用于向受试者的气道施用酶的组合物和方法 |
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| 申请号 | CN201480060878.2 | 申请日 | 2014-11-04 | 公开(公告)号 | CN105764488A | 公开(公告)日 | 2016-07-13 |
| 申请人 | 得克萨斯州大学系统董事会; | 发明人 | R·O·威廉姆斯三世; S·艾德尔; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供用于向受试者的气道递送酶的方法和组合物。在一些方面，提供诸如纤溶酶原活化剂的酶的雾化组合物。在其他方面，提供包含酶的全氟化 碳 组合物，诸如纤溶酶原活化剂。在一些方面，组合物可以用于 治疗 肺 部感染或急性肺损伤，诸如吸入烟雾诱导型急性肺损伤(ISALI)。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种制备用于向受试者的气道施用的酶溶液的方法，其包括将所述酶溶液雾化以提供雾化溶液。 |
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| 说明书全文 | 用于向受试者的气道施用酶的组合物和方法[0002] 发明背景 [0003] 1.发明领域 [0005] 2.相关技术说明 [0006] 具有严重烧伤和烟雾暴露的许多患者产生被称为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的严重形式的ALI(急性肺损伤)，其与30-40％的死亡率、延长的住院治疗以及长期发病率有关。吸入烟雾(IS)诱导型ALI(ISALI)的特征在于严重的气道阻塞、纤维蛋白气道脱落物或碎片以及肺泡纤维蛋白沉积。现在缺乏对ISALI的有效特异性治疗。 [0007] 烧伤在美国每年影响超过1百万个患者，而在民用和军事实践中ISALI每年影响数千烟雾暴露患者(Enkhbaatar等,2004a)。ISALI在美国每年促成超过3000例死亡和17,000例火灾相关损害以及每100,000人口2-3例的火灾相关死亡率，这在发达国家中是比率最高者之一[Committee on injury and poison prevention(2000)Pediatrics105:1355-1357]。支持性护理是不理想的、长期的并且昂贵的。结果引起显著死亡率和发病率。尽管目前存在包括机械通气的支持性护理，包括与ISALI相关的ARDS的死亡率仍接近30-40％(Phua等,2009)。 [0008] 这些考虑要求测试新的和可能更有效的治疗。ISALI与严重的呼吸障碍、延长的住院治疗以及常常需要机械通气相关联。ISALI的长期并发症包括支气管反应性、肺纤维化加速以及支气管扩张。在所有形式的ALI中，ISALI特别容易发生异常纤维蛋白周转，包括在大的气道中形成的纤维蛋白脱落物和肺泡中的纤维蛋白(Enkhbaatar等,2004a)。支气管脱落物干扰气体交换，往往需要支气管镜清除术并且促进肺不张。当在临床实践中使用雾化肝素和N-乙酰半胱氨酸时，仍未在任何随机或前瞻性控制的临床试验中证实雾化肝素在ISALI患者中的功效(Tuinman等2012)，单独肝素当在我们在绵羊中进行的研究中加以测试时也未证明改善ISALI(Enkhbaatar等,2008a；Enkhbaatar等,2008b)。肝素不清除已确定的凝块并且雾化肝素可能在ISALI中引发系统性凝血病(O'Donnell,2012)。 [0009] 发明概述 [0010] 本文提供制备用于向受试者的气道施用的酶溶液的方法，该方法包括将酶溶液雾化(例如使用振动筛网雾化器)。酶可以是组织型纤溶酶原活化剂，其包括单链尿激酶型纤溶酶原活化剂(scuPA)和组织型纤溶酶原活化剂(tPA)。在一些实施方案中，振动筛网雾化器是 Professional Nebulizer或EZ Breathe Atomizer。 [0011] 因此，在第一个实施方案中，提供一种制备用于向受试者的气道施用的酶溶液的方法，其包括将酶溶液雾化以提供雾化溶液。在某些方面，酶可以是纤溶酶原活化剂，诸如单链尿激酶型纤溶酶原活化剂(scuPA)或组织型纤溶酶原活化剂(tPA)。在某些方面，可以通过使用振动筛网雾化器将酶溶液雾化。在一些方面，将酶溶液雾化不包括使用喷射雾化器或超声波雾化器。在某些方面，将实施方案的酶溶液雾化可以包括提供足够的雾化能量和/或时间，以提供具有约2.5μm与10μm、2.5μm与8μm或3.0μm与6μm之间的的中值液滴尺寸的雾化溶液。在一些具体方面，将酶溶液雾化包括获得冻干酶组合物，使冻干酶组合物在溶液(例如水溶液)中复水以提供酶溶液，并且将酶溶液雾化。因此，在另一实施方案中，提供一种根据实施方案的方法制备的雾化酶溶液。 [0012] 在另一实施方案中，提供一种包含scuPA或tPA的雾化溶液的组合物。在一些方面，实施方案的组合物或酶溶液可以是水溶液。在某些方面，酶溶液包含生理上可接受的盐浓度和/或pH缓冲剂。举例来说，酶溶液可以是无菌盐水溶液或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在优选方面，组合物或酶溶液包含scuPA。 [0013] 在另一实施方案中，提供一种治疗受试者的方法，其包括向有需要的受试者的气道施用雾化酶溶液(例如tPA和/或scuPA酶溶液)。举例来说，受试者可能具有急性肺损伤或感染。在其他方面，供治疗的受试者具有吸入烟雾诱导型急性肺损伤(ISALI)、化学品诱导型肺损伤、格鲁布性支气管炎、严重哮喘或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。在这个实施方案中，纤溶酶原活化剂是使用诸如振动筛网雾化器(例如 Professional Nebulizer或EZ Breathe Atomizer)的雾化器加以雾化。熟练技术人员了解，递送治疗和药学上可接受剂量的酶的任何类型的喷雾器，诸如雾化器均适合用于根据实施方案的用途。 [0014] 在另一实施方案中，提供一种包含纤溶酶原活化剂和全氟化碳(例如“呼吸液体”)的组合物。在一些方面，纤溶酶原活化剂是scuPA和/或tPA。在一些方面，全氟化碳可以包含环烷基。举例来说，全氟化碳可以是全氟萘烷和/或全氟-溴辛烷。 [0015] 本发明的其他实施方案提供一种用于治疗具有肺部感染或肺损伤的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的包含纤溶酶原活化剂和全氟化碳的组合物。在一些方面，纤溶酶原活化剂是scuPA或tPA。在某些方面，全氟化碳可以是全氟萘烷和/或全氟-溴辛烷。 [0016] 本发明的其他目的、特征以及优点由以下详细描述将变得显而易见。然而，应了解，详细描述和具体实施例在指示本发明的优选实施方案时仅通过说明方式给出，因为由该详细描述在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对本领域技术人员来说将变得显而易见。 [0019] 图1是显示在具有博莱霉素(bleomycin)诱导型ALI的小鼠中重组scuPA的气管内递送增加BAL uPA活性的图。 [0020] 图2显示用雾化scuPA对绵羊进行处理提供在scuPA处理后与人类uPA抗原相关的可检测的uPA活性(泳道3)。在scuPA处理的动物的肺匀浆(泳道4)中类似地发现uPA抗原和活性。泳道1：uPA标准物，而泳道2：基线uPA活性。 [0021] 图3是示出制备若干不同雾化单链尿激酶型纤溶酶原活化剂(scuPA)制剂的方法的示意图。 [0022] 图4是示出根据图3制备的雾化scuPA制剂的活性的示意图。 [0023] 图5是示出组织型纤溶酶原活化剂(tPA)一旦与全氟萘烷(PFD)或全氟-溴辛烷(PFB)混合的活性的示意图。 [0024] 说明性实施方案的描述 [0025] I.本发明 [0026] 本文提供一种制备用于向受试者的气道施用的酶溶液的方法，其包括使用雾化器，诸如振动筛网雾化器将酶溶液雾化。本文详述的本发明研究的一个令人惊奇的发现是，诸如通过使用振动筛网雾化器将酶雾化产生保留显著酶活性水平的雾化组合物。本文还提供一种通过经由气道向受试者施用治疗有效量的雾化纤溶酶原活化剂来治疗受试者的肺损伤和感染(诸如吸入烟雾诱导型急性肺损伤，ISALI)的方法。在一些情况下，纤溶酶原活化剂是使用振动筛网雾化器加以雾化。本文进一步提供一种包含纤溶酶原活化剂和全氟化碳的组合物，以及使用纤溶酶原活化剂/全氟化碳组合物来治疗肺损伤和感染(例如ISALI)的方法。在一些实施方案中，用于根据实施方案的用途的酶是酶原。在其他方面，酶是纤溶酶原活化剂。 [0027] 在其他实施方案中，用于本文中的酶是选自tPA和scuPA的纤溶酶原活化剂。术语“组织型纤溶酶原活化剂”和“tPA”可互换使用并且在本文中指可参与纤溶酶原至纤溶酶的转化的丝氨酸蛋白酶(在一些实施方案中，EC 3.4.21.68)。应了解，术语“组织型纤溶酶原活化剂”和“tPA”包括重组形式，包括但不限于阿替普酶(altepase)、瑞替普酶(reteplase)、替奈普酶(tenecteplase)以及去氨普酶(desmoteplase).术语“组织型纤溶酶原活化剂”和“tPA”进一步包括单链形式(sc-tPA)、双链形式(ds-tPA)以及其混合物。在一些实施方案中，tPA是人类tPA或源自人类的tPA。术语“单链尿激酶型纤溶酶原活化剂”和“scuPA”可互换使用并且在本文中指尿激酶丝氨酸蛋白酶(在一些实施方案中，EC3.4.21.73)的酶原，该丝氨酸蛋白酶可参与纤溶酶原至纤溶酶的转化。“单链尿激酶型纤溶酶原活化剂”或“scuPA”可以通过在Lys158与Ile159之间的蛋白水解裂解来活化，使得两个链通过二硫键连接，从而形成丝氨酸蛋白酶。以下实施例3和图4描述使用振动筛网雾化器将scuPA雾化以及在雾化之后实现的与现有技术雾化方法相比令人惊奇的高酶活性。在一些实施方案中，振动筛网雾化器是 Professional Nebulizer或EZ Breathe Atomizer。 [0028] 术语“酶溶液”在本文中指含有适合于雾化的酶的任何液体制剂。在一些实施方案中，酶溶液含有如本文所定义的药学上可接受的载体或赋形剂。酶溶液是经由吸入或本领域技术人员已知的任何其他方法施用到受试者的气道。术语“气道”在本文中指呼吸道的任何部分，包括上呼吸道、呼吸气道以及肺。上呼吸道包括鼻和鼻道、口腔以及喉咙。呼吸气道包括喉、气管、支气管以及细支气管。肺包括呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊以及肺泡。 [0029] 本文还提供一种治疗受试者的吸入烟雾诱导型急性肺损伤(ISALI)的方法，其包括经由气道向受试者施用治疗有效量的雾化纤溶酶原活化剂，其中纤溶酶原活化剂是使用振动筛网雾化器加以雾化。在一些实施方案中，纤溶酶原活化剂选自tPA和scuPA。在其他或另外的实施方案中，振动筛网雾化器是 Professional Nebulizer或EZ Breathe Atomizer。 [0030] 应了解，“治疗ISALI”表示部分或完全地延缓、缓解、缓和或减轻病症或病状(诸如ISALI病状)的一种或多种症状的强度和/或缓解、缓和或阻止病症或病状(诸如ISALI病状)的一种或多种病因。根据本发明的治疗可以防止性、预防性、缓解性或治疗性地加以应用。在一些情况下，术语“治疗(treat/treating/treatment)”和其语法变化形式包括与治疗受试者之前相比或与在一般或研究群体中此类病状或症状的发病率相比，部分或完全减轻与ISALI症状相关的症状或症状。在一些实施方案中，ISALI病状包括以下中的一者或多者：氧合作用减少、气道阻塞(包括重度气道阻塞)、纤维蛋白气道脱落物或碎片以及肺泡纤维蛋白沉积。因此，治疗ISALI病状包括以下中的一者或多者：氧合作用改善、气道阻塞减轻、纤维蛋白气道脱落物或碎片减少以及肺泡纤维蛋白沉积减少。在一些实施方案中，ISALI病状经治疗出血发生率降低。 [0031] 本文进一步提供一种包含纤溶酶原活化剂和全氟化碳(PFC)的组合物。在一些实施方案中，组合物中的纤溶酶原活化剂选自tPA和scuPA。在其他或另外的实施方案中，组合物中的PFC选自全氟萘烷、全氟-1,3-二甲基环己烷、FC-75、全氟辛烷以及全氟-溴辛烷。在一些方面，PFC是或包含具有环烷基的PFC，诸如全氟萘烷、全氟-1,3-二甲基环己烷或FC-75。应了解，纤溶酶原活化剂和PFC可以呈任何比率或浓度。在一些实施方案中，组合物以每毫升PFC约0.005-0.040mg的浓度包含纤溶酶原活化剂。 [0032] 进一步提供一种治疗受试者的吸入烟雾诱导型急性肺损伤(ISALI)的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的包含纤溶酶原活化剂和PFC的组合物。实施例4和图5证实在全氟化碳混合物中纤溶酶原活化剂tPA保留活性。此外，PFC和纤溶酶原活化剂相加地促进气道碎片移除以及肺泡纤维蛋白的清除并且促成改善的结果。具体来说，PFC有效递送纤溶酶原活化剂，其促进1)气道脱落物的溶解和移动；以及2)气道和肺泡碎片的移除，同时支持呼吸气体交换。机械地，PFC有效补充肺容积。鉴于PFC液体的低表面张力，PFC使纤溶酶原活化剂分布在整个肺中，可能在脱落物与气道壁之间，因此在脱落物形成时使其分解，同时减慢新脱落物的形成。在PFC从肺部挥发时，纤溶酶原活化剂仍然进一步起溶解气道脱落物和肺泡纤维蛋白的作用。在再给药PFC悬浮液时，PFC体积不仅沉积额外的药物，而且移动脱落物和肺泡碎片。因为PFC是不可压缩的，所以它限制开放的损坏的小气道并且因而有助于复张(recruitment)。虽然我们不受任何特定机制的约束，但是与PFC接触也可以通过使在几乎所有形式的ALI中在小气道和肺泡中的组织因子引起的凝聚减轻而保护下面的上皮。在封闭式吸痰的情况下，较低密度的碎片漂浮在相对较密集的PFC中，从而促进气道纤维蛋白脱落物片段和碎片的移除。 [0033] 因此，在施用纤溶酶原活化剂和PFC组合物的方法的一些实施方案中，纤溶酶原活化剂选自tPA和scuPA。在其他或另外的施用纤溶酶原活化剂和PFC组合物的方法的实施方案中，组合物中的PFC选自全氟萘烷和全氟-溴辛烷。 [0034] 还应了解，前述内容涉及本发明的优选实施方案，并且可以在其中做出各种变化，而不会脱离本发明的范围。本发明是通过以下实施例进一步说明，这些实施例不应解释为以任何方式对本发明范围构成限制。相反，应清楚地了解，可能想到各种其他实施方案、修改形式以及其等效物，在阅读本文的描述后，这些其他实施方案、修改形式以及其等效物可使本领域技术人员想到它们，而不会脱离本发明的精神和/或所附权利要求书的范围。本文参考的所有专利、专利申请以及出版物出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。说明书和权利要求书中所用的术语定义如下。 [0035] II.定义 [0036] 除非上下文另有明确说明，否则如本说明书和权利要求书中所用，单数形式“一个(种)(a/an)”和“所述”包括复数参考物。举例来说，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。 [0037] 除非明确指出仅指替代物或替代物是相互排斥的，否则在权利要求书中使用术语“或”是用于指“和/或”，不过本公开支持指仅仅替代物和“和/或”的定义。如本文所用的“另一个(种)”可以指至少第二个或更多个。 [0038] 在本申请通篇中，术语“约”用于指示这样的值，所述值包括装置、用于确定该值的方法的固有误差变化或研究主题中存在的变化。 [0039] 术语“施用”是指经口、局部、静脉内、皮下、经皮、经真皮、肌内、关节内、肠胃外、小动脉内、真皮内、心室内、颅内、腹膜内、病灶内、鼻内、直肠、阴道、通过吸入或经由植入型药盒(implanted reservoir)的施用。术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内以及颅内注射或输注技术。在一些实施方案中，经由吸入施用雾化组合物。 [0040] 术语“气道”在本文中指呼吸道的任何部分，包括上呼吸道、呼吸气道以及肺。上呼吸道包括鼻和鼻道、口腔以及喉咙。呼吸气道包括喉、气管、支气管以及细支气管。肺包括呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊以及肺泡。 [0041] “组合物”意指活性剂与另一惰性(例如可检测试剂或标记)或活性(诸如佐剂)的化合物或组合物的组合。 [0042] 如本文所用，术语“包含”意指组合物和方法包括所列举的元素，但不排除其他元素。“基本上由……组成”在用于限定组合物和方法时，应指排除对组合有任何必不可少意义的其他元素。因此，基本上由如本文所定义的元素组成的组合物将不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物以及药学上可接受的载剂，诸如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。“由……组成”应指排除超过痕量的其他成分元素和用于施用本发明组合物的基本方法步骤。由这些过渡术语中的每一者定义的实施方案在本发明的范围内。 [0043] “对照”是在实验中用于比较目的的替代受试者或样品。对照可以是“阳性”或“阴性”的。用于治疗目的的“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括人类、家畜和农场动物、非人类灵长类动物以及动物园、运动或宠物动物，诸如狗、马、猫、牛等。 [0044] 术语“酶”在本文中指一种或多种催化特定生化反应的多肽或者指酶原。术语“酶原”是指代谢成酶的生物活性物质。在一个实施方案中，酶是组织型纤溶酶原活化剂(tPA)。在其他或另外的实施方案中，酶是酶原并且是单链尿激酶型纤溶酶原活化剂(scuPA)。 [0045] 术语“纤维蛋白溶酶”在本文中指促进血液凝块溶解的若干蛋白水解酶中的任一种。纤维蛋白溶酶包括但不限于纤溶酶、组织型纤溶酶原活化剂(tPA、sc-tPA以及dc-tPA)、尿激酶(uPA)以及尿激酶酶原(scuPA)。 [0046] 术语“同一性”或“同源性”应被解释为指如果有必要实现整个序列的最大同一性百分比，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分，在比对序列并且引入空位之后，在候选序列中与相比较的相应序列的残基同一的氨基酸残基的百分比。N-末端或C-末端延伸与插入均不应被解释为降低同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是本领域中熟知的。序列同一性可以使用序列分析软件来测量。 [0047] 术语“吸入烟雾诱导型急性肺损伤”和“ISALI”在本文中可互换使用并且指由烟雾吸入所造成的急性肺损伤(ALI)的形式。ALI也被称为“轻度ARDS”。ALI可以通过在受试者中发现以下状况中的一个或多个来定义：1)胸部x光片上双侧肺浸润，2)如临床指征通过右心导管插入术测量时肺毛细血管楔压<18mmHg(2.4kPa)，以及3)PaO2/FiO2<300mmHg(40kPa)。在一些实施方案中，治疗ISALI包括治疗以下病状中的一种或多种：氧合作用减少、气道阻塞(包括重度气道阻塞)、纤维蛋白气道脱落物或碎片以及肺泡纤维蛋白沉积。 [0048] 术语“雾化(nebulizing/nebulized)”和其他语法变化形式在本文中指将液体转化成小气溶胶液滴的过程。在一些实施方案中，气溶胶液滴具有约2-10μm的中值直径。在一些实施方案中，气溶胶液滴具有约2-4μm的中值直径。 [0049] 术语“全氟化碳”和“PFC”可互换使用并且在本文中指主要含有碳和氟的有机氟化合物。应了解，术语“全氟化碳”意在包括含有除碳和氟以外的分子的高度氟化分子并且通常被称为碳氟化合物。全氟化碳的实例包括但不限于全氟萘烷、全氟-溴辛烷、FC 77、PF 5060以及Rimar101。根据本发明使用的PFC就气体溶解度、密度以及表面张力而言共享类似的物理化学性质，但就辐射不透明度和运动粘度而言可能不同，所述辐射不透明度和运动粘度对在清创术期间气道脱落物的可视化和移动性可能具有影响。各种所列全氟化碳包括所有相关异构体，诸如立体异构体、对映异构体以及非对映异构体。 [0050] 术语“纤溶酶原活化剂”是指将纤溶酶原转化成纤溶酶的丝氨酸蛋白酶多肽，并且如本文所定义包括但不限于tPA、uPA(双链或活性形式)以及酶原scuPA。 [0051] “药物组合物”意在包括活性剂与惰性或活性载剂的组合，从而使得组合物适合于体外、体内或离体的诊断或治疗用途。 [0052] 如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”或“赋形剂”涵盖任何标准药物载剂，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、盐水(包括无菌盐水)、水以及乳液，诸如油/水或水/油乳液，其中“油”表示乳液中药学上可接受的水不混溶相，以及各种类型的润湿剂。组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。关于载剂、稳定剂以及佐剂的实例，参见Martin,REMINGTON'S PHARM.SCI.,第15版(Mack Publ.Co.,Easton(1975))。 [0054] 术语“药物有效量”、“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指诸如ACPD组合物的化合物将引起在组织、系统、动物或人类中由研究者、兽医、医生或其他临床医师正在寻求的生物或医学反应的量。 [0055] 术语“多肽”在其最广泛意义上是用于指具有两个或更多个亚单位氨基酸、氨基酸类似物或拟肽的化合物。所述亚单位可以通过肽键连接。在另一个实施方案中，所述亚单位可以通过例如酯、醚的其他键连接。如本文所用的术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和拟肽。如果肽链是短的，那么具有三个或更多个氨基酸的肽通常称为寡肽。如果肽链是长的，那么所述肽通常被称为多肽或蛋白质。 [0056] 聚核苷酸或聚核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一序列具有某一百分比(例如80％、85％、90％或95％)的“序列同一性”或“同源性”意味着在比对时，在比较这两个序列时所述百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。这种比对和同源性或序列同一性百分比可以使用本领域中已知的软件程序来确定，例如CURRENT PROTOCOLS IN MOLEC ULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等,编著,1987)增刊30,章节7.7.18,表7.7.1中所描述的那些。优选地，在比对中使用默认参数。优选比对程序是BLAST，使用默认参数。特别地，优选程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；过滤＝无；链＝两条；截断值＝60；预期＝10； 矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；分类＝高得分；数据库＝非冗余,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank C DS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。 [0057] 如本文所用的术语“预防(prevent/preventing/prevention)”和其语法变化形式是指部分或完全地延缓或阻止病症或病状和/或一种或多种其伴随症状的发作或复发或者防止受试者获得或再次获得病症或病状或者降低受试者获得或再次获得病症或病状或一种或多种其伴随症状的风险的方法。 [0058] 术语“受试者”在本文中定义为包括动物，诸如哺乳动物，包括但不限于灵长类动物(例如人类)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在优选的实施方案中，受试者是人类。 [0059] 术语“药物有效量”、“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指诸如tPA和/或scuPA组合物的化合物将引起在组织、系统、动物或人类中由研究者、兽医、医生或其他临床医师正在寻求的生物或医学反应的量。 [0060] 术语“单链尿激酶型纤溶酶原活化剂”和“scuPA”可互换使用并且在本文中指尿激酶丝氨酸蛋白酶多肽(在一些实施方案中，EC3.4.21.73)的酶原，所述丝氨酸蛋白酶可参与纤溶酶原至纤溶酶的转化；或者指如以引用的方式并入本文中的美国专利号7,332,469中所描述的酶原。“单链尿激酶型纤溶酶原活化剂”或“scuPA”可以通过在Lys158与Ile159之间的蛋白水解裂解来活化，使得两个链通过二硫键连接，从而形成丝氨酸蛋白酶。应了解，scuPA同源物也包括在本发明中。术语“scuPA同源物”在本文中指鉴定为EC 3.4.21.73的尿激酶丝氨酸蛋白酶多肽的酶原的同源物、直系同源物及旁系同源物，以及与鉴定为EC 3.4.21.73的尿激酶丝氨酸蛋白酶多肽的酶原或与如美国专利号7,332,469中所描述的酶原具有大于70％同源性的其他序列。 [0061] “受试者”、“个体”或“患者”在本文中可互换使用，其指的是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人类。哺乳动物包括但不限于鼠、猿、人类、农场动物、运动动物以及宠物。 [0062] 术语“治疗有效量”包括诸如tPA和/或scuPA组合物的化合物在施用时足以防止正在治疗的ISALI异常的一种或多种症状的发展，或在某种程度上使其缓解的量。治疗有效量将视而诸如tPA和/或scuPA组合物的化合物、病症或症状和其严重程度、施用途径、施用时间、排泄速率、药物组合、治疗医师的判断、剂型以及所要治疗的受试者的年龄、体重、总体健康、性别以及/或者饮食变化。 [0063] 术语“组织型纤溶酶原活化剂”和“tPA”可互换使用并且在本文中指可参与纤溶酶原至纤溶酶的转化的丝氨酸蛋白酶(在一些实施方案中，EC 3.4.21.68)。应了解，术语“组织型纤溶酶原活化剂”和“tPA”包括重组形式，包括但不限于阿替普酶(altepase)、瑞替普酶(reteplase)、替奈普酶(tenecteplase)以及去氨普酶(desmoteplase)。术语“组织型纤溶酶原活化剂”和“tPA”进一步包括单链形式(sc-tPA)、双链形式(ds-tPA)以及其混合物。在一些实施方案中，tPA是人类tPA或源自人类的tPA。还应了解的是，tPA同源物也包括在本发明中。术语“tPA同源物”是指被鉴定为EC 3.4.21.68的组织型纤溶酶原活化剂多肽的同源物、直系同源物以及旁系同源物，以及与被鉴定为EC 3.4.21.68的组织型纤溶酶原活化剂多肽具有大于70％同源性的其他序列。在一些实施方案中，tPA是单链形式，诸如ALTEPASETM形式。 [0064] 如本文中所用的术语“治疗(treat/treating/treatment)”和其语法变化形式包括部分或完全地延缓、缓解、缓和或减轻病症或病状(诸如ISALI病状)的一种或多种伴随症状的强度和/或缓解、缓和或阻止病症或病状(诸如ISALI病状)的一种或多种病因。根据本发明的治疗可以防止性、预防性、缓解性或治疗性地加以应用。在一些情况下，术语“治疗(treat/treating/treatment)”和其语法变化形式包括与治疗受试者之前相比或与在一般或研究群体中此类病状或症状的发病率相比，部分或完全减轻与ISALI症状相关的症状或症状。在一些实施方案中，ISALI病状包括以下中的一者或多者：氧合作用减少、气道阻塞(包括重度气道阻塞)、纤维蛋白气道脱落物或碎片以及肺泡纤维蛋白沉积。在一些实施方案中，ISALI病状经治疗出血发生率降低。 [0065] 术语“振动筛网雾化器”在本文中指按使用具有多个孔的振动筛网或板(孔板)来产生精细粒子、低速气溶胶的一般原理进行操作的任何雾化器。一些雾化器可以含有具有1000至7000个孔的筛网/膜，所述筛网/膜在贮液器的顶部振动(参见例如美国专利公布 20090134235以及Waldrep和Dhand 2008，其各自以引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，振动筛网雾化器是 Professional Nebulizer、Omron Pari 或EZ Breathe Atomizer。在一些方面，振动筛网雾化器具有约50- 250kHz、75-200kHz、100-150kHz之间或约120kHz的振动频率。这些装置将气溶胶递送至肺部的效率高并且残留在这些装置中的液体体积是最小的，这对于昂贵并且有效的如纤溶酶原活化剂的化合物来说是优点。 [0066] III.实施例 [0067] 包括以下实施例以展示本发明的优选实施例。本领域技术人员应了解，以下实施例中所公开的技术代表本发明人发现在本发明的实践中很好地起作用的技术，并且因此可以被认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应了解，可以在所公开的具体实施方案中作出许多改变，并且仍然获得相同或类似的结果，而不会脱离本发明的精神和范围。 [0068] 实施例1–在具有博莱霉素诱导型ALI的小鼠中重组scuPA的气管内递送使BAL uPA活性增加 [0069] 在C57/B6小鼠中在第0天以2.5U/kg博莱霉素来诱导ALI(n＝10个动物/组)。将小鼠每天以25,000U进行处理；经由微型喷雾器(100μl)每个小鼠167μg重组人类scuPA。在第7天，在最后一次微型喷雾器施用scuPA之后4小时获得BAL。使用酰胺水解底物S-2444(直接+在与1mU/ml纤溶酶一起孵育5小时之后)测量uPA活性。结果示于图1中。纤溶酶处理后uPA活性增加表明，一些雾化scuPA在肺泡衬液内保持完整并且仍然可用于在体内通过纤溶酶活化。未发生肺部或全身性出血。这些数据证实先前报导的那些表明在外伤诱导的AL中雾化scuPA使灌洗纤维蛋白溶解活性增加并且是良好耐受的(Munster等,2002)。发现的结果还表明，在ALI中在肺部产生scuPA的持久的纤维蛋白溶解活性(在气溶胶化之后4小时实质性增加)。 [0070] 实施例2–雾化scuPA使气道脱落物溶解并且在具有ISALI的绵羊的BAL中是可检测的 [0071] 将绵羊用雾化scuPA处理(2mg/处理，在ISALI诱导之后4小时开始并且每4小时一次持续48小时。气道脱落物负荷(阻塞得分12)落入按每4小时4mg用雾化tPA处理的绵羊的范围内(相比之下，在经媒介物处理的具有ISALI的绵羊中是20.7)(Enkhbaatar等,2004b)。如图2中所示，绵羊的BAL(支气管肺泡灌洗)不具有通过荧光分析可检测的基线uPA活性(泳道2)，但是在scuPA处理之后具有与人类uPA抗原有关的可检测的uPA活性(泳道3)，并且在来自经scuPA处理的动物的肺匀浆(泳道4)中类似地发现uPA抗原和活性。泳道1：uPA标准物。 [0072] 实施例3–雾化scuPA使气道脱落物溶解并且在具有ISALI的绵羊的BAL中是可检测的 [0073] 还对scuPA溶液进行了研究，所述scuPA溶液含有1mg/mL溶解于生理缓冲盐水或生理盐水中的scuPA，并且然后使用两种类型的振动筛网雾化器(EZ Breathe Atomizer和AeroNeb Pro雾化器)加以雾化。scuPA容易溶解于两种液体载剂。得到证实的是，雾化之前和之后的scuPA活性不受雾化条件(例如由雾化器中的雾化过程引起的溶液形成、剪切力和温度)的影响。另外，得到证实的是，scuPA溶液的中值几何粒度是3-4微米，并且具有窄的和可接受的尺寸分布。以下提供材料、方法和结果，并且在图3中提供程序的示意图。 [0074] 磷酸盐缓冲盐水和无菌盐水制剂： [0075] 磷酸盐缓冲盐水(DPBS，批次14190-250,Gibco)是购自Biostore,UT-Austin。PBS的组成如表1中所示。 [0076] 表1 [0077] [0078] PBS的pH值是7.3±0.1。无菌盐水是购自B.Braun Medical Inc(批次J1H573)。两种制剂均储存在环境室温下，并且避免过多的热量。 [0079] 装置介绍： [0080] 使用EZ Breathe Atomizer雾化器和AeroNeb pro雾化器进行测试。Professional Nebulizer System(振动筛网，Aerogen,Galway)是供多个患者使用的便携式医疗装置。 旨在将被批准与通用雾化器一起使用的用于吸入的医师处方药气溶胶化。EZ Breathe Atomizer(振动筛网，Nephron Pharmaceuticals Corporation,USA)是旨在将液体药物以气溶胶形式喷洒到人员将呼吸的空气中的装置。这些装置可以在存在和不存在机械通气或其他正压呼吸辅助的情况下由患者使用。 [0081] Scu-PA溶液制备： [0082] 获得各自含有3.5mg/mL scu-PA的八个小瓶并且储存于-80℃。为制得两种scu-PA溶液，按以下方式制备溶液： [0083] A.使scu-PA小瓶保持在室温(20℃-25℃)下，直到它们溶解成溶液。使用6mL注射器从小瓶中转移2mL溶液到新的10mL小瓶中。 [0084] B.使用附带21号针头的6mL注射器注射3mL无菌磷酸盐缓冲盐水(或无菌盐水)到一个小瓶中。手动搅动内容物，直到所有scu-PA溶液是均匀的。然后用无菌磷酸盐缓冲盐水(或无菌盐水)将此溶液稀释到1mg/mL的最终浓度。 [0085] 几何粒度分布(PSD)测试： [0086] 两种雾化器均分开地加载有作为样品的1mg/mL浓度的两种5mL scu-PA以及作为空白对照的纯盐水和纯PBS(总共8个样品)。几何粒度分布(PSD)是使用Malvern Spraytec测定。标准雾化程序进行5次；每次测试持续5秒钟。所有测定在环境室温、大气压力以及湿度下进行。 [0087] 从雾化器收集到的样品用于进一步的研究： [0089] 表2 [0090] [0091] 结果： [0092] 表3指示样品的几何粒度分布(PSD)信息(n＝5)，而图4示出了在雾化之后各样品的活性。 [0093] 表3 [0094] [0095] 基于这些结果，针对雾化对scuPA溶液进行优化，精力集中于确定最佳雾化器。关于雾化器施用所研究的其他参数包括确定加工参数(例如对于scuPA活性来说的最佳溶液组成；空气动力学性质，包括精细粒子分数、质量中值空气动力学直径以及总喷射剂量)的影响；温度在雾化期间(例如使用不同雾化器机构类型)对scuPA活性的影响；以及液体的剪切力(例如喷雾压力、超声波振动、筛目大小)对scuPA活性的影响。 [0096] 实施例4–tPA于PFC的悬浮液是稳定的并且保留tPA活性 [0097] 图5显示tPA于PFC中的悬浮液是稳定的并且tPA活性得以保留。对于这些研究，在50分钟保持时间期间在37℃下使用10mL注射器和21号针头通过气管内管(7mm成人气管内管)注射tPA/PFC悬浮液(以0.22mg/mL制得的18mL tPA-PFC悬浮液)。注意到的是，tPA充分润湿并且在PFC中解聚。关于tPA施用所研究的其他参数包括确定加工参数(例如tPA的粒度减小、PFC的粘度以及所得tPA-PFC悬浮液、tPA-PFC悬浮液的固体含量以及其在关于tPA活性进行支气管镜检期间对施用的影响)的影响。然后使用同样的方法来分析scuPA-PFC干预的调配物。 [0098] PFC和纤维蛋白溶酶相加地促进气道碎片移除以及肺泡纤维蛋白的清除，并且促成改善的结果。具体来说，PFC有效地递送纤维蛋白溶酶，这促进1)气道脱落物的溶解和移动；以及2)气道和肺泡碎片的移除，同时支持呼吸气体交换。机械地，PFC有效补充肺容积。鉴于PFC液体的低表面张力，PFC使纤维蛋白溶酶分布在整个肺中，可能在脱落物与气道壁之间，因此在脱落物形成时使其分解，同时减慢新脱落物的形成。在PFC从肺部挥发时，纤维蛋白溶酶仍然进一步起溶解气道脱落物和肺泡纤维蛋白的作用。在再给药PFC悬浮液时，PFC体积不仅沉积额外的药物，而且移动脱落物和肺泡碎片。因为PFC是不可压缩的，所以它限制开放的损坏的小气道并且因而有助于复张。与PFC接触也可以通过使在几乎所有形式的ALI中在小气道和肺泡中的组织因子引起的凝聚减轻而保护下面的上皮。在封闭式吸痰的情况下，较低密度的碎片漂浮在相对较密集的PFC中，从而促进气道纤维蛋白脱落物片段和碎片的移除。 [0099] *** [0100] 本文所公开和要求保护的所有方法均可根据本公开在不进行过多实验的情况下完成和执行。虽然已根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对本领域技术人员来说将显而易见的是，可以在所述方法和步骤或所描述的方法的步骤顺序方面应用各种改变，而不会脱离本发明的概念、精神以及范围。更具体地，将显而易见的是，化学与生理学相关的某些试剂可以取代本文所描述的试剂，同时实现相同或相似的结果。所有这些类似的对于本领域技术人员来说显而易见的取代和修改被认为在由所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围以及概念之内。 [0101] 参考文献 [0102] 以下参考文献在其提供示例性程序或补充本文阐述的其他细节的情况下是以引用的方式具体地并入本文中。 [0103] Committee on injury and poison prevention(2000)Pediatrics 105：1355-1357 [0104] Enkhbaatar&Traber(2004)Clin.Sci.(Lond).107：137-143 [0105] Enkhbaatar et al.(2004)Shock.22：70-75 [0106] Enkhbaatar et al.(2008).Clin.Sci.(Lond).114：321-329 [0107] Enkhbaatar，Herndon，and Traber(2008)J Burn Care Res.30：159-162[0108] O′Donnell(2012).J.Pharm.Pract.25：22-29 [0109] Munster et al.(2002)Blood Coagul.Fibrinolysis 13：591-601 [0110] Phua et al.(2009)Am J Respir Crit Care Med.179：220-227 [0111] Tuinman et al.(2012).Crit Care 16：R70 [0112] Waldrep and Dhand，(2008)Current Drug Delivery，5(2)：114-119 [0113] U.S.Patent Publn.20090134235 |
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