[0001] 本发明属医药领域中的重组蛋白质药物。背景技术：

[0002] 组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是目前应用广泛的溶栓药物。但天然型t-PA存在着半衰期短，有出血副作用，使用剂量高，成本价格高，临床使用条件苛刻等缺陷，因此科学界一直对其进行蛋白质结构改造。为提高t-PA的溶栓活性，并克服上述缺陷，我们从改造天然t-PA的分子结构入手，通过蛋白质工程改造，得到了t-PA的重组衍生物-新型组合突变体(简称rPA)。发明内容：

[0003] 根据t-PA的结构分析和分子设计，我们在将t-PA分子中的EGF区、Finger区和Kringle I区删除的基础上，保留了具有溶栓作用的Kringle II和蛋白酶二个功能区(176-527氨基酸)，同时将t-PA分子中的PAI-1结合位点的氨基酸进行定点突变，构建了能够显著延长t-PA半衰期、提高特异活性，且其活性不被PAI-1抑制的，诸多优势特征组合的新型t-PA突变体。该新型t-PA溶栓剂，其多种特性均有显著改善。经检索我们的这种新型t-PA突变体氨基酸序列是首创性工作，国际上没有类似的突变体发表。(rPA的核苷酸序列和氨基酸序列附后)。具体实施方式：

[0004] 首先PCR扩增出天然t-PA的176-527位氨基酸的cDNA。再将该cDNA中的PAI-1结合位点核苷酸序列364-372的CAC AGG AGG改变为GCC GCG GCG，使相应的第122-124位氨基酸HRR突变为AAA，便构建了新的t-PA突变体rPA，并克隆于大肠杆菌表达载体pET22b。在大肠杆菌中得到高效表达。表达蛋白占总菌体蛋白的40％，以包涵体形式存在。经蛋白质变性、复性，得到了有生物活性的rPA。为了获得更高的rPA的表达，保证其生物活性，我们将rPA基因克隆于毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9k，用毕赤酵母进行表达，在培养上清中经分离纯化，得到高活性的rPA。对用大肠杆菌和毕赤酵母表达的rPA进行理化和生物学性质研究表明，rPA在具有天然t-PA的优点，如血栓特异性的同时，在药理药代上优于t-PA。突变体的半衰期为约28分钟，而t-PA只有3.5分钟。rPA还表现出显著增强的血纤蛋白刺激性，并实质性地增加酶原性；与PAI-1反应后t-PA活性无抑制。说明我们的分子改构提高了纤溶酶原水解活性，大幅度增加了血纤蛋白辅因子的差别，核苷酸序列364-372相对应的氨基酸序列影响PAI-1结合活性，而不影响其纤溶酶原水解活性，这样的氨基酸突变显著提高了对PAI-1抑制的耐受性。上述突变特征的组合增加了该t-PA突变体的临床治疗应用的优势。该工作使其成为治疗活性好、用量少、临床使用方便的治疗心肌梗塞和脑血栓、肺栓塞等血栓性疾病的新型生物工程药物。

[0005] 当然，亦可依不同方法来制备rPA，如可在细菌或昆虫细胞及动物细胞等较高等真核细胞中表达，但最好是在酵母系统中表达。由于rPA分子包含9对二硫键，若用大肠杆菌进行表达必需经过变性和复性步骤，复性率很低，纯化困难，其产量和应用受到限制。为了提高rPA的表达产率，我们用甲醇营养型的毕赤酵母来分泌表达rPA。由酵母细胞中表达的优点不仅因为可以分泌rPA，而且还因为它在实际上是呈准确折迭形式的并具有高度活性的。

[0006] 优选采用的酵母载体是所谓的穿梭载体，其具有的细菌质粒和酵母质粒的复制原点，以在两种宿主系统中分泌的基因。此外，该类型载体还含有表达外来基因所必需的启动子顺序，以及最好有可改善产率的终止顺序，从而即可使利于同分泌信号融合的异源基因定位于启动子和终止密码子之间。

[0007] 具体工艺简述如下：

[0008] rPA表达质粒构建→转化毕赤酵母→高密度发酵表达→上清液分离→超滤浓缩→阳离子交换层析纯化→脱盐→除菌过滤→制剂分装→成品冻干。经上述步骤，即可制备得到纯度大于99％，生物比活性高于500,000IU/mg蛋白的rPA。

[0009] 实施例1：

[0010] 首先用PCR扩增和定点突变的方法获得rPA的全长cDNA。经DNA序列测定证实其序列正确后，插入我们已改建过的酵母表达质粒pPIC9K-Y。所购建成的表达质粒经DNA序列测定分析正确后，用Sal I酶切成线性质粒，用电穿孔的方法转化入毕赤酵母，经过筛选即得到rPA的高表达酵母工程菌。该工程菌在酵母培养基中生长、诱导、分泌，再将发酵液离心后，取上清液，超滤至十分之一体积，经脱盐后，过CM-Sepharose阳离子交换层析住纯化，即得到纯度>99％，比活性高于500,000IU/mg的rPA纯品。

[0011] 本发明的优点：

[0012] 本发明提供了一种t-PA的新型重组衍生物-组合突变体rPA以及用酵母分泌表达具天然蛋白结构和生物活性的rPA的新型工艺方法。rPA在具有天然t-PA的优点，如血栓特异性的同时，还具有以下优点：显著增强的血纤蛋白刺激性，延长的半衰期，增加的酶原性以及提高的对PAI-1抑制的耐受性。因而可能成为具有诸多临床优势的新一代溶栓药物。

[0013] rPA核苷酸序列和氨基酸序列

[0014] 1/1 28/10

[0015] ATG GGA AAC AGT GAC TGC TAC TTT GGG AAT GGG TCA GCC TAC CGT GGC ACG[0016] gly asn ser asp cys tyr phe gly asn gly ser ala tyr arg gly thr[0017] 58/20 88/30

[0018] CAC AGC CTC ACC GAG TCG GGT GCC TCC TGC CTC CCG TGG AAT TCC ATG ATC CTG ATA GGC[0019] his ser leu thr glu ser gly ala ser cys leu pro trp asn ser met ile leu ile gly[0020] 118/40 148/50

[0021] AAG GTT TAC ACA GCA CAG AAC CCC AGT GCC CAG GCA CTG GGC CTG GGC AAA CAT AAT TAC[0022] lys val tyr thr ala gln asn pro ser ala gln ala leu gly leu gly lys his asn tyr[0023] 178/60 208/70

[0024] TGC CGG AAT CCT GAT GGG GAT GCC AAG CCC TGG TGC CAC GTG CTG AAG AAC CGC AGG CTG[0025] cys arg asn pro asp gly asp ala lys pro trp cys his val leu lys asn arg arg leu[0026] 238/80 268/90

[0027] ACG TGG GAG TAC TGT GAT GTG CCC TCC TGC TCC ACC TGC GGC CTG AGA CAG TAC AGC CAG[0028] thr trp glu tyr cys asp val pro ser cys ser thr cys gly leu arg gln tyr ser gln[0029] 298/100 328/110

[0030] CCT CAG TTT CGC ATC AAA GGA GGG CTC TTC GCC GAC ATC GCC TCC CAC CCC TGG CAG GCT[0031] pro gln phe arg ile lys gly gly leu phe ala asp ile ala ser his pro trp gln ala[0032] 358/120 388/130

[0033] GCC ATC TTT GCC AAG GCC GCG GCG TCG CCC GGA GAG CGG TTC CTG TGC GGG GGC ATA CTC[0034] ala ile phe ala lys ala ala ala ser pro gly glu arg phe leu cys gly gly ile leu[0035] 418/140 448/150

[0036] ATC AGC TCC TGC TGG ATT CTC TCT GCC GCC CAC TGC TTC CAG GAG AGG TTT CCG CCC CAC[0037] ile ser ser cys trp ile leu ser ala ala his cys phe gln glu arg phe pro pro his[0038] 478/160 508/170

[0039] CAC CTG ACG GTG ATC TTG GGC AGA ACA TAC CGG GTG GTC CCT GGC GAG GAG GAG CAG AAA[0040] his leu thr val ile leu gly arg thr tyr arg val val pro gly glu glu glu gln lys[0041] 538/180 568/190

[0042] TTT GAA GTC GAA AAA TAC ATT GTC CAT AAG GAA TTC GAT GAT GAC ACT TAC GAC AAT GAC[0043] phe glu val glu lys tyr ile val his lys glu phe asp asp asp thr tyr asp asn asp[0044] 598/200 628/210

[0045] ATT GCG CTG CTG CAG CTG AAA TCG GAT TCG TCC CGC TGT GCC CAG GAG AGC AGC GTG GTC[0046] ile ala leu leu gln leu lys ser asp ser ser arg cys ala gln glu ser ser val val[0047] 658/220 688/230

[0048] CGC ACT GTG TGC CTT CCC CCG GCG GAC CTG CAG CTG CCG GAC TGG ACG GAG TGT GAG CTC[0049] arg thr val cys leu pro pro ala asp leu gln leu pro asp trp thr glu cys glu leu[0050] 718/240 748/250

[0051] TCC GGC TAC GGC AAG CAT GAG GCC TTG TCT CCT TTC TAT TCG GAG CGG CTG AAG GAG GCT[0052] ser gly tyr gly lys his glu ala leu ser pro phe tyr ser glu arg leu lys glu ala[0053] 778/260 808/270

[0054] CAT GTC AGA CTG TAC CCA TCC AGC CGC TGC ACA TCA CAA CAT TTA CTT AAC AGA ACA GTC[0055] his val arg leu tyr pro ser ser arg cys thr ser gln his leu leu asn arg thr val[0056] 838/280 868/290

[0057] ACC GAC AAC ATG CTG TGT GCT GGA GAC ACT CGG AGC GGC GGG CCC CAG GCA AAC TTG CAC[0058] thr asp asn met leu cys ala gly asp thr arg ser gly gly pro gln ala asn leu his[0059] 898/300 928/310

[0060] GAC GCC TGC CAG GGC GAT TCG GGA GGC CCC CTG GTG TGT CTG AAC GAT GGC CGC ATG ACT[0061] asp ala cys gln gly asp ser gly gly pro leu val cys leu asn asp gly arg met thr[0062] 958/320 988/330

[0063] TTG GTG GGC ATC ATC AGC TGG GGC CTG GGC TGT GGA CAG AAG GAT GTC CCG GGT GTG TAC[0064] leu val gly ile ile ser trp gly leu gly cys gly gln lys asp val pro gly val tyr