생물학적 활성 화물의 경구 전달용 콜릭스 독소-유래 융합 분자

생물학적 활성 화물의 경구 전달용 콜릭스 독소-유래 융합 분자{CHOLIX TOXIN-DERIVED FUSION MOLECULES FOR ORAL DELIVERY OF BIOLOGICALLY ACTIVE CARGO}

관련 특허출원

본 출원은 2014년 5월 7일에 출원된 미국 가출원 번호 제 61/990,054호의 이익을 주장하고, 본 명세서에 전체 참조로 포함된다.

생물학적 활성 폴리펩티드 (아미노산 잔기로 구성된 고분자를 지칭하며; 일반적으로 단백질 또는 펩티드로도 정의됨)의 경구 전달은 제약 업계의 오랜 목표였다. 불행하게도, 위장관(gastrointestinal (GI) tract)의 수많은 물리학적, 생리학적, 및 생물학적 장벽은, 이들이 아미노산 및 디- 또는 트리-펩티드 수송체를 통한 흡수를 위해 충분히 분해될 수 있을 때까지 단백질 및 펩티드의 흡수를 저해하도록 설계되고; 및/또는 내강 표면(luminal surface)에서 엔도솜 흡수 후에 단백질 및 펩티드를 세포 내에서 파괴적인 리소좀 구획으로 수송되도록 설계된다. 이와 같이, 소분자로 달성할 수 있는 것과 유사한 방식으로 장(intestine)으로부터의 폴리펩티드 흡수의 실현 가능성은 제한되어 있고, 대부분의 폴리펩티드 및 단백질에 대해서는 낮은 경구 생체이용률이 계속 문제가 되고 있다.

암, 염증성 질환, 면역 질환, 성장 결핍 장애 등과 같은 질환의 치료를 위한 다양한 생물학적 활성 폴리펩티드를 평가하는 임상 연구에서 몇몇 유망한 결과가 있었지만, 몇몇 DNA-기반 치료제가 이러한 용도로 FDA 승인받았으며, 최적의 치료적 유효량의 전달을 막는 짧은 생물학적 반감기, 및/또는 치료적 유효량에서 관찰되는 유해한 부작용 및 독성과 같은 내재적 한계로 인해 종종 불충분하거나 또는 부적당한 전반적인 효능이 있기 때문에, 이러한 치료제는 실제로 이들의 최적의 가능성에 도달하지 못하였다. 또한, 많은 이러한 치료제들은 환자 및 간병인에게 부담이 되는 정맥내 또는 빈번한 피하 주사에 의한 연속 투여를 필요로 하는, 다중 투여 요법을 필요로 한다.

유망한 생물학적 활성 폴리펩티드를 평가하기 위한 향후 임상 연구는, 이러한 폴리펩티드를 인간 피험자에게 경구로 투여하는데 사용될 수 있는 새로운 방법 및/또는 약학 조성물에서 크게 유익할 수 있다.

본 발명은 염증성 질환 및/또는 자가면역 질환 및/또는 암의 치료를 위해, 개선되고 효과적인 치료법을 제공하도록 설계되고 경구 전달용으로 제형화된, 신규한 비-자연적으로 발생하는 융합 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 생물학적 활성 화물에 결합된 변형된 콜릭스 독소를 포함하는 융합 분자를 포함하는 약학 조성물의 경구 전달이, 무엇보다도, 하기의 이점을 제공할 수 있다는 발명자의 고유한 통찰력에 부분적으로 기초한다:

a) 변형된 콜릭스 독소는 링커 없이, 또는 비-절단형(non-cleavable) 링커와 함께 생물학적 활성 화물에 결합되고, 생물학적 활성 화물의 수용체도 발현하는 면역 세포의 표면에서 이의 수용체(들)에 의한 변형된 콜릭스 독소의 앵커링 효과 (anchoring effect)는 표적 세포의 표면에서 생물학적 활성 화물을 더 많이 노출시킬 수 있고, 콜릭스 수용체 및 생물학적 활성 화물 수용체 둘 다에 결합함으로써 상승 효과를 제공할 수 있다;

b) 변형된 콜릭스 독소는 상피 세포의 기저측면 막(basolateral membrane)에 존재하는 효소, 또는 피험자의 혈장 내에 존재하는 효소에 의해 절단할 수 있는 링커가 있는 생물학적 활성 화물에 결합되고, 이러한 절단은 상피막(epithelial membrane)을 횡단하여 통과세포외배출(transcytosis) 직후 융합 분자의 나머지로부터 생물학적 활성 화물을 방출되게 할 것이다;

c) 점막하-위장관 공간(submucosal-GI space) 및 간문맥계(hepatic-portal system)로 생물학적 활성 화물의 직접 전달은, 화물이 비경구(parenteral) 경로에 의해 투여될 때 관찰되는 전신 독성을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 비-경구 (non-oral) 또는 위장관(GI) 경로를 통해 표적하기 어려웠던 점막하 표적 생물학에 대한 접근을 가능하게 할 수 있다;

d) 일단 위장관 상피를 횡단하여 수송되면, 본 발명의 융합 분자는 혈청에서 연장된 반감기를 나타낼 것이다, 즉, 융합 분자의 생물학적 활성 화물은 이의 비-융합된 상태의 생물학적 활성 화물에 비해 연장된 혈청 반감기를 나타낼 것이다;

e) 융합 분자의 경구 투여는 피험자의 혈장 내에서 관찰되는 것보다 더 높은 유효 농도의 전달된 생물학적 활성 화물을 피험자의 간으로 전달할 수 있다; 그리고 f) 주사 바늘을 사용하지 않고 피험자의 피부에 구멍을 내어 생물학적 활성 화물을 피험자에게 전달함으로써, 환자/간병인의 편의성 및 순응도의 개선 외에도, 통증 또는 이와 관련된 잠재적인 합병증을 피함으로써 이러한 피험자의 삶의 질을 개선시키는 능력.

따라서, 일 측면에서, 본 발명은 경구 전달용으로 제형화된, 비-자연적으로 발생하는 융합 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 상기 융합 분자는 피험자에게 전달될 생물학적 활성 화물에 결합된 변형된 콜릭스 독소를 포함하고, 콜릭스 독소는 비-독성이다.

일 측면에서, 본 발명은 경구 전달용으로 제형화된, 비-자연적으로 발생하는 융합 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 상기 융합 분자는 피험자에게 전달될 생물학적 활성 화물에 결합된 변형된 콜릭스 독소를 포함하고, 콜릭스 독소는 비-독성이며, 상기 융합 분자는 생물학적 활성 화물의 수용체를 활성화시키거나, 또는 촉매-활성 물질의 촉매 공정을 가능하게 하는 능력을 가진다.

다양한 실시예에서, 약학 조성물의 융합 분자는 콜릭스 독소 도메인 II 내의 아미노산 잔기에서 절단된(truncated) 변형된 콜릭스 독소를 포함한다. 다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 서열번호: 15, 서열번호: 16, 서열번호: 17, 서열번호: 18, 서열번호: 19, 서열번호: 20, 서열번호: 21, 서열번호: 22, 서열번호: 23, 서열번호: 24, 서열번호: 25, 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29, 서열번호: 30, 서열번호: 31, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 37, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40 또는 서열번호: 41에 제시된 아미노산 서열을 갖는 절단된 콜릭스 독소를 포함한다.

다양한 실시예에서, 약학 조성물의 융합 분자는 콜릭스 독소 도메인 Ib 내의 아미노산 잔기에서 절단된 변형된 콜릭스 독소를 포함한다. 다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 42, 서열번호: 43, 서열번호: 44, 서열번호: 45, 서열번호: 46, 서열번호: 47, 서열번호:48, 서열번호: 49, 서열번호: 50, 서열번호: 51, 서열번호: 52, 서열번호: 53, 서열번호: 54, 서열번호: 55, 서열번호: 56, 서열번호: 57, 서열번호: 58, 서열번호: 59, 서열번호: 60, 서열번호: 61, 서열번호: 62, 서열번호: 63, 서열번호: 64, 서열번호: 65, 서열번호: 66, 서열번호: 67, 서열번호: 68, 서열번호: 69, 서열번호: 70, 서열번호: 71, 서열번호: 72, 서열번호: 73, 서열번호: 74, 서열번호: 75, 서열번호: 76, 서열번호: 77, 서열번호: 78, 서열번호: 79, 또는 서열번호: 80에 제시된 아미노산 서열을 갖는 절단된 콜릭스 독소를 포함한다.

다양한 실시예에서, 약학 조성물의 융합 분자는 도메인 Ⅲ가 절단되거나 또는 돌연변이된 변형된 콜릭스 독소를 포함한다. 다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 1의 아미노산 잔기 E581이 결실된 서열번호: 81에 제시된 아미노산 서열을 갖는 돌연변이된 콜릭스 독소를 포함한다 (본 명세서에서 "콜릭스 ΔE581"로 명명됨).

다양한 실시예에서, 약학 조성물의 융합 분자는 도메인 Ia가 돌연변이된 변형된 콜릭스 독소를 포함한다.

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 거대분자, 소분자, 펩티드, 폴리펩티드, 핵산, mRNA, miRNA, shRNA, siRNA, 안티센스 분자, 항체, DNA, 플라스미드, 백신, 고분자 나노입자, 또는 촉매-활성 물질로부터 선택된다.

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 히알루로니다제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제(tissue plasminogen activator), 유로키나제, 또는 PGE-아데노신 탈아미노효소(adenosine deaminase)로부터 선택되는 효소이다.

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 인터루킨-10, 인터루킨-19, 인터루킨-20, 인터루킨-22, 인터루킨-24, 또는 인터루킨-26으로부터 선택되는 위장관에서 염증 조절제인 폴리펩티드이다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 폴리펩티드는 서열번호: 82에 제시된 아미노산 서열을 갖는 인터루킨-10이다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 폴리펩티드는 서열번호: 83에 제시된 아미노산 서열을 갖는 인터루킨-19이다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 폴리펩티드는 서열번호: 84에 제시된 아미노산 서열을 갖는 인터루킨-20이다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 폴리펩티드는 서열번호: 85에 제시된 아미노산 서열을 갖는 인터루킨-22이다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 폴리펩티드는 서열번호: 86에 제시된 아미노산 서열을 갖는 인터루킨-24이다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 폴리펩티드는 서열번호: 87에 제시된 아미노산 서열을 갖는 인터루킨-26이다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 위장관에서 염증 조절제인 소분자이다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 위장관에서 염증 조절제인 안티센스 또는 siRNA 분자이다.

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 항체, 또는 이의 단편, 또는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 인공 구조체(artificial construct), 또는 항체 또는 이의 단편을 이의 항원에 결합하는 것을 모방하도록 설계된 인공 구조체인 TNFSF 저해제이다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 가용성 TNFSF 수용체 융합 단백질인 TNFSF 저해제이다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 소분자인 TNFSF 저해제이다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 안티센스 또는 siRNA 분자인 TNFSF 저해제이다.

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 88에 제시된 중쇄가변영역 아미노산 서열 및 서열번호: 89에 제시된 경쇄가변영역 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 90에 제시된 중쇄가변영역 아미노산 서열 및 서열번호: 91에 제시된 경쇄가변영역 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 92에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 가용성 TNFSF 수용체 융합 단백질 이량체이다.

일 측면에서, 본 발명은 대사성 장애, 예를 들어 제 1 형 당뇨병 및 제 2 형 당뇨병의 치료를 위해, 개선되고 효과적인 치료법을 제공하도록 설계되고, 경구 전달용으로 제형화된, 신규한 비-자연적으로 발생하는 융합 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 생물학적 활성 폴리펩티드 (아미노산 잔기로 구성된 고분자를 지칭하며; 일반적으로 단백질 또는 펩티드로도 정의됨)의 경구 전달은 제약 업계의 오랜 목표였다. 불행하게도, 위장관 (GI)의 수많은 물리학적, 생리학적, 및 생물학적 장벽은, 이들이 아미노산 및 디- 또는 트리-펩티드 수송체를 통한 흡수를 위해 충분히 분해될 수 있을 때까지 단백질 및 펩티드의 흡수를 저해하도록 설계되고; 및/또는 내강 표면에서 엔도솜 흡수 후에 단백질 및 펩티드를 세포 내에서 파괴적인 리소좀 구획으로 수송되도록 설계된다. 이와 같이, 소분자로 달성할 수 있는 것과 유사한 방식으로 장 (intestine)으로부터의 폴리펩티드 흡수의 실현 가능성은 제한되어 있고, 대부분의 폴리펩티드 및 단백질에 대해서는 낮은 경구 생체이용률이 계속 문제가 되고 있다.

다양한 실시예에서, 본 발명은 경구 전달용으로 제형화된, 비-자연적으로 발생하는 융합 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 상기 융합 분자는 피험자에게 전달될 포도당-저하제에 결합된 변형된 콜릭스 독소를 포함한다.

다양한 실시예에서, 본 발명은 포도당-저하제에 결합된 변형된 콜릭스 독소를 포함하는 융합 분자를 포함하는 약학 조성물의 경구 전달이, 무엇보다도, 하기의 이점을 제공할 수 있다는 점에 부분적으로 기초한다:

a) 변형된 콜릭스 독소는 링커 없이 포도당-저하제에 결합되고, 포도당-저하제의 수용체도 발현하는 세포의 표면에서 이의 수용체(들)에 의한 변형된 콜릭스 독소의 앵커링 효과는 표적 세포의 표면에서 포도당-저하제를 더 많이 노출시킬 수 있다;

b) 변형된 콜릭스 독소는 상피 세포의 기저측면 막에 존재하는 효소, 또는 피험자의 혈장 내에 존재하는 효소에 의해 절단할 수 있는 링커가 있는 포도당-저하제에 결합되고, 이러한 절단은 상피막을 횡단하여 통과세포외배출 직후 융합 분자의 나머지로부터 포도당-저하제를 방출되게 할 것이다;

c) 점막하-위장관 공간 및 간문맥계로 포도당-저하제의 직접 전달은, 포도당-저하제가 비경구(parenteral) 경로에 의해 투여될 때 관찰되는 전신 독성을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 비-경구(non-oral) 또는 위장관(GI) 경로를 통해 표적하기 어려웠던 점막하 표적 생물학에 대한 접근을 가능하게 할 수 있다;

d) 점막하-위장관 공간 및 간문맥계로 포도당-저하제의 직접 전달은, 덜 빈번한 인슐린 주사를 포함하여, 개선된 투여 요법을 제공할 수 있다. 그리고

e) 주사 바늘을 사용하지 않고 피험자의 피부에 구멍을 내어 포도당-저하제를 피험자에게 전달함으로써, 통증 또는 이와 관련된 잠재적인 합병증을 피함으로써 이러한 피험자의 삶의 질을 개선시키는 능력.

다양한 실시예에서, 포도당-저하제는 거대분자, 소분자, 펩티드, 폴리펩티드, 핵산, mRNA, miRNA, shRNA, siRNA, 안티센스 분자, 항체, DNA, 플라스미드, 백신, 고분자 나노입자, 또는 촉매-활성 물질로부터 선택된다. 다양한 실시예에서, 포도당-저하제는 인크레틴 또는 인크레틴 모방체이다. 다양한 실시예에서, 포도당-저하제는 GLP-1 이다. 다양한 실시예에서, 포도당-저하제는 GLP-1 작용제(agonist) 이다. 다양한 실시예에서, 포도당-저하제는 엑센딘이다. 다양한 실시예에서, 포도당-저하제는 포도당 저해 단백질 수용체(glucose inhibitory protein receptor, GIPR) 작용제이다.

다양한 실시예에서, 포도당-저하제는 펩티드인 GLP-1 작용제이다. 다양한 실시예에서, 포도당-저하제는 소분자인 GLP-1 작용제이다. 다양한 실시예에서, 포도당-저하제는 안티센스 또는 siRNA 분자인 GLP-1 작용제이다. 다양한 실시예에서, 포도당-저하제는 항체, 또는 이의 단편, 또는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 인공 구조체, 또는 항체 또는 이의 단편을 이의 항원에 결합하는 것을 모방하도록 설계된 인공 구조체인 GLP-1 작용제이다.

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 93에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 GLP-1 작용제 펩티드인 포도당-저하제이다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 94에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 GLP-1 작용제 펩티드인 포도당-저하제이다.

일 측면에서, 본 발명은 성장 호르몬 결핍증, 및 유사 장애의 치료를 위해, 개선되고 효과적인 치료법을 제공하도록 설계되고, 경구 전달용으로 제형화된, 신규한 비-자연적으로 발생하는 융합 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

다양한 실시예에서, 본 발명은 경구 전달용으로 제형화된, 비-자연적으로 발생하는 융합 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 상기 융합 분자는 피험자에게 전달될 성장 호르몬(GH)에 결합된 변형된 콜릭스 독소를 포함한다.

다양한 실시예에서, 본 발명은 성장 호르몬에 결합된 변형된 콜릭스 독소를 포함하는 융합 분자를 포함하는 약학 조성물의 경구 전달이, 무엇보다도, 하기의 이점을 제공할 수 있다는 발명자의 고유한 통찰력에 부분적으로 기초한다:

a) 변형된 콜릭스 독소는 상피 세포의 기저측면 막 표면에 존재하는 효소, 또는 피험자의 혈장 내에 존재하는 효소에 의해 절단할 수 있는 링커가 있는 성장 호르몬에 결합되고, 이러한 절단은 상피막을 횡단하여 통과세포외배출 직후 융합 분자의 나머지로부터 성장 호르몬을 방출되게 할 것이다;

b) 점막하-위장관 공간 및 간문맥계로 성장 호르몬의 직접 전달은, 성장 호르몬이 비경구(parenteral) 경로에 의해 투여될 때 관찰되는 전신 독성을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 비-경구(non-oral) 또는 위장관(GI) 경로를 통해 표적하기 어려웠던 점막하 표적 생물학에 대한 접근을 가능하게 할 수 있다 (예를 들어, 피하(sc) 주사를 통한 전신 전달에 대해 IGF-1의 더 효율적인 유도를 제공함);

c) 점막하-위장관 공간 및 간문맥계로 성장 호르몬의 직접 전달은, 개선된 투여 요법을 제공할 수 있다;

d) 경구 전달은 성장하는 어린이에서 관찰되는 혈청 수준과 더 일치하는 간에 대한 성장 호르몬의 짧은 맥박을 달성할 것이고, 이 맥박 프로파일은 피하 주사에 의해서는 달성할 수 없다; 그리고

e) 주사 바늘을 사용하지 않고 피험자의 피부에 구멍을 내어 성장 호르몬을 피험자에게 전달함으로써, 환자/간병인의 편의성 및 순응도의 개선 외에도, 통증 또는 이와 관련된 잠재적인 합병증을 피함으로써 이러한 피험자의 삶의 질을 개선시키는 능력.

다양한 실시예에서, 성장 호르몬은 거대분자, 소분자, 펩티드, 폴리펩티드, 핵산, mRNA, miRNA, shRNA, siRNA, 안티센스 분자, 항체, DNA, 플라스미드, 백신, 고분자 나노입자, 또는 촉매-활성 물질로부터 선택된다. 다양한 실시예에서, 성장 호르몬은 인간 성장 호르몬 (또는 이의 변이체), 성장 호르몬 2, 또는 성장 호르몬-방출 호르몬이다. 다양한 실시예에서, 성장 호르몬은 서열번호: 95에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 인간 성장 호르몬 (소마토트로핀)이다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 생물학적 활성 화물에 직접 결합된 변형된 콜릭스 독소를 포함한다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 콜릭스 독소의 C-말단에 직접 결합된다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 생물학적 활성 화물에 화학적으로 결합된 변형된 콜릭스 독소를 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 비-절단형 링커에 의해 생물학적 활성 화물에 결합된 콜릭스 독소를 포함한다. 다양한 실시예에서, 비-절단형 링커는 서열번호: 96, 서열번호: 97, 서열번호: 98 또는 서열번호: 99의 아미노산 서열을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 절단형 링커에 의해 생물학적 활성 화물에 결합된 콜릭스 독소를 포함한다. 다양한 실시예에서, 링커는 피험자의 편광 상피 세포의 기저측면 막에 존재하는 효소에 의해 절단할 수 있다. 다양한 실시예에서, 링커는 상기 피험자의 혈장 내에 존재하는 효소에 의해 절단할 수 있다. 다양한 실시예에서, 절단형 링커는 서열번호: 100, 서열번호: 101, 서열번호: 102, 서열번호: 103, 서열번호: 104, 서열번호: 105, 서열번호: 106, 서열번호: 107, 서열번호: 108, 서열번호: 109, 서열번호: 110, 서열번호: 111, 서열번호: 112, 서열번호: 113, 서열번호: 114, 서열번호: 115, 서열번호: 116, 서열번호: 117, 서열번호: 118, 서열번호: 119, 또는 서열번호: 120의 아미노산 서열을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 절단형 링커에 의해 생물학적 활성 화물에 결합된 콜릭스 독소를 포함하고, 상기 절단형 링커는 담배 에칭 바이러스(tobacco etch virus, TEV) 프로테아제에 대한 기질로 알려져 있는 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 실시예에서, 절단형 링커는 서열번호: 121의 아미노산 서열을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 122에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. (이것은 콜릭스 ⁴¹⁵ -TEV-IL-10 이다)

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 123에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. (이것은 콜릭스 ⁴¹⁵ -(G ₄ S) ₃ -IL-10 이다)

다른 측면에서, 본 발명은 피험자에게 본 발명의 약학 조성물을 경구 투여하는 단계를 포함하는, 피험자에서 염증성 질환의 치료 방법을 제공한다. 다양한 실시예에서, 염증성 질환은 염증성 장 질환, 건선 또는 세균성 패혈증(bacterial sepsis)으로부터 선택된다. 다양한 실시예에서, 염증성 장 질환은 크론병, 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 교원성 대장염(collagenous colitis), 림프구성 대장염, 허혈성 대장염, 전환 대장염(diversion colitis), 베체트 증후군(Behcet's syndrome) 또는 불확정 대장염(indeterminate colitis) 이다.

다른 측면에서, 본 발명은 피험자에게 본 발명의 약학 조성물을 경구 투여하는 단계를 포함하는, 피험자에서 자가면역 질환의 치료 방법을 제공한다. 다양한 실시예에서, 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 용혈성 빈혈(hemolytic anemia), 혈소판감소성 자반병(thrombocytopenia purpura), 그레이브스병(Grave's disease), 쇼그렌병(Sjogren's disease), 피부근염 (dermatomyositis), 하시모토병(Hashimoto's disease), 다발성근염(polymyositis), 염증성 장 질환, 다발성 경화증(MS), 당뇨병, 류마티스 관절염, 또는 피부 경화증 (scleroderma) 이다.

다른 측면에서, 본 발명은 피험자에게 본 발명의 약학 조성물을 경구 투여하는 단계를 포함하는, 피험자에서 암의 치료 방법을 제공한다. 다양한 실시예에서, 치료될 암은 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphomas), 호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 털세포 백혈병(hairy cell leukemia), 급성 림프모구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia), 다발성 골수종(multiple myeloma), 방광암, 신장암, 난소암, 자궁경부암, 유방암, 폐암, 비인두암, 악성 흑색종 및 리툭시맙 내성 NHL 및 백혈병을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

다른 측면에서, 본 발명은 대사성 장애를 갖는 피험자를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 장애를 치료하기에 충분한 양의 본 발명의 융합 분자를 경구 투여하는 단계를 포함하고, 상기 대사성 장애는 당뇨병, 비만, 비만으로 인한 당뇨병, 고혈당증(hyperglycemia), 이상지질혈증(dyslipidemia), 고중성지방혈증 (hypertriglyceridemia), X 증후군(syndrome X), 인슐린 저항성, 내당능 장애 (impaired glucose tolerance, IGT), 당뇨병성 이상지질혈증(diabetic dyslipidemia), 또는 고지혈증(hyperlipidemia) 이다.

다른 측면에서, 본 발명은 지방간 질환 (예를 들어, 비알콜성 지방간 질환 (nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD); 비알콜성 지방간염(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)), 위장관 질환, 또는 신경퇴행성 질환을 갖는 피험자를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 질환을 치료하기에 충분한 양의 본 발명의 융합 분자를 경구 투여하는 단계를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 GH 결핍 성장 장애를 갖는 피험자를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 장애를 치료하기에 충분한 양의 본 발명의 융합 분자를 경구 투여하는 단계를 포함하고, 상기 장애는 성장 호르몬 결핍증(growth hormone deficiency, GHD), 터너 증후군(Turner syndrome, TS), 누난 증후군 (Noonan syndrome), 프라더-윌리 증후군(Prader-Willi syndrome), 저신장증 호메오박스-함유 유전자(short stature homeobox-containing gene, SHOX) 결핍증, 만성 신부전증(chronic renal insufficiency), 및 특발성 저신장증 단장 증후군 (idiopathic short stature short bowel syndrome), 희귀한 뇌하수체 종양들(rare pituitary tumors) 또는 이들의 치료로 인한 GH 결핍증, 및 HIV/AIDS와 관련된 근소모성 질환(muscle-wasting disease) 이다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 비-자연적으로 발생하는 융합 분자를 필요로 하는 피험자에서 염증성 질환의 치료, 예방 및/또는 방지용 약제의 제조를 위해 본 발명의 비-자연적으로 발생하는 융합 분자의 용도에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 비-자연적으로 발생하는 융합 분자를 필요로 하는 피험자에서 자가면역 질환의 치료, 예방 및/또는 방지용 약제의 제조를 위해 본 발명의 비-자연적으로 발생하는 융합 분자의 용도에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 비-자연적으로 발생하는 융합 분자를 필요로 하는 피험자에서 암의 치료, 예방 및/또는 방지용 약제의 제조를 위해 본 발명의 비-자연적으로 발생하는 융합 분자의 용도에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 비-자연적으로 발생하는 융합 분자를 필요로 하는 피험자에서 대사성 장애의 치료, 예방 및/또는 방지용 약제의 제조를 위해 본 발명의 비-자연적으로 발생하는 융합 분자의 용도에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 비-자연적으로 발생하는 융합 분자를 필요로 하는 피험자에서 지방간 질환의 치료, 예방 및/또는 방지용 약제의 제조를 위해 본 발명의 비-자연적으로 발생하는 융합 분자의 용도에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 비-자연적으로 발생하는 융합 분자를 필요로 하는 피험자에서 GH 결핍 성장 장애의 치료, 예방 및/또는 방지용 약제의 제조를 위해 본 발명의 비-자연적으로 발생하는 융합 분자의 용도에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 비-자연적으로 발생하는 변형된 콜릭스 독소-생물학적 활성 화물 융합 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 본 발명의 비-자연적으로 발생하는 변형된 콜릭스 독소-생물학적 활성 화물 융합 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 임의로, 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 의해 인식되는 서열을 조절하기 위해 작동가능하게 연결됨; 본 발명의 비-자연적으로 발생하는 변형된 콜릭스 독소-생물학적 활성 화물 융합 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포; 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 본 발명의 비-자연적으로 발생하는 변형된 콜릭스 독소-생물학적 활성 화물 융합 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 임의로, 숙주 세포 배양 배지로부터 비-자연적으로 발생하는 변형된 콜릭스 독소-생물학적 활성 화물 융합 분자를 회수하는 단계를 포함하는 본 발명의 비-자연적으로 발생하는 변형된 콜릭스 독소-생물학적 활성 화물 융합 분자의 제조 방법을 제공한다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥에 의해 별도로 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화의 기술과 관련하여 사용되는 명명법은 당해 기술분야에서 일반적으로 사용되고 잘 알려진 기술이다. 본 발명의 방법 및 기술은 별도의 표시가 없으면 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 더 구체적인 문헌들에 기재된 대로 일반적으로 당해 기술분야에서 잘 알려진 통상적인 방법에 따라 수행된다. 참조, 예를 들어, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), and Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1990), 참조로 본 명세서에 포함된다. 효소 반응 및 정제 기술은 당해 기술분야에서 통상적으로 달성되는 바와 같이 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 제조업자의 명세서에 따라 수행된다. 본 명세서에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 제약 화학의 실험 과정 및 기술과 관련하여 사용되는 명명법은 당해 기술분야에서 일반적으로 사용되고 잘 알려진 기술이다. 표준 기술은 화학 합성, 화학 분석, 제약 제제, 제형, 및 전달, 및 환자의 치료에 사용된다.

정의

용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 고분자를 나타내기 위해 본 명세서에서 통용된다. 다양한 실시예에서, "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 알파 탄소가 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산의 사슬이다. 따라서, 사슬의 한쪽 끝에 있는 말단 아미노산 (아미노 말단)은 유리 아미노기를 가지는 반면, 사슬의 다른쪽 끝에 있는 말단 아미노산 (카복시 말단)은 유리 카복실기를 가진다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노 말단" (약칭 N-말단)은 펩티드의 아미노 말단에서 아미노산 위의 유리 α-아미노기 또는 펩티드 내 다른 위치에 있는 아미노산의 α-아미노기 (펩티드 결합에 참여할 때 이미노기)를 나타낸다. 유사하게, 용어 "카복시 말단"은 펩티드의 카복시 말단 위의 유리 카복실기 또는 펩티드 내 다른 위치에 있는 아미노산의 카복실기를 나타낸다. 또한, 펩티드는 본질적으로 아미드 결합과는 반대로 에테르에 의해 결합된 아미노산과 같은 펩티드 모방체를 포함하는 임의의 폴리아미노산을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 폴리펩티드는 (1) 단백질 가수분해에 대한 민감성 감소, (2) 산화에 대한 민감성 감소, (3) 단백질 복합체의 형성에 대한 결합 친화도 변화, (4) 결합 친화도 변화, 및 (5) 기타 물리화학적 또는 기능적 특성 부여 또는 변형을 위해, 임의의 방식으로 그리고 임의의 이유로 변형된 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 단일 또는 다수의 아미노산 치환 (예를 들어, 보존적 아미노산 치환)은 자연적으로 발생하는 서열 (예를 들어, 분자간 접촉할 때 형성하는 도메인(들) 바깥쪽 폴리펩티드 부분)에서 될 수도 있다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산의 폴리펩티드에서 기능적으로 유사한 아미노산으로의 치환을 나타낸다. 하기의 6개 군은 각각 서로 보존적 치환인 아미노산을 함유한다:

1) 알라닌 (A), 세린 (S), 및 트레오닌 (T)

2) 아스파르트산 (D) 및 글루탐산 (E)

3) 아스파라긴 (N) 및 글루타민 (Q)

4) 아르기닌 (R) 및 리신 (K)

5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 및 발린 (V)

6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 및 트립토판 (W)

"비-보존적 아미노산 치환"은 이들 부류 중 하나의 일원을 다른 부류의 일원으로 치환하는 것을 나타낸다. 이러한 변화를 주는데 있어서, 다양한 실시예에 따라, 아미노산의 수치요법 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각 아미노산은 이의 소수성과 전하 특성(charge characteristics)을 기준으로 하여 수치요법 지수를 부여하였다: 이들은 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 리신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5) 이다.

단백질 상에 상호작용하는 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 아미노산의 수치요법 지수의 중요성은 당해 기술분야에서 이해된다 (참조, Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131). 특정 아미노산이 유사한 수치요법 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 여전히 유사한 생물학적 활성을 보유하는 것으로 알려져 있다. 수치요법 지수를 기준으로 변화를 주는데 있어서, 다양한 실시예에서, 수치요법 지수가 ± 2 이내인 아미노산의 치환이 포함된다. 다양한 실시예에서, 수치요법 지수가 ± 1 이내인 아미노산의 치환이 포함되고, 다양한 실시예에서, 수치요법 지수가 ± 0.5 이내인 아미노산의 치환이 포함된다.

또한, 유사한 아미노산의 치환이, 특히 이렇게 함으로써 생성된 생물학적 기능 단백질 또는 펩티드가 본 명세서에 개시된 바와 같은 면역학적 실시예에서의 사용을 목적으로 하는 경우에, 친수성을 기준으로 하여 효과적으로 이루어질 수 있다는 것이 당해 기술분야에서 이해된다. 다양한 실시예에서, 인접 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 단백질의 가장 큰 국소 평균 친수성은 그의 면역원성 및 항원성, 즉 단백질의 생물학적 특성과 상호 관련이 있다.

하기의 친수성 값이 이들 아미노산 잔기에 부여되었다: 아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파르테이트 (+3.0.+-.1); 글루타메이트 (+3.0.+-.1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5.+-.1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5) 및 트립토판 (-3.4). 유사한 친수성 값을 기준으로 변화를 주는데 있어서, 다양한 실시예에서, 친수성 값이 ± 2 이내인 아미노산의 치환이 포함되고, 다양한 실시예에서, 친수성 값이 ± 1 이내인 아미노산의 치환이 포함되고, 다양한 실시예에서, 친수성 값이 ± 0.5 이내인 아미노산의 치환이 포함된다.

예시적인 아미노산 치환은 표 1에 제시된다.

숙련된 장인은 잘-알려진 기술을 이용하여 본 명세서에 제시된 바와 같은 폴리펩티드의 적당한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 다양한 실시예에서, 당업자는 활성에 중요하지 않은 것으로 여겨지는 영역을 표적화시킴으로써 활성을 파괴하지 않으면서 변화시킬 수 있는 분자의 적당한 영역을 확인할 수 있다. 다른 실시예에서, 숙련된 장인은 유사한 폴리펩티드 중에서 보존되는 분자의 잔기 및 일부를 확인할 수 있다. 추가 실시예에서, 생물학적 활성 또는 구조에 대해 중요할 수 있는 영역조차도 생물학적 활성을 파괴시키지 않고 또는 폴리펩티드 구조에 악영향을 미치지 않고 보존적 아미노산 치환을 받을 수 있다.

추가로, 당업자는 활성 또는 구조에 중요한 유사한 폴리펩티드의 잔기를 확인하는 구조-기능 연구를 검토할 수 있다. 이러한 비교의 관점에서, 당업자는 유사한 폴리펩티드의 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 상응하는 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기의 중요성을 예측할 수 있다. 당업자는 이러한 예측된 중요한 아미노산 잔기에 대해 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택할 수 있다.

당업자는 유사한 폴리펩티드의 이러한 구조와 관련하여 3-차원 구조 및 아미노산 서열을 분석할 수도 있다. 이러한 정보를 고려하여, 당업자는 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 3-차원 구조에 대한 정렬을 예측할 수 있다. 다양한 실시예에서, 당업자는 폴리펩티드의 표면 상에 존재할 것으로 예측되는 아미노산 잔기에 대해 급진적인 변화를 일으키지 않는 것을 선택할 수 있는데, 이는 이러한 잔기가 다른 분자와의 중요한 상호작용에 관여될 수 있기 때문이다. 또한, 당업자는 각각의 원하는 아미노산 잔기에서 단일 아미노산 치환을 함유하는 시험 변이체를 생성할 수 있다. 그 다음, 변이체는 당업자에게 알려진 활성 분석을 이용하여 스크리닝 될 수 있다. 이러한 변이체를 사용하여 적당한 변이체에 관한 정보를 수집할 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산 잔기로의 변화가 파괴되거나, 바람직하지 않게 감소되거나, 또는 부적당한 활성을 일으킨다는 것을 발견하면, 이러한 변화를 가진 변이체를 피할 수 있다. 즉, 이러한 통상적인 실험으로부터 수집된 정보에 기초하여, 당업자는 추가 치환이 단독으로 또는 다른 돌연변이와 함께 배제되어야 하는 아미노산을 용이하게 결정할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드 단편" 및 "절단된 폴리펩티드"는 상응하는 전장 단백질에 비해 아미노-말단 및/또는 카복시-말단 결실을 가지는 폴리펩티드를 나타낸다. 다양한 실시예에서, 단편은 길이가 적어도 5, 적어도 10, 적어도 25, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900 또는 적어도 1000인 아미노산일 수 있다. 다양한 실시예에서, 단편은 길이가 1000 이하, 900 이하, 800 이하, 700 이하, 600 이하, 500 이하, 450 이하, 400 이하, 350 이하, 300 이하, 250 이하, 200 이하, 150 이하, 100 이하, 50 이하, 25 이하, 10 이하, 또는 5 이하인 아미노산일 수도 있다. 단편은 하나 이상의 추가 아미노산, 예를 들어, 상이한 자연적으로-발생하는 단백질 (예를 들어, Fc 또는 류신 지퍼 도메인)의 아미노산 서열 또는 인공 아미노산 산 서열 (예를 들어, 인공 링커 서열)의 말단 중 어느 한쪽 또는 양쪽에 더 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드 변이체" 및 "폴리펩티드 돌연변이체"는 하나 이상의 아미노산 잔기를 다른 폴리펩티드 서열에 대해 아미노산 서열에 삽입, 결실 및/또는 치환되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 다양한 실시예에서, 삽입, 결실, 또는 치환될 아미노산 잔기의 수는 길이가 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 25, 적어도 50, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 125, 적어도 150, 적어도 175, 적어도 200, 적어도 225, 적어도 250, 적어도 275, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450 또는 적어도 500인 아미노산일 수 있다. 본 발명의 변이체는 융합 단백질을 포함한다.

폴리펩티드의 "유도체"는 화학적으로 변형된, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 알부민 (예를 들어, 인간 혈청 알부민), 인산화, 및 글리코실화와 같은 다른 화학적 부분(chemical moiety)에 결합된 폴리펩티드이다.

용어 "% 서열 동일성(sequence identity)"은 용어 "% 동일성"으로 본 명세서에서 통용되고, 서열 정렬 프로그램을 이용하여 정렬할 때, 2 이상의 펩티드 서열간의 아미노산 서열 동일성의 수준 또는 2 이상의 뉴클레오티드 서열간의 뉴클레오티드 서열 동일성의 수준을 나타낸다. 예를 들어, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 80% 동일성은 정의된 알고리즘에 의해 결정된 80% 서열 동일성과 동일한 것을 의미하고, 주어진 서열이 다른 서열의 다른 길이와 적어도 80% 동일하다는 것을 의미한다. 다양한 실시예에서, % 동일성은 주어진 서열에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 또는 그 이상의 서열 동일성으로부터 선택된다. 다양한 실시예에서, % 동일성은 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 85%, 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 95%, 또는 약 95% 내지 약 99%의 범위 내이다.

용어 "% 서열 상동성(sequence homology)"은 용어 "% 상동성"으로 본 명세서에서 통용되고, 서열 정렬 프로그램을 이용하여 정렬할 때, 2 이상의 펩티드 서열간의 아미노산 서열 상동성의 수준 또는 2 이상의 뉴클레오티드 서열간의 뉴클레오티드 서열 상동성의 수준을 나타낸다. 예를 들어, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 80% 상동성은 정의된 알고리즘에 의해 결정된 80% 서열 상동성과 동일한 것을 의미하고, 따라서 주어진 서열의 동족체(homologue)는 주어진 서열의 길이에 대해 80% 이상의 서열 상동성을 가진다. 다양한 실시예에서, % 상동성은 주어진 서열에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 또는 그 이상의 서열 상동성으로부터 선택된다. 다양한 실시예에서, % 상동성은 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 85%, 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 95%, 또는 약 95% 내지 약 99%의 범위 내이다.

두 서열 사이의 동일성을 결정하는데 사용될 수 있는 예시적인 컴퓨터 프로그램은, BLAST 프로그램의 세트, 예를 들어, BLASTN, BLASTX, 및 TBLASTX, BLASTP 및 TBLASTN, NCBI 웹사이트에서 인터넷 상에서 공개적으로 이용가능한 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 참조, 또한 Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10 (특히 공개된 기본 설정에 관하여, 즉, 매개변수 w=4, t=17) 및 Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402. 서열 검색은 일반적으로 GenBank Protein Sequences 및 기타 공공 데이터베이스의 아미노산 서열과 관련하여 주어진 아미노산 서열을 평가할 때 BLASTP 프로그램을 이용하여 수행된다. BLASTX 프로그램은 GenBank Protein Sequences 및 기타 공공 데이터베이스의 아미노산 서열에 대해 모든 판독 프레임에서 번역된 핵산 서열을 검색하는데 선호된다. BLASTP 및 BLASTX는 11.0의 개방 갭 페널티(open gap penalty), 및 1.0의 확장 갭 페널티(extended gap penalty)의 기본 매개변수를 이용하여 실행하고, BLOSUM-62 매트릭스를 이용한다. 참조 id.

퍼센트 서열 동일성을 계산하는 것 이외에, BLAST 알고리즘은 두 서열 간의 유사성의 통계적 분석도 수행한다 (참조, 예를 들어, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787 (1993)). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 하나의 척도는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 일치가 우연히 일어날 확률의 지표를 제공하는 가장 작은 합계 확률 (P(N))이다. 예를 들어, 시험 핵산과 기준 핵산의 비교에서 가장 작은 합계 확률이 0.1 이하, 0.01 이하, 또는 0.001 이하인 경우, 핵산은 기준 서열과 유사하다고 간주된다.

"폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위로 구성된 고분자를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 자연적으로 발생하는 핵산, 예를 들어 데옥시리보핵산 ("DNA") 및 리보핵산 ("RNA"), 및 핵산 유사체를 포함한다. 핵산 유사체는 자연적으로 발생하는 포스포디에스터 결합 이외의 다른 뉴클레오티드와 함께 결합에 관여하는 뉴클레오티드인 비-자연적으로 발생하는 염기들을 포함하는 것, 또는 포스포디에스터 결합 이외의 결합을 통해 결합된 염기들을 포함하는 것을 포함한다. 따라서, 뉴클레오티드 유사체는 제한 없이 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로트리에스터, 포스포라미데이트, 보라노포스페이트, 메틸포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산 (PNAs) 등을 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 자동 DNA 합성기를 이용하여 합성될 수 있다. 용어 "핵산"은 일반적으로 커다란 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 약 50 이하의 뉴클레오티드인 짧은 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 뉴클레오티드 서열이 DNA 서열 (즉, A, T, G, C)에 의해 표시될 때, 이것은 "U"가 "T"를 대체하는 RNA 서열 (즉, A, U, G, C)을 포함하는 것도 이해될 것이다.

본 명세서에서는 폴리뉴클레오티드 서열을 기재하는데 종래의 표기법이 사용된다: 단일-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 끝은 5'-끝이고; 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 방향은 5'-방향으로 언급된다. 초기의 RNA 전사체에 대해 뉴클레오티드의 5'에서 3'로 첨가되는 방향을 전사 방향이라고 한다. mRNA와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥을 "코딩 가닥"이라고 하며; RNA 전사체의 5'-끝의 5'에 위치하는 그 DNA로부터 전사된 mRNA와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 서열은 "상류 서열(upstream sequences)"이라고 하고; 코딩 RNA 전사체의 3'-끝의 3'에 위치하는 RNA와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 서열은 "하류 서열(downstream sequences)"이라고 한다.

"상보적(Complementary)"은 2개의 폴리뉴클레오티드의 상호작용하는 표면의 위상학적 적합성(topological compatibility) 또는 일치(matching)를 함께 나타낸다. 따라서, 두 분자는 상보적으로 기재될 수 있으며, 또한 접촉 표면 특성은 서로 상보적이다. 만일 제 1 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 제 2 폴리뉴클레오티드의 결합 파트너인 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일하거나, 또는 제 1 폴리뉴클레오티드가 가혹한 혼성화 조건 하에 제 2 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 수 있다면, 제 1 폴리뉴클레오티드는 제 2 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적이다.

"특이적으로 혼성화하는(Hybridizing specifically to)" 또는 "특이적 혼성화(specific hybridization)" 또는 "선택적으로 혼성화하는(selectively hybridize to)"은, 서열이 DNA 또는 RNA의 복합체 혼합물 (예를 들어, 총 세포) 내에 존재할 때 가혹한 조건 하에서 특정 뉴클레오티드 서열에 우선적으로 핵산 분자를 결합, 이중화(duplexing), 또는 혼성화 하는 것을 나타낸다. 용어 "가혹한 조건"은 프로브가 이의 표적 서열에 대해 우선적으로 혼성화하고, 다른 서열에 대해서는 보다 적게, 또는 전혀 혼성화하지 않는 조건을 나타낸다. 서던 혼성화 및 노던 혼성화와 같은 핵산 혼성화 실험의 맥락에서 "가혹한 혼성화" 및 "가혹한 혼성화 세척 조건"은 서열-의존적이고, 상이한 환경 매개변수에 따라 상이하다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 안내는 하기 문헌에서 확인될 수 있다: Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I, chapter 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, NY; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 3.sup.rd ed., NY; and Ausubel et al., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY.

일반적으로, 매우 가혹한 혼성화 및 세척 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5℃ 낮은 것으로 선택된다. Tm은 표적 서열의 50%가 완전히 일치하는 프로브에 혼성화하는 (규정된 이온 강도 및 pH 하에서의) 온도이다. 매우 가혹한 조건은 특정 프로브에 대한 Tm과 같은 것으로 선택된다. 서던 블롯 또는 노던 블롯에서 여과기 상의 약 100개 이상의 상보적 잔기를 가지는 상보적 핵산의 혼성화에 대한 가혹한 혼성화 조건의 예는, 42℃에서 1mg의 헤파린을 갖는 50% 포르말린이고, 혼성화는 밤새도록 수행된다. 매우 가혹한 세척 조건의 예는 약 15분 동안 72℃에서 0.15 M NaCl 이다. 가혹한 세척 조건의 예는 15분 동안 65℃에서 0.2 x SSC 세척이다. SSC 완충액의 설명을 위해 Sambrook et al. 참조. 높은 가혹한 세척은 낮은 가혹한 세척에 선행되어 배경 프로브 신호를 제거할 수 있다. 예를 들어, 약 100 이상의 뉴클레오티드의 이중나선(duplex)에 대한 예시적인 중간 가혹한 세척은, 15분 동안 45℃에서 1 x SSC 이다. 예를 들어, 약 100 이상의 뉴클레오티드의 이중나선에 대한 예시적인 낮은 가혹한 세척은, 15분 동안 40℃에서 4-6 x SSC 이다. 일반적으로, 특정 혼성화 분석에서 관련없는 프로브에 대해 관찰된 것보다 2 x (또는 그 이상)의 신호 대 노이즈 비는 특정 혼성화의 검출을 나타낸다.

"프라이머"는 지정된 폴리뉴클레오티드 주형에 특이적으로 혼성화할 수 있고 상보적 폴리뉴클레오티드의 합성을 위한 개시점을 제공할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 이러한 합성은 폴리뉴클레오티드 프라이머가 합성이 유도되는 조건 하에 놓여있을 때, 즉 뉴클레오티드, 상보적 폴리뉴클레오티드 주형, 및 DNA 폴리머라제와 같은 중합화제의 존재 하에 있을 때 발생한다. 프라이머는 일반적으로 단일-가닥이지만, 이중-가닥일 수도 있다. 프라이머는 일반적으로 데옥시리보핵산이지만, 다양한 합성 및 자연적으로 발생하는 프라이머는 많은 적용에서 유용하다. 프라이머는 합성의 개시 부위로서 작용하기 위해 혼성화하도록 설계된 주형에 대해 상보적이지만, 주형의 정확한 서열을 반영할 필요는 없다. 이러한 경우, 주형에 대한 프라이머의 특이적 혼성화는 혼성화 조건의 가혹함에 달려 있다. 프라이머는 발색(chromogenic) 부분, 방사성(radioactive) 부분, 또는 형광(fluorescent) 부분으로 표지될 수 있으며, 검출가능한 부분으로서 사용될 수 있다.

"프로브"는 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때, 다른 폴리뉴클레오티드의 지정된 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 프로브가 표적 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지만, 주형의 정확한 상보적 서열을 반영할 필요는 없다. 이러한 경우, 표적에 대한 프라이머의 특이적 혼성화는 혼성화 조건의 가혹함에 달려 있다. 프로브는 발색 부분, 방사성 부분, 또는 형광 부분으로 표지될 수 있으며, 검출가능한 부분으로서 사용될 수 있다. 프로브가 상보적 폴리뉴클레오티드의 합성을 위한 개시점을 제공하는 경우, 프로브는 또한 프라이머일 수 있다.

"벡터"는 이것에 결합된 다른 핵산을 세포 내로 도입하는데 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. 하나의 유형의 벡터는 "플라스미드"이고, 추가의 핵산 절편 (segments)이 결합(ligated)될 수 있게 선형 또는 원형 이중 가닥 DNA 분자를 나타낸다. 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결여 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)이고, 여기서 추가의 DNA 절편은 바이러스 게놈으로 도입될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제(autonomous replication)를 할 수 있다 (예를 들어, 세균성 복제 기원(origin of replication)을 포함하는 세균 벡터 및 에피솜 포유류 벡터(episomal mammalian vectors)). 기타 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입될 때 숙주 세포의 게놈에 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제된다. "발현 벡터"는 선택된 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시할 수 있는 벡터의 유형이다.

"조절 서열(regulatory sequence)"은 작동가능하게 연결된 핵산의 발현 (예를 들어, 발현의 수준, 시기, 또는 위치)에 영향을 주는 핵산이다. 조절 서열은 조절된 핵산에 직접, 또는 하나 이상의 다른 분자 (예를 들어, 조절 서열 및/또는 핵산에 결합하는 폴리펩티드)의 작용을 통해 이의 효과를 발휘할 수 있다. 조절 서열의 예는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함한다. 조절 서열의 다른 예는, 예를 들어, Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. and Baron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06에 기재되어 있다. 조절 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현 (예를 들어, 발현의 수준, 시기, 또는 위치)에 영향을 주는 경우, 뉴클레오티드 서열은 조절 서열에 "작동가능하게 연결된다".

"숙주 세포"는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포이다. 숙주 세포는 원핵생물, 예를 들어, E. coli 일 수 있거나, 또는 진핵생물, 예를 들어, 단일-세포 진핵생물 (예를 들어, 효모 또는 다른 균류), 식물 세포 (예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포 (예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터 세포, 랫트 세포, 마우스 세포, 또는 곤충 세포) 또는 하이브리도마일 수 있다. 일반적으로, 숙주 세포는 폴리펩티드-인코딩 핵산으로 형질전환되거나 또는 형질감염된 다음, 숙주 세포에서 발현될 수 있는 배양된 세포이다. 문구 "재조합 숙주 세포"는 발현되는 핵산으로 형질전환되거나 또는 형질감염된 숙주 세포를 나타내기 위해 사용될 수 있다. 또한, 숙주 세포는 핵산을 포함하나 조절 서열이 핵산과 함께 작동가능하게 연결되도록 숙주 세포 내로 도입되지 않으면, 원하는 수준에서 이를 발현하지 않는 세포일 수 있다. 용어 숙주 세포는 특정 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적인 자손을 나타내는 것으로 이해된다. 어떤 변형은 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대(succeeding generations)에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 부모 세포와 동일하지 않을 수 있으나, 본 명세서에서 사용된 용어의 범위 내에 여전히 포함된다.

용어 "분리된 분자(isolated molecule)" (여기서 분자는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다)는 이의 유래의 기원 또는 근원에 의하여 (1) 이의 원래 상태에서 동반되는 자연적으로 결합된 성분과 관련이 없고, (2) 동일한 종으로부터 다른 분자가 실질적으로 없으며, (3) 다른 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, 또는 자연에서 발생하지 않는 분자이다. 따라서, 화학적으로 합성되거나, 또는 자연적으로 유래한 세포와 다른 세포 시스템에서 발현되는 분자는, 이의 자연적으로 결합된 성분으로부터 "분리될" 것이다. 또한, 분자는 당해 기술분야에서 잘 알려진 정제 기술을 이용하여 분리함으로써 자연적으로 결합된 성분이 실질적으로 존재하지 않게 할 수 있다. 분자 순도 또는 균질성은 당해 기술분야에서 잘 알려진 많은 방법에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 시료의 순도는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 겔의 염색을 이용하여 분석함으로써, 당해 기술분야에서 잘 알려진 기술을 이용하여 폴리펩티드를 시각화할 수 있다. 특정 목적을 위해, HPLC 또는 정제를 위한 당해 기술분야에서 잘 알려진 다른 방법을 이용하여 더 높은 해상도를 제공할 수 있다.

시료의 적어도 약 60% 내지 75%가 단일 종의 폴리펩티드를 나타낼 때, 단백질 또는 폴리펩티드는 "실질적으로 순수한", "실질적으로 균질한", 또는 "실질적으로 정제된"이다. 폴리펩티드 또는 단백질은 단량체 또는 다량체일 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 단백질은 일반적으로 단백질 시료의 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% W/W, 보다 일반적으로는 약 95%를 포함할 것이고, 예를 들어 99% 이상의 순수할 것이다. 단백질 순도 또는 균질성은 당해 기술분야에서 잘 알려진 많은 방법, 예를 들어 단백질 시료의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 다음, 당해 기술분야에서 잘 알려진 염색으로 겔을 염색하자마자 단일 폴리펩티드 밴드를 시각화하여 나타낼 수 있다. 특정 목적을 위해, HPLC 또는 정제를 위한 당해 기술분야에서 잘 알려진 다른 방법을 이용하여 더 높은 해상도를 제공할 수 있다.

"링커"는 공유 결합, 또는 이온 결합, 반데르발스 결합 또는 수소 결합을 통해 2개의 다른 분자, 예를 들어 5' 끝에서 하나의 상보적 서열 및 3' 끝에서 다른 상보적 서열에 혼성화하는 핵산 분자를 연결함으로써 2개의 비-상보적 서열을 연결하는 분자를 나타낸다. "절단형 링커"는 절단형 링커에 의해 연결된 2개의 성분을 분리하기 위해 분해되거나 또는 그 반대로 절단될 수 있는 링커를 나타낸다. 절단형 링커는 일반적으로 효소, 전형적으로 펩티다제, 프로테아제, 뉴클레아제, 리파제 등에 의해 절단된다. 절단형 링커는 편광 상피 막을 횡단하여 융합 분자의 통과세포외배출(transcytosis) 후에 환경에서 이러한 변화가 있을 때, 환경 단서 (environmental cues), 예를 들어, 특정 효소 활성, 온도의 변화, pH, 염 농도 등에 의해서 절단될 수도 있다.

"약학 조성물"은 동물에서의 약학 용도에 적합한 조성물을 나타낸다. 약학 조성물은 약리학적 유효량의 활성제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. "약리학적 유효량"은 의도된 약리학적 결과를 생성하는데 효과적인 물질의 양을 나타낸다.

"약학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 표준 약학적 담체, 비히클, 완충액, 및 부형제, 예를 들어 인산염 완충 식염수 용액(phosphate buffered saline solution), 5% 덱스트로오스 수용액, 및 에멀젼, 예를 들어 유/수 또는 수/유 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제 및/또는 보조제를 나타낸다. 적당한 약학적 담체 및 제형은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 21st Ed. 2005, Mack Publishing Co, Easton에 기재되어 있다. "약학적으로 허용가능한 염"은 금속염 (나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등) 및 암모니아 또는 유기 아민의 염을 포함하여 약학 용도의 화합물로 제형화될 수 있는 염이다.

용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 생물학적 장애 및/또는 적어도 하나의 이의 수반되는 증상을 완화시키거나 또는 저지시키는 방법을 나타낸다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 질환, 장애 또는 질병을 "완화시키다"는 질환, 장애 또는 질병의 증상의 중등도 및/또는 발생 빈도를 감소시키는 것을 의미한다. 또한, 본 명세서에서 "치료"는 치유적(curative), 완화적(palliative) 및 예방적 (prophylactic) 치료를 포함한다.

변형된 콜릭스 독소 폴리펩티드

본 명세서에서 사용된 성숙 콜릭스 독소 (Jorgensen, R. et al., J Biol Chem 283(16):10671-10678 (2008))는 70.7 kD, 634 잔기 단백질이고, 이의 서열은 서열번호: 1에 제시된다:

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDK

GESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGE

DSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPS

VSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYET

VAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDD

LSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQV

LTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESR

SGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRI

APVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRV

YIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIH

AVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK (서열번호: 1)

다양한 실시예에서, 콜릭스 독소는 서열번호: 1의 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99%의 관찰된 상동성을 공유하는 아미노산 서열을 가진다.

성숙 콜릭스 독소를 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열번호: 2에 제시된다:

ATGGTCGAAGAAGCTTTAAACATCTTTGATGAATGCCGTTCGCCATGTTCGTTGACCCCGGA

ACCGGGTAAGCCGATTCAATCAAAACTGTCTATCCCTAGTGATGTTGTTCTGGATGAAGGTG

TTCTGTATTACTCGATGACGATTAATGATGAGCAGAATGATATTAAGGATGAGGACAAAGGC

GAGTCCATTATCACTATTGGTGAATTTGCCACAGTACGCGCGACTAGACATTATGTTAATCAA

GATGCGCCTTTTGGTGTCATCCATTTAGATATTACGACAGAAAATGGTACAAAAACGTACTCT

TATAACCGCAAAGAGGGTGAATTTGCAATCAATTGGTTAGTGCCTATTGGTGAAGATTCTCCT

GCAAGCATCAAAATCTCCGTTGATGAGCTCGATCAGCAACGCAATATCATCGAGGTGCCTAA

ACTGTATAGTATTGATCTCGATAACCAAACGTTAGAGCAGTGGAAAACCCAAGGTAATGTTTC

TTTTTCGGTAACGCGTCCTGAACATAATATCGCTATCTCTTGGCCAAGCGTGAGTTACAAAG

CAGCGCAGAAAGAGGGTTCACGCCATAAGCGTTGGGCTCATTGGCATACAGGCTTAGCACT

GTGTTGGCTTGTGCCAATGGATGCTATCTATAACTATATCACCCAGCAAAATTGTACTTTAGG

GGATAATTGGTTTGGTGGCTCTTATGAGACTGTTGCAGGCACTCCGAAGGTGATTACGGTTA

AGCAAGGGATTGAACAAAAGCCAGTTGAGCAGCGCATCCATTTCTCCAAGGGGAATGCGAT

GAGCGCACTTGCTGCTCATCGCGTCTGTGGTGTGCCATTAGAAACTTTGGCGCGCAGTCGC

AAACCTCGTGATCTGACGGATGATTTATCATGTGCCTATCAAGCGCAGAATATCGTGAGTTTA

TTTGTCGCGACGCGTATCCTGTTCTCTCATCTGGATAGCGTATTTACTCTGAATCTTGACGAA

CAAGAACCAGAGGTGGCTGAACGTCTAAGTGATCTTCGCCGTATCAATGAAAATAACCCGG

GCATGGTTACACAGGTTTTAACCGTTGCTCGTCAGATCTATAACGATTATGTCACTCACCATC

CGGGCTTAACTCCTGAGCAAACCAGTGCGGGTGCACAAGCTGCCGATATCCTCTCTTTATTT

TGCCCAGATGCTGATAAGTCTTGTGTGGCTTCAAACAACGATCAAGCCAATATCAACATCGA

GTCTCGTTCTGGCCGTTCATATTTGCCTGAAAACCGTGCGGTAATCACCCCTCAAGGCGTCA

CAAATTGGACTTACCAGGAACTCGAAGCAACACATCAAGCTCTGACTCGTGAGGGTTATGTG

TTCGTGGGTTACCATGGTACGAATCATGTCGCTGCGCAAACCATCGTGAATCGCATTGCCCC

TGTTCCGCGCGGCAACAACACTGAAAACGAGGAAAAGTGGGGCGGGTTATATGTTGCAACT

CACGCTGAAGTTGCCCATGGTTATGCTCGCATCAAAGAAGGGACAGGGGAGTATGGCCTTC

CGACCCGTGCTGAGCGCGACGCTCGTGGGGTAATGCTGCGCGTGTATATCCCTCGTGCTTC

ATTAGAACGTTTTTATCGCACGAATACACCTTTGGAAAATGCTGAGGAGCATATCACGCAAGT

GATTGGTCATTCTTTGCCATTACGCAATGAAGCATTTACTGGTCCAGAAAGTGCGGGCGGGG

AAGACGAAACTGTCATTGGCTGGGATATGGCGATTCATGCAGTTGCGATCCCTTCGACTATC

CCAGGGAACGCTTACGAAGAATTGGCGATTGATGAGGAGGCTGTTGCAAAAGAGCAATCGA

TTAGCACAAAACCACCTTATAAAGAGCGCAAAGATGAACTTAAG (서열번호: 2)

다양한 실시예에서, 콜릭스 독소는 서열번호: 2의 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99%의 관찰된 상동성을 공유하는 핵산 서열을 함유한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자의 제조에 사용되는 변형된 콜릭스 독소는 절단된 콜릭스 독소이고, 상기 융합 분자는 생물학적 활성 화물의 수용체를 활성화시키는 능력을 가진다. 본 명세서에 기재된 절단된 콜릭스 독소는 절단된 콜릭스 독소를 포함하는 아미노산 잔기를 참조하여 확인될 것이다, 예를 들어, 서열번호: 1의 아미노산 잔기 1-386으로 이루어진 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁸⁶ 로 확인될 것이다.

다양한 실시예에서, 융합 분자의 제조에 사용되는 변형된 콜릭스 독소는 돌연변이된 콜릭스 독소이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 돌연변이가 아미노산 잔기 결실을 수반하는 돌연변이된 콜릭스 독소는 결실된 아미노산 잔기, 예를 들어 서열번호: 1의 아미노산 E581이 결실된 돌연변이된 콜릭스 독소를 참조하여 확인될 것이며, 이것은 "콜릭스 ΔE581"로 확인될 것이다. 돌연변이가 아미노산 잔기 치환을 수반하는 돌연변이된 콜릭스 독소는 특정 아미노산 잔기에서 특정 아미노산 치환을 참조하여 확인될 것이다. 따라서, 잔기가 절단된 콜릭스 독소에서 나타날지라도, 용어 "S30A"는 서열번호: 1의 30번 위치에서 "S" (세린, 표준 단일 문자 코드) 잔기가 "A" (알라닌, 표준 단일 문자 코드)로 치환되는 것을 나타내며, 변형된 독소는 "콜릭스 ^S30A "로 확인될 것이다.

콜릭스 독소 도메인 Ia (서열번호: 1의 아미노산 1-265)는 세포 표면 수용체의 리간드로서 작용하고 세포에 융합 분자의 결합을 매개하는 "수용체 결합 도메인"이다, 예를 들어, 도메인 Ia는 융합 분자의 세포내이입(endocytosis)을 허용하기에 충분한 친화도를 갖는 상피 세포의 정단막(apical membrane) 상에 존재하는 세포 표면 수용체에 결합할 것이다. 도메인 Ia는 제한 없이 당업자에 의해 상피 세포의 정단막 상에 존재하는 것으로 알려진 임의의 수용체에 결합할 수 있다. 예를 들어, 수용체 결합 도메인은 α2-MR에 결합할 수 있다. 세포에 융합 분자의 결합을 매개하는 능력이 실질적으로 제거되지 않는 한, 보존적 또는 비보존적 치환은 도메인 Ia의 아미노산 서열에 대해 이루어질 수 있다. 다양한 실시예에서, 융합 분자는 돌연변이된 도메인 Ia를 포함하는 콜릭스 독소를 포함한다.

다양한 실시예에서, 도메인 Ia는 항원 제시 세포 (antigen presenting cell, APC) 수용체 결합 도메인을 포함한다. 다양한 실시예에서, APC 수용체 결합 도메인은 콜릭스 도메인 Ia의 세포 인식 도메인이거나 또는 APCs 상의 세포 표면 수용체와 결합하기에 충분한 콜릭스 도메인 Ia의 일부이다.

다양한 실시예에서, APC 수용체 결합 도메인은 수지상 세포 또는 다른 APC 상에 존재하는 것으로 확인된 수용체에 결합한다. APCs 상의 세포 표면 수용체의 예는 DEC-205 (CD205), CD207, CD209, CD11a, CD11b, CD11c, CD36, CD14, CD50, CD54, CD58, CD68, CD80, CD83, CD86, CD102, CD3, CD14, CD19, Clec9a, CMFR-44, 덱틴-1 (dectin-1), 덱틴-2, FLT3, HLA-DR, LOX-1, MHC II, BDCA-1, DC-SIGN, TLR(Toll-like receptors)-2, -3, -4, 및 -7, 및 α2-거대글로불린 수용체(α2-macroglobulin receptor) ("α2-MR")를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 다양한 실시예에서, APC 수용체 결합 도메인은 α2-MR이다.

콜릭스 독소 도메인 II (서열번호: 1의 아미노산 266-386)는 점막의 정단 표면(apical surface)을 경계로 하는 내강(lumen)으로부터 점막의 기저측면 쪽으로 통과세포외배출(transcytosis)을 매개하는 "통과세포외배출 도메인"이다. 본 명세서에 언급된 바와 같이, "통과세포외배출"은 편광 상피 세포를 통한 융합 분자의 트래피킹(trafficking)을 나타낸다. 이러한 트래피킹은 편광 상피 세포의 기저측면 막으로부터 생물학적 활성 화물의 방출을 허용한다. 통과세포외배출 활성이 실질적으로 제거되지 않는 한, 본 발명의 융합 분자는 도메인 II의 전체 아미노산 서열을 포함하는 변형된 콜릭스 독소를 포함할 수 있거나, 또는 도메인 II의 일부를 포함할 수 있다. 또한, 통과세포외배출 활성이 실질적으로 제거되지 않는 한, 보존적 또는 비보존적 치환은 통과세포외배출 도메인의 아미노산 서열에 대해 이루어질 수 있다. 통과세포외배출 도메인이 통과세포외배출 활성을 갖는지 여부를 결정하기 위해 당업자에 의해 일상적으로 사용될 수 있는 대표적인 분석법이 본 명세서에 기재되어 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 통과세포외배출 활성이 도메인 II의 전체 아미노산 서열을 포함하는 변형된 콜릭스 독소에 비해 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%이면, 통과세포외배출 활성은 실질적으로 제거되지 않는다.

다양한 실시예에서, 비-자연적으로 발생하는 융합 분자는 콜릭스 독소 도메인 II 내의 아미노산 잔기에서 절단된 변형된 콜릭스 독소를 포함하고, 상기 융합 분자는 생물학적 활성 화물의 수용체를 활성화시키는 능력을 가진다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁸⁶ (서열번호: 3) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁸⁵ (서열번호: 4) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁸⁴ (서열번호: 5) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁸³ (서열번호: 6) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁸² (서열번호: 7) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁸¹ (서열번호: 8) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁸⁰ (서열번호: 9) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁷⁹ (서열번호: 10) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁷⁸ (서열번호: 11) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁷⁷ (서열번호: 12) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁷⁶ (서열번호: 13) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁷⁵ (서열번호: 14) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁷⁴ (서열번호: 15) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁷³ (서열번호: 16) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁷² (서열번호: 17) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁷¹ (서열번호: 18) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁷⁰ (서열번호: 19) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁶⁹ (서열번호: 20) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁶⁸ (서열번호: 21) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁶⁷ (서열번호: 22) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁶⁶ (서열번호: 23) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁶⁵ (서열번호: 24) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁶⁴ (서열번호: 25) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁶³ (서열번호: 26) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁶² (서열번호: 27) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁶¹ (서열번호: 28) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁶⁰ (서열번호: 29) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁵⁹ (서열번호: 30) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁵⁸ (서열번호: 31) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁵⁷ (서열번호: 32) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁵⁶ (서열번호: 33) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁵⁵ (서열번호: 34) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁵⁴ (서열번호: 35) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁵³ (서열번호: 36) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁵² (서열번호: 37) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁵¹ (서열번호: 38) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁵⁰ (서열번호: 39) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁴⁹ (서열번호: 40) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁴⁸ (서열번호: 41) 이다.

콜릭스 독소 도메인 Ib (서열번호: 1의 아미노산 387-425)는 세포 결합, 전좌(translocation), ER 잔류(retention) 또는 ADP 리보실화 활성을 포함하여, 임의의 알려진 콜릭스의 활성에 필수적이지 않다. 다양한 실시예에서, 비-자연적으로 발생하는 융합 분자는 콜릭스 독소 도메인 Ib 내의 아미노산 잔기에서 절단된 변형된 콜릭스 독소를 포함하고, 상기 융합 분자는 생물학적 활성 화물의 수용체를 활성화시키는 능력을 가진다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴²⁵ (서열번호: 42) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴²⁴ (서열번호: 43) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴²³ (서열번호: 44) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴²² (서열번호: 45) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴²¹ (서열번호: 46) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴²⁰ (서열번호: 47) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴¹⁹ (서열번호: 48) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴¹⁸ (서열번호: 49) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴¹⁷ (서열번호: 50) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴¹⁶ (서열번호: 51) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴¹⁵ (서열번호: 52) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴¹⁴ (서열번호: 53) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴¹³ (서열번호: 54) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴¹² (서열번호: 55) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴¹¹ (서열번호: 56) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴¹⁰ (서열번호: 57) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴⁰⁹ (서열번호: 58) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴⁰⁸ (서열번호: 59) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴⁰⁷ (서열번호: 60) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴⁰⁶ (서열번호: 61) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴⁰⁵ (서열번호: 62) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴⁰⁴ (서열번호: 63) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴⁰³ (서열번호: 64) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴⁰² (서열번호: 65) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴⁰¹ (서열번호: 66) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ⁴⁰⁰ (서열번호: 67) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁹⁹ (서열번호: 68) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁹⁸ (서열번호: 69) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁹⁷ (서열번호: 70) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁹⁶ (서열번호: 71) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁹⁵ (서열번호: 72) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁹⁴ (서열번호: 73) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁹³ (서열번호: 74) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁹² (서열번호: 75) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁹¹ (서열번호: 76) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁹⁰ (서열번호: 77) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁸⁹ (서열번호: 78) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁸⁸ (서열번호: 79) 이다. 일 실시예에서, 절단된 콜릭스 독소는 콜릭스 ³⁸⁷ (서열번호: 80) 이다.

콜릭스 독소 도메인 III (서열번호: 1의 아미노산 426-634)는 세포독성의 원인이 되며 소포체 잔류 서열(endoplasmic reticulum retention sequence)을 포함한다. 도메인 III는 단백질 합성을 불활성화하는 신장 인자 2 (elongation factor 2, "EF2")의 ADP 리보실화를 매개한다. "내인성 ADP 리보실화 활성이 결여된" 콜릭스 또는 "해독된 콜릭스"는 콜릭스 도메인 III을 포함하지 않거나 또는 분자를 해독하는 방식으로 도메인 III 내에서 변형된 (변형된 변이체를 포함하여) 본 명세서에 기재된 임의의 콜릭스를 나타낸다. 예를 들어, 서열번호: 1의 581번 위치 아미노산에서 글루탐산 (Glu) 잔기의 결실은 분자를 해독한다. 이 해독된 콜릭스를 "콜릭스 ΔE581"라고 한다. 다양한 실시예에서, ER 잔류 신호 이외의 콜릭스 도메인 III의 부분은 다른 아미노산 서열로 대체될 수 있다. 이 아미노산 서열 자체는 비-면역원성, 약간 면역원성, 또는 고도의 면역원성일 수 있다. 고도의 면역원성 ER 잔류 도메인은 체액성 면역 반응을 유도하는데 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 콜릭스 도메인 III 자체는 고도의 면역원성이고 강건한 체액성 면역 반응이 요구되는 경우 융합 분자에서 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "해독된 콜릭스 서열"은 전장 서열 또는 전장 서열의 일부일 수 있다. 일반적으로, 해독된 콜릭스 서열은 세포 인식 도메인, 전좌 도메인, 또는 소포체 잔류 도메인과 같은 해독된 콜릭스의 특정 생물학적 활성을 갖는 하나 이상의 도메인 또는 도메인의 일부를 가진다. 예를 들어, 해독된 콜릭스 서열은 도메인 II 및 해독된 도메인 III만을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 해독된 콜릭스 서열은 도메인 Ia, 도메인 II 및 해독된 도메인 III만을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 해독된 콜릭스 서열은 도메인 Ia, Ib, II, 및 해독된 도메인 III 모두를 포함할 수 있다. 따라서, 해독된 콜릭스 서열은 천연(native) 콜릭스의 인접 서열(contiguous sequence)일 수 있거나, 또는 ADP 리보실화 활성이 결여된 천연 콜릭스의 비-인접 아서열(non-contiguous subsequences)로 구성된 서열일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 비-자연적으로 발생하는 융합 분자는 서열번호: 81에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 콜릭스 독소 ΔE581로 본 명세서에서 명명된, 돌연변이된 변형된 콜릭스 독소를 포함한다.

생물학적 활성 화물

변형된 콜릭스 독소 폴리펩티드 외에, 본 발명의 융합 분자는 피험자에게 전달하기 위한 생물학적 활성 화물을 더 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "생물학적 활성 화물"은 거대분자, 소분자, 펩티드, 폴리펩티드, 핵산, mRNA, miRNA, shRNA, siRNA, 안티센스 분자, 항체, DNA, 플라스미드, 백신, 고분자 나노입자, 또는 촉매-활성 물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 피험자의 혈류에 도입될 때 바람직한 생물학적 활성을 수행할 수 있는 거대분자이다. 예를 들어, 생물학적 활성 화물은 수용체 결합 활성, 효소 활성, 전달자 활성(messenger activity) (즉, 호르몬, 사이토카인, 신경전달물질(neurotransmitter), 또는 다른 신호 분자로서 작용), 발광 또는 기타 검출가능한 활성, 또는 조절 활성, 또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다. 특정 진단 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 인듐 및 테크네튬, 자성 입자, 공기 또는 바륨과 같은 방사선 불투과성 물질(radiopaque materials), 및 형광 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않는 약학적으로 허용가능한 감마-방출 부분에 결합할 수 있거나 또는 그 자체일 수 있다.

다양한 실시예에서, 융합 분자의 생물학적 활성 화물은 피험자의 혈액 이외의 피험자의 생물학적 구획에서 그 효과를 발휘할 수 있다. 예를 들어, 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 림프계에서 그 효과를 발휘할 수 있다. 다른 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 예를 들어, 피험자의 간, 심장, 폐, 췌장, 신장, 뇌, 골수 등과 같은 기관(organ) 또는 조직에서 그 효과를 발휘할 수 있다. 이러한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 검출가능한 농도로 혈액, 림프, 또는 다른 생물학적 유체에 존재하거나 또는 존재하지 않을 수도 있으나, 생물학적 효과를 발휘하기 위해 여전히 그 작용 부위에서 충분한 농도로 축적될 수 있다.

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 하나 이상의 폴리펩티드 아단위를 포함하는 단백질이다. 예를 들어, 단백질은 이량체, 삼량체, 또는 그 이상의 다량체일 수 있다. 다양한 실시예에서, 2 이상의 아단위의 단백질은 공유 결합, 예를 들어 이황화 결합으로 연결될 수 있다. 다른 실시예에서, 아단위의 단백질은 비-공유 상호작용과 함께 결합될 수 있다. 당업자는 이러한 단백질을 일상적으로 확인할 수 있고, 면역분석법을 이용하여 아단위가 적당히 관련되는지 여부를 결정할 수 있다.

다양한 실시예에서, 전달될 생물학적 활성 화물은 , 인터루킨-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30과 같은 사이토카인 및 사이토카인 수용체, 림포카인 저해 인자(lymphokine inhibitory factor), 대식세포 콜로니 자극 인자 (macrophage colony stimulating factor), 혈소판 유래 성장 인자(platelet derived growth factor), 줄기세포 인자(stem cell factor), 종양 성장 인자(tumor growth factor)-β, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor), 림프독소 (lymphotoxin), Fas, 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor), 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ; 에리트로포이에틴, 안지오제닌(angiogenin), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor), 각질형성세포 성장인자(keratinocyte growth factor), 신경 성장인자(nerve growth factor), 종양 성장 인자-α, 트롬보포이에틴, 갑상선 자극 인자(thyroid stimulating factor), 갑상선 방출 호르몬(thyroid releasing hormone), 뉴로트로핀(neurotrophin), 표피성장인자(epidermal growth factor), VEGF, 섬모 향신경성 인자(ciliary neurotrophic factor), LDL, 소마토메딘(somatomedin), 인슐린 성장인자(insulin growth factor), 인슐린-유사 성장 인자(insulin-like growth factor) I 및 II와 같은 성장인자 및 단백질 호르몬; ENA-78, ELC, GRO-α, GRO-β, GRO-γ, HRG, LEF, IP-10, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MIP-1-α, MIP-1-β, MG, MDC, NT-3, NT-4, SCF, LIF, 렙틴(leptin), RANTES, 림포탁틴(lymphotactin), 에오탁신(eotaxin)-1, 에오탁신-2, TARC, TECK, WAP-1, WAP-2, GCP-1, GCP-2와 같은 케모카인; α-케모카인 수용체, 예를 들어, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7; 및 β-케모카인 수용체, 예를 들어, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7로부터 선택된다.

본 발명에 따라 전달될 수 있는 생물학적 활성 화물의 다른 예는, 항종양성 화합물(antineoplastic compounds), 예를 들어, 니트로소우레아, 예컨대, 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴, 스트렙조토신; 메틸히드라진, 예컨대, 프로카바진, 다카바진; 스테로이드 호르몬, 예컨대, 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 프로제스틴, 안드로겐, 테트라히드로데스옥시카리코스테론; 면역활성 화합물, 예를 들어, 면역억제제, 예컨대, 피리메타민, 트리메토프테린, 페니실라민, 시클로스포린, 아자티오프린; 및 면역자극제, 예컨대, 레바미솔, 디에틸 디티오카바메이트, 엔케팔린, 엔돌핀; 항균성 화합물, 예를 들어, 항생제, 예컨대, β-락탐, 페니실린, 세팔로스포린, 카바페님 및 모노박탐, β-락타마제 저해제, 아미노글리코사이드, 마크로라이드(macrolides), 테트라사이클린, 스펙티노마이신; 항말라리아제, 항아메바제; 항원생동물제(antiprotazoals); 항진균제, 예를 들어, 암포테리신 β, 항바이러스제, 예를 들어, 아시클로버, 이독수리딘, 리바비린, 트리플루리딘, 비다르빈 (vidarbine), 갱시클로버; 구충제(parasiticides); 장내 구충제(antihalmintics); 방사성 의약품; 장관 약물; 혈액학적 화합물(hematologic compounds); 면역글로불린; 혈액 응고 단백질, 예를 들어, 항혈우병 인자(antihemophilic factor), 제9인자 복합체(factor IX complex); 항응고제, 예를 들어, 디쿠마롤, 헤파린 Na; 피브로리신 저해제, 예를 들어, 트라넥사민산(tranexamic acid); 심장혈관 약물 (cardiovascular drugs); 말초 항-아드레날린 약물(anti-adrenergic drugs); 중추작용 항고혈압 약물, 예를 들어, 메틸도파, 메틸도파 HCl; 항고혈압 직접 혈관확장제(antihypertensive direct vasodilators), 예를 들어, 디아족사이드, 히드랄라진 HCl; 레닌-안지오텐신 시스템에 영향을 미치는 약물; 말초 혈관확장제, 예를 들어, 펜토라민; 항-협심증 약물(anti-anginal drugs); 심장 글리코사이드(cardiac glycosides); 심근수축 혈관확장제(inodilators), 예를 들어, 암리논(amrinone), 밀리논(milrinone), 에녹시몬(enoximone), 페녹시몬(fenoximone), 이마조단 (imazodan), 술마졸(sulmazole); 항부정맥제(antidysrhythmics); 칼슘 차단제 (calcium entry blockers); 혈액 지질에 영향을 미치는 약물, 예를 들어, 라니티딘, 보센탄, 레줄린; 호흡기계 약물(respiratory drugs); 교감신경유사 약물 (sypathomimetic drugs), 예를 들어, 알부테롤, 비톨테롤 메실레이트, 도부타민 HCl, 도파민 HCl, 에페드린 So, 에피네프린, 펜플루라민 HCl, 이소프로테레놀 HCl, 메톡사민 HCl, 노르에피네프린 비타르트레이트(norepinephrine bitartrate), 페닐에프린 HCl, 리토드린 HCl; 콜린유사 약물 (cholinomimetic drugs), 예를 들어, 아세틸콜린 Cl; 항콜린에스터라제, 예를 들어, 에드로포늄 Cl(edrophonium Cl); 콜린에스터라제 재활성제(cholinesterase reactivators); 아드레날린 차단 약물 (adrenergic blocking drugs), 예를 들어, 아세부톨롤 HCl, 아테놀롤, 에스몰롤 HCl, 라베탈롤 HCl, 메토프롤롤, 나돌롤, 펜토라민 메실레이트, 프로파놀롤 HCl; 항무스카린 약물(antimuscarinic drugs), 예를 들어, 아니소트로핀 메틸브로마이드, 아트로민 SO ₄ , 클리니듐 Br, 글리코피롤레이트, 이프라트로피움 Br, 스코폴라민 HBr; 신경근 차단 약물(neuromuscular blocking drugs); 탈분극 약물(depolarizing drugs), 예를 들어, 아트라큐리움 베실레이트, 헥사플루오레늄 Br, 메토큐린 요오드, 석시닐콜린 Cl, 투보큐라린 Cl, 베큐로늄 Br; 중추작용 근육이완제, 예를 들어, 바클로펜; 신경전달물질 및 신경전달물질 제제, 예를 들어, 아세틸콜린, 아데노신, 아데노신 트리포스페이트; 아미노산 신경전달물질, 예를 들어, 흥분성 (excitatory) 아미노산, GABA, 글리신; 생체아민 신경전달물질, 예를 들어, 도파민, 에피네프린, 히스타민, 노르에피네프린, 옥토파민, 세로토닌, 티라민; 신경펩티드, 산화질소, K+ 채널 독소; 항파킨슨 약물, 예를 들어, 아말티딘 HCl, 벤즈트로핀 메실레이트, 카르비도파; 이뇨제, 예를 들어, 디클로르펜아미드, 메타졸아미드, 벤드로플루메티아지드, 폴리티아지드; 항편두통 약물, 예를 들어, 카르보프로스트 트로메타민 메실레이트, 메틸세르지드 말레에이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따라 전달될 수 있는 생물학적 활성 화물의 또 다른 예는, 뇌하수체 호르몬, 예를 들어, 융모성 고나도트로핀(chorionic gonadotropin), 코신트로핀 (cosyntropin), 메노트로핀(menotropins), 소마토트로핀(somatotropin), 이오르티코트로핀(iorticotropin), 프로티렐린(protirelin), 티로트로핀(thyrotropin), 바소프레신(vasopressin), 리프레신(lypressin); 부신 호르몬(adrenal hormones), 예를 들어, 베클로네타손 디프로프리오네이트(beclomethasone dipropionate), 베타메타손(betamethasone), 덱사메타손(dexamethasone), 트리암시놀론(triamcinolone); 췌장 호르몬(pancreatic hormones), 예를 들어, 글루카곤, 인슐린; 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone), 예를 들어, 디히드로타키스테롤(dihydrotachysterol); 갑상선 호르몬(thyroid hormones), 예를 들어, 칼시토닌 에티드로네이트 이나트륨 (calcitonin etidronate disodium), 레보티록신(levothyroxine) Na, 리오티로닌 (liothyronine) Na, 리오트릭스(liotrix), 티로글로불린(thyroglobulin), 테리파라티드 아세테이트(teriparatide acetate); 항갑상선 약물(antithyroid drugs); 에스트로겐 약물(estrogenic hormones); 프로게스틴(progestins) 및 길항제 (antagonists); 호르몬 피임제(hormonal contraceptives); 고환 호르몬(testicular hormones); 위장 호르몬(gastrointestinal hormones), 예를 들어, 콜레시스토키닌 (cholecystokinin), 엔테로글리칸(enteroglycan), 갈라닌(galanin), 위산 저해 폴리펩티드(gastric inhibitory polypeptide), 표피성장인자-유로가스트론(epidermal growth factor-urogastrone), 가스트린-방출 펩티드(gastrin-releasing peptide), 가스트린(gastrins), 펜타가스트린(pentagastrin), 테트라가스트린(tetragastrin), 모틸린(motilin), 펩티드 YY, 세크레틴(secretin), 혈관활성 장 펩티드(vasoactive intestinal peptide), 또는 신칼리드(sincalide)와 같은 호르몬을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따라 전달될 수 있는 생물학적 활성 화물의 또 다른 예는, 히알루로니다제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제(tissue plasminogen activator), 유로키나제(urokinase), PGE-아데노신 탈아미노효소(adenosine deaminase)와 같은 효소; 드로페리돌(droperidol), 에토미데이트(etomidate), 펜타닐 시트레이트(fentanyl citrate)/드로페리돌, 헥소바비탈(hexobarbital), 케타민 HCl, 메토헥시탈(methohexital) Na, 티아밀랄(thiamylal) Na, 티오펜탈 (thiopental) Na과 같은 정맥 마취제; 항간질제(antiepileptics), 예를 들어, 카바마제핀(carbamazepine), 클로나제팜(clonazepam), 디발프로엑스(divalproex) Na, 에토석시미드(ethosuximide), 메페니토인(mephenytoin), 파라메타디온 (paramethadione), 페니토인(phenytoin), 프리미돈(primidone)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 히알루로니다제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 유로키나제, PGE-아데노신 탈아미노효소로부터 선택된 효소이다.

본 발명에 따라 전달될 수 있는 생물학적 활성 화물의 또 다른 예는, 화학요법제, 예를 들어 백혈병, 림프종, 암종(carcinomas), 육종(sarcomas), 골수종 (myelomas) 등을 포함하여, 다양한 유형의 인간 암에 대해 효과적인 화학요법 또는 항-종양제, 예를 들어, 독소루비신, 미토마이신, 시스플라틴, 다우노루비신, 블레오마이신, 악티노마이신 D, 및 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

염증 조절제 (인터루킨-10 및 관련 사이토카인)

인터루킨-10 (IL-10)은 많은 세포 집단에 의해 생성되는 중요한 면역조절 사이토카인이며, 이의 주요 생물학적 기능은 염증 반응의 제한 및 종결 및 T 세포, B 세포, 자연 살해 세포, 항원-제시 세포, 비만 세포, 및 과립구와 같은 여러 면역 세포의 분화 및 증식의 조절인 것 같다. 보다 최근의 자료는 IL-10도 제한된 염증을 가진 감염성 및 비감염성 입자를 제거하는데 도움이 되는 면역자극 특성을 매개한다는 것을 제시한다; Asadullah et al., Pharmacol Rev , 55:241-269, 2003. 또한, 수많은 연구는 염증성 질환, 악성 질환, 및 자가면역 질환에서 IL-10의 주요 영향을 제시하고, IL-10 과발현은 흑색종, 기저세포 및 편평세포 암종, 및 여러 림프종과 같은 특정 종양에서 확인되었다; Id. IL-10과 구조적으로 관련된 5개의 새로운 인간 분자인, IL-19 (Gallagher et al., Genes Immun ., 1:442-450, 2000); IL-20 (Blumberg et al., Cell, 104:9-19, 2001), IL-22 (Dumoutier et al., Genes Immun., 1:488-494, 2000), IL-24 (Jiang et al., Oncogene , 11:2477-2486, 1995) 및 IL-26 (Knappe et al., J. Virol ., 74:3881-3887, 2000)이 발견되었고, 자료는 면역 세포가 새로운 IL-10 계열 일원(family members)의 주요 공급원임을 제시한다; Wolk et al., J. Immunol ., 168:5397-5402, 2002.

실험 모델에서 여러 염증성 질환의 과정 중에 IL-10 전달로부터 일부 유망한 결과가 있었지만, 염증성 및/또는 면역 장애의 치료를 위한 치료제로서 IL-10을 평가하는 여러 임상 연구는 대다수의 자료가 상반되어서, 다소 실망스러웠다; Asadullah et al., Pharmacol Rev , 55:241-269, 2003. 전반적으로, 상기 자료는 IL-10이 안전하고 일반적으로 내성이 좋다는 것을 시사하나, 표준 용량으로 전신 투여한 후 장내에서 궁극적인 국소 IL-10 농도가 너무 낮아서, 단지 한계 효능 (marginal efficacy)만을 야기한다. Id. 불행하게도, 용량을 충분히 증가시키는 능력은 부작용 (예를 들어, 빈혈, 두통)으로 인해 제한되고, 전신 투여된 IL-10의 더 높은 용량은 크론병과 같은 특정 징후에서 도움이 되기보다는 오히려 해로울 수 있다는 우려가 있다; Herfarth et al, Gut , 50(2): 146-147, 2002.

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 인터루킨-10, 인터루킨-19, 인터루킨-20, 인터루킨-22, 인터루킨-24, 또는 인터루킨-26으로부터 선택되는 위장관에서 염증 조절제로 결정된 폴리펩티드이다.

인터루킨-10 (IL-10)은 제 2 형 헬퍼 T 세포의 생성물로서 처음 확인되었으며, 나중에 B 세포 및 대식세포를 포함하는 다른 세포 유형에 의해 생성되는 것으로 나타났다 (Moore et al., Annu Rev Immunol, 19:683-765, 2001). 또한, 이것은 제 1 형 헬퍼 T 세포로부터 생성된 여러 사이토카인, 예를 들어 γ-인터페론, IL-2, 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 합성을 저해한다 (Fiorentino et al., J Immunol , 146:3444-3451, 1991). IL-10이 세포-매개 면역 반응 조절제를 저해하고 항원-제시 세포-의존성 T 세포 반응을 억제하는 능력은, IL-10이 면역억제 특성을 갖는다는 것을 나타낸다. 또한, 이러한 사이토카인은 IL-1, IL-6, IL-8, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), 과립구 콜로니-자극 인자(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF), 및 TNF-α와 같은 다른 사이토카인의 단핵구/대식세포 생성을 저해한다.

IL-10 단백질은 이의 2개의 단량체 아단위를 연결하는 비-공유 상호작용의 파괴시 생물학적으로 불활성이되는 기능성 이량체를 형성한다. N-말단은 IL-10 수용체 활성화와 직접 관련되지 않는 것으로 보인다. 따라서, 본 발명의 일 측면에서, 융합 분자는 절단형 링커를 이용하여 변형된 콜릭스 독소의 C-말단에 IL-10 단백질의 N-말단을 통한 결합을 통해 구축된다. 이러한 구조는 IL-10 상호작용의 결과로서 용액 이량체를 야기할 수 있다.

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 82에 제시된 아미노산 서열을 갖는 인간 인터루킨-10 또는 이의 단편 또는 변이체이다:

MHSSALLCCLVLLTGVRASPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQM

KDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENL

KTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKI

RN (서열번호: 82)

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 82의 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99%의 관찰된 상동성을 공유하는 아미노산 서열을 함유한다.

IL-19는 IL-10 사이토카인 아계열(subfamily)에 속하는 사이토카인이다. 이 사이토카인은 단핵구에서 우선적으로 발현되는 것으로 밝혀졌다. 이것은 IL-20 수용체 복합체를 결합할 수 있고 전사 3의 신호 변환기(signal transducer) 및 활성제(activator) (STAT3)의 활성화를 야기할 수 있다 (Yamamoto-Furusho JK, et al . Hum Immunol, 72(11):1029-32, 2011). 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 83에 제시된 아미노산 서열을 갖는 인간 인터루킨-19 또는 이의 단편 또는 변이체이다:

MKLQCVSLWLLGTILILCSVDNHGLRRCLISTDMHHIEESFQEIKRAIQAKDTFPNVTILST

LETLQIIKPLDVCCVTKNLLAFYVDRVFKDHQEPNPKILRKISSIANSFLYMQKTLRQCQE

QRQCHCRQEATNATRVI HDNYDQLEVHAAAIKSLGELDVFLAWINKNHEVMSSA

(서열번호: 83)

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 83의 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99%의 관찰된 상동성을 공유하는 아미노산 서열을 함유한다.

IL-20은 인터루킨 10 (IL-10)과 구조적으로 관련된 사이토카인이다. 이 사이토카인은 각질형성세포에서 전사 3의 신호 변환기 및 활성제 (STAT3)를 통해 이의 신호를 변환하는 것으로 나타났다. 이 사이토카인에 대해 특이적인 수용체는 피부에서 발현되고 건선 피부에서 급격히 상향조절되는 것으로 밝혀졌으며, 이는 표피 기능 및 건선에서 이 단백질의 역할을 암시한다 (Yamamoto-Furusho JK, et al . Immunol Lett, 149(1-2):50-3 2013). 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 84에 제시된 아미노산 서열을 갖는 인간 인터루킨-20 또는 이의 단편 또는 변이체이다:

MKASSLAFSLLSAAFYLLWTPSTGLKTLNLGSCVIATNLQEIRNGFSEIRGSVQAKDGNI

DIRILRRTESLQDTKPANRCCLLRHLLRLYLDRVFKNYQTPDHYTLRKISSLANSFLTIKK

DLRLCHAHMTCHCGEEAMK KYSQILSHFEKLEPQAAVVKALGELDILLQWMEETE

(서열번호: 84)

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 84의 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99%의 관찰된 상동성을 공유하는 아미노산 서열을 함유한다.

IL-22는 인터루킨 10 (IL-10)과 구조적으로 관련된 사이토카인이다. IL-22 분비 CD4(+) T (Th22) 세포 및 IL-22는 자가면역 질환의 발병기전에 관여하며, NMO 및 MS의 발병기전에서 중요한 역할을 할 수 있다 (Xu et al., J Neuroimmunol., Aug 15;261(1-2):87-91, 2013). 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 85에 제시된 아미노산 서열을 갖는 인간 인터루킨-22 또는 이의 단편 또는 변이체이다:

MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAAAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFML

AKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQE

VVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNA

CI (서열번호: 85)

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 85의 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99%의 관찰된 상동성을 공유하는 아미노산 서열을 함유한다.

IL-24는 다양한 암 세포에서 선택적으로 아폽토시스를 유도할 수 있는 인터루킨 10 (IL-10)과 구조적으로 관련된 사이토카인이다. 이 유전자의 과발현은 아폽토시스의 유도와 관련 있는 여러 GADD 계열 유전자의 발현을 증가시킨다. 미토겐-활성화 단백질 키나제 14 (MAPK7/P38), 및 열 충격 27kDa 단백질 1 (HSPB2/HSP27)의 인산화는 흑색종 세포에서 이 유전자에 의해 유도되나, 정상 불멸 멜라닌형성세포(melanocytes)에서는 그렇지 않은 것으로 밝혀졌다 (Lin BW, et al ., J Korean Med Sci, 28(6):833-9, 2013). 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 86에 제시된 아미노산 서열을 갖는 인간 인터루킨-24 또는 이의 단편 또는 변이체이다:

MNFQQRLQSLWTLASRPFCPPLLATASQMQMVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHF

GPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLL

EFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLF

RRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL (서열번호: 86)

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 86의 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99%의 관찰된 상동성을 공유하는 아미노산 서열을 함유한다.

IL-26은 헤르페스바이러스 사이미리(herpesvirus saimiri)-형질전환된 T 세포에서 이의 특이적인 과발현에 의해 동정되었다. 인코딩된 단백질은 IL-10 계열의 사이토카인의 일원이다. 이것은 분비된 단백질이며, 동종이량체(homodimer)로서 작용할 수 있다. 이 단백질은 헤르페스바이러스 사이미리에 의한 감염 후 T 세포의 형질전환된 표현형에 기여하는 것으로 생각된다 (Corvaisier M, et al . PLoS Biol, 10(9):e1001395, 2012). 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 87에 제시된 아미노산 서열을 갖는 인간 인터루킨-26 또는 이의 단편 또는 변이체이다:

MLVNFILRCGLLLVTLSLAIAKHKQSSFTKSCYPRGTLSQAVDALYIKAAWLKATIPEDRI

KNIRLLKKKTKKQFMKNCQFQEQLLSFFMEDVFGQLQLQGCKKIRFVEDFHSLRQKLS

HCISCASSAREMKSITRMKRIFYRIGNKGIYKAISELDILLSWIKKLLESSQ

(서열번호: 87)

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 87의 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99%의 관찰된 상동성을 공유하는 아미노산 서열을 함유한다.

중요하게도, 절단형 링커가 결여된 비-자연적으로 발생하는 융합 분자는 (그러나 상당히 적은 양의) IL-10의 수용체도 발현하는 면역 세포의 표면에서 이의 수용체(들)에 의한 변형된 콜릭스 독소의 앵커링 효과가 표적 세포의 표면에서 IL-10을 더 많이 노출시킬 수 있고, 이의 수용체에 콜릭스의 결합 및 IL-10R에 IL-10의 결합을 통해 상승 효과를 제공할 수 있다는 점에서 유리할 수 있다.

종양 괴사 인자 초계열 (Tumor Necrosis Factor Super Family)

종양 괴사 인자는 상응하는 초계열의 수용체 (이하 "TNFSFR")와 상호작용하는 빠르게 성장하는 초계열의 사이토카인 (이하 "TNFSF") 이다. 약 25년 전에 종양 괴사 인자-알파 ("TNF-α")가 발견된 이후, TNFSF가 30 이상의 수용체를 통해 신호를 보내는 20 이상의 일원으로 이루어진 큰 계열(large family)의 관련 단백질로 성장하였다 (참조, 예를 들어, "Therapeutic Targets of the TNF Superfamily", edited by Iqbal S. Grewal, Landes Bioscience/Springer Science+Business Media, LLC dual imprint / Springer series: Advances in Experimental Medicine and Biology, 2009). TNFSF의 일원은 광범위한 조직 분포를 가지며, TNFSF 리간드-수용체 상호작용은 활성화, 증식, 분화 및 아폽토시스를 포함하여, 조혈 (hematopoiesis)에서 다발성 세포 반응(pleiotropic cellular responses)에 이르는, 다양한 생물학적 과정에 관여한다. TNFSF 리간드-수용체 상호작용은 종양 형성, 이식 거부, 패혈성 쇼크, 바이러스 복제, 골 흡수 및 자가면역에도 관련되어 있다. 특정 반응은 신호, 세포 유형, 및 세포에 의해 수신된 동시 신호인 수용체에 의존한다.

다수의 TNFSF 일원이 종양 세포에서 발현되기 때문에, 항체 기반 치료법은 이들 분자를 표적화하기 위해 개발되고 있으며, 일부는 현재 임상 실험 중이다 (예를 들어, 육종 및 흑색종의 치료에서 인간에 사용하기 위한 TNF-α) (Eggermont et al., Lancet Oncol, 4:429-437, 2003; Lans et al., Clin Cancer Res, 7:784-790, 2001). 또한, 이들 분자들 중 다수는 항체-약물 컨쥬게이트 (예를 들어, CD30 및 CD70)의 표적으로서 이용되거나, 또는 방사선 면역 요법(radioimmunotherapy) (예를 들어, BLyS 수용체 TACI 및 BR3)으로 이용되고 있다 (Buchsbaum et al., J Nucl Med, 44:434-436, 2003).

유사하게, 다수의 TNFSF 일원은 병원균, 염증성 반응 및 자가면역에 대한 방어와 같은 선척적 및 후천적 면역 반응과 관련이 있기 때문에, 자가면역 및 기타 염증성 질환의 치료를 위한 많은 TNFSF 수용체 및 리간드를 표적화하는 방법이 개발되고 있다. 실제로, 인간화/인간 단일클론 항체 (예를 들어, 인플릭시맙 (infliximab) (REMICADE®) 또는 아달리무맙(adalimumab) (HUMIRA®)) 또는 IgG 및 가용성 TNFSF 수용체의 재조합 융합 단백질 (예를 들어, 에타네르셉트(etanercept) (ENBREL®))를 포함하여 다수의 생물학적 TNF 차단 치료제 (이하, "TNF 저해제")가 개발되었으며, 현재 인간에서 크론병과 류마티스 관절염에 관련된 염증을 저해하는데 사용되고 있다 (Mitoma et al., Arthritis Rheum, 58:1248-1257, 2008; Shealy et al., Handb Exp Pharmacol, 181:101-129, 2008). 따라서, 장내 및 폐 점막을 포함하나 이에 한정되지 않는 국소적으로 이러한 제제를 전달할 수 있는 가능성은, 효능 및 안전성에 부가적인 이점을 제공할 것이다.

이들 다양한 TNF 저해제가 인간 치료제로 승인되고 인간 환자에서 성공적으로 사용되고 있지만, 이들 TNF 저해제와 관련된 다수의 독성, 예를 들어 간독성, 혈전색전증 합병증(thromboembolic complications), 및 결핵 및 림프종의 발병 위험의 증가가 남아 있다 (Gardam et al., Lancet Infect Dis, 3:148-155, 2003). 또한, 질환의 진행을 정지시키는데 효과적이지만, 이들 제제는 매우 고가이며, 일반적으로 정맥내 또는 피하로 투여되고, 질환을 치유하지 않는다. 표적 치료제의 부작용을 줄일 수 있는 조직 특이적 개입을 위한 방법을 개발하기 위해, TNFSF 일원의 신호 전달(signal transduction)의 지속적인 검사가 필요하다.

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 분리된 항체 또는 항체 단편인 TNF 저해제이다. 본 발명의 구조체 및 방법에서 유용한 분리된 항체 또는 항체 단편은 제한 없이 단일클론 Abs (mAbs), 다클론 Abs, Ab 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 키메라 Abs, 미니-Abs 또는 도메인 Abs (dAbs), 이중 특이적(dual specific) Abs, 이중특이적(bispecific) Abs, 이종컨쥬게이트 Abs, 단일쇄 Abs (SCA), 단일쇄 가변영역 단편 (ScFv), Ab 부분 또는 다중 Ab 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화 Abs, 완전 인간 Abs, 및 요구되는 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린(Ig) 분자의 임의의 다른 변형된 형태를 포함한다.

항-TNF-α 항체. FDA 승인된 항-TNF-α 항체인, 아달리무맙 (Abbvie HUMIRA®; DrugBank DB 00051)은 인간을 치료하는데 사용되었다. 본 발명의 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 88에 제시된 중쇄가변영역 서열:

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGK

GLEWVSAITWNSGHIDYADSVERGFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAE

DTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS

SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS

GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC

(서열번호: 88)

및 서열번호: 89에 제시된 경쇄가변영역 서열:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAA

STLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQG

TKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL

QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT

KSFNRGEC (서열번호: 89)

을 포함하는 인간 항체 또는 항원-결합 단편 또는 이의 항원-결합 또는 면역학적 기능성 면역글로불린 단편이다.

다양한 실시예에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체를 제공하며, 상기 종쇄는 중쇄가변영역을 포함하고, 상기 중쇄가변영역은 서열번호: 88에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 상기 경쇄는 경쇄가변영역을 포함하고, 상기 경쇄가변영역은 서열번호: 89에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 상기 항체는 인간 TNF-α에 특이적으로 결합한다.

FDA 승인된 항-TNF-α 항체인, 인플릭시맙 (Centocor REMICADE®; DrugBank DB 00065)은 인간을 치료하는데 사용되었다. 본 발명의 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 90에 제시된 중쇄가변영역 서열:

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQA

PGKGLEWVAIISFDGSNKSSADSVKGRFTUSRRNSKNALFLQM

NSLRAEDTAVFYCARDRGVSAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSS

(서열번호: 90)

및 서열번호: 91에 제시된 경쇄가변영역 서열:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQA

PRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTRFTLTISSLEPEDFAVYYC

QQRSNWPPFTFGPGTKVDIL (서열번호: 91)

을 포함하는 인간 항체 또는 항원-결합 단편 또는 이의 항원-결합 또는 면역학적 기능성 면역글로불린 단편이다.

다양한 실시예에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체를 제공하며, 상기 종쇄는 중쇄가변영역을 포함하고, 상기 중쇄가변영역은 서열번호: 90에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 상기 경쇄는 경쇄가변영역을 포함하고, 상기 경쇄가변영역은 서열번호: 91에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 상기 항체는 인간 TNF-α에 특이적으로 결합한다.

여러 다른 TNFSF 리간드 또는 TNFSFRs에 대한 항체가 문헌에 기재되어 있으며, 다양한 염증성 질환, 자가면역 질환 및 암의 치료 또는 예방에서 치료 후보 물질로 평가된다. 지정된 TNFSF 폴리펩티드 또는 TNFSFRs에 대한 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 공개적으로 이용가능한 데이터베이스로부터 용이하게 이용가능하다. 이러한 항체 및 추가의 TNF 저해제의 종합적인 검토는 Iqbal S. Grewal, Landes Bioscience/Springer Science+Business Media, LLC dual imprint / Springer series: Advances in Experimental Medicine and Biology, 2009에 의해 편집된 "TNF 초계열의 치료 표적"에서 제공되며, 이러한 TNF 저해제를 교시하기 위한 목적으로 전체 참조로 본 명세서에 포함된다.

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 가용성 수용체 또는 가용성 공동-리간드(co-ligand)를 포함하는 TNFSF 저해제이다. 용어 "가용성 수용체", "가용성 사이토카인 수용체(SCR)" 및 "면역어드헤신(immunoadhesin)"은 수용체, 예를 들어 수용체의 결합 특이성을 보유하고 TNFSF 일원에 결합할 수 있는 TNFSF 일원 및 Ig 서열의 수용체의 세포외 도메인을 포함하는 가용성 키메라 분자를 나타내는 것으로 통용된다. 다양한 실시예에서, TNFSFSCR은 TNFSF 일원에 결합할 수 있는 TNFSF 일원 세포외 도메인의 TNFSFR 아미노산 서열 (또는 이의 일부) (일 실시예에서, TNFSFR의 결합 특이성을 실질적으로 보유하는 아미노산 서열) 및 Ig 서열의 융합을 포함한다. 2개의 다른 유형의 TNFSFR은 제 I 형 TNFSFR (TNFSFRI) 및 제 II 형 TNFSFR (TNFSFRII)로 존재하는 것으로 알려져 있다. 다양한 실시예에서, TNFSF 수용체는 인간 TNFSF 수용체 서열이고, 융합은 Ig 불변 도메인 서열이다. 다른 실시예에서, Ig 불변 도메인 서열은 Ig 중쇄 불변 도메인 서열이다. 다른 실시예에서, (예를 들어, 이황화 결합에 의한 공유 결합을 통해) 2개의 TNF 수용체-Ig 중쇄 융합의 결합은 동종이량체 Ig-유사 구조를 야기한다.

본 발명에서 유용한 시판되는 가용성 수용체의 예는 ENBREL® (에타네르셉트) 이다. ENBREL®은 인간 IgG1의 Fc 부분에 연결된 인간 75 킬로달톤 (p75) 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR)의 세포외 리간드-결합 부분으로 구성되는 재조합 인간 TNFR-p75-Fc 이량체 융합 단백질로 구성된다. 에타네르셉트의 Fc 성분은 CH2 도메인, CH3 도메인 및 힌지 영역(hinge region)을 함유하나, IgG1의 CH1 도메인은 함유하지 않는다. 에타네르셉트는 중국 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary, CHO) 포유류 세포 발현 세스템에서 재조합 DNA 기술에 의해 생성된다. 이것은 934 아미노산으로 이루어진다. 생성물은 IgG의 Fc 부분을 갖는 인간 TNFR-p75의 가용성 부분의 DNA를 인코딩함으로써 만들어진다. 본 발명의 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 92에 제시된 서열을 포함하는 이량체 융합 단백질인 TNF 저해제 또는 이의 단편 또는 변이체이다:

LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTS

DTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPG

WYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSS

TDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQ

HTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDEPKSCDKTHTCPPCPAPE

LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV

EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK

TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP

ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK

SLSLSPGK (서열번호: 92)

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 92의 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성의 관찰된 상동성을 공유하는 아미노산 서열을 함유한다.

TNF 저해제가 유래되고 본 발명의 구조체 및 방법에서 생물학적 활성 화물로 사용될 것으로부터의 적당한 TNFSF 리간드 및 TNFSFRs의 예시적이나 이에 한정되지 않는 목록이 표 2에 제공된다.

포도당- 저하제

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 포도당-저하제이다. 다양한 실시예에서, 포도당-저하제는 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 300, 약 400, 약 500, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900 또는 약 1000 아미노산을 포함하는 펩티드이다.

본 발명의 융합 분자에서 포도당-저하제로 사용되거나, 또는 포도당-저하제로의 사용을 고려한 포도당-저하제가 유도될 수 있는 것으로부터의 적당한 포도당 대사-관련 단백질의 예시적이나 이에 한정되지 않는 목록이 표 3에 제공된다.

글루카곤 전구체 전전구글루카곤(preproglucagon)의 조직-특이적 번역-후 처리에 의해 장내 L-세포에서 합성된 전구-글루카곤 인크레틴 계열의 일원인, 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1)은 식욕 및 포만감의 조절에 관련되는 강력한 포도당-저하제이다. GLP-1은 뇌, 췌장, 장, 폐, 위, 및 신장을 포함하여, 조직에 널리 분포되어 있는 GLP-1 수용체 (GLP-1R)를 통해 작용한다. GLP-1의 효과는 주위 포도당 농도에 따라, 인슐린 분비성(insulinotropic) 및 인슐린 유사성(insulinomimetic)인 것으로 보인다. 췌장에서 인슐린 분비를 증가시키고, 알파 세포와 베타 세포 모두에서 인슐린 민감성을 증가시키며, 췌장에서 글루카곤 분비를 감소시키는 능력으로 인해, GLP-1 및 이의 유사체는 당뇨병의 치료 전략으로 상당한 주목을 끌었다.

진행중인 인슐린 요법과 함께 GLP-1 작용제를 추가하는 여러 임상 시험이 연구되었고, 여러 GLP-1 작용제는 엑세나티드 (상품명 Byetta®, 애밀린/아스트라제네카); 리라글루티드 (상품명 Victoza®, 노보 노르디스크 A/S); 릭시세나티드 (lixisenatide) (상품명 Lyxumia®, 사노피); 알비글루티드(albiglutide) (상품명 Tanzeum®, 글락소스미스클라인); 둘라글루티드(dulaglutide) (상품명 Trulicity®, 일라이 릴리)를 포함하여, T2D의 치료를 위해 승인되었다. GLP-1 작용제의 효능이 입증된 반면, GLP-1 작용제의 임상 사용과 관련된 주요 단점은 정맥내 주사 또는 빈번한 피하 주사에 의한 연속 투여를 필요로 하는 짧은 생물학적 반감기이고, 지금까지 승인된 모든 GLP-1 약물은 1일 2회 또는 1주일에 1회 기준으로 피하 투여된다. 또한, 이러한 GLP-1 작용제의 사용과 관련된 안전성 문제, 즉, 췌장염 및 췌장 종양, 저혈당증, 및 신장 손상이 있다. 다른 보고된 부작용은 위장 장애 (gastrointestinal disorders), 예를 들어 소화불량, 식욕 감퇴, 메스꺼움, 구토, 복통, 설사, 현기증, 두통, 및 초조한 느낌(feeling jittery)을 포함한다. 이와 같이, T2D 환자의 주사 빈도를 줄이기 위해 더 오래 지속되는 천연 GLP-1의 유사체의 제조, 및 서방출(sustained release) 및 기타 관련 기술의 개발에 대한 광범위한 연구가 계속되고 있다.

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 93에 제시된 아미노산 서열을 갖는 GLP-1 작용제 또는 이의 단편 또는 변이체이다:

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (서열번호: 93)

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 93의 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99%의 관찰된 상동성을 공유하는 아미노산 서열을 함유한다.

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 94에 제시된 아미노산 서열을 갖는 GLP-1 작용제 또는 이의 단편 또는 변이체이다:

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEEFIIAWLVKGRG (서열번호: 94)

다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 서열번호: 94의 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99%의 관찰된 상동성을 공유하는 아미노산 서열을 함유한다.

인간 성장 호르몬

성장 호르몬(Growth Hormone, GH) (소마트로핀(somatropin) 또는 소마토트로핀(somatotropin)으로도 알려짐)은 인체의 주 호르몬(master hormone)이고, 내분비계에 의해 합성되고 분비된다. 이 호르몬은 신체의 다양한 기관에서 세포의 성장 및 복제와 같은 필수 기능을 조절한다. GH의 필수 기능의 일부는 근육 성장 조절, 뼈의 무기화(mineralization) 및 강도 향상, 지방 침착(fat deposition) 감소, 및 좋은 에너지 수준 유지를 포함한다. 성장 호르몬의 생성 및 분비는 시상하부 (hypothalamus)에 의해 분비되는 성장 호르몬 방출 호르몬(Growth Hormone Releasing Hormone, GHRH)에 의해 조절된다. GHRH는 뇌하수체(pituitary gland)를 자극하여 혈류로 직접 방출되는 GH를 생성한다. GH는 차례로 간을 자극하여 연골세포(chondrocytes) (cartilaginous cells)의 증식을 자극하고, 근아세포(myoblasts)의 분화를 촉진하며, 단백질 합성을 향상시키고, 차례로 다른 근육 및 조직 세포의 성장에 도움을 주는 인슐린-유사 성장 인자(Insulin-like Growth Factor, IGF-1)를 생성한다.

미국에서는, 합성으로 생성된 인간 성장 호르몬 (HGH)을 소아 집단에서 사용하여 성장 호르몬 결핍증 (GHD), 터너 증후군 (TS), 누난 증후군, 프라더-윌리 증후군, 저신장증 호메오박스-함유 유전자 (SHOX) 결핍증, 만성 신부전증, 특발성 저신장증 및 부당경량아 (children small for gestational age)로 인한 저신장증을 치료하였다. 성인에서는, HGH를 사용하여 단장 증후군(short bowel syndrome), 소장의 상당 부분의 제거 수술 또는 장내 질환(intestinal disease)의 절단으로 인해 영양분을 적절히 흡수하지 못하는 질병, 희귀한 뇌하수체 종양 또는 이의 치료로 인한 GH 결핍증, 및 HIV/AIDS와 관련된 근육-소모성 질환을 치료하였다.

성장 호르몬 결핍증 (GHD)은 여러 호르몬의 생성의 원인이 되는 뇌의 기저에 위치한 작은 샘(small gland)인, 뇌하수체전엽으로부터 성장 호르몬 (GH)의 불충분한 분비에 의해 특징지워진 다른 병리학의 군을 포함하는 희귀한 장애이다. GHD는 그 자체로 또는 다른 뇌하수체 호르몬 결핍증과 함께 발생할 수 있다. GHD는 출생 (선천적) 시 존재하거나 또는 외상, 침윤, 종양 또는 방사선 요법의 결과로 획득될 수 있다. 알려진 원인이 없는 세번째 범주 (특발성)가 있다. 소아기-발병 GHD는 선척적, 후천적, 또는 특발성의 3가지 모두일 수 있다. 이것은 성장 지연, 저신장, 및 아이의 생활 연령(chronological age)에 부적합한 사지의 뼈 (bones of the extremities)의 늘리기의 지연에 의해 반영된 성숙 지연을 야기한다. 성인-발병 GHD는 뇌하수체 종양 또는 뇌의 외상에서 가장 흔하게 발병하지만 특발성일 수도 있다. 이것은 에너지 수준 감소, 신체 조성 변화, 골다공증 (골밀도 감소), 근육 강도 감소, LDL 또는 콜레스테롤 수준 증가와 같은 지질 이상, 인슐린 저항성, 및 심장 기능 손상을 포함하여 다수의 다양한 증상으로 특징지워진다. 성인 GHD는 매년 100,000명 중 1명에 영향을 미치는 것으로 추정되고, 이의 발생률은 소아기-발병 GHD 환자를 고려할 때 100,000명 당 대략 2명이다. 이러한 사례의 약 15-20%는 소아기 GHD가 성인기로의 전이로 나타난다 (Stochholm K et al., Eur J Endocrinol ., 155:61-71, 2006).

터너 (또는 울리히-터너(Ullrich-Turner)) 증후군 (TS)은 전체 염색체 X가 없거나 또는 그 염색체 내에 결실로 특징지워진 염색체 이상이며, 여성에서의 성장에 영향을 미친다. 터너 증후군의 가장 공통적인 특징은 저신장이며, 5세쯤 되면 분명해진다. 이 질병은 전세계적으로 2,500명의 신생 여아 중 약 1명에서 발생하나, 생존하지 못하는 임신 (유산 및 사산) 중에서 훨씬 더 흔하다. 염색체 질병으로서, 터너 증후군에 대한 치료법은 없다.

재조합 DNA-유래 인간 성장 호르몬은 GHD 및 TS의 치료를 위해 특별히 승인된 유일한 약물이다. 2005년 현재, 미국 (및 이의 제조사)에서 이용가능한 다양한 재조합 인간 성장 호르몬 (주사용 소마트로핀 [rDNA 기원]이라고도 함)은, NUTROPIN® (제넨테크), HUMATROPE® (릴리), GENOTROPIN® (화이자), NORDITROPIN® (노보), 및 SAIZEN® (머크 세로노)을 포함하였다. 2006년에, 미국 식품의약국 (FDA)은 OMNITROPE® (산도즈)로 불리는 rHGH의 버전을 승인하였다. 보다 적은 주사를 고려하여 (매일 대신 2주 또는 4주 마다), 인간 성장 호르몬의 서방출 형태인 NUTROPIN DEPOT® (제넨테크/알케르메스)는 1999년에 FDA에 의해 승인을 받았다; 그러나, 상기 제품은 재정적인 이유로 2004년 제넨테크/알케르메스에 의해 중단되었다. 추가 승인된 재조합 HGH 제품은 단장 증후군에 대해 SEROSTIM® (EMD 세로노), TEV-TROPIN® (테바) 및 ZORBITIVE® (머크 세로노)을 포함한다.

이러한 주사가능한 rHGH's는 GHD와 같은 성장 장애의 관리를 위해 가장 효과적이고 자발적이며 신뢰할 수 있는 선택 치료법인 것으로 입증되었지만, 1) 심각하고 비가역적인 장기간 사용 및 고용량과 관련된 합병증을 포함하여 일부 상당한 한계가 있고, 당뇨병, 심혈관 질환 및 대장암의 발병 확률을 포함한다. 기타 일반적인 부작용은 관절 통증, 일반 부종, 심한 두통, 저혈당, 손목 통증 (손목 터널 증후군(carpel tunnel syndrome)), 죽상 동맥경화증 발병 가능성을 증가시키는 혈액 내 LDL 수준의 증가 등을 포함한다; 2) 그럼에도 불구하고, 엄격한 FDA 규범으로 인해 HGH 주사는 일반의약품(over the counter)으로 이용할 수 없고, 암시장이 만연하다. 의료 처방 없이 HGH 주사의 입수는 불법으로 간주되며 구금 및 벌금으로 법에 의해 처벌받는다; 그리고 3) 치료 비용은 비싸다. 제약 회사에 따라 1개월의 치료 동안 HGH 주사의 비용은 일반적으로 $800 내지 $3000 사이이다. 마지막으로, rHGH를 이용하는 통상적인 방법은 일반적으로 HGH가 피하 주사를 통해 투여되는 다중-용량 용법(multi-dose regimens)을 포함한다. 이러한 방법과 관련된 불편, 통증 및 사회적 낙인(social stigma)이 상당할 수 있다. 성장 호르몬 결핍증 (GHD), 터너 증후군 (TS) 및 관련 장애로 인한 저신장증을 치료하기 위한 소아 집단의 관리는, 이러한 고도의 침습적이고 반복적인 치료법으로 특히 어려울 수 있다.

전장 인간 HGH는 191 아미노산으로 이루어진다. 분자 생물학적 기술을 이용하여 생성된 HGH는 자연적으로 발생하는 HGH와 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, 사용된 HGH는 천연 호르몬에 대한 아미노산 서열에서 하나 이상의 변화를 포함하는 HGH 유사체일 수 있다. 이러한 아미노산 변화는 향상된 생물학적 활성 또는 일부 다른 생물학적 또는 논리적 이점을 제공할 수 있다. 다양한 실시예에서, 재조합 HGH는 Genbank Accession No. P01241에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. HGH 아미노산 서열 (P01241의 26 aa 신호 서열 없이) 서열번호: 95에 제시된다:

FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFS

ESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNV

YDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLL

YCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF (서열번호: 95)

본 발명의 HGH는 임의의 공급원으로부터 생성되거나 또는 고상 합성을 이용하여 화학적으로 합성된, 분리된, 정제된 및/또는 재조합 HGH를 포함하여, 서열번호: 95의 서열을 갖는 임의의 공급원으로부터의 HGH를 나타낸다. 또한, 천연 HGH의 보존된 아미노산 치환이 본 명세서에 포함된다. 예를 들어, 보존적 아미노산 변화가 일어날 수 있는데, 비록 이들이 단백질 또는 펩티드의 일차 서열을 변경시킬지라도, 이의 기능을 정상적으로 변화시키지 않는다. 보존적 아미노산 치환은 일반적으로 하기의 군 내에서의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 다양한 실시예에서, HGH는 서열번호: 95의 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99%의 관찰된 상동성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는다.

다양한 실시예에서, 본 발명의 융합 분자에서의 사용이 고려되는 HGH는 당해 기술분야에서 광범위하게 기재된 인간 성장 호르몬 변이체 및 돌연변이체를 포함한다 (참조, US 특허 제 8,637,646호 (Wells et al) 및 본 명세서에 인용된 문헌들, 및 US 20110130331 (Guyon et al), 이들 각각은 이러한 성장 호르몬 변이체 및 돌연변이체를 제공하는 특정 목적을 위해 본 명세서에서 전체 참조로 포함된다.).

다양한 실시예에서, 본 발명의 융합 분자에서의 사용이 고려되는 HGH는 NUTROPIN® (제넨테크), HUMATROPE® (릴리), GENOTROPIN® (화이자), NORDITROPIN® (노보), SAIZEN® (머크 세로노), OMNITROPE® (산도즈), SEROSTIM® (EMD 세로노), TEV-TROPIN® (테바) 및 ZORBITIVE® (머크 세로노)을 포함한다.

본 발명의 융합 분자에서 성장 호르몬으로 사용되거나, 또는 성장 호르몬으로의 사용을 고려한 성장 호르몬이 유도될 수 있는 것으로부터의 적당한 성장 호르몬 단백질의 예시적이나 이에 한정되지 않는 목록이 표 4에 제공된다.

생물학적 활성 화물의 결합을 위한 삽입 부위

융합 분자의 생물학적 활성 화물은 제한 없이 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 융합 분자의 나머지에 결합될 수 있다. 생물학적 활성 화물은 변형된 콜릭스 독소의 세포-결합 또는 통과세포외배출(transcytosis) 활성을 파괴하지 않는 융합 분자의 임의의 부분으로 도입될 수 있다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 변형된 콜릭스 독소의 N-말단 또는 C-말단에 직접 결합된다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 변형된 콜릭스 독소의 아미노산의 측쇄와 함께 연결될 수 있다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 비-절단형 펩티드 링커를 갖는 변형된 콜릭스에 결합된다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 절단형 링커에서의 절단이 융합 분자의 나머지로부터 생물학적 활성 화물을 분리하도록 절단형 링커를 갖는 변형된 콜릭스 독소에 결합된다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 절단형 링커의 절단 후에 폴리펩티드에 결합된 상태로 유지되는 짧은 리더 펩티드도 포함할 수 있는 폴리펩티드이다. 예를 들어, 생물학적 활성 화물은 1 이상의 아미노산, 5 이상의 아미노산, 10 이상의 아미노산, 15 이상의 아미노산, 20 이상의 아미노산, 25 이상의 아미노산, 30 이상의 아미노산, 50 이상의 아미노산, 또는 100 이상의 아미노산의 짧은 리더 펩티드를 포함할 수 있다. 어떤 경우에는, 생물학적 활성 화물은 100 미만의 아미노산, 50 미만의 아미노산, 30 미만의 아미노산, 25 미만의 아미노산, 20 미만의 아미노산, 15 미만의 아미노산, 10 미만의 아미노산, 또는 5 미만의 아미노산의 짧은 리더 펩티드를 포함할 수 있다. 어떤 경우에는, 생물학적 활성 화물은 1-100 사이의 아미노산, 5-10 사이의 아미노산, 10 내지 50 사이의 아미노산, 또는 20 내지 80 사이의 아미노산의 짧은 리더 펩티드를 포함할 수 있다. 천연 콜릭스 독소에서, 도메인 Ib 루프는 아미노산 387 내지 425에 걸쳐 있고, 395번 및 402번 위치에서 2개의 시스테인 사이의 이황화 결합으로 구조적으로 특징지워진다. 콜릭스 독소의 이 도메인 Ib 부분은 세포 결합, 전좌, ER 잔류 또는 ADP 리보실화 활성을 포함하여, 임의의 알려진 콜릭스 독소의 활성에 필수적이지 않다. 따라서, 도메인 Ib는 완전히 결실될 수 있거나, 또는 생물학적 활성 화물을 함유하도록 변형될 수 있다. 따라서, 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 콜릭스 독소 도메인 Ib에 삽입될 수 있다. 바람직하다면, 생물학적 활성 화물은 가교 결합되지 않은 395번 및 402번 위치에서 시스테인 사이의 콜릭스 독소 도메인 Ib에 삽입될 수 있다. 이것은 시스테인 사이의 이황화 결합을 감소시킴으로써, 하나 또는 둘의 시스테인을 Ib 도메인으로부터 완전히 결실시킴으로써, 하나 또는 둘의 시스테인을 다른 잔기, 예를 들어, 세린으로 돌연변이시킴으로써, 또는 다른 유사한 기술에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, 생물학적 활성 화물은 395번 및 402번 위치에서 시스테인 사이의 도메인 Ib 루프에 삽입될 수 있다. 이러한 실시예에서, 시스테인 사이의 이황화 결합을 사용하여 생물학적 활성 화물 도메인을 제한하였다.

생물학적 활성 화물이 융합 단백질로서 융합 분자의 다른 부분과 함께 발현되는 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 제한 없이 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 융합 분자 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 활성 화물에 상응하는 아미노산은 천연 아미노산 서열의 결실과 함께 또는 없이, 융합 분자 내로 직접 삽입될 수 있다. 다양한 실시예에서, 콜릭스 독소의 Ib 도메인의 전부 또는 일부가 결실되고 생물학적 활성 화물로 대체될 수 있다. 다양한 실시예에서, Ib 루프의 시스테인 잔기는 결실되어 생물학적 활성 화물이 구속되지 않은 채로 유지된다. 다른 실시예에서, Ib 루프의 시스테인 잔기는 이황화 결합과 연결되고 생물학적 활성 화물을 구속한다.

생물학적 활성 화물이 융합 단백질로서 융합 분자의 나머지와 함께 발현되지 않는 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 제한 없이 당업자에게 알려진 임의의 적당한 방법에 의해 융합 분자의 나머지와 함께 연결될 수 있다. 더 상세하게는, 분자의 나머지에 수용체 결합 도메인을 연결하기 위해 상기 기재된 예시적인 방법은 분자의 나머지에 생물학적 활성 화물을 연결하기 위해 동일하게 적용할 수 있다.

융합 단백질의 생성

다양한 실시예에서, 비-자연적으로 발생하는 융합 분자는 재조합 DNA 방법론을 이용하여 합성된다. 일반적으로, 이것은 융합 분자를 인코딩하는 DNA 서열을 생성하는 단계, 특정 프로모터의 조절 하에 발현 카세트 내에 DNA를 위치시키는 단계, 숙주에서 분자를 발현시키는 단계, 발현된 분자를 분리하는 단계, 필요하다면, 분자를 재생하는 단계(renaturing)를 포함한다.

본 명세서에 기재된 융합 분자 (예를 들어, 콜릭스 ⁴¹⁵ -IL-10)를 인코딩하는 DNA는 적당한 서열의 클로닝 및 제한, 또는 포스포트리에스터 방법 [Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99]; 포스포디에스터 방법 [Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151]; 디에틸포스포라미다이트(diethylphosphoramidite) 방법 [Beaucage et al. (1981) Tetra. Lett., 22: 1859-1862)]; 고체 지지체 방법 [US 특허번호 제 4,458,066호] 등과 같은 방법에 의한 직접 화학 합성을 포함하여, 임의의 적당한 방법에 의해 제조될 수 있다.

화학 합성은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 이것은 상보적 서열과 함께 혼성화에 의해 또는 주형으로서 단일 가닥을 이용하여 DNA 폴리머라제와 함께 중합에 의해 이중 가닥 DNA로 변환될 수 있다. 당업자는 DNA의 화학 합성이 약 100 염기의 서열로 제한되지만, 더 긴 서열은 더 짧은 서열의 결합에 의해 얻어질 수 있다는 것을 인식할 것이다.

대안적으로, 서열을 복제하고, 적당한 제한 효소를 이용하여 적당한 서열로 절단할 수 있다. 그 다음 단편을 결합하여 원하는 DNA 서열을 생성할 수 있다.

다양한 실시예에서, 본 발명의 융합 분자를 인코딩하는 DNA는 PCR (polymerase chain reaction)과 같은 DNA 증폭 방법을 이용하여 복제될 수 있다. 따라서, 예를 들어, NdeI에 대한 제한 부위를 함유하는 센스 프라이머, 및 HindIII에 대한 제한 부위를 함유하는 안티센스 프라이머를 이용하여, IL-10에 대한 유전자를 PCR 증폭시킨다. 이는 성숙 IL-10 서열을 인코딩하고 말단 제한 부위를 갖는 핵산을 생성할 수 있다. "상보적" 제한 부위를 갖는 변형된 콜릭스 독소는 유사하게 복제된 다음 IL-10 및/또는 IL-10에 결합된 링커에 결합될 수 있다. 핵산 서열의 결합 및 벡터로의 삽입은 변형된 콜릭스 독소에 결합된 IL-10을 인코딩하는 벡터를 생성한다.

비-절단형 링커

다양한 실시예에서, 변형된 콜릭스 독소 및 생물학적 활성 화물은 하나 이상의 아미노산 (예를 들어, 최대 25 아미노산)으로 이루어진 펩티드 스페이서에 의해 분리될 수 있다. 일반적으로, 스페이서는 단백질에 결합하거나 또는 이들 사이의 약 최소 거리 또는 다른 공간적 관계를 보존하는 것 이외에 특정 생물학적 활성을 가지지 않을 것이다. 그러나, 다양한 실시예에서, 스페이서를 구성하는 아미노산 은 접힘, 순전하(net charge), 또는 소수성과 같은 분자의 일부 특성에 영향을 주기 위해 선택될 수 있다.

다양한 실시예에서, 링커는 콜릭스 독소 및 생물학적 활성 화물 둘 다에 공유 결합을 형성할 수 있다. 적당한 링커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 직쇄 또는 분지쇄 탄소 링커, 이종고리형 탄소 링커, 또는 펩티드 링커를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다양한 실시예에서, 링커는 이의 측기(side groups)를 통해 (예를 들어, 시스테인에 이황화 결합을 통해) 콜릭스 독소 및/또는 생물학적 활성 화물을 구성하는 아미노산에 결합될 수 있다. 다양한 실시예에서, 링커는 콜릭스 독소 및/또는 생물학적 활성 화물의 말단 아미노산의 알파 탄소 아미노기 및/또는 카복실기에 결합된다.

콜릭스 독소 상의 기와 반응적인 하나의 작용기 및 생물학적 활성 화물에 반응적인 다른 기를 갖는 이작용성 링커를 사용하여 원하는 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 대안적으로, 유도체화는 표적 부분의 화학적 처리를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항체 단편과 같은 폴리펩티드 상의 유리 설프히드릴 기의 생성 방법은 알려져 있다 (참조, US 특허번호 제 4,659,839호).

항체와 같은 단백질에 방사성핵종 금속 킬레이트(radionuclide metal chelates), 독소 및 약물을 포함하여 다양한 화합물의 결합을 위한 많은 방법 및 링커 분자가 알려져 있다. 참조, 예를 들어, 유럽특허출원번호 제 188,256호; US 특허번호 제 4,671,958호, 제 4,659,839호, 제 4,414,148호, 제 4,699,784호; 제 4,680,338호; 제 4,569,789호; 및 제 4,589,071호; 및 Borlinghaus et al. (1987) Cancer Res. 47: 4071-4075.

다양한 실시예에서, 피험자에게 전달될 생물학적 활성 화물은 아미노산 서열 GGGGS (서열번호: 96), GGGGSGGGGS (서열번호: 97), GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 98), 또는 GGGGSGGG (서열번호: 99)를 포함하는 하나 이상의 비-절단형 펩티드 링커를 이용하여 변형된 콜릭스 독소에 결합되고, 상기 변형된 콜릭스 독소는 대식세포, 항원-제시 세포 및 수지상 세포와 같은 면역계의 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는 특정 세포에 상기 생물학적 활성 화물을 표적화한다.

절단형 링커

다양한 실시예에서, 피험자에게 전달될 생물학적 활성 화물은 하나 이상의 절단형 링커를 이용하여 변형된 콜릭스 독소에 결합된다. 융합 분자에 존재하는 절단형 링커의 수는, 적어도 어느 정도는, 변형된 콜릭스 독소 및 생물학적 활성 화물의 특성과 관련하여 생물학적 활성 화물의 위치에 의존한다. 생물학적 활성 화물이 단일 링커에서 절단과 함께 융합 분자의 나머지로부터 분리될 수 있는 경우, 융합 분자는 단일 절단형 링커를 포함할 수 있다. 또한, 생물학적 활성 화물이 이량체 또는 다른 다량체인 경우, 각 아단위의 생물학적 활성 화물은 절단형 링커에서 절단에 의해 융합 분자의 나머지 및/또는 다른 아단위의 생물학적 활성 화물로부터 분리될 수 있다.

다양한 실시예에서, 절단형 링커는 상피 세포의 기저측면 막에 존재하는 또는 근처에 있는 절단 효소에 의해 절단될 수 있다. 이러한 효소에 의해 절단될 절단형 링커를 선택함으로써, 생물학적 활성 화물은 점막을 횡단하여 통과세포외배출 (transcytosis) 후에 융합 분자의 나머지로부터 유리시키고 상피 세포로부터 막의 기저측면 쪽 상의 세포 매트릭스로 방출시킬 수 있다. 또한, 융합 분자가 세포의 기저측면 막으로부터 융합 분자 및 생물학적 활성 화물의 방출을 야기하는 편광 상피 세포에서 트래피킹 경로에 들어가기 전에 절단 효소가 융합 분자를 절단하지 않는 한, 기저측면 막으로부터 융합 분자를 방출하기 전에 절단형 링커를 절단하도록, 상피 세포 내부에 존재하는 절단 효소를 사용할 수 있다.

다양한 실시예에서, 편광 상피 세포의 기저측면 막에 존재하는 효소는 카텝신 GI, 키모트립신 I, 엘라스타제 I, 서브틸리신(Subtilisin) AI, 서브틸리신 AII, 트롬빈 I, 또는 유로키나제 I로부터 선택된다. 표 5는 이들 효소를 특정 펩티다제에 의해 인식되고 절단되는 아미노산 서열과 함께 나타낸다.

다양한 실시예에서, 절단형 링커는 전달 구조체의 나머지보다 더 큰 절단 경향을 나타낸다. 당업자가 알고 있는 바와 같이, 많은 펩티드 및 폴리펩티드 서열은 펩티다제 및 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 다양한 실시예에서, 절단형 링커는 전달 구조체의 투여 동안 전달 구조체 내에 존재하는 다른 아미노산 서열에 비해 우선적으로 절단되도록 선택된다. 다양한 실시예에서, 수용체 결합 도메인은 피험자의 혈류에 전달 구조체를 전달한 후 실질적으로 (예를 들어, 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 또는 약 75%) 원래 그대로이다. 다양한 실시예에서, 전좌 도메인은 피험자의 혈류에 전달 구조체를 전달한 후 실질적으로 (예를 들어, 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 또는 약 75%) 원래 그대로이다. 다양한 실시예에서, 거대분자는 피험자의 혈류에 전달 구조체를 전달한 후 실질적으로 (예를 들어, 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 또는 약 75%) 원래 그대로이다. 다양한 실시예에서, 절단형 링커는 피험자의 혈류에 전달 구조체를 전달한 후 실질적으로 (예를 들어, 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 또는 약 75%) 절단된다.

다른 실시예에서, 절단형 링커는 피험자의 혈장에서 발견되는 절단 효소에 의해 절단된다. 피험자의 혈장 내에 존재하는 당업자에게 알려진 임의의 절단 효소를 사용하여 절단형 링커를 절단할 수 있다. 절단형 링커를 절단하기 위해 이러한 효소의 사용은, 더 효율적인 절단이 기저측면 막 근처에서 발생할 것이라고 여겨지기 때문에, 편광 상피 세포의 기저측면 막 근처에서 발견되는 절단 효소의 사용보다 덜 바람직하다. 그러나, 당업자가 혈장 효소에 의해 매개되는 절단이 부작용을 피하기 위해 전달 구조체의 충분한 분획을 절단하기에 충분히 효율적이라고 결정한다면, 이러한 혈장 절단 효소를 사용하여 전달 구조체를 절단할 수 있다. 따라서, 다양한 실시예에서, 절단형 링커는 카스파제-1, 카스파제-3, 전구단백질 전환효소 (proprotein convertase) 1, 전구단백질 전환효소 2, 전구단백질 전환효소 4, 전구단백질 전환효소 4 PACE 4, 프롤릴 올리고펩티다제, 엔도텔린 절단 효소 (endothelin cleaving enzyme), 디펩티딜-펩티다제 IV, 신호 펩티다제, 네프릴리신 (neprilysin), 레닌(renin), 및 에스터라제로 이루어진 군으로부터 선택된 효소로 절단될 수 있다 (참조, US 특허번호 제 6,673,574호, 본 명세서에서 전체 참조로 포함됨). 표 6은 이들 효소를 특정 펩티다제에 의해 인식된 아미노산 서열(들)과 함께 나타낸다. 펩티다제는 별표로 표시된 아미노산의 N-말단 쪽의 이들 서열을 포함하는 펩티드를 절단한다.

따라서, 다양한 실시예에서, 절단형 링커는 상피 세포의 기저측면 막에 존재하는 효소에 의해 절단될 수 있는 당업자에게 알려진 임의의 절단형 링커일 수 있다. 다양한 실시예에서, 절단형 링커는 펩티드를 포함한다. 다른 실시예에서, 절단형 링커는 핵산, 예를 들어 RNA 또는 DNA를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 절단형 링커는 탄수화물, 예를 들어 이당류 또는 삼당류를 포함한다.

대안적으로, 다양한 실시예에서, 절단형 링커는 전달 구조체가 투여된 피험자의 혈장 내에 존재하는 효소에 의해 절단될 수 있는 당업자에게 알려진 임의의 절단형 링커일 수 있다. 다양한 실시예에서, 절단형 링커는 펩티드를 포함한다. 다른 실시예에서, 절단형 링커는 핵산, 예를 들어 RNA 또는 DNA를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 절단형 링커는 탄수화물, 예를 들어 이당류 또는 삼당류를 포함한다.

다양한 실시예에서, 펩티다제는 기저측면 쪽 ('기저측면'이라고도 함)에서 훨씬 더 높게 (예를 들어, 정단 쪽(apical side)에 비해 100%, 200%, 또는 그 이상의 활성 증가) 나타난다. 따라서, 다양한 실시예에서, 절단형 링커는 막의 정단 쪽에서보다 막의 기저측면 쪽에서 50% 더 높은 활성을 나타내는 효소에 의해 절단될 수 있다. 다양한 실시예에서, 절단형 링커는 막의 정단 쪽에서보다 막의 기저측면 쪽에서 100% 더 높은 활성을 나타내는 효소에 의해 절단될 수 있다. 다양한 실시예에서, 절단형 링커는 막의 정단 쪽에서보다 막의 기저측면 쪽에서 200% 더 높은 활성을 나타내는 효소에 의해 절단될 수 있다. 다양한 실시예에서, 절단형 링커는 막의 정단 쪽에서보다 막의 기저측면 쪽에서 500% 더 높은 활성을 나타내는 효소에 의해 절단될 수 있다. 다양한 실시예에서, 절단형 링커는 막의 정단 쪽에서보다 막의 기저측면 쪽에서 1,000% 더 높은 활성을 나타내는 효소에 의해 절단될 수 있다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 100, 서열번호: 101, 서열번호: 102, 서열번호: 103, 서열번호: 104, 서열번호: 105, 서열번호: 106 또는 서열번호: 107로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 절단형 링커를 포함하고, 편광 상피 세포의 정단 쪽에서보다 편광 상피 세포의 기저측면 쪽에서 더 높은 활성을 나타내는 효소에 의해 절단될 수 있으며, 및/또는 편광 상피 세포의 정단 쪽에서보다 혈장에서 더 높은 활성을 나타내는 효소에 의해 절단될 수 있다.

다양한 실시예에서, 절단형 링커는 융합 분자의 환경에서의 변화 후에 절단되는 절단형 링커일 수 있다. 예를 들어, 절단형 링커는 pH 민감성이고 융합 분자가 편광 상피 세포의 기저측면 막으로부터 방출될 때 겪는 pH의 변화에 의해 절단되는 절단형 링커일 수 있다. 예를 들어, 장관 내강(intestinal lumen)은 강알칼리성인 반면, 혈장은 본질적으로 중성이다. 따라서, 절단형 링커는 알칼리성에서 중성 pH로 이동시 절단되는 부분일 수 있다. 절단형 링커를 절단하는 융합 분자의 환경에서의 변화는, 융합 분자가 제한 없이 당업자에게 알려진 편광 상피 세포의 기저측면 막으로부터 방출될 때 겪는 임의의 환경 변화일 수 있다.

다양한 실시예에서, 절단형 링커는 피험자의 혈장에서 발견되는 절단 효소에 의해 절단될 수 있다. 피험자의 혈장 내에 존재하는 당업자에게 알려진 임의의 절단 효소를 사용하여 절단형 링커를 절단할 수 있다. 따라서, 다양한 실시예에서, 절단형 링커는 서열번호: 108, 서열번호: 109, 서열번호: 110, 서열번호: 111, 서열번호: 112, 서열번호: 113, 서열번호: 114, 서열번호: 115, 서열번호: 116, 서열번호: 117, 서열번호: 118, 서열번호: 119 또는 서열번호: 120으로부터 선택되는 효소로 절단될 수 있다.

다양한 실시예에서, 절단형 링커는 담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제에 대해 알려진 기질인 아미노산 서열을 함유하는 링커이다. 따라서, 다양한 실시예에서, 절단형 링커는 GGGGSGGGENLYFQS (서열번호: 121)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.

변형된 콜릭스 독소에 화물의 화학 결합

다양한 실시예에서, 피험자에게 전달될 생물학적 활성 화물은 변형된 콜릭스 독소에 화학적으로 결합된다. 분자를 화학적으로 결합하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

2개의 분자를 결합하는 방법은 물질의 화학 구조에 따라 다르다. 폴리펩티드는 일반적으로 다양한 작용기; 예를 들어, 다른 펩티드 상 또는 거기의 분자와 결합하는 링커 상의 적당한 작용기와의 반응에 이용할 수 있는, 카복실산 (COOH) 기 또는 유리 아민 (NH ₂ )기를 함유한다.

대안적으로, 항체 및/또는 생물학적 활성 화물은 유도체화되어 추가의 반응성 작용기에 노출되거나 또는 결합될 수 있다. 유도체화는 Pierce Chemical Company, Rockford Ill로부터 구입할 수 있는 임의의 다수의 링커 분자의 결합을 포함할 수 있다.

다양한 실시예에서, 분리된 변형된 콜릭스 독소는 세균성 발효에 의해 제조되고 확립된 방법에 의해 정제된다. 정제된 변형된 콜릭스 독소는 이의 C-말단에서 변형된 다음 단백질의 C-말단 근처에 위치한 유리 설프히드릴 잔기를 통해 직접 화학 결합할 수 있다. C-말단 변형은 담배 에칭 바이러스(TEV)의 고도의 선택적인 프로테아제에 대한 공통 절단 서열을 숨겨주는(harboring) 시스테인-구속 루프, 제 2 시스테인, 및 헥사-히스티딘 (His ₆ ) 태그를 포함한다. 제 2 시스테인은 궁극적으로 결합에 사용되는 Cys와 함께 이황화 다리를 형성하기 위해 포함된다. 단백질에 His ₆ 서열을 가하는 것은 정제를 단순화하고, TEV 절단 서열은 약한 환원(mild reduction) 후에 말단의 Cys 잔기를 선택적으로 제거하는 메커니즘을 제공한다. nt콜릭스 구조체의 발현 및 분리 후에 0.1 mM 디티오테이톨(dithiotheitol)로 TEV 절단 및 약한 환원은, 화물 결합의 일반적인 메커니즘으로서 말레이미드-기반 반응을 통한 생물학적 활성 화물의 직접적인 화학 결합을 허용한다. TEV 프로테아제 절단, 환원, 및 유리 설프히드릴과의 말레이미드 반응을 통한 화물 결합 후에, 유리된 C-말단 서열의 제거는 제 2 Ni ^{2 +} 컬럼 크로마토그래피 단계에 의해 달성되었다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 변형된 콜릭스 독소와 공유적으로 장식된 입자를 포함하고, 생물학적 활성 화물은 입자에 통합된다. 다양한 실시예에서, 입자는 직경이 ~150 nm보다 작거나, ~100 nm보다 작거나, 또는 ~50 nm보다 작을 수 있다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 변형된 콜릭스 독소에 비-공유적으로 결합된 생물학적 활성 화물을 포함한다. 이 융합 분자는 IL-10 수용체의 표면 요소와 같은 상피를 횡단하여 비-공유 결합된 IL-10을 수송할 수 있다 (Josephson, K., Logsdon, NJ, Walter, MR, Immunity 15: 35-46, 2001, 본 명세서에 전체 참조로 포함됨).

약학 조성물 및 전달 방법

본 발명의 약학 조성물은 인간 피험자에게 투여하기 위한 조성물에 관한 것이다. 약학 조성물은 본 명세서에 열거된 비-자연적으로 발생하는 융합 분자를 단독으로 또는 조합하여 포함한다. 약학 조성물은 비-자연적으로 발생하는 융합 분자의 특성을 변경시킬 수 있는, 예를 들어, 이의 기능을 안정화, 조절 및/또는 활성화할 수 있는 추가의 분자를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 고체 형태 또는 액체 형태일 수 있으며, 그 중에서도, 분말, 정제, 용액 또는 에어로졸의 형태일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 임의로 및 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. "약학적으로 허용가능한 담체"는 비-독성 고체, 반고체 또는 액체 여과기, 희석제, 캡슐화 물질 및 임의의 표준 약학적 담체, 비히클, 완충액, 및 부형제, 예를 들어 인산염 완충 식염수 용액, 5% 덱스트로오스 수용액, 및 에멀젼, 예를 들어 유/수 또는 수/유 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제 및/또는 보조제를 나타낸다.

약학 조성물은 일반적으로 융합 분자의 즉시 사용을 위해 적당하게 제형화된다. 예를 들어, 만일 융합 분자가 즉시 투여되지 않으면, 융합 분자는 저장에 적합한 조성물로 제형화될 수 있다. 이러한 조성물 중 하나는 적당한 안정화제와 함께 융합 분자의 동결건조된 제제이다. 대안적으로, 융합 분자 조성물은 저장을 위해 하나 이상의 적당한 안정화제와 함께 용액으로 제형화될 수 있다. 당업자에게 알려진 임의의 이러한 안정화제는 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 동결건조된 제제에 적합한 안정화제는 당, 염, 계면활성제, 단백질, 카오트로픽제(chaotropic agents), 지질, 및 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 액체 제제에 적합한 안정화제는 당, 염, 계면활성제, 단백질, 카오트로픽제, 지질, 및 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 조성물에 사용될 수 있는 특정 안정화제는 트레할로오스, 혈청 알부민, 포스파티딜콜린, 레시틴 및 아르기닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 융합 분자의 동결건조된 제제 또는 액체 제제를 안정화시키기 위한 다른 화합물, 조성물, 및 방법은, 예를 들어, US 특허번호 제 6,573,237호, 제 6,525,102호, 제 6,391,296호, 제 6,255,284호, 제 6,133,229호, 제 6,007,791호, 제 5,997,856호, 및 제 5,917,021호에서 확인될 수 있다.

다양한 실시예에서, 본 발명의 약학 조성물은 경구 전달용으로 제형화된다. 경구 전달용으로 제형화된 약학 조성물은 위장관 (GI) 상피를 횡단하여 통과세포외배출을 매개하는 변형된 콜릭스 독소의 능력을 이용한다. 이러한 약학 조성물의 경구 투여는 소화 점막, 예를 들어 장내 점막의 편광 상피 세포를 통해 융합 분자를 흡수한 다음, 점막의 기저측면 쪽에서 생물학적 활성 화물의 방출을 야기할 것으로 예상된다. 다양한 실시예에서, 상피 세포는 비강 상피 세포, 구강 상피 세포, 장내 상피 세포, 직장 상피 세포, 질 상피 세포, 및 폐 상피 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 약학 조성물은 GI 상피를 횡단하여 융합 단백질의 수송을 용이하게 하기 위해 통과세포외배출 인핸서의 첨가를 포함할 수 있다. 이러한 인핸서는 당해 기술분야에 알려져 있다. 참조, Xia et al., (2000) J. Pharmacol. Experiment. Therap., 295:594-600; and Xia et al. (2001) Pharmaceutical Res., 18(2):191-195, 각각은 본 명세서에 전체 참조로 포함된다.

일단 GI 상피를 횡단하여 수송되면, 본 발명의 융합 분자는 혈청에서 연장된 반감기를 나타낼 것으로 예상된다, 즉, 융합 분자의 생물학적 활성 화물은 이의 비-융합된 상태의 생물학적 활성 화물에 비해 연장된 혈청 반감기를 나타낼 것으로 예상된다. 이와 같이, 본 발명의 약학 조성물의 경구 제형은 이들이 GI 상피로의 수송 및 위(stomach)에서 융합 분자의 보호에 적합하도록 제조된다. 이러한 제형은 담체 및 분산제 성분을 포함할 수 있으며, 에어로졸 (경구 또는 폐 전달용), 시럽, 에릭시르제, 츄잉정(chewable tablets)을 포함하는 정제, 경질 또는 연질 캡슐, 트로키(troches), 로렌지, 수성 또는 유성 현탁액, 에멀젼, 카세제(cachets) 또는 펠렛 과립, 및 분산형 분말을 포함하여 임의의 적당한 형태일 수 있다. 다양한 실시예에서, 약학 조성물은 정확한 용량의 간단한 경구 투여에 적합한 고체 제형, 예를 들어, 정제, 캡슐 등으로 사용된다.

다양한 실시예에서, 경구 제형은 융합 분자 및 이것이 위에 있는 동안 융합 분자를 보호할 수 있는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 예를 들어, 보호 화합물은 융합 분자의 산 및/또는 효소적 가수분해를 방지할 수 있어야 한다. 다양한 실시예에서, 경구 제형은 융합 분자 및 위에서 소장으로 구조체의 수송을 용이하게 할 수 있는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 예를 들어, 중탄산나트륨(sodium bicarbonate)의 함유는 [Mrsny et al., Vaccine 17:1425-1433, 1999]에 기재된 바와 같이 위에서 십이지장으로 위내(intra-gastric) 전달된 물질의 빠른 이동을 촉진하는데 유용할 수 있다. 융합 분자가 위를 통과하고 소장 내 편광 상피 막을 접촉할 수 있도록 조성물을 제형화하는 다른 방법은 [DeYoung, Int J Pancreatol, 5 Suppl:31-6, 1989]에 기재된 장용성-코팅 기술 및 [US 특허번호 제 6,613,332호, 제 6,174,529호, 제 6,086,918호, 제 5,922,680호, 및 제 5,807,832호]에 제공된 방법을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 각각은 본 명세서에 전체 참조로 포함된다.

경구용 약학 조성물은 약학 조성물의 제조를 위해 당해 기술분야에 알려진 임의의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 이러한 조성물은 약학적으로 우아하고 맛이 좋은 제제를 제공하기 위해 감미제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 함유할 수 있다. 예를 들어, 경구 전달 가능한 정제를 제조하기 위해, 융합 분자를 적어도 하나의 약학적 부형제와 혼합하고, 고체 제형을 압축하여 위장관으로 전달하기 위해 알려진 방법에 따라 정제를 형성한다. 정제 조성물은 일반적으로 첨가제, 예를 들어 당류(saccharide) 또는 셀룰로오스 담체; 전분 풀(starch paste) 또는 메틸 셀룰로오스와 같은 결합제; 충전제; 붕해제; 또는 의료 제제의 제조에 통상적으로 사용되는 기타 첨가제로 제형화된다. 경구 전달 가능한 캡슐을 제조하기 위해, DHEA를 적어도 하나의 약학적 부형제와 혼합하고, 고체 제형을 위장관으로 전달하기에 적합한 캡슐 용기에 넣는다. 융합 분자를 포함하는 조성물은 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton Pa. 18042) at Chapter 89]에 일반적으로 기재된 바와 같이 제조될 수 있으며, 참조로 본 명세서에 포함된다.

다양한 실시예에서, 약학 조성물은 정제의 제조에 적합한 비-독성 약학적으로 허용가능한 부형제와의 혼합물에서 융합 분자를 함유하는 경구 전달 가능한 정제로 제형화된다. 이들 부형제는 불활성 희석제, 예를 들어 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토오스, 인산칼슘 또는 인산나트륨; 과립화제 및 붕해제, 예를 들어, 옥수수 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 및 윤활제, 예를 들어, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산, 또는 탈크일 수 있다. 정제는 코팅되지 않을 수 있거나 또는 위장관에서의 붕해 및 흡수를 지연시켜 장기간에 걸쳐 지속 작용(sustained action)을 제공하는 알려진 기술로 코팅될 수 있다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연 물질을 단독으로 또는 왁스와 함께 사용할 수 있다.

다양한 실시예에서, 약학 조성물은 융합 분자가 불활성 고체 희석제, 예를 들어, 탄산칼슘, 인산칼슘, 또는 카올린과 혼합한 경질 젤라틴 캡슐로, 또는 융합 분자가 수성 또는 유성 매질, 예를 들어, 아라키스 오일(arachis oil), 낙화생유 (peanut oil), 유동 파라핀(liquid paraffin) 또는 올리브 오일과 혼합한 연질 젤라틴 캡슐로 제형화된다.

다양한 실시예에서, 수성 현탁액은 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와의 혼합물에서 융합 분자를 함유할 수 있다. 이러한 부형제는 현탁화제, 예를 들어, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검이고; 분산제 또는 습윤제는 자연적으로 발생하는 포스파티드(phosphatide), 예를 들어, 레시틴, 또는 지방산과 알킬렌 옥사이드의 축합체(condensation products), 예를 들어 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 장쇄 지방족 알콜과 에틸렌 옥사이드의 축합체, 예를 들어, 헵타데실에틸옥시세타놀(heptadecylethyloxycetanol), 또는 지방산으로부터 유도된 부분 에스터 및 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트와 같은 헥시톨과 에틸렌 옥사이드의 축합체, 또는 지방산으로부터 유도된 부분 에스터 및 헥시톨 무수물(hexitol anhydrides)과 에틸렌 옥사이드의 축합체, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트일 수 있다. 수성 현탁액은 하나 이상의 보존제, 예를 들어, 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향료, 및 하나 이상의 감미제, 예를 들어 수크로오스 또는 사카린을 함유할 수도 있다.

다양한 실시예에서, 유성 현탁액은 식물성 오일, 예를 들어, 아라키스 오일, 올리브 오일, 참기름 또는 코코넛 오일, 또는 유동 파라핀과 같은 광유(mineral oil)에 융합 분자를 현탁시켜 제형화될 수 있다. 유성 현탁액은 증점제, 예를 들어, 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알콜을 함유할 수 있다. 상기에 제시된 바와 같은 감미제, 및 향료를 첨가하여 맛이 좋은 경구 제제를 제공할 수 있다. 이러한 조성물은 아스코르브산과 같은 항산화제의 첨가에 의해 보존될 수 있다.

다양한 실시예에서, 약학 조성물은 수중유(oil-in-water) 에멀젼의 형태일 수 있다. 유상은 식물성 오일, 예를 들어, 올리브 오일 또는 아라키스 오일, 또는 광유, 예를 들어 아카시아 검 또는 트라가칸트 검, 자연적으로-발생하는 포스파티드, 예를 들어 대두 레시틴, 및 에스터 또는 지방산으로부터 유도된 부분 에스터 및 헥시톨 무수물, 예를 들어 소르비탄 모노올레에이트, 및 에틸렌 옥사이드와 동일한 부분 에스터의 축합체, 예를 들어 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트일 수 있다. 에멀젼은 감미제 및 향료를 함유할 수도 있다.

약학 조성물이 정제 또는 캡슐 형태인 다양한 실시예에서, 정제 또는 캡슐은 위에서 효소 작용으로부터 생물학적 활성 화물을 보호하고 피험자에 의해 흡수될 생물학적 활성 화물이 충분히 있도록 보장하기 위해 코팅되거나 또는 캡슐화하여 효과적인 반응을 생기게 한다. 이러한 코팅 또는 캡슐화 방법은, 예를 들어, 약물 담체로서 소수성 백본(backbone) 및 친수성 분지(branches)를 갖는 고분자로 구성된 나노입자에서의 캡슐화, 미세입자에서의 캡슐화, 에멀젼 내의 리포좀 내로의 삽입, 및 다른 분자에의 결합을 포함한다. 나노입자의 예는 키토산 및 카보폴로 코팅된 점막접착성 나노입자 (Takeuchi et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 47(1):39-54, 2001) 및 하전된 조합 폴리에스터인 폴리(2-설포부틸-비닐 알콜) 및 폴리(D,L-락틱-코-글리콜산) (Jung et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 50(1):147-160, 2000)을 함유하는 나노입자를 포함한다.

생물학적 활성 화물을 층별(layer-by-layer) 방법으로 방출하여 위장관을 따라 움직이는 동안 미리-결정된 시간 프레임 동안 생물학적 활성 화물을 방출하는 캡슐화 또는 코팅된 정제를 사용할 수 있다. 또한, 생물학적 활성 화물을 포함하는 정제는 더 큰 정제 내에 배치될 수 있으며, 이에 의해 환경 및 처리 조건, 예를 들어 온도, 화학 물질 (예를 들어, 용매), pH, 및 수분으로부터 내부 정제를 보호할 수 있다. 또한, 외부 정제 및 코팅은 위 환경(gastric environment)에서 생물학적 활성 화물을 보호하는 역할을 한다.

다양한 실시예에서, 약학 조성물은 폴리에스터 미소구체(microspheres), 제인 미소구체, 프로테이노이드(proteinoid) 미소구체, 폴리시아노아크릴레이트 미소구체, 및 지질-기반 시스템을 이용하여 경구 전달용으로 제형화될 수 있다 (참조, 예를 들어, DiBase and Morrel, Oral Delivery of Microencapsulated Proteins, in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 255-288 (Plenum Press 1997)).

표면활성제 또는 계면활성제는 점막 또는 라이닝(lining)을 통해 폴리펩티드의 흡수를 촉진한다. 유용한 표면활성제 또는 계면활성제는 지방산 및 이의 염, 담즙산염, 인지질 또는 알킬 당류(alkyl saccharide)를 포함한다. 지방산 및 이의 염의 예는 카프릴레이트 (C ₈ ), 카프레이트 (C ₁₀ ), 라우레이트 (C ₁₂ ) 및 미리스테이트 (C ₁₄ )의 나트륨, 칼륨 및 리신 염을 포함한다. 담즙산염의 예는 콜산(cholic acid), 케노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid), 글리코콜산(glycocholic acid), 타우로콜산(taurocholic acid), 글리코케노데옥시콜산(glycochenodeoxycholic acid), 타우로케노데옥시콜산(taurochenodeoxycholic acid), 데옥시콜산(deoxycholic acid), 글리코데옥시콜산(glycodeoxycholic acid), 타우로데옥시콜산(taurodeoxycholic acid), 리토콜산(lithocholic acid), 및 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid)을 포함한다. 인지질의 예는 단일-쇄 인지질, 예를 들어 리소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine), 리소포스파티딜글리세롤(lysophosphatidylglycerol), 리소포스파티딜에탄올아민(lysophosphatidylethanolamine), 리소포스파티딜이노시톨(lysophosphatidylinositol) 및 리소포스파티딜세린(lysophosphatidylserine); 또는 이중-쇄 인지질, 예를 들어 디아실포스파티딜콜린 (diacylphosphatidylcholines), 디아실포스파티딜글리세롤 (diacylphosphatidylglycerols), 디아실포스파티딜에탄올아민 (diacylphosphatidylethanolamines), 디아실포스파티딜이노시톨 (diacylphosphatidylinositols) 및 디아실포스파티딜세린 (diacylphosphatidylserines)을 포함한다. 알킬 당류의 예는 알킬 글루코시드 (alkyl glucosides) 또는 알킬 말토시드(alkyl maltosides), 예를 들어 데실 글루코시드 및 도데실 말토시드를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물을 경구 투여하는 방법에 관한 것이다. 임의의 특정 이론 또는 작용 메커니즘에 얽매이게 할 의도 없이, 융합 분자의 경구 투여는 소화 점막, 예를 들어 장내 점막의 편광 상피 세포를 통해 융합 분자를 흡수한 다음, 점막의 기저측면 쪽에서 융합 분자의 절단 및 생물학적 활성 화물의 방출을 야기할 것으로 생각된다. 따라서, 생물학적 활성 화물이 간에서 생물학적 활성을 발휘할 때, 예를 들어 이의 동족(cognate) 수용체에 IL-10을 결합시켜 매개되는 활성을 발휘할 때, 생물학적 활성 화물은 피험자에서 관찰되는 혈장 농도를 기준으로 하여 예상되는 것 이상의 효과를 발휘한다고 생각된다, 즉, 융합 분자의 경구 투여는 피험자의 혈장에서 관찰되는 것보다 더 높은 효과적인 농도의 전달된 생물학적 활성 화물을 피험자의 간으로 전달할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물을 경구 투여하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 환자 또는 간병인에 의해 조성물을 경구 투여하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 투여 단계는 융합 분자, 질환 또는 환자 상태 또는 개별 환자에 따라 하루에 한번 또는 두번과 같은 간격으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 방법은 개개의 융합 분자의 다양한 용량의 투여를 포함한다. 예를 들어, 약학 조성물의 초기 용량은 혈당 수준의 감소와 같은 원하는 효과를 유도하기 위해 보다 높은 수준일 수 있다. 일단 원하는 효과가 달성되면, 이후의 용량은 줄일 수 있다. 이러한 투여 프로토콜에 대한 변화 또는 변형은 주치의(attending physician) 또는 의료 종사자(health care worker)에 의해 수행될 수 있다.

약학 조성물은 적당한 용량으로 피험자에게 투여될 수 있다. 용량 용법은 주치의 및 임상 인자에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 용량은 환자의 크기, 체표면적, 연령, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 투여 경로, 일반적인 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물을 포함하여, 많은 인자에 의존한다. 주어진 상황에 대한 치료적 유효량은 통상적인 실험에 의해 용이하게 결정될 것이며, 통상적인 임상의 또는 의사의 기술 및 판단 범위 내에 있다. 당업자는 개인에게 투여되는 약학 조성물의 유효량이 특히 생물학적 활성 화물의 특성에 의존한다는 것을 알고 있다. 변화를 관찰하는데 필요한 치료 기간과 반응을 일으키는 치료 후 간격은 원하는 효과에 따라 다양하다. 특정 양은 당업자에게 잘 알려진 통상적인 시험에 의해 결정될 수 있다.

생물학적 활성 화물의 양은 특정 활성제의 목적을 달성하는데 효과적인 양이다. 조성물의 양은 일반적으로 약리학적으로, 생물학적으로, 치료적으로, 또는 화학적으로 유효한 양이다. 그러나, 상기 양은 조성물이 캡슐, 정제 또는 액체와 같은 단위 제형에 사용될 때 약리학적, 생물학적, 치료적, 또는 화학적 유효량 미만일 수 있으며, 이는 단위 제형이 다양한 담체/생물학적 또는 화학적 활성제 조성물을 함유할 수 있거나 또는 나누어진 약리학적, 생물학적, 치료적, 또는 화학적 유효량을 함유할 수 있기 때문이다. 총 유효량은 생물학적 활성 화물의 약리학적, 생물학적, 치료적 또는 화학적 활성 양을 합계로 함유하는 누적 단위로 투여될 수 있다.

다양한 실시예에서, 피험자에게 투여되는 융합 분자의 양은 최대 0.001 pg, 최대 1 pg, 최대 2 pg, 최대 3 pg, 최대 4 pg, 최대 5 pg, 최대 10 pg, 최대 50 pg, 최대 100 pg, 최대 1 μg, 최대 2 μg, 최대 3 μg, 최대 4 μg, 최대 5 μg, 최대 10 μg, 최대 50 μg, 최대 100 μg, 최대 1 mg, 최대 2 mg, 최대 3 mg, 최대 4 mg, 최대 5 mg, 최대 10 mg, 최대 50 mg, 최대 100 mg, 또는 최대 1g이다.

다양한 실시예에서, 피험자에게 투여되는 융합 분자의 양은 적어도 0.001 pg, 적어도 1 pg, 적어도 2 pg, 적어도 3 pg, 적어도 4 pg, 적어도 5 pg, 적어도 10 pg, 적어도 50 pg, 적어도 100 pg, 적어도 1 μg, 적어도 2 μg, 적어도 3 μg, 적어도 4 μg, 적어도 5 μg, 적어도 10 μg, 적어도 50 μg, 적어도 100 μg, 적어도 1 mg, 적어도 2 mg, 적어도 3 mg, 적어도 4 mg, 적어도 5 mg, 적어도 10 mg, 적어도 50 mg, 적어도 100 mg, 또는 적어도 1g이다.

다양한 실시예에서, 피험자에게 투여되는 융합 분자의 양은 0.001 pg 내지 약 1g, 1 pg 내지 10 pg, 50 pg 내지 100 pg, 1 μg 내지 5 μg, 10 μg 내지 20 μg, 10 μg 내지 500 mg, 10 μg 내지 100 mg, 10 μg 내지 1000 μg, 10 μg 내지 250 μg, 10 μg 내지 100 μg, 10 μg 내지 50 μg, 1 mg 내지 5 mg, 또는 10 mg 내지 100 mg이다.

투여되는 융합 분자를 포함하는 조성물의 부피는 일반적으로 융합 분자의 농도 및 조성물의 제형에 의존할 것이다. 다양한 실시예에서, 융합 분자 조성물의 단위 용량은 0.001 μl 내지 1 ml, 1 μl 내지 100 μl, 50 μl 내지 500 μl, 0.01 ml 내지 1 ml, 1 ml 내지 100 ml, 0.05 ml 내지 1 ml이다. 예를 들어, 융합 분자 조성물의 단위 용량은 약 0.5 ml일 수 있다.

일 실시예에서, 융합 분자 조성물의 단위 용량은 최대 약 0.001 μl, 최대 1 μl, 최대 10 μl, 최대 50 μl, 최대 200 μl, 최대 0.01 ml, 최대 0.05 ml, 최대 0.1 ml, 최대 0.2 ml, 최대 0.5 ml, 또는 최대 1 ml이다.

일 실시예에서, 융합 분자 조성물의 단위 용량은 적어도 0.001 μl, 적어도 1 μl, 적어도 10 μl, 적어도 50 μl, 적어도 200 μl, 적어도 0.01 ml, 적어도 0.05 ml, 적어도 0.1 ml, 적어도 0.2 ml, 적어도 0.5 ml, 또는 적어도 1 ml이다.

융합 분자 조성물은 1 내지 50회 용량 (예를 들어, 0.5 ml 내지 25 ml), 보다 통상적으로 1 내지 10회 용량 (예를 들어, 0.5 ml 내지 5 ml)을 함유하는 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 융합 분자 조성물은 1회 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 용량은 약 1 내지 약 6 시간, 약 6 내지 약 12 시간, 약 12 내지 약 24 시간, 약 1 일 내지 약 3 일, 약 1 일 내지 약 1 주, 약 1 주 내지 약 2 주, 약 2 주 내지 약 1 개월, 약 4 내지 약 8 주, 약 1 내지 약 3 개월, 또는 약 1 내지 약 6 개월 간격으로 하나 이상의 용량으로 투여될 수 있다.

다양한 실시예에서, 융합 분자를 포함하는 약학 조성물은, 반드시는 아니지만, 증상을 개선시키는데 효과적인 양으로 매일 투여될 수 있다. 일반적으로, 총 일일 용량은 하루에 적어도 약 0.001 pg, 적어도 약 0.1 mg, 적어도 약 1 mg, 적어도 약 10 mg, 적어도 약 50 mg, 적어도 약 100 mg, 적어도 약 150 mg, 적어도 약 200 mg, 적어도 약 250 mg, 적어도 약 300 mg, 적어도 약 350 mg, 적어도 약 400 mg, 적어도 약 450 mg, 적어도 약 500 mg, 또는 하루에 적어도 약 1000 mg의 양으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 4개의 캡슐 또는 정제는 각각 50 mg 융합 분자를 함유하도록, 캡슐 또는 정제에서의 용량은 경구 투여용으로 제형화 될 수 있다. 경구 전달용 캡슐 또는 정제는 최대 완전 하루 경구 용량, 예를 들어, 하루에 200 mg 이상을 알맞게 함유할 수 있다.

다양한 실시예에서, 융합 분자를 포함하는 약학 조성물은, 반드시는 아니지만, 증상을 개선시키는데 효과적인 양으로 매일 투여될 수 있다. 일반적으로, 총 일일 용량은 하루에 최대 50 mg, 하루에 최대 100 mg, 하루에 최대 150 mg, 하루에 최대 200 mg, 하루에 최대 250 mg, 하루에 최대 300 mg, 하루에 최대 350 mg, 하루에 최대 400 mg, 하루에 최대 450 mg, 하루에 최대 500 mg, 또는 하루에 최대 1000 mg의 양으로 투여될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "공동-투여", "공동-투여된" 및 "병용하여"는, 본 발명의 융합 분자 및 하나 이상의 다른 치료제를 나타내는 것을 의미하는 것으로 의도되고, 하기의 것을 나타내고 포함한다: 이러한 성분들이 함께 실질적으로 동일한 시간에 환자에게 상기 성분을 방출하는 단일 제형으로 제형화 될 때, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 융합 분자 및 치료제(들)의 이러한 조합의 동시 투여; 이러한 성분들이 실질적으로 동시에 환자에 의해 취해진 별도의 제형으로 서로 별도로 제형화하여 상기 성분이 상기 환자에게 실질적으로 동시에 방출될 때, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 융합 분자 및 치료제(들)의 이러한 조합의 실질적으로 동시 투여; 이러한 성분들이 각 투여 사이의 상당한 시간 간격으로 환자에 의해 연속하여 취해진 별도의 제형으로 서로 별도로 제형화하여 상기 성분이 상기 환자에게 실질적으로 상이한 시간에 방출될 때, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 융합 분자 및 치료제(들)의 이러한 조합의 순차적인 투여; 및 이러한 성분들이 함께 조절된 방식으로 상기 성분을 방출하는 단일 제형으로 제형화하여 이들이 상기 환자에게 동일한 시간 및/또는 상이한 시간에 동시, 연속 및/또는 중첩하는 방식으로 방출되며, 여기서 각 부분이 동일하거나 또는 상이한 경로에 의해 투여될 때, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 융합 분자 및 치료제(들)의 이러한 조합의 순차적인 투여.

다양한 실시예에서, 융합 분자를 포함하는 약학 조성물은 제 2 성분과 함께 공동-투여될 수 있고, 상기 제 2 성분은 호르몬, 독소, 또는 GM-1 (모노시알로테트라헥소실강글리오시드) 수용체에 결합할 수 있는 생활성제(bioactive agent) 이다 (Hakomori, Advances in Exp. Medicine and Biology, 174:333-339, 1984). 다양한 실시예에서, 제 2 성분은 SV40 바이러스, 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 또는 콜레라 독소, 또는 녹농균( Pseudomonas aeruginosa )으로부터의 외독소(exotoxin) A (PE)와 같은 독소이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "콜레라 독소" 또는 "CT"는 급성, 생명을 위협하는 거대한 물 설사(watery diarrhea)를 야기할 수 있는 비브리오 콜레라균( Vibrio cholerae bacterium)의 시조 독성제(eponymous virulence agent)를 나타낸다. CT는 상피의 정단 표면에서 세포 표면 G _M1 강글리오시드 구조에 결합하는 B 아단위의 5량체로 구성된 단일 A 아단위로 구성된 단백질 복합체이다. CT는 CTXf 또는 CTXψ로 불리는 용원성 박테리오파지(lysogenic bacteriophage)의 변이체를 운반하는 비브리오 콜레라( V. cholerae )의 독성 균주로 수평 유전자 전달 후에 비브리오 콜레라( V. cholerae )에 의해 분비된다. 그러나, 최근의 콜레라 발생은 일부 혈청군(serogroups) (비(non)-O1, 비-O139)의 균주가 CT를 발현하지 않으나 다소 다른 독성 인자를 사용하는 것을 제시하였다. 비-O1, 비-O139 환경 및 임상 자료의 상세한 분석은 PE와 약간의 유사성을 가진 새로운 추정된 분비된 외독소의 존재를 제시하였다. CT의 서열은 알려져 있으며, 기재되어 있다 (Mekalanos JJ et al Nature 306, page 551 (1983)).

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "녹농균( Pseudomonas aeruginosa )으로부터의 외독소 A", "슈도모나스 외독소( Pseudomonas exotoxin) A" 또는 "PE"는 진핵세포에서 단백질 합성을 저해하는 녹농균( Pseudomonas aeruginosa )에 의해 분비된 극도로 활성인 단량체 단백질 (분자량 66 kD)을 나타낸다. PE의 613-잔기 서열은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어, US 특허번호 제 5,602,095호에 제시되어 있다. 도메인 Ia (아미노산 1-252)는 세포 결합을 매개한다. 도메인 II (아미노산 253-364)는 세포질로의 전좌의 원인이 되고, 도메인 III (아미노산 400-613)는 신장 인자 2의 ADP 리보실화를 매개한다. 도메인 Ib (아미노산 365-399)의 기능은, 비록 이것의 큰 부분이 알려져 있을 지라도, 정의되지 않은 채로 남아 있고, 아미노산 365-380은 세포 독성의 손실 없이 결실될 수 있다. 참조, Siegall et al., J Biol Chem, 264:14256-61 (1989).

PE의 특정 세포독성 단편은 당해 기술분야에서 알려져 있으며 종종 단편의 분자량에 의해 참조되고, 당업자에게 PE 단편의 특정 조성물을 지정한다. 예를 들어, PE40은 면역독소의 독성 부분으로 연구되고 사용된 첫 번째 단편들 중 하나였다. 용어는 비-특이적 결합을 담당하는 도메인인, 도메인 Ia에서 절단된 형태의 PE를 나타낸다. 참조, 예를 들어, Pai et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 88:3358-3362 (1991); and Kondo et al., J. Biol. Chem., 263:9470-9475 (1988). 그러나, 비-특이적 결합의 제거는, 도메인 Ia의 특정 잔기를 돌연변이시켜 달성될 수도 있다. 예를 들어, US 특허번호 제 5,512,658호는 도메인 Ia가 존재하나 57번, 246번, 247번, 및 249번 위치에서 도메인 Ia의 염기성 잔기가 산성 잔기 (글루탐산, 또는 "E")로 대체된 돌연변이된 PE가 비-특이적 세포독성을 크게 감소시킨다는 것을 개시하고 있다. 이 돌연변이 형태의 PE는 종종 "PE4E"라고도 한다.

다양한 실시예에서, 병용 요법은 동일한 약학 조성물 또는 별도의 약학 조성물 중 하나로, 분리된 융합 분자 조성물 및 제 2 물질 조성물을 동시에 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 실시예에서, 분리된 융합 분자 조성물 및 제 2 물질 조성물은 연속적으로 투여된다, 즉, 분리된 융합 분자 조성물은 제 2 물질 조성물의 투여 전 또는 후에 투여된다.

다양한 실시예에서, 분리된 융합 분자 조성물 및 제 2 물질 조성물은 동시에 투여된다, 즉, 분리된 융합 분자 조성물 및 제 2 물질 조성물의 투여 기간은 서로 중첩된다.

다양한 실시예에서, 분리된 융합 분자 조성물 및 제 2 물질 조성물의 투여는 비-동시적이다. 예를 들어, 다양한 실시예에서, 분리된 융합 분자 조성물의 투여는 제 2 물질 조성물이 투여되기 전에 종료된다. 다양한 실시예에서, 제 2 물질 조성물의 투여는 분리된 융합 분자 조성물이 투여되기 전에 종료된다. 다양한 실시예에서, 본 발명의 융합 분자의 투여는 단독으로 또는 치료제와 병용하여, 식사와 함께, 예를 들어 식사 전, 식사 중 또는 식사 후에 행할 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명의 융합 분자의 투여는 단독으로 또는 치료제와 병용하여, 식사 전에 행할 수 있다. 다양한 실시예에서, 본 발명의 융합 분자는 단독으로 또는 치료제와 병용하여, 식사 전 12 시간 이상, 11 시간 이상, 10 시간 이상, 9 시간 이상, 8 시간 이상, 7 시간 이상, 6 시간 이상, 5 시간 이상, 4 시간 이상, 3 시간 이상, 2 시간 이상, 1 시간 이상, 50 분 이상, 40 분 이상, 30 분 이상, 20 분 이상, 10 분 이상, 5 분 이상, 또는 1 분 이상 투여될 수 있다. 다양한 실시예에서, 본 발명의 융합 분자는 단독으로 또는 치료제와 병용하여, 식사 전 12 시간 미만, 11 시간 미만, 10 시간 미만, 9 시간 미만, 8 시간 미만, 7 시간 미만, 6 시간 미만, 5 시간 미만, 4 시간 미만, 3 시간 미만, 2 시간 미만, 1 시간 미만, 50 분 미만, 40 분 미만, 30 분 미만, 20 분 미만, 10 분 미만, 5 분 미만, 또는 1 분 미만 투여될 수 있다. 다양한 실시예에서, 본 발명의 융합 분자는 단독으로 또는 치료제와 병용하여, 식사 전 약 1 분 내지 약 10 분, 약 5 내지 약 30 분, 약 20 분 내지 약 60 분, 약 1 시간 내지 약 3 시간, 약 2 시간 내지 약 10 시간, 또는 약 5 시간 내지 약 12 시간 투여될 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명의 융합 분자의 투여는 단독으로 또는 치료제와 병용하여, 식사 후에 행할 수 있다. 다양한 실시예에서, 본 발명의 융합 분자는 단독으로 또는 치료제와 병용하여, 식사 후 12 시간 이상, 11 시간 이상, 10 시간 이상, 9 시간 이상, 8 시간 이상, 7 시간 이상, 6 시간 이상, 5 시간 이상, 4 시간 이상, 3 시간 이상, 2 시간 이상, 1 시간 이상, 50 분 이상, 40 분 이상, 30 분 이상, 20 분 이상, 10 분 이상, 5 분 이상, 또는 1 분 이상 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명의 융합 분자는 단독으로 또는 치료제와 병용하여, 식사 후 12 시간 미만, 11 시간 미만, 10 시간 미만, 9 시간 미만, 8 시간 미만, 7 시간 미만, 6 시간 미만, 5 시간 미만, 4 시간 미만, 3 시간 미만, 2 시간 미만, 1 시간 미만, 50 분 미만, 40 분 미만, 30 분 미만, 20 분 미만, 10 분 미만, 5 분 미만, 또는 1 분 미만 투여될 수 있다. 다양한 실시예에서, 본 발명의 융합 분자는 단독으로 또는 치료제와 병용하여, 식사 전 12 시간 미만, 11 시간 미만, 10 시간 미만, 9 시간 미만, 8 시간 미만, 7 시간 미만, 6 시간 미만, 5 시간 미만, 4 시간 미만, 3 시간 미만, 2 시간 미만, 1 시간 미만, 50 분 미만, 40 분 미만, 30 분 미만, 20 분 미만, 10 분 미만, 5 분 미만, 또는 1 분 미만 투여될 수 있다. 다양한 실시예에서, 본 발명의 융합 분자는 단독으로 또는 치료제와 병용하여, 식사 후 약 1 분 내지 약 10 분, 약 5 내지 약 30 분, 약 20 분 내지 약 60 분, 약 1 시간 내지 약 3 시간, 약 2 시간 내지 약 10 시간, 또는 약 5 시간 내지 약 12 시간 투여될 수 있다.

사용 방법

다른 측면에서, 경구 전달용으로 제형화된 약학 조성물은 경구 제형 및 전달에 특히 적합한 특정 종류의 질환 또는 질병을 치료하는데 사용된다. 이러한 종류의 질환 또는 질병은 바이러스성 질환 또는 감염, 암, 대사성 질환, 비만, 자가면역 질환, 염증성 질환, 알러지, 이식편 대 숙주병(graft-vs-host disease), 전신 미생물 감염, 빈혈, 심혈관 질환, 정신병, 유전병(genetic diseases), 신경퇴행성 질환, 조혈세포 장애(disorders of hematopoietic cells), 내분비계 질환 또는 생식기 질환, 위장관 질환을 포함한다. 많은 만성 질환에서, 본 발명의 융합 분자의 경구 제형은 이들이 주사 가능한 치료 또는 약물 프로토콜에 의존하지 않고 경구 투여를 통해 장기(long-term) 환자 간호 및 치료를 허용하기 때문에 특히 유용하다.

본 발명의 다양한 실시예에서, 본 발명의 융합 분자를 포함하는 약학 조성물은 염증성 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위해 제공된다. "염증성 질환"은 급성 또는 만성 염증과 관련된 모든 질환을 포함한다. 급성 염증은 유해한 자극에 대한 신체의 초기 반응이며, 혈장 및 백혈구 (예를 들어, 과립구)가 혈액으로부터 손상된 조직 내로의 증가된 이동에 기인한다. 다수의 생화학적 결과는 국소 혈관계, 면역계, 및 손상된 조직 내의 다양한 세포와 관련된 염증 반응을 증식시키고 성숙시킨다. 장기간 염증은 염증 부위에 존재하는 세포 유형의 점진적인 변화를 야기하는 만성 염증이라고 하고, 염증 과정에서 조직의 동시 파괴 및 치유를 특징으로 한다. 염증성 질환은 화상, 화학적 자극제, 동상, 독소, 병원균에 의한 감염, 신체 상해, 과민성으로 인한 면역 반응, 이온화 방사선, 또는 이물질, 예를 들어, 파편(splinters), 먼지(dirt) 및 잔해(debris)에 의해 야기될 수 있다. 염증성 질환의 예는 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다.

다양한 실시예에서, 염증성 질환은 염증성 장 질환, 건선 및 세균성 패혈증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "염증성 장 질환"은 크론병, 궤양성 대장염, 콜라겐성 대장염, 림프성 대장염, 허혈성 대장염, 전환 대장염(diversion colitis), 베체트 증후군(Behcet's syndrome) 및 불확정 대장염(indeterminate colitis)을 포함하는 대장 및 소장의 염증성 질환의 군을 나타낸다.

본 발명에 따른 "크론병"은 인터루킨-12, 종양 괴사 인자 (TNF), 및 인터페론-γ의 증가된 생성을 포함하는 면역 반응 패턴을 가지며 (Romagnani. Inflamm Bowel Dis 1999; 5:285-94), 이것으로 고통받는 환자의 생활양식에 치명적인 영향을 미칠 수 있는, T-헬퍼 유형 1 (Th 1) 염증성 장 질환이다. 크론병의 일반적인 증상은 설사, 경련(cramping), 복통, 발열, 및 직장 출혈을 포함한다. 크론병 및 이와 관련된 합병증은 종종 한번 이상의 수술을 필요로 하는 환자에서 야기된다. 크론병에 대한 치료법은 알려져 있지 않으며, 장기적이고 효과적인 치료 방안은 제한적이다. 치료의 목적은 염증을 조절하고, 영양 결핍을 바로잡고, 복통, 설사 및 직장 출혈과 같은 증상을 완화시키는 것이다. 치료는 사람이 재발을 경험한 횟수를 낮춤으로써 질환을 조절하는데 도움이 될 수 있지만, 치료법은 없다. 치료는 약물, 영양 보충제, 수술, 또는 이러한 방안의 조합을 포함할 수 있다. 치료를 위해 투여될 수 있는 일반적인 치료제는 설파살라진(sulfasalazine)을 포함하는 항-염증 약물, 프레드니손을 포함하는 코르티손 또는 스테로이드, 6-머캅토푸린 또는 아자티오프린과 같은 면역계 억제제, 및 항생제를 포함한다.

본 발명에 따른 "건선"은 피부 및 관절에 영향을 미치는 질환이다. 일반적으로 붉은 비늘 조각이 피부에 나타난다. 건선성 플라크(psoriatic plaques)라고 불리는, 건선에 의해 야기된 비늘 조각은 염증 부위와 과도한 피부 생성 부위이다. 피부는 이들 부위에서 빠르게 축적되어 은백색을 나타낸다. 플라크는 팔꿈치와 무릎의 피부에 자주 발생하지만, 두피와 생식기를 포함하는 모든 부위에 영향을 미칠 수 있다. 건선은 면역-매개성으로 전염되지 않는다고 가정된다. 이 질환은 작은 국소적 패치(minor localised patches)로부터 완전한 신체 범위(complete body coverage)까지 중증도에 따라 변하는 만성 재발성 질병이다. 손톱 및 발톱은 자주 영향을 받으며 (건선성 조갑 이영양증(psoriatic nail dystrophy)), 이는 고립된 결과로 볼 수 있다. 또한, 건선은 건선성 관절염으로 알려져 있는 관절의 염증을 야기할 수 있다. 건선을 가진 사람의 10 내지 15%가 건선성 관절염을 가지고 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "세균성 패혈증"은 혈류에서 세균의 순환에 기인하는 생명을 위협하는 질병을 나타낸다. 패혈증은 미세순환의 실패로 인한 조직 손상 및 궁극적으로 패혈성 쇼크를 야기하는 전염증성 사이토카인의 일반화된 전신 생성을 야기한다.

본 발명의 다른 측면은, 약학적으로 허용가능한 담체 내의 본 명세서에 기재된 융합 분자의 치료적 유효량을 (단일 요법 또는 병용 요법으로) 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 질환의 치료, 예방 및/또는 방지 방법에 관한 것이다.

본 발명과 관련된 자가면역 질환은, 개체 자신의 조직 또는 이의 공동-분리 (co-segregate) 또는 징후 또는 이로부터 야기되는 질병으로부터 발생하는 질환 또는 장애이다. 다양한 실시예에서, 자가면역 질환은 전신성 홍반선 루프(SLE), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 용혈성 빈혈, 혈소판 감소증 자반병(thrombocytopenia purpura), 그레이브병(Grave's disease), 쇼그렌병(Sjogren's disease), 피부근염(dermatomyositis), 하시모토병 (Hashimoto's disease), 다발성 근염(polymyositis), 염증성 장 질환, 다발성 경화증(MS), 당뇨병, 류마티스 관절염, 및 피부경화증(scleroderma)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명에 따른 "류마티스 관절염"은 신체 면역계가 골관절을 공격하게 하는 자가면역 질환이다 (Muller B et al., Springer Semin Immunopathol., 20:181-96, 1998). 류마티스 관절염은 많은 조직과 기관에 영향을 미칠 수 있지만, 주로 활액성 관절(synovial joints)을 공격하는 만성, 전신성 염증성 질환이다. 이 과정은 활액 세포의 과형성(hyperplasia), 과도한 활액, 및 활액막(synovium)에서의 판누스(pannus)의 발생에 대해 이차적인 활액막 (활액막염(synovitis))의 염증 반응을 일으킨다. 질환 과정의 병리학은 종종 관절 연골(articular cartilage)의 파괴와 관절의 강직(ankylosis)에 이르게 한다. 또한, 류마티스 관절염은 폐, 심낭 (pericardium), 흉막(pleura) 및 공막(sclera)에서 확산 염증을 야기할 수 있으며, 또한 피부 아래의 피하 조직에서 가장 흔한 결절성 병변(nodular lesions)을 생성할 수 있다.

본 발명의 다양한 실시예에서, 약학적으로 허용가능한 담체 내의 본 명세서에 기재된 융합 분자의 치료적 유효량을 (단일 요법 또는 병용 요법으로) 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료, 예방 및/또는 방지에 사용하기 위한 본 발명의 융합 분자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 치료될 암은 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 털세포 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 다발성 골수종, 췌장암, 대장암, 위암, 전립선암, 방광암, 신장암, 난소암, 자궁경부암, 유방암, 폐암, 비인두암, 악성 흑색종, 리툭시맙 내성 NHL 및 백혈병을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

다양한 실시예에서, 본 명세서에 기재된 융합 분자의 치료적 유효량은 하나 이상의 다른 치료제와 병용하여 투여될 것이다. 이러한 치료제는 염증성 질환, 자가면역 질환, 또는 암과 같은 본 명세서에 기재된 바와 같은 특정 질환 상태에 대한 표준 치료제로서 당해 기술분야에서 용인될 수 있다. 예상되는 예시적인 치료제는 사이토카인, 성장 인자, 스테로이드, NSAIDs, DMARDs, 항-염증제, 화학요법제, 방사선 치료제, 또는 기타 활성제 및 보조제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

다양한 실시예에서, 본 발명은 대사성 장애를 갖는 피험자를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 장애를 치료하기에 충분한 양의 본 발명의 융합 분자를 경구 투여하는 단계를 포함하고, 상기 대사성 장애는 당뇨병, 비만, 비만으로 인한 당뇨병, 고혈당증, 이상지질혈증, 고중성지방혈증, X 증후군, 인슐린 저항성, 내당능 장애 (IGT), 당뇨병성 이상지질혈증, 또는 고지혈증이다.

다른 측면에서, 본 발명은 지방간 질환 (예를 들어, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD); 비알콜성 지방간염(NASH)), 위장관 질환, 또는 신경퇴행성 질환을 갖는 피험자를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 질환을 치료하기에 충분한 양의 본 발명의 융합 분자를 경구 투여하는 단계를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 비-자연적으로 발생하는 융합 분자를 필요로 하는 피험자에서 GH 결핍 성장 장애의 치료, 예방 및/또는 방지용 약제의 제조를 위해 본 발명의 비-자연적으로 발생하는 융합 분자의 용도에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 GH 결핍 성장 장애를 갖는 피험자를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 장애를 치료하기에 충분한 양의 본 발명의 융합 분자를 경구 투여하는 단계를 포함하고, 상기 장애는 성장 호르몬 결핍증(GHD), 터너 증후군(TS), 누난 증후군, 프라더-윌리 증후군, 저신장증 호메오박스-함유 유전자 (SHOX) 결핍증, 만성 신부전증, 및 특발성 저신장증 단장 증후군, 희귀한 뇌하수체 종양들 또는 이들의 치료로 인한 GH 결핍증, 및 HIV/AIDS와 관련된 근소모성 질환이다.

융합 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드

다른 측면에서, 본 발명은 비-자연적으로 발생하는 융합 분자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이들 폴리뉴클레오티드는 융합 분자의 제조에 유용하다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 변형된 콜릭스 독소를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 서열, 및 생물학적 활성 화물을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 폴리링커 삽입 부위를 포함하는 발현 시스템을 제공한다. 폴리링커 삽입이 변형된 콜릭스 독소의 수용체 결합 도메인 또는 통과세포외배출(transcytosis) 도메인을 파괴하지 않는 한, 폴리링커 삽입 부위는 폴리뉴클레오티드 서열의 어디에나 있을 수 있다. 다양한 실시예에서, 발현 시스템은 절단형 링커에서의 절단이 인코딩된 융합 분자의 나머지로부터 폴리링커 삽입 부위에 삽입된 핵산에 의해 인코딩된 생물학적 활성 화물을 분리하도록 절단형 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 폴리링커 삽입 부위가 인코딩된 구조체의 말단에 있는 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리링커 삽입 부위와 폴리뉴클레오티드의 나머지 사이의 절단형 링커를 인코딩하는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 폴리링커 삽입 부위가 인코딩된 구조체의 말단에 없는 실시예에서, 폴리링커 삽입 부위는 절단형 링커를 각각 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 측면에 있을 수 있다.

본 발명의 융합 분자에 유용한 변형된 콜릭스 독소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제조하는데 사용될 수 있는 다양한 in vitro 방법은, 역전사, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사-기반 증폭 시스템(transcription-based amplification system, TAS), 자가-유지 서열 복제 시스템 (self-sustained sequence replication system) (3SR) 및 QP 복제효소 증폭 시스템(replicase amplification system) (QB)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 재조합 핵산의 구축에 유용한 당업자에게 알려진 임의의 이러한 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 단백질 또는 이의 일부를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 변형된 콜릭스 독소 또는 수용체 결합 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드의 DNA 서열을 기준으로 한 프라이머를 이용하여 cDNA의 중합효소 연쇄 반응에 의해 분리될 수 있다.

이러한 클로닝 및 in vitro 증폭 방법을 이용하기 위한 지침은 [US 특허번호 제 4,683,195호; Mullis et al., 1987, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; 및 Erlich, ed., 1989, PCR Technology, Stockton Press, NY.]에 기재되어 있다. 또한, 융합 분자 또는 이의 일부를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 가혹한, 적당히 가혹한, 또는 매우 가혹한 혼성화 조건 하에서 원하는 폴리뉴클레오티드의 서열로부터 선택된 프로브로 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 분리될 수 있다.

본 발명의 융합 분자를 인코딩하는 핵산의 구축은, 생물학적 활성 화물을 인코딩하는 핵산의 삽입 부위를 구조체에 도입함으로써 촉진시킬 수 있다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물의 삽입 부위는 변형된 콜릭스 독소의 도메인 Ib의 시스테인 잔기를 인코딩하는 뉴클레오티드 사이에 도입될 수 있다. 다른 실시예에서, 삽입이 이에 의해 인코딩된 기능성 도메인을 파괴하지 않는 한, 삽입 부위는 구조체를 인코딩하는 핵산 내 어디에나 도입될 수 있다. 다양한 실시예에서, 삽입 부위는 ER 잔류 도메인 내에 있을 수 있다.

또한, 폴리뉴클레오티드는 인코딩된 융합 분자의 아미노 말단에서 분비 서열을 인코딩할 수도 있다. 이러한 구조체는 면역원의 분리를 단순화하기 때문에, 포유류 세포에서 융합 분자를 생성하는데 유용하다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 융합 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유도체 버전도 포함한다. 이러한 유도체는 제한 없이 당업자에게 알려진 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 유도체는 융합 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 1, 2, 3, 5, 10 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 치환, 삽입, 또는 결실을 포함하는, 부위-특이적 돌연변이유발(site-specific mutagenesis)에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 유도체는 무작위 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있다. 핵산을 무작위로 돌연변이시키는 하나의 방법은 0.1 mM MnCl ₂ 및 불균형 뉴클레오티드 농도의 존재 하에 PCR 반응에서 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 이러한 조건은 PCR 반응에서 사용된 폴리머라제의 부정확한 통합 속도를 증가시키고 증폭된 핵산의 무작위 돌연변이유발을 야기한다.

따라서, 다양한 실시예에서, 본 발명은 융합 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 융합 분자는 변형된 콜릭스 독소 및 피험자에게 전달될 생물학적 활성 화물; 및 임의로, 비-절단형 또는 절단형 링커를 포함한다. 절단형 링커에서의 절단은 융합 분자의 나머지로부터 생물학적 활성 화물을 분리할 수 있다. 절단형 링커는 피험자의 편광 상피 세포의 기저측면 막에서 또는 피험자의 혈장 내에 존재하는 효소에 의해 절단될 수 있다.

다양한 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 가혹한 혼성화 조건 하에 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드에 혼성화한다. 추가 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 가혹한 혼성화 조건 하에 본 발명의 임의의 융합 분자를 인코딩하는 핵산에 혼성화한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 융합 분자를 발현하기 위한 발현 벡터를 제공한다. 일반적으로, 발현 벡터는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 분자이다. 발현 벡터는 적당한 프로모터, 복제 서열, 선택가능한 마커 등을 포함시킴으로써 원핵생물 또는 진핵생물에서의 기능에 용이하게 적응하여 안정한 전사 및 번역 또는 mRNA를 야기할 수 있다. 발현 벡터의 구축 및 발현 벡터를 포함하는 세포에서 유전자의 발현 기술은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 참조, 예를 들어, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning--A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, and Ausubel et al., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY.

발현 벡터에서 사용하기에 유용한 프로모터는, 메탈로티오네인 (metallothionein) 프로모터, 항시성 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (constitutive adenovirus major late promoter), 덱사메타손-유도성 (dexamethasone-inducible) MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP pol III 프로모터, 항시성 MPSV 프로모터, 테트라사이클린-유도성(tetracycline-inducible) CMV 프로모터 (예를 들어, 인간 즉시-초기(human immediate-early) CMV 프로모터), 및 항시성 CMV 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

발현 벡터는 융합 분자가 발현되는 세포에 적합한 발현 및 복제 신호를 함유해야 한다. 융합 분자를 발현하는데 유용한 발현 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스와 같은 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 코스미드 등을 포함한다. 포유류 세포에 발현 벡터를 형질감염시키기 위해서는 바이러스 벡터 및 플라스미드 벡터가 바람직하다. 예를 들어, 발현 조절 서열이 CMV 프로모터를 포함하는 발현 벡터 pcDNA1 (Invitrogen, San Diego, Calif.)는, 이러한 세포 내로 형질감염 및 발현의 양호한 속도를 제공한다.

발현 벡터는 제한 없이 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 융합 분자의 발현을 위해 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 방법은 용액으로부터의 세포에 의한 분자의 직접 흡수; 리포좀 또는 면역리포좀을 이용하여 리포펙션(lipofection)을 통한 촉진 흡수; 입자-매개 형질감염 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 참조, 예를 들어, US 특허번호 제 5,272,065호; Goeddel et al., eds, 1990, Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., CA; Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression--A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning--A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; and Ausubel et al., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY.

또한, 발현 벡터는 융합 분자의 분리를 단순화시키는 정제 부분을 함유할 수 있다. 예를 들어, 6개의 히스티딘 잔기의 폴리히스티딘 부분은 단백질의 아미노 말단 끝에서 포함될 수 있다. 폴리히스티딘 부분은 니켈-킬레이트 크로마토그래피에 의해 단일 단계에서 단백질을 간편하게 분리할 수 있다. 다양한 실시예에서, 정제 부분은 정제 후 융합 분자의 나머지로부터 절단될 수 있다. 다른 실시예에서, 정제 부분은 융합 분자의 기능성 도메인의 기능을 방해하지 않으며, 따라서 절단될 필요가 없다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 융합 분자, 또는 이의 일부의 발현을 위한 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 상기 세포는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해 고농도의 융합 분자를 발현하는 능력을 갖는 것으로 선택된다. 다양한 실시예에서, 세포는 원핵 세포, 예를 들어, E. coli 이다. 실시예에 기재된 바와 같이, 융합 분자는 적절하게 접히고 E. coli 에서 발현될 때 적당한 이황화 결합을 포함한다.

다른 실시예에서, 세포는 진핵 세포이다. 유용한 진핵 세포는 효모 및 포유류 세포를 포함한다. 재조합 폴리펩티드를 발현하는데 유용한 당업자에게 알려진 임의의 포유류 세포는 제한 없이 융합 분자를 발현하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포는 융합 분자를 발현하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 융합 분자는 하기에 기재된 바와 같이 재조합에 의해 제조될 수 있다. 그러나, 융합 분자는 당업자에게 알려진 방법을 이용하여 화학 합성에 의해 제조될 수도 있다.

본 발명의 융합 분자를 발현 및 정제하는 방법은 하기의 실시예에서 광범위하게 기재된다. 일반적으로, 상기 방법은 벡터로부터 융합 분자를 발현할 수 있는 세포에 융합 분자를 인코딩하는 발현 벡터의 도입에 의존한다. 그 다음, 융합 분자는 피험자에게 투여하기 위해 정제될 수 있다.

통과세포외배출 시험( Transcytosis Testing)

통과세포외배출 도메인의 기능은 상피 막을 통과하는 융합 분자의 능력의 함수로서 시험될 수 있다. 통과세포외배출은 먼저 세포에의 결합을 요구하기 때문에, 이러한 분석법은 세포 인식 도메인의 기능을 평가하는데도 사용될 수 있다.

융합 분자의 통과세포외배출 활성은 제한 없이 당업자에게 알려진 임의의 방법으로 시험될 수 있다. 다양한 실시예에서, 통과세포외배출 활성은 융합 분자가 결합하는 비-편광 세포에 들어가는 능력을 평가함으로써 시험될 수 있다. 임의의 특정 이론 또는 작용 메커니즘에 얽매이게 할 의도 없이, 통과세포외배출 도메인이 편광 상피 세포를 통과할 수 있게 하는 동일한 특성 또한 통과세포외배출 도메인을 갖는 분자가 비-편광 세포로 들어갈 수 있게 한다고 생각된다. 따라서, 융합 분자가 세포에 들어가는 능력은 세포의 내부에서 구조체의 물리적 존재를 검출함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 융합 분자는 형광 마커로 표지될 수 있으며, 융합 분자는 세포에 노출될 수 있다. 그 다음, 세포를 세척하고, 세포에 들어가지 않은 임의의 융합 분자를 제거하고, 남아 있는 표지의 양을 결정할 수 있다. 이 견인 (traction)에서 표지의 검출은 융합 분자가 세포에 들어갔다는 것을 나타낸다.

다른 실시예에서, 융합 분자의 통과세포외배출 능력은 편광 상피 세포를 통과하는 융합 분자의 능력을 평가함으로써 시험될 수 있다. 예를 들어, 융합 분자는 형광 마커로 표지될 수 있으며, 상피 세포층의 정단막에 접촉될 수 있다. 상피 세포에 의해 형성된 막의 기저측면 쪽에서 검출된 형광은 통과세포외배출 도메인이 적절히 기능하고 있음을 나타낸다.

절단형 링커 절단 시험

절단형 링커의 기능은 일반적으로 절단 분석법에서 시험될 수 있다. 당업자에게 알려진 임의의 적당한 절단 분석법을 제한 없이 사용하여 절단형 링커를 시험할 수 있다. 세포-기반 및 무세포 분석법 모두 절단형 링커를 절단하는 효소의 능력을 시험하는데 사용될 수 있다.

절단형 링커의 절단을 시험하기 위한 예시적인 무세포 분석법은 편광 상피 세포의 추출물을 제조하는 단계 및 막-관련 효소에 상응하는 추출물의 분획에 절단형 링커를 갖는 표지된 융합 분자를 노출시키는 단계를 포함한다. 이러한 분석법에서, 표지는 전달될 생물학적 활성 화물 또는 융합 분자의 나머지에 부착될 수 있다. 이들 효소 중에는, 상기 기재된 바와 같이 편광 상피 세포의 기저측면 막 근처에서 발견되는 절단 효소가 있다. 절단은 융합 분자를 항체와 결합시키고 결합되지 않은 분자를 세척함으로써 검출될 수 있다. 만일 표지가 전달될 생물학적 활성 화물에 부착되면, 항체에 결합된 분자 상에 표지가 거의 또는 전혀 관찰되지 않아야 한다. 대안적으로, 분석법에서 사용된 결합제는 생물학적 활성 화물에 대해 특이적일 수 있으며, 구조체의 나머지는 표지될 수 있다. 두 경우 모두, 절단을 평가할 수 있다.

또한, 절단은 막으로 모인(assembled) 편광 상피 세포에 의한 절단을 시험하는 세포-기반 분석법을 이용하여 시험될 수 있다. 예를 들어, 표지된 융합 분자, 또는 절단형 링커를 포함하는 융합 분자의 일부가 링커의 절단을 허용하는 조건 하에서, 적당한 상피 세포, 예를 들어, Caco-2 세포의 단층의 정단 쪽 또는 기저측면 쪽에 접촉될 수 있다. 절단은 융합 분자, 또는 이의 일부에 특이적으로 결합하는 시약을 이용하여 표지의 유무를 검출함으로써 검출될 수 있다. 예를 들어, 융합 분자에 대해 특이적인 항체는 항체에 의해 결합된 융합 분자의 부분과 관련하여 절단형 링커의 말단에 표지를 포함하는 융합 분자를 결합시키는데 사용될 수 있다. 그 다음, 절단은 항체에 결합된 분자 상의 표지의 존재를 검출함으로써 평가될 수 있다. 만일 절단이 발생하면, 항체에 결합된 분자 상에 표지가 거의 또는 전혀 관찰되지 않아야 한다. 이러한 실험을 수행함으로써, 정단막보다는 기저측면 막에서 우선적으로 절단하는 효소가 확인될 수 있고, 또한, 융합 분자에서 절단형 링커를 절단하는 이러한 효소의 능력이 확인될 수 있다.

또한, 절단은 US 특허번호 제 6,759,207호에 기재된 바와 같은 형광 리포터 분석법을 이용하여 시험될 수도 있다. 간단하게, 이러한 분석법에서, 형광 리포터는 절단 효소가 리포터를 절단할 수 있는 조건 하에 적당한 상피 세포의 단층의 기저측면 쪽에 접촉된다. 리포터의 절단은 형광 리포터의 구조를 변화시켜, 비-형광 구성(non-fluorescent configuration)에서 형광 구성으로 변화시킨다. 관찰된 형광의 양은 기저측면 막에 존재하는 절단 효소의 활성을 나타낸다.

또한, 절단은 US 특허번호 제 6,592,847호에 기재된 것과 같은 분자내 소광 분자 프로브(intra-molecularly quenched molecular probe)를 이용하여 시험될 수도 있다. 이러한 프로브는 일반적으로 적당한 파장의 빛으로 여기될 때 광자를 방출하는 형광 부분 및 형광 부분에 근접할 때 이러한 광자를 흡수하는 소광제 부분(quencher moiety)을 포함한다. 프로브의 절단은 형광이 검출될 수 있도록 형광 부분으로부터 소광 부분을 분리함으로써, 절단이 발생하였음을 나타낸다. 따라서, 이러한 프로브는 절단 효소가 프로브를 절단할 수 있는 조건 하에 적당한 상피 세포의 단층의 기저측면 쪽을 프로브와 접촉시킴으로써 특정 절단 효소에 의한 절단을 확인하고 평가하는데 사용될 수 있다. 관찰된 형광의 양은 시험되는 절단 효소의 활성을 나타낸다.

예시적인 콜릭스 독소-생물학적 활성 화물 융합 분자

본 발명의 실시예는 표 7에 기재된 융합 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 80의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소 및 서열번호: 82의 아미노산 서열을 갖는 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 70의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소 및 서열번호: 82의 아미노산 서열을 갖는 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 42의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소 및 서열번호: 82의 아미노산 서열을 갖는 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 114에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 115에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 52의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소, 및 서열번호: 88의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변 및 서열번호: 89의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변을 포함하는 항체인 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 52의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소, 및 서열번호: 90의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변 및 서열번호: 91의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변을 포함하는 항체인 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 52의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소 및 서열번호: 92의 아미노산 서열을 갖는 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 52의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소 및 서열번호: 93의 아미노산 서열을 갖는 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 52의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소 및 서열번호: 94의 아미노산 서열을 갖는 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 52의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소 및 서열번호: 95의 아미노산 서열을 갖는 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 80의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소, 및 서열번호: 88의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변 및 서열번호: 89의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변을 포함하는 항체인 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 80의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소, 및 서열번호: 90의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변 및 서열번호: 91의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변을 포함하는 항체인 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 80의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소 및 서열번호: 92의 아미노산 서열을 갖는 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 80의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소 및 서열번호: 93의 아미노산 서열을 갖는 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 80의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소 및 서열번호: 94의 아미노산 서열을 갖는 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 80의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소 및 서열번호: 95의 아미노산 서열을 갖는 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 70의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소, 및 서열번호: 88의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변 및 서열번호: 89의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변을 포함하는 항체인 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 70의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소, 및 서열번호: 90의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변 및 서열번호: 91의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변을 포함하는 항체인 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 70의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소 및 서열번호: 92의 아미노산 서열을 갖는 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 70의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소 및 서열번호: 93의 아미노산 서열을 갖는 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 70의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소 및 서열번호: 94의 아미노산 서열을 갖는 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 70의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소 및 서열번호: 95의 아미노산 서열을 갖는 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 42의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소, 및 서열번호: 88의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변 및 서열번호: 89의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변을 포함하는 항체인 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 42의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소, 및 서열번호: 90의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변 및 서열번호: 91의 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변을 포함하는 항체인 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 42의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소 및 서열번호: 92의 아미노산 서열을 갖는 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 42의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소 및 서열번호: 93의 아미노산 서열을 갖는 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 42의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소 및 서열번호: 94의 아미노산 서열을 갖는 생물학적 활성 화물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 서열번호: 42의 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜릭스 독소 및 서열번호: 95의 아미노산 서열을 갖는 생물학적 활성 화물을 포함한다.

도 1은 본 명세서에서 평가된 2개의 예시적인 콜릭스 독소-IL-10 융합 분자의 유전적 구조를 나타낸다. 안정된 비-절단형 링커 서열 ((G ₄ S) ₃ ) 또는 담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제에 대한 기질로 알려져 있는 링커 서열을 이용하여, 인간 IL-10 단량체 서열의 N-말단을 변형된 콜릭스 독소 (콜릭스 ⁴¹⁵ )의 C-말단에 유전적으로 결합하였다. 각 구조체는 N-말단 메티오닌 (M)도 함유한다.
도 2는 IL-10 이량체화에 의해 움직이도록 되어 있는 재접힘(refolding) 이후의 예시적인 "이량체 콜릭스 독소-IL-10" 융합 분자를 대표하는 리본 다이어그램이다. 콜릭스 독소의 첫번째 415 아미노산 (서열번호: 1)은 인간 IL-10 서열과 연결하기 위해 16 아미노산 링커 (표시되지 않음)를 통해 연결된다. IL-10 이량체화는 자주색 콜릭스 ⁴¹⁵ /청색 hIL-10 및 오렌지색 콜릭스 ⁴¹⁵ /녹색 조직(organization)이 나타나는 것으로 예상된다.
도 3은 봉입체(inclusion bodies)로부터 유도 및 발현 후에 콜릭스 ⁴¹⁵ -TEV-IL-10 ("C"로 표시됨) 및 콜릭스 ⁴¹⁵ -(G ₄ S) ₃ -IL-10 ("N"으로 표시됨)의 쿠마씨 염색된 SDS PAGE 이다. 발현된 융합 분자는 각각 66380.78 및 65958.25 달톤의 계산된 질량과 비슷한 ~ 66 kDa의 예상 분자 크기를 나타낸다. SeeBlue® Plus2 Prestained MW 표준이 표시된다.
도 4는 2가지 농도에서 본 발명의 예시적인 콜릭스 독소-IL-10 융합 분자로 처리된 마우스 대식세포-유래 J774.2 세포주를 이용하여 유동 세포 계측법(flow cytometry) 분석 결과를 나타내는 막대 그래프이다. % 증식은 처리 후 48시간에 측정되었다. 값은 n=4 ± 표준편차를 나타낸다. 자료는 "이량체 콜릭스 ⁴¹⁵ -(G ₄ S) ₃ -IL-10" 융합 분자가 생물학적 활성 IL-10임을 나타낸다.
도 5는 이량체 콜릭스 ⁴¹⁵ -(G ₄ S) ₃ -IL-10 융합 분자가 in vitro 에서 Caco-2 세포 단층의 장벽 특성에 대한 효과에 대해 시험된 분석 결과를 나타내는 선 그래프이다. 형광물질(Fluorescein)-표지된 70 kDa 덱스트란 및 다양한 농도의 이량체 콜릭스 ⁴¹⁵ -(G ₄ S) ₃ -IL-10 융합 분자를 이들 단층의 정단 표면(apical surface)에 가하고, 기저 구획에서 검출된 형광의 누적량을 교체로 150 μL 부피를 모아 시간 경과에 따라 관찰하였다. 누적되는 기저 덱스트란 수준 (pmol)은 시간에 대해 플롯팅하였다. 각 선은 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 및 240분에 측정된 기저 형광값의 평균 (n=4)을 나타낸다.
도 6은 이량체 콜릭스 ⁴¹⁵ -(G ₄ S) ₃ -IL-10 융합 분자가 in vitro 에서 Caco-2 세포 단층의 장벽 특성에 대한 효과에 대해 시험된 분석 결과를 나타내는 선 그래프이다. 형광물질-표지된 70 kDa 덱스트란 및 다양한 농도의 이량체 콜릭스 ⁴¹⁵ -(G ₄ S) ₃ -IL-10 융합 분자를 이들 단층의 정단 표면에 가하고, 기저 구획에서 검출된 형광의 누적량을 시간 경과에 따라 관찰하였다.
도 7A 및 7B는 이량체 콜릭스 ⁴¹⁵ -(G ₄ S) ₃ -IL-10 융합 분자가 Caco-2 세포 단층을 횡단하여 이동하려는 능력을 평가하는 ELISA 분석 결과를 나타내는 선 그래프이다. 다양한 농도에서 정단 첨가 후 시간 경과에 따라 기저 구획에 도달하는 이량체 콜릭스 ⁴¹⁵ -(G ₄ S) ₃ -IL-10 융합 분자의 누적량은 설명문에 나타내었다. 각 선은 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 및 240분에 측정된 기저 IL-10 수준의 평균 (n=4)을 나타낸다. 시간 경과에 따라 수송된 누적 IL-10은 6A = 8000 fmol IL-10 확장된 및 6B = 1000 fmol IL-10의 범위에서 그래프로 나타내었다.

하기의 실시예는 본 발명을 단지 설명하기 위한 것일 뿐, 어떤 방식으로든 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.

실시예 1

본 실시예에서, 변형된 콜릭스 독소 서열, 절단형 링커 서열, 및 생물학적 활성 화물을 포함하는, 단일 아미노산 서열로서 비-자연적으로 발생하는 융합 분자의 제조가 일반적으로 기재되어 있다.

폴리펩티드 인터루킨-10 (서열번호: 82), 인터루킨-19 (서열번호: 83), 인터루킨-20 (서열번호: 84), 인터루킨-22 (서열번호: 85), 인터루킨-24 (서열번호: 86), 또는 인터루킨-26 (서열번호: 87)을 전달하기 위한 7개의 예시적인 융합 분자 발현 벡터는 일반적으로 하기에 기재된 바와 같이 구축된다. 먼저, 폴리펩티드 유전자는 NdeI 및 EcoRI, PstI 및 PstI, AgeI 및 EcoRI, 또는 PCR 산물의 양 끝의 PstI 및 EcoRI 부위의 제한 효소 쌍을 통합시킨 PCR에 의해 증폭된다. 제한 효소 소화 후, PCR 산물을 세포 발현을 위해 적당한 플라스미드에 클로닝시키고, 이를 상응하는 제한 효소 쌍으로 소화시킨다. 결과의 구조체는 서열번호: 1의 아미노산 1-386을 인코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 변형된 콜릭스 독소 (콜릭스 ³⁸⁶ ) 및 각 폴리펩티드를 포함하고, 또한 폴리펩티드의 N-말단에서 6-His 모티프로 태깅하여 정제를 용이하게 한다. 최종 플라스미드는 제한 효소 소화 및 DNA 시퀀싱에 의해 확인된다.

또한, 콜릭스 ⁴¹⁵ (서열번호: 52), 서열번호: 121에 제시된 아미노산 서열을 갖는 절단형 링커 서열, 및 서열번호: 82의 아미노산 잔기 20-178로 이루어진 IL-10 폴리펩티드인 생물학적 활성 화물을 포함하는 비-자연적으로 발생하는 융합 분자 (이 융합 분자는 "Cholix ⁴¹⁵ -TEV-IL-10"으로 명명됨, 참조 도 1 (서열번호: 122)); 및 콜릭스 ⁴¹⁵ (서열번호: 52), 서열번호: 98에 제시된 아미노산 서열을 갖는 비-절단형 링커 서열, 및 서열번호: 82의 아미노산 잔기 20-178로 이루어진 IL-10 폴리펩티드인 생물학적 활성 화물을 포함하는 비-자연적으로 발생하는 융합 분자 (이 융합 분자는 "Cholix ⁴¹⁵ -(G ₄ S) ₃ -IL-10"으로 명명됨, 참조 도 1 (서열번호: 123))가 제조되었다.

비-절단형 또는 절단형 링커를 포함하는 발현 벡터는 적당한 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 도입함으로써 구축된다. 이렇게 하기 위하여, 적당한 제한 부위에 상보적인 서열 및 원하는 링커의 아미노산 서열을 인코딩하는 올리고뉴클레오티드를 합성한 다음, 변형된 콜릭스 서열 및 폴리펩티드 서열 사이에서 상기 기재된 바와 같이 제조된 발현 벡터에 결합시킨다.

다양한 실시예에서, 융합 분자는 하기와 같이 발현된다: E. coli BL21(DE3) pLysS 컴피턴트 세포(competent cells) (Novagen, Madison, Wis.)는 적당한 플라스미드의 존재 하에 표준 열-쇼크 방법을 이용하여 형질전환시켜 암피실린-함유 배지에서 선택된 융합 분자 발현 세포를 생성하고, 항생제와 함께 루리아-베르타니 브로스(Luria-Bertani broth) (Difco; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에서 분리 및 성장시킨 다음, OD 0.6에서 1 mM 이소프로필-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. IPTG 유도 2시간 후, 세포를 10분 동안 5,000 rpm에서 원심분리하여 수확하였다. 세포 용해 후 봉입체를 분리하고, 단백질을 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 2 mM EDTA, 6 M 구아니딘 HCl, 및 65 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol)을 함유하는 완충액에 용해하였다. 용해된 융합 분자를 0.1 M Tris, pH=7.4, 500 mM L-아르기닌, 0.9 mM GSSG, 2 mM EDTA의 존재 하에 다시 접었다. 다시 접힌 단백질을 Q 세파로오스 이온 교환 및 Superdex 200 겔 여과 크로마토그래피 (Amersham Biosciences, Inc., Sweden)로 정제하였다. 단백질의 순도는 SDS-PAGE 및 분석 HPLC (Agilent, Inc. Palo Alto, Calif.)로 평가하였다.

도 2는 IL-10 이량체화에 의해 움직이도록 되어 있는 재접힘(refolding) 이후의 예시적인 융합 분자, 예를 들어, Cholix ⁴¹⁵ -TEV-IL-10를 대표하는 리본 다이어그램이다. IL-10 이량체화는 자주색 콜릭스 ⁴¹⁵ /청색 hIL-10 및 오렌지색 콜릭스 ⁴¹⁵ /녹색 조직이 나타나는 것으로 예상된다.

콜릭스 ⁴¹⁵ -TEV-IL-10 및 콜릭스 ⁴¹⁵ -(G ₄ S) ₃ -IL-10는 이의 예상되는 분자 크기에 대한 적당한 접힘을 확인하기 위해 평가되었다. 유도 후, 발현된 단백질을 봉입체로부터 수집하였다. 봉입체에서 콜릭스 ⁴¹⁵ -TEV-IL-10 (겔에서 "C"로 표시됨) 발현 및 콜릭스 ⁴¹⁵ -(G ₄ S) ₃ -IL-10 (겔에서 "N"으로 표시됨) 발현의 정도는 각각 66380.78 및 65958.25 달톤의 계산된 질량과 비슷한 ~ 66 kDa의 겉보기 분자량을 나타낸다. 참조 도 3. TEV 링커 (Cs) 및 비-TEV 링커 (Ns)에 대한 봉입체 제거 후 상층액 매질에서 이러한 단백질의 결여는 키메라 유도의 정도 및 특이성을 설명하는 것으로 나타났다. SeeBlue® Plus2 Prestained MW 표준이 표시된다.

실시예 2

본 실시예는 손상되지 않은 상피를 횡단하여 생물학적 활성 화물을 운반하는 이의 능력과 관련하여 융합 분자의 적당한 접힘을 확인하는 in vitro 방법을 기재한다.

J774 마우스 대식세포주는 IL-10 반응형(responsive) 세포주로서 사용될 수 있다 (O'Farrell AM, et al., EMBO J, 17(4):1006-18, 1998). IL-10은 이의 최적의 활성에 필요한 이량체를 자연적으로 형성한다. E coli 에 의해 발현된 콜릭스 ⁴¹⁵ -(G ₄ S) ₃ -IL-10을 봉입체로부터 수집하고, 이황화 셔플 교환 완충 시스템(disulphide shuffle exchange buffer system)을 이용하여 접었다. 결과의 물질을 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피로 정제하여, 2개의 콜릭스 ⁴¹⁵ 분자에 결합된 IL-10 이량체의 예상 크기인, ~130 kDa의 단백질을 분리하였다 (이하 "이량체 콜릭스 ⁴¹⁵ -IL-10" 융합 분자). 상기 제제는 SDS PAGE에 기초하여 ~ 85-90%의 단백질 순도를 가졌다. J774.2 세포주의 배양물을 25nM 및 250 nM의 농도에서 이량체 콜릭스 ⁴¹⁵ -IL-10 융합 분자와 함께 48시간 동안 처리하였다. 처리되지 않은 일치된 세포와 비교하여, 이량체 Cholix ⁴¹⁵ -IL-10 융합 분자는 살아있는/죽은 세포의 유동 세포 계측법에 의해 평가된 바와 같이 세포 수의 용량-의존적 감소를 나타내었다. (참조 도 4). 값은 n=4 ± 표준편차를 나타낸다.

대안적으로, 기저측면 통과세포외배출의 정단에 사용된 세포 단층의 기저 구획에서 IL-10 반응형 세포를 공동-배양할 수 있다 (Rubas W, et al., Pharm Res. 13(1):23-6, 1996).

실시예 3

본 실시예에서, 이량체 콜릭스 ⁴¹⁵ -(G ₄ S) ₃ -IL-10 융합 분자는 in vitro 에서 Caco-2 세포 단층의 장벽 특성에 대한 효과를 평가하였다. 기저측면 구획으로부터의 배지와 함께 Caco-2 세포 (인간 대장암 유래 세포주)를 몇시간 동안 주기적으로 샘플링하였다 (Rubas W, et al., J Pharm Sci., 85(2):165-9, 1996). Caco-2 (ATCC HTB-37™) 세포를 완전 배지: 10% 소태아혈청, 2.5 mM 글루타민, 100 U의 페니실린/ml, 및 100 ㎍의 스트렙토마이신/ml로 보충된 둘베코스 변형된 이글스 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium F12, DMEM F12) (Gibco BRL, Grand Island, NY)에서 37℃, 5% CO ₂ 에서 유지시켰다. 세포를 2~3일 마다 이 배지 (완전 배지로 명명됨)로 공급하고, 5~7일 마다 계대배양하였다. 분석을 위해, 세포를 24-웰 플레이트 또는 96-웰 플레이트에 씨딩하고 합류(confluence)로 성장시켰다.

본 연구에 사용된 확립된 Caco-2 단층은 chopstick Millicell-ERS® 전압계 (Millipore)를 이용하여 측정된 ~ 450-600 Ω·㎠ (평균 579 Ω·㎠)의 TER (transepithelial electrical resistance) 값을 가졌다. 형광물질(Fluorescein)-표지된 70 kDa 덱스트란 및 다양한 농도 (4.7 nM, 23.6 nM 및 236 nM)의 이량체 콜릭스 ⁴¹⁵ -(G ₄ S) ₃ -IL-10 융합 분자를 이들 단층의 정단 표면(apical surface)에 가하고, 기저 구획에서 검출된 형광의 누적량을 교체로 150 μL 부피를 모아 시간 경과에 따라 관찰하였다. 도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 여과기 지지체 상에 Caco-2 세포가 없는 경우, 덱스트란은 빠르게 정단에서 기저 구획으로 이동하였다. 비교하면, 70 kDa 덱스트란 수송 정도는 Caco-2 단층을 통해 훨씬 적었고, 다양한 이량체 콜릭스 ⁴¹⁵ -IL-10 융합 분자는 이들 Caco-2 단층을 통해 70 kDa 덱스트란 수송 정도에 대해 임의의 용량-의존적 효과를 나타내지 않았으며 이량체 콜릭스 ⁴¹⁵ -IL-10 융합 분자에 노출되지 않은 Caco-2 단층으로 얻어진 결과와 현저히 다르지 않았다. 이량체 콜릭스 ⁴¹⁵ -(G ₄ S) ₃ -IL-10 융합 분자는 in vitro 에서 Caco-2 세포 단층의 장벽 특성에 명백하게 영향을 미치지 않는다.

실시예 4

본 실시예에서, ELISA 분석법을 수행하여 이량체 콜릭스 ⁴¹⁵ -(G ₄ S) ₃ -IL-10 융합 분자가 Caco-2 세포 단층을 횡단하여 이동하려는 능력을 평가한다. A549 (ATCC CCL-185™), L929 (ATCC CRL-2148™), 및 Caco-2 (ATCC HTB-37™) 세포를 완전 배지: 10% 소태아혈청, 2.5 mM 글루타민, 100 U의 페니실린/ml, 및 100 ㎍의 스트렙토마이신/ml로 보충된 둘베코스 변형된 이글스 배지 (DMEM F12) (Gibco BRL, Grand Island, NY)에서 37℃, 5% CO ₂ 에서 유지시켰다. 세포를 2~3일 마다 이 배지 (완전 배지로 명명됨)로 공급하고, 5~7일 마다 계대배양하였다. 분석을 위해, 세포를 24-웰 플레이트 또는 96-웰 플레이트에 씨딩하고 합류(confluence)로 성장시켰다.

Caco-2 세포를 콜라겐-코팅된 0.4-μm 기공 크기의 폴리카보네이트 막 트랜스웰 지지체 (Corning-Costar, Cambridge, MA) 상에 합류 단층으로 성장시키고, chopstick Millicell-ERS® 전압계 (Millipore)를 이용하여 측정된 >250 Ω·㎠의 TER(transepithelial electrical resistance)을 달성한 후 18-25일 동안 사용한다. 이 단층을 통해 이량체 Cholix ⁴¹⁵ -(G ₄ S) ₃ -IL-10 융합 분자의 정단에서 기저측면 (A→B) 수송은, 37℃에서 4.7 nM, 23.6 nM 및 236 nM 적용 4시간 후 수송된 단백질의 양을 측정하여 결정된다. TER 측정 및 10 kDa 형광 덱스트란 (HPLC 크기 배제 프로토콜을 이용하여 측정됨)의 정도는 연구 과정 동안 단층 장벽 특성을 확인하는데 사용된다. 콜릭스 수송 정도는 세포-기반 세포독성 분석법에서 수집된 배지의 적정에 의해 결정된다. 수송된 이량체 콜릭스 ⁴¹⁵ -(G ₄ S) ₃ -IL-10 융합 분자는 포획용 항-IL-10 항체 및 검출용 콜릭스에 대한 다클론 혈청을 이용하여 ELISA(enzyme linked immunosorbant assay)로 측정된다. 도 7 (A 및 B)에 나타난 바와 같이, 이량체 콜릭스 ⁴¹⁵ -(G ₄ S) ₃ -IL-10 융합 분자는 Caco-2 세포 단층을 횡단하여 이동한다.

실시예 5

본 실시예에서, 절단형 서열이 결여된 비-자연적으로 발생하는 융합 분자의 제조를 기재한다. 이러한 융합 분자는 점막하/GI 공간을 특이적으로 표적하고 그 공간에 생물학적 활성 화물의 작용을 제한하도록 설계된다.

비-독성 돌연변이체 형태의 콜릭스 독소인, 콜릭스 독소 △E581 (서열번호: 81)을 인코딩하는 플라스미드 구조체를 제조한다. 단백질 발현은 적당한 플라스미드로 열-쇼크 (42℃에서 1분)에 의해 형질전환 후 E. coli DH5α 세포 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 달성된다. 항생제-함유 배지에서 선택된 형질전환된 세포를 루리아-베르타니 브로스(Luria-Bertani broth) (Difco)에서 분리 및 성장시킨다. 1 mM 이소프로필-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도한다. IPTG 유도 2시간 후, 세포를 4℃에서 10분 동안 5,000 x g 에서 원심분리하여 수확한다. 세포 용해 후 봉입체를 분리하고, 단백질을 6 M 구아니딘 HCl 및 2 mM EDTA (pH 8.0) + 65 mM 디티오트레이톨에서 용해시킨다. 재접힘 및 정제 후, 단백질을 -80℃에서 Ca ^{2 +} 및 Mg ^{2 +} 가 없는 PBS (pH 7.4)에서 ~5 ml/ml로 저장한다. 본 연구에서 사용된 모든 단백질은 크기 배제 크로마토그래피를 기반으로 하여 >90% 순도임을 확인하였다.

콜릭스 독소 △E581 단백질은 이의 C-말단에서 변형되어 단백질의 C-말단 근처에 위치한 유리 설프히드릴 잔기를 통해 직접 화학 결합이 가능하다. C-말단 변형은 담배 에칭 바이러스(TEV)의 고도의 선택적인 프로테아제에 대한 공통 절단 서열을 숨겨주는(harboring) 시스테인-구속 루프, 제 2 시스테인, 및 헥사-히스티딘 (His ₆ ) 태그를 포함한다. 제 2 Cys은 궁극적으로 결합에 사용되는 Cys와 함께 이황화 다리를 형성하기 위해 포함된다. 단백질에 His ₆ 서열을 가하는 것은 정제를 단순화하고, TEV 절단 서열은 약한 환원(mild reduction) 후에 말단의 Cys 잔기를 선택적으로 제거하는 메커니즘을 제공한다. nt콜릭스 구조체의 발현 및 분리 후에 0.1 mM 디티오테이톨로 TEV 절단 및 약한 환원은, 화물 결합의 일반적인 메커니즘으로서 말레이미드-기반 반응을 통한 생물학적 활성 화물의 직접적인 화학 결합을 허용한다. TEV 프로테아제 절단, 환원, 및 유리 설프히드릴과의 말레이미드 반응을 통한 화물 결합 후에, 유리된 C-말단 서열의 제거는 제 2 Ni ²⁺ 컬럼 크로마토그래피 단계에 의해 달성되었다.

실시예 6

콜릭스 독소 △E581-화물의 트랜스-상피 수송은 in vitro 에서 Caco-2 단층을 이용하여 평가된다. Caco-2 세포 (계대배양 횟수 25-35)는 상기 기재된 바와 같이 합류 단층으로 성장된다; Rubas, W. et al., Pharm Res, 10:113-118 (1993). 간단하게, 세포를 5% CO ₂ 및 90% 습도의 환경에서 2 mM L-글루타민, 10% 소태아혈청, 및 100 유닛의 페니실린/스트렙토마이신이 풍부한 DMEM/고성장 배지 내에서 37℃로 유지시킨다. 세포를 75cm ² 플라스크에서 1:3의 분할비(split ratio)로 매주 계대배양시키고, 63,000 세포/cm ² 의 밀도로 Corning Costar (Cambridge, MA)의 미리습윤되고 (prewetted) 콜라겐-코팅된 투과성 (0.4-μm 기공 크기) 폴리카보네이트 (Transwell ^TM ) 여과기 지지체 상에 씨딩한다. 성장 배지를 이틀에 한번 교체한다. 전압-저항계(volt-ohm-meter) (World Precision Instruments, Sarasota, FL)를 이용하여 상당한 TEER(trans-epithelial resistance) 측정의 획득에 의해 결정된 합류 단층은, 씨딩 후 20-26일 동안 사용된다.

트랜스-상피 수송 유속은 Caco-2 세포의 편광 단층을 이용하여 정단 (Ap)에서 기저측면 (Bl)으로 및 Bl에서 Ap 방향으로 in vitro 에서 측정하여, 각각 점막 (mucosal)에서 장막(serosal)으로 및 장막에서 점막으로의 유출 결과를 기재한다. 수송 연구를 시작하기 직전에, 각 여과기의 TEER(transepithelial resistance)이 측정된다: <200 Ω·㎠의 단층 TEER 값은 연구에서 제외하였다. 포함된 단층으로부터 Ap 및 Bl 배지를 제거하고, 이들 표면을 인산염 완충 식염수 (PBS)로 1회 세척한다. 그 다음, 한 세트의 단층은 10㎍ 콜릭스 독소 △E581-화물과 10㎍ TRITC-덱스트란 또는 10㎍ BSA-화물과 10㎍ TRITC-덱스트란을 함유하는 100㎕ PBS의 Ap (공여자) 적용을 받는다. 그 다음, 수여자 (B1) 구획은 500 μL PBS를 받아 수송 연구에 대한 T ₀ 를 설정한다. 공여자 및 수여자 구획 모두 37℃에서 4시간의 배양 후 샘플링하여, 각각 단층을 횡단하여 수송된 물질의 양과 정단 표면에 보유된 양을 결정한다.

실시예 7

본 실시예는 E. coli 에서 IL-10 폴리펩티드의 C-말단에서 직접 융합된 서열번호: 1의 아미노산 1-415를 인코딩하는 서열을 포함하는 변형된 콜릭스 독소를 포함하는 융합 분자 ("콜릭스 ⁴¹⁵ -IL-10 융합 분자"라고 함)의 제조 및 발현을 기재하고 있다. 단백질 발현은 적당한 플라스미드로 열-쇼크 (42℃에서 1분)에 의해 형질전환 후 E. coli DH5α 세포 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 달성된다. 항생제-함유 배지에서 선택된 형질전환된 세포를 루리아-베르타니 브로스(Luria-Bertani broth) (Difco)에서 분리 및 성장시킨다. 1 mM 이소프로필-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도한다. IPTG 유도 2시간 후, 세포를 4℃에서 10분 동안 5,000 x g 에서 원심분리하여 수확한다. 세포 용해 후 봉입체를 분리하고, 단백질을 6 M 구아니딘 HCl 및 2 mM EDTA (pH 8.0) + 65 mM 디티오트레이톨에서 용해시킨다. 재접힘 및 정제 후, 단백질을 -80℃에서 Ca ^{2 +} 및 Mg ^{2 +} 가 없는 PBS (pH 7.4)에서 ~5 ml/ml로 저장한다. 본 연구에서 사용된 모든 단백질은 크기 배제 크로마토그래피를 기반으로 하여 >90% 순도임을 확인하였다.

468/508 nm의 여기/방출 특성을 갖는 공유 결합된 적색 형광 염료를 함유하고 알데히드 표면 작용기를 갖는 폴리스티렌 비드 (10 nm 직경) (XPR-582)는 Duke Scientific (Palo Alto, CA)으로부터 얻어진다. 100㎕의 XPR-582 비드 (2% 고형분)는 최종 부피 200㎕의 중성(pH 7.0) 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 대략 2.5 nmoles IL-10 또는 콜릭스 ⁴¹⁵ -IL-10 융합 분자와 혼합한다. 실온에서 2시간 동안 부드럽게 흔든 후, 20㎕의 PBS 내 2 mg/ml의 소혈청 알부민 용액 (BSA; Sigma, 미국 미주리 주 세인트루이스)을 첨가한다. 그 다음, 제제를 PBS로 3회 희석 및 Millipore (Bedford, MA)의 100,000 분획분자량 마이크로콘 여과 장치(Microcon filter device)를 이용한 농축으로 투석한다. 코팅된 비드의 최종 제제는 1% 고형분이었다.

실시예 8

본 실시예에서, 서열번호: 52의 변형된 콜릭스 독소 서열 (콜릭스 ⁴¹⁵ ), 절단형 링커 서열 (서열번호: 121) 또는 비-절단형 링커 서열 (서열번호: 98), 및 TNFSF 저해제인 생물학적 활성 화물을 포함하는 비-자연적으로 발생하는 분리된 융합 분자는 실시예 1에 기재된 대로 제조되고, 적당한 접힘, 적당한 크기를 확인하기 위해 상기 실시예들에 기재된 바와 같이 평가된다.

6개의 예시적인 융합 분자 발현 벡터 (각 링커에 대해 3개)를 제조하여, 1) 서열번호: 88 및 89의 중쇄가변영역 서열 및 경쇄가변영역 서열을 포함하는 항체인 TNF 저해제; 2) 서열번호: 90 및 91의 중쇄가변영역 서열 및 경쇄가변영역 서열을 포함하는 항체인 TNF 저해제; 및 3) 서열번호: 92의 서열을 포함하는 IgG의 Fc 부분을 갖는 이량체의 가용성 인간 TNFR-p75인 TNFSF 저해제로부터 선택된 TNFSF 저해제를 상피 세포를 횡단하여 정단에서 기저로 수송하려는 융합 분자의 능력을 시험하였다.

실시예 9

본 실시예에서, 서열번호: 52의 변형된 콜릭스 독소 서열 (콜릭스 ⁴¹⁵ ), 절단형 링커 서열 (서열번호: 121) 또는 비-절단형 링커 서열 (서열번호: 98), 및 포도당-저하제인 생물학적 활성 화물을 포함하는 비-자연적으로 발생하는 분리된 융합 분자는 실시예 1에 기재된 대로 제조되고, 적당한 접힘, 적당한 크기를 확인하기 위해 상기 실시예들에 기재된 바와 같이 평가된다.

4개의 예시적인 융합 분자 발현 벡터 (각 링커에 대해 2개)를 제조하여, 1) 서열번호: 93의 서열을 포함하는 GLP-1 작용제; 및 2) 서열번호: 94의 서열을 포함하는 GLP-1 작용제로부터 선택된 포도당-저하제를 상피 세포를 횡단하여 정단에서 기저로 수송하려는 융합 분자의 능력을 시험하였다.

실시예 10

본 실시예에서, 서열번호: 52의 변형된 콜릭스 독소 서열 (콜릭스 ⁴¹⁵ ), 절단형 링커 서열 (서열번호: 121) 또는 비-절단형 링커 서열 (서열번호: 98), 및 인간 성장 호르몬인 생물학적 활성 화물을 포함하는 비-자연적으로 발생하는 분리된 융합 분자는 실시예 1에 기재된 대로 제조되고, 적당한 접힘, 적당한 크기를 확인하기 위해 상기 실시예들에 기재된 바와 같이 평가된다.

2개의 예시적인 융합 분자 발현 벡터 (각 링커에 대해 1개)를 제조하여, 서열번호: 95의 서열을 포함하는 인간 성장 호르몬을 상피 세포를 횡단하여 정단에서 기저로 수송하려는 융합 분자의 능력을 시험하였다.

실시예 11

본 실시예는 조직에서 실시예 1에서 제조된 융합 분자의 대표적인 생물학적 활성 화물의 조직학적 검출을 기재한다. 융합 분자의 투여 후, 동물을 CO ₂ 로 질식시켜 안락사시키고, 심장천자로 채혈한다. 특정 조직 (림프절, 기도(trachea), 뇌, 비장 간, 위장관)을 제거하고, PBS로 간단히 씻어 잔류 혈액을 제거한 다음, OCT에서 동결시킨다. 절편 (5 마이크론 두께)을 슬라이드 위에 놓는다. 슬라이드를 10분 동안 아세톤에 고정시키고 PBS로 헹군다. 슬라이드를 3% 퍼옥시다제와 함께 5분 동안 배양한다. 그 다음, 슬라이드를 단백질로 5분 더 차단한다. 일차 항체 대 각 생물학적 활성 화물을 1:100 희석하여 30분 동안 슬라이드 위에서 배양한 다음 PBS로 세척한다. 그 다음, 비오틴-표지된 이차 항체를 약 15분 동안 배양한 다음 PBS로 세척한다. 스트렙타비딘 HRP 표지를 15분 동안 슬라이드 위에서 배양한 다음 PBS로 세척한다. HRP 크로마겐(Chromagen)을 5분 동안 적용한 다음 증류된 H ₂ 0로 여러 번 헹군다. 마지막으로, 슬라이드를 헤마톡실린으로 1분 동안 대조염색하고, 덮개를 벗긴 다음, 생물학적 활성 화물의 존재를 검사한다.

본 발명의 융합 분자는 피험자에게 거대분자의 국소 또는 전신 전달을 위한 통상적인 기술에 비해 몇 가지 이점을 제공한다. 이러한 장점들 중 가장 중요한 것은 주사 바늘을 사용하지 않고 피험자의 피부에 구멍을 내어 생물학적 활성 화물을 피험자에게 전달하는 능력이다. 많은 피험자들은 거대분자의 반복적이고 규칙적인 투여를 필요로 한다. 예를 들어, 당뇨병 환자는 혈당 농도를 조절하기 위해 하루에 여러 번 인슐린을 주입해야 한다. 이러한 피험자의 삶의 질은, 만일 거대분자의 전달이 통증 또는 이와 관련된 잠재적인 합병증을 피함으로써 주입 없이 달성될 수 있다면, 크게 개선될 것이다.

또한, 상피 세포의 기저측면 막에 존재하는 효소에 의해 절단되는 링커가 있는 융합 분자의 나머지에 생물학적 활성 화물의 결합은, 생물학적 활성 화물이 융합 분자로부터 유리되고 상피막을 횡단하여 통과세포외배출 직후 융합 분자의 나머지로부터 방출되게 하는 것을 가능하게 한다. 이러한 유리는 생물학적 활성 화물에 대한 면역 반응의 유도 가능성을 감소시킨다. 또한, 생물학적 활성 화물이 융합 분자의 나머지에서 없는 이의 표적과 상호 작용할 수 있다.

또한, 절단형 링커가 결여된 비-자연적으로 발생하는 융합 분자는 (그러나 상당히 적은 양의) 생물학적 활성 화물의 수용체도 발현하는 면역 세포의 표면에서 이의 수용체(들)에 의한 변형된 콜릭스 독소의 앵커링 효과가 표적 세포의 표면에서 생물학적 활성 화물을 더 많이 노출시킬 수 있고, 이의 수용체에 콜릭스의 결합 및 IL-10R에 IL-10의 결합을 통해 상승 효과를 제공할 수 있다는 점에서 유리할 수 있다.

또한, 일단 위장관 상피를 횡단하여 수송되면, 본 발명의 융합 분자는 혈청에서 연장된 반감기를 나타낼 것이다, 즉, 융합 분자의 생물학적 활성 화물은 이의 비-융합된 상태의 생물학적 활성 화물에 비해 연장된 혈청 반감기를 나타낼 것이고, 융합 분자의 경구 투여는 피험자의 혈장 내에서 관찰되는 것보다 더 높은 유효 농도의 전달된 생물학적 활성 화물을 피험자의 간으로 전달할 수 있다.

또한, 융합 분자의 실시예는 재조합 시스템에서 구축되고 발현될 수 있다. 재조합 기술은 임의의 적당한 생물학적 활성 화물의 도입을 위해 설계된 삽입 부위를 갖는 융합 분자를 제조할 수 있게 한다. 이러한 삽입 부위는 새로운 생물학적 활성 화물의 전달을 위해 당업자가 융합 분자를 신속하고 용이하게 생성할 수 있게 하며, 그렇게 해야할 필요가 있다.

본 명세서에 개시되고 청구된 모든 물품 및 방법은 본 발명의 관점에서 과도한 실험 없이 제조되고 수행될 수 있다. 본 발명의 물품 및 방법이 실시예에 의하여 기재되었지만, 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않고 물품 및 방법에 변화를 적용할 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이러한 모든 변화 및 균등물은, 현재 존재하든 또는 나중에 개발되든, 첨부된 청구항에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 정신 및 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 명세서에 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자의 수준을 나타낸다. 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 모든 목적을 위해, 그리고 마치 각 개개의 간행물이 임의의 및 모든 목적을 위해 전체 참조로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 나타낸 것과 동일한 정도로, 본 명세서에 전체 참조로 통합된다. 본 명세서에 예시적으로 기재된 발명은 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소(들)의 부재 시에 적절하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 명세서의 각 예에서, "포함하는", "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진"이라는 용어들 중 어느 하나는 두 개의 용어들 중 어느 하나로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 설명의 용어로서 사용되는 것이지 제한을 위한 것이 아니며, 나타내고 기재된 구성 또는 이의 일부의 임의의 등가물을 배제하는 이러한 용어 및 표현의 사용에 있어서 의도는 없지만, 청구된 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것이 인정된다. 따라서, 본 발명이 실시예들 및 선택적 특징들에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본 명세서에 개시된 개념들의 변형 및 변화가 당업자에 의해 의지될 수 있고, 이러한 변형 및 변화는 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다는 것을 이해하여야 한다.

서열목록

수반되는 서열목록에 열거된 아미노산 서열은 37 CFR 1.822에 정의된 바와 같이 아미노산에 대한 표준 3 문자 코드를 사용하여 나타낸다.

서열번호: 1은 성숙 비브리오 콜레라( Vibrio cholera ) 콜릭스 독소의 634 아미노산 서열이다.

서열번호: 2는 성숙 비브리오 콜레라( V. cholera ) 콜릭스 독소의 634 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열이다.

서열번호: 3-80은 서열번호: 1에 제시된 성숙 콜릭스 독소에서 유래된 다양한 절단된 콜릭스 독소의 아미노산 서열이다.

서열번호: 81은 서열번호: 1의 아미노산 잔기 E581이 결실된 돌연변이된 콜릭스 독소의 아미노산 서열이다.

서열번호: 82는 인간 인터루킨-10 (IL-10)의 아미노산 서열이다.

서열번호: 83은 인간 인터루킨-19 (IL-19)의 아미노산 서열이다.

서열번호: 84는 인간 인터루킨-20 (IL-20)의 아미노산 서열이다.

서열번호: 85는 인간 인터루킨-22 (IL-22)의 아미노산 서열이다.

서열번호: 86은 인간 인터루킨-24 (IL-24)의 아미노산 서열이다.

서열번호: 87은 인간 인터루킨-26 (IL-26)의 아미노산 서열이다.

서열번호: 88 - 항-TNF-알파 항체의 중쇄가변영역 서열.

서열번호: 89 - 항-TNF-알파 항체의 경쇄가변영역 서열.

서열번호: 90 - 항-TNF-알파 항체의 중쇄가변영역 서열.

서열번호: 91 - 항-TNF-알파 항체의 경쇄가변영역 서열.

서열번호: 92 - 인간 TNFR-p75-Fc 이량체 융합 단백질의 아미노산 서열.

서열번호: 93 - GLP-1 작용제 펩티드 아미노산 서열 (엑세나티드).

서열번호: 94 - GLP-1 작용제 펩티드 아미노산 서열 (리라글루티드).

서열번호: 95 - 인간 성장 호르몬의 아미노산 서열 (소마토트로핀).

서열번호: 96-121은 다양한 펩티드 링커의 아미노산 서열이다.

서열번호: 122는 콜릭스 ⁴¹⁵ -TEV-IL-10 융합 분자의 아미노산 서열이다.

서열번호: 123은 콜릭스 ⁴¹⁵ -(G ₄ S) ₃ -IL-10 융합 분자의 아미노산 서열이다.

서열목록

서열번호: 1 - 성숙 비브리오 콜레라( Vibrio cholera ) 콜릭스 독소 아미노산 서열

서열번호: 2 - 성숙 비브리오 콜레라( V. cholera ) 콜릭스 독소를 인코딩하는 핵산 서열

서열번호: 3 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁸⁶

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQA

서열번호: 4 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁸⁵

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서열번호: 5 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁸⁴

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서열번호: 6 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁸³

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서열번호: 7 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁸²

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서열번호: 8 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁸¹

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서열번호: 9 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁸⁰

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서열번호: 10 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁷⁹

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서열번호: 11 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁷⁸

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서열번호: 12 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁷⁷

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTP

서열번호: 13 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁷⁶

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLT

서열번호: 14 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁷⁵

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGL

서열번호: 15 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁷⁴

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서열번호: 16 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁷³

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서열번호: 17 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁷²

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHH

서열번호: 18 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁷¹

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTH

서열번호: 19 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁷⁰

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서열번호: 20 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁶⁹

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYV

서열번호: 21 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁶⁸

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDY

서열번호: 22 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁶⁷

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYND

서열번호: 23 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁶⁶

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYN

서열번호: 24 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁶⁵

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIY

서열번호: 25 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁶⁴

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI

서열번호: 26 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁶³

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQ

서열번호: 27 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁶²

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVAR

서열번호: 28 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁶¹

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVA

서열번호: 29 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁶⁰

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTV

서열번호: 30 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁵⁹

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLT

서열번호: 31 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁵⁸

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVL

서열번호: 32 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁵⁷

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQV

서열번호: 33 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁵⁶

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQ

서열번호: 34 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁵⁵

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVT

서열번호: 35 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁵⁴

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMV

서열번호: 36 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁵³

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGM

서열번호: 37 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁵²

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPG

서열번호: 38 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁵¹

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNP

서열번호: 39 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁵⁰

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENN

서열번호: 40 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁴⁹

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINEN

서열번호: 41 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁴⁸

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINE

서열번호: 42 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴²⁵

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPEN

서열번호: 43 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴²⁴

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPE

서열번호: 44 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴²³

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLP

서열번호: 45 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴²²

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYL

서열번호: 46 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴²¹

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSY

서열번호: 47 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴²⁰

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRS

서열번호: 48 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴¹⁹

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGR

서열번호: 49 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴¹⁸

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSG

서열번호: 50 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴¹⁷

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRS

서열번호: 51 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴¹⁶

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESR

서열번호: 52 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴¹⁵

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIES

서열번호: 53 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴¹⁴

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIE

서열번호: 54 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴¹³

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINI

서열번호: 55 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴¹²

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANIN

서열번호: 56 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴¹¹

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANI

서열번호: 57 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴¹⁰

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQAN

서열번호: 58 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴⁰⁹

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQA

서열번호: 59 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴⁰⁸

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQ

서열번호: 60 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴⁰⁷

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNND

서열번호: 61 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴⁰⁶

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNN

서열번호: 62 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴⁰⁵

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASN

서열번호: 63 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴⁰⁴

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVAS

서열번호: 64 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴⁰³

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVA

서열번호: 65 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴⁰²

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCV

서열번호: 66 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴⁰¹

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSC

서열번호: 67 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ⁴⁰⁰

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKS

서열번호: 68 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁹⁹

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADK

서열번호: 69 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁹⁸

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDAD

서열번호: 70 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁹⁷

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDA

서열번호: 71 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁹⁶

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPD

서열번호: 72 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁹⁵

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP

서열번호: 73 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁹⁴

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFC

서열번호: 74 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁹³

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLF

서열번호: 75 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁹²

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSL

서열번호: 76 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁹¹

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILS

서열번호: 77 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁹⁰

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADIL

서열번호: 78 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁸⁹

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADI

서열번호: 79 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁸⁸

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAAD

서열번호: 80 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 ³⁸⁷

VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAA

서열번호: 81 - 변형된 비브리오 콜레라 콜릭스 독소 아미노산 서열 콜릭스 △581

서열번호: 82 - 인간 인터루킨-10 아미노산 서열

MHSSALLCCLVLLTGVRASPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN

서열번호: 83 - 인간 인터루킨-19 아미노산 서열

MKLQCVSLWLLGTILILCSVDNHGLRRCLISTDMHHIEESFQEIKRAIQAKDTFPNVTILSTLETLQIIKPLDVCCVTKNLLAFYVDRVFKDHQEPNPKILRKISSIANSFLYMQKTLRQCQEQRQCHCRQEATNATRVIHDNYDQLEVHAAAIKSLGELDVFLAWINKNHEVMSSA

서열번호: 84 - 인간 인터루킨-20 아미노산 서열

MKASSLAFSLLSAAFYLLWTPSTGLKTLNLGSCVIATNLQEIRNGFSEIRGSVQAKDGNIDIRILRRTESLQDTKPANRCCLLRHLLRLYLDRVFKNYQTPDHYTLRKISSLANSFLTIKKDLRLCHAHMTCHCGEEAMKKYSQILSHFEKLEPQAAVVKALGELDILLQWMEETE

서열번호: 85 - 인간 인터루킨-22 아미노산 서열

MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAAAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI

서열번호: 86 - 인간 인터루킨-24 아미노산 서열

MNFQQRLQSLWTLASRPFCPPLLATASQMQMVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL

서열번호: 87 - 인간 인터루킨-26 아미노산 서열

MLVNFILRCGLLLVTLSLAIAKHKQSSFTKSCYPRGTLSQAVDALYIKAAWLKATIPEDRIKNIRLLKKKTKKQFMKNCQFQEQLLSFFMEDVFGQLQLQGCKKIRFVEDFHSLRQKLSHCISCASSAREMKSITRMKRIFYRIGNKGIYKAISELDILLSWIKKLLESSQ

서열번호: 88 - 항-TNF-알파 항체의 중쇄가변영역 서열

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVERGFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC

서열번호: 89 - 항-TNF-알파 항체의 경쇄가변영역 서열

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

서열번호: 90 - 항-TNF-알파 항체의 중쇄가변영역 서열

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAIISFDGSNKSSADSVKGRFTYSRRNSKNALFLQMNSLRAEDTAVFYCARDRGVSAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSS

서열번호: 91 - 항-TNF-알파 항체의 경쇄가변영역 서열

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTRFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIL

서열번호: 92 - 인간 TNFR-p75-Fc 이량체 융합 단백질의 아미노산 서열

LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호: 93 - GLP-1 작용제 펩티드 아미노산 서열 (엑세나티드)

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS

서열번호: 94 - GLP-1 작용제 펩티드 아미노산 서열 (리라글루티드)

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEEFIIAWLVKGRG

서열번호: 95 - 인간 성장 호르몬의 아미노산 서열 (소마토트로핀)

FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF

서열번호: 96 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

GGGGS

서열번호: 97 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

GGGGSGGGGS

서열번호: 98 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

GGGGSGGGGSGGGGS

서열번호: 99 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

GGGGSGGG

서열번호: 100 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

AAPF

서열번호: 101 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

GGF

서열번호: 102 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

AAPV

서열번호: 103 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

GGL

서열번호: 104 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

AAL

서열번호: 105 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

FVR

서열번호: 106 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

VGR

서열번호: 107 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

RKPR

서열번호: 108 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

YVAD Xaa Xaa = 임의의 아미노산

서열번호: 109 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

D Xaa Xaa D Xaa Xaa = 임의의 아미노산

서열번호: 110 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

R (Xaa) _n R Xaa Xaa = 임의의 아미노산 n = 0, 2, 4 또는 6

서열번호: 111 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

K (Xaa) _n R Xaa Xaa = 임의의 아미노산 n = 0, 2, 4 또는 6

서열번호: 112 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

ERTKR Xaa Xaa = 임의의 아미노산

서열번호: 113 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

RVRR Xaa Xaa = 임의의 아미노산

서열번호: 114 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

Decanoyl-R VRR Xaa Xaa = 임의의 아미노산

서열번호: 115 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

P Xaa WVP Xaa Xaa = 임의의 아미노산

서열번호: 116 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

WVA Xaa Xaa = 임의의 아미노산

서열번호: 117 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

Xaa F Xaa Xaa Xaa = 임의의 아미노산

서열번호: 118 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

Xaa Y Xaa Xaa Xaa = 임의의 아미노산 n = 0, 2, 4 또는 6

서열번호: 119 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

Xaa W Xaa Xaa Xaa = 임의의 아미노산 n = 0, 2, 4 또는 6

서열번호: 120 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

(V, A 또는 P)-Y-(S, P 또는 A)와 조합한 DRWIPFHLL

서열번호: 121 - 펩티드 링커의 아미노산 서열

GGGGSGGGENLYFQS

서열번호: 122 - 콜릭스 ⁴¹⁵ -TEV-IL-10 융합 분자의 아미노산 서열

서열번호: 123 - 콜릭스 ⁴¹⁵ -(G ₄ S) ₃ -IL-10 융합 분자의 아미노산 서열

MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPGDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDITTENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSPASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYNAQQIVSLFLATRILFTHIDSIFTLNLDGQEPEVAERLDDLRRINENNPGMVIQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNSDQANINIESGGGGSGGGGSGGGGSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN

SEQUENCE LISTING <110> APPLIED MOLECULAR TRANSPORT LLC <120> CHOLIX TOXIN-DERIVED FUSION MOLECULES FOR ORAL DELIVERY OF BIOLOGICALLY ACTIVE CARGO <130> CACAM1.0002WO <160> 123 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 634 <212> PRT <213> Vibreo cholerae <400> 1 Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser 1 5 10 15 Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro 20 25 30 Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile 35 40 45 Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile 50 55 60 Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val 65 70 75 80 Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu 85 90 95 Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala 100 105 110 Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys 115 120 125 Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro 130 135 140 Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys 145 1 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cag aaagagggtt cacgccataa gcgttgggct 600 cattggcata caggcttagc actgtgttgg cttgtgccaa tggatgctat ctataactat 660 atcacccagc aaaattgtac tttaggggat aattggtttg gtggctctta tgagactgtt 720 gcaggcactc cgaaggtgat tacggttaag caagggattg aacaaaagcc agttgagcag 780 cgcatccatt tctccaaggg gaatgcgatg agcgcacttg ctgctcatcg cgtctgtggt 840 gtgccattag aaactttggc gcgcagtcgc aaacctcgtg atctgacgga tgatttatca 900 tgtgcctatc aagcgcagaa tatcgtgagt ttatttgtcg cgacgcgtat cctgttctct 960 catctggata gcgtatttac tctgaatctt gacgaacaag aaccagaggt ggctgaacgt 1020 ctaagtgatc ttcgccgtat caatgaaaat aacccgggca tggttacaca ggttttaacc 1080 gttgctcgtc agatctataa cgattatgtc actcaccatc cgggcttaac tcctgagcaa 1140 accagtgcgg gtgcacaagc tgccgatatc ctctctttat tttgcccaga tgctgataag 1200 tcttgtgtgg cttcaaacaa cgatcaagcc aatatcaaca tcgagtctcg ttctggccgt 1260 tcatatttgc ctgaaaaccg tgcggtaatc acccctcaag gcgtcacaaa ttggacttac 1320 caggaactcg aagcaacaca tcaagctctg actcgtgagg gttatgtgtt cgtgggttac 1380 catggtacga atcatgtcgc tgcgcaaacc atcgtgaat c gcattgcccc tgttccgcgc 1440 ggcaacaaca ctgaaaacga ggaaaagtgg ggcgggttat atgttgcaac tcacgctgaa 1500 gttgcccatg gttatgctcg catcaaagaa gggacagggg agtatggcct tccgacccgt 1560 gctgagcgcg acgctcgtgg ggtaatgctg cgcgtgtata tccctcgtgc ttcattagaa 1620 cgtttttatc gcacgaatac acctttggaa aatgctgagg agcatatcac gcaagtgatt 1680 ggtcattctt tgccattacg caatgaagca tttactggtc cagaaagtgc gggcggggaa 1740 gacgaaactg tcattggctg ggatatggcg attcatgcag ttgcgatccc ttcgactatc 1800 ccagggaacg cttacgaaga attggcgatt gatgaggagg ctgttgcaaa agagcaatcg 1860 attagcacaa aaccacctta taaagagcgc aaagatgaac ttaag 1905 <210> 3 <211> 386 <212> PRT <213> Vibreo cholerae <400> 3 Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser 1 5 10 15 Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro 20 25 30 Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile 35 40 45 Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile 50 55 60 Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val 65 7 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breo cholerae <400> 75 Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser 1 5 10 15 Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro 20 25 30 Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile 35 40 45 Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile 50 55 60 Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val 65 70 75 80 Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu 85 90 95 Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala 100 105 110 Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys 115 120 125 Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro 130 135 140 Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys 145 150 155 160 Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile 165 170 175 Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly 180 185 190 Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys 195 200 205 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