用于治疗中风的非神经毒性纤溶酶原激活因子

本发明与非神经毒性纤溶酶原激活剂的治疗用途有关，特别是源 自Desmodus rotundus唾液的非神经毒性纤溶酶原激活剂(DSPA)， 优选治疗中风。

将临床症状相关的不同临床现象概括为术语“中风”。根据各自的 发病机理，这些临床现象可能会首先分化为所谓的缺血性和出血性损 伤。

缺血性损伤(缺血)的特征是，因动脉血供应匮乏而导致脑中血 液循环的减弱或中断。这常常是由因动脉硬化而变窄的血管的血栓形 成，或动脉或心栓塞引起的。

出血性损伤主要以因动脉压过高而损伤形成的脑供应动脉穿孔为 基础。然而，在所有脑损伤中仅有大约20％是由出血性损伤引起的。 因此，由血栓形成引起的中风更为相关。

与其它组织缺血相比，神经组织缺血普遍伴随着受影响细胞的坏 死。神经组织中较高的坏死发生率可以用对“兴奋性中毒”现象的新理 解来解释，该现象是一种包括众多反应步骤的复杂级联反应。该级联 反应由因缺氧而瞬间丢失ATP并去极化的缺血神经元引发。它导致突 触后释放神经递质谷氨酸的增加，该神经递质激活调控阳离子通道的 膜结合谷氨酸受体。然而，由于该谷氨酸释放的增加使得谷氨酸受体 被过度激活。

谷氨酸受体调控由谷氨酸与受体的结合而开启的电压依赖型阳离 子通道。它导致Na+和Ca2+大量流入细胞从而干扰Ca2+依赖型细胞代 谢。Ca2+依赖型分解代谢酶的激活尤其可以解释随后的细胞死亡(Lee， Jin-Mo等，″The changing landscape of ischaemic brain injury mechanisms″；Dennis W.Zhol″Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system″)。

尽管谷氨酸介导的神经毒性机制还未被完全了解，但是人们都同 意其在很大程度上促成了脑缺血后的神经细胞死亡(Jin-Mo Lee，等)。

除保护重要功能和稳定生理参数外，在急性脑缺血的治疗中，重 新疏通封闭的血管也具有极大的重要性。可以经不同的方法实现重新 疏通。单纯的机械重新疏通方法，例如心脏病发作后的PTCA，迄今 为止仍未获得令人满意的效果。只有实现成功纤维蛋白溶解作用才能 使病人的物理状况得到令人满意的改善。这可以通过导管的局部应用 来实现(PROCAT，一项用尿激酶前体进行的研究)。然而，尽管已 经获得了阳性结果，该方法作为一种药物治疗方法还未获得官方批准。

自然发生的纤维蛋白溶解作用是以丝氨酸蛋白酶纤溶酶的蛋白水 解活性为基础的，该酶由其失活前体经催化(激活)形成。体内天然 存在的纤溶酶原激活剂u-PA(尿激酶型纤溶酶原激活剂)和t-PA(组 织纤溶酶原激活剂)催化纤溶酶原的天然激活。与u-PA相反，t-PA 与纤维蛋白和纤溶酶原一起形成一个所谓的激活剂复合体。因此，t-PA 的催化活性是纤维蛋白依赖的，并且在其存在下增强约550倍。除纤 维蛋白外，纤维蛋白原也能刺激由t-PA介导的纤溶酶原向纤溶酶转变 的催化作用——即使程度较低一些。在纤维蛋白原存在下，t-PA活性 仅增强25倍。纤维蛋白的切割产物也(纤维蛋白降解产物(FDP)) 能刺激t-PA。

对急性中风进行血栓溶解治疗的早期尝试可以追溯至二十世纪五 十年代。用链激酶，一种源自β溶血性链球菌的纤维蛋白溶解剂，进 行的首次广泛临床试验于1995年才开始。链激酶与纤溶酶原一起形成 催化其它纤溶酶原分子转变为纤溶酶的复合体。

由于链激酶是一种细菌蛋白酶从而能激发机体的变态反应，因此 采用链激酶的疗法存在严重缺陷。此外，由于之前包括抗体产生的链 球菌感染使病人可能出现所谓的链激酶抗性从而使得该疗法更难进 行。除此之外，欧洲(Multicenter Acute Stroke Trial of Europe (MAST-E)，Multicenter Acute Stroke Trial ofItaly(MAST-I))和澳 大利亚(Australian Streptokinase Trial(AST))的临床试验表明，用 链激酶治疗病人后呈现上升的死亡率风险以及更高的脑内流血(脑内 出血(intracerebral haemorrhage)ICH)风险。这些试验不得不在早 期就被终止。

作为选择，也可以采用尿激酶——它也是一种经典的纤维蛋白溶 解剂。与链激酶相反，由于它是一种天然存在于不同机体组织的酶， 因此它不具有抗原特性。它是一种纤溶酶原激活剂，且不依赖于辅助 因子。尿激酶由肾细胞培养物产生。

已经获得用产生自重组仓鼠细胞的组织型纤溶酶原激活剂——所 谓的rt-PA——(参见EP 0093619，US 4766075)进行的治疗性血 栓溶解的广泛经验。九十年代用t-PA在全世界范围内完成了几个临床 试验——以急性心肌梗死为主要症状——得到部分无法了解且矛盾的 结果。在所谓的欧洲急性中风试验中(ECASS)，在病人出现中风症 状后6小时内于静脉内使用rt-PA进行治疗。90天后检查死亡率和 Barthel指数作为病人的残疾或独立生活力指标。未报道生活力的显著 改善，但是报道了——尽管不显著——死亡率的上升。因此可以推断， 对根据各自病史个别选择出的病人在中风发作后立即用rt-PA进行的 血栓溶解治疗可能是有利的。然而，不推荐rt-PA在中风发作后6小 时内的普遍使用，因为在这段时间内的应用会增加脑内出血(ICH) 的危险(C.Lewandowski C和Wiliam Barsan，2001：Treatment of Acute Stroke；in：Annals of Emergency Medicine 37：2；S.202ff.)。

中风的血栓溶解治疗也是美国National Institute of Neurologic Disorder and Stroke进行的临床试验(所谓的NINDS rtPA中风试验) 课题。该试验的重点集中在出现症状后3小时内用rt-PA静脉内治疗 的效果上。治疗后三个月检查病人。由于观察到该治疗对病人生活力 的积极效果，因此推荐在三个小时的时间段内用rt-PA进行治疗，尽 管作者发现了更高的ICH风险。

两项进一步的研究(ECASS II Trial：Alteplase Thrombolysis for Acute Noninterventional Therapy in Ischaemic Stroke(ATLANTIS)) 调查了中风发作后三小时内用rt-PA治疗的积极效果是否能在六小时 内的治疗中重现。然而，由于未曾观察到临床症状的改善或死亡率的 任何降低，这个问题并不能得到肯定回答。其仍具有更高的ICH风险。

那些部分矛盾的结果使得对rt-PA的使用需要高度谨慎。在1996 年美国心脏协会(American Heart Association)的一份出版物中已经 指出医生们对血栓溶解治疗中风的严重多疑癖；而对心肌梗死治疗中 的纤维蛋白溶解物却没有这样的多疑癖(van Gijn J，MD，FRCP， 1996-Circulation 1996，93：1616-1617)。

一份1997年出版的综述首先给出了这一多疑癖背后的合理性(更 新于2001年3月)。根据该综述，当在中风发作后六小时内应用血栓 溶解物时，所有的血栓溶解物治疗(尿激酶、链激酶、rt-PA或重组 尿激酶)都导致中风后第一个10天内显著更高的死亡率，尽管死亡或 残废病人的总数降低了。这一效果主要是由ICH导致的。因此并不推 荐血栓溶解物在治疗中风中的广泛应用。

甚至之前，这样的结果使得其它一些作者给出了纯粹的讽刺言论： 中风病人必须选择要么死亡要么残废地活着(SCRIP 1997：2265，26)。

不过迄今为止使用rt-PA的疗法仍然是美国食品和药物管理局 (FDA)唯一批准的急性脑缺血的治疗方法。然而，其被限制于在中 风后三小时内使用rt-PA。

对rt-PA的批准是在1996年。之前在1995年，公开了关于t-PA 消极副作用的第一份声明，其中为在三小时之外将t-PA应用于中风治 疗时产生的剧烈效果提供了说明性依据。相应地，海马小胶质细胞和 神经细胞产生促进谷氨酸介导的兴奋性中毒的t-PA。该结论是从一项 关于t-PA缺陷型和野生型小鼠的研究推导得出的，其中将谷氨酸激动 剂分别注射入它们的海马。t-PA缺陷型小鼠对外源(inthrathecal)施 用的谷氨酸表现出显著更高的抗性(Tsirka SE等，Nature，Vol.377， 1995，″Excitoxin-induced neuronal degeneration and seizure are mediated by tissue plasminogen activator″)。这些结果在1998年得到 证实，当时Wang等证明当静脉内注射t-PA时t-PA缺陷型小鼠中出 现几乎两倍量的坏死神经组织。在野生型小鼠中外源t-PA的这一消极 结果仅为约33％(Wang等，1998，Nature，″Tissue plasminogen activator(t-PA)increases neuronal damage after focal cerebral ischaemia in wild type and t-PA deficient mice″)。

2001年初Nicole等发表了对由t-PA引起的兴奋性中毒的进一步 研究结果(Nicole O.，Docagne F Ali C；Margaill I；Carmeliet P； MacKenzie E T，Vivien D和Buisson A，2001：The proteolytic activity of tissue-plasminogen activator enhances NMDA receptor-mediated signaling；in：Nat Med 7，59-64)。他们证明由去极化皮质神经元释放 的t-PA会与所谓的NMDA型谷氨酸受体的NR1亚单位相互作用从而 导致NR1的裂解。它增强受体活性从而导致施用谷氨酸激动剂NMDA 后出现更大的组织破坏。NMDA激动剂诱导兴奋性中毒。因此，t-PA 通过激活NMDA型谷氨酸受体表现出神经毒性。

根据进一步的说明性概念，t-PA的神经毒性由纤溶酶原向纤溶酶 的转变间接导致。根据该模型，纤溶酶是神经毒性的效应物(Chen ZL 和Strickland S，1997：Neuronal Death in the hippocampus is promoted by plasmin-catalysed degradation of laminin.Cell：91， 917-925)。

附图5给出了t-PA的时间依赖性神经毒性效应的总结。其中，与 内源t-PA相比重组t-PA增强的毒性变得明显。这可能是由于rt-PA 能以更高的浓度进入组织。

尽管t-PA具有神经毒性副作用以及上升的死亡率效应，它仍然得 到了FDA的批准。这是因为缺乏无害但却有效的替代物——因此这得 感谢非常实际的成本效益分析。所以，仍然需要安全的疗法。然而， 如果它们仍然以血栓溶解物为基础——在不能找到血栓溶解作用的替 代方式的情况下——那就要考虑神经毒性问题(参见如Wang等a.a.O.； Lewandowski和Barson 2001a.a.O.)。

因此尽管几乎所有血栓溶解物都是潜在适用的，也还是终止了为 开发中风治疗新药物而进行的对包括DSPA(Desmodus rotundus)纤 溶酶原激活剂)在内的已知血栓溶解物的进一步研究。尤其是就DSPA 来说，较早期就已经指出了它对这一医药用途的潜在适用性(Medan P； Tatlisumak T；Takano K；Carano RAD；Hadley SJ；Fisher M： Thrombolysis with recombinant Desmodus saliva plasminogen activator(rDSPA)in a rat embolic stroke model；in：Cerebrovasc Dis 1996：6；175-194(4th International Symposium on Thrombolic Therapy in Acute Ischaemic Stroke)。DSPA是一种与t-PA高度同源 (相似)的纤溶酶原激活剂。因此——且加上由于t-PA的神经毒性副 作用导致的希望破灭——对将DSPA作为中风治疗的适宜药物没有更 多的指望。

相反，近期旨在改进已知血栓溶解疗法的策略试图不再于静脉内 使用血栓溶解物质，而经导管于动脉内使用血栓溶解物质，从而直接 接近血管内的血栓。首次试验是用重组产生的尿激酶进行的。因此， 可能可以降低血栓溶解作用的必需剂量以及随之产生的消极副作用。 然而，这一应用需要高的技术花费，而且并不是任何地方都可以进行 的。此外，病人不得不经费时的过程进行准备。然而时间常常是有限 的。因此，这一准备过程又导致了附加的危险。

目前，新的思想指向了抗凝血剂，例如肝素、阿司匹林或安克洛 酶——马来蝰蛇(malayan pit viper)毒液中的活性物质。然而两个检 验肝素效果的进一步临床试验(International Stroke Trial(IST)和 Trial of ORG 10172 in Acute Stroke Treatment(TOAST))并未显示 出对死亡率的显著改善或对中风的预防。

一种进一步的新疗法的焦点既非集中于血栓也非稀释血液或抗凝 结作用，而是尝试提高因中断血液供应而受损的细胞的生命力(WO 01/51613A1和WO 01/51614A1)。为达到该目的，使用了源自醌类、 氨基糖苷类或氯霉素类的抗生素。基于相似原因，进一步建议从中风 发作后立即应用胞磷胆碱(citicholin)开始。胞磷胆碱在体内被切割 为胞苷和胆碱。切割产物形成神经元细胞膜的一部分并因此支持受损 组织的再生(US 5,827,832)。

近期对安全治疗的研究以下面新发现为基础的，即，中风的致命 后果部分是仅仅由中断的血液供应间接导致或由包括过度激活的谷氨 酸受体在内的兴奋性中毒或神经毒性直接导致的。t-PA加强这一效应 (参见上述)。因此一种降低兴奋性中毒的思想是应用所谓的神经保护 剂(neuroprotectives)。它们可以个别使用或与纤维蛋白溶解剂一起 使用以减小神经毒性效应。它们能够或者作为例如谷氨酸受体拮抗剂 直接地降低兴奋性中毒、或者通过抑制电压依赖型钠或钙离子通道间 接地导致兴奋性中毒降低(Jin-Mo Lee等a.a.O.)。

可以用例如2-氨基-5膦酰戊酸盐(2-amino-5-phosphonovalerate， APV)或2-氨基-5-膦酰庚酸(2-amino-5-phosphonoheptanoate，APH) 产生对NMDA型谷氨酸受体的竞争性抑制(拮抗作用)。可以用例如 结合于通道苯环利定的物质来实现非竞争性抑制。这样的物质可以是 苯环利定、MK-801、右啡烷或cetamine。

迄今为止，采用神经保护剂的治疗还未表现出所期望的成功，可 能因为神经保护剂要表现它们的保护效应必须与血栓溶解剂结合。这 适用于其它物质(同时参见附图6)。

甚至t-PA和神经保护试剂的组合也仅导致有限的损伤。尽管如 此，也未避免此类纤维蛋白溶解试剂的神经毒性缺陷。

图1：进行了将t-PA或DSPA扩散入t-PA-/-小鼠的海马区的灌注 实验，最初的实验设计来证实t-PA和DSPA在灌注7天时都能保留蛋 白水解活性。为了该目的，将t-PA和DSPA的等分试样(100nmol) 在37℃和30℃于水浴中孵育7天。为了确定蛋白水解活性，在非还原 条件下，对5倍系列稀释的探针进行SDS-PAGE，并且通过酶谱分析法 估计蛋白水解活性。将冷冻7天的t-PA和DSPA等分试样用作对照。 如图1中可以看出，在37℃和30℃孵育上述时间段后，t-PA或DSPA 活性仅有少量损失。

图2：为了确定酶是否保留其蛋白水解活性，用t-PA或DSPA灌 注t-PA-/-小鼠7天(见上述)。然后用PBS对小鼠心脏进行灌注， 并去脑。分离同侧和对侧的海马区以及小脑区域(作为阴性对照)。 对组织样品(20μg)进行说明书方法部分所述的SDS-PAGE和酶谱分 析。从图2中可以看出，在海马的同侧区检测到了t-PA和DSPA活性， 在对侧区也检测到了一些活性。这表明灌注的蛋白酶不仅在脑中保留 了其活性，而且也扩散到了海马区。作为对照，在从小脑制备的提取 物中没有检测到活性。

图3：制备冠状脑切片，并用Nissl染色检测神经元。如图3所 示，用PBS灌注的t-PA-/-小鼠对随后的KA攻击具有抗性，然而重组 t-PA的灌注恢复了对KA处理的敏感性。相反，将同样浓度的DSPA灌 注入海马区并没有改变动物对KA的敏感性。

图4a和4b：在野生型小鼠的神经变性模型中也检查了t-PA和 DSPA的效果。将t-PA注射入这些小鼠的纹状体中，增强了谷氨酸类 似物NMDA导致的神经变性效果(Nicole等人，2001)。

在t-PA或DSPA存在下(各为46μM)，将NMDA注射入野生型小 鼠的纹状体区，总体积1μl。24小时后，去脑，根据Callaway方法 (Callaway等人，2000)(见上述)确定病灶损伤大小。如图4a和 4b所示，单独注射NMDA在所有处理的小鼠(N＝4)中导致可重复的损 伤。当t-PA和NMDA一起施用时，损伤大小增加了大约50％ (P＜0.01，n＝4)。与之形成鲜明对照的是，NMDA和相同浓度的DSPA 的共同注射导致损伤大小增加(与单独注射NMDA相比)。

图5：图解说明了影响DSPA和rt-PA的利用的各种因素，即

——由于损伤的增加，再灌注的治疗效果随时间降低

——rt-PA的神经毒效果增加；但是，它的增加超过了内源性t-PA 神经毒效果的增加

并且概述了由于内源性t-PA的毒性只有DSPA的利用受到限制。

图6：描述了可挽救组织是成功的溶栓的前提。

图7和图8：在红藻氨酸模型上进行定量检查。其显示了DSPA的 浓度即使增加10倍也不能恢复t-PA缺陷小鼠对KA处理的敏感性，而 低10倍的t-PA浓度导致了KA诱导的组织损伤。由此可以得出结论： 在KA处理后刺激神经变性方面，DSPA的神经毒性效果比t-PA至少低 100倍。

图9：显示修饰的尿激酶的氨基酸序列。

图10：显示改良的组织纤溶酶原激活剂的氨基酸序列。

因此当前的发明的一个目的是为人类中风治疗提供一种新的治疗 理念。

根据本发明，如权利要求1所概括，建议在中风治疗中使用非毒 性纤溶酶原激活因子。进一步的有利用途分别作为独立权利要求以及 进一步的从属权利要求主题。

本发明的中心思想是纤溶酶原激活剂在中风治疗中的用途，其成 熟酶表现出选择性由纤维蛋白增强许多倍的活性，即大于650倍。

根据本发明，纤溶酶原激活剂的用途以下列发现为基础：血脑屏 障由于因中风导致的脑内组织损伤而受到损伤或破坏。因此，在脑中 循环的纤维蛋白原能进入脑神经组织。它在此处激活导致——通过激 活谷氨酸受体或纤溶酶原——进一步组织损伤的t-PA。为避免该效应， 本发明建议使用呈高度纤维蛋白选择性且——作为对讨论的反驳—— 具有降低的被纤维蛋白原激活的潜力的纤溶酶原激活剂。因此，该纤 溶酶原激活剂并非——至少与t-PA相比而言程度较低——由因血脑 屏障受损而从血液进入神经组织的纤维蛋白原激活，因为t-PA的激活 剂纤维蛋白由于其大小而不能进入神经组织。因此根据本发明的纤溶 酶原激活剂是非神经毒性的。

根据本发明的一个优选实施方式，使用了非毒性纤溶酶原激活剂， 其包括至少一种所谓的cymogene三联体(cymogene triade)元件。 一个类似的已知三联体是来自胰凝乳蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶的催 化中心，它由三个互作的氨基酸即天门冬氨酸194、组氨酸40和丝氨 酸32组成。然而，该三联体并不存在于与丝氨酸蛋白酶一样同属于胰 凝乳蛋白酶家族的t-PA中。不过，已知向天然t-PA的适宜位点导入 至少一个上述氨基酸的定向诱变导致在纤维蛋白存在下前体酶活性 (单链t-PA)减弱和成熟酶活性(双链t-PA)增强。因此，三联体中 至少一个氨基酸——或具有与三联体中对应功能的氨基酸——的导入 能增强t-PA的cymogenity(也就是成熟酶活性与前体酶活性的比率)。 结果导致纤维蛋白特异性显著提高。这是由所导入的氨基酸残基和/ 或野生型序列氨基酸残基之间的构象互作引起的。

已知t-PA中用His取代Phe 305(F305H)和用Ser取代Ala 292 (A292S)的诱变使cymogenity增强20倍，而单纯的F305H突变使 cymogentity增强5倍(EL Madison，Kobe A，Gething M-J；Sambrook JF，Goldsmith EJ 1993：Converting Tissue Plasminogen Activator to a Zymogen：A regulatory Triad of Asp-His-Ser；Science：262，419-421)。 存在纤维蛋白时，这些t-PA突变活性分别增强30.000倍(F305H)和 130.000倍(F305H，A292S)。另外，这些突变包括将Arg275置换为 R275E以防止纤溶酶在切割位点Aug275-Ile276的切割，从而将单链 t-PA转变为双链形式。单一的突变部位R275E使t-PA的纤维蛋白特 异性增强6.900倍(K Tachias，Madison EL 1995：Variants of Tissue-type Plasminogen Activator Which Display Substantially Enhanced Stimulation by Fibrin，in：Journal of Biological Chemistry 270，31：18319-18322)。

t-PA的位点305和292与胰凝乳蛋白酶中丝氨酸蛋白酶的已知三 联体的位点His40和Ser32同源。通过分别导入组氨酸或丝氨酸的相 应取代，这些氨基酸能与t-PA的天门冬氨酸477互作从而在t-PA突 变体中产生有功能的三联体(Madison等，1993)。

根据本发明，由于这些t-PA突变体因增强的纤维蛋白特异性而不 表现或——与野生型t-PA相比——表现显著降低的神经毒性，因此可 将它们用于治疗中风。为公开已述及的t-PA单纯F305H；F305H； A292S突变体或与R275E的组合突变，我们引入Madison等(1993) 的出版物，以及将Tachias和Madison(1995)全文引作参考。

作为替代，纤溶酶原激活剂纤维蛋白特异性的增强可通过Asp194 (或同源位点的天门冬氨酸)的点突变实现。纤溶酶原激活剂属于胰 凝乳蛋白酶家族中丝氨酸蛋白酶组，且因此它包含负责成熟蛋白酶的 催化活性构象稳定性的保守氨基酸Asp194。已知在丝氨酸蛋白酶的 cymogenic形式中Asp194与His40相互作用。Cymogene经切割激活 后该特异性互作被打断，Asp194侧链旋转约170°以与Ile16形成一个 新盐桥。该盐桥本质上促进丝氨酸蛋白酶催化中心氧阴离子穴 (oxyanione pocket)的稳定性。它也存在于t-PA中。

引入替换Asp194的点突变似乎分别阻碍丝氨酸蛋白酶催化构象 的形成或稳定性。尽管这样，该突变的纤溶酶原激活剂在它们的辅助 因子纤维蛋白的存在下显示出显著增强的活性——特别是与成熟野生 形式相比——这只能解释为与纤维蛋白的互作允许促进催化活性的构 象变化(L.Strandberg，Madison EL，1995：Variants of Tissue-type Plasminogen Activator with Substantially Enhanced Response and Selectivity towards Fibrin co-factors，in：Journal of Biological Chemistry 270，40：2344-2349)。

总之，纤溶酶原激活剂的Asp194突变体在纤维蛋白存在下其活 性高度增强，因此根据本发明可对其进行利用。

在根据本发明的一个优选实施方式中，使用了t-PA突变体，该突 变体中Asp194被谷氨酸(D194E)或天冬酰胺(D194N)取代。这些 突变体中的t-PA活性在无纤维蛋白时减少1～2000倍，而当纤维蛋白 存在时其活性增强可达到498.000～1.050.000倍。这些突变体可进一 步包含Arg15至R15E的取代，它防止纤溶酶在肽键Arg15-Ile16处 切割单链t-PA，从而导致形成双链形式的t-PA。该单一突变将纤维蛋 白对t-PA的激活增强12.000倍。为公开在位点194和15的t-PA突 变，引入Strandberg和Madison(1995)全文作为参考。

也可以通过在所谓的“自溶环(autolysis loop)”中导入点突变来 增强纤溶酶原激活剂对纤维蛋白的依赖性。该成分已知源于胰蛋白酶； 在丝氨酸蛋白酶的同源部分中也能发现该成分，且其尤以三个疏水氨 基酸(Leu、Pro和Phe)为特征。纤溶酶原激活剂中的自溶环负责与 纤溶酶原的相互作用。该区域中的点突变使纤溶酶原与纤溶酶原激活 剂间不再有效形成蛋白质-蛋白质相互作用。这些突变仅在缺少纤维蛋 白时是功能相关的。相反在存在纤维蛋白时，它们负责纤溶酶原激活 剂活性的增强(K Song-Hua，Tachias K，Lamba D，Bode W，Madison EL，1997：Identification of a Hydrophobic exocite on Tissue Type Plasminogen Activator That Modulates Specificity for Plasminogen，in： Journal of Biological Chemistry 272；3，1811-1816)。

在一个优选实施方式中，使用在位置420至423具有点突变的 t-PA。若这些残基经定向诱变取代，其使得t-PA的纤维蛋白依赖性增 强高达61.000倍(K Song-Hua等)。Song-Hua等检测了点突变L420A、 L420E、S421G、S421E、P422A、P422G、P422E、F423A和F423E。 为公开根据本发明的用途将这些出版物全文引入作为参考。

根据进一步的有利实施方式，使用具有根据SEQ ID NO.1(附图 10)所示氨基酸序列的改良组织纤溶酶原激活剂。该改良t-PA与野生 型t-PA的区别在于，其自溶环中位点420至423的疏水氨基酸改变如 下：His420、Asp421、Ala422和Cys423。该t-PA优选在位点194具 有一个苯丙氨酸。进一步，位点275可为谷氨酸。有利的是，位点194 为苯丙氨酸。

进一步，根据本发明可以使用尿激酶。根据本发明，尿激酶可以 具有根据SEQ ID NO.2(附图9)所示的氨基酸序列，其中自溶环的 疏水氨基酸被Val420、Thr421、Asp422和Ser423取代。有利的是， 尿激酶带有一个Ile275和一个Glu194。该突变体具有——与野生型尿 激酶相比——增强500倍的纤维蛋白特异性。

两种突变体——尿激酶与t-PA——都进行了半定量试验分析，且 与野生型t-PA相比都显示增强的纤维蛋白特异性。

源自吸血蝙蝠(vampire bat)(Desmodus rotundus)唾液的纤溶酶 原激活剂(DSPA)在纤维蛋白存在时也表现出高度增强的活性——特 异增强100.000倍。因此，根据本发明优选可以使用它。术语DSPA 包括四种不同的蛋白酶，它们完成吸血蝙蝠的主要功能，即猎物伤口 流血时间的延长(Cartwright，1974)。这四种蛋白酶(DSPAα1、 DSPAα2、DSPAβ、DSPAγ)彼此间以及与人t-PA呈现高度的相似性 (同源性)。它们也表现出相似的生理活性，因此同分类于术语DSPA 下。DSPA公开于专利EP 0352119A1和US 6008019和5830849 中，因此为满足公开将它们全文引入作为参考。

迄今为止DSPAα是该组中最彻底分析的蛋白酶。其氨基酸序列与 已知的人t-PA氨基酸序列具有大于72％的同源性(等 人，1991)。然而，t-PA和DSPA间有两个本质区别。首先，所有的 DSPA作为单链分子时具有完全蛋白酶活性，因为——与t-PA相反 ——它不转变为双链形式(Gardell等，1989；等，1991)。 其次，DSPA的催化活性几乎完全依赖于纤维蛋白(Gardell等，1989； Bringmann等，1995；Toschie等，1998)。例如，在纤维蛋白存在下， DSPAα1的活性增强100.000倍而t-PA的活性仅增强550倍。相反， 纤维蛋白原对DSPA活性的诱导显著较弱，因为其活性仅增强7～9 倍(Bringmann等，1995)。总之，DSPA比仅被纤维蛋白激活550倍 的野生型t-PA显著更依赖于纤维蛋白且更为纤维蛋白特异性的。

由于其纤维蛋白溶解特性以及与t-PA极大相似，DSPA成为血栓 溶解试剂开发中一种令人感兴趣的候选物。尽管如此，DSPA作为血 栓溶解物试剂的医疗用途过去被限制于对心肌梗死的治疗，因为—— 由于t-PA对谷氨酸诱导的神经毒性的促进——人们不能合理预测与 t-PA有关的纤溶酶原激活剂可被合理应用于急性中风的治疗。

令人惊讶的是，即使DSPA显示出与t-PA高度相似(同源)并且 其分子的生理效应在很大程度上也类似，DSPA却没有神经毒性效应。 上述结论导致产生这样一种思想，DSPA也许可以在中风治疗中成功 用作血栓溶解试剂而不造成神经组织损伤的严重危险。特别有趣的是 这样一个事实，DSPA也可以在出现中风症状3小时后使用。

由上述发现发展而来的本发明的进一步教导是以显示DSPA的本 质特征(尤其是缺乏t-PA的神经毒性)的方式来改良和生产进一步的 纤溶酶原激活剂。其基础是研究获得的结构与生化效应间的关系，这 使得根据已知或新发现的神经毒性纤溶酶原激活剂将神经毒性纤溶酶 原激活剂转化为非神经毒性纤溶酶原激活剂从而生产非神经毒性纤溶 酶原激活剂成为可能。

该新教导是以通过使用所谓的红藻氨酸模型和NMDA诱导的纹 状体损伤检测模型完成的对一侧使用t-PA和另一侧使用DSPA的神经 变性效应的体内比较试验为基础的。

红藻氨酸模型(也称为红藻氨酸损伤模型)以通过外部应用红藻 氨酸(KA)作为红藻氨酸型(KA型)谷氨酸受体以及NMDA和AMPA 谷氨酸受体的激动剂所产生的对神经毒性谷氨酸级联反应的刺激为基 础。以t-PA缺陷型小鼠脑干为试验模型，可以显示只有在补加外源 t-PA后实验动物对红藻氨酸的敏感性才能达到野生型小鼠的水平。相 反，相同实验条件下输入等摩尔浓度的DSPA不能恢复对红藻氨酸 (KA)的敏感性。得出结论，t-PA的神经毒性效应不是由DSPA诱 导的。这些结果的总结于表2。

表2：

＊P＜0.0001

基于该模型的定量研究显示，甚至10倍的DSPA浓度增长也不能 恢复t-PA缺陷型小鼠对KA处理的敏感性而降低10倍的t-PA浓度就 已经导致KA诱导的组织损伤。由此得出结论，就KA处理后的神经 变性刺激来说，DSPA具有比t-PA至少低100倍的神经毒性潜力(同 时参见附图7和8)。

在第二个神经变性模型中，用野生型小鼠比较了t-PA以及DSPA 对NMDA依赖型神经变性刺激的可能效应。为此目的，向野生型小 鼠单独注射NMDA，或者与t-PA或DSPA组合注射NMDA(用作 NMDA型谷氨酸受体的激动剂)。该模型可以在因血脑屏障被破坏而 始终导致神经变性或血浆蛋白质流入的条件下比较这些蛋白酶的效果 (Chen等，1999)。

用该模型工作时，NMDA注射导致小鼠纹状体的可重复性损伤。 t-PA和NMDA的联合注射使损伤量增加至少50％。相反，与DSPAα1 的共注射不会导致由NMDA引起的损伤的增强或延伸。甚至在能够 自由扩散于由NMDA引起的损伤区域的血浆蛋白质存在下，DSPA也 不会导致神经变性的增强(同时参见表3)。

表3：

＊＊不显著

这些结果显示，无纤维蛋白的DSPA——与t-PA相反——表现得 类似哺乳动物以及人神经系统中的一种惰性蛋白酶——且因此不促进 由KA或NMDA引起的神经毒性效应。尽管存在对类t-PA蛋白质在 中风治疗用途中的偏见，无神经毒性使DSPA成为一种适宜治疗急性 中风的血栓溶解物试剂。

首个临床试验结果也显示这些结果也适用于人类中风治疗。已经 发现成功灌输后病人可以得到显著改善(改善8个点NIHSS或NIHSS 值0到1)。表1列出这些数据。

表1：

  病人   NIHSS   基线   Post Tmt   第7天   第30天   第90天   sAEs   1001   12   7   4   4   ＊   再次梗塞形成   1002   8   9   2   0   0   1003   8   10   12   10   ＊   1004   8   4   2   0   0   1005   11   11   4   5   ＊   1006   9   7   1   ＊   ＊   1007   14   6   ＊   ＊   ＊   2001   19   20   --   --   --   ICH，死亡   2002   15   21   --   --   --   ICH，死亡   3001   8   7   6   5   ＊   3002   15   16   9   8   ＊   3003   10   19   21   ＊   --   第39天死亡

DSPA和其它非神经毒性纤溶酶原激活剂的神经毒性缺乏特性 (参见上述)为中风治疗提供了特别的优势，这些纤溶酶原激活剂的 使用——与野生型t-PA相反——并不受限于中风发作后最长为3小时 的时间段。相反，治疗可以迟些开始——例如6小时后或甚至更迟， 因为几乎不存在刺激兴奋性中毒反应的危险。首次用DSPA进行的临 床试验证明了中风发作后在甚至超过6至9小时的时间范围对病人的 安全治疗。

用非神经毒性激活剂进行的这一无时间限制的治疗特别重要，因 为它第一次允许甚至在诊断被延误或不能足够肯定地确定中风发作时 安全地治疗呈急性中风症状的病人。现有技术中，这组病人由于不利 的风险评估而是被排除在采用纤溶酶原激活剂的血栓溶解疗法之外 的。因此，消除了血栓溶解试剂用于中风治疗的禁忌。

DSPA和其它的非神经毒性纤溶酶原激活剂不表现组织损伤副作 用。然而，为限制由天然存在于人体的谷氨酸诱导的组织损伤，将它 们与神经保护试剂联合应用于中风治疗是有利的。可以使用竞争性或 非竞争性抑制谷氨酸受体的神经保护试剂。有效的组合是使用例如已 知的NMDA型、红藻氨酸型或使君子酸型谷氨酸受体抑制剂，例如 APV、APH、苯环利定、MK-801、右啡烷或cetamine。

进一步，与阳离子联用是有利的，因为阳离子尤其是Zn离子会 阻断由谷氨酸受体调控的阳离子通道从而能够降低神经毒性效应。

在进一步有利的实施方式中，非神经毒性纤溶酶原激活剂可以与 至少一种进一步的治疗性试剂或与药学可接受载体联用。尤其有利的 是与通过活化细胞来支持组织损伤降低的治疗性试剂的联用，因为它 促进已受损组织的再生或在防止进一步发生中风中起作用。有利的例 子是与抗生素如醌类、抗凝血剂如肝素或水蛭素以及与胞磷胆碱或乙 酰水杨酸的组合。

与至少一种凝血酶抑制剂的联用也是有利的。优选，也可以使用 血栓调节蛋白和血栓调节蛋白类似物例如solulin、triabin或 pallidipin。进一步与抗炎症物质的联用是有利的，因为它们影响白细 胞浸润。

t-PA和DSPA的比较检测方法如下：

1.动物

野生型小鼠(c57/Black 6)和t-PA缺陷型小鼠(t-PA-/-mice) (c57/Black 6)(Carmeliet等，1994)由Dr.Peter Carmeliet，Leuven， Belgium提供。

2.脑组织蛋白质抽提

t-PA或DSPAα1灌注后用酶谱分析进行脑组织中蛋白水解活性的 评估(Granelli-Piperno和Reich，1974)。对海马进行七天灌注后麻 醉小鼠，然后用PBS经心脏灌流，取脑。切下海马区域，转入eppendorf 管并培养于等体积(w/v)(约30-50μm)不含蛋白酶抑制剂的0.5 ％NP-40裂解缓冲液(0.5％NP-40，10mM Tris-HCl pH 7.4，10mM NaCL，3mM MgCl2，1mM EDTA)中。用手动式玻璃匀浆机匀浆脑 提取物并将其置于冰上30分钟。随后离心样品，取得上清。检测存在 的蛋白质含量(Bio-Rad-reagent)。

3.蛋白酶的酶谱分析

根据Granelli，Piperno和Reich(1974)的方法用酶谱分析检 测样品和脑组织提取物中的蛋白水解活性。在非还原条件下对含重组 蛋白质(至多100nM)的样品或脑组织提取物(20μg)进行(10％) SDS-PAGE。将胶从盘中取出，在1％triton×100中洗涤2小时，之 后覆盖在一块含有聚合纤维蛋白原和纤溶酶原的琼脂糖凝胶上 (Granelli，Piperno和Reich，1974)。于37℃下将胶在湿润容器中 温育直到出现蛋白水解条带。

4.t-PA、DSPA向海马内的灌注及随后的红藻氨酸注射

红藻氨酸损伤模型是以Tsirka等的研究(1995)为基础的。向动 物腹腔内(i.p.)注射阿托品(4mg/kg)，之后通过腹腔注射戊巴比妥 钠(70mg/kg)麻醉。然后将小鼠置于脑立体定位框架(stereotaxic frame)中，并将一个含有100μl PBS或重组人t-PA(0.12mg/ml， 1.85μM)或DSPAα1(1.85μM)的微渗泵(Alzet型号1007D，Alzet CA.USA)皮下植入肩胛骨间。为了在中线附近导入液体，将泵经无 菌管与脑插管连接，并从穿越颅骨且坐标为前囱-2.5mm、midiolateral 0.5mm和背腹侧1.6mm的锉孔插入。将插管固定在合适的位置，且 使泵能以每小时0.5μl的速率灌注相应溶液共7天。

灌注蛋白酶两天后，再次麻醉小鼠并再将其置于脑立体定位框架 中。然后，向海马单侧注射溶于0.3μl PBS中的1.5nmol红藻氨酸 (KA)。坐标为：前囱-2.5mm、内侧1.7mm和背腹侧1.6mm。将 excitotoxin(KA)持续30秒注入。红藻氨酸处理后，为防止液体倒 流将注射针头在这些坐标再保持2分钟。

5.脑处理程序

KA注射5天后，麻醉动物并用30ml PBS经心脏灌流，接着用 70ml 4％的多聚甲醛液经心脏灌流，用相同的固定剂固定，随后在30 ％的蔗糖中进一步浸泡24小时。之后在冷冻切片机上切制冠状脑片 (40μm)，然后或者用硫堇(BDH，Australia)复染或者如下述进行 免疫组织化学检测处理。

6.海马内神经元丢失的定量

根据前人所述(Tsirka等，1995；Tsirka等，1996)完成对海马 CA1-CA3子域神经元丢失的定量。从所有处理组制备背侧海马的五个 连续部分，注意确保它们带有CA注射和损伤区域。根据海马的照相 扫描作图(camera lucida drawings)对这些切片的海马子域 (CA1-CA3)进行作图。与相同放大倍数下作图的1mm标准进行比 较以测定出子域全长。测定了含有有活力锥体神经元(呈正常形态) 的组织长度和无神经元(不含细胞，无硫堇染色)的组织长度。对这 些代表各海马子域完整神经元和神经元丢失的长度取脑片平均值，并 计算标准差。

7.用或不用t-PA或DSPA产生的纹状体内NMDA兴奋性中毒 损伤

麻醉野生型小鼠(c57/Black 6)并将其置于脑立体定位框架内(参 见上述)。单独或与46μM rt-PA或46μM DSPAα1联合用50nmol NMDA单侧注射小鼠左侧纹状体。同时单独注射t-PA和DSPA作为 对照(浓度均为46μM)。注射坐标为：前囱-0.4mm、midiolateral 2.0 mm和背腹侧2.5mm。以0.2μl/分钟的速率转移溶液(对于全部处理 组总体积均为1μl)5分钟并在注射后将针头在原位再保留2分钟以 使液体回流降到最少。24小时后麻醉小鼠，用30ml PBS经心脏灌注， 接着用70ml 4％多聚甲醛液经心脏灌注，用相同的固定剂固定24小 时，之后在30％的蔗糖中进一步浸泡24小时。然后在冷冻切片机上 切制脑片(40μm)，并置于明胶包被的玻片上。

8.对注射NMDA后损伤体积的定量

用Callaway等(2000)描述的方法完成对纹状体损伤体积的定量。 制备跨越损伤区域的连续冠状切片。根据Callaway的方法使损伤区域 可视化，并通过使用一台微电脑成像装置来定量损伤体积(MCID， Imaging Research Inc.，Brock University，Ontario，Canada)。

9.免疫组织化学

根据标准方法完成免疫组织化学。将冠状切片在3％H2O2和10％ 甲醇中浸泡5分钟，之后在5％正常山羊血清中浸泡60分钟。将切片 与抗-GFAP抗体(1∶1.000；Dako，Carpinteria，CA，USA)孵育过 夜以检测星形胶质细胞、或与抗-MAC-1抗体(1∶1.000；Serotec， Raleigh，NC，USA)孵育过夜以检测小胶质细胞或与抗-DSPA多克 隆抗体(Schering AG，Berlin)孵育过夜。漂洗后，将切片与适当的 生物素化第二抗体(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA) 一起孵育。接着在用3，3′-Diaminebebcidine/0.03％H2O2可视化之前 用抗生物素蛋白/生物素-复合体(Vector Laboratories，Burlingame， CA，USA)最后孵育60分钟。然后将切片置于明胶包被的玻片上、 干燥、脱水以及封上盖玻片。

B.结果

1.灌注的t-PA或DSPA扩散进入t-PA-/-小鼠的海马，并保持 蛋白水解活性

最初的试验是为证实DSPA和t-PA在7天灌注期间都保持它们的 蛋白水解活性而设计的。为该目的，将等分量的t-PA和DSPA(100 nmol)在37℃和30℃水浴中孵育7天。为检测蛋白水解活性，在非 还原条件下将探针的5倍连续稀释液进行SPS-PAGE，用酶谱分析来 评估蛋白水解活性。用一份冷冻保存7天的等分量t-PA和DSPA作对 照。正如可从附图1看到的，在30℃或37℃下孵育这一段时间仅造 成较小的DSPA或t-PA活性丧失。

2.t-PA和DSPA活性在灌注后从t-PA-/-小鼠制备的海马提取物 中被恢复

首先不得不证实所灌注的蛋白酶出现在被灌注动物脑中，且尽管 处在该区室中也仍然保持它们的蛋白水解活性。为证实这一点用t-PA 或DSPA灌注t-PA-/-小鼠7天(参见上述)。然后用PBS经心脏灌注 小鼠，并切除脑。分离海马同侧和对侧区以及小脑区(用作阴性对照)。 将组织样品(20μg)进行SDS-PAGE，以及根据方法部分的说明作酶 谱分析。正如可从附图2看到的，t-PA和DSPA活性在海马同侧区都 被检测到了，但在对侧区也检测到了一些活性。这表明，所灌注的蛋 白酶不仅在脑中保持了它们的活性，而且还扩散进了海马区。作为对 照，从小脑制备的提取物中没有检测到活性。

3.DSPA的免疫组织化学评价

为进一步证实DSPA确实已经扩散进入了海马区，灌注DSPA后 对t-PA-/-小鼠的冠状脑片进行免疫组织化学分析。在海马区检测到 了DSPA-抗原，其中灌注区域的染色最深。结果证实所灌注的DSPA 是可溶的并确实出现在海马中。

4.DSPA灌注不能体内恢复由红藻氨酸介导的神经变性。

t-PA-/-小鼠特征性表现对红藻氨酸(KA)介导的神经变性的抗 性。然而，rt-PA在海马内的灌注完全恢复对KA-介导的损伤的敏感 性。为判定该模型中DSPA是否可以替代t-PA，用微渗泵将t-PA或 DSPA灌注至t-PA-/-小鼠海马内。两组都测试了12只小鼠。2天后 给动物注射红藻氨酸，然后让它们恢复。5天后杀死动物，取脑并处 理(参见上述)。作为对照，用KA处理前对t-PA-/-小鼠进行了PBS 灌注(N＝3)。

制备冠状脑切片，并用Nissl染色法检测神经元。如附图3所示， 用PBS灌注的t-PA-/-小鼠对之后的KA刺激有抗性。然而，灌注重 组t-PA恢复了对KA处理的敏感性。相反，海马区中灌注相同浓度的 DSPA不改变动物对KA的敏感性。

那些结果的定量是以获自各组12只小鼠的数据为基础的。在 DSPA灌注的12只小鼠中有两只观察到了轻微的神经变性扩展。其原 因尚不清楚，可能与DSPA的存在无关。综合数据已考虑了这两只动 物中观察到的这一轻微效应。用t-PA处理的所有12只小鼠都对KA 处理敏感。这些结果显示，当灌注等摩尔浓度的t-PA或DSPAα1时， 只有t-PA给药导致对KA诱导的神经变性的敏感性的恢复。

5.DSPA灌注不导致小胶质细胞激活

由t-PA灌注产生的t-PA-/-小鼠KA敏感性的修复也导致小胶质 细胞激活(Rogove等，1999)。为评估在t-PA或DSPA灌注及随后的 KA处理后小胶质细胞激活的程度，用Mac-1抗体对小鼠冠状切片进 行免疫组织化学染色以确定激活的小胶质细胞。t-PA灌注后对KA敏 感性的修复导致Mac-1阳性细胞的明显增多。在用DSPA灌注的小鼠 中未观察到该现象。因此，KA处理后DSPA的存在不导致小胶质细 胞的激活。

6.小鼠海马区的DSPA和t-PA滴定。

用于灌注的t-PA浓度是以Tsirka等(1995)所述浓度为基础的 (100μl 0.12mg/ml[1.85μM])。用低10倍量的t-PA(0.185μM)和 高10倍量的DSPA(18.5μM)重复KA损伤试验。较低的t-PA浓度 仍然能够恢复对KA处理的敏感性(n＝3)。这一发现尤其值得注意， 即KA处理后灌注浓度提高10倍的DSPA仅导致少量神经元的丢失。 这些数据有力地表明，DSPA不导致对KA敏感性的增强。

7.t-PA和DSPA对野生型小鼠中NMDA-依赖型神经变性的效 应

还检测了t-PA和DSPA在野生型小鼠神经变性模型中的效应。向 这些小鼠纹状体中注射t-PA确定地导致由谷氨酸类似物NMDA引起 的神经变性效应的增强(Nicole等，2001)。

在t-PA或DSPA(各46μM)存在下向野生型小鼠纹状体区注射 总体积为1μl的NMDA。24小时后取脑，并根据Callaway的方法 (Callaway等，2000)对损伤大小进行定量(参见上述)。正如可从 附图4看到的，单独注射NMDA在所有处理小鼠(N＝4)中产生可重 复性损伤。当联合使用t-PA和NMDA时，损伤大小提高大约50％ (P＜0.01，n＝4)。明显相反的是，NMDA和相同浓度的DSPA的共同 注射与单独注射NMDA相比不导致损伤大小的增加。

单独注射t-PA或DSPA不导致可检测的神经变性。单独给药时 t-PA缺乏效应与Nicole等(2001)的结果一致。这些数据显示，DSPA 的存在甚至在神经变性事件过程中也不增强神经变性。

为证实DSPA注射确实已经扩散进入了海马区，用DSPA抗体对 冠状切片进行了免疫组织化学分析。检测表明，DSPA确实进入了纹 状体区。

用间接色原测试进行的纤溶酶原激活的动力学分析

根据Madisan E.L.，Goldsmith E.J.，Gerard R.D.，Gething M.-J.， Sambrook J.F.(1989)Nature 339721-724；Madison E.LO.， Goldsmith E.J.，Gething M.J.，Sambrook J.F.和Bassel-Duby R.S. (1990)Proc.Natl.Acad.Sci U.S：A 87，3530-3533以及Madison E.L.，Goldsmith E.J.，Gething M.J.，Sambrook J.F.和Gerard R.D. (1990)J.Biol.Chem 265，21423-21426用底物Lys-纤溶酶原 (American Diagnostica)和spectrocyme PL(American Diagnostica) 完成了对t-PA活性的间接色原测试。在有或无辅助因子DESAFIB (American Diagnostica)存在下都进行了测试。DESAFIB是一种通 过用蛋白酶蛇毒凝血酶(batroxobin)对高纯度人纤维蛋白原进行切 割获得的可溶性纤维蛋白单体制剂。蛇毒凝血酶切割在纤维蛋白原 Aα-链中的Arg16-Gly17结合位点从而释放纤维蛋白原肽链A。无肽 Gly-Pro-Arg-Pro存在时，所产生的代表纤维蛋白I单体的des-AA- 纤维蛋白原是可溶的。Lys-纤溶酶原的浓度变化范围在DESAFIB存 在时为0.0125～0.2μM以及在无辅助因子存在时为0.9～16μM。

不同刺激物存在下的间接色原测试。

根据上述引用的出版物完成标准间接色原测试。使用了含有 0.25～1ng酶、0.2μM Lys-纤溶酶原和0.62mM spectrocyme PL且总 体积为100μl的探针。测试在存在缓冲液、25μg/ml DESAFIB、100 μg/ml纤维蛋白原溴化氰片段(American Diagnostica)或100μg/ml 刺激性13氨基酸肽P368下完成的。在微量滴定板中进行分析，并持 续1小时在“Molecular Devices Thermomax”中于波长405nm处每30 秒检测一次光学密度。反应温度为37℃。

本申请为分案申请，母案申请号为028234782(国际申请号为 PCT/EP02/12204)，申请日为2002年10月31日，发明名称为“用于 治疗中风的非神经毒性纤溶酶原激活因子”。