乳动物细胞中，可用作有效的启动子来表达处于其控制之下的基因。该人类的uPA启动区域，系借助SmaⅠ消化而取自于人类基因库（见上文），并且包括人类uPA基因上的大约自-2353碱基对至大约+29碱基对之间的大约2.38千对碱基。不仅该“天然”人类uPA启动子可用于在合适的哺乳动物细胞系统中进行基因表达，而且按照本发明，由缺失、插入、取代或混码（shuffling）而得到的保持或甚而至于具有更佳的调节功能的其它任何衍生物也可适用。尤其是uPA启动子区域的缺失衍生物，至少在某些例子中是被优先采用的。取得缺失衍生物的代表性的例子，系用OxaNⅠ或EcoRⅤ处理 uPA启动子之后，接着将所获片段连接起来。具体而言，如用OxaNⅠ消化所得的缺失衍生物失去了大约在-1827碱基对至大约-1202碱基对之间的0.6干对碱基片段（其中+1为uPAmRNA中转录的第一个碱基），而如用OxaNⅠ及EcoRⅤ进行消化，所得衍生物失去了自大约-1827碱基对至-537碱基对之间的1.29千碱基对片段。现已证实，即使与公认为很有效的启动子系统的，诸如RSV等常用病毒启动子，如采用uPA启动子缺失衍生物则具有引导调节基因的表达，以得到相近的甚或比一般病毒启动子有更高的产量。作为多腺苷酸作用位点，已知的任何一种均可适用，诸如对uPA基因为天然的与启动子区域相联结的，或取自于真核细胞或病毒的。一旦含有启动子、转录起始子及（通常含有的）多联结子的表达盒制备好之后，所选的基因序列便可插入使之转化入动物细胞中。

一般而言，将上述各个部分相接起来的顺序并不是不可更动的，从而使得在该基因的插入过程之前，侧翼区域可先与包括选择性标记或其它区域，诸如强化因子、转录调节区域之类的复制系统相结合。将这些片段连接到一块的方式，取决于许多因素，如组建的难易、限制性位点的选择、各个片段获取的可行性等等，然而，所有这些均是本技术领域人员有能力作出选择的。

复制系统的选择，在某种程度上讲取决于究竟需要稳定的表达，还是过渡性的表达。对于过渡性表达，基于含有一个复制源的病毒序列，（诸如SV40），的游离基因元件被采用。对于稳定的表达，则采用其它的游离基因元件（例如，基于牛乳头瘤病毒的载体）或所有程序集中于基因组中的序列。许多这样的病毒序列已经被连接至可选择的标记中，诸如基因gpt、neo及dhfr。这些标记可用于对含载体的细胞的选择，其中一些则可用于整合的外源序列的放大作用。

为了尽可能增进所需物质的生产，可通过向细胞作共转化而方便 地实现，即首先转化含GASGA表达盒的组建，而后组建第二个含选择标记的独立的结构。另一方面，可以通过制备一个衔接结构来放大基因，在其中GASGA盒与诸如dhfr或金属硫因等基因的表达盒。宿主细胞为用GASGA表达载体转化后，产生可回收数量的GASGA的任何动物细胞，优先采用哺乳动物或禽类的细胞。这些细胞的例子（其中显然包括人类细胞），包括那些在转化之前能够或不能够产生可回收数量的pro-uPA的已知的及已建立的细胞系，诸如LB6（一种自亲代L细胞衍化的小鼠成纤维的细胞的（fibroblastoid）细胞系（Corsaro    C.M.及Pearson    L.M.等著，《促进DNA媒介基因在哺乳动物中的转化》、《体细胞遗传》（Somatic    cell    genetics）7，603-616，1981）;CHO（中国仓鼠卵巢）（Kao    F.T.，Puck    F.等著，Proc.Natl.Acad.Sci.，60，1275-1281，1968）及人类表皮癌细胞系A431（Fabricant    R.N.，De    Larco    J.E.，及Todaro    G.F.等著《培养的人类黑瘤上的神经生长因子受体》，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，565-569，1977）。上述的头两个细胞系（LB6及CHO）不产生Pro-uPA，而最后提到的那个（A431）则能。可是，一般地讲，已建立的细胞系，诸如CHO、COS、LTK、Hela及CN-1均可适用于本发明的方法。

对产生GASGA的单层CHO细胞系的反复再克隆，可从培养基中分离出保持了产生uPA能力而同时又具有在悬浊液中进行自我复制能力的衍化细胞系。由于易于培养并且在每次发酵物中的单位产率较高，因而对本技术领域中人员这类细胞系的优点是显而易见的。本发明的一个较理想的实施例，是这些能产生GASGA的CHO细胞能在在培养基悬浮液中生长。可用任何惯常的方式将表达载体引入宿主细胞中，例如用微注射、DEAE-葡聚糖媒介转染、磷酸钙沉 淀的DNA转染及电极化处理（electroporation）（参见：Bonerji    J.等著，（cell）《细胞》33，729-740（1983）;Graham    F.L.及Van    der    Eb    A.J.著《病毒学》（Virology）52，456-467（1983）及Potter    H.等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，7161-7165（1984））。转染之后，使细胞生长合适的培养基中，诸如在（Dulbecco's    modified    Eagle）培养基（DMEM）中（其中含10%至20%失活胎牛血清，细胞可以稳定地维持于其中，随后将合适的选择剂例如抗生素引入）。将选择的细胞反复克隆，并用通常的测定法对它们的GASGAs产量进行测定，例如用血纤维蛋白裂解测定或免疫氨基裂解测定（IAA）。该测定法必须借助于不与蛋白质GFD发生专一性识别或连接的而对scu-PA及/或uPA具有专一性的单克隆抗体。适合的单克隆抗体为那些可识别uPA    B-链而不识别A链的单克隆抗体，如以下文献所描述。Herion    P.等发表于《生物科学报导1》885-892（1981），SalernoM.G.等著，Proc，Natl.Acad.Sci，USA，1984，81，110-114，或Kaltoft等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1982，79，3720-3723或MAB5B4（如Nolli等人在（Haemostas）（1986，56，214-218）所述，可与uPA的“Kringle”区域连续，而不与GFD区域连结）。

此后，将分离的产生GASGA的克隆进行大量培养以产生相当数量的GASGAs。在大量培养方面，本发明的一个优选的实施例是以加入抑肽酶（aprotinin）为特征的。在原始培养基中，或在培养过程中加入这种物质的效果在于使pro-uPA的回收数量增多。普通采用的抑肽酶（aprotinin）的加入浓度为10-50IU/ml，而最好为20-25IU/ml。

根据引导序列是否保持以及产物是否可以分泌的区别，可区别采 用连续或重复调换培养基的方法，并将GASGAs从培养基中分离。如果引导物丧失，且产物仍留在细胞内，细胞在丰获后，被杀死并且溶胞而分离出该产物。常用的技术，诸如离子交换或亲和层析、高效液相色谱及反相高效液相色谱可用于分离及纯化操作中。合适的亲和层析纯化方法包括采用不与蛋白质GFD识别或结合的抗scu-PA或uPA的单克隆抗体，诸如与uPAB-链结合而不与A-链结合，或仅与A-链上“Kringle”区域结合（见上文）的单克隆抗体。可以方便地使用，Herion    P.及Bollen    A.在《生物科学》（1983，3，373-379）上描述的免疫吸收剂，同样也可采用MAB5    B4（参见Nolli等人著作，见上文）。

一个方便地确证所获化合物的确没有与uPA GFD相结合的方法，是以采用免疫酰氨基裂解测定（参见：Corti等著，《（Thromb·Heamostas）》（1986，56，407-410，及1.6.2）该方法采用不与包括GFD的蛋白质区域发生识别或结合的单克隆抗体（参见上文关于此类抗体的若干特例），以区别于采用可与蛋白质区域（诸如MAB CD6或DC1，见下文详述）相识别或相结合的单克隆抗体的免疫氨基裂解测定法。平行地或连续地进行。

具有该特殊性能的单克隆抗体可以按照应用合适的选择方法的已知的细胞融合技术而制备。免疫剂可以为scu    PA、tcu-PA、ATF或其混合物，可按以下的常用方法进行免疫操作。抗原承受体可为本技术所用的任何一种实验动物，但其中优先选用啮齿动物，诸如，大鼠、小鼠或免子。用于与经处理的动物脾藏细胞相融合的稳定的细胞系，可以为任何一种已知的及易获的细胞系，诸如，可优先选用的肿瘤细胞系，例如，小鼠骨髓瘤NSO（P3/NS1/1    Ag-4.1的亚系）（ATCC保藏号TIB18）。优选的用所需特性对MABs进行选择的探针，为分子量约为6，000的相应于uPA序列中大致跨 跃自第4位的亮氨酸至位于第43位的谷氨酸残基的，亦即相应于（为其相关部分或包括）uPA的所谓的GFD的氨基酸序列的一个肽片段（称为F6）。这种片段是用可以切除与谷氨酸残基相近的蛋白序列的酶，诸如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）衍化的蛋白酶V8，对ATF进行控制处理而获得的。作为该选择系统中的阴性对照物（positive control），有时可以方便地再引入一个用V8处理ATF而得的片段，即称为B11的分子量大致为11，000的，必定相应于uPA（Kringle）区域的片段，并且还可随机地引入第三个片段，即由同一步骤中得到称为F12的必须相应于uPA（Kringle）区域的但须切断氨基酸52及53的片段。与片段F6也与uPA（scu PA及/或tcu PA）结合而不与（Kringle）区域（片段B11）或催化区域（B-链）相结合的MABs，例如利用诸如亲和层析或离子交换层析，采纳诸如免疫亲和性或免疫斑吸等试验而进一步提纯并分离。从而获得所需的对uPA GFD区域选择性地识别或结合的特性。

为演示本发明的GASGAs衍生物不与uPA受体（诸如U937单细胞上受体;参见Stoppelli    MP等著，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，1985，82，4939-4943）相结合，可以用一种测定法来表演，该测定法包括，用本发明的GASGA衍生物取代uPA之后，重复本文所叙述的实验，该物仅作为正对照而被引入本实施例。在该测定法中，EO系列的GASGAs衍生物结合力很低。一般低于uPA结合力的10%。

除采用U397单细胞之外，上述试验还可以采用人类脐静脉内皮细胞进行演示，（参见：Ajjar    KA等著，J.Biol.Chem.1986，261，11656-11662）。

本发明化合物的体内活性，可通过对实验动物进行的试验来证实， 诸如，对麻醉兔进行的凝血溶解试验（参见：Collen    D.等著，J.Clin.Invest.1983，73，368-376）。

本发明的GASGAs衍生物因此可用以取代scu-PA或uPA而应用于采用溶解血栓等物质进行的治疗应用中。为此，本发明化合物既可就此施用，然而最好按照本技术领域的已知技术配成配方后施用，参考书目诸如，瑞明顿氏（Remington's）Pharmaceutical    Science《药物科学》，第17版，麦克（Mack）出版有限公司出版于1985年。本发明GASGAs衍生物可用与目前的uPA或scu-PA相似的常用配方配制。

因而较为合适的治疗用途为溶解血栓，可以在梗塞或栓塞发生的早期加以应用，诸如用于心脏梗塞、肺栓塞或外周动脉栓塞的治疗。给药途径优先选用静脉注射，施用形式可以为浓缩药团或用灌注的形式。如有必要，最好在以溶解血柱有效数量的本发明化合物通过静脉注射药团施药后，再加一个比较短期的以较低剂量静脉注射灌注施药。每天的剂量因病人的年龄，身材及身体状况而有很大的变动，然而一般的范围为2-30毫克/每次，其中较佳为2-20毫克/每次，最佳为2-10毫克/每次。如本技术领域所公知，在此特定的治疗领域，可由内科医师根据具体的病例来决定合适的施用剂量及施用方案。

含有如已被描述过的uPA、scu-PA或t-PA的常用稳定剂的剂量单元中，GASGAs含量范围为每单元0.5-2毫克，相当于每单元含uPA为50，000-200，000国际单位。

用于配制于2毫升灭菌盐水以供静脉（e.v.）注射用的冻干药物配方的例子如下所示：

GASGA-EO（冻干）    1毫克

甘露醇    20毫克

乙二胺四乙酸    2毫克

磷酸缓冲剂（适量）

本发明的化合物可单独给药或与诸如肝素、阿司匹林等抗凝剂联用，或与其他PA的其它任何形式，诸如scu-PA、uPA、t-PA或其修饰形式，诸如欧洲专利申请第231883及236040号所描述的链激酶或它们的混合物联用。

附图简要说明：

以下附图旨在进一步对本发明进行说明，说明书、权利要求书及参照附图，主要用于说明而不对本发明的范围产生限制。以下附图的简要说明为使附图及作为本发明的整体更为易于理解。

图1：uPA基因、mRNA及蛋白质的结构。

由上至下：

-插入在噬菌体λ-uPA2中的uPA基因限制性图谱;

-插入在噬菌体λ-uPAⅠ中的uPA基因限制性图谱;

-uPA开放的阅读框架（Ba：BamHⅠ;EⅠ：EcoRⅠ;S：SmaⅠ;HIII：HindⅢ）的限制性图谱;

-人类uPA基因外显子/内含子结构：黑框（black    boxes）：不转译5′及3′区域;阴影框：转译的外显子;线条：内含子;

-部分末拼结的cDNA克隆pHUK1的外显子/内含子结构;

-外显子及氨基酸在pro-uPAmRNA中的相应性;

-蛋白区域与pro-uPA中的氨基酸南嘤π浴?

图2：RSV-uPA的组建

将从λ-uPA1制得的含uPAmRNA的完全的ORF的SmaⅠDNA片段（参见该图上部）插入框架中，该框架系通过用HindⅢ及HpaⅠ消化带有细菌质粒功能及RSV的LTR的质粒RSV-Neo获得的（见该图左部）。RSV-uPA具有在启动子控 制下uPA    ORA，启动子包含于Rs    VLTR之中，并且当插入适合的真核宿主时可以表达蛋白质（见该图下部）。

图3;GASGAs表达载体的组建

详细的限制性图谱及外显子/内含子结构：

A）人类uPAORF（框：外显子;线条：内含子）;

B）质粒RSVuPA中外显子Ⅳ两旁的区域的扩展部分，它显示了如同相应的氨基酸一样在两个相邻的外显子中分裂开的密码子中的核苷酸;

C）RSVuPAP＞S（左）及RSVuPAB＞X（右）中的如上所述的相同区域（图3）;

D）在RSVuPA-E0（左）及RSVuPA-E2（右）的ORF中的GFD区域的结构;嵌合质粒中的新的密码子及创造的氨基酸示于图谱之下;来自RSVuPAP＞S的外显子称为“Ⅰ”，而来自RSVuPAB＞X的称为“2”。

图4：pBPV-230.8的限制性图谱

pBP322衍生物pML2dx被插入在BPV-1基因组的独特的BamHⅠ位点（参见：Saver等著，Mol，Cell.Biol.5，3507;1985）邻近转化区域的3′端的BamHⅠ位点被修饰为SalⅠ。

图5：人类uPA表达盒的组建

质粒RSVuPA有两个独特的限制性位点，NdeⅠ及ApaⅠ，由XhoⅠ修饰，连接而获得质粒p71。从后者，uPA表达盒（见该图下部）可由XhoⅠ消化而获得。适合于插入两个XhoⅠ及/或SalⅠ位点的片段可以驱使人类uPA基因的转录。

图6;在附加体的载体中RSV-uPA结构的插入

质粒pBPV230.8经通过置换BamHⅠ、HindⅢ及SalⅠ三个病毒位点中的一个，经修饰而分别获得pBB、pBH及pBS。 每个衍生载体中的新的XhoⅠ位点用框线标出。因XhoⅠ连接子的插入及在pBB及pBS中的XhoⅠ位点的侧翼连接而获得的新的BamHⅠ及SalⅠ位点示于图中。

在三个质粒中，RSV/uPA结构（见图3）以两个方向被插入XhoⅠ位点，得到以下质粒：

-pBBuPAa、pBHuPAa及pBSuPAa，其中uPA及BPVmRNAs在同样意义下被转录。

-pBBuPAb、pBHuPAb及pBSuPAb，其中uPAmRNA及BPVmRNAs以相反的方向转录。

图7：在BPV衍化载体中的uPA    ORF的修饰

表达uPA（A）、GASGA-E0（B）及GASGA-E2（C）的BVP衍生载体的操作步骤图。上部所示的为pBPV230.8XhoⅠ衍生物，左部为贡献出RSV/uPA盒（uPA表达盒）的RSV-Neo-衍化表达载体（图7A）或分别由RSVuPA-E0及RSVuPA-E2衍化而得的BssHⅠ/SacⅠ片段（GASGAs表达载体，图7B及C）。

图8：puPA2的结构

质粒pEMBL8-CAT通过用载有细菌CAT基因的片段取代位于ClaⅠ及HindⅢ之间的片段，得到pEMBL8再经衍生而得到（参见：Dente等著，Nucl.Acid Res.，1645-1655;1983）。含有uPA启动子的SmaⅠ片段被插入CAT基因上游而产生质粒pupA2，质粒pupA3（见该图右部）在正确定向架上有启动子。

图9：人类uPA启动子的序列

图中显示含有mRNA起始点、TATA框（box）及uPA启动子的上游调节区域的来自于λ-uPA1噬菌体DNA的一段2.38千碱基对SmaⅠ片段的序列。如Riccio等人应用的引物延伸分析，图谱 中核苷酸+1相应于uPAmRNA中的第一个核苷酸。

图10：uPA启动子的限制性图谱及其衍生物

表明其中的uPA启动子已经被修饰的区域的puPA2修饰质粒的限制性图谱如图所示;

-puPA2/41，其中启动子的5′端的SmaⅠ位点转化成为XhoⅠ;

-puPA2/17，其中位于两个OxaNⅠ位点之间的区域已缺失;

-puPA2/254，其中位于5′OxaNⅠ位点及EcoRⅤ位点之间的区域已缺失。

图11：uPA启动子衍生的载体

图11A描绘了质粒puPA2/41、puPA2/17及puPA2/254的限制性图谱。

图11B：通过用SalⅠ/XbaⅠ消化而将CAT基因删去及SalⅠ连接，而分别地从puPA2/41、pupA2/17及puPA/254得到pPP17及pPP254。

这些含有uPA启动子（或其衍生物）、TATA框（box）及mRNA起始点的载体，可用于表达基因或cDNA，例如，在平头端SmaⅠ位点或BamHⅠ位点将有MboⅠ、XhoⅡ、BglⅡ、BclⅠ及BamHⅠ端的片段插入其中来实现。这些结构可采用XhoⅠ及SalⅠ双消化被切割。同样的双消化可用于切开启动子结构，并将在基因或被表达的cDNA的另一个质粒5′端插入作为一个“表达盒”插入。

被填充的圆表示复制的质粒源。

图11C描绘了质粒pPP41×S，pPP17×S及pPP254×S，系将-7.3千碱基对，并在质粒SMaⅠ位点上含有upAORF的SMaⅠ片段插入至pPP41，pPP17及pPP254而衍生得到的相 应产物。

图12：小基因衍化的GASGAs表达载体的结构。

在uPA    ORF中删去外显子Ⅳ（pPP：：XS-EO，图12B）或使之加倍（pPP：：XS-E2，图12C）以使uPA表达载体（pPP：：XS，图12A）修饰。

图13：uPA受体连接分析

该图显示，当用GASGA-EO载体转化的CHO细胞的培养上清液加入时，对125I-DFP-UK与U937细胞上的uPA受体的结合力的抑制作用。未标记的uPA用作正对照。

图14：RSVuPA-EO-49的结构

RSV-uPA-EO-49是一表达载体它含有存在一个相当程度上与外显子Ⅳ（即GFD的编码区域）相应缺失部分的uPA ORF的表达载体（参见该图右下方）。这是通过将含有质粒的大部分但缺少外显子Ⅲ及Ⅳ（参见该图右上方）的RSV-uPAB＞X片段与一个自内含子B的3′部分跨越至内含子C的5′部分的HindⅢ-SalⅠ质粒片段（见图下部中央）相连结而获得的。

上述的RSV-uPAB＞X片段通过用HindⅢ及XhoⅠ消化RSV-uPAB＞X（图2）而获得，而HindⅢ-SalⅠ片段（相当部分仅对应于外显子Ⅲ）通过用HindⅢ消化一个用P71（见图5）（其末端已被SalⅠ连接子修饰）经PstⅠ消化而衍生的质粒片段而获得。

图15：RSV-G-Asp的组建

质粒RSV-G-Asp（见图底部），经用ScaⅠ部分消化RSVuPA（见图上部）而组建，并用Asp718连接子修饰末端，选择合适的限制型式。该载体在位于译码（frame）之外的插入部份的下游具有uPAORF。

图16：RSVuPA-Tet的组建

质粒pBR13Tet示于图（d）的底部。这是通过用PstⅠ及HindⅢ消化，使pBR322中的大多数的氨苄青霉素抗性基因被删去，并在把突出的末端切平之后使质粒重新循环。

将从该质粒（pBR13Tet见b）上取出的含有四环素抗性基因及复制源的NdeⅠ/PvuⅡ片段，与取自于RSVuPA（见C）含有RSV启动子及人类uPA基因及其自身的多腺苷酸化位点（PAS）的NdeⅠ/HpaⅠ片段相连结。

图17：连接子修饰的RSVuPA-Tet衍生物组建

用ScaⅠ消化使含有一个独特的于uPA外显子Ⅳ中含ScaⅠ位点的质粒RSVuPA-Tet（见图的上方）成为线状，并分别用Asp718连接子、ClaⅠ连接子及XhoⅠ连接子进行连接而使之修饰，分别得到称为RSVuPA-Tet-Asp（底部左方）、称为RSVuPA-Tet-Cla的质粒（底部中央）及称为RSVuPA-Tet-XhoⅠ的质粒（底部右方）。这些质粒在已不位于读码（frame）中的插入部分的下游具有uPA编码区域。

图18：DNA及打断的GASGAs的氨基酸序列

含有位于读码外的插入部分的下游的uPA编码区域的质粒RSV-uPA-Tet-Asp、RSV-uPA-Tet-Cla、RSV-uPA-Tet-XhoⅠ，被分别地用专一于多连结子衍化位点的酶消化而修饰，使部分或全部地填补突出的末端，而重新恢复正确的阅读框架、图中也示出了接近于该修饰相关的DNA及氨基酸序列。

在竖行所称“修饰位点”指起始质粒的修饰位点（例如，Asp718指用作起始材料以获得图中所示的修饰的质粒即RSV-uPA-Tet-Asp的独特的位点，当部分填入时所得的修饰质粒称为RSV-SAD，当全部填入时所得的修饰质粒称为RSV-SVRTD）。该图也示出由填入而引起的限制性位点。

实施例：

以下的各实施例皆以便于实施的方式对本发明作说明，而无意对其范围加以限制。为了使以下各实施例便于理解，在各实施例（自1.1至1.6.5）之前的段落中，对基本以相同的方式用于不同实施例的技术及方法（诸如DNA酶修饰法、DNA沉淀、蛋白质提纯等等）进行叙述。为了避免重复完全的步骤，在各个实施例中常常引用对应于已作过叙述的该段落。

1.1细胞可由商业途径或科学团体或公认的保藏机构获得。

1.2细胞生长在合适的培养基中，诸如，含有10%热失活胎牛血清的Dubecco改进的Eagle培养基（DMEM）。

1.3分子生物学上适用的培养基、缓冲液及溶液。

以能得到为前提，在其它的所有情况下，试剂为“DNA/RNA级”及“分析纯级”。如不特别指明，细菌及噬菌体生长用的液态及固态培养剂、缓冲液及各种溶液均按Maniatis    T.，Fritsch    E.F.，Sambrook    J.，等编《冷泉港实验室手册-分子克隆》（1982年）中的方法制备、贮存及使用。如不作特别说明，也按上述同一参考书对玻璃器皿、塑料物品及五金工具制作、保存及使用。采用去离子/蒸馏水，如果用于酶缓冲液中需作热压处理。

1.4分子生物学上使用的酶

限制性的核苷酸内切酶、DNA修饰酶及RNase均可以购买到。这些药品是购自Boehringer、Bethesda研究实验室（BRL）、Pharmacia;溶菌酶及牛血清白蛋白（BSA）同样可买到。这里使用的溶菌酶购自Sigma，BSA及购自Boehringer。常用的缓冲剂溶液用于各个酶反应。它们的组成及制备为普通公知的，并可按照各个不同酶相关的信息方便地进行制备，制备物经过滤灭菌后分成几份于-20℃进行保藏。许多现用的缓冲剂也以浓缩液的形式购买到合 成DNA连接子及t-RNA、鲱鱼精DNA易于获得。这里所用的合成DNA连接子购自P-L    Pharmacia或新英格兰生物实验室，而tRNA及鲱鱼精DNA则购自Boehringer。

1.5.rDNA技术

如在以下的各实施例中不作特别的说明，按照Maniatis等人所述的方式，并参照其中的原有参考来进行rDNA技术。

1.5.1限制性消化及DNA的酶修饰

本领域中，单一及多次限制性消化及DNA酶修饰的操作已众所周知，而对之所作的报导是普通可获得的。在生产者的小册子（manufacturers'booklets）以及Maniatis等人（第4章）所称“热失活”是指在70℃下维持10-15分钟使酶失活，然后在室温下放置该混合物10至15分钟，并用Eppendorf离心机离心2分钟。对限制性消化及酶DNA修饰的结果的检测，择优在含0.5毫克/毫升溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的1%琼脂糖凝胶上，在100伏电压下电泳1-2小时来进行（也请参见Maniatis等人的文献，第五章）

1.5.2苯酚/氯仿抽提

择优按Maniatis等人文献中458页所描述的方式用苯酚/氯仿从核酸水溶液中抽提蛋白质;当反应体积少于200毫升时对DNA进行“反抽提”。

1.5.3DNA沉淀

DNA沉淀在进行时，最好加入0.1份的体积的3M乙酸钠（pH5.2）及3份体积的乙醇（于-20℃）。仅当以下实施例指明时才加入20至40微克tRNA。将混合物在干冰/乙醇浴中放置15至30分钟或在-20℃保持过夜，然后用Eppendorf微型离心机或Sorvall离心机以1000G在4℃下离心15分钟。DNA沉淀物颗粒用70%乙醇洗一次，再立即用100%乙醇洗一次，最后在（Savant）真空离心机中干 燥。

1.5.4-5′脱磷酸化作用

5′DNA末端的脱磷酸化最好用购到的腓肠磷酸酯酶（CIP）（购自Boehringer）于37℃进行1小时。CIP用酚/氯仿抽提而除去，或加入最终浓度约为50mM的亚乙基双（氧亚乙基次氮基）四乙酸（EGTA），并在68℃下加热45分钟。

1.5.5DNA连结

按本领域已知方式进行DNA连接。

可以方便地按照T4 DNA连接酶生产者的指导进行。当使用合成连接子时连接酶反应在8℃下进行，而在所有其它的情况下在14至16℃下进行。当钝端DNA需要连接时，加入PEG1500或PEG4000至最终浓度为10%。可方便地采用以下的组成物的10×连结缓冲剂：0.66M Tris-HCL pH7.6，50mM MgCl2，50mM二硫苏糖醇，及5mMATP。

1.5.6DNA连结子

最好采用连结子DNAs，磷酸化后按Maniatis等人于125-126页中方法进行复核，并按392页及其之后的方法使用的。激酶反应、连结作用及连接子单独及被连结的DNA片段的限制性作用的检测，是在2%琼脂糖凝胶上使连结子电泳10至20分钟，而在连结片段的情况下电泳1至2小时，并按Maniatis等人于172页介绍的自动射线照相后目测DNA。

1.5.7制备型凝胶电泳

制备型凝胶电泳最好在含有0.5微克/毫升的溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的1×TBE缓冲液（0.089M    Tris，0.089M硼酸及0.002MDTA，Maniatis等人，于156页中介绍）的0.7%至0.8%琼脂糖上进行。DNA先于25伏下电泳2小时，而后于 50伏电压下电泳16至20小时。用305mm紫外透射器使DNA片段显现，将DNA带切下用电洗脱系统（ISCO）在0.1XTBE（见上）于400伏下进行10至15分钟电洗脱。用已制备的并经低盐缓冲液淋洗的（Elutip）-D柱（Schleicher    &    Schuell），用高盐缓冲液进行洗脱以纯化DNA。典型的情况为，将含有0.2M    NaCl、20mMTRIS-HClpH7.3-7.5（TRIS即2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇）及1.0mMEDTA用于柱的制备。该缓冲液也用于淋洗，而洗脱缓冲液含有1.0M    NaCl，20mMTRIS-HCl    pH7.3-7.5，及1.0mMEDTA。最后按1.5.3的方法沉淀DNA。

1.5.8大肠杆菌的转化

大肠杆菌的转化（参见：Hanahan    D.，《用质粒转化大肠杆菌的研究》，J.Mol.Biol.（1983）155    557-580）最好根据本领域的技术（《生产者小册子》亦对此作了概要说明）采用商业或其它形式得到的感受态细胞（诸如：DH1、HD5或BRL的HB101菌株（Bethesda研究实验室））来进行。当DNA片段欲插入一个不同的质粒时采纳100微升（BRL）的草案，而当用DNA连接子改变限制性位点时则采纳一个小规模的20微升（BRL）的草案。在没有抗生素的情况下进行的保温之后细胞在琼脂LB平板上，铺成平板。细胞在存在合适的抗生素的情况下铺于琼脂LB平板上（参见Maniatis等人的文献，440-444页）在37℃下保温过夜。

1.5.9转化细胞的筛选（miniprep分析）

从DNA转化的感受态大肠杆菌细胞的抗性菌落，最好通过把分离出来菌落在5毫升的LB及合适的抗生素（参见：Maniatis等人文献，440页）存在下进行筛选，于37℃下生长过夜，并按Maniatis等人的报导（366-367页）用沸腾法分析培养液的样品（1.5毫升）。 可以方便地采用以下的各种变动：

-反应体积放大1.5倍;

-大肠杆菌DH1及DH5菌株沸腾60秒;

-DNA沉淀在不加入盐的情况下进行，加入1份体积的异丙醇，并把各个试管置于-20℃下20至25分钟;

-分别用1毫升70%乙醇及1毫升100%乙醇洗涤沉淀DNA各一次;

-以10毫克/毫升的浓度加入无DNase的RNase，并在70℃将DNA培养20分钟。

1.5.10质粒的大规模制备

最好按Maniatis等人所述方法（第三章）进行质粒的大规模制备。最好采用碱性溶胞方法来重获质粒DNA（参见：Maniatis等人的方法，90-91页）在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓氯化铯（Cs    Cl）梯度中提纯质粒DNA两次，然后用异戊醇抽提该混合物，分离含DNA的水相，并对TEpH8进行透析（Maniatis等）并贮存在4℃。

1.6对所获得GASGAs进行提纯及定性

1.6.1化学药品

采用的所用化学药品要则广泛地由商业途径而得到，或从商业途径可得到的产品方便地制得。以下列举的为用于以下的实施例的若干化学药品及其来源：亲和凝胶10（活化琼脂糖）、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠、考马斯亮蓝（均购自Bio    Rad，Richmond，USA）;CNBr-活化葡聚糖、用于低分子量蛋白质的电泳校正仪（均购自Pharmacia，Uppsala，Sweden）。两性电解质（购自LKB    AB，Bromma，Sweden）;牛血清白蛋白（BSA）、Chon    fraction    V、猪胰蛋白酶、猪的血纤维蛋白溶酶、血纤维蛋 白原Ⅰ级fractionⅠ型Ⅳ、苯甲脒（均购自Sigma    Chemical    Co.，St.Louis，MO63178，USA）;抑肽酶（aprotinin）（购自Bayer，Leverkusen），GFR、糖肽酶F（购自Boehringer    Mannheim    GmbH，FRG）;S-2444（购自Kabi    AB，Stockolm，Sweden）。高分子量的尿激酶（HMW-uPA）及所谓的氨基末端片段（ATF）（均由Lepetit    Research    Laboratories    SpAMilano，Italy）。Scu-PA（前uPA）大部分可按照以下的文献所叙述的方法来制备，Stump    D.C.，Thienpoint    M.，Collen    D.，J.Biol.Chem.261，1267-1273，1986。A431    scu-uPA可按Corti    A.，Nolli    M.L.，SoffientiniA.在《血栓（Haemostas）》（1986）中的56，219-224页中所描述的方法来制得。其余各种试剂为分析级产品（均购自Merck    Darmstad，GFR或Carlo    Erba，Italy）。

1.6.2-免疫学及活性测试

血纤维蛋白水解测试是用血纤维蛋白平板法（参见Astrup    T.，Mullertz    S.，著《用于测定血纤维蛋白水解活性的血纤维蛋白平板法》Arch    Biochem    Biophys    1952，40∶346-351）。用尿激酶参考标准逐在每一测试值中进行校正。活性用相对于作为初级标准的国际参考制备，来测定其国际单位。sc-uPA（细胞产生的单链尿激酶）潜在的血纤维蛋白水解活性，在以下的活化之后进行测定：用0.5M碳酸钠缓冲液作为偶联剂缓冲剂将血纤维蛋白溶酶（10毫克）与CNBr-活化葡聚糖（交联琼脂糖）（2.5毫升）偶联。将以一份血纤维蛋白溶酶-琼脂糖（0.9毫升）与十份0.15M氯化钠、0.05M磷酸钠缓冲液（pH7.4）配成的悬浊液混以sc-uPA样品（0.1毫升），然后于20℃下缓慢转动1小时。在1000g下离心2分钟除去血纤维蛋白溶酶-琼脂糖，然后用血纤维蛋白平板测定法对上清液进行测定。

用Lowey的方法测定蛋白质的浓度（参见：Lowry    O.，Rosebrough    H.，Parr    A.，Randall    R.，《用福林苯酚试剂械鞍字什舛ā罚琂.Biol.Chem.1951，193，265-275）。通过测定合成底物pyro-Glu-Gly-Arg-pNA，S-2444的水解速率来进行酰胺分解测定（Claeson    G.，Friberger    P.，Knos    M.，Eriksson    E.，《测定血浆中前激肽释放酶、腺的激肽释放酶（glandular）激肽释放酶及尿激酶的方法》《（Haemostasis）》1978;7∶76-78）。按Corti    A.，Nolli    ML.，Cassani    G.，等人描述的方法进行免疫吸收剂酰胺分解测定（IAA）。用一种新的免疫吸收剂酰胺分解测定法（IAA）（参见：Thromb.Haemostas    1986，56∶407-410）对单链及双链的尿激酶型血纤维蛋白溶酶原激活剂进行区分检测。该方法开发了利用两种蛋白质的抗原及酶的性质，在分析中将免疫测定选择性与酶活性的专一性结合起来。

在各自的测试中采用了两种类型的单克隆抗体：

a）一个识别包括GFD区域的蛋白质区域，而不识别蛋白质的催化部分，或不识别（Kringle）（诸如MAB CD6或DC1）的单克隆抗体。

b）一个识别蛋白催化区域而不干扰酶的活性，并且不识别包括GF区（诸如在说明书的前面部分所述）的区域的单克隆抗体。

GASGAs与上述中的单克隆抗体的a点结合而不与MABs的b点结合，而与此相反，scuPA/tcuPA与两种系列的MABs均结合。GASGAs、ATF及scu    PA/tcu    PA与识别Kringle的MABs（诸如MAB5    B4）连接。

1.6.3反相FPLC：

用FPLC（快速蛋白质液相层析）系统（Pharmacia    Fine    Chemicals）进行反相层析，采用一个前-RPC    HR5/10反相层析柱（大孔型、小颗粒的带有C1/C8基团的二氧化硅），洗脱用缓冲剂：缓冲剂A，0.1%三氟乙酸水溶液，及缓冲剂B，0.1%三氟乙酸的乙腈溶液;洗脱方式：100%A;洗脱20分钟，以A中B的含量自0至60%的线性梯度洗脱65分钟，100%B洗脱25分钟;流速为0.3毫升/小时。

1.6.4电泳步骤：

按照Laemmli    UK的方法（《在噬菌体T4的头部组装的过程中劈开结构蛋白质》Nature    1970，227∶680-685）在凝胶板上进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。（可方便地采用1.5×120×150毫米的凝胶板）。聚集胶与分离凝胶分别含有3%及12.5%丙烯酰胺。用于分子量测定的商业途径可以获得的电泳仪的标记蛋白质（两性电解质）在两种凝胶中电泳。2-巯基乙醇被用作还原剂，考马斯亮蓝用于凝胶染色。当采用不同含量的丙烯酰胺凝胶时，常常在括号中注明。免疫斑点吸印法按已知技术进行（参见：Salerno    G.，Verde    P.，Nolli    ML.，Corti    A.，Szots    H.，Meo    T.，Johnson    J.，Bullok    S.，Cassani    G.，Blasi    F.，《用人类尿激酶单克隆抗体识别单链前尿激酶前体》，Proc    Natl    Acad    Sci    USA    1984，&1∶110-114）采用纯化的单克隆抗体，不识别或不给合含uPAGFD区诸如能识别uPAB-链而不识别A-链（参见：Herion等人，在《生物科学报导1》，885-892页（1981），Salerno    M.G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci，USA1984，81，110-114页，或Kaltoft等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，1982，79，3720-3723页）或采用仅在“Kringle”区域诸如MAB5    B4（见上文，Nolli等）与A链相结合的单克隆抗体。

1.6.5GASGAs的纯化

用与上述的将A431-uPA从A431肿瘤细胞上清液提纯的同样方法，用免疫层析及离子交换FPLC将GASGA从细胞培养上清液中提纯（参见：Corti A.，NolliM.L.，Soffientini A.，Cassani G.《来源于人类A431细胞的单链尿激酶类血纤维蛋白溶酶原激活剂（前尿激酶），Throm Haemostas 1986;56：219-224页）。

将含1%聚乙二醇（PEG）6000的，0.15M氯化钠及0.05M磷酸钠的缓冲液（pH7.4）用于平衡负载有那些与uPAB一链结合而不与A链结合的单克隆抗体（诸如MAB    AAU2，见Herion    P.及Bollen    A.《生物科学报导3》373-379页，1983）的改变的琼脂糖基质。

在4℃下以50毫升/小时的流速将2升细胞上清液上柱，随后用平衡缓冲剂洗涤。用含1%PEG6000的1M氯化钠及0.1M乙酸的混合液进行洗脱。对各组份用IAA法测试（见1.6.2）并收集那些含GASGA的组份，收集的各个组份的存在含量高低的分布，然后，采用经0.05M乙酸钠缓冲剂（pH4）预平衡的单SHR5/5柱（以具有窄小的颗粒大小分布范围的珠状树脂为基的亲水性强阳离子交换剂;带电荷基团为-CH2SO3H），通过FPLC（快速蛋白液相层析）系统（Pharmacia Fine Chemicals，Sweden）中进行的离子交换层析，使收集物进一步纯化及浓缩。样品通常用蒸馏水稀释两倍，使离子强度减弱后再上柱。当用平衡缓冲剂洗涤之后，以60毫升/小时的流速，用缓冲剂A（0.05M乙酸钠缓冲剂，pH4）及缓冲剂B（1M氯化钠，0.05乙酸钠，pH5）混合物的盐/pH线性梯度，自A中含B30%至 70%（50分钟），然后100%B（20分钟）对被结合的蛋白质进行洗脱。用免疫吸收剂一酰胺解测定法（IAA）（见1.6.2.）测定具有酶活性的GASGA及酶学上失活的血纤维蛋白溶酶可活化GASGA抗原的在细胞上清液中的含量。酶学上有活力的GASGA及酶学上无活力，可用血纤维蛋白溶酶原活化的GASGAs抗原可用免疫吸收一酰胺分解法（IAA）测定，酶学上有活力的GASGAs据测占最终产物的95%左右。GASGA的反相FPLC分析在280mm获得一个单一的峰。

或者，上述步骤亦可用Corti等人叙述的方法（见上文）所制备葡聚糖-MAB5    B4亲和性基质上进行。纯化效力与上面报导的相似。

实施例EO

人类基因库

用本领域已知技术（参见P.H.Hieter等Cell，Vol.22，197-207（1980）及Maniatis等）制备噬菌体入（Charon）28中的人类基因组DNA库。将重组体入溶解产物在大肠杆菌K12株LE392上滴定（Maniatis等，504页）。噬菌体滴定技术，如同用缺口转译探针筛选噬菌体库技术一样，在本技术领域中已为人熟知（Maniatis等），在本发明中大量地应用于下面的实验中。在筛选时，将10微升溶解产物的一千倍稀释液吸附于0.3毫升浓缩2.5倍的10mM Mg SO4中的大肠杆菌K12LE392培养液上，然后在37℃下保温20分钟。加入7ml 0.7%琼脂糖，并将所有的混合物平铺在含NZYMC琼脂的150毫米的塑料平板上。（见Maniatis等人的方法）。总共采用0.41毫升溶解产物的一千倍稀释液，共用了41块板。保温一天之后，每块板平均显现出1.5×104个噬菌斑。作为一个良好的例子， 在41块板上总共观察到6×105个噬菌斑。

将从每块板上取下的噬菌斑转移至两个硝基纤维素过滤片上（Schleicher及Schuell    Co.）将过滤片干燥、洗涤后在真空中烘焙，然后按所述方式（见Maniatis等）进行预杂交。用分离自人类尿激酶cDNA的DNA片段组成的缺口转译探针进行杂交（Verde    A.等，.Proc，Natl.Acad.Sci.，81，4727-4731，1984）。

E0.1-缺口转译

质粒pHUK-I（Verde等.，Proc.Natl，Acad.Sci.81，4727-4731，1984）含有与人类尿激酶mRNA互补的重组插入体。用限制性核酸内切酶Pst-Ⅰ处理以切下大约1.5千对碱基的片段，用琼脂糖凝胶电泳进行分离，切下相应的凝胶区域，然后用电洗脱（参见1.5.7）重获该DNA片段。该1.5千对碱基的PstⅠ片段含有人类尿激酶mRNA（Verde等.，Proc.Natl.Acad.Sci.，81，4727-4731，1984）的大约75%的编码区域。该PstⅠ片段（5.0毫克）的统一标记是在每个α32P-dCTP及α32P-dGTP（参见：Maniatis等人方法）有200微居理（microCi）存在的情况下，用Bethesda研究实验室出品的缺口转译仪来进行的。标记DNA的产率为1.8-2.9×108cpm/mg。

E0.2-uPA基因阳性（positive）噬菌体的分离

用缺口转译Pst-Ⅰ片段对、41对过滤片进行杂交。在一个有大约为108cpm的标记DNA的塑料壳中，将8个过滤片组成的各个组在40毫升杂交溶液中进行杂交。杂交是在2×SSC、0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）（Maniatis等）中，在42℃温度下，在17个小时的时期内进行的。过滤片在15分钟内，室温下，于2×SSC、0.1%SD S中洗涤四次，然后在68℃下，在2小时内于1×SSC、0.1%SDS中洗涤一次。干燥之后，过滤片暴露于X射线胶片（Kodak）达12至24小时，随后冲洗。在筛选中，将在两个复制过滤片（三个）的识别位点上被发现给出一个正的杂交点的噬菌斑将噬菌斑用小体积的NZYMC肉汤（Maniatis等）取出，并在不同的稀释度下，用于感染大肠杆菌K12L392，并播在10厘米的NZYMC-琼脂板上。选出显现500至5000个噬菌斑的平板，并进行再筛选。这些噬菌斑被转移至两块硝基纤维素滤片（Schleicher及Schuell Co.）上，并用上述的人类uPA cDNA的缺口转译的1.5千对碱基的Pst-Ⅰ片段处理并杂交。结果所有噬菌斑都显出一个正的杂交信号，富集倍数为105左右。从三个正噬菌斑中分离的单噬菌斑分离物称为λ-uPA-1。λ-uPA-2及λ-uPA-3。

E0.3-大规模噬菌体制备

用大规模的培养溶解产物，将噬菌斑在大肠杆菌K12LE392上进行放大，噬菌体通过在氯化铯中反复进行分带而分离，先后用含酚的水相及氯仿/异戊醇（24∶1）进行抽提而提纯，并按照Maniatis等人于第3章中叙述的方法使DNA自水相中用乙醇沉淀出来。

实施例E1

uPA-编码基因在哺乳动物细胞中的表达

E1.1-uPAORF的分离

将200微克基本上按E0.3的方法得到的λ-uPA1，在25℃下用80微升含30单位的SmaⅠ消化1小时;用EDTA（最终浓度为50mM）中止反应，并使用一个10厘米的刷子（Comb）于100伏电压下，在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的0.8%琼脂糖凝胶上对DNA进行电泳。然后，在紫外线下对凝胶进行分析，将走速为第二慢的含有大约为7.3千对碱基的人类uPA基因的开放的阅读 框架（ORF）的区带从凝胶上切下。按1.5.7叙述的方法将所含的DNA进行电洗脱而提纯。

E1.2-载体DNA的制备

含RSV启动子RSV-neo衍化片段及pBR322衍化的对苄氨青霉素抗性及复制源通过HindⅢ消化、充填（filling    in）、HpaⅠ消化、CIP处理及在琼脂糖凝胶上进行片段分离而制备。

以下对RSV-neo载体的修饰作更具体地叙述（见图2）：

E1.2.1-HindⅢ消化

在37℃下于1小时内用200微升单位的HindⅢ对20微克RSV-neo质粒DNA进行完全消化。限制性酶热失活后，用等体积的酚∶氯仿对混合液进行抽提，DNA的沉淀也是通过50微克tRNA（1.5.3）进行的，随后使之重新溶解于20微升TE（Maniatis等）。

E1.2.2-充填（Filling    in）及HpaⅠ消化

以上制备的打开的载体的突出的末端，在37℃下，通过将DNA与25毫升含1单位的DNA聚合酶的（Klenow）片段共同保温1小时（Maniatis等，113页）而使之变平，并按1.5.2及1.5.3所述方法进行提纯。接着，在37℃下，用40毫升80单位的HpaⅠ在1小时之内将线性的钝端载体DNA劈开，随后用相同的方式进行提纯。这些操作劈去新霉素抗性基因，留下了含有复制源及自质粒pBR322衍化而获的苄氨青霉素抗性基因（见图2）的，具有自启动子至聚腺苷酸化位点之间有开口的RSV-LTR的具有平齐的末端的3.5千对碱基长度的DNA线性片段。

E1.2.3-CIP处理

用1.5单位在50微升反应基质（最终体积）中的腓肠磷酸脂酶（CIP）处理DNA，以从DNA末端上除去5′磷酸盐残基;然后加入亚乙基双（氧亚乙基次氮基）四乙酸（EGTA）（最终浓度为 10mM）并在68℃下进行处理（见1.5.4），使酶失活。

E1.2.4-片段纯化

用如1.5.7所述的0.6%琼脂糖制备型凝胶分离DNA片段。将含3.5千对碱基片段的色带的那部分凝胶切下，对DNA片段进行电洗脱（1.5.7），将获得的混合物调至合适的盐浓度，并用（Elutip-D）柱（Schleicher及Schuell    Co.）进行提纯。洗脱之后，将乙醇、乙酸钠、及载运子tRNA加入DNA溶液中，按1.5.3所述方法使DNA沉淀并使之重新溶解于20微升TE中。

E1.3-受控于RSV-LTR启动子下的uPA基因的克隆

将3单位的T4    DNA连结酶及2.5微升10×缓冲剂（Maniatis等，246页）加至3微克脱磷酸化DNA载体（按上述E1.2方法制备）及7.5微克7.3千对碱基的uPA片段（如上述E1.1所述方法制备）。将25微升反应混合物于14℃保温16小时（见1.5.5），并用于转化100微升HB101大肠杆菌感受态细胞（见1.5.8）。于37℃下，在含有50毫克/毫升的苄氨青霉素的LB琼脂平板上对细菌进行过夜培养筛选。将被分离的菌落挑出，生长于5毫升含苄氨青霉素的LB上，并按微型制剂（miniprep）分析法（1.5.9）进行操作。对提纯的质粒DNAs的限制性类型进行研究以确定载体译码中uPA基因的正确定向。这些质粒中其中具有正确定向的一个称为RSV-uPA，经分离后被用于接下的实施例（图2）。

E1.4.1-转染

以上所获之RSP-uPA被用于转染哺乳动物细胞。所用的该方法将在涉及用GASGAs载体进行转染的实施例2中更为详细地加以提供。

E.1.4.2-大量培养

为最大程度生产以上所得的转化细胞，进一步进行再克隆并按实 施例2的相应段落所报导的技术在较大的发醇罐中进行大量培养。

E1.5-uPA的定量

上述的培养细胞系的uPA的产量，可直接地在以上获得的G418抗性克隆上进行定量，或者照该技术领域中已知的方法通过将一系列不同稀释度的G418抗性细胞的上清液点在酪蛋白/琼脂糖/血纤维蛋白溶酶原平板上，在遇到单链的情况下，经纤维蛋白溶酶原活化测定pA的辐射状的扩散度。

含酪蛋白/琼脂糖/血纤维蛋白溶原的琼脂凝胶基本上按Schum    aker    GFB及Schill    W.B.在anal.Biochem.48，9，1972及Bjevum    O    J等在Quantitative    Immunoelectro-phresis，Scandi-navian    J.Immunoi.Suppl    2，N.H.Axelsen    ed.，Aas    and    Wahl    Oslo，1975，82-83所述的方法，另外，生产可用IAA法测定（见1.6.2）对应于单链形式的活化双链uPA的分析可用IAA（见1.6.2）

实施例2

GASGAs表达载体的组建

为获得表达EO或E2GASGAs的转录单元，我们通过插入一个独特位点于内含子C（位于外显子Ⅳ的5′处，含有类EGF区域编码的绝大部分）或在内含子D（位于外显子Ⅳ的3′处）（图3B）而改变质粒RSVuPA（见E.1.1.3）。获得的质粒，RSVuPAP＞S及RSVuPAB＞X（图3C），通过外显子改组（Shuffling），用于致变人类uPAORF，而获得两个GASGAs表达载体（图3D）：RSVuPA-EO，其中含外显子Ⅳ的类EGF区域被删去;

RSVuPA-E2，其中外显子Ⅳ被重复。

E2.1-RSVuPAB＞X的组建

在37℃下，用12.5微升（最终体积）分别含10至0.12酶单位的 BglⅡ缓冲液，分别在各自的反应容器中在30分钟内部分消化5微克RSVuPA    DNA，从而寻找最为合适的反应条件。将反应试管置于干冰/乙醇浴中，加入EDTA至10mM（最终浓度），最后在70℃下加热20分钟以使酶失活。在微型凝胶上对每一试管中的样品进行分析。当用3.33单位及1.11单位的酶进行消化时发现良好的结果。

选择这些反应条件并应用于5微克RSV-uPADNA。在37℃下，于15分钟内，存在20微升（最终体积）dNTPs（最终浓度各为1mM）的条件下，用2单位T4 DNA聚合酶将由此得到的5′突出末端分别充填（fill in）。然后，在70℃下加热20分钟使聚合酶失活。加入2微克磷酸化XhoⅠ连接子，并且在8℃下，于含有10%PEG1500及1个单位的T4 DNA连接酶的80微升缓冲剂（最终体积）中，在16小时内使之与质粒连接。热失活之后，加入8毫升XhoⅠ缓冲液、1微升XhoⅠ（含80单位）及11微升水，并在37℃下对DNA消化3小时。然后使酶加热失活，使DNA沉淀，随之重新悬浮于5微升TE中，在15℃下用50微升缓冲剂中所含的1单位的T4 DNA连接酶，用3小时使之连接。用2.5微升该混合物用于转化大肠杆菌HB101感受态细胞，用微型制备分析（1.5.9）对苄氨青霉素抗性菌落进行筛选。一个含有位于外显子Ⅳ及Ⅴ之间的转化成一个独特的XhoⅠ位点的BglⅡ位点（该修饰的DNA片段如图3C右部所示）的质粒被分离，并称为RSVuPAB＞X（以下亦称为pB＞X）。

E2.2-RSVuPAP＞S的组建

用PstⅠ部分消化RSVuPA而获得质粒RSVuPAP＞X。限制性条件大约为，在37℃下1小时之后留下50%DNA未劈开，随后将之放大至50微克/50微升消化（0.0625单位/微克），在DNA沉淀之后，在37℃下，50毫升（最终体积）溶液中在10分钟内用2单位T4 DNA聚合酶使5′突出末端钝化。然后，加入5毫克磷酸化 SalⅠ连接子DNA，用2单位T4 DNA连接酶及10%PEG1500于100微升（最终体积）体积中，用16小时进行连接。连接酶被热灭活后，在37℃下，于3小时内，用80单位SalⅠ对DNA进行消化（最终的缓冲剂体积为300微升）。最后将所获DNA对0.75%琼脂糖凝胶进行上柱，并用未消化的及线性质粒DNAs（各为500微克）作为对比。含与线性标记物接近的区带的部分凝胶被切下，进行电洗脱并提纯（1.5.7），然后使之重新悬浮于5毫升TE中，随后于15℃下，在10毫升体积中，在4小时内用2单位T4 DNA连接酶（见Mania-tis等）使之自我连接。用2.5微升对大肠杆菌HB101感受态细胞进行转化，用微型制备分析（1.5.9）对苄氨青霉素抗性菌落进行筛选。含有位于外显子Ⅲ及Ⅳ（该修饰片段示于图3C的左部）之间的PstⅠ位点上的独特SalⅠ位点的质粒被分离，称为质粒RSVu PAP＞S，以下亦称为pP＞S。

E2.3-自RSVuPAB＞X制备NdeⅠ/XhoⅠDNA片段

在37℃下，在3小时内用40微升（最终体积）内所含的40单位NdeⅠ对15微克RSVuPAB＞XDNA进行完全消化。加入5微升含1单位CIP的10X缓冲剂（Maniatis等）的水溶液，使体积增加至50微升。在37℃下用60分钟进行DNA脱磷酸化，用酚∶氯仿抽提一次，沉淀后重新使之悬浮于20毫升TE（见Maniatis等）中。用25微升40单位的XhoⅠ对线性质粒进行完全消化，并在0.75%的制备型胶上分离法（1.5.7）。分离形成的两个区带，按1.5.7所述方法进行电洗脱及提纯，然后重新悬浮于5微升TE中。

E2.4-自RSVuPAP＞S制备NdeⅠ/SalⅠDNA片段

在37℃于60分钟内（40微升，最终体积）用40单位SalⅠ使15微克RSVuPAP＞SDNA消化至完全。加入5微升含1单位CIP的10X缓冲剂的水溶液使反应体积增至50微升，在37℃下于60分钟内 使DNA脱磷酸化，按以前的段落所述进行提纯，在37℃在5小时内，用25微升40单位的NdeⅠ使之消化完全，随后按1.5.7的方法将获得的DNA片段分离并提纯。

E2.5-RSVu    PA-EO的组建

将1微克以上所得的来自RSVu PAP＞S的1.7千碱基对的NdeⅠ/SalⅠ片段与2.5微克来自RSVuPAB＞X的8.6千碱基对的XhoⅠ/NdeⅠ片段，于15℃下，在20毫升2单位连接酶中连接16小时。用5微升该混合物转化大肠杆菌HB101感受态细胞，在这些苄氨青霉素抗性克隆中分离出RSVuPA-EO质粒，其中uPA外显子Ⅳ，经内含子C及D融合而被删去，且其中经相对于Ser9及Asp45的密码子的残基碱基对的融合而产生的一个酪氨酸单元被插入至Pro8及Lys46之间（见图3D，左部）。

E2.6-RSVuPA-E2的组建

将1毫克来自RSVuPAB＞X的2.2千碱基对的NdeⅠ/XhoⅠ片段与2毫克来自RSVuPAP＞S的9.1千碱基对的SalⅠ/NdeⅠ片段在15℃下，加入20微升2单位连接酶进行保温，使之相连接。用微型制备剂分析对用5毫升该混合物转化大肠杆菌HB101感受态细胞而得的苄氨青霉素抗性菌落进行筛选，以分离质粒RSVuPA-E2（其中外显子Ⅳ及侧接内含子部分被重复，且两个类EGF区域被融合密码子而产生的一个苏氨酸相连接（图3D，左部））。

E2.7另一种组建RSVuPA-EO的方法

另一种组建RSVuPA-EO的方法是先用HindⅢ和HhoⅠ对RSVuPAB＞X之类的质粒进行两次消化，以从该质粒中截取外显子Ⅲ和Ⅳ;然后用仅仅包含外显子Ⅲ的HindⅢ-PstⅠ片段取而 代之，其中PstⅠ位点被合适地修饰，而联结到XhoⅠ的末端（参见图14）。简言之，275个碱基对的片段通过下列步骤从质粒p71（图5）中得到：

（1）PstⅠ的完全消化;

（2）用T4    DNA聚合酶修饰其末端，并加入SalⅠ联结子;

（3）经HindⅢ消化和CIP处理后，再用SalⅠ消化;

（4）对片段进行凝胶提纯。

该片段通过下述步骤插入从RSVuPAB＞X所得的载体中;

（1）XhoⅠ消化和CIP处理;

（2）HindⅢ消化;

（3）凝胶提纯。

E2.7.1    含有外显子Ⅲ的275个碱基对片段的制备

在37℃下，400微克质粒p71在350微升缓冲液（参见1.5.1）中用800单位的PstⅠ消化1小时，然后萃取和沉淀出DNA部分（参见1.5.2和1.5.3）。分离出0.69千对碱基片段，并在1.2%琼脂糖制备型凝胶上进行提纯（参见1.5.7）。在37℃下，该片段用T4    DNA聚合酶处理45分钟，然后对酶进行热灭活，并将反应条件调节至在100微升中进行CIP处理的状态（参见1.5.4），接着用11单位的CIP在37℃下对DNA进行30分钟的脱磷酸化处理后，再依次对其进行萃取和沉淀，并在12℃的温度下，将其联结到SalⅠ8个链节的联结子上，处理时间为16小时。此后，在37℃下，DNA部分在200微升缓冲液中用400单位HindⅢ进行HindⅡ消化，时间为30分钟。然后再加入50单位的酶，使反应再继续进行30分钟。接着，对酶进行热灭活，并将反应条件调节至在含有11单位CIP的400毫升缓冲液中的CIP状态后，对DNA在37℃下进行90分钟的脱磷酸化处理。最后，在37℃下，用含有180单位SalⅠ的200微升缓冲液（最终体积）对 DNA消化16小时，所得的275碱基对DNA片段在2%琼脂糖凝胶上进行分离和提纯。

E.2.7.2 从RSVuPAB＞X中制备XhoⅠ-HindⅢ片段

在37℃温度下，50微克RSVuPAB＞X质粒在350微升缓冲液中用200单位的XhoⅠ消化2小时30分钟（参见1.5.1），然后在同样温度下，在800微升缓冲液中用11单位的CIP进行30分钟脱磷酸化处理，接着再在50℃下处理60分钟（参见1.5.4），最后，经萃取和沉淀（参见1.5.2和1.5.3）后，用HindⅢ在37℃下，充分消化1小时。所形成的9.9千对碱基DNA片段用0.8%制备型琼脂糖凝胶法（参见1.5.7）进行分离和提纯。

E2.7.3    RSVuPA-EO-49的组建

按E2.7.1中所述方法制备得到的275个碱基对片段，与按E2.7.2中所述方法制备得到的载体DNA，两者以2∶1的摩尔比，在不同浓度（分别约为600毫微克/毫升和60毫微克/毫升）下进行混合，接着在16℃的温度下，用5单位的T4    DNA连接酶在100微升溶液中连接65小时，然后使DNA部分沉淀析出，并使之再悬浮在20微升水中。从上述溶液中取出等分试样，用于转化大肠杆菌DH5感受态细胞（参见1.5.8）。通过微量制剂（minprep）分析，从耐氨苄青霉素的菌落中选出一种具有预期限制图谱的菌落，称之为RSVuPA-EO-49（参见图14）。

E2.8    GASGAs在哺乳动物细胞中的表达

用磷酸钙沉淀技术使GASGAs表达载体在小鼠LB6细胞中转染，并通过下述方法分析产生GASGAs的克隆：

（1）酪蛋白溶解测定法（参见Piperno-Granelli    and    Reich，J.Exp.Med.148∶223-234，1987），以选出产生PA的克隆，并定量测定在培养基中选出的PA的量;

（2）血纤维蛋白平板法（参见Astrup    T.，Mullertz    S.，Arch.Biochem.Bhiphys.1952，40，346-351）;

（3）IAA法（参见1.6.2），以确定单链PAs与活化的双链PAs的相对量;

（4）受体结合测定法（参见M.P.Stoppelli    et.al.，Proc.Nath.Acad.Sci.USA，82，4939-4943，1985），以验证GASGAs与U937细胞上的uPA相结合的能力，所说的uPA受体被认为与内冬孢子（endotelial）uPA受体相同或非常相似。

E2.8.1    GASGAs表达载体的转化

转化前一天，在补充以青霉素（50单位/毫升）、链霉素（50微克/毫升）、2mM谷氨酰胺、和10%热灭活的小牛胎血清（FCS）的Dulbecco改性Eagle培养基（DMEM，Flow Laboratories Inc.出品）中，将细胞（murine LB6，参见“Corsaro C.M.and Pearson L.M.in Somatic Cell Genetics，7，603，1981）以约104微升/平方厘米的浓度铺展成平板。此后基本上采用磷酸钙-DNA共沉淀法进行转染（Graham and Van der Eb，Virology 52，456，1983）。通过将DNA（在这一情况下，是由GASGAs表达载体（参见上文）和RSV-Neo（参见E1.2）以大致为1∶1的比例混合而成）在2MCo Cl（0.25毫升，系最终体积）中的溶液加到2X HBS缓冲液（137mM NaCl、0.7mM Na2HPO4、21mM HEPES、4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸，pH7.1，共计0.25毫升]中，以制备磷酸钙DNA沉淀。然后将此DNA共沉淀混合物加到上述细胞中。在37℃下停留3小时，从细胞中移去沉淀物，用DMEM（不含小牛胎血清）对细胞洗涤二次，接着加入1.5毫升的15%丙三醇的HBS溶液，再将细胞在37℃下培养1-2分钟后，用DMEM（不含小牛胎血清）洗涤，以除去丙三醇。 此后，用全部DMEM（参见上文有关细胞培养的内容）供以细胞养分，并在37℃下放置约48小时，经非常温和的胰酶消化后，涂敷在平板上，其浓度为每块平板上含有105个细胞（置于含有下列成分的介质中，即DMEM，10%热灭活的ECS，50单位/毫升的青霉素50微克/毫升的链霉素，2mM谷氨酰胺和0.8微克/毫升的G418（Geneticin）]。然后再将细胞培养二至三周左右，并每隔3天更换一次培养基。

E2.8.2    产生GASGAs的克隆之选择

用上述酪蛋白或血纤维蛋白测定法（参见E2.8）选出GASGAs克隆。酪蛋白溶解测定法系用酪蛋白-血纤维蛋白溶酶原-琼脂糖涂复层复盖培养基而进行的，每一块平板的复盖层系按下述方法制备：

（1）0.25毫升不含脂肪的干牛奶[8%W/V（即单位容积中重量百分比），在沸水浴中加热30分钟];

（2）0.50毫升2X    DME培养基;

（3）50微升7.5单位/毫升的血纤维蛋白溶酶原，在0.22微米的过滤器上过滤灭菌;

（4）0.2毫升的5%琼酯糖溶液（经高压灭菌）。

将上述这些组分加到置于48℃水浴内的琼脂糖溶液中，除去培养基后，将其在培养细胞上铺展成层。然后将细胞置于含有5%CO2的增湿培养器中，在37℃下进行培养，经2、4和8小时，分别检查一下不透明层中是否出现透明区。用预先充有约0.5%DME的巴斯德（Pasteur）移液吸管抽吸出显示最高PA活性的克隆，用力搅拌，使其重新悬浮，然后再涂敷在24个井型平板上。然后，使细胞生长至汇合，进行胰酶消化，并取出五分之一在同样类型的培养平板上再铺展成层。48小时后，对上清液进行检测（以下将作较为详细的描述）。

血纤维平板测试系用类似的方法进行，但在100毫米平板上涂敷2.5毫升血纤维蛋白-琼脂糖（参见Astrup    T.，引用的参考文献）在1XDME（参见上文）中的溶液，以此代替以上所列的试剂。

E2.8.3    GASGAs定量测定

a）为了定量测定PA的含量，将GASGAs表达克隆上清液，以及A431细胞（阳性对照物）的上清液与标准浓度的uPA稀释液在酪蛋白-血纤维蛋白溶酶原-琼酯糖平板上进行比较，其中酪蛋白-血纤维蛋白溶酶原-琼脂糖平板系按前面所述的方法制备，但最终的琼酯糖浓度为1.8%，而且每块100毫米平板的用量为5毫升。每隔一定间隔时间打孔，用巴斯德移液吸管抽出。汇集的上清液逐次用缓冲液以1∶2的比例稀释，再从每一稀释度上清液中取出10微升加到平板中。uPA标准溶液先用2倍水配制，然而用2倍DME以1∶1的比例稀释至最终浓度约为4000单位/毫升。所得的溶液用DME以1∶2的比例逐次稀释，从各稀释液中取出10微升加到平板上。将产生GASGAs的克隆分成三个不同的级，通过与标准uPA制剂的系列稀释液作比较，可推知GASGAs的浓度。

b）另外，对G418抗性克隆计数，然后移入24井型微滴板上，在对上清液测定前使之生长至饱和。显示出有效的GASGAs生产水平（大于0.5微克/毫升）的克隆，在补给热灭活小牛血清与10%DMSO的混合物后，以冷冻贮备物的形式贮存在液氮中。以后再使这些细胞克隆，以选出高生产率的细胞，也如上所述的方式进行冷冻贮藏。

使GASGAs产率最高的克隆再进行克隆，并大量培养。用CHO（中国仓鼠卵巢）或鼠的LB6细胞所进行的实验结果示于下表1。

表1

E2.8.4    大批培养

将一只能自动控制浓解氧浓度、pH和温度的4升细胞反应器用来培养按照上述例子所述的方法得到的产率最高的克隆的接种物。培养用的介质是含有5%热灭活的FCS，1mM谷氨酰胺、25单位/毫升青霉素、25微克/毫升链霉素和400微克/毫升的G418的DMEM，或者是一种无血清的配方，以DMEM作为基本组分，补充以白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、胆碱、维生素和微量金属。细胞接种物系在一只150cm的烧瓶内生长，瓶内盛有DMEM及10%热灭活的FCS、2mM谷氨酰胺、50单位/毫升的青霉素、50微克/毫升的链霉素和400微克/毫升的G418，该细胞在Cytodex微型载体（Pharmacia）上进行培养。

细胞达到的最大群体密度为2.5×106个/毫升，在整个培养期间GASGAs被合成，并由已知的方法，如血纤维蛋白测定法或IAA法（参见1.6.2）进行测定。由IAA法测定得的最大浓度达20微克/毫升。

E2.8.5    活化GASGAs的定量测定

为了定量测定地生产GASGAs克隆或生产uPA的A431（细胞（阳性对照物）的培养物中活性双链PAs的相对量，用小鼠单克隆抗体和IAA测试法（1.6.1）对所说培养物的上清液进行测定，该小鼠单克隆抗体能够识别uPA催化结构域或Kringle，而不会干扰酶活性，亦不会结合GFD。

结果表明，双链活化PA的量一般在PA总量的20%-50%的范围内，若将蛋白酶抑制剂加到正在生长的培养物中，则该量小于5%。

E2.9    受体结合测定法

对生产GASGAs的克隆的上清液或A431细胞的上清液，检验其与放射性标记的125I-DFP-UK对U937细胞上的uPA受体的结合进行竞争的能力（Stoppelli M.P.et al.Proc，Natl.Acad.Sci，U.S.A，1985，82，4939-4943）。

如E2.8.2中所述的方法，收集那些分泌类似PA活性物质的克隆，并使之生长至汇合，然后按照上述方法对上清液进行检验。高产率的克隆（见表1）和A431细胞分别在105细胞/毫升的浓度下涂敷成层。采用IAA法，并使用上述E2.8.5中所述的单克隆抗体，测定上清液试样中的PAs浓度。以用于培养物的同样培养基制备1∶2稀释液，以进行受体结合测定，测定方法基本上如Cubellis等人所描述的方法（J.Biolog，Chem261∶15819-15822，1986）。概括地说，每一种稀释液取200微升，用来使1-2×106个937细胞（参见上文）重新悬浮在其内，并在各细胞悬浮液中添加125I-DFP-UK，添加量的活性约相当于20000-80000计数/分（最终的scu-PA浓度为50pM）。

一个典型的实验结果示于图13，它表明，PSVuPA-EO转染克隆的上清液不能与碘化tcu    PA争夺与uPA受体的结合。

E2.10    GASGA-EO产物的纯化

收集在抑肽酶存在下进行生长的生产GASGA-EO的CHO细胞的上清液，并按1.6.5中所述的方法，用免疫色层分离法、离子交换色层分离法和逆相液相色谱法（1.6.3）对GASGA-EO进行提纯（由SDS-PAGE电泳法测得的纯度高于95%）。

E2.11    GASGAs生物化学和免疫特性

提纯后的GASGA-EO在还原和非还原条件（参见1.6.4）下，显示出的表观分子量约为50KD。被血纤维蛋白溶酶活化后（参见1.6.2），经还原的蛋白质是一种双链蛋白质，由一个30KD链和一个20KD链构成，前者的移动方式与tcu PA的B链相同，而后者的移动速率较之tcu PA的A链快。如同预期的那样，用免疫污斑法分析时，在全部的小鼠抗uPA血清条件下，GASGA-EO蛋白质与mAB5B4（识别“Kringle”区）反应，但不与识别GFD区的mABsDC1或CD6反应（参见“制备”）

E2.12    N-末端氨基酸顺序分析

使用一个应用生物系统470型气相蛋白质顺序分析仪完成N-末端氨基酸顺序分析，结果如下：

GASGA-EO    1    5    10

a.a.Ser    Asn    Glu    Leu    His    Gln    Val    Pro    Tyr    Lys    Ser    Lys

uPA    1    5    8（24）    46

GASGA-EO    15    20    24

a.a.Thr-Tyr    Glu    Gly    Asn    Gly？His    Phe    Tyr    Arg    Gly

uPA    50    55    60

数字代表GASGA-EO和uPA顺序，通过密码子被RSVuPA-EO重组体质粒中的外显子Ⅲ和Ⅴ之间共用（参见图3），在uPA中Tyr24被GASGA-EO中的Tyr9取代，而且该Tyr24将外显子Ⅲ（uPA Pro8）上最后一个完全编码的氨基酸与外显子 V（uPA Lys46）上最后一个完全编码的氨基酸相连结。在循环19处的氨基酸身分不确知，因此打有问号。循环14并不表明有任何可检测到的氨基酸存在，而如预期的那样，意味着存在一种Cys残基[除非预先用羰甲基化（carbomethylation）保护，该残基不能被此分析中所用的顺序器检出]。

例E3

用RSV-uPA-BPV载体生产GASGAs

在RSVuPA质粒DNA中，限制核酸内切酶NdeⅠ和ApaⅠ各自仅切割一次（参见图5），第一次在靠近RSV启动区的pBR322衍生区，第二次在靠近uPA多聚腺苷酸位点的SV40区3′处。这两个位点能通过XhoⅠ连接而被修饰，经XhoⅠ消化后，得到一种含有RSV启动区/uPA密码区的片段，后者适合于在含有XhoⅠ位点和/或SalⅠ位点的载体中进行克隆。

E3.1.1 在37℃下，70微克RSV-uPA-DNA用含有420单位NdeⅠ的300微升溶液消化完全，时间为24小时[测定条件：150mM NaCl，10mM三羟基氨基甲烷·盐酸（即Tris·HCl），pH7.8，7mM MgCl2，6mM2-巯基乙醇，100微克/毫升BSA]。经热灭活后，将氯化钠浓度调节罙paⅠ条件（6mM NaCl、6mMTris·HCl pH7.4、6mM MgCl2、6mM2-巯基乙醇、100微克/毫升BSA），在30℃下，DNA在400微升（最终体积）溶液中用160单位的ApaⅠ完全切开，时间为4小时。然后按1.5.3中所述的方法，对DNA进行提纯和沉淀，并使之再溶解在20微升TE中，通过在37℃下用5单位的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ对DNA（最终反应体积为25微升）培养1小时，然后对酶进行热灭活（Maniatis等人，113页）;由此使NdeⅠ突出端充填。

E3.1.2    将如上所得的NaeⅠ/ApaⅠ消化的圆端RSV-uPA 质粒与磷酸化XhoⅠ联结子DNA（摩尔比约1∶15）混合后，在8℃下培养18小时（最终体积为50微升），然后如1.5.5所指出的，用连接酶热灭活。接着，在37℃下，用120单位的XhoⅠ，在200微升溶液中对DNA消化4小时，并对XhoⅠ进行热灭活。

E3.1.3    将以上所得的DNA片段在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁的0.75%琼脂糖凝胶上电泳分离，电泳时间为20小时，电压35伏（详见1.5.7）所得的带在紫外透射照明器上检测，最宽的带相应于8.35千对碱基RSV启动区/uPA密码区片段;而最狭的带相应于2.45千对碱基耐氨苄青霉素的，含有复制源的片段。切出这二个带，并按1.5.7中所述的方法提纯。最狭的带最后用3单位的CIP在37℃下处理30分钟，接着再在56℃下处理30分钟，以后按1.5.2和1.5.3中所述的方法进行提纯和沉淀。将最大和最小的片段大致以1∶4至4∶1范围内的不同摩尔比进行混合，在14℃下连接3小时，从各反应混合物中取出一部分，用于按1.5.8中所述的方法对大肠杆菌DHI感受细胞进行转化。使细菌在含有氨苄青霉素的琼脂平板上生长过夜，对来自分离后菌落的质粒进行分析，查明其是否存在合适的限制片段图谱，选出一种作为质粒p71，其中，置于RSV启动区转译控制下的人类uPA基因，通过用XhoⅠ的切割，使之从其余质粒中切除（图5底部）。

E3.4.1    BPV限制性位点的修饰

通过插入一个单一的XhoⅠ位点，对pBPV230.8（参见图4）在三个不同位点处（分别为BamHⅠ、HindⅢ或SalⅠ）进行修饰，使RSV启动区/uPA密码区（RSVuPA）的插入较为容易。在37℃下，用过量的合适限制酶（BamHⅠ或HindⅢ或SalⅠ）在100微升（最终体积）溶液中，将10微克BPV230.8DNA消化完全，时间3小时。对酶进行热灭活后，按1.5.3中所述的方法提纯 DNA，然后再将其重新溶解在10微升缓冲液中（Maniatis等，113页），接着在37℃下，用5单位的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段处理2小时，使之成为平端。聚合酶经热灭活后，先在37℃和50微升（最终体积）溶液中，用5单位的CIP进行30分钟的脱磷酸化处理，接着再在56℃下处理30分钟。最后，在EGTA存在下，通过加热对酶进行灭活处理，并按1.5.2和1.5.3所述的方法，对DNA进行提纯。向再度溶解的平端线性BPV230.8DNA中加入标记的XhoⅠ联结子DNA（摩尔比为100∶1），在2.5单位T4    DNA连接酶（1.5.4）存在下，在温度为8℃的50微升（最终体积）溶液中连接15小时。在连接酶经热灭活后，含有约1%连接DNA的试样用8单位XhoⅠ消化，在其连接前后，对等分量的DNA进行电泳处理，并按1.5.6中所述的方法进行分析。然后，将盐浓度调节至100mM    NaCl，而pH值调节至7.5左右（Maniatis    et    al，pag.104    and    Biochemicals    for    Molecular    Biology;Boehringer    Mannheim，Munich    1985），在37℃的200微升溶液中，全部用DNA用XhoⅠ切割，时间为1小时，然后将其载在0.6%琼脂糖凝胶上，进行电泳处理，切出相应于线状质粒的带，然后按1.5.7中所述的方法进行电洗脱和提纯。通过连接使线性DNA自行对合，并用于转化感受态大肠杆菌DH5细胞（BRL）（参见1.5.8）。在含有氨苄青霉素的琼脂平板上培养过液的分离菌落中的质粒用微量制剂分析法（参见1.5.9）筛选，以检查其内是否存在新的XhoⅠ位点。由此得到下述pBPV230.8衍生质粒（图6中间）：

（1）pBB，其中XhoⅠ位点系在BamHⅠ位置处产生，两侧翼与两个BamHⅠ位点相接;

（2）pBS，其中XhoⅠ位点系在SalⅠ位置处产生，两侧翼与两个SalⅠ位点相接;

（3）pBH，其中XhoⅠ位点系在Hind笪恢么Σ?

E3.1.5 在一系列不同的实验中，各取50微克的pBB DNA、pBH DNA和pBS DNA，在37℃和50微升溶液中用过量XhoⅠ（在pBS的情况下用SalⅠ）消化至完全，时间2小时，然后对酶进行热灭活，用浓缓冲液（参见1.5.1）按要求调整反应条件，使反应体积增加一倍，接着再按1.5.4中所述的方法，用1单位CIP对线性质粒DNA进行脱磷酸化处理。酶经热灭活后，将DNA载在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的0.6%琼酯糖凝胶上，在30伏下电泳16小时。按1.5.7中所述的方法，对相应于单节显性的线性质粒的主要DNA带进行电洗脱、提纯后，再进行溶解。同样，50微克p71质粒DNA用80单位XhoⅠ消化至完全，对酶进行热灭活，然后将混合物载在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的0.6%琼脂糖凝胶上，在30伏下电泳16小时。具有8.35千对碱基带的凝胶部分含有RSV启动区/uPA密码区结构，按1.5.7中所述方法对该凝胶部分进行电洗脱和提纯后，再予以溶解。将BPV载体DNA（图6中间）和插入体DNA（图5底部）以2∶1至1∶4范围内比例进行混合，接着在150℃和DNA浓度大致为0.2微克/微升的条件下，用2单位的T4 DNA连接酶样品进行连接，时间24小时。用缓冲液对反应介质进行调节，连接的DNA在37℃和15微升（最终体积）溶液中，用20单位的XbaⅠ消化1小时（测定条件：50mM NaCl、6mM Tris-HCl pH7.9、6mM MgCl2、100微克/毫升BSA）粒。此种酶不切割RSV/uPA结构，仅对BPV230.8衍生载体切割一次。XbaⅠ经热灭活后，所得的DNA混合物用水稀释1-5倍，加入10X连结缓冲液，然后在14℃下用2.5单位的T4 DNA连接酶培养2小时。从各反应实验中取出5微升样品，用于转化大肠杆菌DH5感受态细胞（参见1.5.8）。这些细菌在 37℃的温度下，在含有氨苄青霉素的琼脂板上生长过夜，所产生的菌落样品用微量制剂分析法（参见1.5.9）进行分析。最后，选出具有合适限制图谱的分离出来的菌落（参见1.5.9，图6底部）。

E3.2    在BPV衍生的表达载体中uPA转录单元的修饰

在含有uPA ORF的7.3千对碱基的SmaⅠ片段中，限制酶BssHⅠ和SacⅠ仅仅切割一次，每一次切割分别在nt413处产生一个5′突出端，而在nt4344处产生一个3′突出端。该片端包含uPA的GED密码区，而在RSVuPA衍生GASGAs质粒（参见图3）中的相应片段含有GFD0和GFD2区。

因此，所有BPV载体中的BssHⅠ/SacⅠ片段均被RSVuPA-EO或RSVuPA-E2中的BssHⅠ/SacⅠ片段取代，由此得到：

（1）具有外显子Ⅳ-缺失ORF的EO系列的载体;

（2）具有外显子Ⅳ-重复ORF的E2系列载体;

概括地说，上述两种系列的制备方法如下：

（a）来自RSVuPA-EO或RSVuPA-E2中的DNA，先用BssHⅠ完全消化后，用CIP处理，接着再用SacⅠ完全消化，而最小的DNA片段在凝胶上进行提纯;

（b）来自BPV衍生uPA表达载体的DNA，先用SacⅠ进行类似的完全消化，然后用CIP处理，接着再用BssHⅠ完全消化，而最大的片段在凝胶上进行提纯;

（c）将外显子Ⅳ-缺失BssHⅠ/SacⅠ片段或外显子Ⅳ-复制BssHⅠ/SacⅠ片段插在以上所得的每个游离基因载体DNAs中。

E3.2.1制备“EO”或“E2”BssHⅠ/SacⅠ盒

将50微克取自RSVuPA-EO或RSVuPA-E2（参见图 3）的质粒DNA，在37℃和75微升（最终体积）溶液中，用64单位的BssHⅠ消化至完全（消化2小时）。然后对酶进行热灭活，并在150微升（最终体积）溶液中用2.5单位的CIP对DNA进行脱磷酸反应。接着用酚/氯仿对DNA进行提纯（参见1.5.2），经沉淀（参见1.5.3）后，使之再悬浮在100微升缓冲液中，并在37℃下用80单位的SacⅠ消化3小时。由此分别得到含有“EO”盒的片段或含有“E2”盒的片段，以后再在琼脂糖凝胶（参见1.5.8）上提纯。

E3.2.2    BssHⅠ/SacⅠBPV-衍生载体

框架（frame）的制备

取自各个pBPV230.8衍生物uPA表达载体（参见图6底部）的20微克DNA，在37℃和50微升溶液（最终体积）中用40单位的SacⅠ完全消化，时间3小时，然后对酶进行热灭活，接着在100微升（最终体积）溶液中用2单位CIP（参见1.5.4）进行脱磷酸化处理。经萃取和沉淀（参见1.5.2，1.5.3）后，将DNA再溶解在100微升缓冲液中，并在37℃下用40单位的BssHⅠ消化2小时。琼脂糖凝胶（参见1.5.8）上分离出在含有BssHⅠ/SacⅠ    EGF的区中缺失的最大片段。

E3.2.3“ED”或“E2”盒在BPV/RSV/uPA

框架中的插入

这种方法用于在BPV衍生uPA表达载体中产生GFD0（“0”）或GFD2（“2”）系列：

（a）含有如上所述方法（参见E3.2.1）制备的GFD0或GFD2盒的1微克BssHⅠ胶磷酸的/SacⅠDNA片段，在15℃和20微升溶液（最终体积）中，用2单位DNA连接酶使之连结到含有BPV/RSV/uPA框架（参见E3.2.2）的4微克ScaⅠ脱磷酸的/BssHⅠ载体DNA上，反应时间为16小时;

（b）将5微升上述混合物用于转化DH5大肠杆菌感受态细胞;

（c）用微量制剂分析法（参见1.5.9）筛选耐氨苄青霉素的菌落，并分离出显示预期限制图谱的质粒。

从产生pBPV230.8-衍生scu-PA的各质粒（图7A）系列开始，重复上述方法，由此得到二个系列的BPV-衍生GASGA表达载体：

（1）系列“0”，其中至少一部分EGF状的结构域已被删除（后缀EO，参见图7B）;

（2）系列“2”，其中大部分EGF状结构域已被复制（后缀E2，参见呼7C）。

E3.3    GASGA产物的表达和分析

上述所得的BPV衍生GASGA表达载体在LB6小鼠细胞或CHO细胞（参见E1.4）中用RSV-Neo并发转染（cotransfected）选出G418抗性克隆，并按E2.8中所述的方法进行分析。所得蛋白质的PA酶性能，免疫特性、以及uPA受体结合性能反映了用RSVuPA-EO和RSVuPA-E2（参见上文）所得的蛋白质的有关性能。

例E4

人类uPA启动区的改性衍生物的组建

E4.1    pu    PA2质粒的组建

按E0.3中所述方法制备的50微克λ-uPA1    DNA，在30℃和100微升（最终体积）溶液中，并有合适缓冲液的情况下，用30单位的SmaⅠ消化60分钟。所得的DNA中取出500毫微克，在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的1%琼脂糖凝胶上进行分析，而将余下的DNA贮存在-20℃温度下。然后在68℃下对酶进行热灭活（10分钟），并将所产生的DNA制剂载在含有溴化3，8-二氨基-5- 乙基-6-苯基菲啶鎓的0.8%制备型琼酯糖凝胶上。电泳分离系在50伏和TBE缓冲液（Maniatis    et    al，ch.5）中进行20小时，然后在中等长度的紫外透射照明器上用肉眼观察DNA带。切出含有前uPA启动区的约2.38千对碱基的带，并按1.5.7中所述的方法，对DNA进行电洗脱和提纯。50微克pEMBL8    CAT    DNA（图8）在30℃下，用含有30单位SmaⅠ的25微升（最终体积）溶液同样地消化1小时。然后加入64微升水、10微升CIP10X缓冲液和含有1单位CIP的1微升（最终体积）溶液，再将反应混合物在37℃下培养60分钟。按照1.5.4中所述的方法加入EGTA和加热，以对CIP灭活，然后在1.5.7中所述的同样条件下，在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的0.8%琼脂糖凝胶上对DNA进行提纯。此后将1.5微克的2.38千对碱基λ-uPA1衍生片段和如上制备的500毫微克线状脱磷酸的pEMBL8    CAT    DNA混合在一起，在14℃的温度下，在含有10%PEG和2单位T4    DNA连接酶的20微升合适缓冲液中进行连接，时间为20小时。然后按1.5.8中所述的方法，将5微升上述反应混合液用于转化感受态HB101大肠杆菌细胞。分析耐氨苄青霉素的菌落，在含有合适定位插入体的菌落中，选出一种，称之为puPA2（图8的右边）。

E4.2puPA2/41质粒的组建

用下述方式来研究用于获得上述制备的SmaⅠ部分消化的线状puPA2    DNA的最佳条件：即在10微升（最终体积）合适的缓冲液中，分别用1.0、2.0、3.0和4.0单位的SmaⅠ消化250毫微克的此种质粒。各反应混合物中取出50%的量（体积比），将其转移至不同的试管内，在30℃下反应6分钟后，置于干冰/乙醇浴中冷冻，而其余部分再培养9分钟后，进行冷冻。然后，每一种冷冻试样用EDTA配制成10mM的浓度，酶经热灭活后，在含有溴化3，8-二氨 基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的1%琼脂糖小型凝胶上对DNA进行分析。用2单位的上述物质培养15分钟，和用3单位的该物质培养6分钟，可获得良好结果。然后，以如下方式产生制备型消化：5微克puPA2    DNA在50微升合适的缓冲液中用50单位的SmaⅠ消化，然后加入1微升500mM    EDTA和冷冻，使反应终止。对所加的酶进行热灭活后，将此种puPA2    DNA制剂与2.25微克XhoⅠ联接子混合，然后按1.5.6中所述的方法进行磷酸化处理，接着再在含有10%PEG1500和2.5单位T4    DNA连接酶的86微升反应混合物中进行连接，先在7℃下培养6小时，然后慢慢地将温度增加到17℃，并再培养10小时。10%的连接DNA在37℃下，用含有55单位XhoⅠ的20微升，（最终体积）溶液消化2小时，对酶进行热灭活后，按1.5.3中所示的方法沉淀DNA。将沉淀出的DNA再溶解于4微升TE（Maniatis等）中，加入1微升含有1单位T4    DNA连接酶的5X连接缓冲液（Maniatis等），将混合物在15℃下放置2小时30分钟，使其自行连结，然后用来转化HB101感受态大肠杆菌细胞（参见1.5.8）。用微型制剂分析法筛选耐氨苄青霉素的菌落。其中一种菌落称为puPA2/41，它具有SmaⅠ位点，该位点与含有2.38千对碱基插入体的uPA启动区的5′末端的一侧翼相接，转化成XhoⅠ位点（图10）。

E4.3    CAT分析

对puPA2及其衍生物puPA2/41和RSV-CAT引起CAT基因转录的能力进行测试。质粒DNAs被转染到人类A1251细胞系（参见1.1）中，后者是通过磷酸钙沉淀法，从肾癌细胞（Stoppelli    M.P.，Verde    P.，Grimaldi    G.，Locatelli    E.K.，Blasi    F.，J.Cell    Biol.1986，102，1231-1241）衍生得到，经64±4小时后，测定转染细胞中可能产生的CAT蛋白质的量。 E4.3.1    质粒DNA的提纯

采用文献“Birnboim H.C.and Doly J.1979，Nucleic Acid Res.7，1513”（在Maniatis等人著作的第90页中也作了报道）中所述的碱溶解法，从各细菌克隆培养过夜的400毫升LB液体培养物中提纯质粒DNAs。由此得到的质粒DNA在溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓氯化铯梯度上提纯2次，通过刺孔法收集含有质粒DNA的带，并用含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的异戊醇（参见Maniatis等，93-94页）充分萃取。然后以1∶4的比例，用水稀释含有DNA的CsCl水溶液，接着加入0.1倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）和3倍体积的乙醇，以沉淀出DNA。将上述混合的在-20℃下放置30分钟后，在4℃和10000XG的条件下，旋转15分钟，将DNA部分甩下，再相继用70%乙醇和100%乙醇分别洗涤一次，干燥后再继续溶解在2毫升TE中，并以同样的方法再进行沉淀和洗涤，最后使之再溶解在1毫升TE（参见Maniatis等人的文献）中。测定光密度260（O.D.260），将浓度调节至500毫微克/微升左右，然后在小型凝胶上检验，并再用分光光度测定法进行测定。最后，用无水乙醇以1∶1的稀释比将质粒DNAs稀释，并贮存在-20℃的温度下。

E4.3.2    用磷酸钙法沉淀

每只欲被转染的60毫米陪替氏培养皿上盛有40微升DNA乙醇/TE溶液（相当于10微克DNA），使之在Savant真空离心机中干燥后，再溶于220微升水中。然后加入30微升2MCa Cl2（Mallinkrodt or Merck出品），并进行快速混合。另外，将250微升的2XHBS[10克/升HEPES，4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸，16克/升 NaCl，pH7.1±0.05，无菌]与5微升的100XPO4（70mM Na2HPO4和70mMNa H2PO4，无菌）进行混合后，慢 慢地滴加DNA/CaCl2溶液，同时用巴斯德（Pasteur）移液吸管充分鼓泡。此后将该混合物在室温下放置30分钟（Graham and Van der Eb，Virology，52，456;1984）。

E4.3.3    A1251细胞的转染

在37℃和5%CO2增湿培养箱中，使A1251细胞在完全培养基[DNA培养基（Gibco），并在该培养基中补充10%的小牛胎血清（Hyclone）和1%抗菌素溶液（Gibco）]中生长至接近汇合。在转染前24小时，使细胞在60毫米陪替氏培养皿（每只培养皿有105个细胞）中裂解，在转染前4至6小时，再供给新鲜培养基。在t0时，加入沉淀DNA，并使混合物在培养器中放置16-18小时。培养过夜后，细胞用DME（参见7.2）洗涤一次，然后再补充以完全培养基，并使其留在培养器中，直至培养完毕，予以收集。在实验中，一式三份进行试验，对于每一份试样来说，干燥的DNA溶解后的所有步骤均分开进行。所得细胞用于以后步骤中。

E4.3.4    细胞溶解产物的制备

加入沉淀DNA后的64±4小时，细胞（在E3.3.3中制备的）用无Ca++的磷酸盐-缓冲盐水（PBS）（1升蒸馏水中含有80克NaCl、2克KCl、11.5克NaHPO4·2H2O、2克KH2PO4，pH调节至7.2）洗涤三次，然后加入1毫升STE（100mM NaCl、10mMTris、1mM EDTA），并使混合物在室温下放置5分钟。此后用橡皮淀帚刮下细胞，并将其放在Eppendorf管中，在4℃，置于微型离心机中旋转3分钟，将其甩至底部，然后再悬浮在pH值为7.8的100微升250mM的三羟甲基氨基甲烷中。细胞悬浮液在干冰/乙醇浴中放置15分钟后，移入37℃水浴中;这一冻结/融化循环重复二次后，在4℃下，置于微型离心机中旋转5分钟，使细胞核甩至底部，而上清液则移入一只新试管中。为了克服因板与板之间细胞数可 能出现的微小差异而引起的各试样中蛋白质含量的微小差异，按照Lowry法（参见E1.6），对各试样中取出的10微升溶液进行测定，以确定蛋白质浓度。溶解产物的其余部分被贮存在-20℃温度下，直至用于CAT测定。

E4.3.5    CAT测定

来自各溶解产物的100微克蛋白质，用水稀释至133.5微升的体积，然后加入44微升含有下列成份的预先混合好的溶液，这些成份是22.5微升2M三羟甲基氨基甲烷（pH7.8）、20微升新鲜配制的3毫克/毫升乙酰Co A（acetylc Co A）（Sigma）和1.5微升放射性14C-氯霉素（50-60毫居/毫摩尔，Amersham出品）。上述混合物在37℃下培养1小时后，加入1毫升乙酸乙酯和进行旋转，使反应终止。由此形成的二相在Fppendorf微型离心机中分离（5分钟）后，将有机相移入一只新的Eppendorf试管中，在Savant真空离心机中干燥后，再溶于20微升乙酸乙酯中，并在0.25-1毫米硅胶板（Kodak）上用（TLC）薄层层析测定。用氯仿-甲醇（HPLC级，二者之比为95∶5）作为流动相，进行色层分离2-3小时，相应于标记抗菌素的放射性斑点通过放射性自显影仪进行显象。切出相应于放射性斑点的色层分离谱的区域，置于盛有5毫升诸如Econofluor（New Egland Nuclear）之类的合适闪烁溶液的小玻璃瓶中，在β计数器中测定放射性。结果表示表2中（参见E4.4.3）。

E4.4.1    质粒puPA2/17的组建

在37℃和合适的缓冲液（100mM NaCl、10mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸（pH7.5）、10mM MgCl2、10mM2-巯基乙醇、100微克/毫升的BSA）中，300毫微克puPA2/41 DNA（参见3.2）中，用4.2单位的OxaNⅠ完全消化，时间为4小时。在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的小型凝胶（参见1.5.1）上检 验DNA限制，通过加热，在68℃温度下，对酶进行10分钟的热灭活。然后加入2微升水、1.5微升10X缓冲液和1.5微升的T4    DNA连接酶，并将混合物在15℃下培养18小时。将2.5微升此种混合物用于转化大肠杆菌HB101感受态细胞（参见1.5.8）。用微量制剂分析（参见1.5.9）对耐氨苄青霉素的菌落进行分析。选出具有合适限制图谱的菌落，其中之一称为puPA2/17（参见图10）。

E4.4.2    质粒puPA2/254的组建

在37℃和10微升合适的缓冲液（Maniatis等）中，4微克puPA2/41    DNA（参见图10）用5单位EcoRV消化完全，时间2小时，然后加入由7微升水、2微升10X缓冲液和含有1单位CIP的1微升缓冲液（Manitis等）槌傻幕旌弦骸Ｉ鲜龌旌衔镌?7℃下培养1小时后，加入EGTA至最终浓度为10mM，并使该混合物在68℃下再培养45分钟。按1.5.3所述的方法，使DNA沉淀析出，并进行洗涤和干燥，最后再使之溶解在7.5微升TE（Maniatis等）中。在37℃下，用4.2单位DxaNⅠ在10微升（最终体积）溶液中对DNA进行完全消化，时间4小时，然后在37℃下，用1单位DNAPolⅠ的Klenow片段（20微升，最终体积）处理1小时，以充填5′末端。然后沉淀出DNA（参见1.5.3），并使之再悬浮在7.5微升的TE（参见Maniatis等人的文献）中。接着加入0.5微升的100mMATP、1微升10X缓冲液（参见Maniatis等人的文献）和2.5单位的T4    DNA连接酶（1微升），将混合物在15℃下培养18小时。然后用2.5微升此种混合物来转化大肠杆菌HB101感受态细胞（参见1.5.8），并将细菌涂敷在含有氨苄青霉素的LB平板（参见Maniatis等人的文献）上。选出具有合适限制图谱的菌落，其中之一般称之为puPA2/254（参见图10）。

E4.4.3    CAT分析

对puPA2/41及其缺失衍生物puPA2/17，以及puPA2/254和RSV-CAT检验其促使CAT基因转录的能力。用磷酸钙沉淀技术，使质粒DNA在A1251和Heka细胞系（参见1.1）中进行转染，64±4小时后，测定CAT的胞内浓度。基本上按E3.3中所述的方法，对质粒DNA依次进行提纯、磷酸钙沉淀、细胞转染、细胞溶解产物制备，以及CAT测定。结果示于表2。

表2

Al251    Hela

RSV-CAT    100    100

puPA2/41    128    32.3

puPA2/17    303.8    74.3

puPA2/254    378.5    174.3

E4.5    uPA衍生物表达载体的组建

可从质粒puPA2/41、puPA2/17和puPA2/254中切出细菌CAT基因，以将它们用作表达载体。饰变将优先保存uPA启动区衍生顺序、uPATATA箱（box）、mRNA起始点和pEMBL8衍生多联结子。包括这些区的DNA片段可从载体中切除，插入不同基因的上游，作为“表达盒”。从上述质粒中切除细菌CAT基因，由此得到三种uPA衍生表达载体，即：来自puPA2/41的pPP41，来自puPA2/17的pPP17，以及来自puPA2/254的pPP254。

E4.5.1    pPP41的组建

在37℃下，25微克的puPA2/41    DNA用4单位的XbaⅠ进行部分消化，时间45分钟，加入EDTA（达到50mM）使反应终止，然后进行热灭活。沉淀后（参见1.5.3），在37℃下，用2.5单位DNA    PolⅠ的Klenow片段（最终体积为20微升）处理1小时，以 充填DNA。然后在8℃下，用2单位连接酶处理16小时，使DNA连接到50摩尔过量的SalⅠ联结子（参见1.5.5和1.5.6）上，对酶进行热灭活后，在37℃下用过量SalⅠ完全消化2小时。在0.75琼脂糖凝胶（参见1.5.7）上处理DNA片段，切出含有5-6千对碱基范围内的DNA片段的凝胶部分。然后按1.5.7中所述的方法，对这部分DNA进行萃取和提纯，并使之再悬浮在10微升TE中，接着在16℃下，用2单位连结酶（最终体积为10微升）使上述2微升溶液自行连接4小时。然后，将2.5微升的此种DNA制剂用于转化DH5大肠杆菌感受态细胞（参见1.5.8-1.5.9）。通过微量制剂分析，在耐氨苄青霉素的菌落中，选出质粒pPP41，亦即这是一种具有包含在多联结子的SalⅠ位点和缺失CAT基因下游XbaⅠ位点之间区域的质粒（图11B）。

E4.5.2    pPP/17和pPP254的组建

大致按照以上所述的方法，在37℃下，用24单位的XbaⅠ分别将10微克puPA2/17    DNA或10微克puPA2/254    DNA完全消化2小时，由此得到二种表达载体。在37℃下，用DNAPolⅠ（2.5单位）的Klenow片段充填线状质粒的5′突出端，处理时间为1小时，然后在8℃下，用2单位连结酶使之连结到50摩尔的过量SalⅠ联结子（参见1.5.5和1.5.6）上，处理时间为16小时，对酶进行热灭活后，在37℃下，用过量SalⅠ对DNA完全消化2小时。然后再对酶进行热灭活，沉淀出DNA（参见1.5.3）后，再使之悬浮在10微升TE中。2微升此种DNA溶液在15℃下，用2单位DNA连接酶（最终体积为10微升）连结16小时，然后用2.5微升该溶液转化DH5大肠杆菌感受态细胞。在耐氨苄青霉素的菌落中，选出质粒pPP17和pPP254，这两种质粒携带uPA衍生缺失启动区，并具有对E4.5.1中pPP41（图11B）所述的相同的一般特性。

例E5

E5    用uPA衍生GFD改性小基因生产GASGAs

E5.1    提纯含有uPA的SmaⅠ片段

如E1.1（参见图1）所述，从λ-uPA1相得到一种含有uPA密码区的7.3千碱基对的SmaⅠ片段。

E5.2    载体DNA的制备

在25℃下，用50单位的SmaⅠ分别消化pPP41XS、pPP17XS和pPP254XS（最终体积为50微升），以得到相应的质粒DNA各20微克，然后，在37℃下，用1单位CIP对线状质粒进行1小时的脱磷酸化处理（最终体积为150微升），接着再按1.5.3中所述的方法，在0.8%琼脂糖凝胶上进行凝胶提纯。将分离出的DNA制剂再悬浮在20微升TE中，并贮存在4℃温度下。

E5.3    uPA衍生小基因的组建

将以上得到的每一种线状脱磷酸质粒DNA（参见E5.1）（3微克）与1微克uPA-ORF（亦即如E1.1中所述方法得到的含有7.3千对碱基的uPA密码区的SmaⅠ片段）混合，并在15℃下，在10%PEG1500中用2单位连接酶（最终体积为10微升）处理16小时。

从每一种反应混合物中取出2.5微升，用于转化感受态大肠杆菌DH5细胞（参见1.5.8）。用微量制剂分析法（参见1.5.9），在耐氨苄青霉素的菌落中，选出质粒pPP41XS、pPP17XS和pPP254XS，它分别从pPP41、pPP17和pPP254中衍生得到，并具有下述特性（参见图11C）：

（1）uPA密码区被插入至含有uPA启动区的载体中的SmaⅠ位点;

（2）uPA信使RNA起始位点与人类uPA基因相同;

（3）它含有一种pEMBL8衍生顺序;

（4）通过用XhaⅠ和SalⅠ消化，uPA衍生小基因能从载体中切除，并插入不同载体中;

（5）切除的小基因能被插入具有SalⅠ或XhoⅠ位点的载体中;

（6）切除的小基因能被插入载体中，当插入合适的宿主时，则能使它们保持附加体的形状;

（7）pPP41XS具有处在来自uPA启动区的一个2.35千对碱基片段控制下的uPA密码区;

（8）pPP17X具有处在与包含在pPP41XS是相同的启动区片段控制下的uPA密码区，但其中在两个OxaNⅠ位点之间已产生了缺失;

（9）pPP254XS具有处在与包含在pPP41XS中相同的启动区片段控制下的uPA密码区，但在5′OxaNⅠ位点和EcoRⅤ位点之间已产生缺失。

E5.4    GASGAs表达小基因的组建

基本上按照实施例E3中所述的产生表达BPV衍生质粒的GASGAs的方法，以进行在pPP衍生表达载体中含有从外显子Ⅱ至内含子J（参见图3A）的uPA    ORF的BssHⅠ/SacⅠDNA片段的取代。

E5.4.1    载体DNA的提纯

按E3.4.3中所述的方法，对来自质粒pPP41XS、pPP17XS或pPP254XS的20微克DNA依次用SacⅠ消化，用CIP处理，以及用BssHⅠ限制。含有pEMBL8区，uPA启动区的载体架（Vector    frame）或其衍生物，以及uPA    ORF的5′和3′末端（参见图12A）均在琼脂糖凝胶（参见1.5.8）上进行提纯，并使DNA片段再次悬浮在10微升TE中。

E5.4.2    插入体DNA的提纯

按E3.4.1中所述的方法，对来自质粒RSVuPA-EO或质粒RSVuPA-E2的50微克DNA依次用BssHⅠ消化，用CIP脱磷酸化处理，以及用SacⅠ限制。将含“EO”或“E2”密码区的两种片段在琼脂糖凝胶（参见1.5.8）上提纯后，再使之悬浮在20微升TE中。

E5.4.3    GASGSs表达小基因的组建

对于每一种衍生质粒均采用下述相同的方法：

（a）将载体DNA（按E5.4.1中所述的方法制备）与插入体DNA（按E5.4.2中所述的方法制备）以1∶2的摩尔比进行混合（10微升的最终体积中含有0.3微克DNA），并在16℃下，用2单位的T4    DNA连接酶连接16小时;

（b）从以上所得的各混合物中取出2.5微升，用于转化DH5大肠杆菌感受态细胞（参见1.5.8）;

（c）分析耐氨苄青霉素菌落中（参见1.5.9）是否具有BssHⅠ/SacⅠ插入体，得到各由3种质粒组成的二个系列（图12B和12C）。

E5.5    GASGA产物有表达和分析

按上述方式所得的uPA小基因衍生GASGA表达载体在LB6小鼠细胞和CHO细胞中用RSV-Neo并发转染，并按E2.8中所述的方法选出耐G418的克隆，并进行分析。

PA酶性质、免疫特性和uPA受体结合性质均类似于用RSVuPA-EO和RSVuPA-E2所得产物的性质。

例E6

间断的GASGAs的产生

E6.1    限制位点饰变：部分消化

质粒RSVuPA具有两个XcaⅠ位点，第一个位点在pBR 322衍生的耐氨苄青霉素基因中，而第二位点在GFD中，后者系包含在uPA基因的外显子Ⅳ中（参见图2）。

为找出使RSVuPA线性化的最佳条件，特进行下述试验：在37℃下，用ScaⅠ在10微升缓冲液中对100毫微克质粒消化1小时（参见1.5.1）。酶的添加量在10单位-0.3单位的范围内。结果表明，对于100毫微克质粒，用5单位或2.5单位的ScaⅠ消化可获得最佳结果。在上这二种浓度下，将反应按比例扩大至1微克，加入EDTA，使最终浓度达到10mM，汇集反应混合物，萃取和沉淀出DNA（参见1.5.2和1.5.3）。在20微升缓冲液（最终体积）中，用5单位的T4    DNA连接酶（参见1.5.5），以质粒与联结子的摩尔比为1∶100的条件下，将质粒DNA连结到8链节的脱磷酸KpnⅠ/Asp718联结子（参见1.5.6）（Boehringer;CGGTACCG顺序）上，处理时间48小时。然后对酶进行热灭活，接着在400微升缓冲液中，用360单位的Asp718（参见1.5.1）消化DNA，沉淀（参见1.5.3）后，将其载在0.8%制备电泳凝胶上，电压40V，处理时间16小时。按1.5.7中所述的方法，对相应于质粒线性大小（10.8千对碱基）的DNA色带进行电洗脱和提纯后，在小型凝胶上进行定量测定，然后取出50毫微克，在24微升缓冲液中，用2.5单位连接酶使其自行连接，沉淀后，用于转化100微升感受大肠杆菌DH5细胞（参见1.5.8）。在耐氨苄青霉素的克隆中，选出具有预期限制图谱的克隆，称之为RSV-G-Asp（参见图15）。

为了获得间断GASGAs，按照下述对于质粒RSV-uPA-Tet-Asp（图6.2）所述的方法，通过完全充填Asp718位点（如E6.3.1中所述的方法），或使之成圆头（blunting）后（如E6.3.2中所述）再进行部分充填，由此得到两种载体表达的GASGAs产物，这些产物相当于用表达RSV-SVRTD（参见E6.3.1）或 RSV-SAD（参见E6.3.2）可得到的物质。

E6.2    限制位点饰变：全部消化

为了获得一种携带独特ScaⅠ位点的质粒，通过下述方式，用氨苄青霉素抗性来代替四环素抗性（参见图16）：

（1）删除pBR322中的大部分抗氨苄青霉素的基因，得到AsmS，TetR质粒pBR13Tet;

（2）用来自缺失pBR322的NdeⅠ-PvuⅡ片段替代RSVuPA中的HpaⅠ-NdeⅠ片段。

在所得的质粒中，ScaⅠ位点仅仅存在于外显子Ⅳ的uPA密码区，并通过一些联结子的插入而发生突变。

E6.2.1    缺失pBR322（pBR13    Tet）的组建

在37℃和50微升缓冲液（最终体积）中，用10个单位的PstⅠ（参见1.5.1）对100毫微克的pBR322    DNA消化1小时，然后对酶进行热灭活，并将反应条件调节至在37℃的400微升缓冲液（最终体积）的状态，用50单位HindⅢ消化，消化时间为1小时。对DNA部分进行萃取和沉淀（参见1.5.2和1.5.3）后，再进行溶解，并用在37℃下，用4单位的T4    DNA聚合酶（参见Maniatis等人的文献）使之成为圆端，处理时间为30分钟。经萃取和沉淀后，用2.5单位的T4    DNA连接酶（最终体积为100微升）使DNA自行连接，再经沉淀后，用于转化大肠杆菌DH5感受态细胞。通过微量制剂分析，从四环素阳性菌落中选出一种具有正确限制图谱的菌落，称之为pBR13Tet（图16b）。

E6.2.2 AmpR对TetR的取代

a）在37℃下，用12单位的NdeⅠ在50微升缓冲液（最终体积）中对2微克pBR13Tet消化1小时，然后将反应条件调整至在37℃和200微升溶液中，用2单位CIP处理的状态（参见1.5.4），处理时 间为30分钟，加入EGTA，使之最终浓度为10mM，DNA部分经萃取、沉淀后，在37℃和100微升缓冲液（最终体积）中，用20单位的PvuⅡ消化1小时，再经萃取和沉淀后，最终使之再溶解在10微升TE中。

b）在37℃下，20微克RSVuPA在150微升溶液中，用100单位的HpaⅠ消化1小时后，将反应条件调至在37℃和300微升缓冲液中，用22单位CIP处理（参见1.5.4）的状态，处理时间为30分钟，加入EGTA，使之最终浓度为10mM，DNA部经萃取、沉淀后，在37℃和200微升溶液中，用60单位NdeⅠ消化1小时，再经萃取和沉淀后，最终使之再溶于20微升TE中。

c）将不同量的消化RSVuPA（参见E4.4b）加到2.5微升限制pBR13Tet（参见E4.4a）中，使之摩尔比为1∶1，1∶2和1∶4，以进行三种不同的连结反应（参见1.5.5）。在50微升缓冲液中，用5单位的T4    DNA连接酶进行连接，反应过夜。对酶进行热灭活后，沉淀出DNA部分，并使之再溶解在10微升水中，将5微升此种混合物用于转化大肠杆菌DH5感受态细胞。用微用制剂分析法，在四环素阳性菌落中选出一种具有正确限制图谱的菌落，称之为RSVuPA-Tet（图16d）。

E6.2.3    ScaⅠ位点的饰变

在37℃和200微升溶液中，将1微克RSVuPA-Tet用100单位ScaⅠ完全消化3小时（参见1.5.1）。对DNA进行萃取和沉淀后，使之再溶解在20微升TE中（参见1.5.2和1.5.3）。在另外的反应器中，使由此得到的2微升线状RSVuPA-Tet连接到50摩尔过量的下列联结子中，这些联结子不含有处理前存在于质粒中的任何位点，所说的联结子为：

（1）Asp718    8个链节（CGGTACCG顺序，由 Boehringer提供）;

（2）ClaⅠ8个链节（CATCGATG顺序，由New    England    Biolabs提供）;

（3）XhoⅠ8个链节（CCTCGAGG顺序，由New    England    Biolabs提供）。

按1.5.5所述的方法，在10微升缓冲液中，用12单位T4    DNA接酶进行连接反应，萃取和沉淀出DNA部分后，使之在37℃下，重新溶解在分别含有360单位Asp718、200单位ClaⅠ或240单位XhoⅠ的300微升合适的缓冲液中，处理时间为16小时。对三种反应混合物中的DNA部分分别进行萃取、沉淀，并在100微升缓冲液中，用1单位连结酶使DNA自行对合16小时。经萃取和沉淀后，使各个DNA部分再溶解在5微升水中，并用于转化100微升感受态DH5大肠杆菌细胞。用微量制剂分析法，从每一种转化系列的四环素阳性菌落中，就各系列选出一种具有正确限制图谱的菌落，分别称为RSVuPA-Tet-Asp，RSVuPA-Tet-Cla和RSVuPA-Tet-XhoⅠ（参见17）。

E6.3    GASGAs表达载体的制备

通过在新引入的位点打开E6.1和E6.2所述的质粒，并充填所产生的突出端，以破坏人类uPA的uPA受体结合区（GFD）。所得结果或者是12碱基对插入体[当全部核苷酸均被加入（参见E6.3.1）]或是6碱基对插入体[若仅仅加入第一个核苷酸，而其余突出端用大肠杆菌DNA聚合酶（参见图6.3.2）消化]，取决于充填反应期间所加的核苷酸。这些GASGAs载体保持uPA读码，但表达的蛋白质丧失与其细胞受体结合的能力。

E6.3.1    完全充填

E3.2中所述的Asp    718或XhoⅠ改性质粒1微克，在37℃和50 微升溶液中，用5单位合适的酶消化（参见1.5.1），使它们在插入联结子处线性化，使之得以进一步修饰，由此得到每一侧4个核苷酸的突出端。可对DNA进行萃取和沉淀（参见1.5.2和1.5.3），并使之再溶解在含有所有4个核苷酸的50微升合适缓冲液（参见Maniatis等人的文献）中，并用5单位的DNA聚合酶，Klenow片段，在室温下处理30分钟。所得的平端DNA能按通常方法进行萃取和沉淀。相应于10%沉淀物的部分，在100微升溶液（参见1.5.5）中，用6单位DNA连接酶自行连接16小时。

萃取和沉淀后，各个DNA部分可被再溶解在5微升水中，并用于转化100微升感受态EH5大肠杆菌细胞，就每一转化而言，可通过微量制剂分析，从四环素阳性菌落中，选出一种具有预期限制图谱的菌落，分别称为（参见图18）：

（1）RSV-SVRTD，系来自在RSVuPA-Tet-Asp中的Asp718位点的完全充填，其中，新的Sna    BⅠ位点已被引入;

（2）RSV-SSIED，系来自RSVuPA-Tet-Xho中的XhoⅠ位点的完全充填，其中新的PvuⅠ位点已被引入。

E6.3.2    部分充填和/或末端平整化

E6.2.3中所述的Asp718或ClaⅠ的联结子改性质粒1微克（RSVuPA-Tet-Asp和RSVuPA-Tet-Cla），在37℃和50微升缓冲液（最终体积）中，用5单位合适的酶消化（参见1.5.1），使它们在插入联结子处线性化，以使之进一步修饰，由此得到4或2个核苷酸突出端。可对DNA进行萃取和沉淀（参见1.5.2和1.5.3），然后再使之溶解在50微升仅含有2mMdGTP（在Asp718充填的情况下）或仅含有2mMdATP和2mMdTTP[在ClaⅠ末端平整化的情况下]的合适缓冲液（参见Maniatis等人的文献）中，并在室温下，用12单位的大肠杆菌DNA聚合酶[无 DNA酶;（Boerhinger）]处理30分钟。所得的平端DNA能按通常方法进行萃取和沉淀，所得沉淀的10%的量，用6单位DNA连接酶在100微升合适的缓冲剂（参见1.5.5）中自行连接16小时。经萃取和沉淀后，将各DNA制剂重新溶解在5微升水中，并用于转化100微升感受态DH5大肠杆菌细胞。通过微量制剂分析，在四环素阳性菌落中，就各转化系列选出一种具有预期限制图谱的克隆，分别称为（参见图18）：

（1）RSV-SAD，系由RSVuPA-Tet-Asp中Asp718位点的部分充填而产生，其中一个新的EagⅠ位点已被引入;

（2）RSV-SYD，系使RSVuPA-Tet-Cla中的ClaⅠ位点成为圆端而产生，其中一个新的NdeⅠ位点已被引入。

E6.4    “间断”GASGAs的表达和分析

间断GASGAs表达载体（例如在E6.3中所述的那些载体）可在CHO细胞中，用RSV-Neo进行并发转染，再按E2.8中所述的方法，选出RSV-Neo抗性克隆，并进行分析。由“间断”GASGAs所产生的血纤维蛋白溶酶原的活化，免疫特性，以及uPA受体结合性能均类似于用RSVuPA-EO所得产物的性能。被选克隆可被分离，并在保持选定压力下，可在发酵罐中生长（参见E2.8）。

E6.5    “间断”GASGAs在附加体载体中的表达

大致按照E3中所述的表达BPV衍生质粒的GASGAs的制备方法，用E6.3中所述的GASGAs表达载体衍生得到的结构类似物片段，替代含有从外显子Ⅱ至内含子J（参见图3A）的uPAORF的BssHⅠ/SacⅠ片段，由此可产生表达附加体的载体（例如以BPV为基的表达载体（参见E3）的“间断”GASGAs。这类附加体的载体可按E6.4中所述的方法进行表达和分析。

E6.6    “间断”GASGAs表达小基因的组建

组建“间断”GASGAs表达小基因的方法系按E5.4中所述的方式进行，在所说的小基因中，对GASGA编码的转录单元系置于uPA启动区或其衍生物的转录控制下。例如，基本上可按照E5中所述的方法，制备GASGAs表达的pXS衍生质粒（参见E4）。这类小基因uPA衍生载体可按E6.4中所述的方法予以表达分析。

制备：

P1.抗GFD单克隆抗体的制备

通过适当选择来自杂种瘤的抗uPA MABs，可得到tcuPA/scuPA的GFD区特有的单克隆抗体（MABs），该杂种瘤的脾细胞先祖来自用scuPA、tcuPA或ATF，或者其混合物免疫的动物。对于这一用于选择的合适探查物是称作F6的肽片段，它的表观分子量约为6KD，并具有一个氨基酸顺序，后者相应于从4号位处亮氨酸残基至43号位处谷氨酸残基的uPA顺序，而且，所述的肽片段相应于（包括或是下述有关部分）uPA的所谓GFD（类似生长因子的结构域），亦即与表皮生长因子特性顺序有高度对应性的氨基酸顺序。该区域被认为对uPA与其细胞表面受体的结合起主要作用。

P1.1单克隆抗体的产生

将高纯度的54，000道尔顿尿激酶120，000单位/毫克（PERSOLVRLepetit）用于免疫7周令的雌性Balb/c小鼠。将置于弗（罗因德）氏完全佐剂中的此尿激酶注射到融合前60天的动物腹膜中。

另外，10微克尿激酶在30天后再给予小鼠。在融合前10天，用常规ELISA法测定取自尾静脉血样中抗尿激酶抗体的效价，在融合前5天，通过静脉内注射的方式，仅仅给于那些抗体效价大于1∶10，000的动物10微克尿激酶的最终的加强剂量。在融合的当天，摘除脾，并用置于50%PEG6000中的约5×107小鼠骨髓瘤细胞NSO （P3/NS1/1Ag4.1的亚系，ATCC登绿号为TIB18）与脾细胞（约1×108）融合。

大致按照C.Milstein和G.Koehler的方法进行融合后，将细胞重新悬浮在补充以10%小牛胎血清和HAT培养基（0.1mM次黄嘌呤、0.25mM氨基嘌呤、0.017mM胸腺嘧啶核苷，Flow室验室）的Dulbecco改性Eagle培养基（DMEM）中，并施加到含有小鼠巨噬细胞（饲养层）的不同Costar板上。

每隔3天更换一次HAT培养基，而自融合后10天起，则每隔2-3天，用ELISA免疫测定法，检验上清液中是否存在抗尿激酶的单克隆抗体。

P1.2用ELISA法筛选产生抗尿激酶单克隆抗体的杂种瘤

按照一种改进型Perlman法[Immunochemistry，8，873（1971）]，将通用96井型软微滴板（Dynatech）涂复含有尿激酶（每毫升溶液的含量为20微克）的磷酸盐缓冲盐水，pH值为7.2（0.05M磷酸钠，pH7.2，其中含有0.5M氯化钠），使每个井的量为50微升，并在室温下培养1小时。用0.05%Tween20充分洗涤所含的磷酸盐缓冲盐水后，在室温下，用3%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水将井浸泡3小时，以避免非专一性的结合。仔细洗涤后，将50微升杂种瘤培养物的上清液（或者相同体积的腹水）加到井中，使之在室温下反应2小时。对板进行洗涤后，在室温下，用辣根过氧化物酶（P161，DAKO）配制成的兔一抗一鼠国际单位（Ig）的1∶1000稀释液在室温下培养90分钟。彻底洗涤后，该板用1毫克/毫升的色素原，邻位苯基亚乙基二胺（SIGMA）在0.1M柠檬酸缓冲液（pH6）和1.7mMH2O2中的溶液进行培养，每个井中溶液量为200微升。20分钟内显色，对照既无抗原又无抗体的空白样品，在492毫微米处读出光密度。较之空白样品色度深4倍的井视作阳性。

P1.3用免疫污斑法筛选抗GFD的单克隆抗体

在scuPA、uPA、ATF和uPA片段F12、B11以及F6（由下述P2中所述的方法得到）存在下，用免疫污斑测定法（Western blot）进一步分析在上述筛选（P1.2）中呈阳性的克隆。按类似于SDS-PAGE（含有20%丙烯酰胺）实验（参见1.5.7）的方式，对这些参照化合物进行试验，然后在硝基纤维素膜上渗开，并对照在上述ELISA测定中呈阳性的克隆上清液进行分析。

分离出与scuPA/tcuPA、ATF和uPA片段F6相结合，但不与片段F12或B11相结合的那些MABS，进一步培养所产生的克隆，以使它们产生显著的量。分离出二种能生产具有GFD专一性（亦即不具备与其他uPA区结合的能力）的MABS，并称之为CD1和CD6（参见表3）。

P1.4大批培养产生抗尿激酶的杂种瘤

选出能产生抗尿激酶抗体的杂种瘤，使之通过限制稀释进行克隆，并在大量培养物中生长，然后注入事先经0.5毫升Pristane（2，6，10，14-四甲基十五碳烷;Aldrich）处理的Balb/c小鼠的腹膜中。15天后收集腹水。抗尿激酶单克隆抗体的浓度在10-20毫克/毫升范围内。用蛋白质-A琼脂糖或尿激酶-琼脂糖的亲和性色层分离法对上述产物进行提纯。

P1.5用亲和性色层分离法在琼脂糖-尿激酶上提纯抗尿激酶的单克隆抗体

使CNBr-活性琼脂糖4b（Pharmacia）与高分子量尿激（120，000国际单位/毫克）反应，以制备琼脂糖-尿激酶结合体。结合效率约为20毫克（尿激酶）/毫升（膨胀凝胶）。将如上所得的腹水（由生产杂种瘤产生1毫升腹水）施加到事先与0.01M磷酸钠缓冲液（pH8.0）平衡的琼脂糖-尿激酶亲和性柱（1.6厘米×15厘米）中。用 同样的缓冲液淋洗后，用0.1M乙酸（pH3.0）洗提选择性吸附的抗尿激酶单克隆抗体。汇集含有抗体的级分，在PSDE09005微孔膜上进行超滤浓缩，然后冷冻贮存，直至提供使用。

P1.6由凝胶电泳产生的单克隆抗体制剂的纯度和均匀性的测定

按照“W.K.Laemmli    in    Nature    227，680（1970）”中所述的方法，将以上所得的单克隆抗体用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）电泳。仅仅相应于IgG重链和轻链的带是明显的，这表明上述洗提液含有纯免疫球蛋白。

P2 uPA片段F6、B11和F12的制备

a）ATF的酶裂解和所产生的片段（F6、B11和F12）的测定。

在37℃下，按照“Stoppelli    M.P.et    al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1985，82，4939-4943”中所述的方法制备的uPA氨基末端片段（ATF）（1.1毫克）;用金黄色葡萄球菌衍生蛋白酶V8（0.32毫克;Boehringer）在磷酸钠缓冲液（50mM，pH7.8）中处理90分钟。在这些条件下，蛋白酶V8切割谷氨酸残基的羧基侧的ATF。将混合物沸腾2分钟，以中断酶反应，由此得到的蛋白片段在SDS-PAGE（20%丙烯酰胺）上进行分析，并与初始的ATF进行比较。相应于ATF的色带不再存在，但观察到表观分子量分别为12，000、11，000和6000的三个色带，系由与已知分子量的标准物进行比较而确定。

b）片段F6、B11和F12的亲和性色层分离

将以上所得的混合物载在5    B4-琼脂糖基质（一种含有称为5    B4的单克隆抗体的琼脂糖改性基质）上，后者结合高分子量的尿激酶，但不与由常规方法，从MAB    5    B4与琼脂糖（Pharmacia）相连接（参见Corti    A.，Nolli    ML.，Soffientini    A.and    CassaniG.in    Throm    Haemostas    1986;56，219-224）而制备的 低分子量尿激酶相结合。该柱预先已与含有0.15M氯化钠和0.05M磷酸钠缓冲液（pH7.4）的1%聚乙二醇（PEG）6000达到平衡。

c）未结合的片段的回收

将平衡缓冲液通过柱，收集级分，进行等外线监测（280毫微米），并按其含量予以汇集。得到二份主要的汇集级分，其中一份级分含有表观分子量为12，000（称之为F12）膗PA片段，另一级分的表观分子量为6000（称为F6）。用离子交换色层分离法对这些片段进行提纯，然后按下述（e）中所述的方法，用逆相色层分离法脱盐。

d）回收结合的级分

与基质相结合的级分，然后用含有1M氯化钠和1M乙酸的1%PEG6000洗提。收集级分，用紫外线（280毫微米）监测，并根据其含量予以汇集。由此得到单独一份主要级分，该级分含有表观分子量为11，000的uPA片段，称之为B11，并按下述方法提纯。

e）片段B11，F16和F12的提纯

分别含有以上得到的片段B11、F12或F6的汇集级分，用离子交换色层分离纯化及浓缩，在使用预先与0.05M乙酸钠缓冲液（pH4.8）达到平衡的Mono S HR5/5柱（以球状亲水性树脂为基的强阳离子交换剂，其中树脂粒经的分布范围窄;带电基团是-CH2SO3）的FPLC（快速蛋白质液相色层分离）系统中进一步进行提纯和浓缩。

以0-1M氯化钠水溶液的纯性梯度进行洗提，流量为60毫升/小时，时间45分钟。将分别含有B11、F6和F12片段的级分供给1、6、3中所述的逆相色层分离柱，以进行脱盐。通过在减压下蒸出溶剂，使纯片段从相应级分中分离出来。

f）对F6、B11和F12的氨基酸定序

用自动顺序仪（Applied    Biosystem，气相470A型）测定片段F和B的N-末端顺序，所产生的每一个峰是由含有少量污染物的 一个主要片段组成，而所产生的片段F6是单肽（表4）。片段顺序表明，在谷氨酸残基的羧基侧，被V8优先切割。片段F12和片段B11的差别仅在于在52号位和53号位之间的切去。片段F6的分子量相当于在位置GLu3和GLu43处切去ATF而产生的肽类。因此，V8切割GFD区的肽，两种肽基本上对应于所谓的“Kringle”区（仅在切割位点上不同）。

表3

mAB    scuPA    LMW    ATF    B11    F12    F6

5B4    +    -    +    +    -    -

DC1    +    -    +    -    -    +

CD6    +    -    +    -    -    +

用单克隆抗体（mAB）识别uPA的不同部分：5B4识别Kringle区的相应表位，DC1和CD6识别GFD区。低分子量（LMW）系指含有136-411氨基酸的uPA的33KD降解产物。

表4

F6    1    5    10    14

a.a.  Leu  His  Gln  Val  Pro  Ser    Asn    -    Asp  -    Leu  Asn  Gly  Gly

uPA    4    8    13    17

表4：片段F6的N-末端氨基酸顺序，uPA表示在uPA分子中的相应位置;（循环8和10）未检出任何氨基酸，这被介释为Cys残基的出现，因为这些残基不能直接被所用的HPLC系统检出。