補体Ｂ因子発現を調節するための組成物及び方法

配列表 本願は、電子形式の配列表とともに出願されている。この配列表は、2015年4月28日に作成されたサイズ204kbのBIOL0251WOSEQ_ST25.txtという名称のファイルとして提供される。この配列表の電子形式の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本実施形態は、補体B因子(CFB)特異的阻害剤を対象に投与することによって、補体代替経路の調節異常に関連する疾患を処置し、防止し、または改善するための方法、化合物、及び組成物を提供する。

補体系は、外来細胞の溶解、抗原貪食の強化、抗原保持因子の凝集、ならびにマクロファージ及び好中球の誘引に関与する宿主自然免疫系の一部である。補体系は3つの初期経路−古典経路、レクチン経路、及び代替経路−に分類され、それらは、成分C3に収束して、C3コンバターゼとして知られる酵素複合体を生成させ、それがC3をC3aとC3bとに切断する。C3bはCFBに媒介されてC3コンバターゼと会合し、C5コンバターゼの生成をもたらす。C5コンバターゼはC5をC5aとC5bとに切断し、そのC5bが膜侵襲経路を開始して、成分C5b、C6、C7、C8、及びC9を含む膜侵襲複合体(MAC)の形成をもたらす。膜侵襲複合体(MAC)は膜貫通チャネルを形成して標的細胞のリン脂質二重層を破壊し、それが細胞溶解につながる。

ホメオスタシス状態では、C3の自発的加水分解とC3bの生成とによる代替経路の活性化の結果として、代替経路が低い「アイドリング(tickover)」レベルで絶えず活性化されて、C5コンバターゼを生成している。

概要 補体系は自然免疫を媒介し、傷害に対する正常な炎症応答に重要な役割を果たすが、その調節異常は重度の傷害を引き起こしうる。代替補体経路がその構成的「アイドリング」レベルを超えて活性化すると、無制限な機能亢進が起こり、補体調節異常の疾患として顕在化しうる。

ここに提供する特定の実施形態は、補体B因子(CFB)特異的阻害剤の投与によって、対象における補体代替経路の調節異常に関連する疾患を処置し、防止し、または改善する方法に関する。ここに提供するいくつかの実施形態は、補体代替経路の調節異常に関連する疾患を有するかまたは前記疾患を有するリスクがある対象におけるCFBの発現を、前記対象にCFB特異的阻害剤を投与することによって阻害する方法に向けられる。特定の実施形態では、補体代替経路の調節異常に関連する疾患を有するかまたは前記疾患を有するリスクがある対象の眼におけるC3沈着を低減しまたはC3沈着の蓄積を阻害する方法には、前記対象にCFB特異的阻害剤を投与することが含まれる。いくつかの実施形態では、補体代替経路の調節異常に関連する疾患を有するかまたは前記疾患を有するリスクがある対象の腎臓におけるC3沈着を低減しまたはC3沈着の蓄積を阻害する方法には、前記対象にCFB特異的阻害剤を投与することが含まれる。

詳細な説明 前記一般的な説明及び以下の詳細な説明はどちらも例示的かつ説明的であるにすぎず、本願に係る発明を限定するものではないと理解すべきである。本明細書において、単数形の使用は、別段の明示がある場合を除き、複数形を含む。本明細書において「または(or)」の使用は、別段の言明がある場合を除き、「及び/または(and/or)」を意味する。さらに、「〜を含む(including)」という用語、ならびに「〜を含む(includes)」及び「含まれる(included)」などの他の形態の使用は、限定的ではない。また、「要素」または「成分」などの用語は、別段の明示がある場合を除き、1つのユニットを含む要素及び成分と2つ以上のサブユニットを含む要素及び成分をどちらも包含する。

本明細書において使用する見出しには構成上の目的しかなく、記載される主題を限定するものと解釈してはならない。本願において引用する文書または文書の一部は、すべて、例えば限定するわけではないが特許、特許出願、記事、書籍、及び論文を含めて、その文書のうちの本明細書において論じる部分も、その全体も、参照により明確に組み込まれる。

特別な定義が与えられない限り、本明細書に記載する分析化学、合成有機化学、ならびに医化学及び製薬化学に関連して用いられる術語、ならびにそれらの手順及び技法は、周知であり、当技術分野で一般に使用されるものである。化学合成及び化学分析には、標準的技法を使用することができる。そのような技法及び手順のうち特定のものは、例えば「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」Sangvi及びCook編,American Chemical Society,ワシントンD.C.,1994、「Remington’s Pharmaceutical Sciences」Mack Publishing Co.,ペンシルベニア州イーストン,第21版,2005、及び「Antisense Drug Technology,Principles,Strategies,and Applications」Stanley T.Crooke編,CRC Press,フロリダ州ボカラトン、ならびにSambrook et al.,「Molecular Cloning,A laboratory Manual」第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989に見いだすことができ、これらは、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。許容される場合、本開示の全体を通して言及する特許、出願、公開された出願、及び他の出版物、ならびに他のデータはすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。 別段の表示がある場合を除き、以下の用語は、以下の意味を有する。

「2’−Fヌクレオシド」とは、2’位にフッ素を含む糖を含むヌクレオシドを指す。別段の表示がある場合を除き、2’−Fヌクレオシドにおけるフッ素は(天然リボースのOHを置き換える)リボ位に存在する。

「2’−O−メトキシエチル」(2’−MOE及び2’−O(CH₂)₂−OCH₃ともいう)は、フラノース環の2’位にあるO−メトキシエチル修飾を指す。2’−O−メトキシエチル修飾糖は、修飾糖である。

「2’−MOEヌクレオシド」(2’−O−メトキシエチルヌクレオシドともいう)は、2’−MOE修飾糖部分を含むヌクレオシドを意味する。

「2’−置換ヌクレオシド」とは、フラノシル環の2’位にHまたはOH以外の置換基を含むヌクレオシドを意味する。特定の実施形態において、2’置換ヌクレオシドは、二環式糖修飾を有するヌクレオシドを含む。

「3’標的部位」とは、ある特定アンチセンス化合物の最も3’側のヌクレオチドに相補的な標的核酸のヌクレオチドを指す。

「5’標的部位」とは、ある特定アンチセンス化合物の最も5’側のヌクレオチドに相補的な標的核酸のヌクレオチドを指す。

「5−メチルシトシン」とは、5位に取り付けられたメチル基で修飾されたシトシンを意味する。5−メチルシトシンは修飾核酸塩基である。

「約」とは、ある値の±10%以内を意味する。例えば、「CFBの少なくとも約70%阻害を達成する化合物」と言明した場合、それは、CFBレベルが60%〜80%の範囲内で阻害されることを含意する。

「投与」または「投与すること」とは、ここに提供するアンチセンス化合物を、意図したその機能を果たすように対象に導入する経路を指す。使用することができる投与経路の一例として、非経口投与、例えば皮下、静脈内、または筋肉内への注射または注入が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書にいう「アルキル」とは、最大24個の炭素原子を含有する飽和直鎖または分岐鎖炭化水素ラジカルを意味する。アルキル基の例として、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、n−ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。アルキル基は、典型的には、1〜約24個の炭素原子、より典型的には、1〜約12個の炭素原子(C1〜C12アルキル)を含み、1〜約6個の炭素原子がより好ましい。

本明細書にいう「アルケニル」とは、最大24個の炭素原子を含有し、かつ少なくとも1つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分岐鎖炭化水素鎖ラジカルを意味する。アルケニル基の例として、エテニル、プロペニル、ブテニル、1−メチル−2−ブテン−1−イル、1,3−ブタジエンなどのジエンなどが挙げられるが、これらに限定されない。アルケニル基は、典型的には、2〜約24個の炭素原子、より典型的には、2〜約12個の炭素原子を含み、2〜約6個の炭素原子がより好ましい。本明細書にいうアルケニル基は、場合によっては、1つ以上のさらなる置換基を含みうる。

本明細書にいう「アルキニル」とは、最大24個の炭素原子を含有し、かつ少なくとも1つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分岐鎖炭化水素ラジカルを意味する。アルキニル基の例として、エチニル、1−プロピニル、1−ブチニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。アルキニル基は、典型的には、2〜約24個の炭素原子、より典型的には、2〜約12個の炭素原子を含み、2〜約6個の炭素原子がより好ましい。本明細書にいうアルキニル基は、場合によっては、1つ以上のさらなる置換基を含みうる。

本明細書にいう「アシル」とは、有機酸からヒドロキシル基を除去することによって形成されるラジカルを意味し、一般式−C(O)−Xを有し、式中、Xは、典型的には、脂肪族、脂環式、または芳香族である。例として、脂肪族カルボニル、芳香族カルボニル、脂肪族スルホニル、芳香族スルフィニル、脂肪族スルフィニル、芳香族ホスフェート、脂肪族ホスフェートなどが挙げられる。本明細書にいうアシル基は、さらなる置換基を場合によっては含みうる。

本明細書にいう「脂環式」とは、環式環系を意味し、前記環は、脂肪族である。前記環系は、1つ以上の環を含むことができ、少なくとも1つの環は脂肪族である。好ましい脂環式基は、環内に約5〜約9個の炭素原子を有する環を含む。本明細書にいう脂環式基は、場合によっては、さらなる置換基を含みうる。

本明細書にいう「脂肪族」とは、最大24個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖炭化水素ラジカルを意味し、任意の2つの炭素原子の間の飽和度は、一重、二重、または三重結合である。脂肪族基は、好ましくは、1〜約24個の炭素原子、より典型的には、1〜約12個の炭素原子を含有し、1〜約6個の炭素原子がより好ましい。脂肪族基の直鎖または分岐鎖は、窒素、酸素、硫黄、及びリンを含む1つ以上のヘテロ原子で中断されていてもよい。ヘテロ原子によって中断されているそのような脂肪族基には、ポリアルコキシ、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、及びポリイミンが含まれるが、これらに限定されない。本明細書にいう脂肪族基は、場合によっては、さらなる置換基を含みうる。

本明細書にいう「アルコキシ」とは、アルキル基と酸素原子とで形成されるラジカルを意味し、アルコキシ基は前記酸素原子を使って親分子に取り付けられる。アルコキシ基の例として、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、n−ブトキシ、sec−ブトキシ、tert−ブトキシ、n−ペントキシ、ネオペントキシ、n−ヘキソキシなどが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書にいうアルコキシ基は、場合によっては、さらなる置換基を含みうる。

本明細書にいう「アミノアルキル」とは、アミノ置換されたC1〜C12アルキルラジカルを意味する。前記ラジカルのアルキル部分は、親分子と共有結合を形成する。アミノ基は、任意の位置に位置することができ、アミノアルキル基は、アルキル部分及び/またはアミノ部分を、さらなる置換基で置換することができる。

本明細書にいう「アラルキル」及び「アリールアルキル」とは、C1〜C12アルキルラジカルに共有結合で連結されている芳香族基を意味する。結果として生じるアラルキル(またはアリールアルキル)基のアルキルラジカル部分は、親分子と共有結合を形成する。例として、ベンジル、フェネチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書にいうアラルキル基は、場合によっては、当該ラジカル基を形成するアルキル基、アリール基、またはそれら両方の基に取り付けられたさらなる置換基を含みうる。

本明細書にいう「アリール」及び「芳香族」とは、1つ以上の芳香族環を有する単環式または多環式炭素環式環系ラジカルを意味する。アリール基の例として、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、イデニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいアリール環系は、1つ以上の環内に約5〜約20個の炭素原子を有する。本明細書にいうアリール基は、場合によっては、さらなる置換基を含みうる。

「改善」とは、関連する疾患、障害、または状態の少なくとも1つの指標、徴候、または症状の軽減を指す。特定の実施形態では、改善は、状態または疾患の1つ以上の指標の進行の遅延または減速を包含する。指標の重症度は、当業者に知られている主観的尺度または客観的尺度によって決定することができる。

「動物」とは、ヒトまたはヒト以外の動物を指し、これには、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、及び非ヒト霊長類(サル及びチンパンジーを含むが、これらに限定されない)が含まれるが、これらに限定されない。

「アンチセンス活性」とは、アンチセンス化合物によるその標的核酸へのハイブリダイゼーションに起因する任意の検出可能な活性または測定可能な活性を意味する。特定の実施形態では、アンチセンス活性が、標的核酸またはそのような標的核酸がコードするタンパク質の量または発現の減少である。

「アンチセンス化合物」とは、水素結合によって標的核酸へのハイブリダイゼーションを起こすことができるオリゴマー化合物を意味する。アンチセンス化合物の例として、一本鎖化合物及び二本鎖化合物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、shRNA、ssRNA、及び占有に基づく(ocupancy−based)化合物が挙げられる。

「アンチセンス阻害」とは、アンチセンス化合物が存在しない場合の標的核酸レベルとの比較で、標的核酸に相補的なアンチセンス化合物の存在下での標的核酸レベルの低減を意味する。

「アンチセンス機序」とは、化合物と標的核酸とのハイブリダイゼーションを伴うすべての機序をいう。前記ハイブリダイゼーションの結果または効果は、標的の分解または標的の占有であり、これに付随して、例えば転写またはスプライシングに関わる細胞機構の停止が起こる。

「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、標的核酸の対応する領域または対応するセグメントへのハイブリダイゼーションを可能にする核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。

「塩基相補性」とは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基が標的核酸中の対応する核酸塩基と正確な塩基対合(すなわちハイブリダイゼーション)を起こす能力を指し、これは、対応する核酸塩基間のワトソン−クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合によって媒介される。

「二環式糖部分」とは、4〜7員環の2つの原子をつないで第2の環を形成することで二環式構造をもたらす橋を含む4〜7員環(フラノシルを含むが、これに限定されない)を含む修飾糖部分を意味する。特定の実施形態では、前記4〜7員環が糖環である。特定の実施形態では、前記4〜7員環がフラノシルである。特定のそのような実施形態では、前記橋が、フラノシルの2’−炭素と4’−炭素とをつなぐ。

「二環式核酸」または「BNA」または「BNAヌクレオシド」とは、ヌクレオシド糖単位の4’位と2’位の間の2つの炭素原子をつないで二環式糖を形成する橋を有する核酸モノマーを意味する。そのような二環式糖の例として、以下に図示するA)α−L−メチレンオキシ(4’−CH₂−O−2’)LNA、(B)β−D−メチレンオキシ(4’−CH₂−O−2’)LNA、(C)エチレンオキシ(4’−(CH₂)₂−O−2’)LNA、(D)アミノオキシ(4’−CH₂−O−N(R)−2’)LNA及び(E)オキシアミノ(4’−CH₂−N(R)−O−2’)LNAが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書にいうLNA化合物には、糖の4’位と2’位との間に少なくとも1つの橋を有する化合物であって、橋のそれぞれが、−[C(R₁)(R₂)]_n−、−C(R₁)=C(R₂)−、−C(R₁)=N−、−C(=NR₁)−、−C(=O)−、−C(=S)−、−O−、−Si(R₁)₂−、−S(=O)_x−及び−N(R₁)−[ここで、xは0、1、または2であり、nは1、2、3、または4であり、各R₁及びR₂は、独立して、H、保護基、ヒドロキシル、C₁−C₁₂アルキル、置換C₁−C₁₂アルキル、C₂−C₁₂アルケニル、置換C₂−C₁₂アルケニル、C₂−C₁₂アルキニル、置換C₂−C₁₂アルキニル、C₅−C₂₀アリール、置換C₅−C₂₀アリール、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、C₅−C₇脂環式ラジカル、置換C₅−C₇脂環式ラジカル、ハロゲン、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、COOJ₁、アシル(C(=O)−H)、置換アシル、CN、スルホニル(S(=O)₂−J₁)、またはスルホキシル(S(=O)−J₁)であり、各J₁及び J₂は、独立して、H、C₁−C₁₂アルキル、置換C₁−C₁₂アルキル、C₂−C₁₂アルケニル、置換C₂−C₁₂アルケニル、C₂−C₁₂アルキニル、置換C₂−C₁₂アルキニル、C₅−C₂₀アリール、置換C₅−C₂₀アリール、アシル(C(=O)−H)、置換アシル、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、C₁−C₁₂アミノアルキル、置換C₁−C₁₂アミノアルキルまたは保護基である]から独立して選択される1つまたは2〜4つの連結基を、独立して含むものが含まれるが、これらに限定されない。

LNAの定義に包含される4’−2’架橋基の例として、次式の1つが挙げられるが、これらに限定されない:−[C(R₁)(R₂)]_n−、−[C(R₁)(R₂)]_n−O−、−C(R₁R₂)−N(R₁)−O−または−C(R₁R₂)−O−N(R₁)−。さらに、LNAの定義に包含される他の架橋基には、4’−CH₂−2’、4’−(CH₂)₂−2’、4’−(CH₂)₃−2’、4’−CH₂−O−2’、4’−(CH₂)₂−O−2’、4’−CH₂−O−N(R₁)−2’及び4’−CH₂−N(R₁)−O−2’−橋があり、ここで、各R₁及びR₂は、独立して、H、保護基またはC₁−C₁₂アルキルである。

本発明のLNAの定義には、リボシル糖環の2’−ヒドロキシル基が糖環の4’炭素原子につながれてメチレンオキシ(4’−CH₂−O−2’)橋を形成し、よって二環式糖部分を形成しているLNAも含まれる。橋は、2’酸素原子と4’炭素原子とをつなぐメチレン(−CH₂−)基であってもよく、これにはメチレンオキシ(4’−CH₂−O−2’)LNAという用語が使用される。さらに、この位置にエチレン架橋基を有する二環式糖部分の場合は、エチレンオキシ(4’−CH₂CH₂−O−2’)LNAという用語が使用される。メチレンオキシ(4’−CH₂−O−2’)LNAの異性体であるα−L−メチレンオキシ(4’−CH₂−O−2’)も、本明細書にいうLNAの定義に包含される。

「キャップ構造」または「末端キャップ部分」とは、アンチセンス化合物のどちらかの末端に組み込まれた化学修飾を意味する。

「炭水化物」とは、天然に存在する炭水化物、修飾炭水化物、または炭水化物誘導体を意味する。

「炭水化物クラスター」とは、足場基またはリンカー基に取り付けられた1つ以上の炭水化物残基を有する化合物を意味する(例えば、炭水化物共役クラスターの例として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Maier et al.「Synthesis of Antisense Oligonucleotides Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting」Bioconjugate Chemistry,2003,(14):18−29、またはRensen et al.「Design and Synthesis of Novel N−Acetylgalactosamine−Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor」J.Med.Chem.2004,(47):5798−5808を参照のこと)。

「炭水化物誘導体」とは、出発物質または中間体として炭水化物を用いて合成されうる任意の化合物を意味する。

「cEt」または「拘束エチル」とは、4’−炭素と2’−炭素とをつなぐ橋を含む二環式糖部分を意味し、この橋は4’−CH(CH₃)−O−2’という式を有する。

「化学修飾」とは、天然に存在する対応物と比較した場合の化合物の化学的相違を意味する。オリゴヌクレオチドの化学修飾は、ヌクレオシド修飾(糖部分修飾及び核酸塩基修飾を含む)ならびにヌクレオシド間連結部修飾を含む。オリゴヌクレオチドの場合、核酸塩基配列だけの相違は、化学修飾には含まれない。

「切断可能な結合」とは、開裂されうる任意の化学結合を意味する。特定の実施形態では、切断可能な結合は、アミド、ポリアミド、エステル、エーテル、ホスホジエステルの一方もしくは両方のエステル、リン酸エステル、カルバメート、ジスルフィド、またはペプチドのなかから選択される。

「切断可能部分」とは、生理学的条件下で開裂されうる結合または基を意味する。特定の実施形態では、切断可能部分が、細胞の内部またはリソソームなどの細胞内コンパートメントの内部で切断される。特定の実施形態では、切断可能部分が、ヌクレアーゼなどの内在性酵素によって切断される。特定の実施形態では、切断可能部分が、1個、2個、3個、4個、または5個以上の切断可能な結合を有する原子団を含む。

「共役体」または「共役基」とは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴマー化合物に結合される原子または原子団を意味する。概して、共役基は、それらが取り付けられた化合物の1つ以上の特性、例えば限定するわけではないが、薬力学的特性、薬物動態学的特性、結合特性、吸収特性、細胞分布特性、細胞取り込み特性、電荷特性、及び/またはクリアランス特性などを修飾する。

共役基に関連して「共役リンカー」または「リンカー」とは、任意の原子または原子団を含む共役基の一部分であって、(1)オリゴヌクレオチドを共役基の別の部分と共有結合で連結するか、または(2)共役基の2つ以上の部分を共有結合で連結するものを意味する。

共役基は、本明細書においてはラジカルとして示され、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴマー化合物への共有結合を形成するための結合を提供する。特定の実施形態では、オリゴマー化合物における結合点が、オリゴマー化合物の3’末端ヌクレオシドの3’−ヒドロキシル基の3’−酸素原子である。特定の実施形態では、オリゴマー化合物における結合点が、オリゴマー化合物の5’末端ヌクレオシドの5’−ヒドロキシル基の5’−酸素原子である。特定の実施形態では、オリゴマー化合物への結合を形成するための結合は、切断可能な結合である。特定のそのような実施形態において、そのような切断可能な結合は、切断可能部分のすべてまたは一部を構成する。

特定の実施形態では、共役基が、切断可能部分(例えば、切断可能な結合または切断可能なヌクレオシド)と、GalNAcクラスター部分などの炭水化物クラスター部分とを含む。そのような炭水化物クラスター部分は、標的部分と、場合によっては、共役リンカーとを含む。ある特定の実施形態では、炭水化物クラスター部分が、リガンドの数及びその実体によって特定される。例えば、ある特定の実施形態では、炭水化物クラスター部分が3個のGalNAc基を含み、「GalNAc3」と表記される。ある特定の実施形態では、炭水化物クラスター部分が4個のGalNAc基を含み、「GalNAc4」と表記される。具体的な炭水化物クラスター部分(具体的なテザー基、分岐基、及び共役リンカー基を有するもの)を、本明細書では、ローマ数字と、それに続く下付き文字「a」で説明し、表記する。したがって、「GalNac3−1a」とは、3個のGalNac基、ならびに具体的に特定されたテザー基、分岐基、及び連結基を有する共役基の具体的炭水化物クラスター部分を指す。そのような炭水化物クラスター断片は、切断可能な結合または切断可能なヌクレオシドなどの切断可能部分を介してオリゴマー化合物に取り付けられる。

「共役化合物」とは、共役基としての使用に好適な任意の原子、原子団、または連結された原子団を意味する。ある特定の実施形態では、共役化合物は、1つ以上の特性、例えば限定するわけではないが、薬力学的特性、薬物動態学的特性、結合特性、吸収特性、細胞分布特性、細胞取り込み特性、電荷特性、及び/またはクリアランス特性などを有しうるか、または付与しうる。

「拘束エチルヌクレオシド」(cEtヌクレオシドともいう)は、4’−CH(CH₃)−O−2’橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオシドを意味する。

「補体B因子(CFB)」とは、CFBの任意の核酸またはタンパク質を意味する。「CFB核酸」とは、CFBをコードする任意の核酸を意味する。例えば特定の実施形態において、CFB核酸は、CFBをコードするDNA配列、CFBをコードするDNA(イントロンとエクソンとを含むゲノムDNAを含む)から転写されたRNA配列(これには非タンパク質コード(すなわちノンコーディング)RNA配列と、CFBをコードするmRNA配列とが含まれる)を包含する。「CFB mRNA」とはCFBタンパク質をコードするmRNAを意味する。

「CFB特異的阻害剤」とは、CFB RNA及び/またはCFBタンパク質の発現または活性を分子レベルで特異的に阻害することができる任意の薬剤を指す。例えばCFB特異的阻害剤には、CFB RNA及び/またはCFBタンパク質の発現を阻害することができる核酸(アンチセンス化合物を含む)、ペプチド、抗体、小分子その他の薬剤が含まれる。

「化学的に異なる領域」とは、同じアンチセンス化合物の別の領域と何らかの形で異なっているアンチセンス化合物の領域を指す。例えば、2’−O−メトキシエチルヌクレオチドを有する領域は、2’−O−メトキシエチル修飾を持たないヌクレオチドを有する領域とは化学的に異なる。

「キメラアンチセンス化合物」とは、少なくとも2つの化学的に異なる領域を有するアンチセンス化合物を意味し、それぞれの位置は複数のサブユニットを有する。

「相補性」とは、第1核酸と第2核酸の核酸塩基間で対合する能力を意味する。

「を含む」(comprise、comprises、及びcomprising)は、明言したステップもしくは要素またはステップ群もしくは要素群の包含を含意するが、他の任意のステップもしくは要素またはステップ群もしくは要素群の排除を含意しないと理解されるであろう。

「連続する核酸塩基」とは、互いに直接隣り合っている核酸塩基を意味する。

「デオキシヌクレオシド」とは、天然に存在するデオキシリボヌクレオシド(DNA)に見られる2’−Hフラノシル糖部分を含むヌクレオシドを意味する。特定の実施形態において、2’−デオキシヌクレオシドは修飾核酸塩基を含むか、またはRNA核酸塩基(例えばウラシル)を含みうる。

「デオキシリボヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの糖部分の2’位に水素を有するヌクレオチドを意味する。デオキシリボヌクレオチドは、さまざまな置換基のいずれでも修飾することができる。

「設計」または「設計された」とは、選ばれた核酸分子と特異的にハイブリダイズするオリゴマー化合物を設計するプロセスを指す。

「異なる修飾がなされた」とは、修飾の不在を含めて、互いに異なる化学修飾または化学置換基を意味する。したがって、例えば、MOEヌクレオシドと無修飾DNAヌクレオシドは、DNAヌクレオシドが修飾されていなくても、「異なる修飾がなされている」という。同様に、DNAとRNAは、たとえそのどちらもが天然に存在する無修飾ヌクレオシドであったとしても、「異なる修飾がなされている」という。異なる核酸塩基を含んでいる点以外は同じであるヌクレオシドは、異なる修飾がなされているとは言わない。例えば、2’−OMe修飾糖及び無修飾アデニン核酸塩基を含むヌクレオシドと、2’−OMe修飾糖及び無修飾チミン核酸塩基を含むヌクレオシドとは、異なる修飾がなされているとは言わない。

「二本鎖」とは、互いにハイブリダイズしている2つの別個のオリゴマー化合物を指す。そのような二本鎖化合物は、生理的に妥当な条件下でハイブリダイゼーションを維持するのに十分な相補性が存在するのであれば、一方もしくは両方の鎖の一方もしくは両方の末端に1つ以上のハイブリダイズしていないヌクレオシド(オーバーハング)及び/または1つ以上のハイブリダイズしていない内部ヌクレオシド(ミスマッチ)を有しうる。

「有効量」とは、ある活性医薬剤を必要とする個体において所望する生理学的結果を実現するのに十分な前記活性医薬剤の量を意味する。有効量は、処置される個体の健康状態及び身体状態、処置される個体の分類群、組成物の製剤、個体の医学的状態の評価、及び他の関連因子に依存して個体間で変動しうる。

「効力」とは、所望の効果を生じさせる能力を意味する。

「発現」には、遺伝子にコードされている情報を、細胞中に存在し細胞中で作動する構造物へと変換する機能のすべてが含まれる。そのような構造物として、転写産物及び翻訳産物が挙げられるが、これらに限定されない。

「完全に相補的」または「100%相補的」とは、第1核酸の各核酸塩基が第2核酸中に相補的核酸塩基を有することを意味する。特定の実施形態では、第1核酸がアンチセンス化合物であり、標的核酸が第2核酸である。

「フラノシル」とは、4つの炭素原子と1つの酸素原子とを含む5員環を含む構造を意味する。

「ギャップマー」とは、キメラアンチセンス化合物であって、RNase H切断を支持する複数のヌクレオシドを有する内側領域が、1つ以上のヌクレオシドを有する外側領域の間に配置されており、内側領域を構成するヌクレオシドが、外側領域を構成する1または複数のヌクレオシドと化学的に異なっているものを意味する。前記内側領域を「ギャップ」と呼び、前記外側領域を「ウイング」と呼ぶことができる。

「ハロ」及び「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択される原子を意味する。

「ヘテロアリール」及び「ヘテロ芳香族」とは、単環式もしくは多環式芳香族環、環系、または縮合環系を含むラジカルであって、前記環のうちの少なくとも1つが芳香族であり、かつ1つ以上のヘテロ原子を含むものを意味する。ヘテロアリールは、縮合環のうちの1つ以上がヘテロ原子を含有していない系を含む縮合環系も包含するものとする。ヘテロアリール基は、典型的には、硫黄、窒素、または酸素から選択される1つの環原子を含む。ヘテロアリール基の例として、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、キノキサリニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアリールラジカルは、親分子に直接取り付けるか、または脂肪族基もしくはヘテロ原子などの連結部分を介して取り付けることができる。本明細書にいうヘテロアリール基は、場合によっては、さらなる置換基を含みうる。

「ハイブリダイゼーション」とは、相補的核酸分子のアニーリングを意味する。特定の実施形態では、相補的核酸分子に、アンチセンス化合物と核酸標的が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、相補的核酸分子に、アンチセンスオリゴヌクレオチドと核酸標的が含まれるが、これらに限定されない。

「ある疾患、障害及び/または状態を有するか、またはそれらを有するリスクがある動物を同定する」とは、前記疾患、障害及び/または状態と診断された動物を同定すること、あるいは前記疾患、障害及び/または状態を発症する素因を有する動物を同定することを意味する。そのような同定は、個体の病歴を評価することや標準的な臨床検査または臨床評価を含む任意の方法によって達成することができる。

「直接隣り合っている」とは、直接隣り合っている要素の間に介在する要素が存在しないことを意味する。

「個体」とは、処置または治療のために選ばれたヒトまたはヒト以外の動物を意味する。

「発現または活性を阻害する」とは、発現または活性の低減、遮断を指し、必ずしも発現または活性の完全な排除を示すわけではない。

「ヌクレオシド間連結部」とは、ヌクレオシド間の化学結合を指す。

「ヌクレオシド間中性連結基」とは、2つのヌクレオシドを直接連結する中性連結基を意味する。

「ヌクレオシド間リン連結基」とは、2つのヌクレオシドを直接連結するリン連結基を意味する。

「延長された」アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書に開示するアンチセンスオリゴヌクレオチドとの比較で、1つ以上の追加ヌクレオシドを有するものである。

「連結部モチーフ」とは、オリゴヌクレオチドまたはその一領域における連結部修飾のパターンを意味する。そのようなオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは修飾されていても無修飾でもよい。別段の表示がある場合を除き、連結部の説明しかない本明細書におけるモチーフは、連結部モチーフであるものとする。したがって、そのような事例では、ヌクレオシドは限定されない。

「連結されたデオキシヌクレオシド」とは、デオキシリボースで置換された核酸塩基(A、G、C、T、U)が、リン酸エステルで連結されているものを意味する。

「連結されたヌクレオシド」とは、ヌクレオシド間連結部によって一つに連結された隣り合うヌクレオシドを意味する。

「ロックト核酸ヌクレオシド」または「LNA」とは、4’−CH2−O−2’橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオシドを意味する。

「ミスマッチ」または「非相補的核酸塩基」とは、第1核酸の核酸塩基が第2核酸または標的核酸の対応する核酸塩基と対合できない場合を指す。

「修飾ヌクレオシド間連結部」とは、天然に存在するヌクレオシド間結合(すなわちホスホジエステルヌクレオシド間結合)からの置換または何らかの改変を指す。

「修飾核酸塩基」とは、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、またはウラシル以外の任意の核酸塩基を意味する。「無修飾核酸塩基」とは、プリン塩基で(A)及びグアニン(G)、ならびにピリミジン塩基であるチミン(T)、シトシン(C)及びウラシル(U)を意味する。

「修飾ヌクレオシド」とは、修飾糖部分及び/または修飾核酸塩基を独立して有するヌクレオシドを意味する。

「修飾ヌクレオチド」とは、修飾糖部分、修飾ヌクレオチド間連結部、または修飾核酸塩基を独立して有するヌクレオチドを意味する。

「修飾オリゴヌクレオチド」とは、少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間連結部、修飾糖、及び/または修飾核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドを意味する。

「修飾糖」とは、天然糖部分からの置換及び/または何らかの改変を意味する。

「調節する」とは、細胞、組織、器官または生物における特徴を変化させまたは調整することを指す。例えば、CFB mRNAを調節するとは、細胞、組織、器官、または生物におけるCFB mRNA及び/またはCFBタンパク質のレベルを増加または減少させることを意味しうる。「調節因子」は、細胞、組織、器官または生物における変化をもたらす。例えばCFBアンチセンス化合物は、細胞、組織、器官または生物におけるCFB mRNA及び/またはCFBタンパク質の量を減少させる調節因子であることができる。

「モノマー」とはオリゴマーの一単位を指す。モノマーとしては、天然に存在するものか修飾体かを問わず、ヌクレオシド及びヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。

「単環式または多環式の環系」という用語は、単環式または縮合されもしくは連結された多環式のラジカル環系から選択されるすべての環系を包含するものとし、脂肪族、脂環式、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アリールアルキル、複素環式、ヘテロアリール、ヘテロ芳香族、及びヘテロアリールアルキルから個別に選択される単一の環系及び混成環系を包含するものとする。そのような単環式及び多環式の構造は、それぞれが同一のレベルの飽和を有する環を含有するか、またはそれぞれが独立して、完全飽和、部分飽和、もしくは完全不飽和を含むさまざまな飽和度を有する環を含有することができる。各環は、複素環式環が生じるように、そしてまた、例えば一方の環が炭素環原子のみを有しかつ縮合している環が2つの窒素原子を有するベンズイミダゾールなどの混合モチーフに存在しうるC環原子のみを含む環が生じるように、C、N、O、及びSから選択される環原子を含むことができる。単環式または多環式の環系は、例えば一方の環に2つの=O基が取り付けられているフタルイミドのように、さらに置換基で置換することができる。単環式または多環式の環系は、環原子を介した直接結合、複数の環原子を介した縮合、置換基を介した結合、または二機能性連結部分を介した結合などといったさまざまな戦略を用いて、親分子に取り付けることができる。

「モチーフ」とは、アンチセンス化合物における無修飾ヌクレオシドと修飾ヌクレオシドのパターンを意味する。

「天然糖部分」とは、DNA(2’−H)またはRNA(2’−OH)に見いだされる糖部分を意味する。

「天然に存在するヌクレオシド間連結部」とは、3’→5’ホスホジエステル連結部を意味する。

「中性連結基」とは、荷電していない連結基を意味する。中性連結基には、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、MMI(−CH2−N(CH3)−O−)、アミド−3(−CH2−C(=O)−N(H)−)、アミド−4(−CH2−N(H)−C(=O)−)、ホルムアセタール(−O−CH2−O−)、及びチオホルムアセタール(−S−CH2−O−)などがあるが、これらに限定されない。さらに、中性連結基には、シロキサン(ジアルキルシロキサン)、カルボン酸エステル、カルボキサミド、硫化物、スルホン酸エステル、及びアミドを含む非イオン性連結部も含まれる(例えば「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」Y.S.Sanghvi及びP.D.Cook編,ACS Symposium Series 580;Chapter 3及び4(pp.40−65)を参照されたい)。さらに、中性連結基には、混合N、O、S、及びCH2成分パーツを含む非イオン性連結部も含まれる。

「非相補的核酸塩基」とは、互いに水素結合を形成せず、他のいかなる形でもハイブリダイゼーションを支持することのない、一対の核酸塩基を指す。

「非ヌクレオシド間中性連結基とは、2つのヌクレオシドを直接連結しない中性連結基を意味する。特定の実施形態では、非ヌクレオシド間中性連結基が、ヌクレオシドをヌクレオシド以外の基に連結する。特定の実施形態では、非ヌクレオシド間中性連結基は、どちらもヌクレオシドではない2つの基を連結する。

「非ヌクレオシド間リン連結基」とは、2つのヌクレオシドを直接連結しないリン連結基を意味する。特定の実施形態では、非ヌクレオシド間リン連結基がヌクレオシドをヌクレオシド以外の基に連結する。特定の実施形態では、非ヌクレオシド間リン連結基が、どちらもヌクレオシドではない2つの基を連結する。

「核酸」とは、モノマー型ヌクレオチドで構成された分子を指す。核酸には、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、一本鎖核酸、及び二本鎖核酸などがあるが、これらに限定されない。

「核酸塩基」とは、もう一つの核酸の塩基と対合することができる複素環式部分を意味する。

「核酸塩基相補性」とは、もう一つの核酸塩基と塩基対合することができる核酸塩基を指す。例えばDNAでは、アデニン(A)がチミン(T)と相補的である。例えばRNAでは、アデニン(A)がウラシル(U)と相補的である。特定の実施形態では、相補的核酸塩基とは、アンチセンス化合物の核酸塩基であって、その標的核酸の核酸塩基と塩基対合することができるものを指す。例えば、あるアンチセンス化合物の特定の位置にある核酸塩基が標的核酸の特定の位置にある核酸塩基と水素結合することができるなら、前記オリゴヌクレオチドと前記標的核酸の間の水素結合の位置は、それら核酸塩基対において相補的であるとみなされる。

「核酸塩基修飾モチーフ」とは、オリゴヌクレオチドに沿った核酸塩基への修飾のパターンを意味する。別段の表示がある場合を除き、核酸塩基修飾モチーフは、核酸塩基配列に依存しない。

「核酸塩基配列」とは、連続する核酸塩基の順序を意味し、糖、連結部、及び/または核酸塩基修飾には依存しない。

「ヌクレオシド」とは、糖に連結された核酸塩基を意味する。

「ヌクレオシド模倣物」には、例えばモルホリノ、シクロヘキセニル、シクロヘキシル、テトラヒドロピラニル、ビシクロまたはトリシクロ糖模倣物、例えば非フラノース糖単位を有するヌクレオシド模倣物などといった、オリゴマー化合物の1つ以上の位置において糖または糖及び塩基を置き換えるため(連結部は必ずしも置き換えられない)に使用される構造が含まれる。ヌクレオチド模倣物には、例えばペプチド核酸またはモルホリノ(−N(H)−C(=O)−O−または他の非ホスホジエステル連結部によって連結されたモルホリノ)などといった、オリゴマー化合物の1つ以上の位置においてヌクレオシド及び連結部を置き換えるために使用される構造が含まれる。糖代用物は、わずかに広い意味を持つ用語であるヌクレオシド模倣物と一部重複するが、糖単位(フラノース環)のみの置き換えを示すものとする。ここに提供するテトラヒドロピラニル環は、フラノース糖基がテトラヒドロピラニル環系で置き換えられた糖代用物の一例を例示するものである。「模倣物」とは、糖、核酸塩基、及び/またはヌクレオシド間連結部の代わりに使用される基を指す。一般的には、模倣物は、糖または糖−ヌクレオシド間連結部の組み合わせの代わりに使用され、核酸塩基は、選ばれたターゲットへのハイブリダイゼーションのために維持される。

「ヌクレオシドモチーフ」とは、オリゴヌクレオチドまたはその一領域におけるヌクレオシド修飾のパターンを意味する。そのようなオリゴヌクレオチドの連結部は修飾されていても無修飾であってもよい。別段の表示がある場合を除き、ヌクレオシドの説明しかない本明細書におけるモチーフは、ヌクレオシドモチーフであるものとする。したがって、そのような事例では、連結部は限定されない。

「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分にリン酸基が共有結合で連結されているヌクレオシドを意味する。

「オリゴマー化合物」とは、連結されたモノマー型サブユニットのポリマーであって、核酸分子の少なくとも一領域にハイブリダイズすることができるものを意味する。

「オリゴヌクレオシド」とは、ヌクレオシド間連結部がリン原子を含有しないオリゴヌクレオチドを意味する。

「オリゴヌクレオチド」とは、連結されたヌクレオシドのポリマーを意味し、ヌクレオシドのそれぞれは互いに依存することなく修飾されていても無修飾でもよい。

「非経口投与」とは、注射または注入による投与を意味する。非経口投与には、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または頭蓋内投与、例えば髄腔内投与もしくは脳室内投与が含まれる。

「医薬組成物」とは、個体への投与に適した物質の混合物を意味する。例えば医薬組成物は1つ以上の活性医薬剤と滅菌水溶液とを含みうる。

「医薬上許容される塩」とは、アンチセンス化合物の生理学的かつ医薬的に許容される塩、すなわち、親オリゴヌクレオチドの望ましい生物学的活性を保持しており、しかも望ましくない毒性効果をそこに付与しない塩を意味する。

「ホスホロチオエート連結部」とは、ホスホジエステル結合が非架橋酸素原子の1つを硫黄原子で置き換えることによって修飾されているヌクレオシド間の連結部を意味する。ホスホロチオエート連結部は修飾ヌクレオシド間連結部である。

「リン連結基」とは、リン原子を含む連結基を意味する。リン連結基には、以下の式を有する基が含まれるが、これに限定されない:

式中、 R_a及びR_dはそれぞれ、独立して、O、S、CH₂、NH、またはNJ₁であり、J₁は、C₁〜C₆アルキルまたは置換C₁〜C₆アルキルであり、 R_bは、OまたはSであり、 R_cは、OH、SH、C₁〜C₆アルキル、置換C₁〜C₆アルキル、C₁〜C₆アルコキシ、置換C₁〜C₆アルコキシ、アミノ、または置換アミノであり、 J₁は、R_bは、OまたはSである。 リン連結基には、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホネート、ホスホラミデート、ホスホロチオアミデート、チオノアルキルホスホネート、ホスホトリエステル、チオノアルキルホスホトリエステル、及びボラノホスフェートが含まれるが、これらに限定されない。

「一部分(portion)」とは、核酸の、所定の数の連続する(すなわち連結された)核酸塩基を意味する。特定の実施形態では、一部分が、標的核酸の、所定の数の連続する核酸塩基である。特定の実施形態では、一部分が、アンチセンス化合物の、所定の数の連続する核酸塩基である。

「防止」とは、数分から無限までのある期間にわたって、疾患、障害、または状態の発症、発生または進行を遅延させまたは未然に防ぐことを指す。防止は、疾患、障害、または状態が発生するリスクを低減することも意味する。

「プロドラッグ」とは、不活性な形態または活性が低い形態の化合物であって、対象に投与した場合に、代謝されることで活性なまたはより活性な化合物(例えば薬物)を形成するものを意味する。

「予防有効量」とは、動物に予防的利益または防止的利益を与える医薬剤の量を指す。

「保護基」とは、当業者に知られている任意の化合物または保護基を意味する。保護基の非限定的な例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる「Protective Groups in Organic Chemistry」T.W.Greene,P.G.M.Wuts,ISBN0−471−62301−6,John Wiley & Sons,Inc,ニューヨークに見いだすことができる。

「領域」は、少なくとも1つの同定可能な構造、機能、または特徴を有する標的核酸の一部分と定義される。

「リボヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの糖部分の2’位にヒドロキシを有するヌクレオチドを意味する。リボヌクレオチドはさまざまな置換基のいずれでも修飾することができる。

「RISCベースのアンチセンス化合物」とは、当該アンチセンス化合物のアンチセンス活性の少なくとも一部がRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に起因するアンチセンス化合物を意味する。

「RNase Hベースのアンチセンス化合物」とは、当該アンチセンス化合物のアンチセンス活性の少なくとも一部が、標的核酸へのアンチセンス化合物のハイブリダイゼーションと、それに続くRNase Hによる標的核酸の切断に起因する、アンチセンス化合物を意味する。

「セグメント」は、標的核酸内の領域の、さらに小さな一部分または下位部分と定義される。

「別個の領域」とは、オリゴヌクレオチドの複数の部分であって、任意の隣接する部分の化学修飾または化学修飾のモチーフが、当該別個の領域を互いに区別することを可能にする少なくとも1つの相違点を含むものを意味する。

「配列モチーフ」とは、オリゴヌクレオチドまたはその一部分に沿って配置された核酸塩基のパターンを意味する。別段の表示がある場合を除き、配列モチーフは化学修飾には依存しないので、化学修飾なしを含めて、化学修飾の任意の組み合わせを有しうる。

「副作用」とは、処置に起因する所望の効果以外の生理学的疾患及び/または状態を意味する。特定の実施形態では、副作用に、注射部位反応、肝機能検査異常、腎機能検査異常、肝毒性、腎毒性、中枢神経系異常、ミオパシー、及び倦怠感が含まれる。例えば、血清中のアミノトランスフェラーゼレベルの増加は、肝毒性または肝機能異常を示しうる。例えば、ビリルビンの増加は、肝毒性及び肝機能異常を示しうる。

本明細書にいう「部位」は、標的核酸内のユニークな核酸塩基位置と定義される。

「進行を減速する」とは、該疾患の発達の減少を意味する。

「特異的にハイブリダイズ可能」とは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸との間に、特異的結合が望まれる条件下で、すなわちインビボアッセイや治療的処置の場合は生理的条件下で、所望の効果を誘導すると共に非標的核酸には最小限の効果しか呈さないかまたは効果を全く呈さないような、十分な相補度を有するアンチセンス化合物を指す。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」とは、オリゴマー化合物がそのターゲット配列にはハイブリダイズするが、他の配列にはごくわずかな数の配列にしかハイブリダイズしないような条件を指す。

「対象」とは、処置または治療のために選択されたヒトまたはヒト以外の動物を意味する。

「置換基(substituent)」及び「置換基(substituent group)」とは、指名された親化合物の原子または基を置換する原子または基を意味する。例えば、修飾ヌクレオシドの置換基は、天然に存在するヌクレオシドに見られる原子または基とは異なる任意の原子または基である(例えば修飾2’−置換基はヌクレオシドの2’位にあるHまたはOH以外の任意の原子または基である)。置換基は、保護されていても保護されていなくてもよい。特定の実施形態では、本開示の化合物は、親化合物の1つの位置または2つ以上の位置に置換基を有する。置換基は、他の置換基でさらに置換されていてもよく、親化合物に直接取り付けるか、またはアルキル基もしくはヒドロカルビル基などの連結基を介して取り付けることができる。

同様に、本明細書において使用する場合、化学官能基に関して「置換基」とは、指名された官能基に通常存在する原子または原子団とは異なる原子または原子団を意味する。特定の実施形態では、置換基が官能基の水素原子を置き換える(例えば特定の実施形態では、置換メチル基の置換基は、無置換メチル基の水素原子のうちの1つを置き換える水素以外の原子または基である)。別段の表示がある場合を除き、置換基としての使用に適する基には、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル(−C(O)Raa)、カルボキシル(−C(O)O−Raa)、脂肪族基、脂環式基、アルコキシ、置換オキシ(−O−Raa)、アリール、アラルキル、複素環式ラジカル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アミノ(N(Rbb)(Rcc))、イミノ(=NRbb)、アミド(C(O)N(Rbb)(Rcc)またはN(Rbb)C(O)Raa)、アジド(−N3)、ニトロ(NO2)、シアノ(−CN)、カルバミド(OC(O)N(Rbb)(Rcc)またはN(Rbb)C(O)ORaa)、ウレイド(N(Rbb)C(O)N(Rbb)(Rcc))、チオウレイド(N(Rbb)C(S)N(Rbb)(Rcc))、グアニジニル(N(Rbb)C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc))、アミジニル(C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc)またはN(Rbb)C(=NRbb)(Raa))、チオール(−SRbb)、スルフィニル(S(O)Rbb)、スルホニル(−S(O)2Rbb)、及びスルホンアミジル(−S(O)2N(Rbb)(Rcc)またはN(Rbb)S(O)2Rbb)が含まれるが、これらに限定されない。式中、各Raa、Rbb、及びRccは、独立して、H、場合によっては連結された化学官能基、またはさらなる置換基であり,好ましいものとしては、アルキル、アルケニル、アルキニル、脂肪族、アルコキシ、アシル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、脂環式、複素環式、及びヘテロアリールアルキルが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載する化合物内の選ばれた置換基は、再帰的に(to a recursive degree)存在する。

「置換糖部分」とは、天然に存在する糖部分ではないフラノシルを意味する。置換糖部分には、2’位、3’位、5’位及び/または4’位に置換基を含むフラノシルなどがあるが、これらに限定されない。特定の置換糖部分は二環式糖部分である。

「糖部分」とは、ヌクレオシドの天然に存在する糖部分または修飾糖部分を意味する。

「糖モチーフ」とは、オリゴヌクレオチドまたはその一領域における糖修飾のパターンを意味する。

「糖代用物」とは、フラノシルを含まない構造であって、しかも、結果として生じるヌクレオシドサブユニットを一つに連結しかつ/または他のヌクレオシドに連結することで相補的なオリゴマー化合物にハイブリダイズすることができるオリゴマー化合物を形成することができるように、ヌクレオシドの天然に存在する糖部分を置き換えることができる構造を意味する。そのような構造には、フラノシルとは異なる数の原子を含むか(例えば4、6、または7員環)、または非酸素原子(例えば炭素、硫黄、もしくは窒素)によるフラノシルの酸素の置き換え、または原子数の変化と酸素の置き換えとの両方が含まれる。そのような構造は、置換糖部分(例えば場合によってはさらなる置換基を含む6員炭素環式二環式糖代用物)について記載したものに対応する置換も含みうる。糖代用物は、さらに複雑な糖の代替物(例えばペプチド核酸の非環系)も包含する。糖代用物には、モルホリノ、シクロヘキセニル及びシクロヘキシトールなどがあるが、これらに限定されない。

「標的」とは、調節することが望まれるタンパク質を指す。

「標的遺伝子」とは、標的をコードする遺伝子を指す。

「ターゲティング」とは、標的核酸に特異的にハイブリダイズして所望の効果を誘導することになるアンチセンス化合物を設計及び選択するプロセスを意味する。

「標的核酸」、「標的RNA」、「標的RNA転写産物」及び「核酸標的」は、いずれも、アンチセンス化合物の標的となりうる核酸を意味する。

「標的領域」とは、標的核酸のうち、1つ以上のアンチセンス化合物の標的となる部分を意味する。

「標的セグメント」とは、標的核酸のうち、アンチセンス化合物が標的とするヌクレオチドの配列を意味する。「5’標的部位」とは、標的セグメントの最も5’側のヌクレオチドを指す。「3’標的部位」とは、標的セグメントの最も3’側のヌクレオチドを指す。

「末端基」とは、オリゴヌクレオチドの3’末端もしくは5’末端のいずれか、またはそれらの両方に取り付けられた1つ以上の原子を意味する。特定の実施形態では、末端基が共役基である。特定の実施形態では、末端基が1つ以上の末端基ヌクレオシドを含む。

「末端ヌクレオシド間連結部」とは、オリゴヌクレオチドまたはその所定の領域の少なくとも2つのヌクレオシド間の連結部を意味する。

「治療有効量」とは、個体に治療的利益を与える医薬剤の量を意味する。

「処置する」とは、動物における疾患、障害、または状態の改変または改善を達成するために、前記動物に医薬組成物を投与することを指す。特定の実施形態では、1つ以上の医薬組成物を前記動物に投与することができる。

「無修飾」核酸塩基とは、プリン塩基であるアデニン(A)及びグアニン(G)、ならびにピリミジン塩基であるチミン(T)、シトシン(C)及びウラシル(U)を意味する。

「無修飾ヌクレオチド」とは、天然に存在する核酸塩基、糖部分及びヌクレオシド間連結部で構成されるヌクレオシドを意味する。特定の実施形態では、無修飾ヌクレオチドがRNAヌクレオチド(すなわちβ−D−リボヌクレオシド)またはDNAヌクレオチド(すなわちβ−D−デオキシリボヌクレオシド)である。

特定の実施形態 特定の実施形態は、補体B因子(CFB)発現を阻害するための方法、化合物及び組成物を提供する。

特定の実施形態は、CFB核酸を標的とするアンチセンス化合物を提供する。特定の実施形態では、前記CFB核酸が、GENBANKアクセッション番号NM_001710.5(配列番号1として本明細書に組み込まれる)、ヌクレオチド31852000から31861000までを切り出したGENBANKアクセッション番号NT_007592.15(配列番号2として本明細書に組み込まれる)、ヌクレオチド536000から545000までを切り出したGENBANKアクセッション番号NW_001116486.1(配列番号3として本明細書に組み込まれる)、GENBANKアクセッション番号XM_001113553.2(配列番号4として本明細書に組み込まれる)、またはGENBANKアクセッション番号NM_008198.2(配列番号5として本明細書に組み込まれる)に示される配列を有する。

特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが10〜30個の連結されたヌクレオシドからなり、配列番号6〜808の核酸塩基配列のいずれかのうちの少なくとも8個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有するものを提供する。

特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが10〜30個の連結されたヌクレオシドからなり、配列番号6〜808の核酸塩基配列のいずれかのうちの少なくとも9個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有するものを提供する。

特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが10〜30個の連結されたヌクレオシドからなり、配列番号6〜808の核酸塩基配列のいずれかのうちの少なくとも10個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有するものを提供する。

特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが10〜30個の連結されたヌクレオシドからなり、配列番号6〜808の核酸塩基配列のいずれかのうちの少なくとも11個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有するものを提供する。

特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが10〜30個の連結されたヌクレオシドからなり、配列番号6〜808の核酸塩基配列のいずれかのうちの少なくとも12個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有するものを提供する。

特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが10〜30個の連結されたヌクレオシドからなり、配列番号6〜808のいずれか一つの核酸塩基配列を含む核酸塩基配列を有するものを提供する。

特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが配列番号6〜808のいずれか一つの核酸塩基配列からなるものを提供する。

特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号1の核酸塩基30〜49、48〜63、150〜169、151〜170、152〜171、154〜169、154〜173、156〜171、156〜175、157〜176、158〜173、158〜177、480〜499、600〜619、638〜657、644〜663、738〜757、1089〜1108、1135〜1154、1141〜1160、1147〜1166、1150〜1169、1153〜1172、1159〜1178、1162〜1181、1165〜1184、1171〜1186、1171〜1190、1173〜1188、1173〜1192、1175〜1190、1175〜1194、1177〜1196、1183〜1202、1208〜1227、1235〜1254、1298〜1317、1304〜1323、1310〜1329、1316〜1335、1319〜1338、1322〜1341、1328〜1347、1349〜1368、1355〜1374、1393〜1412、1396〜1415、1399〜1418、1405〜1424、1421〜1440、1621〜1640、1646〜1665、1646〜1665、1647〜1666、1689〜1708、1749〜1768、1763〜1782、1912〜1931、2073〜2092、2085〜2104、2166〜2185、2172〜2191、2189〜2208、2191〜2210、2193〜2212、2195〜2210、2195〜2214、2196〜2215、2197〜2212、2197〜2216、2202〜2221、2223〜2238、2223〜2242、2225〜2240、2226〜2245、2227〜2242、2227〜2246、2238〜2257、2241〜2260、2267〜2286、2361〜2380、2388〜2407、2397〜2416、2448〜2467、2453〜2472、2455〜2474、2457〜2472、2457〜2476、2459〜2474、2459〜2478、2461〜2476、2461〜2480、2532〜2551、2550〜2569、2551〜2566、2551〜2570、2552〜2568、2552〜2570、2552〜2571、2553〜2568、2553〜2570、2553〜2571、2553〜2572、2554〜2571、2554〜2572、2554〜2573、2555〜2570、2555〜2572、2555〜2574、2556〜2573、2556〜2574、2556〜2575、2557〜2573、2557〜2574、2557〜2575、2557〜2576、2558〜2575、2558〜2576、2558〜2577、2559〜2576、2559〜2577、2559〜2578、2560〜2577、2560〜2578、2560〜2579、2561〜2576、2561〜2578、2561〜2579、2561〜2580、2562〜2577、2562〜2579、2562〜2581、2563〜2578、2563〜2580、2563〜2582、2564〜2581、2564〜2583、2565〜2584、2566〜2583、2566〜2585、2567〜2582、2567〜2584、2567〜2586、2568〜2583、2568〜2585、2568〜2587、2569〜2586、2569〜2588、2570〜2585、2570〜2587、2570〜2589、2571〜2586、2571〜2588、2571〜2590、2572〜2589、2572〜2590、2572〜2591、2573〜2590、2573〜2592、2574〜2590、2574〜2591、2574〜2593、2575〜2590、2575〜2591、2575〜2592、2575〜2594、2576〜2593、2576〜2595、2577〜2594、2577〜2595、2577〜2596、2578〜2594、2578〜2596、2578〜2597、2579〜2598、2580〜2596、2580〜2597、2580〜2598、2580〜2599、2581〜2597、2581〜2598、2581〜2599、2581〜2600、2582〜2598、2582〜2599、2582〜2600、2582〜2601、2583〜2599、2583〜2600、2583〜2601、2583〜2602、2584〜2600、2584〜2601、2584〜2602、2584〜2603、2585〜2601、2585〜2603、2585〜2604、2586〜2601、2586〜2602、2586〜2604、2586〜2605、2587〜2602、2587〜2603、2587〜2605、2587〜2606、2588〜2603、2588〜2604、2588〜2605、2588〜2606、2588〜2607、2589〜2604、2589〜2605、2589〜2606、2589〜2607、2589〜2608、2590〜2605、2590〜2606、2590〜2607、2590〜2608、2590〜2609、2590〜2609、2591〜2607、2591〜2608、2591〜2609、2591〜2610、2592〜2607、2592〜2608、2592〜2609、2592〜2610、2592〜2611、2593〜2608、2593〜2609、2593〜2610、2593〜2612、2594〜2609、2594〜2610、2594〜2611、2594〜2612、2594〜2613、2595〜2610、2595〜2611、2595〜2612、2595〜2613、2595〜2614、2596〜2611、2596〜2612、2596〜2613、2596〜2614、2596〜2615、2597〜2612、2597〜2612、2597〜2613、2597〜2614、2597〜2615、2597〜2616、2598〜2613、2598〜2614、2598〜2615、2598〜2616、2598〜2617、2599〜2614、2599〜2615、2599〜2616、2599〜2617、2599〜2618、2600〜2615、2600〜2616、2600〜2617、2600〜2618、2600〜2619、2601〜2616、2601〜2617、2601〜2618、2601〜2619、2601〜2620、2602〜2617、2602〜2618、2602〜2619、2602〜2620、2602〜2621、2603〜2618、2603〜2619、2603〜2620、2603〜2621、2603〜2622、2604〜2619、2604〜2620、2604〜2621、2604〜2622、2604〜2623、2605〜2620、2605〜2621、2605〜2622、2605〜2623、2605〜2624、2606〜2621、2606〜2622、2606〜2623、2606〜2624、2606〜2625、2607〜2622、2607〜2623、2607〜2624、2607〜2625、2607〜2626、2608〜2623、2608〜2624、2608〜2625、2608〜2626、2608〜2627、2609〜2624、2609〜2625、2609〜2626、2609〜2627、2609〜2628、2610〜2625、2610〜2626、2610〜2627、2610〜2628、2610〜2629、2611〜2626、2611〜2627、2611〜2628、2611〜2629、2611〜2630、2612〜2627、2612〜2628、2612〜2629、2612〜2630、2612〜2631、2613〜2628、2613〜2629、2613〜2630、2613〜2631、2614〜2629、2614〜2630、2614〜2631、2615〜2630、2615〜2631、または2616〜2631内で相補的な10〜30個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ該修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号1に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%相補的であるものを提供する。

特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号1の核酸塩基30〜49、48〜63、150〜169、151〜170、152〜171、154〜169、154〜173、156〜171、156〜175、157〜176、158〜173、158〜177、480〜499、600〜619、638〜657、644〜663、738〜757、1089〜1108、1135〜1154、1141〜1160、1147〜1166、1150〜1169、1153〜1172、1159〜1178、1162〜1181、1165〜1184、1171〜1186、1171〜1190、1173〜1188、1173〜1192、1175〜1190、1175〜1194、1177〜1196、1183〜1202、1208〜1227、1235〜1254、1298〜1317、1304〜1323、1310〜1329、1316〜1335、1319〜1338、1322〜1341、1328〜1347、1349〜1368、1355〜1374、1393〜1412、1396〜1415、1399〜1418、1405〜1424、1421〜1440、1621〜1640、1646〜1665、1646〜1665、1647〜1666、1689〜1708、1749〜1768、1763〜1782、1912〜1931、2073〜2092、2085〜2104、2166〜2185、2172〜2191、2189〜2208、2191〜2210、2193〜2212、2195〜2210、2195〜2214、2196〜2215、2197〜2212、2197〜2216、2202〜2221、2223〜2238、2223〜2242、2225〜2240、2226〜2245、2227〜2242、2227〜2246、2238〜2257、2241〜2260、2267〜2286、2361〜2380、2388〜2407、2397〜2416、2448〜2467、2453〜2472、2455〜2474、2457〜2472、2457〜2476、2459〜2474、2459〜2478、2461〜2476、2461〜2480、2532〜2551、2550〜2569、2551〜2566、2551〜2570、2552〜2568、2552〜2570、2552〜2571、2553〜2568、2553〜2570、2553〜2571、2553〜2572、2554〜2571、2554〜2572、2554〜2573、2555〜2570、2555〜2572、2555〜2574、2556〜2573、2556〜2574、2556〜2575、2557〜2573、2557〜2574、2557〜2575、2557〜2576、2558〜2575、2558〜2576、2558〜2577、2559〜2576、2559〜2577、2559〜2578、2560〜2577、2560〜2578、2560〜2579、2561〜2576、2561〜2578、2561〜2579、2561〜2580、2562〜2577、2562〜2579、2562〜2581、2563〜2578、2563〜2580、2563〜2582、2564〜2581、2564〜2583、2565〜2584、2566〜2583、2566〜2585、2567〜2582、2567〜2584、2567〜2586、2568〜2583、2568〜2585、2568〜2587、2569〜2586、2569〜2588、2570〜2585、2570〜2587、2570〜2589、2571〜2586、2571〜2588、2571〜2590、2572〜2589、2572〜2590、2572〜2591、2573〜2590、2573〜2592、2574〜2590、2574〜2591、2574〜2593、2575〜2590、2575〜2591、2575〜2592、2575〜2594、2576〜2593、2576〜2595、2577〜2594、2577〜2595、2577〜2596、2578〜2594、2578〜2596、2578〜2597、2579〜2598、2580〜2596、2580〜2597、2580〜2598、2580〜2599、2581〜2597、2581〜2598、2581〜2599、2581〜2600、2582〜2598、2582〜2599、2582〜2600、2582〜2601、2583〜2599、2583〜2600、2583〜2601、2583〜2602、2584〜2600、2584〜2601、2584〜2602、2584〜2603、2585〜2601、2585〜2603、2585〜2604、2586〜2601、2586〜2602、2586〜2604、2586〜2605、2587〜2602、2587〜2603、2587〜2605、2587〜2606、2588〜2603、2588〜2604、2588〜2605、2588〜2606、2588〜2607、2589〜2604、2589〜2605、2589〜2606、2589〜2607、2589〜2608、2590〜2605、2590〜2606、2590〜2607、2590〜2608、2590〜2609、2590〜2609、2591〜2607、2591〜2608、2591〜2609、2591〜2610、2592〜2607、2592〜2608、2592〜2609、2592〜2610、2592〜2611、2593〜2608、2593〜2609、2593〜2610、2593〜2612、2594〜2609、2594〜2610、2594〜2611、2594〜2612、2594〜2613、2595〜2610、2595〜2611、2595〜2612、2595〜2613、2595〜2614、2596〜2611、2596〜2612、2596〜2613、2596〜2614、2596〜2615、2597〜2612、2597〜2612、2597〜2613、2597〜2614、2597〜2615、2597〜2616、2598〜2613、2598〜2614、2598〜2615、2598〜2616、2598〜2617、2599〜2614、2599〜2615、2599〜2616、2599〜2617、2599〜2618、2600〜2615、2600〜2616、2600〜2617、2600〜2618、2600〜2619、2601〜2616、2601〜2617、2601〜2618、2601〜2619、2601〜2620、2602〜2617、2602〜2618、2602〜2619、2602〜2620、2602〜2621、2603〜2618、2603〜2619、2603〜2620、2603〜2621、2603〜2622、2604〜2619、2604〜2620、2604〜2621、2604〜2622、2604〜2623、2605〜2620、2605〜2621、2605〜2622、2605〜2623、2605〜2624、2606〜2621、2606〜2622、2606〜2623、2606〜2624、2606〜2625、2607〜2622、2607〜2623、2607〜2624、2607〜2625、2607〜2626、2608〜2623、2608〜2624、2608〜2625、2608〜2626、2608〜2627、2609〜2624、2609〜2625、2609〜2626、2609〜2627、2609〜2628、2610〜2625、2610〜2626、2610〜2627、2610〜2628、2610〜2629、2611〜2626、2611〜2627、2611〜2628、2611〜2629、2611〜2630、2612〜2627、2612〜2628、2612〜2629、2612〜2630、2612〜2631、2613〜2628、2613〜2629、2613〜2630、2613〜2631、2614〜2629、2614〜2630、2614〜2631、2615〜2630、2615〜2631、または2616〜2631のうちの長さが等しい部分に相補的な少なくとも8個の連続する核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を有する10〜30個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、配列番号1に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%相補的であるものを提供する。

特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号2の核酸塩基1608〜1627、1685〜1704、1686〜1705、1751〜1770、1769〜1784、1871〜1890、1872〜1891、1873〜1892、1875〜1890、1875〜1894、1877〜1892、1877〜1896、1878〜1897、1879〜1894、1879〜1898、2288〜2307、2808〜2827、2846〜2865、2852〜2871、2946〜2965、3773〜3792、3819〜3838、3825〜3844、3831〜3850、3834〜3853、3837〜3856、3843〜3862、4151〜4166、4151〜4170、4153〜4172、4159〜4178、4184〜4203、4211〜4230、4609〜4628、4612〜4631、4615〜4634、4621〜4640、4642〜4661、4648〜4667、4686〜4705、4689〜4708、4692〜4711、4698〜4717、4714〜4733、5270〜5289、5295〜5314、5296〜5315、5830〜5849、5890〜5909、5904〜5923、6406〜6425、6662〜6681、6674〜6693、6954〜6973、6960〜6979、6977〜6996、6979〜6998、6981〜7000、6983〜6998、6983〜7002、6984〜7003、6985〜7000、6985〜7004、6990〜7009、7122〜7141、7125〜7144、7151〜7170、7353〜7372、7362〜7381、7683〜7702、7688〜7707、7690〜7709、7692〜7707、7692〜7711、7694〜7709、7694〜7713、7696〜7711、7696〜7715、7767〜7786、7785〜7804、7786〜7801、7787〜7803、7787〜7805、7787〜7806、7788〜7803、7788〜7805、7788〜7806、7788〜7807、7789〜7806、7789〜7807、7789〜7808、7790〜7805、7790〜7807、7790〜7809、7791〜7808、7791〜7809、7791〜7810、7792〜7808、7792〜7809、7792〜7810、7792〜7811、7793〜7810、7793〜7811、7793〜7812、7794〜7811、7794〜7812、7794〜7813、7795〜7812、7795〜7813、7795〜7814、7796〜7811、7796〜7813、7796〜7814、7796〜7815、7797〜7812、7797〜7814、7797〜7816、7798〜7813、7798〜7815、7798〜7817、7799〜7816、7799〜7818、7800〜7819、7801〜7818、7801〜7820、7802〜7817、7802〜7819、7802〜7821、7803〜7818、7803〜7820、7803〜7822、7804〜7821、7804〜7823、7805〜7820、7805〜7822、7805〜7824、7806〜7821、7806〜7823、7806〜7825、7807〜7824、7807〜7825、7807〜7826、7808〜7825、7808〜7827、7809〜7825、7809〜7826、7809〜7828、7810〜7825、7810〜7826、7810〜7827、7810〜7829、7811〜7828、7811〜7830、7812〜7829、7812〜7830、7812〜7831、7813〜7829、7813〜7831、7813〜7832、7814〜7833、7815〜7831、7815〜7832、7815〜7833、7815〜7834、7816〜7832、7816〜7833、7816〜7834、7816〜7835、7817〜7833、7817〜7834、7817〜7835、7817〜7836、7818〜7834、7818〜7835、7818〜7836、7818〜7837、7819〜7835、7819〜7836、7819〜7837、7819〜7838、7820〜7836、7820〜7838、7820〜7839、7821〜7836、7821〜7837、7821〜7839、7821〜7840、7822〜7837、7822〜7838、7822〜7840、7822〜7841、7823〜7838、7823〜7839、7823〜7839、7823〜7840、7823〜7841、7823〜7842、7824〜7839、7824〜7840、7824〜7840、7824〜7841、7824〜7842、7824〜7843、7825〜7840、7825〜7841、7825〜7842、7825〜7843、7825〜7844、7826〜7842、7826〜7843、7826〜7844、7826〜7845、7827〜7842、7827〜7843、7827〜7844、7827〜7845、7827〜7846、7828〜7843、7828〜7844、7828〜7845、7828〜7847、7829〜7844、7829〜7845、7829〜7846、7829〜7847、7829〜7848、7830〜7845、7830〜7846、7830〜7847、7830〜7848、7830〜7849、7831〜7846、7831〜7847、7831〜7848、7831〜7849、7831〜7850、7832〜7847、7832〜7848、7832〜7849、7832〜7850、7832〜7851、7833〜7848、7833〜7849、7833〜7850、7833〜7851、7833〜7852、7834〜7849、7834〜7850、7834〜7851、7834〜7852、7834〜7853、7835〜7850、7835〜7851、7835〜7852、7835〜7853、7835〜7854、7836〜7851、7836〜7852、7836〜7853、7836〜7854、7836〜7855、7837〜7852、7837〜7853、7837〜7854、7837〜7855、7837〜7856、7838〜7853、7838〜7854、7838〜7855、7838〜7856、7838〜7857、7839〜7854、7839〜7855、7839〜7856、7839〜7857、7839〜7858、7840〜7855、7840〜7856、7840〜7857、7840〜7858、7840〜7859、7841〜7856、7841〜7857、7841〜7858、7841〜7859、7841〜7860、7842〜7857、7842〜7858、7842〜7859、7842〜7860、7842〜7861、7843〜7858、7843〜7859、7843〜7860、7843〜7861、7843〜7862、7844〜7859、7844〜7860、7844〜7861、7844〜7862、7845〜7860、7845〜7861、7845〜7862、7846〜7861、または7846〜7862内で相補的な10〜30個の連結されたヌクレオシドからなり、該修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号2に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%相補的であるものを提供する。

特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号2の核酸塩基1608〜1627、1685〜1704、1686〜1705、1751〜1770、1769〜1784、1871〜1890、1872〜1891、1873〜1892、1875〜1890、1875〜1894、1877〜1892、1877〜1896、1878〜1897、1879〜1894、1879〜1898、2288〜2307、2808〜2827、2846〜2865、2852〜2871、2946〜2965、3773〜3792、3819〜3838、3825〜3844、3831〜3850、3834〜3853、3837〜3856、3843〜3862、4151〜4166、4151〜4170、4153〜4172、4159〜4178、4184〜4203、4211〜4230、4609〜4628、4612〜4631、4615〜4634、4621〜4640、4642〜4661、4648〜4667、4686〜4705、4689〜4708、4692〜4711、4698〜4717、4714〜4733、5270〜5289、5295〜5314、5296〜5315、5830〜5849、5890〜5909、5904〜5923、6406〜6425、6662〜6681、6674〜6693、6954〜6973、6960〜6979、6977〜6996、6979〜6998、6981〜7000、6983〜6998、6983〜7002、6984〜7003、6985〜7000、6985〜7004、6990〜7009、7122〜7141、7125〜7144、7151〜7170、7353〜7372、7362〜7381、7683〜7702、7688〜7707、7690〜7709、7692〜7707、7692〜7711、7694〜7709、7694〜7713、7696〜7711、7696〜7715、7767〜7786、7785〜7804、7786〜7801、7787〜7803、7787〜7805、7787〜7806、7788〜7803、7788〜7805、7788〜7806、7788〜7807、7789〜7806、7789〜7807、7789〜7808、7790〜7805、7790〜7807、7790〜7809、7791〜7808、7791〜7809、7791〜7810、7792〜7808、7792〜7809、7792〜7810、7792〜7811、7793〜7810、7793〜7811、7793〜7812、7794〜7811、7794〜7812、7794〜7813、7795〜7812、7795〜7813、7795〜7814、7796〜7811、7796〜7813、7796〜7814、7796〜7815、7797〜7812、7797〜7814、7797〜7816、7798〜7813、7798〜7815、7798〜7817、7799〜7816、7799〜7818、7800〜7819、7801〜7818、7801〜7820、7802〜7817、7802〜7819、7802〜7821、7803〜7818、7803〜7820、7803〜7822、7804〜7821、7804〜7823、7805〜7820、7805〜7822、7805〜7824、7806〜7821、7806〜7823、7806〜7825、7807〜7824、7807〜7825、7807〜7826、7808〜7825、7808〜7827、7809〜7825、7809〜7826、7809〜7828、7810〜7825、7810〜7826、7810〜7827、7810〜7829、7811〜7828、7811〜7830、7812〜7829、7812〜7830、7812〜7831、7813〜7829、7813〜7831、7813〜7832、7814〜7833、7815〜7831、7815〜7832、7815〜7833、7815〜7834、7816〜7832、7816〜7833、7816〜7834、7816〜7835、7817〜7833、7817〜7834、7817〜7835、7817〜7836、7818〜7834、7818〜7835、7818〜7836、7818〜7837、7819〜7835、7819〜7836、7819〜7837、7819〜7838、7820〜7836、7820〜7838、7820〜7839、7821〜7836、7821〜7837、7821〜7839、7821〜7840、7822〜7837、7822〜7838、7822〜7840、7822〜7841、7823〜7838、7823〜7839、7823〜7839、7823〜7840、7823〜7841、7823〜7842、7824〜7839、7824〜7840、7824〜7840、7824〜7841、7824〜7842、7824〜7843、7825〜7840、7825〜7841、7825〜7842、7825〜7843、7825〜7844、7826〜7842、7826〜7843、7826〜7844、7826〜7845、7827〜7842、7827〜7843、7827〜7844、7827〜7845、7827〜7846、7828〜7843、7828〜7844、7828〜7845、7828〜7847、7829〜7844、7829〜7845、7829〜7846、7829〜7847、7829〜7848、7830〜7845、7830〜7846、7830〜7847、7830〜7848、7830〜7849、7831〜7846、7831〜7847、7831〜7848、7831〜7849、7831〜7850、7832〜7847、7832〜7848、7832〜7849、7832〜7850、7832〜7851、7833〜7848、7833〜7849、7833〜7850、7833〜7851、7833〜7852、7834〜7849、7834〜7850、7834〜7851、7834〜7852、7834〜7853、7835〜7850、7835〜7851、7835〜7852、7835〜7853、7835〜7854、7836〜7851、7836〜7852、7836〜7853、7836〜7854、7836〜7855、7837〜7852、7837〜7853、7837〜7854、7837〜7855、7837〜7856、7838〜7853、7838〜7854、7838〜7855、7838〜7856、7838〜7857、7839〜7854、7839〜7855、7839〜7856、7839〜7857、7839〜7858、7840〜7855、7840〜7856、7840〜7857、7840〜7858、7840〜7859、7841〜7856、7841〜7857、7841〜7858、7841〜7859、7841〜7860、7842〜7857、7842〜7858、7842〜7859、7842〜7860、7842〜7861、7843〜7858、7843〜7859、7843〜7860、7843〜7861、7843〜7862、7844〜7859、7844〜7860、7844〜7861、7844〜7862、7845〜7860、7845〜7861、7845〜7862、7846〜7861、及び7846〜7862のうちの長さが等しい部分に相補的な少なくとも8個の連続する核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を有する10〜30個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、配列番号2に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%相補的であるものを提供する。

特定の実施形態では、アンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドがCFB核酸の一領域を標的とする。特定の実施形態では、CFB核酸の一領域を標的とするそのような化合物またはオリゴヌクレオチドが、前記領域のうちの長さが等しい核酸塩基部分に相補的な連続する核酸塩基部分を有する。例えば前記部分は、本明細書に示す領域のうちの長さが等しい部分に相補的な、少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、または16個の連続する核酸塩基部分であることができる。特定の実施形態では、化合物が、共役体と配列番号1の以下のヌクレオチド領域を標的とする修飾オリゴヌクレオチドとを含むか、またはそれらからなる:30〜49、48〜63、150〜169、151〜170、152〜171、154〜169、154〜173、156〜171、156〜175、157〜176、158〜173、158〜177、480〜499、600〜619、638〜657、644〜663、738〜757、1089〜1108、1135〜1154、1141〜1160、1147〜1166、1150〜1169、1153〜1172、1159〜1178、1162〜1181、1165〜1184、1171〜1186、1171〜1190、1173〜1188、1173〜1192、1175〜1190、1175〜1194、1177〜1196、1183〜1202、1208〜1227、1235〜1254、1298〜1317、1304〜1323、1310〜1329、1316〜1335、1319〜1338、1322〜1341、1328〜1347、1349〜1368、1355〜1374、1393〜1412、1396〜1415、1399〜1418、1405〜1424、1421〜1440、1621〜1640、1646〜1665、1646〜1665、1647〜1666、1689〜1708、1749〜1768、1763〜1782、1912〜1931、2073〜2092、2085〜2104、2166〜2185、2172〜2191、2189〜2208、2191〜2210、2193〜2212、2195〜2210、2195〜2214、2196〜2215、2197〜2212、2197〜2216、2202〜2221、2223〜2238、2223〜2242、2225〜2240、2226〜2245、2227〜2242、2227〜2246、2238〜2257、2241〜2260、2267〜2286、2361〜2380、2388〜2407、2397〜2416、2448〜2467、2453〜2472、2455〜2474、2457〜2472、2457〜2476、2459〜2474、2459〜2478、2461〜2476、2461〜2480、2532〜2551、2550〜2569、2551〜2566、2551〜2570、2552〜2568、2552〜2570、2552〜2571、2553〜2568、2553〜2570、2553〜2571、2553〜2572、2554〜2571、2554〜2572、2554〜2573、2555〜2570、2555〜2572、2555〜2574、2556〜2573、2556〜2574、2556〜2575、2557〜2573、2557〜2574、2557〜2575、2557〜2576、2558〜2575、2558〜2576、2558〜2577、2559〜2576、2559〜2577、2559〜2578、2560〜2577、2560〜2578、2560〜2579、2561〜2576、2561〜2578、2561〜2579、2561〜2580、2562〜2577、2562〜2579、2562〜2581、2563〜2578、2563〜2580、2563〜2582、2564〜2581、2564〜2583、2565〜2584、2566〜2583、2566〜2585、2567〜2582、2567〜2584、2567〜2586、2568〜2583、2568〜2585、2568〜2587、2569〜2586、2569〜2588、2570〜2585、2570〜2587、2570〜2589、2571〜2586、2571〜2588、2571〜2590、2572〜2589、2572〜2590、2572〜2591、2573〜2590、2573〜2592、2574〜2590、2574〜2591、2574〜2593、2575〜2590、2575〜2591、2575〜2592、2575〜2594、2576〜2593、2576〜2595、2577〜2594、2577〜2595、2577〜2596、2578〜2594、2578〜2596、2578〜2597、2579〜2598、2580〜2596、2580〜2597、2580〜2598、2580〜2599、2581〜2597、2581〜2598、2581〜2599、2581〜2600、2582〜2598、2582〜2599、2582〜2600、2582〜2601、2583〜2599、2583〜2600、2583〜2601、2583〜2602、2584〜2600、2584〜2601、2584〜2602、2584〜2603、2585〜2601、2585〜2603、2585〜2604、2586〜2601、2586〜2602、2586〜2604、2586〜2605、2587〜2602、2587〜2603、2587〜2605、2587〜2606、2588〜2603、2588〜2604、2588〜2605、2588〜2606、2588〜2607、2589〜2604、2589〜2605、2589〜2606、2589〜2607、2589〜2608、2590〜2605、2590〜2606、2590〜2607、2590〜2608、2590〜2609、2590〜2609、2591〜2607、2591〜2608、2591〜2609、2591〜2610、2592〜2607、2592〜2608、2592〜2609、2592〜2610、2592〜2611、2593〜2608、2593〜2609、2593〜2610、2593〜2612、2594〜2609、2594〜2610、2594〜2611、2594〜2612、2594〜2613、2595〜2610、2595〜2611、2595〜2612、2595〜2613、2595〜2614、2596〜2611、2596〜2612、2596〜2613、2596〜2614、2596〜2615、2597〜2612、2597〜2612、2597〜2613、2597〜2614、2597〜2615、2597〜2616、2598〜2613、2598〜2614、2598〜2615、2598〜2616、2598〜2617、2599〜2614、2599〜2615、2599〜2616、2599〜2617、2599〜2618、2600〜2615、2600〜2616、2600〜2617、2600〜2618、2600〜2619、2601〜2616、2601〜2617、2601〜2618、2601〜2619、2601〜2620、2602〜2617、2602〜2618、2602〜2619、2602〜2620、2602〜2621、2603〜2618、2603〜2619、2603〜2620、2603〜2621、2603〜2622、2604〜2619、2604〜2620、2604〜2621、2604〜2622、2604〜2623、2605〜2620、2605〜2621、2605〜2622、2605〜2623、2605〜2624、2606〜2621、2606〜2622、2606〜2623、2606〜2624、2606〜2625、2607〜2622、2607〜2623、2607〜2624、2607〜2625、2607〜2626、2608〜2623、2608〜2624、2608〜2625、2608〜2626、2608〜2627、2609〜2624、2609〜2625、2609〜2626、2609〜2627、2609〜2628、2610〜2625、2610〜2626、2610〜2627、2610〜2628、2610〜2629、2611〜2626、2611〜2627、2611〜2628、2611〜2629、2611〜2630、2612〜2627、2612〜2628、2612〜2629、2612〜2630、2612〜2631、2613〜2628、2613〜2629、2613〜2630、2613〜2631、2614〜2629、2614〜2630、2614〜2631、2615〜2630、2615〜2631、及び2616〜2631。

特定の実施形態では、アンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドがCFB核酸の一領域を標的とする。特定の実施形態では、CFB核酸の一領域を標的とするそのような化合物またはオリゴヌクレオチドが、前記領域のうちの長さが等しい核酸塩基部分に相補的な連続する核酸塩基部分を有する。例えば前記部分は、本明細書に示す領域のうちの長さが等しい部分に相補的な、少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、または16個の連続する核酸塩基部分であることができる。特定の実施形態では、化合物が、共役体と配列番号2の以下のヌクレオチド領域を標的とする修飾オリゴヌクレオチドとを含むか、またはそれらからなる:1608〜1627、1685〜1704、1686〜1705、1751〜1770、1769〜1784、1871〜1890、1872〜1891、1873〜1892、1875〜1890、1875〜1894、1877〜1892、1877〜1896、1878〜1897、1879〜1894、1879〜1898、2288〜2307、2808〜2827、2846〜2865、2852〜2871、2946〜2965、3773〜3792、3819〜3838、3825〜3844、3831〜3850、3834〜3853、3837〜3856、3843〜3862、4151〜4166、4151〜4170、4153〜4172、4159〜4178、4184〜4203、4211〜4230、4609〜4628、4612〜4631、4615〜4634、4621〜4640、4642〜4661、4648〜4667、4686〜4705、4689〜4708、4692〜4711、4698〜4717、4714〜4733、5270〜5289、5295〜5314、5296〜5315、5830〜5849、5890〜5909、5904〜5923、6406〜6425、6662〜6681、6674〜6693、6954〜6973、6960〜6979、6977〜6996、6979〜6998、6981〜7000、6983〜6998、6983〜7002、6984〜7003、6985〜7000、6985〜7004、6990〜7009、7122〜7141、7125〜7144、7151〜7170、7353〜7372、7362〜7381、7683〜7702、7688〜7707、7690〜7709、7692〜7707、7692〜7711、7694〜7709、7694〜7713、7696〜7711、7696〜7715、7767〜7786、7785〜7804、7786〜7801、7787〜7803、7787〜7805、7787〜7806、7788〜7803、7788〜7805、7788〜7806、7788〜7807、7789〜7806、7789〜7807、7789〜7808、7790〜7805、7790〜7807、7790〜7809、7791〜7808、7791〜7809、7791〜7810、7792〜7808、7792〜7809、7792〜7810、7792〜7811、7793〜7810、7793〜7811、7793〜7812、7794〜7811、7794〜7812、7794〜7813、7795〜7812、7795〜7813、7795〜7814、7796〜7811、7796〜7813、7796〜7814、7796〜7815、7797〜7812、7797〜7814、7797〜7816、7798〜7813、7798〜7815、7798〜7817、7799〜7816、7799〜7818、7800〜7819、7801〜7818、7801〜7820、7802〜7817、7802〜7819、7802〜7821、7803〜7818、7803〜7820、7803〜7822、7804〜7821、7804〜7823、7805〜7820、7805〜7822、7805〜7824、7806〜7821、7806〜7823、7806〜7825、7807〜7824、7807〜7825、7807〜7826、7808〜7825、7808〜7827、7809〜7825、7809〜7826、7809〜7828、7810〜7825、7810〜7826、7810〜7827、7810〜7829、7811〜7828、7811〜7830、7812〜7829、7812〜7830、7812〜7831、7813〜7829、7813〜7831、7813〜7832、7814〜7833、7815〜7831、7815〜7832、7815〜7833、7815〜7834、7816〜7832、7816〜7833、7816〜7834、7816〜7835、7817〜7833、7817〜7834、7817〜7835、7817〜7836、7818〜7834、7818〜7835、7818〜7836、7818〜7837、7819〜7835、7819〜7836、7819〜7837、7819〜7838、7820〜7836、7820〜7838、7820〜7839、7821〜7836、7821〜7837、7821〜7839、7821〜7840、7822〜7837、7822〜7838、7822〜7840、7822〜7841、7823〜7838、7823〜7839、7823〜7839、7823〜7840、7823〜7841、7823〜7842、7824〜7839、7824〜7840、7824〜7840、7824〜7841、7824〜7842、7824〜7843、7825〜7840、7825〜7841、7825〜7842、7825〜7843、7825〜7844、7826〜7842、7826〜7843、7826〜7844、7826〜7845、7827〜7842、7827〜7843、7827〜7844、7827〜7845、7827〜7846、7828〜7843、7828〜7844、7828〜7845、7828〜7847、7829〜7844、7829〜7845、7829〜7846、7829〜7847、7829〜7848、7830〜7845、7830〜7846、7830〜7847、7830〜7848、7830〜7849、7831〜7846、7831〜7847、7831〜7848、7831〜7849、7831〜7850、7832〜7847、7832〜7848、7832〜7849、7832〜7850、7832〜7851、7833〜7848、7833〜7849、7833〜7850、7833〜7851、7833〜7852、7834〜7849、7834〜7850、7834〜7851、7834〜7852、7834〜7853、7835〜7850、7835〜7851、7835〜7852、7835〜7853、7835〜7854、7836〜7851、7836〜7852、7836〜7853、7836〜7854、7836〜7855、7837〜7852、7837〜7853、7837〜7854、7837〜7855、7837〜7856、7838〜7853、7838〜7854、7838〜7855、7838〜7856、7838〜7857、7839〜7854、7839〜7855、7839〜7856、7839〜7857、7839〜7858、7840〜7855、7840〜7856、7840〜7857、7840〜7858、7840〜7859、7841〜7856、7841〜7857、7841〜7858、7841〜7859、7841〜7860、7842〜7857、7842〜7858、7842〜7859、7842〜7860、7842〜7861、7843〜7858、7843〜7859、7843〜7860、7843〜7861、7843〜7862、7844〜7859、7844〜7860、7844〜7861、7844〜7862、7845〜7860、7845〜7861、7845〜7862、7846〜7861、及び7846〜7862。

特定の実施形態では、化合物が、共役体とCFB核酸の3’UTRを標的とする修飾オリゴヌクレオチドとを含むか、またはそれらからなる。特定の態様では、前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号1の核酸塩基配列を有するCFB核酸のヌクレオチド2574〜2626内を標的とする。特定の態様では、前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号1の核酸塩基配列を有するCFB核酸のヌクレオチド2574〜2626内の長さが等しい部分に相補的な少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、または16個の連続する核酸塩基部分を有する。

特定の実施形態では、化合物が、共役体と、配列番号1の核酸塩基配列を有するCFB核酸のうち核酸塩基2457〜2631、2457〜2472、2457〜2474、2457〜2476、2457〜2566、2457〜2570、2457〜2571、2457〜2572、2457〜2573、2457〜2574、2457〜2575、2457〜2576、2457〜2577、2457〜2578、2457〜2579、2457〜2580、2457〜2581、2457〜2582、2457〜2583、2457〜2584、2457〜2585、2457〜2586、2457〜2587、2457〜2588、2457〜2589、2457〜2590、2457〜2591、2457〜2592、2457〜2593、2457〜2594、2457〜2595、2457〜2596、2457〜2597、2457〜2598、2457〜2599、2457〜2600、2457〜2601、2457〜2602、2457〜2603、2457〜2604、2457〜2605、2457〜2606、2457〜2607、2457〜2608、2457〜2609、2457〜2610、2457〜2611、2457〜2612、2457〜2613、2457〜2614、2457〜2615、2457〜2616、2457〜2617、2457〜2618、2457〜2619、2457〜2620、2457〜2621、2457〜2622、2457〜2623、2457〜2624、2457〜2625、2457〜2626、2457〜2627、2457〜2628、2457〜2629、2457〜2630、2457〜2631、2459〜2474、2459〜2476、2459〜2566、2459〜2570、2459〜2571、2459〜2572、2459〜2573、2459〜2574、2459〜2575、2459〜2576、2459〜2577、2459〜2578、2459〜2579、2459〜2580、2459〜2581、2459〜2582、2459〜2583、2459〜2584、2459〜2585、2459〜2586、2459〜2587、2459〜2588、2459〜2589、2459〜2590、2459〜2591、2459〜2592、2459〜2593、2459〜2594、2459〜2595、2459〜2596、2459〜2597、2459〜2598、2459〜2599、2459〜2600、2459〜2601、2459〜2602、2459〜2603、2459〜2604、2459〜2605、2459〜2606、2459〜2607、2459〜2608、2459〜2609、2459〜2610、2459〜2611、2459〜2612、2459〜2613、2459〜2614、2459〜2615、2459〜2616、2459〜2617、2459〜2618、2459〜2619、2459〜2620、2459〜2621、2459〜2622、2459〜2623、2459〜2624、2459〜2625、2459〜2626、2459〜2627、2459〜2628、2459〜2629、2459〜2630、2459〜2631、2461〜2476、2461〜2566、2461〜2570、2461〜2571、2461〜2572、2461〜2573、2461〜2574、2461〜2575、2461〜2576、2461〜2577、2461〜2578、2461〜2579、2461〜2580、2461〜2581、2461〜2582、2461〜2583、2461〜2584、2461〜2585、2461〜2586、2461〜2587、2461〜2588、2461〜2589、2461〜2590、2461〜2591、2461〜2592、2461〜2593、2461〜2594、2461〜2595、2461〜2596、2461〜2597、2461〜2598、2461〜2599、2461〜2600、2461〜2601、2461〜2602、2461〜2603、2461〜2604、2461〜2605、2461〜2606、2461〜2607、2461〜2608、2461〜2609、2461〜2610、2461〜2611、2461〜2612、2461〜2613、2461〜2614、2461〜2615、2461〜2616、2461〜2617、2461〜2618、2461〜2619、2461〜2620、2461〜2621、2461〜2622、2461〜2623、2461〜2624、2461〜2625、2461〜2626、2461〜2627、2461〜2628、2461〜2629、2461〜2630、2461〜2631、2551〜2566、2551〜2570、2551〜2571、2551〜2572、2551〜2573、2551〜2574、2551〜2575、2551〜2576、2551〜2577、2551〜2578、2551〜2579、2551〜2580、2551〜2581、2551〜2582、2551〜2583、2551〜2584、2551〜2585、2551〜2586、2551〜2587、2551〜2588、2551〜2589、2551〜2590、2551〜2591、2551〜2592、2551〜2593、2551〜2594、2551〜2595、2551〜2596、2551〜2597、2551〜2598、2551〜2599、2551〜2600、2551〜2601、2551〜2602、2551〜2603、2551〜2604、2551〜2605、2551〜2606、2551〜2607、2551〜2608、2551〜2609、2551〜2610、2551〜2611、2551〜2612、2551〜2613、2551〜2614、2551〜2615、2551〜2616、2551〜2617、2551〜2618、2551〜2619、2551〜2620、2551〜2621、2551〜2622、2551〜2623、2551〜2624、2551〜2625、2551〜2626、2551〜2627、2551〜2628、2551〜2629、2551〜2630、2551〜2631、2553〜2570、2553〜2571、2553〜2572、2553〜2573、2553〜2574、2553〜2575、2553〜2576、2553〜2577、2553〜2578、2553〜2579、2553〜2580、2553〜2581、2553〜2582、2553〜2583、2553〜2584、2553〜2585、2553〜2586、2553〜2587、2553〜2588、2553〜2589、2553〜2590、2553〜2591、2553〜2592、2553〜2593、2553〜2594、2553〜2595、2553〜2596、2553〜2597、2553〜2598、2553〜2599、2553〜2600、2553〜2601、2553〜2602、2553〜2603、2553〜2604、2553〜2605、2553〜2606、2553〜2607、2553〜2608、2553〜2609、2553〜2610、2553〜2611、2553〜2612、2553〜2613、2553〜2614、2553〜2615、2553〜2616、2553〜2617、2553〜2618、2553〜2619、2553〜2620、2553〜2621、2553〜2622、2553〜2623、2553〜2624、2553〜2625、2553〜2626、2553〜2627、2553〜2628、2553〜2629、2553〜2630、2553〜2631、2554〜2573、2554〜2574、2554〜2575、2554〜2576、2554〜2577、2554〜2578、2554〜2579、2554〜2580、2554〜2581、2554〜2582、2554〜2583、2554〜2584、2554〜2585、2554〜2586、2554〜2587、2554〜2588、2554〜2589、2554〜2590、2554〜2591、2554〜2592、2554〜2593、2554〜2594、2554〜2595、2554〜2596、2554〜2597、2554〜2598、2554〜2599、2554〜2600、2554〜2601、2554〜2602、2554〜2603、2554〜2604、2554〜2605、2554〜2606、2554〜2607、2554〜2608、2554〜2609、2554〜2610、2554〜2611、2554〜2612、2554〜2613、2554〜2614、2554〜2615、2554〜2616、2554〜2617、2554〜2618、2554〜2619、2554〜2620、2554〜2621、2554〜2622、2554〜2623、2554〜2624、2554〜2625、2554〜2626、2554〜2627、2554〜2628、2554〜2629、2554〜2630、2554〜2631、2555〜2572、2555〜2573、2555〜2574、2555〜2575、2555〜2576、2555〜2577、2555〜2578、2555〜2579、2555〜2580、2555〜2581、2555〜2582、2555〜2583、2555〜2584、2555〜2585、2555〜2586、2555〜2587、2555〜2588、2555〜2589、2555〜2590、2555〜2591、2555〜2592、2555〜2593、2555〜2594、2555〜2595、2555〜2596、2555〜2597、2555〜2598、2555〜2599、2555〜2600、2555〜2601、2555〜2602、2555〜2603、2555〜2604、2555〜2605、2555〜2606、2555〜2607、2555〜2608、2555〜2609、2555〜2610、2555〜2611、2555〜2612、2555〜2613、2555〜2614、2555〜2615、2555〜2616、2555〜2617、2555〜2618、2555〜2619、2555〜2620、2555〜2621、2555〜2622、2555〜2623、2555〜2624、2555〜2625、2555〜2626、2555〜2627、2555〜2628、2555〜2629、2555〜2630、2555〜2631、2556〜2573、2556〜2574、2556〜2575、2556〜2576、2556〜2577、2556〜2578、2556〜2579、2556〜2580、2556〜2581、2556〜2582、2556〜2583、2556〜2584、2556〜2585、2556〜2586、2556〜2587、2556〜2588、2556〜2589、2556〜2590、2556〜2591、2556〜2592、2556〜2593、2556〜2594、2556〜2595、2556〜2596、2556〜2597、2556〜2598、2556〜2599、2556〜2600、2556〜2601、2556〜2602、2556〜2603、2556〜2604、2556〜2605、2556〜2606、2556〜2607、2556〜2608、2556〜2609、2556〜2610、2556〜2611、2556〜2612、2556〜2613、2556〜2614、2556〜2615、2556〜2616、2556〜2617、2556〜2618、2556〜2619、2556〜2620、2556〜2621、2556〜2622、2556〜2623、2556〜2624、2556〜2625、2556〜2626、2556〜2627、25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特定の実施形態では、配列番号1の以下のヌクレオチド領域が、アンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的となった時に、少なくとも50%の阻害を示す:30〜49、48〜63、150〜169、151〜170、152〜171、154〜169、154〜173、156〜171、156〜175、157〜176、158〜173、158〜177、480〜499、600〜619、638〜657、644〜663、738〜757、1089〜1108、1135〜1154、1141〜1160、1147〜1166、1150〜1169、1153〜1172、1159〜1178、1162〜1181、1165〜1184、1171〜1186、1171〜1190、1173〜1188、1173〜1192、1175〜1190、1175〜1194、1177〜1196、1183〜1202、1208〜1227、1235〜1254、1298〜1317、1304〜1323、1310〜1329、1316〜1335、1319〜1338、1322〜1341、1328〜1347、1349〜1368、1355〜1374、1393〜1412、1396〜1415、1399〜1418、1405〜1424、1421〜1440、1621〜1640、1646〜1665、1646〜1665、1647〜1666、1689〜1708、1749〜1768、1763〜1782、1912〜1931、2073〜2092、2085〜2104、2166〜2185、2172〜2191、2189〜2208、2191〜2210、2193〜2212、2195〜2210、2195〜2214、2196〜2215、2197〜2212、2197〜2216、2202〜2221、2223〜2238、2223〜2242、2225〜2240、2226〜2245、2227〜2242、2227〜2246、2238〜2257、2241〜2260、2267〜2286、2361〜2380、2388〜2407、2397〜2416、2448〜2467、2453〜2472、2455〜2474、2457〜2472、2457〜2476、2459〜2474、2459〜2478、2461〜2476、2461〜2480、2532〜2551、2550〜2569、2551〜2566、2551〜2570、2552〜2568、2552〜2570、2552〜2571、2553〜2568、2553〜2570、2553〜2571、2553〜2572、2554〜2571、2554〜2572、2554〜2573、2555〜2570、2555〜2572、2555〜2574、2556〜2573、2556〜2574、2556〜2575、2557〜2573、2557〜2574、2557〜2575、2557〜2576、2558〜2575、2558〜2576、2558〜2577、2559〜2576、2559〜2577、2559〜2578、2560〜2577、2560〜2578、2560〜2579、2561〜2576、2561〜2578、2561〜2579、2561〜2580、2562〜2577、2562〜2579、2562〜2581、2563〜2578、2563〜2580、2563〜2582、2564〜2581、2564〜2583、2565〜2584、2566〜2583、2566〜2585、2567〜2582、2567〜2584、2567〜2586、2568〜2583、2568〜2585、2568〜2587、2569〜2586、2569〜2588、2570〜2585、2570〜2587、2570〜2589、2571〜2586、2571〜2588、2571〜2590、2572〜2589、2572〜2590、2572〜2591、2573〜2590、2573〜2592、2574〜2590、2574〜2591、2574〜2593、2575〜2590、2575〜2591、2575〜2592、2575〜2594、2576〜2593、2576〜2595、2577〜2594、2577〜2595、2577〜2596、2578〜2594、2578〜2596、2578〜2597、2579〜2598、2580〜2596、2580〜2597、2580〜2598、2580〜2599、2581〜2597、2581〜2598、2581〜2599、2581〜2600、2582〜2598、2582〜2599、2582〜2600、2582〜2601、2583〜2599、2583〜2600、2583〜2601、2583〜2602、2584〜2600、2584〜2601、2584〜2602、2584〜2603、2585〜2601、2585〜2603、2585〜2604、2586〜2601、2586〜2602、2586〜2604、2586〜2605、2587〜2602、2587〜2603、2587〜2605、2587〜2606、2588〜2603、2588〜2604、2588〜2605、2588〜2606、2588〜2607、2589〜2604、2589〜2605、2589〜2606、2589〜2607、2589〜2608、2590〜2605、2590〜2606、2590〜2607、2590〜2608、2590〜2609、2590〜2609、2591〜2607、2591〜2608、2591〜2609、2591〜2610、2592〜2607、2592〜2608、2592〜2609、2592〜2610、2592〜2611、2593〜2608、2593〜2609、2593〜2610、2593〜2612、2594〜2609、2594〜2610、2594〜2611、2594〜2612、2594〜2613、2595〜2610、2595〜2611、2595〜2612、2595〜2613、2595〜2614、2596〜2611、2596〜2612、2596〜2613、2596〜2614、2596〜2615、2597〜2612、2597〜2612、2597〜2613、2597〜2614、2597〜2615、2597〜2616、2598〜2613、2598〜2614、2598〜2615、2598〜2616、2598〜2617、2599〜2614、2599〜2615、2599〜2616、2599〜2617、2599〜2618、2600〜2615、2600〜2616、2600〜2617、2600〜2618、2600〜2619、2601〜2616、2601〜2617、2601〜2618、2601〜2619、2601〜2620、2602〜2617、2602〜2618、2602〜2619、2602〜2620、2602〜2621、2603〜2618、2603〜2619、2603〜2620、2603〜2621、2603〜2622、2604〜2619、2604〜2620、2604〜2621、2604〜2622、2604〜2623、2605〜2620、2605〜2621、2605〜2622、2605〜2623、2605〜2624、2606〜2621、2606〜2622、2606〜2623、2606〜2624、2606〜2625、2607〜2622、2607〜2623、2607〜2624、2607〜2625、2607〜2626、2608〜2623、2608〜2624、2608〜2625、2608〜2626、2608〜2627、2609〜2624、2609〜2625、2609〜2626、2609〜2627、2609〜2628、2610〜2625、2610〜2626、2610〜2627、2610〜2628、2610〜2629、2611〜2626、2611〜2627、2611〜2628、2611〜2629、2611〜2630、2612〜2627、2612〜2628、2612〜2629、2612〜2630、2612〜2631、2613〜2628、2613〜2629、2613〜2630、2613〜2631、2614〜2629、2614〜2630、2614〜2631、2615〜2630、2615〜2631、及び2616〜2631。

特定の実施形態では、配列番号2の以下のヌクレオチド領域が、アンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的となった時に、少なくとも50%の阻害を示す:1608〜1627、1685〜1704、1686〜1705、1751〜1770、1769〜1784、1871〜1890、1872〜1891、1873〜1892、1875〜1890、1875〜1894、1877〜1892、1877〜1896、1878〜1897、1879〜1894、1879〜1898、2288〜2307、2808〜2827、2846〜2865、2852〜2871、2946〜2965、3773〜3792、3819〜3838、3825〜3844、3831〜3850、3834〜3853、3837〜3856、3843〜3862、4151〜4166、4151〜4170、4153〜4172、4159〜4178、4184〜4203、4211〜4230、4609〜4628、4612〜4631、4615〜4634、4621〜4640、4642〜4661、4648〜4667、4686〜4705、4689〜4708、4692〜4711、4698〜4717、4714〜4733、5270〜5289、5295〜5314、5296〜5315、5830〜5849、5890〜5909、5904〜5923、6406〜6425、6662〜6681、6674〜6693、6954〜6973、6960〜6979、6977〜6996、6979〜6998、6981〜7000、6983〜6998、6983〜7002、6984〜7003、6985〜7000、6985〜7004、6990〜7009、7122〜7141、7125〜7144、7151〜7170、7353〜7372、7362〜7381、7683〜7702、7688〜7707、7690〜7709、7692〜7707、7692〜7711、7694〜7709、7694〜7713、7696〜7711、7696〜7715、7767〜7786、7785〜7804、7786〜7801、7787〜7803、7787〜7805、7787〜7806、7788〜7803、7788〜7805、7788〜7806、7788〜7807、7789〜7806、7789〜7807、7789〜7808、7790〜7805、7790〜7807、7790〜7809、7791〜7808、7791〜7809、7791〜7810、7792〜7808、7792〜7809、7792〜7810、7792〜7811、7793〜7810、7793〜7811、7793〜7812、7794〜7811、7794〜7812、7794〜7813、7795〜7812、7795〜7813、7795〜7814、7796〜7811、7796〜7813、7796〜7814、7796〜7815、7797〜7812、7797〜7814、7797〜7816、7798〜7813、7798〜7815、7798〜7817、7799〜7816、7799〜7818、7800〜7819、7801〜7818、7801〜7820、7802〜7817、7802〜7819、7802〜7821、7803〜7818、7803〜7820、7803〜7822、7804〜7821、7804〜7823、7805〜7820、7805〜7822、7805〜7824、7806〜7821、7806〜7823、7806〜7825、7807〜7824、7807〜7825、7807〜7826、7808〜7825、7808〜7827、7809〜7825、7809〜7826、7809〜7828、7810〜7825、7810〜7826、7810〜7827、7810〜7829、7811〜7828、7811〜7830、7812〜7829、7812〜7830、7812〜7831、7813〜7829、7813〜7831、7813〜7832、7814〜7833、7815〜7831、7815〜7832、7815〜7833、7815〜7834、7816〜7832、7816〜7833、7816〜7834、7816〜7835、7817〜7833、7817〜7834、7817〜7835、7817〜7836、7818〜7834、7818〜7835、7818〜7836、7818〜7837、7819〜7835、7819〜7836、7819〜7837、7819〜7838、7820〜7836、7820〜7838、7820〜7839、7821〜7836、7821〜7837、7821〜7839、7821〜7840、7822〜7837、7822〜7838、7822〜7840、7822〜7841、7823〜7838、7823〜7839、7823〜7839、7823〜7840、7823〜7841、7823〜7842、7824〜7839、7824〜7840、7824〜7840、7824〜7841、7824〜7842、7824〜7843、7825〜7840、7825〜7841、7825〜7842、7825〜7843、7825〜7844、7826〜7842、7826〜7843、7826〜7844、7826〜7845、7827〜7842、7827〜7843、7827〜7844、7827〜7845、7827〜7846、7828〜7843、7828〜7844、7828〜7845、7828〜7847、7829〜7844、7829〜7845、7829〜7846、7829〜7847、7829〜7848、7830〜7845、7830〜7846、7830〜7847、7830〜7848、7830〜7849、7831〜7846、7831〜7847、7831〜7848、7831〜7849、7831〜7850、7832〜7847、7832〜7848、7832〜7849、7832〜7850、7832〜7851、7833〜7848、7833〜7849、7833〜7850、7833〜7851、7833〜7852、7834〜7849、7834〜7850、7834〜7851、7834〜7852、7834〜7853、7835〜7850、7835〜7851、7835〜7852、7835〜7853、7835〜7854、7836〜7851、7836〜7852、7836〜7853、7836〜7854、7836〜7855、7837〜7852、7837〜7853、7837〜7854、7837〜7855、7837〜7856、7838〜7853、7838〜7854、7838〜7855、7838〜7856、7838〜7857、7839〜7854、7839〜7855、7839〜7856、7839〜7857、7839〜7858、7840〜7855、7840〜7856、7840〜7857、7840〜7858、7840〜7859、7841〜7856、7841〜7857、7841〜7858、7841〜7859、7841〜7860、7842〜7857、7842〜7858、7842〜7859、7842〜7860、7842〜7861、7843〜7858、7843〜7859、7843〜7860、7843〜7861、7843〜7862、7844〜7859、7844〜7860、7844〜7861、7844〜7862、7845〜7860、7845〜7861、7845〜7862、7846〜7861、及び7846〜7862。

特定の実施形態では、配列番号1の以下のヌクレオチド領域が、アンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的となった時に、少なくとも60%の阻害を示す:48〜63、150〜169、152〜171、154〜169、154〜173、156〜171、156〜175、158〜173、158〜177、600〜619、1135〜1154、1141〜1160、1147〜1166、1153〜1172、1171〜1186、1173〜1188、1175〜1190、1749〜1768、1763〜1782、1763〜1782、1912〜1931、2189〜2208、2191〜2210、2193〜2212、2195〜2210、2195〜2214、2197〜2212、2197〜2216、2223〜2238、2225〜2240、2227〜2242、2238〜2257、2448〜2467、2453〜2472、2455〜2474、2457〜2472、2457〜2476、2459〜2474、2459〜2478、2461〜2476、2461〜2480、2550〜2569、2551〜2566、2552〜2571、2553〜2568、2553〜2570、2553〜2571、2553〜2572、2554〜2571、2554〜2572、2554〜2573、2555〜2572、2555〜2574、2556〜2573、2556〜2574、2556〜2575、2557〜2574、2557〜2575、2557〜2576、2558〜2575、2558〜2576、2558〜2577、2559〜2576、2559〜2577、2559〜2578、2560〜2577、2560〜2578、2560〜2579、2561〜2578、2561〜2579、2561〜2580、2562〜2577、2562〜2579、2562〜2581、2563〜2578、2563〜2580、2563〜2582、2564〜2581、2564〜2583、2565〜2584、2566〜2583、2566〜2585、2567〜2582、2567〜2584、2567〜2586、2568〜2583、2568〜2585、2568〜2587、2569〜2586、2569〜2588、2570〜2587、2570〜2589、2571〜2588、2572〜2590、2572〜2591、2573〜2590、2573〜2592、2574〜2591、2574〜2593、2575〜2590、2575〜2592、2575〜2594、2576〜2593、2576〜2595、2577〜2594、2577〜2595、2577〜2596、2578〜2594、2578〜2597、2579〜2598、2580〜2596、2580〜2597、2580〜2598、2580〜2599、2581〜2597、2581〜2598、2581〜2599、2581〜2600、2582〜2598、2582〜2599、2582〜2600、2582〜2601、2583〜2599、2583〜2600、2583〜2601、2583〜2602、2584〜2600、2584〜2602、2584〜2603、2585〜2601、2585〜2603、2585〜2604、2586〜2602、2586〜2604、2586〜2605、2587〜2603、2587〜2605、2587〜2606、2588〜2603、2588〜2604、2588〜2606、2588〜2607、2589〜2605、2589〜2606、2589〜2607、2589〜2608、2590〜2605、2590〜2606、2590〜2607、2590〜2608、2590〜2609、2591〜2607、2591〜2609、2591〜2610、2592〜2608、2592〜2609、2592〜2611、2593〜2608、2593〜2609、2593〜2612、2594〜2609、2594〜2610、2594〜2611、2594〜2612、2594〜2613、2595〜2610、2595〜2611、2595〜2612、2595〜2613、2595〜2614、2596〜2611、2596〜2612、2596〜2613、2596〜2614、2596〜2615、2597〜2612、2597〜2613、2597〜2614、2597〜2615、2597〜2616、2598〜2613、2598〜2614、2598〜2615、2598〜2616、2598〜2617、2599〜2614、2599〜2615、2599〜2616、2599〜2617、2599〜2618、2600〜2615、2600〜2616、2600〜2617、2600〜2618、2600〜2619、2601〜2616、2601〜2617、2601〜2618、2601〜2619、2601〜2620、2602〜2617、2602〜2618、2602〜2619、2602〜2620、2602〜2621、2603〜2618、2603〜2619、2603〜2620、2603〜2621、2603〜2622、2604〜2619、2604〜2620、2604〜2621、2604〜2622、2604〜2623、2605〜2620、2605〜2621、2605〜2622、2605〜2623、2605〜2624、2606〜2621、2606〜2622、2606〜2623、2606〜2624、2606〜2625、2607〜2622、2607〜2623、2607〜2624、2607〜2625、2607〜2626、2608〜2623、2608〜2624、2608〜2625、2608〜2625、2608〜2626、2608〜2627、2609〜2624、2609〜2625、2609〜2626、2609〜2627、2609〜2628、2610〜2625、2610〜2626、2610〜2627、2610〜2628、2610〜2629、2611〜2626、2611〜2626、2611〜2627、2611〜2628、2611〜2629、2611〜2630、2612〜2627、2612〜2628、2612〜2629、2612〜2630、2612〜2631、2613〜2628、2613〜2629、2613〜2630、2613〜2631、2614〜2629、2614〜2630、2614〜2631、2615〜2630、2615〜2630、2615〜2631、2615〜2631、及び2616〜2631。

特定の実施形態では、配列番号2の以下のヌクレオチド領域が、アンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的となった時に、少なくとも60%の阻害を示す:1685〜1704、1686〜1705、1769〜1784、1871〜1890、1873〜1892、1875〜1890、1875〜1894、1877〜1892、1877〜1896、1879〜1894、1879〜1898、2808〜2827、3819〜3838、3825〜3844、3831〜3850、3837〜3856、4151〜4166、5890〜5909、5904〜5923、5904〜5923、6406〜6425、6977〜6996、6979〜6998、6981〜7000、6983〜6998、6983〜7002、6985〜7000、6985〜7004、7122〜7141、7683〜7702、7688〜7707、7690〜7709、7692〜7707、7692〜7711、7694〜7709、7696〜7711、7696〜7715、7786〜7801、7787〜7806、7788〜7803、7788〜7805、7788〜7806、7788〜7807、7789〜7806、7789〜7807、7789〜7808、7790〜7807、7790〜7809、7791〜7808、7791〜7809、7791〜7810、7792〜7809、7792〜7810、7792〜7811、7793〜7810、7793〜7811、7793〜7812、7794〜7811、7794〜7812、7794〜7813、7795〜7812、7795〜7813、7795〜7814、7796〜7813、7796〜7814、7796〜7815、7797〜7812、7797〜7814、7797〜7816、7798〜7813、7798〜7815、7798〜7817、7799〜7816、7799〜7818、7800〜7819、7801〜7818、7801〜7820、7802〜7817、7802〜7819、7802〜7821、7803〜7818、7803〜7820、7803〜7822、7804〜7821、7804〜7823、7805〜7822、7805〜7824、7806〜7823、7806〜7825、7807〜7824、7807〜7825、7807〜7826、7808〜7825、7808〜7827、7809〜7826、7809〜7828、7810〜7825、7810〜7827、7810〜7829、7811〜7828、7811〜7830、7812〜7829、7812〜7830、7812〜7831、7813〜7829、7813〜7832、7814〜7833、7815〜7831、7815〜7832、7815〜7833、7815〜7834、7816〜7832、7816〜7833、7816〜7834、7816〜7835、7817〜7833、7817〜7834、7817〜7835、7817〜7836、7818〜7834、7818〜7835、7818〜7836、7818〜7837、7819〜7835、7819〜7837、7819〜7838、7820〜7836、7820〜7838、7820〜7839、7821〜7837、7821〜7839、7821〜7840、7822〜7838、7822〜7840、7822〜7841、7823〜7838、7823〜7839、7823〜7841、7823〜7842、7824〜7840、7824〜7841、7824〜7842、7824〜7843、7825〜7840、7825〜7841、7825〜7842、7825〜7843、7825〜7844、7826〜7842、7826〜7844、7826〜7845、7827〜7843、7827〜7844、7827〜7846、7828〜7843、7828〜7844、7828〜7847、7829〜7844、7829〜7845、7829〜7846、7829〜7847、7829〜7848、7830〜7845、7830〜7846、7830〜7847、7830〜7848、7830〜7849、7831〜7846、7831〜7847、7831〜7848、7831〜7849、7831〜7850、7832〜7847、7832〜7848、7832〜7849、7832〜7850、7832〜7851、7833〜7848、7833〜7849、7833〜7850、7833〜7851、7833〜7852、7834〜7849、7834〜7850、7834〜7851、7834〜7852、7834〜7853、7835〜7850、7835〜7851、7835〜7852、7835〜7853、7835〜7854、7836〜7851、7836〜7852、7836〜7853、7836〜7854、7836〜7855、7837〜7852、7837〜7853、7837〜7854、7837〜7855、7837〜7856、7838〜7853、7838〜7854、7838〜7855、7838〜7856、7838〜7857、7839〜7854、7839〜7855、7839〜7856、7839〜7857、7839〜7858、7840〜7855、7840〜7856、7840〜7857、7840〜7858、7840〜7859、7841〜7856、7841〜7857、7841〜7858、7841〜7859、7841〜7860、7842〜7857、7842〜7858、7842〜7859、7842〜7860、7842〜7861、7843〜7858、7843〜7859、7843〜7860、7843〜7861、7843〜7862、7844〜7859、7844〜7860、7844〜7861、7844〜7862、7845〜7860、7845〜7861、7845〜7862、7846〜7861、7846〜7862、及び7847〜7862。

特定の実施形態では、配列番号1の以下のヌクレオチド領域が、アンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的となった時に、少なくとも70%の阻害を示す:48〜63、150〜169、152〜171、154〜169、154〜173、156〜171、156〜175、158〜173、158〜177、1135〜1154、1141〜1160、1147〜1166、1171〜1186、1173〜1188、1175〜1190、1749〜1768、1763〜1782、1912〜1931、2193〜2212、2195〜2210、2195〜2214、2197〜2212、2197〜2216、2223〜2238、2225〜2240、2227〜2242、2453〜2472、2455〜2474、2457〜2472、2457〜2476、2459〜2474、2461〜2476、2461〜2480、2550〜2569、2551〜2566、2552〜2571、2553〜2570、2553〜2571、2553〜2572、2554〜2571、2554〜2572、2554〜2573、2554〜2573、2555〜2572、2555〜2574、2555〜2574、2556〜2573、2556〜2574、2556〜2575、2557〜2574、2557〜2576、2558〜2575、2558〜2576、2558〜2577、2559〜2576、2559〜2577、2559〜2578、2560〜2577、2560〜2578、2560〜2579、2561〜2578、2561〜2579、2561〜2580、2562〜2577、2562〜2579、2562〜2581、2563〜2578、2563〜2580、2563〜2582、2564〜2581、2564〜2583、2565〜2584、2566〜2583、2566〜2585、2567〜2582、2567〜2584、2567〜2586、2568〜2585、2568〜2587、2569〜2586、2569〜2588、2570〜2587、2570〜2589、2571〜2588、2571〜2590、2572〜2589、2572〜2591、2573〜2590、2573〜2592、2574〜2591、2574〜2593、2575〜2592、2575〜2594、2576〜2593、2576〜2595、2577〜2594、2577〜2596、2578〜2597、2579〜2598、2580〜2596、2580〜2598、2580〜2599、2581〜2597、2581〜2600、2582〜2598、2582〜2600、2582〜2601、2583〜2599、2583〜2601、2583〜2602、2584〜2600、2584〜2602、2584〜2603、2585〜2601、2585〜2603、2585〜2604、2586〜2605、2587〜2606、2588〜2604、2588〜2606、2588〜2607、2589〜2605、2589〜2606、2589〜2607、2589〜2608、2590〜2605、2590〜2606、2590〜2607、2590〜2609、2591〜2607、2591〜2610、2592〜2611、2593〜2608、2593〜2612、2594〜2609、2594〜2610、2594〜2612、2594〜2613、2595〜2610、2595〜2611、2595〜2612、2595〜2613、2595〜2614、2596〜2611、2596〜2614、2596〜2615、2597〜2612、2597〜2613、2597〜2614、2597〜2615、2597〜2616、2598〜2613、2598〜2614、2598〜2615、2598〜2616、2598〜2617、2599〜2614、2599〜2615、2599〜2616、2599〜2617、2599〜2618、2600〜2615、2600〜2616、2600〜2617、2600〜2618、2600〜2619、2601〜2616、2601〜2617、2601〜2618、2601〜2619、2601〜2620、2602〜2617、2602〜2618、2602〜2619、2602〜2620、2602〜2621、2603〜2619、2603〜2620、2603〜2621、2603〜2622、2604〜2619、2604〜2620、2604〜2621、2604〜2622、2604〜2623、2605〜2620、2605〜2621、2605〜2622、2605〜2623、2605〜2624、2606〜2621、2606〜2622、2606〜2623、2606〜2624、2606〜2625、2607〜2622、2607〜2623、2607〜2624、2607〜2625、2607〜2626、2608〜2623、2608〜2624、2608〜2625、2608〜2626、2608〜2627、2609〜2624、2609〜2625、2609〜2626、2609〜2627、2609〜2628、2610〜2625、2610〜2626、2610〜2627、2610〜2628、2610〜2629、2611〜2626、2611〜2627、2611〜2629、2611〜2630、2612〜2627、2612〜2628、2612〜2629、2612〜2630、2612〜2631、2613〜2628、2613〜2629、2613〜2630、2613〜2631、2614〜2629、2614〜2630、2614〜2631、2615〜2630、2615〜2630、2615〜2631、及び2616〜2631。

特定の実施形態では、配列番号2の以下のヌクレオチド領域が、アンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的となった時に、少なくとも70%の阻害を示す:1685〜1704、1686〜1705、1769〜1784、1871〜1890、1873〜1892、1875〜1890、1875〜1894、1877〜1892、1877〜1896、1879〜1894、1879〜1898、3819〜3838、3825〜3844、3831〜3850、4151〜4166、5890〜5909、5904〜5923、5904〜5923、6406〜6425、6983〜6998、6983〜7002、6985〜7000、6985〜7004、7688〜7707、7690〜7709、7692〜7707、7692〜7711、7694〜7709、7696〜7711、7696〜7715、7786〜7801、7787〜7806、7788〜7805、7788〜7806、7788〜7807、7789〜7806、7789〜7807、7789〜7808、7790〜7807、7790〜7809、7791〜7808、7791〜7809、7791〜7810、7792〜7809、7792〜7811、7793〜7810、7793〜7811、7793〜7812、7794〜7811、7794〜7812、7794〜7813、7795〜7812、7795〜7813、7795〜7814、7796〜7813、7796〜7814、7796〜7815、7797〜7812、7797〜7814、7797〜7816、7798〜7813、7798〜7815、7798〜7817、7799〜7816、7799〜7818、7800〜7819、7801〜7818、7801〜7820、7802〜7817、7802〜7819、7802〜7821、7803〜7820、7803〜7822、7804〜7821、7804〜7823、7805〜7822、7805〜7824、7806〜7823、7806〜7825、7807〜7824、7807〜7826、7808〜7825、7808〜7827、7809〜7826、7809〜7828、7810〜7827、7811〜7828、7811〜7830、7812〜7829、7812〜7831、7813〜7832、7814〜7833、7815〜7831、7815〜7833、7815〜7834、7816〜7832、7816〜7835、7817〜7833、7817〜7835、7817〜7836、7818〜7834、7818〜7836、7818〜7837、7819〜7835、7819〜7837、7819〜7838、7820〜7836、7820〜7838、7820〜7839、7821〜7840、7822〜7841、7823〜7839、7823〜7841、7823〜7842、7824〜7840、7824〜7841、7824〜7842、7824〜7843、7825〜7840、7825〜7841、7825〜7842、7825〜7844、7826〜7842、7826〜7845、7827〜7846、7828〜7843、7828〜7847、7829〜7844、7829〜7845、7829〜7847、7829〜7848、7830〜7845、7830〜7846、7830〜7847、7830〜7848、7830〜7849、7831〜7846、7831〜7849、7831〜7850、7832〜7847、7832〜7848、7832〜7849、7832〜7850、7832〜7851、7833〜7848、7833〜7849、7833〜7850、7833〜7851、7833〜7852、7834〜7849、7834〜7850、7834〜7851、7834〜7852、7834〜7853、7835〜7850、7835〜7851、7835〜7852、7835〜7853、7835〜7854、7836〜7851、7836〜7852、7836〜7853、7836〜7854、7836〜7855、7837〜7852、7837〜7853、7837〜7854、7837〜7855、7837〜7856、7838〜7854、7838〜7855、7838〜7856、7838〜7857、7839〜7854、7839〜7855、7839〜7856、7839〜7857、7839〜7858、7840〜7855、7840〜7856、7840〜7857、7840〜7858、7840〜7859、7841〜7856、7841〜7857、7841〜7858、7841〜7859、7841〜7860、7842〜7857、7842〜7858、7842〜7859、7842〜7860、7842〜7861、7843〜7858、7843〜7859、7843〜7860、7843〜7861、7843〜7862、7844〜7859、7844〜7860、7844〜7861、7844〜7862、7845〜7860、7845〜7861、7845〜7862、7846〜7861、7846〜7862、及び7847〜7862。

特定の実施形態では、配列番号1の以下のヌクレオチド領域が、アンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的となった時に、少なくとも80%の阻害を示す:152〜171、154〜169、156〜171、158〜173、1135〜1154、1171〜1186、1173〜1188、1175〜1190、1763〜1782、1912〜1931、2197〜2212、2223〜2238、2225〜2240、2227〜2242、2457〜2472、2459〜2474、2461〜2476、2551〜2566、2553〜2570、2553〜2571、2553〜2572、2554〜2573、2555〜2572、2555〜2574、2556〜2573、2556〜2574、2556〜2575、2557〜2574、2557〜2576、2558〜2575、2558〜2576、2559〜2577、2559〜2578、2560〜2577、2560〜2578、2560〜2579、2561〜2578、2561〜2579、2561〜2580、2562〜2577、2562〜2579、2562〜2581、2563〜2580、2563〜2582、2564〜2581、2564〜2583、2565〜2584、2566〜2583、2567〜2584、2567〜2586、2568〜2585、2568〜2587、2569〜2586、2569〜2588、2570〜2587、2571〜2588、2571〜2590、2572〜2589、2572〜2591、2573〜2590、2573〜2592、2574〜2591、2574〜2593、2575〜2592、2576〜2593、2576〜2595、2577〜2594、2577〜2596、2578〜2597、2580〜2598、2580〜2599、2581〜2597、2581〜2600、2582〜2601、2583〜2602、2584〜2603、2585〜2604、2586〜2605、2587〜2606、2588〜2607、2589〜2608、2590〜2606、2590〜2607、2590〜2609、2591〜2610、2592〜2611、2593〜2608、2593〜2612、2594〜2613、2595〜2611、2595〜2614、2596〜2615、2597〜2612、2597〜2613、2597〜2614、2597〜2615、2597〜2616、2598〜2613、2598〜2613、2598〜2614、2598〜2615、2598〜2616、2598〜2617、2599〜2614、2599〜2617、2599〜2618、2600〜2615、2600〜2617、2600〜2618、2600〜2619、2601〜2616、2601〜2617、2601〜2619、2601〜2620、2602〜2618、2602〜2621、2603〜2620、2603〜2621、2603〜2622、2604〜2619、2604〜2620、2604〜2621、2604〜2622、2604〜2623、2605〜2620、2605〜2621、2605〜2622、2605〜2623、2605〜2624、2606〜2621、2606〜2622、2606〜2623、2606〜2624、2606〜2625、2607〜2622、2607〜2623、2607〜2624、2607〜2625、2607〜2626、2608〜2623、2608〜2624、2608〜2625、2608〜2627、2609〜2624、2609〜2626、2609〜2627、2609〜2628、2610〜2625、2610〜2626、2610〜2628、2610〜2629、2611〜2626、2611〜2627、2611〜2629、2611〜2630、2612〜2627、2612〜2628、2612〜2630、2612〜2631、2613〜2628、2613〜2629、2613〜2631、2614〜2629、2614〜2630、2614〜2631、2615〜2630、及び2616〜2631。

特定の実施形態では、配列番号2の以下のヌクレオチド領域が、アンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的となった時に、少なくとも80%の阻害を示す:1685〜1704、1686〜1705、1873〜1892、1875〜1890、1877〜1892、1879〜1894、3819〜3838、4151〜4166、5904〜5923、6406〜6425、6985〜7000、7692〜7707、7694〜7709、7696〜7711、7786〜7801、7788〜7805、7788〜7806、7788〜7807、7789〜7808、7790〜7807、7790〜7809、7791〜7808、7791〜7809、7791〜7810、7792〜7809、7792〜7811、7793〜7810、7793〜7811、7794〜7812、7794〜7813、7795〜7812、7795〜7813、7795〜7814、7796〜7813、7796〜7814、7796〜7815、7797〜7812、7797〜7814、7797〜7816、7798〜7815、7798〜7817、7799〜7816、7799〜7818、7800〜7819、7801〜7818、7802〜7819、7802〜7821、7803〜7820、7803〜7822、7804〜7821、7804〜7823、7805〜7822、7806〜7823、7806〜7825、7807〜7824、7807〜7826、7808〜7825、7808〜7827、7809〜7826、7809〜7828、7810〜7827、7811〜7828、7812〜7829、7812〜7831、7813〜7832、7814〜7833、7815〜7834、7816〜7832、7816〜7835、7817〜7836、7818〜7837、7819〜7838、7820〜7839、7821〜7840、7822〜7841、7823〜7842、7824〜7843、7825〜7841、7825〜7842、7825〜7844、7826〜7845、7827〜7846、7828〜7843、7828〜7847、7829〜7848、7830〜7846、7830〜7849、7831〜7850、7832〜7847、7832〜7848、7832〜7849、7832〜7850、7832〜7851、7833〜7848、7833〜7849、7833〜7850、7833〜7851、7833〜7852、7834〜7849、7834〜7852、7834〜7853、7835〜7850、7835〜7852、7835〜7853、7835〜7854、7836〜7851、7836〜7852、7836〜7854、7836〜7855、7837〜7853、7837〜7856、7838〜7855、7838〜7856、7838〜7857、7839〜7854、7839〜7855、7839〜7856、7839〜7857、7839〜7858、7840〜7855、7840〜7856、7840〜7857、7840〜7858、7840〜7859、7841〜7856、7841〜7857、7841〜7858、7841〜7859、7841〜7860、7842〜7857、7842〜7858、7842〜7859、7842〜7860、7842〜7861、7843〜7858、7843〜7859、7843〜7860、7843〜7862、7844〜7859、7844〜7861、7844〜7862、7845〜7860、7845〜7861、7846〜7862、及び7847〜7862。

特定の実施形態では、配列番号1の以下のヌクレオチド領域が、アンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的となった時に、少なくとも90%の阻害を示す:154〜169、156〜171、158〜173、1135〜1154、1171〜1186、1173〜1188、1763〜1782、1912〜1931、2223〜2238、2227〜2242、2459〜2474、2461〜2476、2554〜2573、2555〜2574、2560〜2577、2561〜2578、2561〜2579、2562〜2581、2563〜2580、2563〜2582、2564〜2581、2566〜2583、2567〜2584、2568〜2585、2568〜2587、2569〜2586、2570〜2587、2576〜2593、2577〜2594、2577〜2596、2578〜2597、2580〜2599、2581〜2600、2582〜2601、2583〜2602、2584〜2603、2586〜2605、2587〜2605、2587〜2606、2588〜2607、2589〜2608、2590〜2607、2590〜2609、2592〜2611、2595〜2614、2596〜2615、2597〜2612、2597〜2613、2597〜2615、2597〜2616、2598〜2613、2598〜2613、2598〜2617、2599〜2614、2599〜2618、2600〜2615、2600〜2619、2601〜2617、2601〜2620、2602〜2621、2603〜2622、2604〜2623、2605〜2621、2605〜2622、2605〜2624、2606〜2625、2607〜2626、2608〜2623、2608〜2625、2609〜2628、2611〜2627、2611〜2630、2612〜2628、2612〜2631、2613〜2629、2614〜2629、2615〜2630、及び2616〜2631。

特定の実施形態では、配列番号2の以下のヌクレオチド領域が、アンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的となった時に、少なくとも90%の阻害を示す:1685〜1704、1686〜1705、1875〜1890、1877〜1892、1879〜1894、3819〜3838、5904〜5923、6406〜6425、7694〜7709、7696〜7711、7789〜7808、7790〜7809、7795〜7812、7795〜7813、7796〜7813、7796〜7814、7797〜7814、7797〜7816、7798〜7815、7798〜7817、7799〜7816、7801〜7818、7802〜7819、7803〜7820、7803〜7822、7804〜7821、7805〜7822、7811〜7828、7812〜7829、7812〜7831、7813〜7832、7815〜7834、7818〜7837、7819〜7838、7821〜7840、7822〜7840、7822〜7841、7825〜7842、7832〜7847、7832〜7848、7832〜7850、7833〜7848、7833〜7852、7834〜7849、7834〜7853、7835〜7850、7836〜7852、7836〜7855、7837〜7856、7838〜7856、7839〜7857、7839〜7858、7840〜7856、7840〜7857、7840〜7859、7843〜7858、7843〜7860、及び7846〜7862。

特定の実施形態では、以下のアンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドがCFB核酸の一領域を標的とし、少なくとも50%のCFB mRNA阻害を達成する;ISIS番号:516350、532614、532632、532635、532638、532639、532686、532687、532688、532689、532690、532691、532692、532692、532693、532694、532695、532696、532697、532698、532699、532700、532701、532702、532703、532704、532705、532706、532707、532770、532775、532778、532780、532791、532800、532809、532810、532811、532917、532952、588509、588510、588511、588512、588513、588514、588515、588516、588517、588518、588519、588520、588522、588523、588524、588525、588527、588528、588529、588530、588531、588532、588533、588534、588535、588536、588537、588538、588539、588540、588541、588542、588543、588544、588545、588546、588547、588548、588549、588550、588551、588552、588553、588554、588555、588556、588557、588558、588559、588560、588561、588562、588563、588564、588565、588566、588567、588568、588569、588570、588571、588572、588573、588574、588575、588576、588577、588580、588581、588585、588586、588589、588590、588599、588603、588606、588608、588610、588614、588616、588628、588631、588632、588634、588636、588638、588640、588645、588646、588654、588656、588658、588660、588662、588664、588670、588672、588676、588682、588688、588696、588698、588807、588808、588809、588813、588814、588815、588819、588820、588822、588823、588838、588839、588840、588841、588842、588846、588847、588848、588849、588850、588851、588852、588853、588854、588855、588856、588857、588858、588859、588860、588861、588862、588863、588864、588865、588866、588867、588868、588870、588871、588872、588873、588874、588875、588876、588877、588878、588879、588880、588881、588882、588883、588884、598999、599000、599001、599002、599003、599004、599005、599006、599007、599008、599009、599010、599011、599012、599013、599014、599015、599018、599019、599023、599024、599025、599026、599027、599028、599029、599030、599031、599032、599033、599034、599035、599058、599062、599063、599064、599065、599070、599071、599072、599073、599074、599076、599077、599078、599079、599080、599081、599082、599083、599084、599085、599086、599087、599088、599089、599090、599091、599092、599093、599094、599095、599096、599097、599098、599102、599119、599123、599124、599125、599126、599127、599128、599132、599133、599134、599135、599136、599137、599138、599139、599140、599141、599142、599143、599144、599145、599147、599148、599149、599150、599151、599152、599153、599154、599155、599156、599157、599158、599159、599178、599179、599180、599181、599182、599186、599187、599188、599189、599190、599191、599192、599193、599194、599195、599196、599197、599198、599199、599200、599201、599202、599203、599204、599205、599206、599207、599208、599209、599210、599211、599212、599213、599214、599215、599216、599217、599218、599219、599220、599221、599221、599222、599223、599224、599225、599226、599227、599228、599229、599230、599231、599232、599233、599234、599235、599236、599241、599247、599248、599249、599255、599256、599257、599258、599260、599261、599262、599263、599264、599265、599266、599267、599268、599269、599270、599271、599272、599273、599274、599275、599276、599277、599278、599279、599280、599297、599299、599306、599307、599308、599309、599311、599312、599313、599314、599315、599316、599317、599318、599319、599320、599321、599322、599323、599324、599325、599326、599327、599328、599329、599330、599338、599349、599353、599354、599355、599356、599357、599358、599359、599360、599361、599362、599363、599364、599369、599371、599372、599373、599376、599378、599379、599382、599383、599384、599385、599386、599387、599388、599389、599390、599391、599392、599393、599394、599395、599396、599397、599398、599399、599400、599401、599402、599403、599404、599405、599406、599407、599408、599409、599410、599412、599413、599414、599415、599416、599417、599418、599419、599420、599421、599422、599423、599424、599425、599426、599433、599434、599435、599436、599437、599438、599439、599440、599441、599442、599443、599444、599445、599446、599447、599448、599450、599454、599455、599456、599467、599468、599469、599471、599472、599473、599474、599475、599476、599477、599478、599479、599480、599481、599482、599483、599484、599485、599486、599487、599488、599489、599490、599491、599492、599493、599494、599495、599496、599497、599498、599499、599500、599501、599502、599503、599504、599505、599506、599507、599508、599509、599512、599515、599518、599531、599541、599541、599546、599547、599548、599549、599550、599552、599553、599554、599555、599557、599558、599561、599562、599563、599564、599565、599566、599567、599568、599569、599570、599577、599578、599579、599580、599581、599581、599582、599584、599585、599586、599587、599588、599589、599590、599591、599592、599593、599594、599595、601321、601322、601323、601325、601327、601328、601329、601330、601332、601333、601334、601335、601336、601337、601338、601339、601341、601342、601343、601344、601345、601346、601347、601348、601349、601362、601367、601368、601369、601371、601372、601373、601374、601375、601377、601378、601380、601381、601382、601383、601384、601385、601386、601387、及び601388。

特定の実施形態では、以下のアンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドがCFB核酸の一領域を標的とし、少なくとも50%のCFB mRNA阻害を達成する;配列番号:12、30、33、36、37、84、85、86、87、88、89、90、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、198、203、206、208、219、228、237、238、239、317、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、468、472、473、475、478、479、488、492、494、495、498、499、500、502、503、509、510、511、512、513、514、515、517、518、522、523、524、525、529、530、531、534、535、537、540、541、542、543、544、545、546、547、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、563、564、565、569、570、572、573、577、588、589、590、591、592、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、623、640、641、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、700、704、705、706、707、708、709、711、712、713、714、715、716、717、718、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、758、759、760、761、762、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、813、833、834、841、846、849、850、867、及び873

特定の実施形態では、以下のアンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドがCFB核酸の一領域を標的とし、少なくとも60%のCFB mRNA阻害を達成する;ISIS番号:516350、532614、532635、532686、532687、532688、532689、532770、532800、532809、532810、532811、532917、532952、588512、588513、588514、588515、588516、588517、588518、588519、588522、588523、588524、588525、588527、588528、588529、588530、588531、588532、588533、588534、588535、588536、588537、588538、588539、588540、588541、588542、588543、588544、588545、588546、588547、588548、588549、588550、588551、588552、588553、588554、588555、588556、588557、588558、588559、588560、588561、588562、588563、588564、588565、588566、588567、588568、588569、588570、588571、588572、588573、588574、588575、588576、588577、588636、588638、588640、588664、588676、588696、588698、588807、588808、588814、588815、588819、588820、588840、588842、588846、588847、588848、588849、588850、588851、588852、588853、588854、588855、588856、588857、588858、588859、588860、588861、588862、588863、588864、588866、588867、588868、588870、588871、588872、588873、588874、588875、588876、588877、588878、588879、588880、588881、588882、588883、588884、598999、599000、599001、599002、599003、599004、599005、599006、599007、599008、599009、599010、599011、599012、599013、599014、599015、599019、599024、599025、599026、599027、599028、599029、599030、599031、599032、599033、599034、599035、599064、599065、599071、599072、599077、599078、599079、599080、599083、599084、599085、599086、599087、599088、599089、599090、599091、599092、599093、599094、599095、599096、599097、599125、599126、599127、599133、599134、599135、599136、599138、599139、599140、599141、599142、599148、599149、599150、599151、599152、599154、599155、599156、599157、599158、599159、599178、599179、599180、599181、599187、599188、599190、599192、599193、599194、599195、599196、599197、599198、599199、599200、599201、599202、599203、599204、599205、599206、599207、599208、599209、599210、599211、599212、599213、599214、599215、599216、599217、599218、599219、599220、599221、599222、599223、599224、599225、599226、599227、599228、599229、599230、599231、599232、599233、599234、599235、599236、599247、599255、599256、599257、599263、599264、599265、599266、599270、599271、599272、599273、599274、599275、599276、599277、599278、599279、599280、599306、599307、599308、599311、599312、599313、599314、599315、599316、599317、599318、599319、599320、599321、599322、599323、599324、599325、599327、599328、599329、599330、599349、599353、599355、599356、599357、599358、599359、599360、599361、599362、599363、599364、599369、599371、599372、599373、599376、599378、599379、599382、599384、599386、599387、599388、599389、599390、599391、599392、599393、599394、599395、599396、599397、599398、599399、599400、599401、599402、599403、599404、599405、599406、599407、599408、599409、599410、599412、599413、599414、599415、599416、599417、599418、599419、599420、599421、599422、599423、599424、599425、599433、599434、599435、599436、599437、599438、599439、599440、599441、599442、599443、599444、599445、599446、599447、599448、599456、599467、599468、599471、599472、599473、599474、599475、599476、599477、599478、599479、599480、599481、599482、599483、599484、599485、599486、599487、599488、599489、599490、599491、599492、599493、599494、599495、599496、599497、599498、599499、599500、599501、599502、599503、599504、599505、599506、599507、599508、599512、599531、599547、599548、599549、599552、599553、599554、599555、599557、599558、599562、599563、599564、599565、599566、599567、599568、599569、599570、599577、599578、599579、599580、599581、599582、599584、599585、599586、599587、599588、599589、599590、599591、599592、599593、599594、599595、601323、601327、601329、601332、601333、601333、601334、601335、601336、601338、601339、601341、601342、601343、601344、601345、601346、601347、601348、601349、601368、601369、601371、601372、601374、601375、601377、601378、601380、601381、601382、601383、601384、601385、601386、601387、及び601388。

特定の実施形態では、以下のアンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドがCFB核酸の一領域を標的とし、少なくとも60%のCFB mRNA阻害を達成する;配列番号:12、33、84、85、86、87、198、228、237、238、239、317、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、472、473、513、514、515、531、537、541、542、543、544、545、546、547、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、564、565、569、570、577、590、592、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、682、683、684、685、686、687、688、689、700、704、706、707、708、709、711、712、713、714、715、716、717、720、721、722、723、724、725、726、727、727、728、729、730、731、732、733、734、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、758、759、760、761、767、768、770、772、773、774、775、775、776、776、777、777、778、779、780、781、782、783、783、784、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、813、833、834、841、846、849、及び850。

特定の実施形態では、以下のアンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドがCFB核酸の一領域を標的とし、少なくとも70%のCFB mRNA阻害を達成する;ISIS番号:516350、532614、532686、532687、532688、532770、532800、532809、532810、532811、532917、532952、588512、588513、588514、588515、588516、588517、588518、588524、588529、588530、588531、588532、588533、588534、588535、588536、588537、588538、588539、588540、588541、588542、588543、588544、588545、588546、588547、588548、588549、588550、588551、588552、588553、588554、588555、588556、588557、588558、588559、588560、588561、588562、588563、588564、588565、588568、588569、588570、588571、588572、588573、588574、588575、588577、588636、588638、588640、588696、588698、588807、588814、588815、588819、588842、588847、588848、588849、588850、588851、588852、588853、588856、588857、588858、588859、588860、588861、588862、588863、588866、588867、588870、588871、588872、588873、588874、588875、588876、588877、588878、588879、588880、588881、588882、588883、588884、599000、599001、599003、599004、599005、599008、599009、599010、599011、599014、599015、599024、599025、599027、599028、599029、599030、599031、599032、599033、599034、599072、599077、599080、599085、599086、599087、599088、599089、599090、599091、599093、599094、599095、599096、599097、599125、599126、599134、599138、599139、599148、599149、599150、599151、599152、599154、599155、599156、599157、599158、599187、599188、599193、599195、599196、599197、599198、599199、599200、599201、599202、599203、599204、599205、599206、599207、599208、599210、599211、599212、599213、599214、599215、599216、599217、599218、599219、599220、599221、599222、599223、599224、599225、599226、599227、599228、599229、599230、599231、599232、599233、599234、599235、599236、599266、599272、599272、599273、599274、599275、599277、599278、599279、599280、599280、599306、599311、599312、599313、599314、599315、599316、599317、599318、599319、599320、599321、599322、599323、599325、599327、599328、599329、599330、599355、599357、599358、599359、599360、599361、599362、599363、599364、599369、599371、599372、599373、599378、599379、599382、599384、599386、599387、599388、599389、599390、599391、599392、599393、599394、599395、599396、599397、599398、599399、599400、599401、599402、599403、599404、599405、599406、599407、599408、599409、599410、599413、599414、599415、599416、599417、599418、599419、599420、599421、599422、599423、599424、599433、599434、599435、599436、599437、599438、599439、599440、599441、599442、599443、599445、599446、599447、599448、599472、599473、599474、599475、599476、599477、599478、599479、599480、599481、599482、599483、599484、599485、599486、599487、599488、599489、599490、599491、599492、599493、599494、599495、599496、599497、599498、599499、599500、599501、599502、599503、599504、599505、599506、599507、599508、599512、599547、599548、599552、599553、599554、599555、599558、599562、599563、599564、599566、599567、599568、599569、599570、599577、599578、599579、599580、599581、599582、599585、599586、599587、599588、599589、599590、599591、599592、599593、599594、599595、601332、601335、601341、601343、601344、601345、601346、601347、601348、601349、601371、601372、601380、601382、601383、601384、601385、601386、及び601387。

特定の実施形態では、以下のアンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドがCFB核酸の一領域を標的とし、少なくとも70%のCFB mRNA阻害を達成する;配列番号:12、84、85、86、198、228、237、238、239、317、395、396、397、398、399、402、403、404、405、407、408、410、411、412、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、464、465、472、473、513、514、515、541、542、543、544、545、546、547、549、550、551、552、553、554、555、556、557、564、565、569、592、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、645、646、647、648、649、650、653、654、655、656、659、660、662、663、664、665、666、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、677、678、679、680、682、683、684、686、687、688、689、706、708、709、711、712、713、714、715、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、767、768、773、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、793、794、795、797、798、799、813、833、834、841、846、849、867、及び873。

特定の実施形態では、以下のアンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドがCFB核酸の一領域を標的とし、少なくとも80%のCFB mRNA阻害を達成する;ISIS番号:532686、532809、532810、532811、532917、532952、588512、588517、588518、588533、588534、588535、588536、588537、588538、588539、588540、588542、588543、588544、588545、588546、588547、588548、588549、588550、588551、588552、588553、588554、588555、588556、588557、588558、588559、588560、588561、588562、588563、588564、588565、588571、588638、588640、588696、588698、588807、588814、588849、588850、588851、588853、588857、588858、588859、588860、588861、588862、588863、588866、588867、588871、588872、588873、588874、588875、588876、588877、588878、588879、588880、588881、588882、588883、599001、599024、599025、599033、599086、599087、599088、599089、599093、599094、599095、599096、599134、599139、599148、599149、599151、599154、599155、599156、599158、599188、599195、599196、599198、599201、599202、599203、599204、599205、599206、599207、599212、599213、599215、599216、599217、599218、599219、599220、599221、599222、599223、599224、599225、599226、599227、599228、599229、599230、599231、599232、599233、599234、599235、599236、599272、599273、599275、599277、599278、599279、599280、599311、599313、599314、599316、599317、599318、599320、599321、599322、599323、599327、599328、599329、599330、599355、599357、599358、599359、599360、599361、599362、599363、599364、599371、599372、599373、599378、599379、599382、599384、599386、599387、599388、599389、599390、599391、599392、599393、599397、599398、599399、599400、599401、599403、599404、599405、599407、599408、599409、599410、599413、599414、599415、599416、599417、599418、599419、599420、599421、599422、599423、599424、599433、599434、599435、599436、599437、599438、599439、599440、599441、599445、599446、599447、599448、599474、599476、599477、599479、599481、599482、599483、599485、599486、599487、599488、599489、599490、599491、599492、599494、599495、599496、599497、599498、599499、599500、599502、599503、599504、599505、599506、599507、599508、599547、599552、599553、599554、599558、599563、599567、599568、599569、599570、599577、599578、599581、599582、599585、599587、599588、599590、599591、599592、599593、599594、601332、601344、601345、601382、601383、及び601385。

特定の実施形態では、以下のアンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドがCFB核酸の一領域を標的とし、少なくとも80%のCFB mRNA阻害を達成する;配列番号:84、237、238、239、317、395、397、411、412、413、414、415、417、418、419、420、421、422、423、425、426、427、429、430、431、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、472、473、514、515、542、543、544、545、546、547、550、551、552、553、554、555、556、557、564、595、599、600、601、602、603、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、646、655、660、662、663、666、669、670、671、672、673、675、676、677、678、679、682、684、686、687、688、689、706、708、709、711、712、713、714、715、720、722、723、724、725、726、727、729、730、731、732、733、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、768、775、776、778、781、782、783、784、785、787、788、789、790、791、792、793、794、799、813、833、834、841、849、867、及び873。

特定の実施形態では、以下のアンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドがCFB核酸の一領域を標的とし、少なくとも90%のCFB mRNA阻害を達成する;ISIS番号:532686、532811、532917、588536、588537、588538、588539、588544、588545、588546、588548、588551、588552、588553、588554、588555、588556、588557、588558、588559、588560、588561、588562、588564、588638、588640、588696、588698、588849、588850、588851、588860、588866、588867、588872、588873、588874、588876、588877、588878、588879、588881、588883、599149、599188、599203、599206、599220、599221、599222、599223、599224、599225、599226、599227、599228、599229、599235、599236、599279、599280、599314、599321、599362、599378、599390、599391、599398、599399、599404、599413、599414、599416、599419、599420、599422、599435、599437、599438、599441、599483、599494、599508、599552、599553、599554、599568、599570、599577、599581、599591、599592、及び599593。

特定の実施形態では、以下のアンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドがCFB核酸の一領域を標的とし、少なくとも90%のCFB mRNA阻害を達成する;配列番号:84、238、239、317、412、413、420、421、426、434、436、437、438、439、440、442、443、444、445、446、448、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、464、465、472、473、514、515、542、543、544、545、546、551、553、555、556、599、600、601、602、610、616、617、618、662、666、670、676、677、678、688、689、713、723、729、730、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、755、756、768、783、793、833、及び867。

特定の実施形態では、化合物が、本明細書に記載するCFBを標的とする任意のオリゴヌクレオチドと共役基とを含むか、またはそれらからなることができる。

特定の実施形態では、化合物が修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド2193〜2212、2195〜2210、2457〜2476、2571〜2590、2584〜2603、2588〜2607、2592〜2611、2594〜2613、2597〜2616、2600〜2619、または2596〜2611内で相補的な10〜30個の連結されたヌクレオシドからなる。

特定の実施形態では、化合物が修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号198、228、237、440、444、448、450、453、455、549、及び598のいずれか一つを含む核酸塩基配列を有する10〜30個の連結されたヌクレオシドからなる。

特定の実施形態では、化合物が修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号198、228、237、440、444、448、450、453、455、549、及び598のいずれか一つからなる核酸塩基配列を有する。

特定の実施形態において、前述の化合物またはオリゴヌクレオチドは、いずれも、少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間連結部、少なくとも1つの修飾糖、及び/または少なくとも1つの修飾核酸塩基を含むことができる。

特定の態様において、前述の化合物またはオリゴヌクレオチドはいずれも、少なくとも1つの修飾糖を含むことができる。特定の態様では、少なくとも1つの修飾糖が、2’−O−メトキシエチル基を含む。特定の態様では、少なくとも1つの修飾糖が二環式糖、例えば4’−CH(CH₃)−O−2’基、4’−CH₂−O−2’基、または4’−(CH₂)₂−O−2’基である。

特定の態様では、前記修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間連結部、例えばホスホロチオエートヌクレオシド間連結部を含む。

特定の実施形態では、前記修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも1、2、3、4、5、6、または7個のホスホジエステルヌクレオシド間連結部を含む。

特定の実施形態では、前記修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間連結部が、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部及びホスホロチオエートヌクレオシド間連結部から選択される。

特定の実施形態では、前記修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間連結部がホスホロチオエート連結部である。

特定の実施形態において、前述の化合物またはオリゴヌクレオチドは、いずれも、少なくとも1つの修飾核酸塩基、例えば5−メチルシトシンを含む。

特定の実施形態では、化合物が、共役基と、 連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、 連結されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメント、及び 連結されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメント を含む修飾オリゴヌクレオチドとを含み、前記ギャップセグメントは前記5’ウイングセグメントと前記3’ウイングセグメントの間に配置されており、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは修飾糖を含む。特定の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号198、228、237、440、444、448、450、453、455、549、または598に示す配列を含む核酸塩基配列を有する10〜30個の連結されたヌクレオシドからなる。

特定の実施形態では、前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号198、228、237、440、444、448、450、453、もしくは455に示す配列を含むか、またはそれからなる核酸塩基配列を有し、前記修飾オリゴヌクレオチドは、 10個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、 5個の連結されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメント、及び 5個の連結されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメント を含み、前記ギャップセグメントは前記5’ウイングセグメントと前記3’ウイングセグメントの間に配置されており、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは2’−O−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間連結部はホスホロチオエート連結部であり、かつ各シトシンは5−メチルシトシンである。

特定の実施形態では、化合物が一本鎖修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含むか、またはそれらからなり、前記修飾オリゴヌクレオチドは配列番号198、228、237、440、444、448、450、453、または455に示す配列からなる核酸塩基配列を有する20個の連結されたヌクレオシドからなり、前記オリゴヌクレオチドは、 10個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、 5個の連結されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメント、及び 5個の連結されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメント を含み、前記ギャップセグメントは前記5’ウイングセグメントと前記3’ウイングセグメントの間に配置されており、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは2’−O−メトキシエチル糖を含み;各ヌクレオシド間連結部はホスホロチオエート連結部であり、各シトシンは5−メチルシトシンである。

特定の実施形態では、化合物がISIS588540と共役基とを含むか、またはそれらからなる。特定の実施形態では、ISIS588540が以下の化学構造を有する:

特定の実施形態では、前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号549に示す配列を含むか、配列番号549に示す配列からなる核酸塩基配列を有し、前記修飾オリゴヌクレオチドは、 10個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、 3個の連結されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメント、及び 3個の連結されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメント を含み、前記ギャップセグメントは前記5’ウイングセグメントと前記3’ウイングセグメントの間に配置されており、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドはcEt糖を含み、各ヌクレオシド間連結部はホスホロチオエート連結部であり、かつ各シトシンは5−メチルシトシンである。

特定の態様では、前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号598に示す配列を含むか、配列番号598に示す配列からなる核酸塩基配列を有し、前記修飾オリゴヌクレオチドは 10個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、 3個の連結されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメント、及び 3個の連結されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメント を含み、前記ギャップセグメントは前記5’ウイングセグメントと前記3’ウイングセグメントの間に配置されており、前記5’ウイングセグメントは5’→3’方向に2’−O−メトキシエチル糖、2’−O−メトキシエチル糖、及びcEt糖を含み、前記3’ウイングセグメントは5’→3’方向にcEt糖、cEt糖、及び2’−O−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間連結部はホスホロチオエート連結部であり、かつ各シトシンは5−メチルシトシンである。

前述の実施形態のいずれにおいても、前記化合物またはオリゴヌクレオチドは、CFBをコードする核酸に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%相補的であることができる。

前述の実施形態のいずれにおいても、前記化合物またはオリゴヌクレオチドは一本鎖であることができる。

特定の実施形態では、前記共役基が前記修飾オリゴヌクレオチドの5’端で前記修飾オリゴヌクレオチドに連結される。特定の実施形態では、前記共役基は、前記修飾オリゴヌクレオチドの3’端で前記修飾オリゴヌクレオチドに連結される。特定の実施形態では、前記共役基が少なくとも1つのN−アセチルガラクトサミン(GalNAc)、少なくとも2つのN−アセチルガラクトサミン(GalNAc)、または少なくとも3つのN−アセチルガラクトサミン(GalNAc)を含む。

特定の実施形態では、以下の化学構造を有する化合物が、5’−Xを伴うISIS588540を含むか、または5’−Xを伴うISIS588540からなり、ここでXは本明細書に記載するGalNAcを含む共役基である:

特定の実施形態では、化合物が、以下の化学構造によって表されるとおり、配列番号440、5’−GalNAc、及び化学修飾を含むか、またはそれらからなる:

[式中、R¹は−OCH₂CH₂OCH₃(MOE)であり、かつR²がHであるか、またはR¹とR²とが全体として橋を形成し、その場合、R¹は−O−であり、R²は−CH₂−、−CH(CH₃)−、または−CH₂CH₂−であって、R¹とR²は、結果として生じる橋が−O−CH₂−、−O−CH(CH₃)−、及び−O−CH₂CH₂−から選択されることになるように直接つながれている。 また、同じ環上のR³とR⁴の各ペアについては、環ごとに独立して、R³がH及び−OCH₂CH₂OCH₃から選択され、かつR⁴がHであるか、またはR³とR⁴とが全体として橋を形成し、その場合、R³は−O−、かつR⁴は−CH₂−、−CH(CH₃)−、または−CH₂CH₂−であって、R³とR⁴は、結果として生じる橋が−O−CH₂−、−O−CH(CH₃)−、及び−O−CH₂CH₂−から選択されることになるように直接つながれている; また、R⁵はH及び−CH₃から選択され、 また、ZはS⁻及びO⁻から選択される]。

特定の実施形態では、化合物がISIS696844を含む。特定の実施形態では、化合物がISIS696844からなる。特定の実施形態では、ISIS696844が以下の化学構造を有する:

特定の実施形態では、化合物がISIS696845を含む。特定の実施形態では、化合物がISIS696845からなる。特定の実施形態では、ISIS696845が以下の化学構造を有する:

特定の実施形態では、化合物がISIS698969を含む。特定の実施形態では、化合物がISIS698969からなる。特定の実施形態では、ISIS698969が以下の化学構造を有する:

特定の実施形態では、化合物がISIS698970を含む。特定の実施形態では、化合物がISIS698970からなる。特定の実施形態では、ISIS698970が以下の化学構造を有する:

特定の実施形態は、CFBを標的とする修飾オリゴヌクレオチドまたはその塩と共役基とを含む化合物またはそれらからなる化合物のいずれか、及び医薬上許容される担体もしくは希釈剤の少なくとも1つを含む組成物を提供する。

特定の実施形態では、本明細書に記載する化合物または組成物が、250nM未満、200nM未満、150nM未満、100nM未満、90nM未満、80nM未満、70nM未満、65nM未満、60nM未満、55nM未満、50nM未満、45nM未満、40nM未満、35nM未満、30nM未満、25nM未満、または20nM未満のインビトロIC₅₀の少なくとも1つを有することから、有効である。

特定の実施形態において、本明細書に記載する化合物または組成物は、食塩水で処置した動物と比較してALT値またはAST値の増加が4倍以下、3倍以下、または2倍以下であること、または肝臓重量、脾臓重量もしくは腎臓重量の増加が30%以下、20%以下、15%以下、12%以下、10%以下、5%以下、または2%以下であることのうちの少なくとも1つによって実証されるように、耐容性が高い。特定の実施形態において、本明細書に記載する化合物または組成物は、食塩水で処置した動物と比較してALT値またはAST値の増加がないことによって実証されるように、耐容性が高い。特定の実施形態において、本明細書に記載する化合物または組成物は、食塩水で処置した動物と比較して肝臓重量、膵臓重量または腎臓重量の増加がないことによって実証されるように、耐容性が高い。

特定の実施形態は、上述の実施形態のいずれかの化合物またはその塩と少なくとも1つの医薬上許容される担体または希釈剤とを含む組成物を提供する。特定の態様では、前記組成物が、約40センチポアズ(cP)未満、約30センチポアズ(cP)未満、約20センチポアズ(cP)未満、約15センチポアズ(cP)未満、または約10センチポアズ(cP)未満の粘度を有する。特定の態様では、上述した粘度のいずれかを有する前記組成物が、ここに提供する化合物を、約100mg/mL、約125mg/mL、約150mg/mL、約175mg/mL、約200mg/mL、約225mg/mL、約250mg/mL、約275mg/mL、または約300mg/mLの濃度で含む。特定の態様では、上述した粘度及び/または化合物濃度のいずれかを有する前記組成物が、室温または約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃、もしくは約30℃の温度を有する。

特定の実施形態において、対象における補体代替経路の調節異常に関連する疾患を処置し、防止し、または改善する方法は、本明細書に記載する化合物または組成物を前記対象に投与し、それによって前記疾患を処置し、防止し、または改善することを含む。特定の態様では、補体代替経路が正常より強く活性化されている。特定の実施形態では、対象における補体代替経路の調節異常に関連する疾患を処置し、防止し、または改善する方法が、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含むかまたはそれらからなる化合物を前記対象に投与することを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは10〜30個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号6〜808のいずれか一つの核酸塩基配列を含む核酸塩基配列を有する。特定の実施形態では、対象における補体代替経路の調節異常に関連する疾患を処置し、防止し、または改善する方法が、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含むかまたはそれらからなる化合物を前記対象に投与することを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号198、228、237、440、444、448、450、453、455、549、及び598のいずれか一つを含む核酸塩基配列を有する10〜30個の連結されたヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、対象における補体代替経路の調節異常に関連する疾患を処置し、防止し、または改善する方法が、ISIS696844、ISIS696845、ISIS698969、もしくはISIS698970を含むかまたはそれからなる化合物を前記対象に投与することを含む。

特定の実施形態において、対象における加齢黄斑変性(AMD)などの黄斑変性を処置し、防止し、または改善する方法は、本明細書に記載する化合物または組成物を前記対象に投与し、よってAMDを処置し、防止し、または改善することを含む。特定の態様では、補体代替経路が正常より強く活性化されている。特定の態様では、前記AMDが滲出型AMDである。特定の態様では、前記AMDが地図状萎縮などの乾性AMDである。特定の実施形態では、対象における加齢黄斑変性(AMD)、滲出型AMD、乾性AMD、または地図状萎縮などの黄斑変性を処置し、防止し、または改善する方法が、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含むかまたはそれらからなる化合物を前記対象に投与することを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは10〜30個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号6〜808のいずれか一つの核酸塩基配列を含む核酸塩基配列を有する。特定の実施形態では、対象における加齢黄斑変性(AMD)、滲出型AMD、乾性AMD、または地図状萎縮などの黄斑変性を処置し、防止し、または改善する方法が、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含むかまたはそれらからなる化合物を前記対象に投与することを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは配列番号198、228、237、440、444、448、450、453、455、549、及び598のいずれか一つを含む核酸塩基配列を有する10〜30個の連結されたヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、対象における加齢黄斑変性(AMD)、滲出型AMD、乾性AMD、または地図状萎縮などの黄斑変性を処置し、防止し、または改善する方法が、ISIS696844、ISIS696845、ISIS698969、もしくはISIS698970を含むかまたはそれからなる化合物を前記対象に投与することを含む。特定の態様では、前記化合物または組成物が、前記対象に非経口投与される。

特定の実施形態において、対象における補体代替経路の調節異常に関連する腎臓疾患を処置し、防止し、または改善する方法は、本明細書に記載する化合物または組成物を前記対象に投与し、よって前記腎臓疾患を処置し、防止し、または改善することを含む。特定の実施形態では、対象における補体代替経路の調節異常に関連する腎臓疾患を処置し、防止し、または改善する方法が、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含むかまたはそれらからなる化合物を前記対象に投与することを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは10〜30個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号6〜808のいずれか一つの核酸塩基配列を含む核酸塩基配列を有する。特定の実施形態では、対象における補体代替経路の調節異常に関連する腎臓疾患を処置し、防止し、または改善する方法が、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含むかまたはそれらからなる化合物を前記対象に投与することを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号198、228、237、440、444、448、450、453、455、549、及び598のいずれか一つを含む核酸塩基配列を有する10〜30個の連結されたヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、対象における補体代替経路の調節異常に関連する腎臓疾患を処置し、防止し、または改善する方法が、ISIS696844、ISIS696845、ISIS698969、もしくはISIS698970を含むかまたはそれからなる化合物を前記対象に投与することを含む。特定の態様では、補体代替経路が正常より強く活性化されている。特定の態様では、前記腎臓疾患が、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、デンスデポジット病(DDD)、C3糸球体腎炎(C3GN)、CFHR5ネフロパシー、もしくは非典型溶血性尿毒症症候群(aHUS)、またはそれらの任意の組み合わせである。特定の態様では、前記腎臓疾患が、糸球体におけるC3沈着などといったC3沈着に関連する。特定の態様では、前記腎臓疾患が、正常値未満の循環C3レベル、例えば血清中または血漿中C3レベルに関連する。特定の態様では、前記化合物または組成物を投与することにより、C3タンパク質レベルなどの眼C3レベルの蓄積が低減し、または阻害される。特定の態様では、前記化合物または組成物を投与することにより、眼C3沈着のレベルが低減し、または眼C3沈着の蓄積が阻害される。特定の態様では、前記化合物または組成物が前記対象に非経口投与される。特定の態様では、前記化合物または組成物を投与することにより、腎臓におけるC3レベル、例えばC3タンパク質レベルの蓄積が低減し、または阻害される。特定の態様では、前記化合物または組成物を投与することにより、例えば糸球体におけるC3レベルなどの腎臓C3沈着のレベルが低減し、または腎臓C3沈着の蓄積が阻害される。特定の態様において、前記対象は、例えば対象の血中の補体レベルまたは膜侵襲複合体レベルを検出し、かつ/または補体代替経路の調節異常に関連する疾患に関連する補体因子の遺伝子突然変異に関する遺伝子検査を行うことによって、補体代替経路の調節異常に関連する疾患を有するか、または前記疾患を有するリスクがあると同定される。

特定の実施形態において、補体代替経路の調節異常に関連する疾患を有するかまたは前記疾患を有するリスクがある対象における補体B因子(CFB)の発現を阻害する方法は、本明細書に記載する化合物または組成物を前記対象に投与し、それによって前記対象におけるCFBの発現を阻害することを含む。特定の実施形態では、補体代替経路の調節異常に関連する疾患を有するかまたは前記疾患を有するリスクがある対象における補体B因子(CFB)の発現を阻害する方法が、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含むかまたはそれらからなる化合物を前記対象に投与することを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは10〜30個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号6〜808のいずれか一つの核酸塩基配列を含む核酸塩基配列を有する。特定の実施形態では、補体代替経路の調節異常に関連する疾患を有するかまたは前記疾患を有するリスクがある対象における補体B因子(CFB)の発現を阻害する方法が、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含むかまたはそれらからなる化合物を前記対象に投与することを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号198、228、237、440、444、448、450、453、455、549、及び598のいずれか一つを含む核酸塩基配列を有する10〜30個の連結されたヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、補体代替経路の調節異常に関連する疾患を有するかまたは前記疾患を有するリスクがある対象における補体B因子(CFB)の発現を阻害する方法が、ISIS696844、ISIS696845、ISIS698969、もしくはISIS698970を含むかまたはそれからなる化合物を前記対象に投与することを含む。特定の態様では、前記化合物または組成物を投与することにより、眼におけるCFBの発現が阻害される。特定の態様において、前記対象は、加齢黄斑変性(AMD)、例えば滲出型AMD及び乾性AMDを有するか、またはそれらを有するリスクがある。特定の態様では、乾性AMDが地図状萎縮でありうる。地図状萎縮は、網膜の変性を伴う進行した形態の乾性AMDとみなされる。特定の態様では、前記化合物または組成物を投与することにより、腎臓、例えば糸球体におけるCFBの発現が阻害される。特定の態様において、前記対象は、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、デンスデポジット病(DDD)、C3糸球体腎炎(C3GN)、CFHR5ネフロパシー、もしくは非典型溶血性尿毒症症候群(aHUS)、またはそれらの任意の組み合わせを有するか、またはそれらを有するリスクがある。

特定の実施形態において、補体代替経路の調節異常に関連する疾患を有するかまたは前記疾患を有するリスクがある対象の眼におけるC3沈着を低減しまたはC3沈着の蓄積を阻害する方法は、本明細書に記載する化合物または組成物を前記対象に投与し、それによって前記対象の眼におけるC3沈着を低減しまたはC3沈着の蓄積を阻害することを含む。特定の実施形態では、補体代替経路の調節異常に関連する疾患を有するかまたは前記疾患を有するリスクがある対象の眼におけるC3沈着を低減しまたはC3沈着の蓄積を阻害する方法が、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含むかまたはそれらからなる化合物を前記対象に投与することを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは10〜30個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号6〜808のいずれか一つの核酸塩基配列を含む核酸塩基配列を有する。特定の実施形態では、補体代替経路の調節異常に関連する疾患を有するかまたは前記疾患を有するリスクがある対象の眼におけるC3沈着を低減しまたはC3沈着の蓄積を阻害する方法が、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含むかまたはそれらからなる化合物を前記対象に投与することを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号198、228、237、440、444、448、450、453、455、549、及び598のいずれか一つを含む核酸塩基配列を有する10〜30個の連結されたヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、補体代替経路の調節異常に関連する疾患を有するかまたは前記疾患を有するリスクがある対象の眼におけるC3沈着を低減しまたはC3沈着の蓄積を阻害する方法が、ISIS696844、ISIS696845、ISIS698969、もしくはISIS698970を含むかまたはそれからなる化合物を前記対象に投与することを含む。特定の態様では、前記対象が、加齢黄斑変性(AMD)、例えば滲出型AMD及び乾性AMDを有するか、またはそれらを有するリスクがある。特定の態様では、乾性AMDが地図状萎縮でありうる。特定の態様では、前記化合物または組成物が前記対象に非経口投与される。

特定の実施形態において、補体代替経路の調節異常に関連する疾患を有するかまたは前記疾患を有するリスクがある対象の腎臓におけるC3沈着を低減しまたはC3沈着の蓄積を阻害する方法は、本明細書に記載する化合物または組成物を前記対象に投与し、それによって前記対象の腎臓におけるC3沈着を低減しまたはC3沈着の蓄積を阻害することを含む。特定の実施形態では、補体代替経路の調節異常に関連する疾患を有するかまたは前記疾患を有するリスクがある対象の腎臓におけるC3沈着を低減しまたはC3沈着の蓄積を阻害する方法が、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含むかまたはそれらからなる化合物を前記対象に投与することを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは10〜30個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号6〜808のいずれか一つの核酸塩基配列を含む核酸塩基配列を有する。特定の実施形態では、補体代替経路の調節異常に関連する疾患を有するかまたは前記疾患を有するリスクがある対象の腎臓におけるC3沈着を低減しまたはC3沈着の蓄積を阻害する方法が、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含むかまたはそれらからなる化合物を前記対象に投与することを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号198、228、237、440、444、448、450、453、455、549、及び598のいずれか一つを含む核酸塩基配列を有する10〜30個の連結されたヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、補体代替経路の調節異常に関連する疾患を有するかまたは前記疾患を有するリスクがある対象の腎臓におけるC3沈着を低減しまたはC3沈着の蓄積を阻害する方法が、ISIS696844、ISIS696845、ISIS698969、もしくはISIS698970を含むかまたはそれからなる化合物を前記対象に投与することを含む。特定の態様では、前記対象が、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、デンスデポジット病(DDD)、C3糸球体腎炎(C3GN)、CFHR5ネフロパシー、もしくは非典型溶血性尿毒症症候群(aHUS)、またはそれらの任意の組み合わせを有するか、またはそれらを有するリスクがある。特定の態様において、前記化合物または組成物が前記対象に非経口投与される。

特定の実施形態は、補体代替経路の調節異常に関連する疾患を処置するための、本明細書に記載する化合物または組成物の使用に向けられる。特定の実施形態は、補体代替経路の調節異常に関連する疾患を処置するための、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含むかまたはそれらからなる化合物の使用であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが10〜30個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号6〜808のいずれか一つの核酸塩基配列を含む核酸塩基配列を有するものに向けられる。特定の実施形態は、補体代替経路の調節異常に関連する疾患を処置するための、修飾オリゴヌクレオチドと共役基とを含むかまたはそれらからなる化合物の使用であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号198、228、237、440、444、448、450、453、455、549、及び598のいずれか一つを含む核酸塩基配列を有する10〜30個の連結されたヌクレオシドからなるものに向けられる。特定の実施形態は、補体代替経路の調節異常に関連する疾患を処置するための、ISIS696844、ISIS696845、ISIS698969、もしくはISIS698970を含むかまたはそれからなる化合物の使用に向けられる。特定の態様では、補体代替経路が正常より強く活性化されている。特定の態様では、前記疾患が黄斑変性、例えば加齢黄斑変性(AMD)であり、これは滲出型AMDまたは乾性AMDでありうる。特定の態様では、乾性AMDが地図状萎縮でありうる。特定の態様では、前記疾患が、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、デンスデポジット病(DDD)、C3糸球体腎炎(C3GN)、CFHR5ネフロパシー、もしくは非典型溶血性尿毒症症候群(aHUS)、またはそれらの任意の組み合わせなどといった腎臓疾患である。特定の態様では、前記化合物または組成物が前記対象に非経口投与される。

特定の実施形態では、本明細書に記載する化合物または組成物が非経口投与される。例えば特定の実施形態では、前記化合物または組成物を、注射または注入によって投与することができる。非経口投与には、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または頭蓋内投与、例えば髄腔内投与または脳室内投与が含まれる。

アンチセンス化合物 オリゴマー化合物には、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣物、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びsiRNAが含まれるが、これらに限定されない。オリゴマー化合物は、標的核酸に対して「アンチセンス」である(つまり、水素結合によって標的核酸にハイブリダイゼーションを起こす能力を有する)ことができる。

特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、5’→3’方向に記載した場合に、そのアンチセンス化合物が標的とする標的核酸の標的セグメントの逆相補鎖を含む核酸塩基配列を有する。

特定の実施形態では、アンチセンス化合物が10〜30サブユニット長である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が12〜30サブユニット長である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が12〜22サブユニット長である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が14〜30サブユニット長である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が14〜20サブユニット長である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が15〜30サブユニット長である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が15〜20サブユニット長である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が16〜30サブユニット長である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が16〜20サブユニット長である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が17〜30サブユニット長である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が17〜20サブユニット長である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が18〜30サブユニット長である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が18〜21サブユニット長である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が18〜20サブユニット長である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が20〜30サブユニット長である。言い換えると、そのようなアンチセンス化合物は、それぞれ12〜30個の連結されたサブユニット、14〜30個の連結されたサブユニット、14〜20個のサブユニット、15〜30個のサブユニット、15〜20個のサブユニット、16〜30個のサブユニット、16〜20個のサブユニット、17〜30個のサブユニット、17〜20個のサブユニット、18〜30個のサブユニット、18〜20個のサブユニット、18〜21個のサブユニット、20〜30個のサブユニット、または12〜22個の連結されたサブユニットである。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が14サブユニット長である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が16サブユニット長である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が17サブユニット長である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が18サブユニット長である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が19サブユニット長である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が20サブユニット長である。別の実施形態では、アンチセンス化合物が、8〜80、12〜50、13〜30、13〜50、14〜30、14〜50、15〜30、15〜50、16〜30、16〜50、17〜30、17〜50、18〜22、18〜24、18〜30、18〜50、19〜22、19〜30、19〜50、または20〜30個の連結されたサブユニットである。特定のそのような実施形態では、アンチセンス化合物が、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、または80個の連結されたサブユニットの長さ、または上記の値のいずれか2つによって画定される範囲である。いくつかの実施形態では、前記アンチセンス化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、前記連結されたサブユニットがヌクレオチドである。

特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが短縮または切断されていてもよい。例えば、単一のサブユニットを5’端から欠失させるか(5’切断)、あるいは3’端から欠失させること(3’切断)ができる。CFB核酸を標的とする短縮型または切断型アンチセンス化合物は、アンチセンス化合物の5’端から2つのサブユニットが欠失しているか、あるいは3’端から2つのサブユニットが欠失していてもよい。あるいは、欠失したヌクレオシドは、アンチセンス化合物全体に分散していてもよい(例えば1つのヌクレオチドが5’端から欠失し1つのヌクレオシドが3’端から欠失しているアンチセンス化合物)。

延長されたアンチセンス化合物中に単一の追加サブユニットが存在する場合、前記追加サブユニットはアンチセンス化合物の5’端にあっても、3’端にあってもよい。2つ以上のサブユニットが存在する場合、追加されたサブユニットは互いに隣り合っていてもよい(例えば2つのサブユニットがアンチセンス化合物の5’端に付加されているか(5’付加)、あるいは3’端に付加されている(3’付加)アンチセンス化合物)。あるいは、付加されたサブユニットは、アンチセンス化合物全体に分散していてもよい(例えば1つのサブユニットが5’端に付加され、1つのサブユニットが3’端に付加されているアンチセンス化合物)。

活性を排除することなく、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのアンチセンス化合物の長さを増加しもしくは減少させ、かつ/またはミスマッチ塩基を導入することができる。例えばWoolfら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7305−7309,1992)では、13〜25核酸塩基長の一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、標的RNAの切断を誘導するその能力について、卵母細胞注入モデルで試験された。アンチセンスオリゴヌクレオチドの末端近くに8個または11個のミスマッチ塩基を含む25核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミスマッチを含まないアンチセンスオリゴヌクレオチドほどではなかったものの、標的mRNAの特異的切断を指示することができた。また、標的特異的切断が、13核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチド(1つまたは3つのミスマッチを持つものを含む)を使って達成された。

Gautschiら(J.Natl.Cancer Inst.93:463−471,March 2001)は、bcl−2 mRNAに対して100%の相補性を有し、かつbcl−xL mRNAに対して3つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチドが、インビトロ及びインビボでbcl−2とbcl−xLの発現をどちらも低減できることを実証した。さらにまた、このオリゴヌクレオチドはインビボで強力な抗腫瘍活性も示した。

MaherとDolnick(Nuc.Acid.Res.16:3341−3358,1988)は、一連のタンデム14核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびにそれぞれ2つまたは3つの前記タンデムアンチオリゴヌクレオチドの配列で構成される28核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチド及び42核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ヒトDHFRの翻訳を停止させるその能力について、ウサギ網状赤血球アッセイで試験した。3つの14核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれは単独で、28核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは42核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドよりもレベルは低かったものの、翻訳を阻害することができた。

特定のアンチセンス化合物モチーフ及び機序 特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、強化された阻害活性、標的核酸に対する増加した結合アフィニティ、またはインビボヌクレアーゼによる分解に対する耐性などといった性質が前記アンチセンス化合物に付与されるようなパターンまたはモチーフで配置された化学修飾サブユニットを有する。

キメラアンチセンス化合物は、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する増加した耐性、増加した細胞取り込み、標的核酸に対する増加した結合アフィニティ、及び/または増加した阻害活性が付与されるように修飾された少なくとも1つの領域を含有する。キメラアンチセンス化合物の第2の領域は、例えばRNA:DNA二重鎖のRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼRNase Hの基質として役立つなどといった、もう一つの望ましい性質を付与しうる。

アンチセンス活性は、アンチセンス化合物(例えばオリゴヌクレオチド)と標的核酸とのハイブリダイゼーションが関与し、そのハイブリダイゼーションが最終的に生物学的活性をもたらす機序であれば、どの機序に起因するものであってもよい。特定の実施形態では、標的核酸の量及び/または活性が調節される。特定の実施形態では、標的核酸の量及び/または活性が低減する。特定の実施形態では、標的核酸へのアンチセンス化合物のハイブリダイゼーションが、最終的に、標的核酸分解をもたらす。特定の実施形態では、標的核酸へのアンチセンス化合物のハイブリダイゼーションが、標的核酸分解をもたらさない。特定のそのような実施形態では、標的核酸とハイブリダイズしたアンチセンス化合物の存在(占有)が、アンチセンス活性の調節をもたらす。特定の実施形態では、ある特定の化学モチーフまたは化学修飾のパターンを有するアンチセンス化合物が、1つ以上の機序を活用するのに、特に適している。特定の実施形態では、2つ以上の機序によって、かつ/またはまだ解明されていない機序によって、アンチセンス化合物が機能する。したがって、本明細書に記載するアンチセンス化合物は、ある特定の機序に限定されるものではない。

アンチセンス機序には、RNase Hによるアンチセンス;RNAi機序(これはRISC経路を利用するもので、siRNA、ssRNA及びマイクロRNA機序がこれに含まれるが、これらに限定されない);及び占有に基づく機序などがあるが、これらに限定されない。特定のアンチセンス化合物は、2つ以上のそのような機序によって、かつ/またはさらに他の機序によって、作用しうる。

RNase Hによるアンチセンス 特定の実施形態では、アンチセンス活性が、少なくとも部分的には、RNase Hによる標的RNAの分解に起因する。RNase Hは、RNA:DNA二重鎖のRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。「DNA様」の一本鎖アンチセンス化合物は哺乳動物細胞においてRNase H活性を引き出すことが、当技術分野では知られている。したがって、DNAヌクレオシドまたはDNA様ヌクレオシドの少なくとも一部分を含むアンチセンス化合物は、RNase Hを活性化して、標的核酸の切断をもたらしうる。特定の実施形態では、RNase Hを利用するアンチセンス化合物が、1つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。特定の実施形態では、そのようなアンチセンス化合物が、1〜8個の修飾ヌクレオシドのブロックを少なくとも1つは含む。特定のそのような実施形態では、前記修飾ヌクレオシドがRNase H活性を支持しない。特定の実施形態では、そのようなアンチセンス化合物が、本明細書に記載するギャップマーである。特定のそのような実施形態では、前記ギャップマーのギャップがDNAヌクレオシドを含む。特定のそのような実施形態では、前記ギャップマーのギャップがDNA様ヌクレオシドを含む。特定のそのような実施形態では、前記ギャップマーのギャップがDNAヌクレオシドとDNA様ヌクレオシドを含む。

ギャップマーモチーフを有する特定のアンチセンス化合物は、キメラアンチセンス化合物とみなされる。ギャップマーでは、RNaseH切断を支持する複数のヌクレオチドを有する内側領域が、内側領域のヌクレオシドとは化学的に異なる複数のヌクレオチドを有する外側領域の間に配置されている。ギャップマーモチーフを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、ギャップセグメントは一般にエンドヌクレアーゼ切断の基質として役立ち、一方、ウイングセグメントは修飾ヌクレオシドを含む。特定の実施形態では、ギャップマーの領域が、個々の異なる領域を構成する糖部分のタイプによって区別される。ギャップマーの領域を区別するために使用される糖部分のタイプとして、いくつかの実施形態では、β−D−リボヌクレオシド、β−D−デオキシリボヌクレオシド、2’−修飾ヌクレオシド(そのような2’−修飾ヌクレオシドとして、例えば2’−MOEや2’−O−CH₃などを挙げることができる)、及び二環式糖修飾ヌクレオシド(そのような二環式糖修飾ヌクレオシドとして拘束エチルを有するものを挙げることができる)が挙げられる。特定の実施形態では、ウイング中のヌクレオシドがいくつかの修飾糖部分、例えば2’−MOEや、拘束エチルまたはLNAなどの二環式糖部分を含む。特定の実施形態では、ウイングがいくつかの修飾糖部分と無修飾糖部分を含む。特定の実施形態では、ウイングが、2’−MOEヌクレオシド、拘束エチルヌクレオシドやLNAヌクレオシドなどの二環式糖部分、及び2’−デオキシヌクレオシドのさまざまな組み合わせを含みうる。

異なる領域は、それぞれ一様な糖部分を含むか、異なった糖部分を含むか、または交互に並んだ糖部分を含みうる。ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、しばしば「X−Y−Z」と記載されるが、この場合、「X」は5’−ウイングの長さを表し、「Y」はギャップの長さを表し、「Z」は3’−ウイングの長さを表す。「X」と「Z」は、一様な糖部分を含むか、異なった糖部分を含むか、または交互に並んだ糖部分を含みうる。特定の実施形態では、「X」と「Y」が、1つ以上の2’−デオキシヌクレオシドを含みうる。「Y」は2’−デオキシヌクレオシドを含みうる。本明細書において、「X−Y−Z」と記述されるギャップマーは、ギャップが5’−ウイング及び3’−ウイングのそれぞれと直接隣り合って配置されるような構成を有する。したがって、5’−ウイングとギャップの間にも、ギャップと3’−ウイングの間にも、介在ヌクレオチドは存在しない。本明細書に記載するアンチセンス化合物はいずれもギャップマーモチーフを有することができる。特定の実施形態では、「X」と「Z」が同じであり、別の実施形態では、それらが異なる。特定の実施形態では、「Y」が8〜15ヌクレオシドである。X、Y、またはZは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、もしくは30ヌクレオシドまたはそれ以上のいずれであることもできる。

特定の実施形態において、CFB核酸を標的とするアンチセンス化合物は、ギャップが6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、または16個の連結されたヌクレオシドからなるギャップマーモチーフを有する。

特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、以下の式Aによって記述される糖モチーフを有する:(J)_m−(B)_n−(J)_p−(B)_r−(A)_t−(D)_g−(A)_v−(B)_w−(J)_x−(B)_y−(J)_z 式中、 各Aは独立して2’置換ヌクレオシドであり、 各Bは独立して二環式ヌクレオシドであり、 各Jは独立して2’−置換ヌクレオシドまたは2’−デオキシヌクレオシドであり、 各Dは2’−デオキシヌクレオシドであり、 mは0〜4であり、nは0〜2であり、pは0〜2であり、rは0〜2であり、tは0〜2であり、vは0〜2であり、wは0〜4であり、xは0〜2であり、yは0〜2であり、zは0〜4であり、gは6〜14である; ただし、 m、n、及びrのうちの少なくとも1つは0ではなく、 w及びyのうちの少なくとも1つは0ではなく、 m、n、p、r、及びtの和は2〜5であり、かつ v、w、x、y、及びzの和は2〜5であるものとする。

RNAi化合物 特定の実施形態では、アンチセンス化合物が干渉RNA化合物(RNAi)であり、これには、二本鎖RNA化合物(短鎖干渉RNAまたはsiRNAともいう)と一本鎖RNAi化合物(すなわちssRNA)が含まれる。そのような化合物は、少なくとも部分的には、RISC経路によって作動して、標的核酸を分解しかつ/または隔離する(したがってマイクロRNA/マイクロRNA模倣化合物を含む)。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、それらをそのような機序に特に適したものにする修飾を含む。

i.ssRNA化合物 特定の実施形態において、アンチセンス化合物(一本鎖RNAi化合物(ssRNA)としての使用に特に適したものを含む)は、修飾5’末端を含む。特定のそのような実施形態では、前記5’末端が修飾ホスフェート部分を含む。特定の実施形態では、そのような修飾ホスフェートが安定化されている(例えば無修飾5’−ホスフェートと比較して分解/切断に対して耐性である)。特定の実施形態では、そのような5’末端ヌクレオシドが5’−リン部分を安定化する。当技術分野では、いくつかの修飾5’末端ヌクレオシドを、例えばWO/2011/139702などに見いだすことができる。

特定の実施形態では、ssRNA化合物の5’−ヌクレオシドが式IIcを有する:

式中、 T₁は、保護されていてもよいリン部分であり、 T₂は、式IIcの化合物をオリゴマー化合物に連結するヌクレオシド間連結基であり、 Aは式:

の一つを有し; Q₁及びQ₂は、それぞれ独立して、H、ハロゲン、C₁−C₆アルキル、置換C₁−C₆アルキル、C₁−C₆アルコキシ、置換C₁−C₆アルコキシ、C₂−C₆アルケニル、置換C₂−C₆アルケニル、C₂−C₆アルキニル、置換C₂−C₆アルキニルまたはN(R₃)(R₄)であり、 Q₃は、O、S、N(R₅)またはC(R₆)(R₇)であり、 各R₃、R₄、R₅、R₆及びR₇は、独立して、H、C₁−C₆アルキル、置換C₁−C₆アルキルまたはC₁−C₆アルコキシであり、 M₃は、O、S、NR₁₄、C(R₁₅)(R₁₆)、C(R₁₅)(R₁₆)C(R₁₇)(R₁₈)、C(R₁₅)=C(R₁₇)、OC(R₁₅)(R₁₆)またはOC(R₁₅)(Bx₂)であり、 R₁₄は、H、C₁−C₆アルキル、置換C₁−C₆アルキル、C₁−C₆アルコキシ、置換C₁−C₆アルコキシ、C₂−C₆アルケニル、置換C₂−C₆アルケニル、C₂−C₆アルキニルまたは置換C₂−C₆アルキニルであり、 R₁₅、R₁₆、R₁₇及びR₁₈は、それぞれ独立して、H、ハロゲン、C₁−C₆アルキル、置換C₁−C₆アルキル、C₁−C₆アルコキシ、置換C₁−C₆アルコキシ、C₂−C₆アルケニル、置換C₂−C₆アルケニル、C₂−C₆アルキニルまたは置換C₂−C₆アルキニルであり、 Bx₁は複素環式塩基部分であるか;または Bx₂が存在する場合には、Bx₂が複素環式塩基部分であり、かつBx₁がH、ハロゲン、C₁−C₆アルキル、置換C₁−C₆アルキル、C₁−C₆アルコキシ、置換C₁−C₆アルコキシ、C₂−C₆アルケニル、置換C₂−C₆アルケニル、C₂−C₆アルキニルまたは置換C₂−C₆アルキニルであり、 J₄、J₅、J₆及びJ₇は、それぞれ独立して、H、ハロゲン、C₁−C₆アルキル、置換C₁−C₆アルキル、C₁−C₆アルコキシ、置換C₁−C₆アルコキシ、C₂−C₆アルケニル、置換C₂−C₆アルケニル、C₂−C₆アルキニルまたは置換C₂−C₆アルキニルであるか;または J₄が、J₅またはJ₇の一方と共に、O、S、NR₁₉、C(R₂₀)(R₂₁)、C(R₂₀)=C(R₂₁)、C[=C(R₂₀)(R₂₁)]及びC(=O)から選択される1〜3個の連結されたビラジカル基を含む橋を形成し、かつJ₅、J₆及びJ₇の残り2つが、それぞれ独立して、H、ハロゲン、C₁−C₆アルキル、置換C₁−C₆アルキル、C₁−C₆アルコキシ、置換C₁−C₆アルコキシ、C₂−C₆アルケニル、置換C₂−C₆アルケニル、C₂−C₆アルキニルまたは置換C₂−C₆アルキニルであり、 各R₁₉、R₂₀及びR₂₁は、独立して、H、C₁−C₆アルキル、置換C₁−C₆アルキル、C₁−C₆アルコキシ、置換C₁−C₆アルコキシ、C₂−C₆アルケニル、置換C₂−C₆アルケニル、C₂−C₆アルキニルまたは置換C₂−C₆アルキニルであり、 Gは、H、OH、ハロゲンまたはO−[C(R₈)(R₉)]_n−[(C=O)_m−X₁]_j−Zであり、 各R₈及びR₉は、独立して、H、ハロゲン、C₁−C₆アルキルまたは置換C₁−C₆アルキルであり、 X₁は、O、SまたはN(E₁)であり、 Zは、H、ハロゲン、C₁−C₆アルキル、置換C₁−C₆アルキル、C₂−C₆アルケニル、置換C₂−C₆アルケニル、C₂−C₆アルキニル、置換C₂−C₆アルキニルまたはN(E₂)(E₃)であり、 E₁、E₂及びE₃は、それぞれ独立して、H、C₁−C₆アルキルまたは置換C₁−C₆アルキルであり、 nは、1〜約6であり、 mは、0または1であり、 jは、0または1であり、 各置換基は、ハロゲン、OJ₁、N(J₁)(J₂)、=NJ₁、SJ₁、N₃、CN、OC(=X₂)J₁、OC(=X₂)N(J₁)(J₂)及びC(=X₂)N(J₁)(J₂)から独立して選択される1つ以上の置換されていてもよい置換基を含み、 X₂は、O、SまたはNJ₃であり、 各J₁、J₂及びJ₃は、独立して、HまたはC₁−C₆アルキルであり、 jが1である場合、ZはハロゲンでもN(E₂)(E₃)でもなく、かつ 前記オリゴマー化合物は8〜40個のモノマー型サブユニットを含み、標的核酸の少なくとも一部分にハイブリダイズ可能である。

特定の実施形態では、M₃が、O、CH=CH、OCH₂またはOC(H)(Bx₂)である。特定の実施形態では、M₃がOである。

特定の実施形態では、J₄、J₅、J₆及びJ₇がそれぞれHである。特定の実施形態では、J₄が、J₅またはJ₇の一方と共に橋を形成する。

特定の実施形態では、Aが、式:

の一方を有し、 式中、 Q₁及びQ₂は、それぞれ独立して、H、ハロゲン、C₁−C₆アルキル、置換C₁−C₆アルキル、C₁−C₆アルコキシまたは置換C₁−C₆アルコキシである。特定の実施形態では、Q₁及びQ₂が、それぞれHである。特定の実施形態では、Q₁及びQ₂が、それぞれ独立して、Hまたはハロゲンである。特定の実施形態では、Q₁及びQ₂がHであり、Q₁及びQ₂の他方がF、CH₃またはOCH₃である。

特定の実施形態では、T₁が式:

を有し、 式中、 R_a及びR_cは、それぞれ独立して、保護ヒドロキシル、保護チオール、C₁−C₆アルキル、置換C₁−C₆アルキル、C₁−C₆アルコキシ、置換C₁−C₆アルコキシ、保護アミノまたは置換アミノであり、かつ R_bは、OまたはSである。特定の実施形態では、R_bがOであり、R_a及びR_cが、それぞれ独立して、OCH₃、OCH₂CH₃またはCH(CH₃)₂である。

特定の実施形態では、Gが、ハロゲン、OCH₃、OCH₂F、OCHF₂、OCF₃、OCH₂CH₃、O(CH₂)₂F、OCH₂CHF₂、OCH₂CF₃、OCH₂−CH=CH₂、O(CH₂)₂−OCH₃、O(CH₂)₂−SCH₃、O(CH₂)₂−OCF₃、O(CH₂)₃−N(R₁₀)(R₁₁)、O(CH₂)₂−ON(R₁₀)(R₁₁)、O(CH₂)₂−O(CH₂)₂−N(R₁₀)(R₁₁)、OCH₂C(=O)−N(R₁₀)(R₁₁)、OCH₂C(=O)−N(R₁₂)−(CH₂)₂−N(R₁₀)(R₁₁)またはO(CH₂)₂−N(R₁₂)−C(=NR₁₃)[N(R₁₀)(R₁₁)]であり、式中、R₁₀、R₁₁、R₁₂及びR₁₃は、それぞれ独立して、HまたはC₁−C₆アルキルである。特定の実施形態では、Gが、ハロゲン、OCH₃、OCF₃、OCH₂CH₃、OCH₂CF₃、OCH₂−CH=CH₂、O(CH₂)₂−OCH₃、O(CH₂)₂−O(CH₂)₂−N(CH₃)₂、OCH₂C(=O)−N(H)CH₃、OCH₂C(=O)−N(H)−(CH₂)₂−N(CH₃)₂またはOCH₂−N(H)−C(=NH)NH₂である。特定の実施形態では、Gが、F、OCH₃またはO(CH₂)₂−OCH₃である。特定の実施形態では、GがO(CH₂)₂−OCH₃である。

特定の実施形態では、前記5’末端ヌクレオシドが式IIe:

を有する。

特定の実施形態において、アンチセンス化合物(ssRNAに特に適したものを含む)は、オリゴヌクレオチドまたはその領域に沿って、所定のパターンまたは糖修飾モチーフで配置された、1タイプ以上の修飾糖部分及び/または天然に存在する糖部分を含む。そのようなモチーフは、本明細書で論じる糖修飾及び/または他の既知の糖修飾をどれでも含みうる。

特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが、一様な糖修飾を有する領域を含むか、または一様な糖修飾を有する領域からなる。特定のそのような実施形態では、前記領域の各ヌクレオシドが、同じRNA様糖修飾を含む。特定の実施形態では、前記領域の各ヌクレオシドが2’−Fヌクレオシドである。特定の実施形態では、前記領域の各ヌクレオシドが2’−OMeヌクレオシドである。特定の実施形態では、前記領域の各ヌクレオシドが2’−MOEヌクレオシドである。特定の実施形態では、前記領域の各ヌクレオシドがcEtヌクレオシドである。特定の実施形態では、前記領域の各ヌクレオシドがLNAヌクレオシドである。特定の実施形態では、前記一様な領域が、前記オリゴヌクレオチドの全部または本質的に全部を構成する。特定の実施形態では、前記領域が1〜4個の末端ヌクレオシドを除くオリゴヌクレオシド全体を構成する。

特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、糖修飾が交互に並んだ1つ以上の領域を含み、前記ヌクレオシドは、第1タイプの糖修飾を有するヌクレオチドと、第2タイプの糖修飾を有するヌクレオチドとの間で交互する。特定の実施形態では、両タイプのヌクレオシドがRNA様ヌクレオシドである。特定の実施形態では、交互に並ぶヌクレオシドが、2’−OMe、2’−F、2’−MOE、LNA、及びcEtから選択される。特定の実施形態では、交互修飾が、2’−F及び2’−OMeである。そのような領域は連続していてもよいし、異なる修飾がなされたヌクレオシドまたは共役ヌクレオシドによって中断されていてもよい。

特定の実施形態では、交互修飾の交互領域が、それぞれ単一のヌクレオシドからなる(すなわち、パターンは(AB)_xA_yであり、ここでAは第1タイプの糖修飾を有するヌクレオシドであり、Bは第2タイプの糖修飾を有するヌクレオシドである。また、xは1〜20であり、yは0または1である)。特定の実施形態では、交互モチーフで交互に並ぶ1つ以上の領域が、あるタイプのヌクレオシドを2つ以上含む。例えばオリゴヌクレオチドは、以下のヌクレオシドモチーフのいずれかの領域を1つ以上含みうる: AABBAA、 ABBABB、 AABAAB、 ABBABAABB、 ABABAA、 AABABAB、 ABABAA、 ABBAABBABABAA、 BABBAABBABABAA、または ABABBAABBABABAA [式中、Aは第1タイプのヌクレオシドであり、Bは第2タイプのヌクレオシドである]。特定の実施形態では、A及びBは、それぞれ2’−F、2’−OMe、BNA、及びMOEから選択される。

特定の実施形態では、そのような交互モチーフを有するオリゴヌクレオチドが、修飾5’末端ヌクレオシド、例えば式IIcまたは式IIeに示すものも含む。

特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが、2−2−3モチーフを有する領域を含む。そのような領域は、以下のモチーフを含む: −(A)₂−(B)_x−(A)₂−(C)_y−(A)₃− 式中、Aは第1タイプの修飾ヌクレオシドであり、 B及びCは、Aとは異なる修飾がなされたヌクレオシドであるが、BとCとは互いに同じ修飾を有しても異なる修飾を有してもよく、 x及びyは1〜15である。

特定の実施形態では、Aが2’−OMe修飾ヌクレオシドである。特定の実施形態では、B及びCがどちらも2’−F修飾ヌクレオシドである。特定の実施形態では、Aが2’−OMe修飾ヌクレオシドであり、かつBとCがどちらも2’−F修飾ヌクレオシドである。

特定の実施形態では、オリゴヌクレオシドが、以下の糖モチーフを有する: 5’−(Q)−(AB)_xA_y−(D)_z 式中、 Qは、安定化されたホスフェート部分を含むヌクレオシドであり(特定の実施形態では、Qが、式IIcまたは式IIeを有するヌクレオシドである)、 Aは、第1タイプの修飾ヌクレオシドであり、 Bは、第2タイプの修飾ヌクレオシドであり、 Dは、Dと隣り合うヌクレオシドとは異なる修飾を含む修飾ヌクレオシドであり(したがって、もしyが0であれば、Dには、Bとは異なる修飾がなされていなければならず、yが1であれば、Dには、Aとは異なる修飾がなされていなくてはならない。特定の実施形態では、Dが、AともBとも異なる)、 Xは5〜15であり、 Yは0または1であり、 Zは0〜4である。

特定の実施形態では、オリゴヌクレオシドが次の糖モチーフを有する: 5’−(Q)−(A)_x−(D)_z 式中、 Qは、安定化されたホスフェート部分を含むヌクレオシドであり(特定の実施形態では、Qが式IIcまたは式IIeを有するヌクレオシドである)、 Aは、第1タイプの修飾ヌクレオシドであり、 Dは、Aとは異なる修飾を含む修飾ヌクレオシドであり、 Xは11〜30であり、 Zは0〜4である。

特定の実施形態では、上記モチーフ中のA、B、C、及びDが、2’−OMe、2’−F、2’−MOE、LNA、及びcEtから選択される。特定の実施形態では、Dが末端ヌクレオシドを表す。特定の実施形態では、そのような末端ヌクレオシドが、標的核酸にハイブリダイズするようには設計されていない(ただし偶然ハイブリダイズするものは多少あるかもしれない)。特定の実施形態では、各Dヌクレオシドの核酸塩基が、標的核酸の対応する位置にある核酸塩基の実体には関わりなく、アデニンである。特定の実施形態では、各Dヌクレオシドの核酸塩基がチミンである。

特定の実施形態において、アンチセンス化合物(ssRNAとしての使用に特に適したものを含む)は、オリゴヌクレオチドまたはその領域に沿って、所定のパターンまたは修飾ヌクレオシド間連結部モチーフで配置された修飾ヌクレオシド間連結部を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが、交互ヌクレオシド間連結部モチーフを有する領域を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが、一様な修飾ヌクレオシド間連結部の領域を含む。特定のそのような実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部によって一様に連結された領域を含む。特定の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部によって一様に連結されている。特定の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間連結部が、ホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択される。特定の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間連結部がホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択され、かつ少なくとも1つのヌクレオシド間連結部がホスホロチオエートである。

特定の実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも6つのホスホロチオエートヌクレオシド間連結部を含む。特定の実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも8つのホスホロチオエートヌクレオシド間連結部を含む。特定の実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも10個のホスホロチオエートヌクレオシド間連結部を含む。特定の実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも6つの連続するホスホロチオエートヌクレオシド間連結部のブロックを少なくとも1つは含む。特定の実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも8つの連続するホスホロチオエートヌクレオシド間連結部のブロックを少なくとも1つは含む。特定の実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも10個の連続するホスホロチオエートヌクレオシド間連結部のブロックを少なくとも1つは含む。特定の実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも12個の連続するホスホロチオエートヌクレオシド間連結部のブロックを少なくとも1つは含む。特定のそのような実施形態では、少なくとも1つのそのようなブロックが、前記オリゴヌクレオチドの3’端に位置する。特定のそのような実施形態では、少なくとも1つのそのようなブロックが、前記オリゴヌクレオチドの3’端から3ヌクレオシド以内に位置する。

本明細書に記載するさまざまな糖モチーフのいずれかを有するオリゴヌクレオチドは、任意の連結部モチーフを有しうる。例えばオリゴヌクレオチド(例えば上述のものが挙げられるが、それらに限定されない)は、以下の非限定的な表から選択される連結部モチーフを有しうる。

ii.siRNA化合物 特定の実施形態では、アンチセンス化合物が二本鎖RNAi化合物(siRNA)である。そのような実施形態では、一方の鎖または両方の鎖が、ssRNAについて上述した任意の修飾モチーフを含みうる。特定の実施形態において、ssRNA化合物は無修飾RNAでありうる。特定の実施形態において、siRNA化合物は無修飾RNAヌクレオシドと修飾ヌクレオシド間連結部とを含みうる。

いくつかの実施形態は、二本鎖組成物であって、各鎖が1つ以上の修飾ヌクレオシドまたは無修飾ヌクレオシドの場所によって定義されるモチーフを含む、前記二本鎖組成物に関する。特定の実施形態では、完全にハイブリダイズするかまたは少なくとも部分的にハイブリダイズして二重鎖領域を形成する第1オリゴマー化合物と第2オリゴマー化合物とを含む組成物であって、核酸標的に相補的で核酸標的にハイブリダイズする領域をさらに含む、前記組成物が提供される。そのような組成物が、核酸標的に対する完全な相補性または部分的相補性を有するアンチセンス鎖である第1オリゴマー化合物と、第1オリゴマー化合物に対して相補的な1つ以上の領域を有し第1オリゴマー化合物と共に少なくとも1つの二重鎖領域を形成する第2オリゴマー化合物とを含むことは、適切である。

いくつかの実施形態の組成物は、核酸標的にハイブリダイズしてその正常な機能を失わせることにより、遺伝子発現を調節する。いくつかの実施形態では、標的核酸がCFBである。特定の実施形態では、標的としたCFBの分解が、本発明の組成物によって形成される活性化RISC複合体によって助長される。

いくつかの実施形態は、二本鎖組成物であって、一方の鎖が、例えばRISC(または切断)複合体への反対鎖の優先ローディングに影響を及ぼすのに役立つ、前記二本鎖組成物に向けられる。これらの組成物は、選ばれた核酸分子を標的にし、1つ以上の遺伝子の発現を調節するのに有用である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物が、標的RNAの一部分にハイブリダイズすることで、前記標的RNAの正常な機能を失わせる。

特定の実施形態は、二本鎖組成物であって、両方の鎖がヘミマー(hemimer)モチーフ、完全修飾モチーフ、位置修飾モチーフまたは交互モチーフを含む、前記二本鎖組成物に向けられる。本発明の組成物の各鎖は、例えばsiRNA経路において、ある特定の役割を果たすように、修飾することができる。各鎖に異なるモチーフを使用するか、各鎖に異なる化学修飾を持つ同じモチーフを使用することにより、アンチセンス鎖をRISC複合体に誘導すると同時に、センス鎖の組込みを阻害することができる。このモデルでは、各鎖を、その特定の役割が強化されるように、独立して修飾することができる。アンチセンス鎖は、RISCの一領域におけるその役割を強化するために、5’端を修飾することができ、一方、3’端には、RISCの異なる領域におけるその役割を強化するために、異なる修飾を加えることができる。

二本鎖オリゴヌクレオチド分子は、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域とを含み、前記アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記センス領域は標的核酸配列またはその一部分に対応するヌクレオチド配列を有する、二本鎖ポリヌクレオチド分子であることができる。二本鎖オリゴヌクレオチド分子は、一方の鎖がセンス鎖であり、他方がアンチセンス鎖である、2つの別個のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、前記アンチセンス鎖及びセンス鎖は自己相補的である(すなわち各鎖は、他方の鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列であって、例えばアンチセンス鎖とセンス鎖は二重鎖構造または二本鎖構造を形成し、例えば前記二本鎖領域は約15〜約30、例えば約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30塩基対である。また、アンチセンス鎖は標的核酸分子またはその一部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖は標的核酸配列またはその一部分に対応するヌクレオチド配列を含む(例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド分子のうちの約15〜約25ヌクレオチドまたはそれ以上が、標的核酸またはその一部分に相補的である)。あるいは、前記二本鎖オリゴヌクレオチドは単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、この場合、siRNAの自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域は、核酸系リンカーまたは非核酸系リンカーを利用して連結されている。

前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造を持ち、自己相補的センス領域とアンチセンス領域とを有する、ポリヌクレオチドであって、前記アンチセンス領域が、別個の標的核酸分子またはその一部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記センス領域が前記標的核酸配列またはその一部分に対応するヌクレオチド配列を有するものであることができる。前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、2つ以上のループ構造と、自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を含むステムとを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであって、前記アンチセンス領域は標的核酸分子またはその一部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ前記センス領域は前記標的核酸配列またはその一部分に対応するヌクレオチド配列を有するものであることができ、前記環状ポリヌクレオチドは、インビボまたはインビトロでプロセシングを受けて、RNAiを媒介する能力を有する活性なsiRNA分子を生成させることができる。

特定の実施形態では、前記二本鎖オリゴヌクレオチドが、別個のセンス配列またはセンス領域及びアンチセンス配列またはアンチセンス領域を含み、前記センス領域とアンチセンス領域は、当技術分野に知られているヌクレオチド連結分子または非ヌクレオチド連結分子によって共有結合的に連結されているか、あるいはイオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、及び/またはスタッキング相互作用によって非共有結合的に連結されている。特定の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドが、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。もう一つの実施形態では、前記二本鎖オリゴヌクレオチドが、標的遺伝子のヌクレオチド配列と、前記標的遺伝子の発現阻害を引き起こすような形で相互作用する。

本明細書にいう二本鎖オリゴヌクレオチドは、RNAだけを含有する分子に限定される必要はなく、さらに化学修飾ヌクレオチド及び非ヌクレオチドも包含する。特定の実施形態において、短鎖干渉核酸分子は2’−ヒドロキシ(2’−OH)含有ヌクレオチドを欠く。特定の実施形態において、短鎖干渉核酸は、場合によっては、リボヌクレオチド(例えば2’−OH基を有するヌクレオチド)を一切含まない。しかし、RNAiを支持するために分子内にリボヌクレオチドの存在を必要としないそのような二本鎖オリゴヌクレオチドには、2’−OH基を持つ1つまたは複数のヌクレオチドを含有する1つまたは複数のリンカーを取り付けておくか、2’−OH基を持つ1つまたは複数のヌクレオチドを含有する他の基、部分、または鎖を取り付けまたは会合させておくことができる。場合により、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド位置の約5、10、20、30、40、または50%に、リボヌクレオチドを含むことができる。本明細書において使用する用語siRNAは、配列特異的RNAiを媒介する能力を有する核酸分子を記載するために使用される他の用語、例えば短鎖干渉RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子ヘアピンRNA(shRNA)、短鎖干渉オリゴヌクレオチド、短鎖干渉核酸、短鎖干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾siRNA、転写後遺伝子サイレンシングRNA(ptgsRNA)その他と等価であるものとする。加えて、本明細書において使用する用語RNAiは、配列特異的RNA干渉を記述するために使用される他の用語、例えば転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、またはエピジェネティクスなどと等価であるものとする。例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドは、転写後レベルと転写前レベルのどちらでも、遺伝子をエピジェネティックにサイレンシングするために使用することができる。非限定的な一例において、本発明のsiRNA分子による遺伝子発現のエピジェネティックな調整は、遺伝子発現を改変するためのクロマチン構造またはメチル化パターンのsiRNA媒介修飾に起因しうる(例えばVerdel et al.,2004,Science,303,672−676;Pal−Bhadra et al.,2004,Science,303,669−672;Allshire,2002,Science,297,1818−1819;Volpe et al.,2002,Science,297,1833−1837;Jenuwein,2002,Science,297,2215−2218;及びHall et al.,2002,Science,297,2232−2237を参照されたい)。

ここに提供するいくつかの実施形態の化合物及び組成物は、例えば自己相補的配列を持つ一本のRNA鎖が二本鎖コンフォメーションをとる能力を持つ「ヘアピン」またはステム−ループ二本鎖RNAエフェクター分子や、2本の別個のRNA鎖を含む二重鎖dsRNAエフェクター分子などといったdsRNA媒介遺伝子サイレンシング機序またはRNAi機序によって、CFBを標的にすることができると考えられる。さまざまな実施形態において、dsRNAはもっぱらリボヌクレオチドからなるか、またはリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの混合物からなる(例えば2000年4月19日に出願されたWO00/63364または1999年4月21日に出願された米国出願第60/130,377号などに開示されているRNA/DNAハイブリッド)。dsRNAまたはdsRNAエフェクター分子は、前記分子の一セグメントが前記分子のもう一つのセグメントにあるヌクレオチドと塩基対を形成するように自己相補性領域を持つ単一の分子でありうる。さまざまな実施形態において、単一の分子からなるdsRNAは、もっぱらリボヌクレオチドからなるか、またはデオキシリボヌクレオチドの領域に相補的なリボヌクレオチドの領域を含む。あるいは、dsRNAは、互いに相補性領域を有する2つの異なる鎖を含みうる。

さまざまな実施形態では、両方の鎖がもっぱらリボヌクレオチドからなるか、一方の鎖がもっぱらリボヌクレオチドからなり、かつ一方の鎖がもっぱらデオキシリボヌクレオチドからなるか、または一方もしくは両方の鎖がリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの混合物を含有する。特定の実施形態では、相補性領域が、互いに、及び標的核酸配列に対して、少なくとも70、80、90、95、98、または100%相補的である。特定の実施形態では、二本鎖コンフォメーションで存在するdsRNAの領域が、少なくとも19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、50、75、100、200、500、1000、2000または5000ヌクレオチドを含むか、dsRNAに表現されているcDNAまたは他の標的核酸配列中のヌクレオチドのすべてを含む。いくつかの実施形態では、dsRNAが、一本鎖端などの一本鎖領域を一切含有しないか、またはdsRNAがヘアピンである。別の実施形態では、dsRNAが1つ以上の一本鎖領域またはオーバーハングを有する。特定の実施形態では、RNA/DNAハイブリッドが、アンチセンス鎖またはアンチセンス領域である(例えば標的核酸に対して少なくとも70、80、90、95、98、または100%の相補性を有する)DNA鎖またはDNA領域と、センス鎖またはセンス領域である(例えば標的核酸に対して少なくとも70、80、90、95、98、または100%の同一性を有する)RNA鎖またはRNA領域とを含むか、またはその逆である。

さまざまな実施形態では、前記RNA/DNAハイブリッドが、酵素法または化学合成法、例えば本明細書に記載するもの、または2000年4月19日に出願されたWO00/63364または1999年4月21日に出願された米国出願第60/130,377号に記載されているものを使って、インビトロで作製される。別の実施形態では、インビトロで合成されたDNA鎖が、細胞への前記DNA鎖の形質転換に先だって、またはその後に、またはそれと並行して、インビボまたはインビトロで作製されたRNA鎖と複合体を形成する。さらに別の実施形態では、dsRNAが、センス領域とアンチセンス領域とを含有する単一の環状核酸であるか、またはdsRNAが、環状核酸と第二の環状核酸または線状核酸とを含む(例えば2000年4月19日に出願されたWO00/63364または1999年4月21日に出願された米国出願第60/130,377号を参照されたい)。例示的環状核酸として、ヌクレオチドの遊離5’ホスホリル基がもう一つのヌクレオチドの2’ヒドロキシル基に輪を描いて元に戻るように連結された状態になる、投げ縄(lariat)構造が挙げられる。

別の実施形態では、dsRNAが、糖の2’位にハロゲン(フッ素基など)を含有するか、アルコキシ基(メトキシ基など)を含有する修飾ヌクレオチドを1つ以上含有する。このハロゲンまたはアルコキシ基は、対応する2’位が水素またはヒドロキシル基を含有する対応するdsRNAと比較して、dsRNAのインビトロまたはインビボでの半減期を増加させる。さらに別の実施形態では、dsRNAが、隣接するヌクレオチド間に天然に存在するホスホジエステル連結部以外の連結部を1つ以上含む。そのような連結部の例として、ホスホルアミド、ホスホロチオエート、及びホスホロジチオエート連結部が挙げられる。dsRNAは、米国特許第6,673,661号に教示されているような化学修飾核酸分子であってもよい。別の実施形態では、dsRNAが、例えば2000年4月19日に出願されたWO00/63364または1999年4月21日に出願された米国出願第60/130,377号に開示されているように、1本または2本のキャップ鎖を含有する。

別の実施形態では、dsRNAが、WO 00/63364に開示されている少なくとも部分的なdsRNA分子のいずれかであることも、米国仮特許出願第60/399,998号及び米国仮特許出願第60/419,532号ならびにPCT/US2003/033466に記載のdsRNA分子のいずれかであることもでき、これらの文献の教示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。dsRNAはいずれも、本明細書に記載する方法を使って、または標準的方法、例えばWO00/63364に記載の方法を使って、インビトロまたはインビボで発現させることができる。

占有 特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、RNase Hによる標的核酸の切断をもたらすとも、RISC経路による切断または隔離をもたらすとも予想されない。特定のそのような実施形態では、アンチセンス活性が占有に起因しうる。この場合は、ハイブリダイズしたアンチセンス化合物の存在が、標的核酸の活性を妨害する。特定のそのような実施形態では、アンチセンス化合物が、一様に修飾されていてもよいし、修飾物が混在し、かつ/または修飾ヌクレオシドと無修飾ヌクレオシドとが混在していてもよい。

標的核酸、標的領域及びヌクレオチド配列 補体B因子(CFB)をコードするヌクレオチド配列には、次に挙げるものがあるが、これらに限定されない:GENBANKアクセッション番号NM_001710.5(本明細書には配列番号1として組み込まれる)、ヌクレオチド31852000〜31861000が切り出されたGENBANKアクセッション番号NT_007592.15(本明細書には配列番号2として組み込まれる)、ヌクレオチド536000〜545000が切り出されたGENBANKアクセッション番号NW_001116486.1(本明細書には配列番号3として組み込まれる)、GENBANKアクセッション番号XM_001113553.2(本明細書には配列番号4として組み込まれる)、またはGENBANKアクセッション番号NM_008198.2(本明細書には配列番号5として組み込まれる)。

ハイブリダイゼーション いくつかの実施形態では、本明細書に開示するアンチセンス化合物とCFB核酸との間でハイブリダイゼーションが起こる。最もよくあるハイブリダイゼーションの機序は、核酸分子の相補的核酸塩基間での水素結合形成(例えばワトソン−クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合形成)を必要とする。

ハイブリダイゼーションは、さまざまな条件下で起こりうる。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、ハイブリダイズさせようとする核酸分子の性質及び組成によって決まる。

ある配列が標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができるかどうかを決定する方法は、当技術分野では周知である。特定の実施形態において、ここに提供するアンチセンス化合物は、CFB核酸と特異的にハイブリダイズすることができる。

相補性 アンチセンス化合物の十分な数の核酸塩基が、所望の効果(例えばCFB核酸などの標的核酸のアンチセンス阻害)が生じるような形で、標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合することができるのであれば、そのアンチセンス化合物と標的核酸とは互いに相補的である。

アンチセンス化合物が依然として標的核酸に特異的にハイブリダイズできるのであれば、アンチセンス化合物とCFB核酸の間の非相補的核酸塩基は許容されうる。さらにまた、アンチセンス化合物は、介在セグメントまたは隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないような形で、CFB核酸の1つ以上のセグメントにハイブリダイズしてもよい(例えばループ構造、ミスマッチ、またはヘアピン構造)。

特定の実施形態において、ここに提供するアンチセンス化合物またはその指定部分は、CFB核酸、その標的領域、標的セグメント、または指定部分に対して、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%相同であるか、または少なくとも70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%相同である。標的核酸に対するアンチセンス化合物の相補性パーセントは、常法を使って決定することができる。

例えば、アンチセンス化合物の20核酸塩基中18核酸塩基が標的領域に相補的であり、それゆえに特異的にハイブリダイズするであろうアンチセンス化合物は、90パーセントの相補性に相当するであろう。この例では、残りの非相補的核酸塩基は一かたまりになって存在してもよいし、相補的核酸塩基の間に点在していてもよく、互いに連続している必要も、相補的核酸塩基と連続している必要もない。したがって、標的核酸と完全に相補的な2つの領域に挟まれた4つの非相補的核酸塩基を有する18核酸塩基長のアンチセンス化合物は、標的核酸に対して77.8%の総相補性を有し、したがって本発明の範囲に包含されるであろう。標的核酸の一領域に対するアンチセンス化合物の相補性パーセントは、当技術分野において知られているBLASTプログラム(basic local alignment search tool)及びPowerBLASTプログラム(Altschul et al.,J.Mol.Biol.,1990,215,403 410;Zhang and Madden,Genome Res.,1997,7,649 656)を使って、ルーチンに決定することができる。相同性パーセント、配列同一性パーセントまたは配列相補性パーセントは、例えばSmithとWatermanのアルゴリズム(Adv.Appl.Math.,1981,2,482 489)を使用するGapプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,ウィスコンシン州マディソン、ユニバーシティ・リサーチ・パーク)により、デフォルト設定を使って決定することができる。

特定の実施形態では、ここに提供するアンチセンス化合物またはその指定部分が、標的核酸またはその指定部分に完全に相補的(すなわち100%相補的)である。例えばアンチセンス化合物は、CFB核酸、またはその標的領域、または標的セグメントもしくは標的配列に完全に相補的でありうる。本明細書にいう「完全に相補的」とは、アンチセンス化合物の各核酸塩基が、標的核酸の対応する核酸塩基と正確に塩基対合する能力を有することを意味する。例えば20核酸塩基アンチセンス化合物は、そのアンチセンス化合物に完全に相補的な対応する20核酸塩基部分が標的核酸中に存在するのであれば、400核酸塩基長の標的配列に対して完全に相補的である。第1及び/または第2核酸の指定部分に関して完全に相補的という表現を使用することもできる。例えば30核酸塩基アンチセンス化合物の20核酸塩基部分は、400核酸塩基長の標的配列に対して「完全に相補的」であることができる。30核酸塩基オリゴヌクレオチドの20核酸塩基部分は、標的配列が対応する20核酸塩基部分(その各核酸塩基がアンチセンス化合物の前記20核酸塩基部分に相補的であるもの)を有するのであれば、標的配列に対して完全に相補的である。同時に、前記30核酸塩基アンチセンス化合物全体は、前記アンチセンス化合物の残りの10核酸塩基も標的配列に相補的であるかどうかに依存して、標的配列に対して完全に相補的である場合も、そうでない場合もある。

非相補的核酸塩基の場所はアンチセンス化合物の5’端または3’端であることができる。あるいは、1つまたは複数の非相補的核酸塩基が、アンチセンス化合物の内部位置にあってもよい。2つ以上の非相補的核酸塩基が存在する場合、それらは連続して(すなわち連結されて)いてもよいし、不連続であってもよい。一実施形態では、非相補的核酸塩基が、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドのウイングセグメント中にある。

特定の実施形態において、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20核酸塩基長のアンチセンス化合物または11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20核酸塩基長までのアンチセンス化合物が、CFB核酸またはその指定部分などの標的核酸との比較で含む非相補的核酸塩基は、4つ以下、3つ以下、2つ以下、または1つ以下である。

特定の実施形態において、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30核酸塩基長のアンチセンス化合物または11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30核酸塩基長までのアンチセンス化合物が、CFB核酸またはその指定部分などの標的核酸との比較で含む非相補的核酸塩基は、6つ以下、5つ以下、4つ以下、3つ以下、2つ以下、または1つ以下である。

ここに提供するアンチセンス化合物には、標的核酸の一部分に相補的なものも含まれる。ここでいう「一部分」とは、標的核酸の一領域または一セグメント内の所定の数の連続する(すなわち連結された)核酸塩基を指す。「一部分」は、アンチセンス化合物の、所定の数の連続する核酸塩基も意味しうる。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、ある標的セグメントの少なくとも8核酸塩基部分に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、ある標的セグメントの少なくとも9核酸塩基部分に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、ある標的セグメントの少なくとも10核酸塩基部分に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、ある標的セグメントの少なくとも11核酸塩基部分に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、ある標的セグメントの少なくとも12核酸塩基部分に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、ある標的セグメントの少なくとも13核酸塩基部分に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、ある標的セグメントの少なくとも14核酸塩基部分に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、ある標的セグメントの少なくとも15核酸塩基部分に相補的である。ある標的セグメントの少なくとも9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20核酸塩基部分もしくはそれ以上の核酸塩基部分、またはこれらの値のうちの任意の2つによって画定される範囲に相補的な、アンチセンス化合物も考えられる。

同一性 ここに提供するアンチセンス化合物は、ある特定ヌクレオチド配列、配列番号、もしくは具体的Isis番号によって表される化合物、またはその一部分に対して、所定の同一性パーセントも有しうる。本明細書にいうアンチセンス化合物は、それが同じ核酸塩基対合能を有するのであれば、本明細書に開示する配列と同一である。例えば、ウラシルとチミジンはどちらもアデニンと対合するので、開示したDNA配列中のチミジンの代わりにウラシルを含有するRNAは、前記DNA配列と同一であるとみなされるであろう。本明細書に記載するアンチセンス化合物の短縮型及び延長型、ならびにここに提供するアンチセンス化合物と比較して非同一塩基を有する化合物も考えられる。非同一塩基は互いに隣り合っていてもよいし、アンチセンス化合物全体に散在していてもよい。アンチセンス化合物のパーセント同一性は、比較対象である配列との比較で同一塩基対合を有する塩基の数に従って計算される。

特定の実施形態では、アンチセンス化合物またはその一部分が、本明細書に開示するアンチセンス化合物、配列番号、またはその一部分の1つ以上と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一である。

特定の実施形態では、アンチセンス化合物の一部分を、標的核酸のうちの長さが等しい部分と比較する。特定の実施形態では、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25核酸塩基部分を、標的核酸のうちの長さが等しい部分と比較する。

特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの一部を、標的核酸のうちの長さが等しい部分と比較する。特定の実施形態では、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25核酸塩基部分を、標的核酸のうちの長さが等しい部分と比較する。

修飾 ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの核酸塩基(塩基ともいう)部分は、通常、複素環式塩基部分である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合で連結されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合は、リン酸基を、糖の2’、3’または5’ヒドロキシル部分に連結することができる。オリゴヌクレオチドは、互いに隣り合うヌクレオシドを共有結合で連結して、線状ポリマー状のオリゴヌクレオチドを形成させることによって形成される。オリゴヌクレオチド構造内では、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結部を形成していると、一般に言われる。

アンチセンス化合物の修飾には、ヌクレオシド間連結部、糖部分、または核酸塩基の置換または改変が包含される。修飾アンチセンス化合物は、例えば強化された細胞取り込み、核酸標的に対する強化されたアフィニティ、ヌクレアーゼの存在下での増加した安定性、増加した阻害活性などといった望ましい性質ゆえに、ネイティブ型より好ましいことが多い。

化学修飾ヌクレオシドは、短縮型または切断型アンチオリゴヌクレオチドの、その標的核酸に対する結合アフィニティを増加させるために使用することもできる。結果として、そのような化学修飾ヌクレオシドを有する短いアンチセンス化合物で、匹敵する結果を得ることができる場合が多い。

修飾ヌクレオシド間連結部 RNA及びDNAの天然に存在するヌクレオシド間連結部は、3’→5’ホスホジエステル連結部である。1つ以上の修飾(すなわち天然に存在しない)ヌクレオシド間連結部を有するアンチセンス化合物は、例えば強化された細胞取り込み、核酸標的に対する強化されたアフィニティ、及びヌクレアーゼの存在下での増加した安定性などといった望ましい性質ゆえに、天然に存在するヌクレオシド間連結部を有するアンチセンス化合物よりも選択されることが多い。

修飾ヌクレオシド間連結部を有するオリゴヌクレオチドには、リン原子が保たれているヌクレオシド間連結部と、リン原子を有さないヌクレオシド間連結部とが含まれる。代表的なリン含有ヌクレオシド間連結部には、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホラミデート、及びホスホロチオエートが含まれるが、これらに限定されない。リン含有連結部及び非リン含有連結部を調製する方法は、よく知られている。

特定の実施形態では、CFB核酸を標的とするアンチセンス化合物が、1つ以上の修飾ヌクレオシド間連結部を含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオシド間連結部がホスホロチオエート連結部である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物の各ヌクレオシド間連結部がホスホロチオエートヌクレオシド間連結部である。

特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドまたはその一領域に沿って、所定のパターンまたは修飾ヌクレオシド間連結部モチーフで配置された修飾ヌクレオシド間連結部を含む。特定の実施形態では、ヌクレオシド間連結部が、ギャップモチーフ(gapped motif)で配置される。そのような実施形態では、2つのウイング領域のそれぞれにあるヌクレオシド間連結部が、ギャップ領域中のヌクレオシド間連結部とは異なる。特定の実施形態では、ウイング中のヌクレオシド間連結部はホスホジエステルであり、ギャップ中のヌクレオシド間連結部はホスホロチオエートである。ヌクレオシドモチーフは独立して選択されるので、ギャップヌクレオシド間連結部モチーフを有するオリゴヌクレオチドは、ギャップヌクレオシドモチーフを有しても有さなくてもよく、ギャップヌクレオシドモチーフを有する場合、ウイング長とギャップ長は同じであっても同じでなくてもよい。

特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが、交互ヌクレオシド間連結部モチーフを有する領域を含む。特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドが、一様に修飾されたヌクレオシド間連結部の一領域を含む。特定のそのような実施形態では、オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部によって一様に連結された領域を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートによって一様に連結されている。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間連結部が、ホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択される。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間連結部がホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択され、少なくとも1つのヌクレオシド間連結部がホスホロチオエートである。

特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが、少なくとも6つのホスホロチオエートヌクレオシド間連結部を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが少なくとも8つのホスホロチオエートヌクレオシド間連結部を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが少なくとも10個のホスホロチオエートヌクレオシド間連結部を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが少なくとも6つの連続するホスホロチオエートヌクレオシド間連結部のブロックを少なくとも1つは含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが少なくとも8つの連続するホスホロチオエートヌクレオシド間連結部のブロックを少なくとも1つは含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが少なくとも10個の連続するホスホロチオエートヌクレオシド間連結部のブロックを少なくとも1つは含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが少なくとも12個の連続するホスホロチオエートヌクレオシド間連結部のブロックを少なくとも1つは含む。特定のそのような実施形態では、少なくとも1つの上述のブロックが、オリゴヌクレオチドの3’端に位置する。特定のそのような実施形態では、少なくとも1つの上述のブロックがオリゴヌクレオチドの3’端から3ヌクレオシド以内に位置する。

特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが、1つ以上のメチルホスホネート連結部を含む。特定の実施形態では、ギャップマーヌクレオシドモチーフを有するオリゴヌクレオチドが、1つまたは2つのメチルホスホネート連結部を除くすべてがホスホロチオエート連結部である連結部モチーフを含む。特定の実施形態では、1つのメチルホスホネート連結部が、ギャップマーヌクレオシドモチーフを有するオリゴヌクレオチドの中央のギャップ中にある。

特定の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部とホスホジエステルヌクレオシド間連結部の数を、ヌクレアーゼ耐性が維持されるように定めることが望ましい。特定の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部の数と位置及びホスホジエステルヌクレオシド間連結部の数と位置を、ヌクレアーゼ耐性が維持されるように定めることが望ましい。特定の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部を減少させ、かつホスホジエステルヌクレオシド間連結部の数を増加させることができる。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ耐性を維持したまま、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部の数を減少させ、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部を増加させることができる。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ耐性を保ったまま、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部の数を減少させることが望ましい。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ活性を保ったまま、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部の数を増加させることが望ましい。

修飾糖部分 アンチセンス化合物は、場合によっては、糖基が修飾されているヌクレオシドを1つ以上含有しうる。そのような糖修飾ヌクレオシドは、強化されたヌクレアーゼ安定性、増加した結合アフィニティ、または他の何らかの有益な生物学的性質を、アンチセンス化合物に付与しうる。特定の実施形態では、ヌクレオシドが化学修飾リボフラノース環部分を含む。化学修飾リボフラノース環の例には、置換基の付加(5’置換基、2’置換基、非ジェミナル環原子の架橋による二環式核酸(BNA)の形成、S、N(R)、またはC(R₁)(R₂)(R、R₁及びR₂は、それぞれ独立して、H、C₁−C₁₂アルキルまたは保護基である)によるリボシル環酸素原子の置き換え、及びそれらの組み合わせなどがあるが、これらに限定されない。化学修飾糖の例としては、2’−F−5’−メチル置換ヌクレオシド(開示されている他の5’,2’−ビス置換ヌクレオシドについては、PCT国際出願WO2008/101157(公開日2008年8月21日)を参照されたい)、またはSによるリボシル環酸素原子の置き換えと2’位におけるさらなる置換(米国特許出願公開US2005−0130923(公開日2005年6月16日)参照)、あるいはBNAの5’−置換(PCT国際出願WO2007/134181(公開日2007年11月22日)参照、この場合はLNAが例えば5’−メチル基または5’−ビニル基で置換されている)などがある。

修飾糖部分を有するヌクレオシドの例には、5’−ビニル、5’−メチル(RまたはS)、4’−S、2’−F、2’−OCH₃、2’−OCH₂CH₃、2’−OCH₂CH₂F及び2’−O(CH₂)₂OCH₃置換基を含むヌクレオシドがあるが、これらに限定されない。2’位の置換基は、アリル、アミノ、アジド、チオ、O−アリル、O−C₁−C₁₀アルキル、OCF₃、OCH₂F、O(CH₂)₂SCH₃、O(CH₂)₂−O−N(R_m)(R_n)、O−CH₂−C(=O)−N(R_m)(R_n)、及びO−CH₂−C(=O)−N(R_l)−(CH₂)₂−N(R_m)(R_n)から選択することもできる(ここで、各R_l、R_m及びR_nは、独立して、Hまたは置換もしくは無置換C₁−C₁₀アルキルである)。

本明細書にいう「二環式ヌクレオシド」とは、二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドを指す。二環式ヌクレオシドの例には、4’リボシル環原子と2’リボシル環原子の間に橋を含むヌクレオシドなどがあるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ここに提供するアンチセンス化合物が、4’→2’橋を含む二環式ヌクレオシドを1つ以上含む。そのような4’→2’架橋二環式ヌクレオシドの例として、次式の一つが挙げられるが、これらに限定されない:4’−(CH₂)−O−2’(LNA)、4’−(CH₂)−S−2’、4’−(CH₂)₂−O−2’(ENA)、4’−CH(CH₃)−O−2’(拘束エチルまたはcEtともいう)及び4’−C−H(CH₂OCH₃)−O−2’(及びその類似体、2008年6月15日発行の米国特許第7,399,845号参照)、4’−C(CH₃)(CH₃)−O−2’(及びその類似体、国際出願公開WO2009/006478(公開日2009年1月8日)参照);4’−CH₂−N(OCH₃)−2’(及びその類似体、国際出願公開WO/2008/150729(公開日2008年12月11日)参照)、4’−CH₂−O−N(CH₃)−2’(米国特許出願公開US2004−0171570(公開日2004年9月2日)参照)、4’−CH₂−N(R)−O−2’(式中、Rは、H、C₁−C₁₂アルキル、または保護基である)(2008年7月23日発行の米国特許7,427,672号参照)、4’−CH₂−C−(H)(CH₃)−2’(Zhou et al.,J.Org.Chem.,2009,74,118−134参照)、及び4’−CH₂−C−(=CH₂)−2’(及びその類似体、国際出願公開WO 2008/154401(公開日2008年12月8日)参照)。

公表された文献には二環式ヌクレオシドに関する他の報告文も見いだすことができる(例えばSingh et al.,Chem.Commun.,1998,4,455−456;Koshkin et al.,Tetrahedron,1998,54,3607−3630;Wahlestedt et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633−5638;Kumar et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219−2222;Singh et al.,J.Org.Chem.,1998,63,10035−10039;Srivastava et al.,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26)8362−8379;Elayadi et al.,Curr.Opinion Invest.Drugs,2001,2,558−561;Braasch et al.,Chem.Biol.,2001,8,1−7;及びOrum et al.,Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239−243;米国特許第6,268,490号;同第6,525,191号;同第6,670,461号;同第6,770,748号;同第6,794,499号;同第7,034,133号;同第7,053,207号;同第7,399,845号;同第7,547,684号;同第8,530,640号;及び同第7,696,345号;米国特許出願公開番号US2008−0039618;同US2009−0012281;米国特許出願第61/026,995号及び同第61/097,787号;PCT国際出願公開WO2009/067647;同WO2011/017521;同WO2010/036698;同WO1999/014226;同WO2004/106356;同WO2005/021570;同WO2007/134181;同WO2008/150729;同WO2008/154401;及び同WO2009/006478参照。前述の二環式ヌクレオシドのそれぞれは、例えばα−L−リボフラノースとβ−D−リボフラノースなど、1つ以上の立体化学的糖配置を有するものを調製することができる(1999年3月25日にWO99/14226として公開されたPCT国際出願PCT/DK98/00393を参照されたい)。

特定の実施形態では、限定するわけではないが、BNAヌクレオシドの二環式糖部分として、ペントフラノシル糖部分の4’位と2’位の間に少なくとも1つの橋を有する化合物が挙げられ、その橋は、独立して、−[C(R_a)(R_b)]_n−、−C(R_a)=C(R_b)−、−C(R_a)=N−、−C(=O)−、−C(=NR_a)−、−C(=S)−、−O−、−Si(R_a)₂−、−S(=O)_x−、及び−N(R_a)−から独立して選択される1つの基または2〜4つの連結された基を含み、 式中、 xは、0、1、または2であり、 nは、1、2、3、または4であり、 各R_a及びR_bは、独立して、H、保護基、ヒドロキシル、C₁−C₁₂アルキル、置換C₁−C₁₂アルキル、C₂−C₁₂アルケニル、置換C₂−C₁₂アルケニル、C₂−C₁₂アルキニル、置換C₂−C₁₂アルキニル、C₅−C₂₀アリール、置換C₅−C₂₀アリール、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、C₅−C₇脂環式ラジカル、置換C₅−C₇脂環式ラジカル、ハロゲン、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、COOJ₁、アシル(C(=O)−H)、置換アシル、CN、スルホニル(S(=O)₂−J₁)、またはスルホキシル(S(=O)−J₁)であり、かつ 各J₁及びJ₂は、独立して、H、C₁−C₁₂アルキル、置換C₁−C₁₂アルキル、C₂−C₁₂アルケニル、置換C₂−C₁₂アルケニル、C₂−C₁₂アルキニル、置換C₂−C₁₂アルキニル、C₅−C₂₀アリール、置換C₅−C₂₀アリール、アシル(C(=O)−H)、置換アシル、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、C₁−C₁₂アミノアルキル、置換C₁−C₁₂アミノアルキルまたは保護基である。

特定の実施形態では、二環式糖部分の橋が−[C(R_a)(R_b)]_n−、−[C(R_a)(R_b)]_n−O−、−C(R_aR_b)−N(R)−O−または−C(R_aR_b)−O−N(R)−である。特定の実施形態では、前記橋が、4’−CH₂−2’、4’−(CH₂)₂−2’、4’−(CH₂)₃−2’、4’−CH₂−O−2’、4’−(CH₂)₂−O−2’、4’−CH₂−O−N(R)−2’及び4’−CH₂−N(R)−O−2’−であり、式中、各Rは、独立して、H、保護基またはC₁−C₁₂アルキルである。

特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドが、さらに異性立体配置によって定義される。例えば、4’−2’メチレン−オキシ橋を含むヌクレオシドは、α−L立体配置またはβ−D立体配置をとりうる。α−L−メチレンオキシ(4’−CH₂−O−2’)BNAは、以前に、アンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれており、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンス活性を示した(Frieden et al.,Nucleic Acids Research,2003,21,6365−6372)。

特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドとして、以下に図示する(A)α−L−メチレンオキシ(4’−CH₂−O−2’)BNA、(B)β−D−メチレンオキシ(4’−CH₂−O−2’)BNA、(C)エチレンオキシ(4’−(CH₂)₂−O−2’)BNA、(D)アミノオキシ(4’−CH₂−O−N(R)−2’)BNA、(E)オキシアミノ(4’−CH₂−N(R)−O−2’)BNA、及び(F)メチル(メチレンオキシ)(4’−CH(CH₃)−O−2’)BNA、(G)メチレン−チオ(4’−CH₂−S−2’)BNA、(H)メチレン−アミノ(4’−CH₂−N(R)−2’)BNA、(I)メチル炭素環式(4’−CH₂−CH(CH₃)−2’)BNA、(J)プロピレン炭素環式(4’−(CH₂)₃−2’)BNA、及び(K)ビニルBNAが挙げられるが、これらに限定されない:

式中、Bxは塩基部分であり、かつRは、独立して、H、保護基、C₁−C₁₂アルキルまたはC₁−C₁₂アルコキシである。

特定の実施形態では、式I:

[式中、 Bxは、複素環式塩基部分であり、 −Q_a−Q_b−Q_c−は、−CH₂−N(R_c)−CH₂−、−C(=O)−N(R_c)−CH₂−、−CH₂−O−N(R_c)−、−CH₂−N(R_c)−O−または−N(R_c)−O−CH₂であり、 R_cは、C₁−C₁₂アルキルまたはアミノ保護基であり、かつ T_a及びT_bは、それぞれ独立して、H、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持媒体への共有結合による取り付けである] を有する二環式ヌクレオシドが提供される。

特定の実施形態では、式II:

[式中、 Bxは、複素環式塩基部分であり、 T_a及びT_bは、それぞれ独立して、H、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持媒体への共有結合による取り付けであり、 Z_aは、C₁−C₆アルキル、C₂−C₆アルケニル、C₂−C₆アルキニル、置換C₁−C₆アルキル、置換C₂−C₆アルケニル、置換C₂−C₆アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオールまたは置換チオである] を有する二環式ヌクレオシドが提供される。

一実施形態では、前記置換基のそれぞれが、独立して、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、OJ_c、NJ_cJ_d、SJ_c、N₃、OC(=X)J_c、及びNJ_eC(=X)NJ_cJ_dから独立して選択される置換基で一置換または多置換されており、式中、各J_c、J_d及びJ_eは、独立して、H、C₁−C₆アルキル、または置換C₁−C₆アルキルであり、かつXは、OまたはNJ_cである。

特定の実施形態では、式III:

[式中、 Bxは、複素環式塩基部分であり、 T_a及びT_bは、それぞれ独立して、H、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持媒体への共有結合による取り付けであり、 Z_bは、C₁−C₆アルキル、C₂−C₆アルケニル、C₂−C₆アルキニル、置換C₁−C₆アルキル、置換C₂−C₆アルケニル、置換C₂−C₆アルキニルまたは置換アシル(C(=O)−)である] を有する二環式ヌクレオシドが提供される。

特定の実施形態では、式IV:

[式中、 Bxは、複素環式塩基部分であり、 T_a及びT_bは、それぞれ独立して、H、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持媒体への共有結合による取り付けであり、 R_dは、C₁−C₆アルキル、置換C₁−C₆アルキル、C₂−C₆アルケニル、置換C₂−C₆アルケニル、C₂−C₆アルキニルまたは置換C₂−C₆アルキニルであり、 各q_a、q_b、q_c及びq_dは、独立して、H、ハロゲン、C₁−C₆アルキル、置換C₁−C₆アルキル、C₂−C₆アルケニル、置換C₂−C₆アルケニル、C₂−C₆アルキニルまたは置換C₂−C₆アルキニル、C₁−C₆アルコキシル、置換C₁−C₆アルコキシル、アシル、置換アシル、C₁−C₆アミノアルキルまたは置換C₁−C₆アミノアルキルである] を有する二環式ヌクレオシドが提供される。

特定の実施形態では、式V:

[式中、 Bxは、複素環式塩基部分であり、 T_a及びT_bは、それぞれ独立して、H、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持媒体への共有結合による取り付けであり、 q_a、q_b、q_e及びq_fは、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、C₁−C₁₂アルキル、置換C₁−C₁₂アルキル、C₂−C₁₂アルケニル、置換C₂−C₁₂アルケニル、C₂−C₁₂アルキニル、置換C₂−C₁₂アルキニル、C₁−C₁₂アルコキシ、置換C₁−C₁₂アルコキシ、OJ_j、SJ_j、SOJ_j、SO₂J_j、NJ_jJ_k、N₃、CN、C(=O)OJ_j、C(=O)NJ_jJ_k、C(=O)J_j、O−C(=O)−NJ_jJ_k、N(H)C(=NH)NJ_jJ_k、N(H)C(=O)−NJ_jJ_kまたはN(H)C(=S)NJ_jJ_kであるか、または q_e及びq_fが全体として=C(q_g)(q_h)であり、 q_g及びq_hは、それぞれ独立して、H、ハロゲン、C₁−C₁₂アルキルまたは置換C₁−C₁₂アルキルである] を有する二環式ヌクレオシドが提供される。

メチレンオキシ(4’−CH₂−O−2’)BNAモノマーであるアデニン、シトシン、グアニン、5−メチル−シトシン、チミン及びウラシルの合成及び調製は、それらのオリゴマー化及び核酸認識特性と共に、既に記述されている(Koshkin et al.,Tetrahedron,1998,54,3607−3630)。BNAとその調製はWO98/39352及びWO99/14226にも記述されている。

メチレンオキシ(4’−CH₂−O−2’)BNA及び2’−チオ−BNAの類似体も既に調製されている(Kumar et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219−2222)。核酸ポリメラーゼの基質としてのオリゴデオキシリボヌクレオチド二重鎖を構成するロックトヌクレオシド類似体の調製も既に記述されている(Wengel et al.,WO99/14226)。さらにまた、コンフォメーションが制限された新規高アフィニティオリゴヌクレオチド類似体である2’−アミノ−BNAの合成も、当技術分野では既に記述されている(Singh et al.,J.Org.Chem.,1998,63,10035−10039)。加えて、2’−アミノ−及び2’−メチルアミノ−BNAも調製されており、相補的なRNA鎖及び相補的DNA鎖とのそれらの二重鎖の熱安定性が、以前に報告されている。

特定の実施形態では、式VI:

[式中、 Bxは、複素環式塩基部分であり、 T_a及びT_bは、それぞれ独立して、H、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持媒体への共有結合による取り付けであり、 各q_i、q_j、q_k及びq_lは、独立して、H、ハロゲン、C₁−C₁₂アルキル、置換C₁−C₁₂アルキル、C₂−C₁₂アルケニル、置換C₂−C₁₂アルケニル、C₂−C₁₂アルキニル、置換C₂−C₁₂アルキニル、C₁−C₁₂アルコキシル、置換C₁−C₁₂アルコキシル、OJ_j、SJ_j、SOJ_j、SO₂J_j、NJ_jJ_k、N₃、CN、C(=O)OJ_j、C(=O)NJ_jJ_k、C(=O)J_j、O−C(=O)−NJ_jJ_k、N(H)C(=NH)NJ_jJ_k、N(H)C(=O)−NJ_jJ_kまたはN(H)C(=S)NJ_jJ_kであり、かつ q_iとq_jまたはq_lとq_kは、全体として、=C(q_g)(q_h)であり、式中、q_g及びq_hは、それぞれ独立して、H、ハロゲン、C₁−C₁₂アルキルまたは置換C₁−C₁₂アルキルである] を有する二環式ヌクレオシドが提供される。

4’−(CH₂)₃−2’橋を有する炭素環式二環式ヌクレオシド及びアルケニル類似体橋4’−CH=CH−CH₂−2’は既に記述されている(Freier et al.,Nucleic Acids Research,1997,25(22),4429−4443及びAlbaek et al.,J.Org.Chem.,2006,71,7731−7740)。炭素環式二環式ヌクレオシドの合成及び調製も、それらのオリゴマー化及び生化学的研究と共に記述されている(Srivastava et al.,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26),8362−8379)。

本明細書にいう「4’−2’二環式ヌクレオシド」または「4’→2’二環式ヌクレオシド」とは、フラノース環の2つの炭素原子をつなぐ橋を含むフラノース環を含み、前記橋が糖環の2’炭素原子と4’炭素原子をつなぐ、二環式ヌクレオシドを指す。

本明細書にいう「単環式ヌクレオシド」とは、二環式糖部分ではない修飾糖部分を含むヌクレオシドである。特定の実施形態では、ヌクレオシドの糖部分または糖部分類似体が、どの位置で修飾または置換されていてもよい。

本明細書にいう「2’−修飾糖」とは、2’位が修飾されたフラノシル糖を意味する。特定の実施形態では、そのような修飾が、ハライド、例えば限定するわけではないが、置換及び無置換アルコキシ、置換及び無置換チオアルキル、置換及び無置換アミノアルキル、置換及び無置換アルキル、置換及び無置換アリル、及び置換及び無置換アルキニルから選択される置換基を含む。特定の実施形態では、2’修飾が、限定するわけではないが、O[(CH₂)_nO]_mCH₃、O(CH₂)_nNH₂、O(CH₂)_nCH₃、O(CH₂)_nF、O(CH₂)_nONH₂、OCH₂C(=O)N(H)CH₃、及びO(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃]₂などといった置換基(式中、n及びmは1〜約10である)から選択される。他の2’−置換基は、C₁−C₁₂アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、O−アルカリールまたはO−アラルキル、SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、F、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリ−アルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレーター、アンチセンス化合物の薬物動態特性を改良するための基または薬力学的性質を改良するための基、及び類似する性質を有する他の置換基から選択することもできる。特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドが2’−MOE側鎖を含む(Baker et al.,J.Biol.Chem.,1997,272,11944−12000)。そのような2’−MOE置換は、無修飾ヌクレオシド及び他の修飾ヌクレオシド、例えば2’−O−メチル、O−プロピル、及びO−アミノプロピルと比較して、改良された結合アフィニティを有すると記述されている。2’−MOE置換基を有するオリゴヌクレオチドは、インビボ用途に有望な特徴を持つ遺伝子発現のアンチセンス阻害剤であることも示されている(Martin,Helv.Chim.Acta,1995,78,486−504;Altmann et al.,Chimia,1996,50,168−176;Altmann et al.,Biochem.Soc.Trans.,1996,24,630−637;及びAltmann et al.,Nucleosides Nucleotides,1997,16,917−926)。

本明細書にいう「修飾テトラヒドロピランヌクレオシド」または「修飾THPヌクレオシド」とは、通常のヌクレオシド中のペントフラノシル残基の代わりに六員テトラヒドロピラン「糖」(糖代用物)が使用されているヌクレオシドを意味する。修飾THPヌクレオシドには、当技術分野においてヘキシトール核酸(HNA)、アニトール(anitol)核酸(ANA)、マニトール(manitol)核酸(MNA)(Leumann,Bioorg.Med.Chem.,2002,10,841−854)またはフルオロHNA(F−HNA)と呼ばれ、以下に図解するようにテトラヒドロピラン環系を有するものが含まれるが、これらに限定されない。

特定の実施形態では、式VII:

を有する糖代用物が選択され、 式中、前記少なくとも1つの式VIIのテトラヒドロピランヌクレオシド類似体のそれぞれについて、独立して、 Bxは、複素環式塩基部分であり、 T_a及びT_bは、それぞれ独立して、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結するヌクレオシド間連結基であるか、またはT_a及びT_bのうちの一方がテトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結するヌクレオシド間連結基であり、T_a及びT_bのうちの他方がH、ヒドロキシル保護基、連結された共役基または5’もしくは3’末端基であり、 q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆及びq₇は、それぞれ独立して、H、C₁−C₆アルキル、置換C₁−C₆アルキル、C₂−C₆アルケニル、置換C₂−C₆アルケニル、C₂−C₆アルキニルまたは置換C₂−C₆アルキニルであり、かつR₁及びR₂のそれぞれは、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、置換または無置換アルコキシ、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、OC(=X)J₁、OC(=X)NJ₁J₂、NJ₃C(=X)NJ₁J₂及びCNであり、XはO、SまたはNJ₁であり、かつ各J₁、J₂及びJ₃は、独立して、HまたはC₁−C₆アルキルである。

特定の実施形態では、q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆及びq₇がそれぞれHである、式VIIの修飾THPヌクレオシドが提供される。特定の実施形態では、q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆及びq₇のうちの少なくとも1つがH以外である。特定の実施形態では、q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆及びq₇のうちの少なくとも1つがメチルである。特定の実施形態では、R₁及びR₂のうちの一方がフルオロである、式VIIのTHPヌクレオシドが提供される。特定の実施形態では、R₁がフルオロ、かつR₂がHであり、R₁がメトキシ、かつR₂がHであり、そしてR₁がメトキシエトキシ、かつR₂がHである。

特定の実施形態では、糖代用物が、6つ以上の原子及び2つ以上のヘテロ原子を有する環を含む。例えばモルホリノ糖部分を含むヌクレオシド、及びオリゴマー化合物におけるそれらの使用が、報告されている(例えばBraasch et al.,Biochemistry,2002,41,4503−4510;及び米国特許第5,698,685号;同第5,166,315号;同第5,185,444号;及び同第5,034,506号を参照されたい)。本明細書において使用する用語「モルホリノ」とは、以下の式を有する糖代用物を意味する:

。特定の実施形態では、例えば上記モルホリノ構造にさまざまな置換基を付加するか、上記モルホリノ構造のさまざまな置換基を改変することによって、モルホリノが修飾されていてもよい。そのような糖代用物を本明細書では「修飾モルホリノ」という。

修飾の組み合わせ、例えば限定するわけではないが、2’−F−5’−メチル置換ヌクレオシド(開示されている他の5’,2’−ビス置換ヌクレオシドについてはPCT国際出願第WO2008/101157号(公開日2008年8月21日)参照)、及びSによるリボシル環酸素原子の置き換えと2’位におけるさらなる置換(米国特許出願公開US2005−0130923(公開日2005年6月16日)参照)、あるいは二環式核酸の5’−置換(PCT国際出願WO2007/134181(公開日2007年11月22日)参照、この場合は4’−CH₂−O−2’二環式ヌクレオシドの5’位が5’−メチル基または5’−ビニル基でさらに置換されている)なども提供される。炭素環式二環式ヌクレオシドの合成及び調製も、それらのオリゴマー化及び生化学的試験と共に記載されている(例えば、Srivastava et al.,J.Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362−8379を参照のこと)。

特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、天然に存在するヌクレオシド中のペントフラノシル残基の代わりに六員シクロヘキセニルを有するヌクレオシドである修飾シクロヘキセニルヌクレオシドを1つ以上含む。修飾シクロヘキセニルヌクレオシドとして、当技術分野に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない(例えば同一譲受人によるPCT出願公開WO2010/036696(公開日2010年4月10日)、Robeyns et al.,J.Am.Chem.Soc.,2008,130(6),1979−1984;Horvath et al.,Tetrahedron Letters,2007,48,3621−3623;Nauwelaerts et al.,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(30),9340−9348;Gu et al.,Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids,2005,24(5−7),993−998;Nauwelaerts et al.,Nucleic Acids Research,2005,33(8),2452−2463;Robeyns et al.,Acta Crystallographica,Section F:Structural Biology and Crystallization Communications,2005,F61(6),585−586;Gu et al.,Tetrahedron,2004,60(9),2111−2123;Gu et al.,Oligonucleotides,2003,13(6),479−489;Wang et al.,J.Org.Chem.,2003,68,4499−4505;Verbeure et al.,Nucleic Acids Research,2001,29(24),4941−4947;Wang et al.,J.Org.Chem.,2001,66,8478−82;Wang et al.,Nucleosides,Nucleotides & Nucleic Acids,2001,20(4−7),785−788;Wang et al.,J.Am.Chem.,2000,122,8595−8602;PCT出願公開WO06/047842;及びPCT出願公開WO01/049687を参照されたい;また、各文献の本文は、参照によりそのまま本明細書に組み込まれる)。特定の修飾シクロヘキセニルヌクレオシドは、式Xを有する。

式中、前記少なくとも1つの式Xのシクロヘキセニルヌクレオシド類似体のそれぞれについて、独立して、 Bxは、複素環式塩基部分であり、 T₃及びT₄は、それぞれ独立して、シクロヘキセニルヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結するヌクレオシド間連結基であるか、またはT₃及びT₄のうちの一方がテトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結するヌクレオシド間連結基であり、かつT₃及びT₄のうちの他方がH、ヒドロキシル保護基、連結された共役基、または5’末端基もしくは3’末端基であり、かつ q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆、q₇、q₈及びq₉は、それぞれ独立して、H、C₁−C₆アルキル、置換C₁−C₆アルキル、C₂−C₆アルケニル、置換C₂−C₆アルケニル、C₂−C₆アルキニル、置換C₂−C₆アルキニルまたは他の糖置換基である。

本明細書にいう「2’−修飾」または「2’−置換」は、2’位にHまたはOH以外の置換基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。2’−修飾ヌクレオシドには、糖環の2つの炭素原子をつなぐ橋が糖環の2’炭素ともう一つの炭素とをつないでいる二環式ヌクレオシド;及び非架橋2’置換基、例えばアリル、アミノ、アジド、チオ、O−アリル、O−C₁−C₁₀アルキル、−OCF₃、O−(CH₂)₂−O−CH₃、2’−O(CH₂)₂SCH₃、O−(CH₂)₂−O−N(R_m)(R_n)、またはO−CH₂−C(=O)−N(R_m)(R_n)[式中、各R_m及びR_nは、独立して、Hまたは置換または無置換C₁−C₁₀アルキルである]を有するヌクレオシドなどがあるが、これらに限定されない。2’−修飾ヌクレオシドは、例えば糖の他の位置及び/または核酸塩基に、他の修飾をさらに含んでもよい。

本明細書にいう「2’−F」とは、糖環の2’位にフルオロ基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。

本明細書にいう「2’−OMe」または「2’−OCH₃」または「2’−O−メチル」とは、それぞれ、糖環の2’位に−OCH₃基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。

本明細書にいう「MOE」または「2’−MOE」または「2’−OCH₂CH₂OCH₃」または「2’−O−メトキシエチル」とは、それぞれ、糖環の2’位に−OCH₂CH₂OCH₃基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。

本明細書にいう「オリゴヌクレオチド」とは、複数の連結されたヌクレオシドを含む化合物を指す。特定の実施形態では、前記複数のヌクレオシドのうちの1つ以上が修飾されている。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが、1つ以上のリボヌクレオシド(RNA)及び/またはデオキシリボヌクレオシド(DNA)を含む。

アンチセンス化合物に組み込むためのヌクレオシドの修飾に使用することができるビシクロ糖代用環系及びトリシクロ糖代用環系は、当技術分野では、他にも多数知られている(例えば総説Leumann,Bioorg.Med.Chem.,2002,10,841−854を参照されたい)。そのような環系には、活性を強化するために、さまざまな追加の置換を行うことができる。

修飾糖の調製方法は当業者にはよく知られている。そのような修飾糖の調製を教示する代表的米国特許の一部には、例えば限定するわけではないが、U.S.4,981,957;U.S.5,118,800;U.S.5,319,080;U.S.5,359,044;U.S.5,393,878;U.S.5,446,137;U.S.5,466,786;U.S.5,514,785;U.S.5,519,134;U.S.5,567,811;U.S.5,576,427;U.S.5,591,722;U.S.5,597,909;U.S.5,610,300;U.S.5,627,053;U.S.5,639,873;U.S.5,646,265;U.S.5,670,633;U.S.5,700,920;U.S.5,792,847及びU.S.6,600,032ならびに2005年12月22日にWO2005/121371として公開された国際出願PCT/US−2005/019219(出願日2005年6月2日) などがあり、これらはそれぞれ参照により本明細書にそのまま組み込まれる。

修飾糖部分を有するヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分(天然、修飾またはそれらの組み合わせ)は、適当な核酸標的とのハイブリダイゼーションのために維持される。

特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、修飾糖部分を有する1つ以上のヌクレオシドを含む。特定の実施形態では、修飾糖部分が2’−MOEである。特定の実施形態では、2’−MOE修飾ヌクレオシドがギャップマーモチーフで配置される。特定の実施形態では、修飾糖部分が、(4’−CH(CH₃)−O−2’)架橋基を有する二環式ヌクレオシドである。特定の実施形態では、前記(4’−CH(CH₃)−O−2’)修飾ヌクレオシドが、ギャップマーモチーフのウイング全体にわたって配置される。

修飾核酸塩基 核酸塩基(または塩基)の修飾または置換は、天然に存在する無修飾核酸塩基または合成無修飾核酸塩基とは構造上識別できるが、機能的には天然に存在する無修飾核酸塩基または合成無修飾核酸塩基と交換可能である。天然核酸塩基と修飾核酸塩基はどちらも水素結合に参加する能力を有する。そのような核酸塩基修飾は、ヌクレアーゼ安定性、結合アフィニティまたは他の何らかの有益な生物学的性質をアンチセンス化合物に付与することができる。修飾核酸塩基には、例えば5−メチルシトシン(5−me−C)などの合成及び天然核酸塩基が含まれる。5−メチルシトシン置換などの特定の核酸塩基置換は、標的核酸に対するアンチセンス化合物の結合アフィニティを増加させるのに特に有用である。例えば5−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を0.6〜1.2℃増加させることが示されている(Sanghvi,Y.S.、Crooke,S.T.及びLebleu,B.編「Antisense Research and Applications」CRC Press,ボカラトン,1993,pp.276−278)。

他の修飾核酸塩基として、5−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6−メチル誘導体及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2−プロピル誘導体及び他のアルキル誘導体、2−チオウラシル、2−チオチミン及び2−チオシトシン、5−ハロウラシル及びシトシン、5−プロピニル(−CoC−CH3)ウラシル及びシトシンならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6−アゾウラシル、シトシン及びチミン、5−ウラシル(シュードウラシル)、4−チオウラシル、8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシルならびに他の8−置換アデニン及びグアニン、5−ハロ、特に5−ブロモ、5−トリフルオロメチルならびに他の5−置換ウラシル及びシトシン、7−メチルグアニン及び7−メチルアデニン、2−F−アデニン、2−アミノ−アデニン、8−アザグアニン及び8−アザアデニン、7−デアザグアニン及び7−デアザアデニンならびに3−デアザグアニン及び3−デアザアデニンが挙げられる。

複素環式塩基部分として、プリン塩基またはピリミジン塩基が他の複素環、例えば7−デアザ−アデニン、7−デアザグアノシン、2−アミノピリジン及び2−ピリドンで置き換えられているものも挙げることができる。アンチセンス化合物の結合アフィニティを増加させるのにとりわけ有用な核酸塩基として、5−置換ピリミジン、6−アザピリミジンならびにN−2、N−6及びO−6置換プリン、例えば2−アミノプロピルアデニン、5−プロピニルウラシル及び5−プロピニルシトシンが挙げられる。

特定の実施形態では、CFB核酸を標的とするアンチセンス化合物が、1つ以上の修飾核酸塩基を含む。特定の実施形態では、CFB核酸を標的とする短縮型またはギャップ拡幅型アンチセンスオリゴヌクレオチドが1つ以上の修飾核酸塩基を含む。特定の実施形態では、修飾核酸塩基が5−メチルシトシンである。特定の実施形態では、各シトシンが5−メチルシトシンである。

共役アンチセンス化合物 特定の実施形態において、本開示は、共役アンチセンス化合物を提供する。特定の実施形態において、本開示は、核酸転写産物に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む共役アンチセンス化合物を提供する。特定の実施形態において、本開示は、細胞を、核酸転写産物に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む共役アンチセンス化合物と接触させることを含む方法を提供する。特定の実施形態において、本開示は、細胞を、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む共役アンチセンス化合物と接触させること、及び細胞内の核酸転写産物の量または活性を低減させることを含む方法を提供する。

アシアロ糖タンパク質受容体(ASGP−R)は以前に記載されている。例えばPark et al.,PNAS vol.102,No.47,pp.17125−17129(2005)を参照されたい。これらの受容体は、肝臓細胞、特に肝細胞上で発現する。さらに、3つのN−アセチルガラクトサミン(GalNAc)リガンドのクラスターを含む化合物は、ASGP−Rに結合して細胞内への当該化合物の取り込みをもたらす能力を有することが示されている。例えばKhorev et al.,Bioorganic and Medicinal Chemistry,16,9,pp.5216−5231(May 2008)を参照されたい。したがって、そのようなGalNAcクラスターを含む共役体が、肝臓細胞、具体的には肝細胞への特定化合物の取り込みを促進するために使用されている。例えば、特定のGalNAc含有共役体は、インビボで肝臓細胞における二重鎖siRNA化合物の活性を増加させることが示されている。これらの例では、GalNAc含有共役体は、典型的には、siRNA位二重鎖のセンス鎖に取り付けられる。センス鎖はアンチセンス鎖が最終的に標的核酸とハイブリダイズする前に処分されてしまうため、共役体が活性を妨害する懸念はほとんどない。典型的には、共役体は、siRNAのセンス鎖の3’端に取り付けられる。例えば米国特許第8,106,022号を参照されたい。本明細書に記載する特定の共役基は、今までに記載された共役基よりも活性が高く、かつ/または合成が容易である。

本発明の特定の実施形態において、共役体は、一本鎖アンチセンス化合物、例えば限定するわけではないが、RNase Hベースのアンチセンス化合物や、プレmRNA標的核酸のスプライシングを改変するアンチセンス化合物に、取り付けられる。そのような実施形態では、共役体は、利益(細胞内への取り込みの改良)をもたらすのに十分な時間、アンチセンス化合物に取り付けられた状態にあるべきだが、その後は、切断されるか、または他の何らかの形で、活性に必要な後続ステップ、例えば標的核酸へのハイブリダイゼーション及びRNase Hまたはスプライシングもしくはスプライシング調節に関連する酵素との相互作用などを妨害しないようにすべきである。この性質のバランスは、共役体を単にセンス鎖に取り付けるだけでよいsiRNA化合物の場合よりも、一本鎖アンチセンス化合物の場合に、より一層重要である。本明細書には、共役体を欠く同じアンチセンス化合物と比較して、インビボで肝臓細胞における力価が改良されている共役一本鎖アンチセンス化合物を開示する。これらの化合物に要求される性質のバランスを考えると、そのような力価の改良は驚くべきことである。

特定の実施形態において、本明細書における共役基は、切断可能部分を含む。機序に束縛されることは望まないが、上述のように、共役体が取り込みの強化をもたらすのに十分な時間、化合物上に残っているべきであることは必然だが、その後は、共役体の何らかの部分、理想的には共役体の全部が切断されて、親化合物(例えばアンチセンス化合物)をその最も活性な形態で放出することが望ましい。特定の実施形態では、切断可能部分が切断可能なヌクレオシドである。そのような実施形態では、共役体の残りの部分(クラスター)を、1つ以上の切断可能な結合、例えばホスホジエステル連結部のものによって、ヌクレオシドを介してアンチセンスオリゴヌクレオチドに取り付けることにより、細胞中の内在性ヌクレアーゼを利用する。特定の実施形態では、クラスターがホスホジエステル連結部を介して切断可能なヌクレオシドに結合される。特定の実施形態では、切断可能なヌクレオシドが、ホスホジエステル連結部によってアンチセンスオリゴヌクレオチド(アンチセンス化合物)に取り付けられる。特定の実施形態では、共役基が、2つまたは3つの切断可能なヌクレオシドを含みうる。そのような実施形態では、上述の切断可能なヌクレオシドが、切断可能な結合(ホスホジエステル連結部のもの)によって、互いに、アンチセンス化合物に、かつ/またはクラスターに連結される。本明細書における特定の共役体は、切断可能なヌクレオシドを含まず、代わりに切断可能な結合を含む。オリゴヌクレオチドからの共役体の十分な切離は、細胞内で切断を受けやすい少なくとも1つの結合(切断可能な結合)によってもたらされることを示す。

特定の実施形態では、共役アンチセンス化合物がプロドラッグである。そのようなプロドラッグは、動物に投与され、最終的には、より活性な形態に代謝される。例えば共役アンチセンス化合物は切断されることで、共役体の全部または一部を除去し、共役体の全部または一部を欠く活性な(またはより活性な)形態のアンチセンス化合物をもたらす。

特定の実施形態では、共役体がオリゴヌクレオチドの5’端に取り付けられる。特定のそのような5’共役体は、同様の共役基が3’端に取り付けられている対応物よりも効率よく切断される。特定の実施形態では、活性の改良が切断の改良と相関しうる。特定の実施形態では、5’端に共役体を含むオリゴヌクレオチドの有効性が、3’端に共役体を含むオリゴヌクレオチドの有効性よりも高い(例えば実施例56、81、83、及び84を参照のこと)。さらに、5’への取り付けの方が、簡単なオリゴヌクレオチド合成が可能である。オリゴヌクレオチドは、典型的には、3’→5’方向に固体支持体上で合成される。3’共役オリゴヌクレオチドを作製するには、典型的には、事前に共役基を結合しておいた3’ヌクレオシドを固体支持体に取り付けてから、オリゴヌクレオチドを通常どおりに構築する。しかし、その共役ヌクレオシドを固体支持体に取り付ける操作は、合成を複雑にする。さらに、このアプローチを使用した場合、共役体は、オリゴヌクレオチドの合成の間ずっと存在することになり、後続のステップ中に分解されてしまうか、使用できる反応と試薬の種類を制限することになりうる。5’共役オリゴヌクレオチドについて本明細書に記載する構造及び技法を用いることにより、標準的な自動化された技法を使ってオリゴヌクレオチドを合成し、最後(最も5’側)のヌクレオシドと共に共役体を導入するか、またはオリゴヌクレオチドを固体支持体から切り離してから共役体を導入することができる。

当分野の技術水準及び本開示を考慮すれば、当業者は、本明細書の共役体及び共役オリゴヌクレオチドをどれでも容易に作製することができる。さらに、本明細書に開示する特定のそのような共役体及び共役オリゴヌクレオチドの合成は、これまでに開示されていた共役体の合成よりも容易であり、かつ/または必要とするステップ数が少なく、それゆえに安価に行うことができるので、それらは製造上の利点になる。例えば、特定の共役基の合成は、これまでに記載された共役基と比較して、より少ない合成ステップからなり、収率の増加をもたらす。実施例46のGalNAc3−10及び実施例48のGalNAc3−7などの共役基は、既述の共役体、例えば、より多くの化学中間体の組み立てを必要とするU.S.8,106,022またはU.S.7,262,177に記載されているものよりも、はるかに簡単である。したがって、本明細書に記載するこれらの共役体及び他の共役体には、一本鎖オリゴヌクレオチドや二本鎖オリゴヌクレオチド(例えばsiRNA)のどちらかの鎖などといった任意のオリゴヌクレオチドと一緒に使用する際に、既述の化合物に優る利点がある。

同様に、GalNAcリガンドを1つまたは2つしか持たない共役基も、本明細書に開示する。ここに示すように、そのような共役基は、アンチセンス化合物の活性を改良する。そのような化合物は、3つのGalNAcリガンドを含む共役体よりも、調製がはるかに容易である。1つまたは2つのGalNAcリガンドを含む共役基は、一本鎖オリゴヌクレオチドや二本鎖オリゴヌクレオチド(例えばsiRNA)のどちらかの鎖などといった任意のアンチセンス化合物に取り付けることができる。

特定の実施形態では、本明細書の共役体が、耐容性の特定尺度を、実質的に変化させない。例えば、共役アンチセンス化合物の免疫原性は非共役親化合物より高くないことを、本明細書において示す。力価が改良されるので、耐容性が同じままである実施形態は(あるいは実際には力価の増加分と比較して耐容性が少しだけ悪化したとしても)、治療に関して改良された性質を有する。

特定の実施形態では、共役により、共役がなければ結果があまり思わしくないような方法で、アンチセンス化合物を改変することが可能になる。例えば、特定の実施形態では、全ホスホロチオエートアンチセンス化合物の1つ以上のホスホロチオエート連結部を、ホスホジエステル連結基で置き換えることにより、一部の耐容性尺度の改良が起こる。例えば、特定の事例では、1つ以上のホスホジエステルを有するそのようなアンチセンス化合物は、各連結部がホスホロチオエートである同じ化合物よりも、免疫原性が低い。しかし、特定の事例では、実施例26に示すように、1つ以上のホスホロチオエート連結部をホスホジエステル連結部で置き換えると、細胞取り込みの低減及び/または力価の損失も起こる。特定の実施形態において、本明細書に記載する共役アンチセンス化合物は、共役全ホスホロチオエート対応物と比較して、取り込み及び力価をほとんどまたは全く失うことなく、そのような連結部の改変を許容する。事実、特定の実施形態では、例えば実施例44、57、59、及び86では、共役体と少なくとも1つのホスホジエステルヌクレオシド間連結部とを含むオリゴヌクレオチドが、同様に同じ共役体を含む全ホスホロチオエート対応物と比較した場合でさえ、実際に、インビボで力価の増加を呈する。さらに、共役が取り込み/力価の実質的な増加をもたらすので、その実質的な増加分が少し失われても、耐容性の改良を達成するという目的には、許容できる。したがって、特定の実施形態では、共役アンチセンス化合物が、少なくとも1つのホスホジエステル連結部を含む。

特定の実施形態では、本明細書におけるアンチセンス化合物の共役が、肝細胞における送達、取り込み、及び活性の増加をもたらす。したがって、より多くの化合物が肝臓組織に送達される。しかし、特定の実施形態では、そのような送達の増加だけでは、活性の増加全体を説明できない。特定のそのような実施形態では、より多くの化合物が肝細胞に進入する。特定の実施形態では、そのような肝細胞取り込みの増加でも、活性の増加全体を説明することができない。そのような実施形態では、共役化合物の生産的取り込みが増加する。例えば、実施例102に示すように、GalNAc含有共役体の特定実施形態は、非実質細胞との対比で肝細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃縮を増加させる。この濃縮は、肝細胞中で発現する遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドにとって有益である。

特定の実施形態では、本明細書における共役アンチセンス化合物が、腎臓曝露の低減をもたらす。例えば、実施例20に示すように、GalNAc含有共役体の特定実施形態を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、腎臓では、GalNAc含有共役体を欠くアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度より低い。これは、いくつかの有益な治療的意味を有する。腎臓における活性が求められていない治療的適応の場合、腎臓への曝露には、腎毒性のリスクがあり、それに見合う利益がない。さらに、腎臓における高濃度は、典型的には、尿への化合物の損失をもたらし、その結果、クリアランスが速くなる。したがって、標的が腎臓でない場合、腎臓内での蓄積は望ましくない。

特定の実施形態において、本開示は、式:

[式中、 Aは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、 Bは、切断可能部分であり、 Cは、共役リンカーであり、 Dは、分岐基であり、 各Eは、テザーであり、 各Fは、リガンドであり、かつ qは、1〜5の整数である] によって表される共役アンチセンス化合物を提供する。

本明細書における上記の図及び同様の図において、分岐基「D」は、「q」で示される数の(E−F)基に対応するのに必要な数だけ分岐している。したがって、q=1の場合、前記の式は、

であり、q=2の場合、前記の式は、

であり、q=3の場合、前記の式は

であり、q=4の場合、前記の式は

であり、q=5の場合、前記の式は

である。

特定の実施形態では、次の構造を有する共役アンチセンス化合物が提供される。

特定の実施形態では、次の構造を有する共役アンチセンス化合物が提供される。

特定の実施形態では、次の構造を有する共役アンチセンス化合物が提供される。

特定の実施形態では、次の構造を有する共役アンチセンス化合物が提供される。

本開示は、非限定的な以下の番号付き実施形態を提供する。

実施形態1.テザーが、

または

[式中、各nは、独立して、0、1、2、3、4、5、6、または7である] から選択される構造を有する、実施形態1179〜1182のいずれかの共役アンチセンス化合物。

実施形態2.テザーが、構造:

を有する、実施形態1179〜1182のいずれかの共役アンチセンス化合物。

実施形態3.リンカーが

から選択される構造を有する、実施形態1179〜1182または1688〜1689のいずれかの共役アンチセンス化合物。

実施形態4.リンカーが

[式中、各nは、独立して、0、1、2、3、4、5、6、または7である] から選択される構造を有する、実施形態1179〜1182または1688〜1689のいずれかの共役アンチセンス化合物。

実施例5.リンカーが構造:

を有する、実施形態1179〜1182または1688〜1689のいずれかの共役アンチセンス化合物。

ある特定変数を2つ以上(例えば2つ以上の「m」または2つ以上の「n」を)有する実施形態では、別段の表示がある場合を除き、そのような特定変数のそれぞれは、独立して選択される。したがって、2つ以上のnを有する構造の場合、各nは独立して選択されるため、それらは互いに同一である場合も、同一でない場合もありうる。

i.特定の切断可能部分 特定の実施形態において、切断可能部分は、切断可能な結合である。特定の実施形態において、切断可能部分は、切断可能な結合を含む。特定の実施形態において、共役基は、切断可能部分を含む。特定のそのような実施形態において、切断可能部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合する。特定のそのような実施形態において、切断可能部分は、細胞ターゲティング部分に直接結合する。特定のそのような実施形態において、切断可能部分は、共役リンカーに結合する。特定の実施形態において、切断可能部分は、ホスフェートまたはホスホジエステルを含む。特定の実施形態において、切断可能部分は、切断可能なヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体である。特定の実施形態において、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体は、プリン、置換プリン、ピリミジン、または置換ピリミジンから選択される場合によっては保護された複素環式塩基を含む。特定の実施形態において、切断可能部分は、ウラシル、チミン、シトシン、4−N−ベンゾイルシトシン、5−メチルシトシン、4−N−ベンゾイル−5−メチルシトシン、アデニン、6−N−ベンゾイルアデニン、グアニン、及び2−N−イソブチリルグアニンから選択される、場合によっては保護された複素環式塩基を含むヌクレオシドである。特定の実施形態では、切断可能部分が、ホスホジエステル連結部によってアンチセンスオリゴヌクレオチドの3’位に取り付けられ、かつホスホジエステルまたはホスホロチオエート連結部によってリンカーに取り付けられた2’−デオキシヌクレオシドである。特定の実施形態では、切断可能部分が、ホスホジエステル連結部によってアンチセンスオリゴヌクレオチドの3’位に取り付けられ、かつホスホジエステルまたはホスホロチオエート連結部によってリンカーに取り付けられた2’−デオキシアデノシンである。特定の実施形態では、切断可能部分が、ホスホジエステル連結部によってアンチセンスオリゴヌクレオチドの3’位に取り付けられ、かつホスホジエステル連結部によってリンカーに取り付けられた2’−デオキシアデノシンである。

特定の実施形態において、切断可能部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’位に取り付けられる。特定の実施形態において、切断可能部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’位に取り付けられる。特定の実施形態において、切断可能部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの2’位に取り付けられる。特定の実施形態において、切断可能部分は、ホスホジエステル連結部によってアンチセンスオリゴヌクレオチドに取り付けられる。特定の実施形態において、切断可能部分は、ホスホジエステル連結部またはホスホロチオエート連結部のいずれかによってリンカーに取り付けられる。特定の実施形態において、切断可能部分は、ホスホジエステル連結部によってリンカーに取り付けられる。特定の実施形態において、共役基は、切断可能部分を含まない。

特定の実施形態において、切断可能部分は、複合体が動物に投与された後に、標的細胞によって内部に取り込まれて初めて切断される。細胞内で切断可能部分が切断され、それによって活性アンチセンスオリゴヌクレオチドが放出される。理論に束縛されることは望まないが、切断可能部分は細胞内で1つ以上のヌクレアーゼによって切断されると考えられる。特定の実施形態では、1つ以上のヌクレアーゼが切断可能部分とリンカーとの間のホスホジエステル連結部を切断する。特定の実施形態において、切断可能部分は、以下

のなかから選択される構造を有し、 式中、Bx、Bx₁、Bx₂、及びBx₃のそれぞれは、独立して複素環式塩基部分である。特定の実施形態において、切断可能部分は以下のなかから選択される構造を有する。

ii.特定のリンカー 特定の実施形態において、共役基は、リンカーを含む。特定のそのような実施形態において、リンカーは、切断可能部分に共有結合される。特定のそのような実施形態において、リンカーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合される。特定の実施形態において、リンカーは、細胞ターゲティング部分に共有結合される。特定の実施形態において、リンカーは、固体支持体への共有結合をさらに含む。特定の実施形態において、リンカーは、タンパク質結合部分への共有結合をさらに含む。特定の実施形態において、リンカーは、固体支持体への共有結合をさらに含み、タンパク質結合部分への共有結合もさらに含む。特定の実施形態において、リンカーは、係留される(tethered)リガンドを取り付けるための位置を複数含んでいる。特定の実施形態において、リンカーは、係留されるリガンドを取り付けるための位置を複数含み、分岐基には取り付けられない。特定の実施形態において、リンカーは、1つ以上の切断可能な結合をさらに含む。特定の実施形態において、共役基は、リンカーを含まない。

特定の実施形態において、リンカーは、アルキル、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル(−S−)、及びヒドロキシルアミノ(−O−N(H)−)基から選択される基を含む線状基を少なくとも1つは含む。特定の実施形態において、前記線状基は、アルキル、アミド、及びエーテル基から選択される基を含む。特定の実施形態において、前記線状基は、アルキル及びエーテル基から選択される基を含む。特定の実施形態において、前記線状基は、少なくとも1つのリン連結基を含む。特定の実施形態において、前記線状基は、少なくとも1つのホスホジエステル基を含む。特定の実施形態において、前記線状基は、少なくとも1つの中性連結基を含む。特定の実施形態において、前記線状基は、細胞ターゲティング部分及び切断可能部分に共有結合される。特定の実施形態において、前記線状基は、細胞ターゲティング部分及びアンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合される。特定の実施形態において、前記線状基は、細胞ターゲティング部分、切断可能部分、及び固体支持体に共有結合される。特定の実施形態において、前記線状基は、細胞ターゲティング部分、切断可能部分、固体支持体、及びタンパク質結合部分に共有結合される。特定の実施形態において、前記線状基は、1つ以上の切断可能な結合を含む。

特定の実施形態において、リンカーは、足場基に共有結合された線状基を含む。特定の実施形態において、前記足場は、アルキル、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル、及びヒドロキシルアミノ基から選択される基を含む分岐状脂肪族基を含む。特定の実施形態において、前記足場は、アルキル、アミド、及びエーテル基から選択される基を含む分岐状脂肪族基を含む。特定の実施形態において、前記足場は、少なくとも1つの単環式または多環式環系を含む。特定の実施形態において、前記足場は、少なくとも2つの単環式または多環式環系を含む。特定の実施形態では、線状基が足場基に共有結合され、足場基は切断可能部分及びリンカーに共有結合される。特定の実施形態では、線状基が足場基に共有結合され、足場基は、切断可能部分、リンカー、及び固体支持体に共有結合される。特定の実施形態では、線状基が足場基に共有結合され、足場基は、切断可能部分、リンカー、及びタンパク質結合部分に共有結合される。特定の実施形態では、線状基が足場基に共有結合され、足場基は、切断可能部分、リンカー、タンパク質結合部分、及び固体支持体に共有結合される。特定の実施形態において、前記足場基は1つ以上の切断可能な結合を含む。

特定の実施形態において、リンカーは、タンパク質結合部分を含む。特定の実施形態において、タンパク質結合部分は脂質、例えば限定するわけではないが、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、1−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3−ビス−O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3−(オレオイル)リトコール酸、O3−(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン)、ビタミン(例えば葉酸塩、ビタミンA、ビタミンE、ビオチン、ピリドキサール)、ペプチド、炭水化物(例えば単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖)、エンドソーム溶解成分、ステロイド(例えばウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン)、テルペン(例えばトリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸)、またはカチオン性脂質を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、タンパク質結合部分は、C16〜C22長鎖飽和もしくは不飽和脂肪酸、コレステロール、コール酸、ビタミンE、アダマンタン、または1−ペンタフルオロプロピルである。

特定の実施形態において、リンカーは、以下のなかから選択される構造を有し、

式中、各nは、独立して、1〜20であり、pは、1〜6である。

特定の実施形態において、リンカーは、以下のなかから選択される構造を有し、

式中、各nは、独立して、1〜20である。

特定の実施形態において、リンカーは、以下のなかから選択される構造を有し、

式中、nは、1〜20である。

特定の実施形態において、リンカーは、以下のなかから選択される構造を有し、

式中、各Lは、独立して、リン連結基または中性連結基であり、 各nは、独立して、1〜20である。

特定の実施形態において、リンカーは以下のなかから選択される構造を有する。

特定の実施形態において、リンカーは以下のなかから選択される構造を有する。

特定の実施形態において、リンカーは以下のなかから選択される構造を有する。

特定の実施形態において、リンカーは、以下のなかから選択される構造を有し、

式中、nは、1〜20である。

特定の実施形態において、リンカーは以下のなかから選択される構造を有する。

特定の実施形態において、リンカーは以下のなかから選択される構造を有する。

特定の実施形態において、リンカーは以下のなかから選択される構造を有する。

特定の実施形態において、共役リンカーは以下の構造を有する。

特定の実施形態において、共役リンカーは以下の構造を有する。

特定の実施形態において、リンカーは以下のなかから選択される構造を有する。

特定の実施形態において、リンカーは、以下のなかから選択される構造を有し、

式中、各nは、独立して、0、1、2、3、4、5、6、または7である。

iii.特定の細胞ターゲティング部分 特定の実施形態において、共役基は、細胞ターゲティング部分を含む。特定のそのような細胞ターゲティング部分は、アンチセンス化合物の細胞取り込みを増加させる。特定の実施形態において、細胞ターゲティング部分は、分岐基、1つ以上のテザー、及び1つ以上のリガンドを含む。特定の実施形態において、細胞ターゲティング部分は、分岐基、1つ以上のテザー、1つ以上のリガンド、及び1つ以上の切断可能な結合を含む。 1.特定の分岐基

特定の実施形態において、共役基は、分岐基及び少なくとも2つのテザーリガンドを含むターゲティング部分を含む。特定の実施形態において、分岐基は、共役リンカーを結合する。特定の実施形態において、分岐基は、切断可能部分を結合する。特定の実施形態において、分岐基は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを結合する。特定の実施形態において、分岐基は、リンカー及びテザーリガンドのそれぞれに共有結合される。特定の実施形態において、分岐基は、アルキル、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル及びヒドロキシルアミノ基から選択される基を含む分岐状脂肪族基を含む。特定の実施形態において、分岐基は、アルキル、アミド、及びエーテル基から選択される基を含む。特定の実施形態において、分岐基は、アルキル及びエーテル基から選択される基を含む。特定の実施形態において、分岐基は、単環式または多環式環系を含む。特定の実施形態において、分岐基は、1つ以上の切断可能な結合を含む。特定の実施形態において、共役基は、分岐基を含まない。

特定の実施形態において、分岐基は、以下のなかから選択される構造を有し、

式中、各nは、独立して、1〜20であり、 jは、1〜3であり、 mは、2〜6である。

特定の実施形態において、分岐基は、以下のなかから選択される構造を有し、

各nは、独立して、1〜20であり、 mは、2〜6である。

特定の実施形態において、分岐基は以下のなかから選択される構造を有する。

特定の実施形態において、分岐基は、以下のなかから選択される構造を有し、

式中、各A₁は、独立して、O、S、C=O、またはNHであり、 各nは、独立して、1〜20である。

特定の実施形態において、分岐基は、以下のなかから選択される構造を有し、

式中、各A₁は、独立して、O、S、C=O、またはNHであり、 各nは、独立して、1〜20である。

特定の実施形態において、分岐基は、以下のなかから選択される構造を有し、

式中、A₁は、O、S、C=O、またはNHであり、 各nは、独立して、1〜20である。

特定の実施形態において、分岐基は以下のなかから選択される構造を有する。

特定の実施形態において、分岐基は以下のなかから選択される構造を有する。

特定の実施形態において、分岐基は以下のなかから選択される構造を有する。

2.特定のテザー

特定の実施形態において、共役基は、分岐基に共有結合される1つ以上のテザーを含む。特定の実施形態において、共役基は、連結基に共有結合される1つ以上のテザーを含む。特定の実施形態において、各テザーは、アルキル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、アミド、及びポリエチレングリコール基から選択される1つ以上の基を任意の組み合わせで含む線状脂肪族基である。特定の実施形態において、各テザーは、アルキル、置換アルキル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、アミド、ホスホジエステル及びポリエチレングリコール基から選択される1つ以上の基を任意の組み合わせで含む線状脂肪族基である。特定の実施形態において、各テザーは、アルキル、エーテル、及びアミド基から選択される1つ以上の基を任意の組み合わせで含む線状脂肪族基である。特定の実施形態において、各テザーは、アルキル、置換アルキル、ホスホジエステル、エーテル、及びアミド基から選択される1つ以上の基を任意の組み合わせで含む線状脂肪族基である。特定の実施形態において、各テザーは、アルキル及びホスホジエステルから選択される1つ以上の基を任意の組み合わせで含む線状脂肪族基である。特定の実施形態において、各テザーは、少なくとも1つのリン連結基または中性連結基を含む。

特定の実施形態において、テザーは、1つ以上の切断可能な結合を含む。特定の実施形態において、テザーは、アミド基またはエーテル基のいずれかを介して分岐基に結合される。特定の実施形態において、テザーは、ホスホジエステル基を介して分岐基に結合される。特定の実施形態において、テザーは、リン連結基または中性連結基を介して分岐基に結合される。特定の実施形態において、テザーは、エーテル基を介して分岐基に結合される。特定の実施形態において、テザーは、アミド基またはエーテル基のいずれかを介してリガンドに結合される。特定の実施形態において、テザーは、エーテル基を介してリガンドに結合される。特定の実施形態において、テザーは、アミド基またはエーテル基のいずれかを介してリガンドに結合される。特定の実施形態において、テザーは、エーテル基を介してリガンドに結合される。

特定の実施形態において、各テザーは、リガンドと分岐基との間に約8〜約20原子の鎖長を含む。特定の実施形態において、各テザー基は、リガンドと分岐基との間に約10〜約18原子の鎖長を含む。特定の実施形態において、各テザー基は、約13原子の鎖長を含む。

特定の実施形態において、テザーは、以下のなかから選択される構造を有し、

各nは、独立して、1〜20であり、 各pは、1〜約6である。

特定の実施形態において、テザーは以下のなかから選択される構造を有する。

特定の実施形態において、テザーは、以下のなかから選択される構造を有し、

式中、各nは、独立して、1〜20である。

特定の実施形態において、テザーは、以下のなかから選択される構造を有し、

式中、Lは、リン連結基または中性連結基のいずれかであり、 Z₁は、C(=O)O−R₂であり、 Z₂は、H、C₁〜C₆アルキル、または置換C₁〜C₆アルキルであり、 R₂は、H、C₁〜C₆アルキルまたは置換C₁〜C₆アルキルであり、 各m₁は、独立して、0〜20であり、各テザーにつき少なくとも1つのm₁は0より大きい。

特定の実施形態において、テザーは以下のなかから選択される構造を有する。

特定の実施形態において、テザーは、以下のなかから選択される構造を有し、

式中、Z₂は、HまたはCH₃であり、 各m₁は、独立して、0〜20であり、各テザーにつき少なくとも1つのm₁は0より大きい

特定の実施形態において、テザーは、以下のなかから選択される構造を有し、

式中、各nは、独立して、0、1、2、3、4、5、6、または7である。

特定の実施形態において、テザーは、リン連結基を含む。特定の実施形態において、テザーは、いかなるアミド結合も含まない。特定の実施形態において、テザーは、リン連結基を含み、いかなるアミド結合も含まない。 3.特定のリガンド

特定の実施形態において、本開示は、各リガンドがテザーに共有結合されるリガンドを提供する。特定の実施形態において、各リガンドは、標的細胞において少なくとも1種類の受容体に対する親和性を有するように選択される。特定の実施形態において、哺乳類肝臓細胞の表面において少なくとも1種類の受容体に対する親和性を有するリガンドが選択される。特定の実施形態において、肝アシアロ糖タンパク質受容体(ASGP−R)に対する親和性を有するリガンドが選択される。特定の実施形態において、各リガンドは、炭水化物である。特定の実施形態において、各リガンドは、ガラクトース、N−アセチルガラクトースアミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、及びフコースから独立して選択される。特定の実施形態において、各リガンドは、N−アセチルガラクトースアミン(GalNAc)である。特定の実施形態において、ターゲティング部分は2〜6個のリガンドを含む。特定の実施形態において、ターゲティング部分は3個のリガンドを含む。特定の実施形態において、ターゲティング部分は3個のN−アセチルガラクトサミンリガンドを含む。

特定の実施形態において、リガンドは、炭水化物、炭水化物誘導体、修飾炭水化物、多価炭水化物クラスター、多糖、修飾多糖、または多糖誘導体である。特定の実施形態において、リガンドは、アミノ糖またはチオ糖である。例えばアミノ糖は、当技術分野で知られている多くの化合物、例えばグルコサミン、シアル酸、α−D−ガラクトサミン、N−アセチルガラクトサミン、2−アセトアミド−2−デオキシ−D−ガラクトピラノース(GalNAc)、2−アミノ−3−O−[(R)−1−カルボキシエチル]−2−デオキシ−β−D−グルコピラノース(β−ムラミン酸)、2−デオキシ−2−メチルアミノ−L−グルコピラノース、4,6−ジデオキシ−4−ホルムアミド−2,3−ジ−O−メチル−D−マンノピラノース、2−デオキシ−2−スルホアミノ−D−グルコピラノース、及びN−スルホ−D−グルコサミン、及びN−グリコロイル−α−ノイラミン酸から選択されうる。例えば、チオ糖は、5−チオ−β−D−グルコピラノース、メチル2,3,4−トリ−O−アセチル−1−チオ−6−O−トリチル−α−D−グルコピラノシド、4−チオ−β−D−ガラクトピラノース、及びエチル3,4,6,7−テトラ−O−アセチル−2−デオキシ−1,5−ジチオ−α−D−グルコ−ヘプトピラノシドからなる群から選択されうる。

特定の実施形態において、「GalNac」または「Gal−NAc」は、文献内で一般にN−アセチルガラクトサミンと称される2−(アセチルアミノ)−2−デオキシ−D−ガラクトピラノースを指す。特定の実施形態において、「N−アセチルガラクトサミン」は、2−(アセチルアミノ)−2−デオキシ−D−ガラクトピラノースを指す。特定の実施形態において、「GalNac」または「Gal−NAc」は、2−(アセチルアミノ)−2−デオキシ−D−ガラクトピラノースを指す。特定の実施形態において、「GalNac」または「Gal−NAc」は、β型:2−(アセチルアミノ)−2−デオキシ−β−D−ガラクトピラノースとα型:2−(アセチルアミノ)−2−デオキシ−D−ガラクトピラノースの両方を含む、2−(アセチルアミノ)−2−デオキシ−D−ガラクトピラノースを指す。特定の実施形態において、β型:2−(アセチルアミノ)−2−デオキシ−β−D−ガラクトピラノースとα型:2−(アセチルアミノ)−2−デオキシ−D−ガラクトピラノースはどちらも可換的に使用されうる。したがって一方の型が図示される構造において、これらの構造は、他方の型も同様に含むものとする。例えばα型:2−(アセチルアミノ)−2−デオキシ−D−ガラクトピラノースの構造が示される場合、この構造は他方の型も同様に含むものとする。特定の好ましい実施形態では、β型:2−(アセチルアミノ)−2−デオキシ−D−ガラクトピラノースが好ましい実施形態である。

特定の実施形態において、1つ以上のリガンドは、以下のなかから選択される構造を有し、

式中、各R₁は、OH及びNHCOOHから選択される。

特定の実施形態において、1つ以上のリガンドは以下のなかから選択される構造を有する。

特定の実施形態において、1つ以上のリガンドは以下のなかから選択される構造を有する。

特定の実施形態において、1つ以上のリガンドは以下のなかから選択される構造を有する。

i.特定の共役体

特定の実施形態において、共役基は、上述の構造的特徴を含む。特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有し、

式中、各nは、独立して、1〜20である。

特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有し、

式中、各nは、独立して、1〜20であり、 Zは、Hまたは結合固体支持体であり、 Qは、アンチセンス化合物であり、 Xは、OまたはSであり、 Bxは、複素環式塩基部分である。

特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

特定の実施形態において、共役体はピロリジンを含まない。

特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

特定の実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

式中、Xは、6〜11個の連続して結合された原子の置換テザーまたは無置換テザーである。

特定の実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

式中、Xは、10個の連続して結合された原子の置換テザーまたは無置換テザーである。

特定の実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

式中、Xは、4〜11個の連続して結合された原子の置換テザーまたは無置換テザーであり、前記テザーは、厳密に1個のアミド結合を含む。

特定の実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

式中、Y及びZは、C₁〜C₁₂置換もしくは無置換アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基、またはエーテル、ケトン、アミド、エステル、カルバメート、アミン、ピペリジン、ホスフェート、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、トリアゾール、ピロリジン、ジスルフィド、もしくはチオエーテルを含む基から独立して選択される。

特定のそのような実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

式中、Y及びZは、C₁〜C₁₂置換もしくは無置換アルキル基、または厳密に1個のエーテルもしくは厳密に2個のエーテル、アミド、アミン、ピペリジン、ホスフェート、ホスホジエステル、またはホスホロチオエートを含む基から独立して選択される。

特定のそのような実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

式中、Y及びZは、C₁〜C₁₂置換または無置換アルキル基から独立して選択される。

特定のそのような実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

式中、m及びnは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、及び12から独立して選択される。

特定のそのような実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

式中、mは、4、5、6、7、または8であり、nは、1、2、3、または4である。

特定の実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

式中、Xは、4〜13個の連続して結合された原子の置換テザーまたは無置換テザーであり、Xは、エーテル基を含まない。

特定の実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

式中、Xは、8個の連続して結合された原子の置換テザーまたは無置換テザーであり、Xは、エーテル基を含まない。

特定の実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

式中、Xは、4〜13個の連続して結合された原子の置換テザーまたは無置換テザーであり、前記テザーは、厳密に1個のアミド結合を含み、Xはエーテル基を含まない。

特定の実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

式中、Xは、4〜13個の連続して結合された原子の置換テザーまたは無置換テザーであり、前記テザーは、アミド結合及び置換または無置換C₂〜C₁₁アルキル基からなる。

特定の実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

式中、Yは、C₁〜C₁₂置換もしくは無置換アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基、またはエーテル、ケトン、アミド、エステル、カルバメート、アミン、ピペリジン、ホスフェート、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、トリアゾール、ピロリジン、ジスルフィド、もしくはチオエーテルを含む基から選択される。

特定のそのような実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

式中、Yは、C₁〜C₁₂置換もしくは無置換アルキル基、またはエーテル、アミン、ピペリジン、ホスフェート、ホスホジエステル、もしくはホスホロチオエートを含む基から選択される。

特定のそのような実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

式中、Yは、C₁〜C₁₂置換または無置換アルキル基から選択される。

特定のそのような実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

式中、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12である。

特定のそのような実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

式中、nは、4、5、6、7、または8である。

特定の実施形態では、共役体はピロリジンを含まない。 a 特定の共役アンチセンス化合物

特定の実施形態において、共役体は、ヌクレオシドの2’、3’、または5’位でアンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドに結合される。特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は以下の構造を有し、

式中、 Aは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、 Bは、切断可能部分であり、 Cは、共役リンカーであり、 Dは、分岐基であり、 各Eは、テザーであり、 各Fは、リガンドであり、 qは、1〜5の整数である。

特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は以下の構造を有し、

式中、 Aは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、 Cは、共役リンカーであり、 Dは、分岐基であり、 各Eは、テザーであり、 各Fは、リガンドであり、 qは、1〜5の整数である。

特定のそのような実施形態において、共役リンカーは、少なくとも1つの切断可能な結合を含む。

特定のそのような実施形態において、分岐基は、少なくとも1つの切断可能な結合を含む。

特定の実施形態において、各テザーは、少なくとも1つの切断可能な結合を含む。

特定の実施形態において、共役体は、ヌクレオシドの2’、3’、または5’位でアンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドに結合される。

特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は以下の構造を有し、

式中、 Aは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、 Bは、切断可能部分であり、 Cは、共役リンカーであり、 各Eは、テザーであり、 各Fは、リガンドであり、かつ qは、1〜5の整数である。

特定の実施形態において、共役体は、ヌクレオシドの2’、3’、または5’位でアンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドに結合される。特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は以下の構造を有し、

式中、 Aは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、 Cは、共役リンカーであり、 各Eは、テザーであり、 各Fは、リガンドであり、かつ qは、1〜5の整数である。

特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は以下の構造を有し、

式中、 Aは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、 Bは、切断可能部分であり、 Dは、分岐基であり、 各Eは、テザーであり、 各Fは、リガンドであり、かつ qは、1〜5の整数である。

特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は以下の構造を有し、

式中、 Aは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、 Dは、分岐基であり、 各Eは、テザーであり、 各Fは、リガンドであり、かつ qは、1〜5の整数である。

特定のそのような実施形態において、共役リンカーは、少なくとも1つの切断可能な結合を含む。

特定の実施形態において、各テザーは、少なくとも1つの切断可能な結合を含む。

特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は以下のなかから選択される構造を有する。

特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は以下のなかから選択される構造を有する。

特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は以下のなかから選択される構造を有する。

上述の共役体、共役アンチセンス化合物、テザー、リンカー、分岐基、リガンド、切断可能部分、ならびに他の修飾のいくつかの調製を教示する代表的な米国特許、米国特許出願公開、及び国際特許出願公開には、US5,994,517、US6,300,319、US6,660,720、US6,906,182、US7,262,177、US7,491,805、US8,106,022、US7,723,509、US2006/0148740、US2011/0123520号、WO2013/033230、及びWO2012/037254が含まれるが、これらに限定されず、これらの文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

上述の共役体、共役アンチセンス化合物、テザー、リンカー、分岐基、リガンド、切断可能部分、ならびに他の修飾のいくつかの調製を教示する代表的な出版物には、BIESSEN et al.「The Cholesterol Derivative of a Triantennary Galactoside with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor:a Potent Cholesterol Lowering Agent」J.Med.Chem.(1995)38:1846−1852、BIESSEN et al.「Synthesis of Cluster Galactoside with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor」J.Med.Chem.(1995)38:1538−1546、LEE et al.「New and more efficient multivalent glyco−ligands for asialoglycoprotein receptor of mammalian hepatocytes」Bioorganic & Medicinal Chemistry(2011)19:2494−2500、RENSEN et al.「Determination of the Upper Size Limit for Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor on Hepatocytes in Vitro and in Vivo」J.Biol.Chem.(2001)276(40):37577−37584、RENSEN et al.「Design and Synthesis of Novel N−Acetylgalactosamine−Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor」J.Med.Chem.(2004)47:5798−5808、SLIEDREGT et al.「Design and Synthesis of Novel Amphiphilic Dendritic Galactosides for Selective Targeting of Liposomes to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor」J.Med.Chem.(1999)42:609−618、及びValentijn et al.「Solid−phase synthesis of lysine−based Cluster galactosides with high affinity for the Asialoglycoprotein Receptor」Tetrahedron,1997,53(2),759−770が含まれるが、これらに限定されず、これらの文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、RNase Hベースのオリゴヌクレオチド(ギャップマーなど)またはスプライス調節オリゴヌクレオチド(完全修飾オリゴヌクレオチドなど)、及び少なくとも1つ、2つ、または3つのGalNAc基を含む任意の共役基を含む。特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、以下の参考文献:Lee,Carbohydr Res,1978,67,509−514、Connolly et al.,J Biol Chem,1982,257,939−945、Pavia et al.,Int J Pep Protein Res,1983,22,539−548、Lee et al.,Biochem,1984,23,4255−4261、Lee et al.,Glycoconjugate J,1987,4,317−328、Toyokuni et al.,Tetrahedron Lett,1990,31,2673−2676、Biessen et al.,J Med Chem,1995,38,1538−1546、Valentijn et al.,Tetrahedron,1997,53,759−770、Kim et al.,Tetrahedron Lett,1997,38,3487−3490、Lee et al.,Bioconjug Chem,1997,8,762−765、Kato et al.,Glycobiol,2001,11,821−829、Rensen et al.,J Biol Chem,2001,276,37577−37584、Lee et al.,Methods Enzymol,2003,362,38−43、Westerlind et al.,Glycoconj J,2004,21,227−241、Lee et al.,Bioorg Med Chem Lett,2006,16(19),5132−5135、Maierhofer et al.,Bioorg Med Chem,2007,15,7661−7676、Khorev et al.,Bioorg Med Chem,2008,16,5216−5231、Lee et al.,Bioorg Med Chem,2011,19,2494−2500、Kornilova et al.,Analyt Biochem,2012,425,43−46、Pujol et al.,Angew Chemie Int Ed Engl,2012,51,7445−7448、Biessen et al.,J Med Chem,1995,38,1846−1852、Sliedregt et al.,J Med Chem,1999,42,609−618、Rensen et al.,J Med Chem,2004,47,5798−5808、Rensen et al.,Arterioscler Thromb Vasc Biol,2006,26,169−175、van Rossenberg et al.,Gene Ther,2004,11,457−464、Sato et al.,J Am Chem Soc,2004,126,14013−14022、Lee et al.,J Org Chem,2012,77,7564−7571、Biessen et al.,FASEB J,2000,14,1784−1792、Rajur et al.,Bioconjug Chem,1997,8,935−940、Duff et al.,Methods Enzymol,2000,313,297−321、Maier et al.,Bioconjug Chem,2003,14,18−29、Jayaprakash et al.,Org Lett,2010,12,5410−5413、Manoharan,Antisense Nucleic Acid Drug Dev,2002,12,103−128、Merwin et al.,Bioconjug Chem,1994,5,612−620、Tomiya et al.,Bioorg Med Chem,2013,21,5275−5281、国際出願WO1998/013381;WO2011/038356;WO1997/046098;WO2008/098788;WO2004/101619;WO2012/037254;WO2011/120053;WO2011/100131;WO2011/163121;WO2012/177947;WO2013/033230;WO2013/075035;WO2012/083185;WO2012/083046;WO2009/082607;WO2009/134487;WO2010/144740;WO2010/148013;WO1997/020563;WO2010/088537;WO2002/043771;WO2010/129709;WO2012/068187;WO2009/126933;WO2004/024757;WO2010/054406;WO2012/089352;WO2012/089602;WO2013/166121;WO2013/165816;米国特許4,751,219;8,552,163;6,908,903;7,262,177;5,994,517;6,300,319;8,106,022;7,491,805;7,491,805;7,582,744;8,137,695;6,383,812;6,525,031;6,660,720;7,723,509;8,541,548;8,344,125;8,313,772;8,349,308;8,450,467;8,501,930;8,158,601;7,262,177;6,906,182;6,620,916;8,435,491;8,404,862;7,851,615;米国特許出願公開US2011/0097264;US2011/0097265;US2013/0004427;US2005/0164235;US2006/0148740;US2008/0281044;US2010/0240730;US2003/0119724;US2006/0183886;US2008/0206869;US2011/0269814;US2009/0286973;US2011/0207799;US2012/0136042;US2012/0165393;US2008/0281041;US2009/0203135;US2012/0035115;US2012/0095075;US2012/0101148;US2012/0128760;US2012/0157509;US2012/0230938;US2013/0109817;US2013/0121954;US2013/0178512;US2013/0236968;US2011/0123520;US2003/0077829;US2008/0108801;及びUS2009/0203132のうちのいずれかにおいて見いだされる任意の共役基を含み、これらの文献のそれぞれは参照によりその全体が組み込まれる。

アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ試験 本明細書には、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置するための方法を記載する。この方法には、他のアンチセンス化合物による処置のために、適宜変更を加えることができる。

細胞は、細胞が培養中で約60〜80%コンフルエントに達した時に、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理することができる。

培養細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するためによく使用される試薬の一つに、カチオン性脂質トランスフェクション試薬LIPOFECTIN(Invitrogen,カリフォルニア州カールズバッド)がある。アンチセンスオリゴヌクレオチドをOPTI−MEM1(Invitrogen,カリフォルニア州カールズバッド)中でLIPOFECTINと混合することで、所望の最終アンチセンスオリゴヌクレオチド濃度と、100nMアンチセンスオリゴヌクレオチドあたり2〜12μg/mLの範囲に及びうるLIPOFECTIN濃度にする。

培養細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するために使用されるもう一つの試薬は、LIPOFECTAMINE(Invitrogen,カリフォルニア州カールズバッド)である。アンチセンスオリゴヌクレオチドをOPTI−MEM1還元血清培地(Invitrogen,カリフォルニア州カールズバッド)中でLIPOFECTAMINEと混合することで、所望のアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度と、100nMアンチセンスオリゴヌクレオチドあたり2〜12μg/mLの範囲に及びうるLIPOFECTAMIN濃度にする。

培養細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するために使用されるもう一つの技法に、エレクトロポレーションがある。

培養細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するために使用されるさらにもう一つの技法に、細胞によるオリゴヌクレオチド自由取り込みがある。

細胞は、常法により、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理される。細胞はアンチセンスオリゴヌクレオチド処理の16〜24時間後に収集することができ、その時点で、標的核酸のRNAレベルまたはタンパク質レベルが、当技術分野に知られておりかつ本明細書に記載する方法によって測定される。一般に、複数の複製試料で処理を行う場合は、複製試料処理の平均としてデータを表す。

使用するアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株ごとに異なる。ある特定細胞株に関して最適なアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を決定するための方法は、当技術分野では周知である。LIPOFECTAMINEによるトランスフェクションの場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、1nM〜300nMの範囲の濃度で使用される。 エレクトロポレーションによるトランスフェクションの場合は、それより高い625nMから20,000nMまでの範囲の濃度で、アンチセンスオリゴヌクレオチドが使用される。

RNA単離 RNA分析は、全細胞RNAまたはポリ(A)+mRNAに関して行うことができる。RNA単離の方法は当技術分野ではよく知られている。RNAは当技術分野において周知の方法を使って、例えばTRIZOL試薬(Invitrogen,カリフォルニア州カールズバッド)を製造者が推奨するプロトコルに従って使用することによって、調製される。

特定の適応 ここに提供する特定の実施形態は、対象における補体代替経路の調節異常に関連する疾患を、CFBを標的とするアンチセンス化合物などのCFB特異的阻害剤の投与によって処置し、防止し、または改善する方法に関する。

ここに提供する方法で処置し、防止し、かつ/または改善することが可能な、補体代替経路の調節異常に関連する腎疾患の例として、C3糸球体症、非典型溶血性尿毒症症候群(aHUS)、デンスデポジット病(DDD;II型MPGNまたはC3Nephとも呼ばれている)、及びCFHR5ネフロパシーが挙げられる。

ここに提供する方法で処置し、防止し、かつ/または改善することが可能な、補体代替経路の調節異常に関連する他の腎疾患には、IgAネフロパシー;メサンギウム毛細管性(膜性増殖性)糸球体腎炎(MPGN);ループス腎炎及び全身性エリテマトーデス(SLE)を含む自己免疫障害;感染誘発性糸球体腎炎(感染後糸球体腎炎とも呼ばれている);及び腎虚血再灌流傷害、例えば移植後腎虚血再灌流傷害がある。

ここに提供する方法で処置しかつ/または防止することが可能な、補体代替経路の調節異常に関連する非腎臓障害の例として、黄斑変性、例えば加齢黄斑変性(AMD)(滲出型AMD及び地図状萎縮などの乾性AMDを含む);視神経脊髄炎;角膜疾患、例えば角膜炎症;自己免疫性ぶどう膜炎;及び糖尿病性網膜症などの眼疾患が挙げられる。眼疾患には補体系が関与すると報告されている。Jha P, et al.,Mol Immunol(2007)44(16):3901−3908。ここに提供する方法で処置しかつ/または防止することが可能な、補体代替経路の調節異常に関連する非腎臓障害の他の例には、ANCA関連血管炎、抗リン脂質症候群(抗リン脂質抗体症候群(APS)とも呼ばれている)、喘息、関節リウマチ、重症筋無力症、及び多発性硬化症がある。

ここに提供する特定の実施形態は、対象における補体代替経路の調節異常に関連する腎疾患を、CFBを標的とするアンチセンス化合物などのCFB特異的阻害剤の投与によって、処置し、防止し、または改善する方法に関する。特定の態様では、腎疾患がループス腎炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、デンスデポジット病(DDD)、C3糸球体腎炎(C3GN)、CFHR5ネフロパシー、もしくは非典型溶血性尿毒症症候群(aHUS)、またはそれらの任意の組み合わせである。

ここに提供する特定の実施形態は、対象における加齢黄斑変性(AMD)などの黄斑変性を、CFBを標的とするアンチセンス化合物などのCFB特異的阻害剤の投与によって処置し、防止し、または改善する方法に関する。特定の態様では、AMDが滲出型AMDまたは乾性AMDである。特定の態様では、乾性AMDが地図状萎縮でありうる。補体代替経路の調節異常とAMDとの関連は研究によって実証されている。補体成分は、AMD患者の黄斑に蓄積する細胞外物質である眼ドルーゼの一般的構成要素である。さらにまた、CFH及びCFB変異体は、北欧及び北米におけるAMD症例の75%近くを占めると報告されている。特殊なCFB多型がAMDからの防御を付与することも見いだされている。Patel,N. et al., Eye(2008)22(6):768−76。加えて、CFBホモ接合ヌルマウスは補体経路活性が低く、レーザー光凝固後に小さな眼病変及び脈絡膜血管新生(CNV)を呈する。Rohrer,B.et al.,Invest Ophthalmol Vis Sci.(2009)50(7):3056−64。さらにまた、CFB siRNA処置は、レーザー誘発性CNVからマウスを防御する。Bora,NS et al.,J Immunol.(2006)177(3):1872−8。腎臓と眼が共通の発生経路及び構造上の特徴(基底膜コラーゲンIVプロモーター組成及び血管分布を含む)を有することも研究によって示されている。Savige et al.,J Am Soc Nephrol.(2011)22(8):1403−15。腎臓疾患と眼疾患に補体経路が関与することの証拠がある。例えば、遺伝性補体調節タンパク質欠損は、非典型溶血性尿毒症症候群及びAMDに対する素因の原因になる。Richards A et al.,Adv Immunol.(2007)96:141−77。加えて、慢性腎臓疾患はAMDに関連付けられている。Nitsch,D.et al.,Ophthalmic Epidemiol.(2009)16(3):181−6;Choi,J.et al,Ophthalmic Epidemiol.(2011)18(6):259−63。補体代替経路の調節異常に関連する腎臓疾患であるデンスデポジット病(DDD)は、急性腎炎症候群と眼ドルーゼを特徴とする。Cruz and Smith, GeneReviews(2007)Jul 20。さらに、補体代替経路の構成要素の遺伝子欠失を保因するマウスでは、腎疾患表現型と眼疾患表現型が共存する。CFHホモ接合ヌルマウスはDDDを発症し、網膜異常及び視覚機能障害を呈すると報告されている。Pickering et al.,Nat Genet.(2002)31(4):424−8。補体代替経路の調節異常に関連する腎疾患のマウスモデルは、AMDのモデルとしても受け入れられている。Pennesi ME et al.,Mol Aspects Med(2012)33:487−509。例えばCFHヌルマウスはDDDなどの腎疾患とAMDのモデルとして受け入れられている。さらにまた、AMDが補体因子の全身性供給源に関連することも報告されており、これらの補体因子が眼に局所的に蓄積することで代替経路補体活性化を駆動する。Loyet et al.,Invest Ophthalmol Vis Sci.(2012)53(10):6628−37。

以下の実施例は、本開示の特定の実施形態を例証するものであり、限定するものではない。さらに、具体的実施形態を記載する場合、本発明者らは、それらの具体的実施形態の一般的応用を企図している。例えば、ある特定モチーフを有するオリゴヌクレオチドの開示は、そのモチーフまたは同様のモチーフを有する他のオリゴヌクレオチドの合理的裏付けになる。同様に、例えば、ある特定高親和性修飾がある特定位置に見られる場合は、別段の表示がある場合を除き、同じ位置での他の高親和性修飾も好適であるとみなされる。 実施例1:ホスホラミダイト(化合物1、1a、及び2)の調製のための一般的方法

化合物1、1a、及び2を、本明細書に記載する当技術分野で周知の手順どおりに調製した(Seth et al.,Bioorg.Med.Chem.,2011,21(4),1122−1125,J.Org.Chem.,2010,75(5),1569−1581,Nucleic Acids Symposium Series,2008,52(1),553−554)、ならびに公開されたPCT国際出願(国際公開第WO2011/115818号、同第WO2010/077578号、同第WO2010/036698号、同第WO2009/143369号、同第WO2009/006478、及び同第WO2007/090071号)、ならびに米国特許第7,569,686号も参照のこと)。

実施例2:化合物7の調製

化合物3(2−アセトアミド−1,3,4,6−テトラ−O−アセチル−2−デオキシ−β−Dガラクトピラノースまたはガラクトサミンペンタアセテート)は、市販のものである。化合物5を公開された手順(Weber et al.,J.Med.Chem.,1991,34,2692)に従って調製した。 実施例3:化合物11の調製

化合物8及び9は、市販のものである。 実施例4:化合物18の調製

化合物11を実施例3に例証される手順どおりに調製した。化合物14は、市販のものである。化合物17を、Rensen et al.(J.Med.Chem.,2004,47,5798−5808)によって報告された同様の手順を用いて調製した。 実施例5:化合物23の調製

化合物19及び21は、市販のものである。 実施例6:化合物24の調製

化合物18及び23を実施例4及び5に例証される手順どおりに調製した。 実施例7:化合物25の調製

化合物24を実施例6に例証される手順どおりに調製した。 実施例8:化合物26の調製

化合物24を実施例6に例証される手順どおりに調製する。 実施例9:3’末端にGalNAc₃−1を含む共役ASO(化合物29)の一般的調製

保護されたGalNAc₃−1は以下の構造を有する。

共役基GalNAc₃−1(GalNAc₃−1_a)のGalNAc₃クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。GalNAc₃−1_aは、以下の式を有する。

固体支持体に結合された保護GalNAc₃−1(化合物25)を実施例7に例証される手順どおりに調製した。3’末端にGalNAc₃−1を含むオリゴマー化合物29を、自動DNA/RNA合成における標準的手順を用いて調製した(Dupouy et al.,Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45,3623−3627を参照のこと)。ホスホラミダイト構築ブロック(化合物1及び1a)を実施例1に例証される手順どおりに調製した。他のホスホラミダイト構築ブロックを用いて既定の配列及び組成を有するオリゴマー化合物を調製することができるため、例証されるホスホラミダイトは、代表的なものであり、限定する意図はない。固体支持体に添加されるホスホラミダイトの順序及び量を調整して、本明細書に記載するギャップトオリゴマー化合物を調製することができる。そのようなギャップトオリゴマー化合物は、任意の所与の標的によって指示される既定の組成及び塩基配列を有しうる。 実施例10:5’末端にGalNAc₃−1を含む共役ASO(化合物34)の一般的調製

Unylinker(商標)30は、市販のものである。5’末端にGalNAc₃−1クラスターを含むオリゴマー化合物34を、自動DNA/RNA合成における標準的手順を用いて調製する(Dupouy et al.,Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45,3623−3627を参照のこと)。ホスホラミダイト構築ブロック(化合物1及び1a)を実施例1に例証される手順どおりに調製した。他のホスホラミダイト構築ブロックを用いて既定の配列及び組成を有するオリゴマー化合物を調製することができるため、例証されるホスホラミダイトは、代表的なものであり、限定する意図はない。固体支持体に添加されるホスホラミダイトの順序及び量を調整して、本明細書に記載するギャップトオリゴマー化合物を調製することができる。そのようなギャップトオリゴマー化合物は、任意の所与の標的によって決まる既定の組成及び塩基配列を有しうる。 実施例11:化合物39の調製

化合物4、13、及び23を実施例2、4、及び5に例証される手順どおりに調製した。化合物35をRouchaud et al.,Eur.J.Org.Chem.,2011,12,2346−2353に公開された同様の手順を用いて調製する。 実施例12:化合物40の調製

化合物38を実施例11に例証される手順どおりに調製する。 実施例13:化合物44の調製

化合物23及び36を実施例5及び11に例証される手順どおりに調製する。化合物41を、国際公開第WO2009082607号に公開された同様の手順を用いて調製する。 実施例14:化合物45の調製

化合物43を実施例13に例証される手順どおりに調製する。 実施例15:化合物47の調製

化合物46は、市販のものである。 実施例16:化合物53の調製

化合物48及び49は、市販のものである。化合物17及び47を実施例4及び15に例証される手順どおりに調製する。 実施例17:化合物54の調製

化合物53を実施例16に例証される手順どおりに調製する。 実施例18:化合物55の調製

化合物53を実施例16に例証される手順どおりに調製する。 実施例19:固相技法による3’位にGalNAc₃−1を含む共役ASOの調製のための一般的方法(ISIS647535、647536、及び651900の調製)

別段の明示がある場合を除き、オリゴマー化合物の合成に用いるすべての試薬及び溶液を商業的供給源から購入する。標準のホスホラミダイト構築ブロック及び固体支持体を、例えば、T、A、G、及び^mC残基を含む、ヌクレオシド残基の組み込みのために用いる。無水アセトニトリル中のホスホラミダイトの0.1M溶液をb−D−2’−デオキシリボヌクレオシド及び2’−MOEに用いた。

カラムに充填したGalNAc₃−1負荷VIMAD固体支持体(110μmol/g、Guzaev et al.,2003)でのホスホラミダイトカップリング法により、ASO合成を、ABI 394合成装置(1〜2μmolの規模)またはGE Healthcare Bioscience AeKTAオリゴパイロット合成装置(40〜200μmolの規模)で実行した。このカップリングステップでは、固体支持体の負荷量に対して4倍量のホスホラミダイトを送達し、ホスホラミダイト縮合を10分間行った。他のすべてのステップは、製造業者から提供された標準のプロトコルに従った。トルエン中の6%ジクロロ酢酸溶液を用いて、ヌクレオチドの5’−ヒドロキシル基からジメチルトリチル(DMT)基を除去した。カップリングステップ中、無水CH₃CN中の4,5−ジシアノイミダゾール(0.7M)を活性化剤として用いた。ホスホロチオエート連結部を、3分間の接触時間で、1:1のピリジン/CH₃CN中のキサンタンヒドリドの0.1M溶液による硫化によって導入した。6%の水を含有するCH₃CN中の20%のtert−ブチルヒドロペルオキシドの溶液を酸化剤として用いて、12分間の接触時間で、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部を得た。

所望の配列が構築された後、シアノエチルホスフェート保護基を、45分間の接触時間で、トリエチルアミンとアセトニトリルの1:1(v/v)の混合物を用いて脱保護した。固体支持体に結合されたASOをアンモニア水(28〜30重量%)中に懸濁し、55℃で6時間加熱した。

その後、非結合型ASOを濾過し、アンモニアを沸去した。残渣を強アニオン交換カラムでの高圧液体クロマトグラフィーによって精製した(GE Healthcare Bioscience、Source 30Q、30μm、2.54×8cm、A=30%CH₃CN水溶液中100mM酢酸アンモニウム、B=A中1.5M NaBr、60分後0〜40%のB、流量14mL/分−1、λ=260nm)。残渣を逆相カラムでのHPLCにより脱塩して、固体支持体への初期負荷量に基づいて15〜30%の単離収率で所望のASOを得た。ASOを、Agilent 1100 MSDシステムを用いたイオン対HPLC/MS分析によって特徴付けた。

当技術分野で周知の標準のオリゴヌクレオチド合成手順を用いて共役体を含まないアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。

これらの方法を用いて、ApoC IIIを標的とする3個の別個のアンチセンス化合物を調製した。以下の表17に要約されるように、ApoC IIIを標的とする3個のアンチセンス化合物のそれぞれは、同一の核酸塩基配列を有し、ISIS 304801は、すべてがホスホロチオエート連結部である5−10−5MOEギャップマーであり、ISIS 647535は、GalNAc₃−1をその3’末端で共役させたことを除いて、ISIS 304801と同一であり、ISIS 647536は、その化合物の特定のヌクレオシド間連結部がホスホジエステル連結部であることを除いて、ISIS 647535と同一であった。表17にさらに要約されるように、SRB−1を標的とする2つの別個のアンチセンス化合物を合成した。ISIS 440762は、すべてがホスホロチオエートヌクレオシド間連結部である2−10−2 cEtギャップマーであり、ISIS 651900は、その3’末端にGalNAc₃−1を含めたことを除いて、ISIS 440762と同一であった。

下付き文字「e」は、2’−MOE修飾ヌクレオシドを示し、「d」は、β−D−2’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「k」は、6’−(S)−CH₃二環式ヌクレオシド(例えば、cEt)を示し、「s」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部(PS)を示し、「o」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部(PO)を示し、「o’」は、−O−P(=O)(OH)−を示す。上付き文字「m」は、5−メチルシトシンを示す。「GalNAc₃−1」は、先の実施例9に示された構造を有する共役基を示す。GalNAc₃−1が、ASOを共役体の残りの部分に連結させる切断可能なアデノシンを含み、「GalNAc₃−1_a」と指定されることに留意されたい。上述の表ではこの命名法を用いて、共役体の一部であるアデノシンを含む全核酸塩基配列を示す。したがって、上述の表において、「A_do」を省略して「GalNAc₃−1」で終了する配列を列記することもできる。下付き文字「a」を用いて切断可能なヌクレオシドまたは切断可能部分を欠く共役基の部分を示すこの慣例をこれらの実施形態の全体を通して用いる。切断可能部分を欠く共役基のこの部分は、本明細書において「クラスター」または「共役クラスター」または「GalNAc₃クラスター」と称される。特定の事例において、これは、そのクラスター及びその切断可能部分を別々に提供することによって共役基を説明するのに好都合である。 実施例20:huApoC IIIトランスジェニックマウスにおけるヒトApoC IIIの用量依存的アンチセンス阻害

それぞれヒトApoC IIIを標的とし、かつ上に記載されるISIS 304801及びISIS 647535を別々に試験し、用量依存的試験において、ヒトApoC IIIトランスジェニックマウスにおけるヒトApoC IIIを阻害するそれらの能力について評価した。 処理

ヒトApoCIIIトランスジェニックマウスを12時間の明暗周期で維持し、Teklad実験食餌を不断給餌した。実験開始前に動物を研究施設で少なくとも7日間順化させた。ASOをPBS中に調製し、0.2ミクロンのフィルターを通して濾過して滅菌した。注入のためにASOを0.9%PBS中に溶解した。

ヒトApoC IIIトランスジェニックマウスに、ISIS 304801もしくは647535を、0.08、0.25、0.75、2.25、もしくは6.75μmol/kgで、または対照としてPBSを、週1回2週間、腹腔内に注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。最終用量の投与から48時間後に血液を各マウスから採取し、マウスを屠殺し、組織を収集した。 ApoC III mRNA分析

標準のプロトコルに従ってリアルタイムPCR及びRIBOGREEN(登録商標)RNA定量化試薬(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を用いてマウスの肝臓におけるApoC III mRNAレベルを決定した。PBS処理対照に対して標準化する前に(Ribogreenを用いて)ApoC III mRNAレベルを全RNAとの比較で相対的に決定した。以下の結果は、PBS処理対照に対して標準化された各処理群のApoC III mRNAレベルの平均パーセントとして提示され、「%PBS」で表示される。各ASOの半数効果濃度(ED₅₀)も以下の表18に示される。

例証されるように、PBS対照と比較して、両方のアンチセンス化合物がApoC III RNAを減少させた。さらに、GalNAc₃−1に共役されるアンチセンス化合物(ISIS 647535)は、GalNAc₃−1共役体を欠くアンチセンス化合物(ISIS 304801)よりもはるかに強力であった。

ApoC IIIタンパク質分析(比濁アッセイ)

2013年3月29日の出版前にオンラインで公開されたGraham et al(Circulation Research)によって報告された手順を用いて、血漿ApoC IIIタンパク質分析を行った。

マウスから単離した約100μLの血漿を、希釈することなく、Olympus臨床分析器及び市販の比濁ApoC IIIアッセイ(Kamiya、カタログ番号KAI−006、Kamiya Biomedical,Seattle,WA)を用いて分析した。アッセイプロトコルを供給業者が説明するとおりに実行した。

以下の表19に示されるように、PBS対照と比較して、両方のアンチセンス化合物がApoC IIIタンパク質を減少させた。さらに、GalNAc₃−1に共役されるアンチセンス化合物(ISIS 647535)は、GalNAc₃−1共役体を欠くアンチセンス化合物(ISIS 304801)よりもはるかに強力であった。

血漿トリグリセリド及びコレステロールを、Bligh and Dyerの方法(Bligh,E.G.and Dyer,W.J.Can.J.Biochem.Physiol.37:911−917、1959)(Bligh,E and Dyer,W,Can J Biochem Physiol,37,911−917,1959)(Bligh,E and Dyer,W,Can J Biochem Physiol,37,911−917,1959)を用いて抽出し、Beckmann Coulter臨床分析器及び市販の試薬を用いて測定した。

トリグリセリドレベルを、PBSを注入したマウスとの比較で相対的に測定し、「%PBS」で表示する。結果が表20に提示される。例証されるように、両方のアンチセンス化合物がトリグリセリドレベルを低下させた。さらに、GalNAc₃−1に共役されるアンチセンス化合物(ISIS 647535)は、GalNAc₃−1共役体を欠くアンチセンス化合物(ISIS 304801)よりも実質的にはるかに強力であった。

血漿試料をHPLCによって分析して、総コレステロールの量及びコレステロールの異なる画分(HDL及びLDL)の量を決定した。結果が表21及び22に提示される。例証されるように、両方のアンチセンス化合物が総コレステロールレベルを低下させ、LDLを低下させ、HDLを上昇させた。さらに、GalNAc₃−1に共役されるアンチセンス化合物(ISIS 647535)は、GalNAc₃−1共役体を欠くアンチセンス化合物(ISIS 304801)よりも実質的にはるかに強力であった。HDLレベルの増加及びLDLレベルの減少は、ApoC IIIのアンチセンス阻害の心臓血管の有益な影響である。

薬物動態分析(PK)

ASOのPKも評価した。肝臓及び腎臓試料を切り刻み、標準のプロトコルを用いて抽出した。試料をIP−HPLC−MSを利用するMSD1で分析した。全長ISIS 304801及び647535の組織レベル(μg/g)を測定し、結果が表23に提供される。例証されるように、総全長アンチセンス化合物の肝臓濃度は、これら2つのアンチセンス化合物と同様であった。したがって、GalNAc₃−1共役アンチセンス化合物が肝臓でより活性であるが(上のRNA及びタンパク質データによって実証されるように)、肝臓内で著しく高い濃度では存在しない。実際には、計算されたEC₅₀(表23に提供される)は、共役化合物の力価の観察された増加が蓄積の増加に完全に起因するわけではないことを裏付ける。この結果は、共役体が、肝臓蓄積単独以外の機構によって、おそらくアンチセンス化合物の細胞への生産的な取り込みを改善することによって、力価を改善したことを示唆する。

結果は、腎臓におけるGalNAc₃−1共役アンチセンス化合物の濃度が、GalNAc共役体を欠くアンチセンス化合物の濃度よりも低いことも示す。これは、いくつかの有益な治療的意味を有する。腎臓における活性が要求されない治療的指標において、腎臓への曝露は、腎毒性の危険性を有し、それに見合う利益がない。さらに、腎臓における高濃度は、典型的には、尿への化合物の損失をもたらし、より迅速なクリアランスをもたらす。したがって、非腎臓標的の場合、腎臓蓄積は望ましくない。これらのデータは、GalNAc₃−1共役が腎臓蓄積を減少させることを示唆する。

ISIS 647535の代謝物も特定し、それらの質量を高分解能質量分析によって確認した。観察された代謝物の切断部位及び構造が以下に示される。標準的手順を用いて全長ASOの相対%を計算し、結果が表23に提示される。ISIS 647535の主な代謝物は、全共役体を欠く全長ASO(すなわち、ISIS 304801)であり、これは、以下に示される切断部位Aでの切断に由来する。さらに、他の切断部位に由来するさらなる代謝物も観察された。これらの結果は、細胞内の酵素によって切断されうるか、またはサイトゾルの還元環境下で切断されうるか、またはエンドソーム及びリソソーム内の酸性pHに対して不安定な、GalNAc₃−1糖とASOとの間のエステル、ペプチド、ジスルフィド、ホスホラミデート、またはアシルヒドラゾンなどの他の切断可能な結合の導入も有用でありうることを示唆する。

実施例21:単回投与試験におけるヒトApoC IIIトランスジェニックマウスにおけるヒトApoC IIIのアンチセンス阻害

それぞれヒトApoC IIIを標的とし、かつ表17に記載されるISIS 304801、647535、及び647536を、単回投与試験において、ヒトApoC IIIトランスジェニックマウスにおけるヒトApoC IIIを阻害するそれらの能力についてさらに評価した。 処理

ヒトApoCIIIトランスジェニックマウスを12時間の明暗周期に維持し、Teklad実験食餌を不断給餌した。実験開始前に動物を研究施設で少なくとも7日間順化させた。ASOをPBS中に調製し、0.2ミクロンのフィルターを通して濾過滅菌した。注入のためにASOを0.9%PBS中に溶解した。

ヒトApoC IIIトランスジェニックマウスに、ISIS 304801、647535、もしくは647536(上述のもの)、またはPBS処理対照を、以下に示される投与量で1回、腹腔内注入した。処理群は、3匹の動物からなり、対照群は、4匹の動物からなった。治療前及び最終用量後に血液を各マウスから採取し、血漿試料を分析した。最終投与の72時間後にマウスを屠殺した。

試料を収集し、分析して、肝臓におけるApoC III mRNA及びタンパク質レベル、血漿トリグリセリド、ならびにHDL及びLDL画分を含むコレステロールを決定し、上述(実施例20)のように評価した。これらの分析からのデータは、以下の表24〜28に提示される。血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスとの比較で相対的に測定した。ALT及びASTレベルは、アンチセンス化合物がすべての投与量で良好な耐性であったことを示した。

これらの結果は、GalNAc₃−1共役体を欠くアンチセンス化合物(ISIS 304801)と比較して、3’末端にGalNAc₃−1共役体を含むアンチセンス化合物(ISIS 647535及び647536)の力価の改善を示す。さらに、GalNAc₃−1共役体及びいくつかのホスホジエステル連結部を含むISIS 647536は、同一の共役体を含むISIS 647535と同程度に強力であり、ASO内のすべてのヌクレオシド間連結部は、ホスホロチオエート連結部である。

これらの結果は、GalNAc₃−1共役体がアンチセンス化合物の力価を改善することを裏付ける。これらの結果は、GalNAc₃−1共役アンチセンス化合物の同等の力価も示し、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、混成連結部(6個のホスホジエステル連結部を有するISIS 647536)及び同一のアンチセンス化合物の完全なホスホロチオエートバージョン(ISIS 647535)を有する。

ホスホロチオエート連結部は、アンチセンス化合物にいくつかの特性を提供する。例えば、これらは、ヌクレアーゼ消化に抵抗し、タンパク質に結合し、腎臓/尿ではなく肝臓における化合物の蓄積をもたらす。これらは、肝臓における徴候を治療する際に特に望ましい特性である。しかしながら、ホスホロチオエート連結部は、炎症性応答とも関連している。したがって、化合物におけるホスホロチオエート連結部の数を減少させることにより、炎症の危険性の減少が見込まれるが、肝臓中の化合物の濃度も低下させ、腎臓及び尿中の濃度を増加させ、ヌクレアーゼの存在下で安定性を低下させ、全体の力価を低下させる。これらの結果は、特定のホスホロチオエート連結部がホスホジエステル連結部に置換されたGalNAc₃−1共役アンチセンス化合物が、肝臓における標的に対して、完全なホスホロチオエート連結部を有する対応物と同程度に強力であることを示す。そのような化合物は、より炎症誘発性が低いと見込まれる(PSの減少が炎症性効果の減少をもたらすことを示す実験を説明する実施例24を参照のこと)。 実施例22:生体内におけるSRB−1を標的とするGalNAc3−1共役修飾ASOの影響

それぞれSRB−1を標的とし、かつ表17に記載されるISIS 440762及び651900を、用量依存的試験において、Balb/cマウスにおけるSRB−1を阻害するそれらの能力について評価した。 処理

6週齢の雄Balb/cマウス(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)に、ISIS 440762、651900、またはPBS処理対照を、以下に示される投与量で1回、皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。最終投与の48時間後にマウスを屠殺して、標準のプロトコルに従ってリアルタイムPCR及びRIBOGREEN(登録商標)RNA定量化試薬(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を用いて、肝臓におけるSRB−1 mRNAレベルを決定した。PBS処理対照に対して標準化する前に(Ribogreenを用いて)SRB−1 mRNAレベルを全RNAとの比較で相対的に決定した。以下の結果は、PBS処理対照に対して標準化された各処理群のSRB−1 mRNAレベルの平均パーセントとして提示され、「%PBS」で表示される。

表29に例証されるように、両方のアンチセンス化合物がSRB−1 mRNAレベルを低下させた。さらに、GalNAc₃−1共役体(ISIS 651900)を含むアンチセンス化合物は、GalNAc₃−1共役体を欠くアンチセンス化合物(ISIS 440762)よりもはるかに強力であった。これらの結果は、異なる標的に相補的であり、かつ異なる化学修飾ヌクレオシドを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、GalNAc₃−1共役体の力価利益が観察されることを実証し、この事例において、修飾ヌクレオシドは、拘束エチル糖部分(二環式糖部分)を含む。

実施例23:ヒト末梢血単核細胞(hPBMC)アッセイプロトコル

BD Vautainer CPTチューブ法を用いてhPBMCアッセイを実行した。US HealthWorks clinic(Faraday & El Camino Real,Carlsbad)においてインフォームドコンセントを得た志願ドナー由来の全血試料を得て、4〜15個のBD Vacutainer CPT8mLチューブ(VWRカタログ番号BD362753)内に収集した。PBMCアッセイデータシートを用いて、各ドナーのCPTチューブ内の開始合計全血量の近似値を記録した。

遠心分離の直前に、チューブを8〜10回、穏やかに反転させることによって、血液試料を再度混合した。CPTチューブを、水平(スイングアウト)ローター内で、室温(18〜25℃)で30分間、ブレーキオフで1500〜1800RCFで遠心分離した(2700RPM、Beckman Allegra 6R)。細胞を(Ficollとポリマーゲル層との間の)バフィーコート界面から回収し、50mLの滅菌円錐チューブに移し、最大5個のCPTチューブ/50mLの円錐チューブ/ドナーをプールした。その後、細胞をPBS(Ca⁺⁺、Mg⁺⁺を含まない;GIBCO)で2回洗浄した。チューブを最大50mLまで満たし、数回反転させて混合した。その後、試料を、室温で15分間、330×gで遠心分離し(1215RPM、Beckman Allegra 6R)、ペレットを乱すことなくできるだけ多くの上澄みを吸引した。チューブを穏やかに回転させて細胞ペレットを取り除き、細胞をRPMI+10%FBS+pen/strep(約1mL/10mLの開始全血量)中に再懸濁した。60μLの試料を、600μLのVersaLyse試薬(Beckman Coulter、カタログ番号A09777)を有する試料バイアル(Beckman Coulter)にピペット注入し、10〜15秒間穏やかにボルテックスした。試料を室温で10分間インキュベートし、計数前に再度混合した。PBMC細胞型を用いたVicell XR細胞生存率分析器(Beckman Coulter)で細胞懸濁液を計数した(1:11の希釈係数を他のパラメータと共に保存した)。生細胞/mL及び生存率を記録した。細胞懸濁液をRPMI+10%FBS+pen/strep中で1×10⁷生PBMC/mLに希釈した。

細胞を96ウェル組織培養プレート(Falcon Microtest)の50μL/ウェル中に5×10⁵でプレーティングした。RPMI+10%FBS+pen/strep中で希釈した2倍濃度のオリゴ/対照の50μL/ウェルを実験テンプレートに従って添加した(合計100μL/ウェル)。プレートを振盪器に設置し、約1分間混合させた。37℃、5%CO₂で24時間インキュベートした後、プレートを400×gで10分間遠心分離し、その後、MSDサイトカインアッセイ(すなわち、ヒトIL−6、IL−10、IL−8、及びMCP−1)のために上澄みを除去した。 実施例24:hPBMCアッセイにおけるGalNAc₃−1共役ASOの炎症誘発作用の評価

表30に列記されるアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)を、実施例23に記載されるプロトコルを用いたhPBMCアッセイにおいて炎症誘発作用について評価した。ISIS 353512は、このアッセイにおいてIL−6放出に関する高レスポンダーとして知られる内部標準物である。hPBMCを新鮮な志願ドナーから単離し、0、0.0128、0.064、0.32、1.6、8、40、及び200μm濃度のASOで処理した。処理から24時間後、サイトカインレベルを測定した。

IL−6のレベルを一次読み出しとして用いた。標準的手順を用いてEC₅₀及びE_maxを計算した。結果が2つのドナー由来のE_max/EC₅₀の平均比率として表され、「E_max/EC₅₀」で表示される。より低い比率は、炎症誘発応答の相対的減少を示し、より高い比率は、炎症誘発応答の相対的増加を示す。

試験化合物に関して、炎症誘発性が最も低い化合物は、PS/PO連結ASO(ISIS 616468)であった。GalNAc₃−1共役ASO(ISIS 647535)は、その非共役対応物(ISIS 304801)よりもわずかに炎症誘発性が低かった。これらの結果は、いくつかのPO連結部の組み込みが炎症誘発反応を減少させ、GalNAc₃−1共役体の添加が化合物の炎症誘発性を高めず、炎症誘発応答を減少させうることを示す。したがって、混成PS/PO連結部及びGalNAc₃−1共役体の両方を含むアンチセンス化合物が、完全PS連結アンチセンス化合物(GalNAc₃−1共役体の有無にかかわらず)と比較して、より低い炎症誘発応答をもたらすことが予想されるであろう。これらの結果は、GalNAc₃₋1共役アンチセンス化合物、特に減少したPS含有量を有するものの炎症誘発性がより低いことを示す。

総合して、これらの結果は、GalNAc₃−1共役化合物、特にPS含有量を減らしたものを、対応物であるGalNAc₃−1共役体を欠く完全PSアンチセンス化合物よりも高い用量で投与することができることを示唆する。これらの化合物の半減期が実質的に異なることが予想されないため、そのようなより高い投与量は、結果として低頻度の投薬につながる。実際には、GalNAc₃−1共役化合物の方が力価が高く(実施例20〜22を参照のこと)、再投薬は化合物の濃度が所望のレベル未満に低下した時に必要になるが、その所望のレベルは力価に基づくことから、そのような投与の頻度はさらに低くなるだろう。

下付き文字「e」は、2’−MOE修飾ヌクレオシドを示し、「d」は、β−D−2’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「k」は、6’−(S)−CH₃二環式ヌクレオシド(例えば、cEt)を示し、「s」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部(PS)を示し、「o」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部(PO)を示し、「o’」は、−O−P(=O)(OH)−を示す。上付き文字「m」は、5−メチルシトシンを示す。「A_do’−GalNAc₃−1_a」は、示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端に結合される、実施例9に示される構造GalNAc₃−1を有する共役体を示す。

実施例25:生体外におけるヒトApoC IIIを標的とするGalNAc₃−1共役修飾ASOの影響

上述のISIS 304801及び647535を生体外で試験した。トランスジェニックマウス由来の25,000細胞/ウェルの密度の初代肝細胞を、0.03,0.08、0.24、0.74、2.22、6.67、及び20μm濃度の修飾オリゴヌクレオチドで処理した。約16時間の処理期間後、RNAを細胞から単離し、mRNAレベルを定量的リアルタイムPCRで測定し、hApoC III mRNAレベルをRIBOGREENで測定された全RNA含有量に従って調整した。

標準的方法を用いてIC₅₀を計算し、結果が表32に提示される。例証されるように、対照ISIS 304801と比較して、同程度の力価がISIS 647535で処理した細胞において観察された。

この実験において、生体内で観察されるGalNAc₃−1共役の大きな力価利益は、生体外では観察されなかった。生体外での初代肝細胞におけるその後の自由取り込み実験は、GalNAc共役体を欠くオリゴヌクレオチドと比較して、さまざまなGalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチドの力価の増加を示した(実施例60、82、及び92を参照のこと)。 実施例26:ApoC III ASO活性へのPO/PS連結部の影響

ヒトApoC IIIトランスジェニックマウスに、ISIS 304801もしくはISIS 616468(両方ともに上述のもの)またはPBS処理対照を、25mg/kgで週1回2週間、腹腔内注入した。処理群は、3匹の動物からなり、対照群は、4匹の動物からなった。治療前及び最終服用後に血液を各マウスから採取し、血漿試料を分析した。最終投与の72時間後にマウスを屠殺した。

試料を収集し、分析して、上述のように肝臓におけるApoC IIIタンパク質レベルを決定した(実施例20)。これらの分析からのデータが以下の表33に提示される。

これらの結果は、完全PS(ISIS 304801)と比較して、ウイングにPO/PSを有するアンチセンス化合物(ISIS 616468)の力価の減少を示す。

実施例27:化合物56

化合物56は、Glen Researchから市販されているか、またはShchepinov et al.,Nucleic Acids Research,1997,25(22),4447−4454によって報告された公開された手順に従って調製することができる。 実施例28:化合物60の調製

化合物4を実施例2に例証される手順どおりに調製した。化合物57は、市販のものである。化合物60を構造分析で確認した。

他の単保護された置換または無置換アルキルジオール、例えば限定するわけではないが、本明細書に提示されるものを用いて既定の組成を有するホスホラミダイトを調製することができるため、化合物57は、代表的なものであり、限定する意図はない。 実施例29:化合物63の調製

化合物61及び62を、Tober et al.,Eur.J.Org.Chem.,2013,3,566−577、及びJiang et al.,Tetrahedron,2007,63(19),3982−3988によって報告された手順と同様の手順を用いて調製する。

あるいは、化合物63を、Kim et al.の科学文献及び特許文献(Synlett,2003,12,1838−1840、及びKim et al.の公開されたPCT国際出願第WO2004063208号)に報告される手順と同様の手順を用いて調製する。 実施例30:化合物63bの調製

化合物63aを、Hanessian et al.,Canadian Journal of Chemistry,1996,74(9),1731−1737によって報告された手順と同様の手順を用いて調製する。 実施例31:化合物63dの調製

化合物63cを、Chen et al.,Chinese Chemical Letters,1998,9(5),451−453によって報告された手順と同様の手順を用いて調製する。 実施例32:化合物67の調製

実施例2に例証される手順どおりに化合物64を調製した。化合物65を、Or et al.の公開されたPCT国際出願第WO2009003009号によって報告された手順と同様の手順を用いて調製する。他の保護基、例えば限定するわけではないが、本明細書に提示されるものを用いることができるため、化合物65に用いた保護基は、代表的なものであり、限定する意図はない。 実施例33:化合物70の調製

実施例2に例証される手順どおりに化合物64を調製した。化合物68は、市販のものである。他の保護基、例えば限定するわけではないが、本明細書に提示されるものを用いることができるため、化合物68に用いた保護基は、代表的なものであり、限定する意図はない。 実施例34:化合物75aの調製

化合物75をShchepinov et al.,Nucleic Acids Research,1997,25(22),4447−4454によって報告された公開された手順に従って調製する。 実施例35:化合物79の調製

化合物76をShchepinov et al.,Nucleic Acids Research,1997,25(22),4447−4454によって報告された公開された手順に従って調製した。 実施例36:化合物79aの調製

化合物77を実施例35に例証される手順どおりに調製する。 実施例37:固体支持体による5’末端にホスホジエステル連結GalNAc₃−2共役体を含む共役オリゴマー化合物82の調製のための一般的方法(方法I)

GalNAc₃−2が、以下の構造を有する:

共役基GalNAc₃−2(GalNAc₃−2_a)のGalNAc₃クラスター部分を任意の切断可能部分と合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。GalNAc₃−2_aは、以下の式を有する:

VIMAD結合オリゴマー化合物79bを、自動DNA/RNA合成における標準的手順を用いて調製した(Dupouy et al.,Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45,3623−3627を参照のこと)。ホスホラミダイト化合物56及び60を、それぞれ、実施例27及び28にそれぞれ例証される手順どおりに調製した。他のホスホラミダイト構築ブロック、例えば限定するわけではないが、本明細書に提示されるものを用いて、5’末端にホスホジエステル連結共役基を有するオリゴマー化合物を調製することができるため、例証されるホスホラミダイトは、代表的なものであり、限定する意図はない。固体支持体に添加されるホスホラミダイトの順序及び量を調整して、任意の既定の配列及び組成を有する本明細書に記載するオリゴマー化合物を調製することができる。 実施例38:5’末端にホスホジエステル連結GalNAc₃−2共役体を含むオリゴマー化合物82の調製のための代替方法(方法II)

VIMAD結合オリゴマー化合物79bを、自動DNA/RNA合成における標準的手順を用いて調製した(Dupouy et al.,Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45,3623−3627を参照のこと)。GalNAc₃−2クラスターホスホラミダイト(化合物79)を実施例35に例証される手順どおりに調製した。この代替方法は、合成の最終ステップでのホスホジエステル連結GalNAc₃−2共役体のオリゴマー化合物への一段階導入を可能にする。他のホスホラミダイト構築ブロック、例えば限定するわけではないが、本明細書に提示されるものを用いて5’末端にホスホジエステル共役体を有するオリゴマー化合物を調製することができるため、例証されるホスホラミダイトは、代表的なものであり、限定する意図はない。固体支持体に添加されるホスホラミダイトの順序及び量を調整して、任意の既定の配列及び組成を有する本明細書に記載するオリゴマー化合物を調製することができる。 実施例39:固体支持体による5’末端にGalNAc₃−3共役体(5’末端結合のためにGalNAc₃−1修飾されたもの)を含むオリゴマー化合物83hの調製のための一般的方法

化合物18を実施例4に例証される手順どおりに調製した。化合物83a及び83bは、市販のものである。ホスホジエステル連結ヘキシルアミンを含むオリゴマー化合物83eを標準のオリゴヌクレオチド合成手順を用いて調製した。保護されたオリゴマー化合物をアンモニア水で処理することにより、5’−GalNAc₃−3共役オリゴマー化合物(83h)を提供した。

GalNAc₃−3が、以下の構造を有する:

共役基GalNAc₃−3(GalNAc₃−3_a)のGalNAc₃クラスター部分を任意の切断可能部分と合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。GalNAc₃−3_aは、以下の式を有する:

実施例40:固体支持体による3’末端にホスホジエステル連結GalNAc₃−4共役体を含むオリゴマー化合物89の調製のための一般的方法

GalNAc₃−4が、以下の構造を有する:

式中、CMは、切断可能部分である。特定の実施形態において、切断可能部分は、以下のものである:

共役基GalNAc₃−4(GalNAc₃−4_a)のGalNAc₃クラスター部分を任意の切断可能部分と合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。GalNAc₃−4_aは、以下の式を有する:

保護されたUnylinker機能化固体支持体化合物30は、市販のものである。化合物84を、文献に報告される手順と同様の手順を用いて調製する(Shchepinov et al.,Nucleic Acids Research,1997,25(22),4447−4454、Shchepinov et al.,Nucleic Acids Research,1999,27,3035−3041、及びHornet et al.,Nucleic Acids Research,1997,25,4842−4849を参照のこと)。

ホスホラミダイト構築ブロック(化合物60及び79a)を実施例28及び36に例証される手順どおりに調製する。他のホスホラミダイト構築ブロックを用いて、既定の配列及び組成を有する3’末端にホスホジエステル連結共役体を有するオリゴマー化合物を調製することができるため、例証されるホスホラミダイトは、代表的なものであり、限定する意図はない。固体支持体に添加されるホスホラミダイトの順序及び量を調整して、任意の既定の配列及び組成を有する本明細書に記載するオリゴマー化合物を調製することができる。 実施例41:固相技法による5’位にホスホジエステル連結GalNAc₃−2(Bxがアデニンである実施例37を参照のこと)共役体を含むASOの調製のための一般的方法(ISIS 661134の調製)

別段の明示がある場合を除き、オリゴマー化合物の合成に用いるすべての試薬及び溶液を商業的供給源から購入する。標準のホスホラミダイト構築ブロック及び固体支持体を、例えば、T、A、G、及び^mC残基を含む、ヌクレオシド残基の組み込みのために用いる。ホスホラミダイト化合物56及び60を用いて、5’末端のホスホジエステル連結GalNAc₃−2共役体を合成した。無水アセトニトリル中のホスホラミダイトの0.1M溶液をb−D−2’−デオキシリボヌクレオシド及び2’−MOEに用いた。

カラムに充填されたVIMAD固体支持体(110μmol/g、Guzaev et al.,2003)でのホスホラミダイトカップリング法により、ASO合成を、ABI 394合成装置(1〜2μmolの規模)またはGE Healthcare Bioscience AeKTAオリゴパイロット合成装置(40〜200μmolの規模)で実行した。このカップリングステップについて、固体支持体の初期負荷量に対して4倍過剰のホスホラミダイトを送達し、ホスホラミダイトカップリングを10分間行った。すべての他のステップは、製造業者から提供された標準のプロトコルに従った。トルエン中の6%ジクロロ酢酸溶液を用いて、ヌクレオチドの5’−ヒドロキシル基からジメトキシトリチル(DMT)基を除去した。カップリングステップ中、無水CH₃CN中の4,5−ジシアノイミダゾール(0.7M)を活性化剤として用いた。ホスホロチオエート連結部を、3分間の接触時間で、1:1のピリジン/CH₃CN中のキサンタンヒドリドの0.1M溶液による硫化によって導入した。6%の水を含有するCH₃CN中の20%のtert−ブチルヒドロペルオキシドの溶液を酸化剤として用いて、12分間の接触時間で、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部を提供した。

所望の配列が構築された後、シアノエチルホスフェート保護基を、45分間の接触時間で、トルエン中の20%ジエチルアミン(v/v)を用いて脱保護した。固体支持体に結合されたASOをアンモニア水(28〜30重量%)中に懸濁し、55℃で6時間加熱した。

その後、非結合型ASOを濾過し、アンモニアを沸去した。残渣を強アニオン交換カラムでの高圧液体クロマトグラフィーによって精製した(GE Healthcare Bioscience、Source 30Q、30μm、2.54×8cm、A=30%CH₃CN水溶液中100mM酢酸アンモニウム、B=A中1.5M NaBr、60分後0〜40%のB、流量14mL/分、λ=260nm)。残渣を逆相カラムでのHPLCにより脱塩して、固体支持体への初期負荷量に基づいて15〜30%の単離収率で所望のASOを得た。ASOを、Agilent 1100 MSDシステムを用いたイオン対HPLC/MS分析によって特徴付けた。

下付き文字「e」は、2’−MOE修飾ヌクレオシドを示し、「d」は、β−D−2’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「k」は、6’−(S)−CH₃二環式ヌクレオシド(例えば、cEt)を示し、「s」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部(PS)を示し、「o」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部(PO)を示し、「o’」は、−O−P(=O)(OH)−を示す。上付き文字「m」は、5−メチルシトシンを示す。GalNAc₃−2_aの構造が実施例37に示される。 実施例42:固相技法による5’位にGalNAc₃−3共役体を含むASOの調製のための一般的方法(ISIS 661166の調製)

ISIS 661166の合成を、実施例39及び41に例証される手順と同様の手順を用いて実行した。

ISIS 661166は、5’位がGalNAc₃−3共役体を含む5−10−5MOEギャップマーである。ASOを、Agilent 1100 MSDシステムを用いたイオン対HPLC/MS分析によって特徴付けた。

下付き文字「e」は、2’−MOE修飾ヌクレオシドを示し、「d」は、β−D−2’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「s」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部(PS)を示し、「o」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部(PO)を示し、「o’」は、−O−P(=O)(OH)−を示す。上付き文字「m」は、5−メチルシトシンを示す。「5’−GalNAc₃−3a」の構造が実施例39に示される。 実施例43:生体内におけるSRB−1を標的とする5’末端でのホスホジエステル連結GalNAc₃−2の用量依存的試験(Bxがアデニンである実施例37及び41を参照のこと)

5’末端にホスホジエステル連結GalNAc₃−2共役体を含むISIS 661134(実施例41を参照のこと)を、用量依存的試験においてマウスにおけるSRB−1のアンチセンス阻害について試験した。非共役ISIS 440762及び651900(3’末端にGalNAc₃−1共役体、実施例9を参照のこと)を比較のために試験に含め、先の表17に記載する。 処理

6週齢の雄Balb/cマウス(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)に、ISIS 440762、651900、661134、またはPBS処理対照を、以下に示される投与量で1回、皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。最終投与の72時間後にマウスを屠殺して、リアルタイムPCR及びRIBOGREEN(登録商標)RNA定量化試薬(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を用いて、肝臓におけるSRB−1 mRNAレベルを標準プロトコルに従って決定した。PBS処理対照に対して標準化する前に(Ribogreenを用いて)SRB−1 mRNAレベルを全RNAとの比較で相対的に決定した。以下の結果は、PBS処理対照に対して標準化された各処理群のSRB−1 mRNAレベルの平均パーセントとして提示され、「%PBS」で表示される。前記方法と同様の方法を用いてED₅₀を測定し、以下に提示する。

表35に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でSRB−1 mRNAレベルを低下させた。実際には、5’末端にホスホジエステル連結GalNAc₃−2共役体(ISIS 661134)または3’末端に連結されたGalNAc₃−1共役体(ISIS 651900)を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド(ISIS 440762)と比較して、力価の大幅な改善を示した。さらに、5’末端にホスホジエステル連結GalNAc₃−2共役体を含むISIS 661134は、3’末端にGalNAc₃−1共役体を含むISIS 651900と比較して、等効力であった。

3’GalNAc₃−1及び5’GalNAc₃−2の構造は、先の実施例9及び37に記載されている。 薬物動態分析(PK)

高用量群(7mg/kg)でのASOのPKを調べ、実施例20に例証される方法と同一の方法で評価した。肝臓試料を切り刻み、標準のプロトコルを用いて抽出した。661134(5’GalNAc₃−2)及びISIS 651900(3’GalNAc₃−1)の全長代謝物を特定し、これらの質量を高分解能質量分析によって確認した。結果は、5’末端にホスホジエステル連結GalNAc₃−2共役体を含むASO(ISIS 661134)に対して検出された主な代謝物が、ISIS 440762であったことを示した(データ示されず)。検出可能なレベルでさらなる代謝物は観察されなかった。その対応物とは異なり、先の表23aに報告された代謝物と同様のさらなる代謝物が、3’末端にGalNAc₃−1共役体を有するASO(ISIS 651900)で観察された。これらの結果は、ホスホジエステル連結GalNAc₃−1またはGalNAc₃−2共役体を有することで、それらの力価を損なうことなくASOのPKプロファイルを改善しうることを示唆する。 実施例44:SRB−1を標的とする3’末端にGalNAc3−1共役体(実施例9を参照のこと)を含むASOのアンチセンス阻害へのPO/PS連結部の影響

それぞれSRB−1を標的とする、3’末端にGalNAc₃−1共役体を含むISIS 655861及び655862を、単回投与試験においてマウスにおけるSRB−1を阻害するそれらの能力について試験した。親非共役化合物ISIS 353382を比較のために試験に含めた。

ASOは5−10−5MOEギャップマーであり、ギャップ領域は、10個の2’−デオキシリボヌクレオシドを含み、各ウイング領域は、5個の2’−MOE修飾ヌクレオシドを含む。ASOを先の実施例19に例証される方法と同様の方法を用いて調製し、以下の表36に示す。

下付き文字「e」は、2’−MOE修飾ヌクレオシドを示し、「d」は、β−D−2’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「s」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部(PS)を示し、「o」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部(PO)を示し、「o’」は、−O−P(=O)(OH)−を示す。上付き文字「m」は、5−メチルシトシンを示す。「GalNAc₃−1」の構造が実施例9に示される。 処理

6週齢の雄Balb/cマウス(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)に、ISIS 353382、655861、655862、またはPBS処理対照を、以下に示される投与量で1回、皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。治療前及び最終服用後に血液を各マウスから採取し、血漿試料を分析した。最終投与の72時間後にマウスを屠殺して、リアルタイムPCR及びRIBOGREEN(登録商標)RNA定量化試薬(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を用いて、肝臓におけるSRB−1 mRNAレベルを決定した。PBS処理対照に対して標準化する前に(Ribogreenを用いて)SRB−1 mRNAレベルを全RNAとの比較で相対的に決定した。以下の結果は、PBS処理対照に対して標準化された各処理群のSRB−1 mRNAレベルの平均パーセントとして提示され、「%PBS」で表示される。前記方法と同様の方法を用いてED₅₀を測定し、以下に報告する。

表37に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、PBS処理対照と比較して、用量依存的様式でSRB−1 mRNAレベルを低下させた。実際には、3’末端にGalNAc₃−1共役体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド(ISIS 655861及び655862)は、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド(ISIS 353382)と比較して、力価の大幅な改善を示した。さらに、混成PS/PO連結部を有するISIS 655862は、完全PS(ISIS 655861)と比較して、力価の改善を示した。

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスとの比較で相対的に測定した。臓器重量も評価した。結果は、PBS対照と比較して、ASOで処理したマウスにおいて、トランスアミナーゼレベル(表38)の増加も臓器重量(データ示されず)の増加も観察されなかったことを示した。さらに、混成PS/PO連結部を有するASO(ISIS 655862)は、完全PS(ISIS 655861)と比較して、同様のトランスアミナーゼレベルを示した。

実施例45:PFPエステル(化合物110a)の調製

化合物4(9.5g、28.8mmole)を化合物103aまたは103b(38mmole)で個別に処理し、ジクロロメタン(200mL)中のTMSOTf(0.5当量)及びモレキュラーシーブで処理し、室温で16時間撹拌した。この時点で、セライトを通して有機層を濾過し、その後、重炭酸ナトリウム、水、及びブラインで洗浄した。その後、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で還元した。結果として生じた油状物をシリカゲルクロマトグラフィー(2%→10%メタノール/ジクロロメタン)によって精製して、80%超の収率で化合物104a及び104bを得た。LCMS及びプロトンNMRは、その構造と一致した。

化合物104a及び104bを化合物100a〜d(実施例47)と同一の条件で処理して、90%超の収率で化合物105a及び105bを得た。LCMS及びプロトンNMRは、その構造と一致した。

化合物105a及び105bを、化合物901a〜dと同一の条件下、化合物90で個別に処理して、化合物106a(80%)及び106b(20%)を得た。LCMS及びプロトンNMRは、その構造と一致した。

化合物106a及び106bを化合物96a〜d(実施例47)と同一の条件で処理して、107a(60%)及び107b(20%)を得た。LCMS及びプロトンNMRは、その構造と一致した。

化合物107a及び107bを化合物97a〜d(実施例47)と同一の条件で処理して、40〜60%の収率で化合物108a及び108bを得た。LCMS及びプロトンNMRは、その構造と一致した。

化合物108a(60%)及び108b(40%)を化合物100a〜d(実施例47)と同一の条件で処理して、80%超の収率で化合物109a及び109bを得た。LCMS及びプロトンNMRは、その構造と一致した。

化合物109aを化合物101a〜d(実施例47)と同一の条件で処理して、30〜60%の収率で化合物110aを得た。LCMS及びプロトンNMRは、その構造と一致した。あるいは、化合物110bを化合物109bから開始して同様の方法で調製することができる。 実施例46:PFPエステル(オリゴヌクレオチド111)との共役のための一般的手順;ISIS 666881(GalNAc₃−10)の調製

標準の固相オリゴヌクレオチド手順を用いて5’−ヘキシルアミノ修飾オリゴヌクレオチドを合成し、精製した。5’−ヘキシルアミノ修飾オリゴヌクレオチドを0.1M四ホウ酸ナトリウム(pH8.5、200μL)中に溶解し、DMSO(50μL)中に溶解した3当量の選択されたPFPエステル化GalNAc₃クラスターを添加した。ASO溶液への添加時にPFPエステルが沈殿した場合、すべてのPFPエステルが溶解した状態になるまでDMSOを添加した。室温で約16時間混合した後、反応が完了した。結果として生じた溶液を水で希釈して12mLにし、その後、質量カットオフが3000Daのスピンフィルター中、3000rpmで沈降させた。このプロセスを2回繰り返して、小分子不純物を除去した。その後、この溶液を凍結乾燥乾固させ、濃縮アンモニア水中に再溶解し、室温で2.5時間混合し、その後、真空内で濃縮して、アンモニアの大部分を除去した。共役オリゴヌクレオチドを精製し、RP−HPLCによって脱塩し、凍結乾燥させて、GalNAc₃共役オリゴヌクレオチドを得た。

オリゴヌクレオチド111をGalNAc₃−10と共役する。共役基GalNAc₃−10(GalNAc₃−10_a)のGalNAc₃クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。特定の実施形態において、切断可能部分は、以下のGalNAc₃−10で合成されたオリゴヌクレオチド(ISIS 666881)に示される−P(=O)(OH)−A_d−P(=O)(OH)−である。GalNAc₃−10(GalNAc₃−10_a−CM−)の構造は、以下に示される:

この一般的手順に従って、ISIS 666881を調製した。標準の固相オリゴヌクレオチド手順を用いて5’−ヘキシルアミノ修飾オリゴヌクレオチド(ISIS 660254)を合成し、精製した。ISIS 660254(40mg、5.2μmol)を0.1M四ホウ酸ナトリウムpH8.5(200μL)中に溶解し、DMSO(50μL)中に溶解した3当量のPFPエステル(化合物110a)を添加した。ASO溶液への添加時にPFPエステルが沈殿した場合、PFPエステルを完全に溶解するためにさらなるDMSO(600μL)が必要であった。室温で約16時間混合した後、反応が完了した。この溶液を水で希釈して全体積12mLにし、質量カットオフが3000Daのスピンフィルター中、3000rpmで沈降させた。このプロセスを2回繰り返して、小分子不純物を除去した。この溶液を凍結乾燥乾固させ、濃縮アンモニア水中に再溶解し、室温で2.5時間混合し、その後、真空内で濃縮して、アンモニアの大部分を除去した。共役オリゴヌクレオチドを精製し、RP−HPLCによって脱塩し、凍結乾燥させて、90重量%の収率でISIS 666881(42mg、4.7μmol)を得た。

大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^mCは、5−メチルシトシンを示す。下付き文字「e」は、2’−MOE修飾ヌクレオシドを示し、「d」は、β−D−2’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「s」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部(PS)を示し、「o」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部(PO)を示し、「o’」は、−O−P(=O)(OH)−を示す。共役基は、太字で表示されている。 実施例47:GalNAc₃−8を含むオリゴヌクレオチド102の調製

三酸90(4g、14.43mmol)をDMF(120mL)及びN,N−ジイソプロピルエチルアミン(12.35mL、72mmole)中に溶解した。トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル(8.9mL、52mmole)をアルゴン下で滴加し、反応物を室温で30分間撹拌させた。Boc−ジアミン91aまたは91b(68.87mmol)をN,N−ジイソプロピルエチルアミン(12.35mL、72mmole)とともに添加し、反応物を室温で16時間撹拌させた。この時点で、DMFを減圧下で75%超、減量し、その後、混合物をジクロロメタン中に溶解した。有機層を重炭酸ナトリウム、水、及びブラインで洗浄した。その後、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で減量して、油状物とした。結果として生じた油状物をシリカゲルクロマトグラフィー(2%→10%メタノール/ジクロロメタン)によって精製して、約80%の収率で化合物92a及び92bを得た。LCMS及びプロトンNMRは、その構造と一致した。

化合物92aまたは92b(6.7mmole)を20mLのジクロロメタン及び20mLのトリフルオロ酢酸で、室温で16時間処理した。結果として生じた溶液を蒸発させ、その後、メタノール中に溶解し、DOWEX−OH樹脂で30分間処理した。結果として生じた溶液を濾過し、減圧下で減量して油状物とすることで、85〜90%の収率の化合物93a及び93bを得た。

化合物7または64(9.6mmole)をDMF(20mL)中のHBTU(3.7g、9.6mmole)及びN,N−ジイソプロピルエチルアミン(5mL)で15分間処理した。これに、化合物93aまたは93b(3mmole)のいずれかを添加し、室温で16時間撹拌させた。この時点で、DMFを減圧下で75%超、減量し、その後、混合物をジクロロメタン中に溶解した。有機層を重炭酸ナトリウム、水、及びブラインで洗浄した。その後、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で減量して、油状物とした。結果として生じた油状物をシリカゲルクロマトグラフィー(5%→20%メタノール/ジクロロメタン)によって精製して、20〜40%の収率で化合物96a〜dを得た。LCMS及びプロトンNMRは、その構造と一致した。

化合物96a〜d(0.75mmole)をラネーニッケル上で3時間、エタノール(75mL)中で個別に水素化した。この時点で、セライトを通して触媒を濾去し、エタノールを減圧下で除去して、80〜90%の収率で化合物97a〜dを得た。LCMS及びプロトンNMRは、その構造と一致した。

化合物23(0.32g、0.53mmole)をDMF(30mL)中のHBTU(0.2g、0.53mmole)及びN,N−ジイソプロピルエチルアミン(0.19mL、1.14mmole)で15分間処理した。これに、化合物97a〜d(0.38mmole)を個別に添加し、室温で16時間撹拌させた。この時点で、DMFを減圧下で75%超、減量し、その後、混合物をジクロロメタン中に溶解した。有機層を重炭酸ナトリウム、水、及びブラインで洗浄した。その後、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で減量して、油状物とした。結果として生じた油状物をシリカゲルクロマトグラフィー(2%→20%メタノール/ジクロロメタン)によって精製して、30〜40%の収率で化合物98a〜dを得た。LCMS及びプロトンNMRは、その構造と一致した。

化合物99(0.17g、0.76mmole)をDMF(50mL)中のHBTU(0.29g、0.76mmole)及びN,N−ジイソプロピルエチルアミン(0.35mL、2.0mmole)で15分間処理した。これに、化合物97a〜d(0.51mmole)を個別に添加し、室温で16時間撹拌させた。この時点で、DMFを減圧下で75%超、減量し、その後、混合物をジクロロメタン中に溶解した。有機層を重炭酸ナトリウム、水、及びブラインで洗浄した。その後、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で減量して、油状物とした。結果として生じた油状物をシリカゲルクロマトグラフィー(5%→20%メタノール/ジクロロメタン)によって精製して、40〜60%の収率で化合物100a〜dを得た。LCMS及びプロトンNMRは、その構造と一致した。

化合物100a〜d(0.16mmole)を、10%Pd(OH)₂/C上で3時間、メタノール/酢酸エチル(1:1、50mL)中で個別に水素化した。この時点で、セライトを通して触媒を濾去し、有機物を減圧下で除去して、80〜90%の収率で化合物101a〜dを得た。LCMS及びプロトンNMRは、その構造と一致した。

化合物101a〜d(0.15mmole)をDMF(15mL)及びピリジン(0.016mL、0.2mmole)中に個別に溶解した。トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル(0.034mL、0.2mmole)をアルゴン下で滴加し、反応物を室温で30分間撹拌させた。この時点で、DMFを減圧下で75%超、減量し、その後、混合物をジクロロメタン中に溶解した。有機層を重炭酸ナトリウム、水、及びブラインで洗浄した。その後、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で減量して、油状物とした。結果として生じた油状物をシリカゲルクロマトグラフィー(2%→5%メタノール/ジクロロメタン)によって精製して、約80%の収率で化合物102a〜dを得た。LCMS及びプロトンNMRは、その構造と一致した。

実施例46に例証される一般的手順を用いて、GalNAc₃−8共役基を含むオリゴマー化合物102を調製した。共役基GalNAc₃−8(GalNAc₃−8_a)のGalNAc₃クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。好ましい一実施形態において、切断可能部分は、−P(=O)(OH)−A_d−P(=O)(OH)−である。

GalNAc₃−8(GalNAc₃−8_a−CM−)の構造は、以下に示される:

実施例48:GalNAc₃−7を含むオリゴヌクレオチド119の調製

文献(J.Med.Chem.2004,47,5798−5808)に記載される手順に従って化合物112を合成した。

化合物112(5g、8.6mmol)を1:1メタノール/酢酸エチル(22mL/22mL)中に溶解した。炭素(0.5g)上水酸化パラジウムを添加した。反応混合物を室温で12時間、水素下で撹拌した。セライトパッドを通して反応混合物を濾過し、そのパッドを1:1メタノール/酢酸エチルで洗浄した。濾液と洗浄物を合わせ、濃縮乾固させて、化合物105a(定量的)を得た。この構造を、LCMSによって確認した。

化合物113(1.25g、2.7mmol)、HBTU(3.2g、8.4mmol)、及びDIEA(2.8mL、16.2mmol)を無水DMF(17mL)中に溶解し、反応混合物を室温で5分間撹拌した。これに、無水DMF(20mL)中の化合物105a(3.77g、8.4mmol)の溶液を添加した。反応物を室温で6時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去して、油状物を得た。残渣をCH₂Cl₂(100mL)中に溶解し、飽和NaHCO₃水溶液(100mL)及びブライン(100mL)で洗浄した。有機相を分離し、乾燥させ(Na₂SO₄)、濾過し、蒸発させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の10〜20%MeOHで溶出して、化合物114(1.45g、30%)を得た。この構造を、LCMS及び¹H NMR分析によって確認した。

化合物114(1.43g、0.8mmol)を1:1メタノール/酢酸エチル(4mL/4mL)中に溶解した。パラジウム炭素(湿性、0.14g)を添加した。反応混合物を水素でフラッシュし、室温で12時間、水素下で撹拌した。セライトパッドを通して反応混合物を濾過した。このセライトパッドをメタノール/酢酸エチル(1:1)で洗浄した。濾液と洗浄物を一つに合わせ、減圧下で蒸発させて、化合物115(定量的)を得た。この構造を、LCMS及び¹H NMR分析によって確認した。

化合物83a(0.17g、0.75mmol)、HBTU(0.31g、0.83mmol)、及びDIEA(0.26mL、1.5mmol)を無水DMF(5mL)中に溶解し、反応混合物を室温で5分間撹拌した。これに、無水DMF中の化合物115(1.22g、0.75mmol)の溶液を添加し、反応物を室温で6時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をCH₂Cl₂中に溶解した。有機層を飽和NaHCO₃水溶液及びブラインで洗浄し、無水Na₂SO₄上で乾燥させ、濾過した。有機層を濃縮乾固させ、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の3〜15%MeOHで溶出して、化合物116(0.84g、61%)を得た。この構造を、LC MS及び¹H NMR分析によって確認した。

化合物116(0.74g、0.4mmol)を1:1メタノール/酢酸エチル(5mL/5mL)中に溶解した。パラジウム炭素(湿性、0.074g)を添加した。反応混合物を水素でフラッシュし、室温で12時間、水素下で撹拌した。セライトパッドを通して反応混合物を濾過した。このセライトパッドをメタノール/酢酸エチル(1:1)で洗浄した。濾液と洗浄物を一つに合わせ、減圧下で蒸発させて、化合物117(0.73g、98%)を得た。この構造を、LCMS及び¹H NMR分析によって確認した。

化合物117(0.63g、0.36mmol)を無水DMF(3mL)中に溶解した。この溶液に、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(70μL、0.4mmol)及びトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル(72μL、0.42mmol)を添加した。反応混合物を室温で12時間撹拌し、飽和NaHCO₃水溶液に注いだ。この混合物をジクロロメタンで抽出し、ブラインで洗浄し、無水Na₂SO₄上で乾燥させた。このジクロロメタン溶液を濃縮乾固させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、ジクロロメタン中の5〜10%MeOHで溶出して、化合物118(0.51g、79%)を得た。この構造を、LCMSと、¹Hならびに¹H及び¹⁹F NMRによって確認した。

実施例46に例証される一般的手順を用いて、GalNAc₃−7共役基を含むオリゴマー化合物119を調製した。共役基GalNAc₃−7(GalNAc₃−7_a)のGalNAc₃クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。特定の実施形態において、切断可能部分は、−P(=O)(OH)−A_d−P(=O)(OH)−である。

GalNAc₃−7(GalNAc₃−7_a−CM−)の構造は、以下に示される:

実施例49:GalNAc₃−5を含むオリゴヌクレオチド132の調製

化合物120(14.01g、40mmol)及びHBTU(14.06g、37mmol)を無水DMF(80mL)中に溶解した。トリエチルアミン(11.2mL、80.35mmol)を添加し、5分間撹拌した。反応混合物を氷浴中で冷却し、無水DMF(20mL)中の化合物121(10g、mmol)の溶液を添加した。さらなるトリエチルアミン(4.5mL、32.28mmol)を添加し、反応混合物をアルゴン雰囲気下で18時間撹拌した。TLC(1:1の酢酸エチル:ヘキサン;Rf=0.47)によって反応を監視した。溶媒を減圧下で除去した。残渣をEtOAc(300mL)中に取り込み、1M NaHSO₄(3×150mL)、飽和NaHCO₃水溶液(3×150mL)、及びブライン(2×100mL)で洗浄した。有機層をNa₂SO₄で乾燥させた。乾燥剤を濾去し、有機層を回転蒸発によって濃縮した。粗混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ヘキサン中の35〜50%EtOAcを用いて溶出して、化合物122(15.50g、78.13%)を得た。この構造を、LCMS及び¹H NMR分析によって確認した。質量(m/z)589.3[M+H]⁺。

水(20mL)及びTHF(10mL)中のLiOH(92.15mmol)の溶液を、メタノール(15mL)中に溶解した化合物122の冷溶液(7.75g、13.16mmol)に添加した。反応混合物を室温で45分間撹拌し、TLC(1:1のEtOAc:ヘキサン)によって監視した。反応混合物を減圧下で濃縮して、半分の体積にした。残りの溶液を氷浴中で冷却して、濃縮HClを添加して中和した。反応混合物を希釈し、EtOAc(120mL)で抽出し、ブライン(100mL)で洗浄した。エマルジョンが生じたが、一晩静置すると濁りがなくなった。有機層を分離し、乾燥させ(Na₂SO₄₎、濾過し、蒸発させて、化合物123(8.42g)を得た。質量が大きすぎる原因はおそらく残留塩である。LCMSは、この構造と一致した。この生成物をさらに精製することなく使用した。M.W.計算値:574.36、M.W.実測値:575.3[M+H]⁺。

文献(J.Am.Chem.Soc.2011,133,958−963)に記載される手順に従って化合物126を合成した。

化合物123(7.419g、12.91mmol)、HOBt(3.49g、25.82mmol)、及び化合物126(6.33g、16.14mmol)をDMF(40mL)中に溶解し、結果として生じた反応混合物を氷浴中で冷却した。これに、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(4.42mL、25.82mmol)、PyBop(8.7g、16.7mmol)、続いて、Bopカップリング試薬(1.17g、2.66mmol)をアルゴン雰囲気下で添加した。氷浴を除去し、溶液を室温まで温めた。1時間後に反応が完了したことを、TLC(89:10:1のDCM:MeOH:AA)によって決定した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をEtOAc(200mL)中に溶解し、1M NaHSO₄(3×100mL)、飽和NaHCO₃水溶液(3×100mL)、及びブライン(2×100mL)で洗浄した。有機相を分離し、乾燥させ(Na₂SO₄)、濾過し、濃縮した。残渣を50%ヘキサン/EtOAC:100%EtOAcの勾配でのシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、白色の泡状物として化合物127(9.4g)を得た。LCMS及び¹H NMRは、その構造と一致した。質量(m/z)778.4[M+H]⁺。

トリフルオロ酢酸(12mL)をジクロロメタン(12mL)中の化合物127(1.57g、2.02mmol)の溶液に添加し、室温で1時間撹拌した。反応混合物を減圧下でトルエン(30mL)と共蒸発乾固させた。得られた残渣をアセトニトリル(30mL)及びトルエン(40mL)と2回共蒸発させて、トリフルオロ酢酸塩として化合物128(1.67g)を得て、さらに精製することなく次のステップで使用した。LCMS及び¹H NMRは、その構造と一致した。質量(m/z)478.2[M+H]⁺。

丸底フラスコ内で、化合物7(0.43g、0.963mmol)、HATU(0.35g、0.91mmol)、及びHOAt(0.035g、0.26mmol)を一つに合わせ、減圧下、P₂O₅上で4時間乾燥させ、その後、無水DMF(1mL)中に溶解し、5分間撹拌した。これに無水DMF(0.2mL)及びN,N−ジイソプロピルエチルアミン(0.2mL)中の化合物128(0.20g、0.26mmol)の溶液を添加した。反応混合物をアルゴン雰囲気下、室温で撹拌した。30分間後に反応が完了したことを、LCMS及びTLC(7%MeOH/DCM)によって決定した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をDCM(30mL)中に溶解し、1M NaHSO₄(3×20mL)、飽和NaHCO₃水溶液(3×20mL)、及びブライン(3×20mL)で洗浄した。有機相を分離し、Na₂SO₄上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をジクロロメタン中の5〜15%MeOHを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物129(96.6mg)を得た。LC MS及び¹H NMRは、この構造と一致する。質量(m/z)883.4[M+2H]⁺。

20mLのシンチレーションバイアル内で化合物129(0.09g、0.051mmol)をメタノール(5mL)中に溶解した。これに、少量の10%Pd/C(0.015mg)を添加し、反応容器をH₂ガスでフラッシュした。反応混合物を室温で18時間、H₂雰囲気下で撹拌した。セライトパッドを通して反応混合物を濾過し、このセライトパッドをメタノールで洗浄した。濾液洗浄物を一つにプールし、減圧下で濃縮して、化合物130(0.08g)を得た。LCMS及び¹H NMRは、その構造と一致した。この生成物をさらに精製することなく使用した。質量(m/z)838.3[M+2H]⁺。

10mLの先の尖った丸底フラスコに、化合物130(75.8mg、0.046mmol)、0.37Mピリジン/DMF(200μL)、及び撹拌子を添加した。この溶液に、0.7Mトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル/DMF(100μL)を撹拌しながら滴加した。1時間後に反応が完了したことを、LC MSによって決定した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をCHCl₃(約10mL)中に溶解した。有機層をNaHSO₄(1M、10mL)、飽和NaHCO₃水溶液(10mL)、及びブライン(10mL)にそれぞれ3回分配した。有機相を分離し、Na₂SO₄上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、化合物131(77.7mg)を得た。LCMSは、この構造と一致した。さらに精製することなく使用した。質量(m/z)921.3[M+2H]⁺。

実施例46に例証される一般的手順を用いて、GalNAc₃−5共役基を含むオリゴマー化合物132を調製した。共役基GalNAc₃−5(GalNAc₃−5_a)のGalNAc₃クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。特定の実施形態において、切断可能部分は、−P(=O)(OH)−A_d−P(=O)(OH)−である。

GalNAc₃−5(GalNAc₃−5_a−CM−)の構造は、以下に示される:

実施例50:GalNAc₄−11を含むオリゴヌクレオチド144の調製

化合物134の合成。Merrifieldフラスコに、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、及びアセトニトリルで洗浄したアミノメチルVIMAD樹脂(2.5g、450μmol/g)を添加した。この樹脂は、アセトニトリル(4mL)中で膨潤した。20(1.0mmol、0.747g)、TBTU(1.0mmol、0.321g)、アセトニトリル(5mL)、及びDIEA(3.0mmol、0.5mL)を添加して、化合物133を100mLの丸底フラスコ内で事前に活性化した。この溶液を5分間撹拌させ、その後、振盪しながらMerrifieldフラスコに添加した。懸濁液を3時間振盪させた。反応混合物を排出し、樹脂をアセトニトリル、DMF、及びDCMで洗浄した。DCM中500nm(消光係数=76000)でDMTカチオンの吸光度を測定することにより新たな樹脂負荷量を定量化し、238μmol/gであると決定した。無水酢酸溶液中で10分間3回懸濁することにより、この樹脂をキャップした。

反復Fmocベース固相ペプチド合成法を用いて、固体支持体に結合された化合物141を合成した。少量の固体支持体を回収し、アンモニア水(28〜30重量%)中に6時間懸濁した。切断された化合物をLC−MSによって分析した。観察された質量は、その構造と一致した。質量(m/z)1063.8[M+2H]⁺。

固相ペプチド合成法を用いて、固体支持体に結合された化合物142を合成した。

DNA合成装置において標準の固相合成を用いて、固体支持体に結合された化合物143を合成した。

固体支持体に結合された化合物143をアンモニア水(28−30重量%)中に懸濁し、55℃で16時間加熱した。溶液を冷却し、固体支持体を濾過した。濾液を濃縮し、残渣を水中に溶解し、強アニオン交換カラム上でHPLCによって精製した。全長化合物144を含有する画分を一つにプールし、脱塩した。結果として生じたGalNAc₄−11共役オリゴマー化合物をLC−MSによって分析し、観察された質量は、その構造と一致した。

共役基GalNAc₄−11(GalNAc₄−11_a)のGalNAc₄クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。特定の実施形態において、切断可能部分は、−P(=O)(OH)−A_d−P(=O)(OH)−である。

GalNAc₄−11(GalNAc₄−11_a−CM)の構造は、以下に示される:

実施例51:GalNAc₃−6を含むオリゴヌクレオチド155の調製

文献(Analytical Biochemistry 1995,229,54−60)に記載されるように、化合物146を合成した。

化合物4(15g、45.55mmol)及び化合物35b(14.3グラム、57mmol)をCH₂Cl₂(200mL)中に溶解した。活性化モレキュラーシーブ(4Å、2g、粉末)を添加し、反応物を窒素雰囲気下で30分間撹拌させた。TMS−OTfを添加し(4.1ml22.77mmol)、反応物を室温で一晩撹拌させた。完了した時点で、飽和NaHCO₃水溶液(500mL)及び粉砕した氷(約150g)を注いで反応物を反応停止処理した。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、MgSO₄上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮してオレンジ色の油状物を得た。粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、CH₂Cl₂中の2〜10%MeOHで溶出して、化合物112(16.53g、63%)を得た。LCMS及び¹H NMRは、予想した化合物と一致した。

化合物112(4.27g、7.35mmol)を1:1のMeOH/EtOAc(40mL)中に溶解した。この溶液を通してアルゴン流を15分間バブリングして反応混合物をパージした。パールマン触媒(炭素上の水酸化パラジウム、400mg)を添加し、この溶液を通して水素ガスを30分間バブリングした。完了した時点で(TLC(CH₂Cl₂中の10%MeOH)及びLCMS)、セライトパッドを通して触媒を濾去した。濾液を回転蒸発によって濃縮し、高真空下で短時間乾燥させて、化合物105a(3.28g)を得た。LCMS及び1H NMRは、所望の生成物と一致した。

化合物147(2.31g、11mmol)を無水DMF(100mL)中に溶解した。N,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIEA、3.9mL、22mmol)、続いて、HBTU(4g、10.5mmol)を添加した。反応混合物を窒素下で約15分間撹拌させた。これに、乾燥DMF中の化合物105a(3.3g、7.4mmol)の溶液を添加し、窒素雰囲気下で2時間撹拌した。反応物をEtOAcで希釈し、飽和NaHCO₃水溶液及びブラインで洗浄した。有機相を分離し、乾燥させ(MgSO₄)、濾過し、濃縮してオレンジ色のシロップ状物を得た。粗物質をカラムクロマトグラフィー(CH₂Cl₂中の2〜5%MeOH)によって精製して、化合物148(3.44g、73%)を得た。LCMS及び¹H NMRは、予想した生成物と一致した。

化合物148(3.3g、5.2mmol)を1:1のMeOH/EtOAc(75mL)中に溶解した。この溶液を通してアルゴン流を15分間バブリングして反応混合物をパージした。パールマン触媒(炭素上の水酸化パラジウム)を添加した(350mg)。この溶液を通して水素ガスを30分間バブリングした。完了した時点で(TLC(DCM中の10%MeOH)及びLCMS)、セライトパッドを通して触媒を濾去した。濾液を回転蒸発によって濃縮し、高真空下で短時間乾燥させて、化合物149(2.6g)を得た。LCMSは、所望の生成物と一致した。残渣を乾燥DMF(10mL)中に溶解し、次のステップで即座に使用した。

化合物146(0.68g、1.73mmol)を乾燥DMF(20mL)中に溶解した。これに、DIEA(450μL、2.6mmol、1.5当量)及びHBTU(1.96g、0.5.2mmol)を添加した。反応混合物を室温で15分間、窒素下で撹拌させた。無水DMF(10mL)中の化合物149(2.6g)の溶液を添加した。DIEAを添加することにより(必要に応じて)、反応物のpHをpH=9〜10に調整した。反応物を室温で2時間、窒素下で撹拌させた。完了した時点で、反応物をEtOAc(100mL)で希釈し、飽和NaHCO₃水溶液で洗浄し、続いて、ブラインで洗浄した。有機相を分離し、MgSO₄上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、CH₂Cl₂中の2〜10%MeOHで溶出して、化合物150(0.62g、20%)を得た。LCMS及び¹H NMRは、所望の生成物と一致した。

化合物150(0.62g)を1:1のMeOH/EtOAc(5L)中に溶解した。この溶液を通してアルゴン流を15分間バブリングして反応混合物をパージした。パールマン触媒(炭素上の水酸化パラジウム)を添加した(60mg)。この溶液を通して水素ガスを30分間バブリングした。完了した時点で(TLC(DCM中の10%MeOH)及びLCMS)、触媒を濾去した(シリンジチップTeflonフィルター、0.45μm)。濾液を回転蒸発によって濃縮し、高真空下で短時間乾燥させて、化合物151(0.57g)を得た。LCMSは、所望の生成物と一致した。この生成物を4mLの乾燥DMF中に溶解し、次のステップで即座に使用した。

化合物83a(0.11g、0.33mmol)を無水DMF(5mL)中に溶解し、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(75μL、1mmol)及びPFP−TFA(90μL、0.76mmol)を添加した。接触時に反応混合物は赤紫色になり、その後30分間かけて徐々にオレンジ色になった。TLC及びLCMSによって反応の進行を監視した。完了した時点で(PFPエステルの形成)、化合物151(0.57g、0.33mmol)のDMF溶液を添加した。N,N−ジイソプロピルエチルアミンを添加することにより(必要に応じて)、反応物のpHをpH=9〜10に調整した。反応混合物を窒素下で約30分間撹拌した。完了した時点で、溶媒の大部分を減圧下で除去した。残渣をCH₂Cl₂で希釈し、飽和NaHCO₃水溶液で洗浄し、続いて、ブラインで洗浄した。有機相を分離し、MgSO₄上で乾燥させ、濾過し、濃縮してオレンジ色のシロップ状物を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH₂Cl₂中の2〜10%MeOH)によって精製して、化合物152(0.35g、55%)を得た。LCMS及び¹H NMRは、所望の生成物と一致した。

化合物152(0.35g、0.182mmol)を1:1のMeOH/EtOAc(10mL)中に溶解した。この溶液を通してアルゴン流を15分間バブリングして反応混合物をパージした。パールマン触媒(炭素上の水酸化パラジウム)を添加した(35mg)。この溶液を通して水素ガスを30分間バブリングした。完了した時点で(TLC(DCM中の10%MeOH)及びLCMS)、触媒を濾去した(シリンジチップTeflonフィルター、0.45μm)。濾液を回転蒸発によって濃縮し、高真空下で短時間乾燥させて、化合物153(0.33g、定量的)を得た。LCMSは、所望の生成物と一致した。

化合物153(0.33g、0.18mmol)を窒素下で撹拌しながら無水DMF(5mL)中に溶解した。これに、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(65μL、0.37mmol)及びPFP−TFA(35μL、0.28mmol)を添加した。反応混合物を窒素下で約30分間撹拌した。接触時に反応混合物は赤紫色になり、徐々にオレンジ色になった。さらにN,−ジイソプロピルエチルアミンを添加することにより、反応混合物のpHをpH=9〜10で維持した。TLC及びLCMSによって反応の進行を監視した。完了した時点で、溶媒の大部分を減圧下で除去した。残渣をCH₂Cl₂(50mL)で希釈し、飽和NaHCO₃水溶液で洗浄し、その後、ブラインで洗浄した。有機層をMgSO₄上で乾燥させ、濾過し、濃縮してオレンジ色のシロップ状物を得た。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製し、CH₂Cl₂中の2〜10%MeOHで溶出して、化合物154(0.29g、79%)を得た。LCMS及び¹H NMRは、所望の生成物と一致した。

実施例46に例証される一般的手順を用いて、GalNAc₃−6共役基を含むオリゴマー化合物155を調製した。共役基GalNAc₃−6(GalNAc₃−6_a)のGalNAc₃クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。特定の実施形態において、切断可能部分は、−P(=O)(OH)−A_d−P(=O)(OH)−である。

GalNAc₃−6(GalNAc₃−6_a−CM−)の構造は、以下に示される:

実施例52:GalNAc₃−9を含むオリゴヌクレオチド160の調製

文献(J.Med.Chem.2004,47,5798−5808)に記載される手順に従って化合物156を合成した。

化合物156(18.60g、29.28mmol)をメタノール(200mL)中に溶解した。パラジウム炭素(6.15g、10重量%、負荷量(乾燥ベース)、マトリックス炭素粉末、湿式)を添加した。反応混合物を室温で18時間、水素下で撹拌した。セライトパッドを通して反応混合物を濾過し、このセライトパッドをメタノールで完全に洗浄した。合わせた濾液を洗浄し、濃縮乾固させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の5〜10%メタノールで溶出して、化合物157(14.26g、89%)を得た。質量(m/z)544.1[M−H]⁻。

化合物157(5g、9.17mmol)を無水DMF(30mL)中に溶解した。HBTU(3.65g、9.61mmol)及びN,N−ジイソプロピルエチルアミン(13.73mL、78.81mmol)を添加し、反応混合物を室温で5分間撹拌した。これに、化合物47(2.96g、7.04mmol)の溶液を添加した。反応物を室温で8時間撹拌した。反応混合物を飽和NaHCO₃水溶液に注いだ。この混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ(Na₂SO₄)、濾過し、蒸発させた。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ヘキサン中の50%酢酸エチルで溶出して、化合物158(8.25g、73.3%)を得た。この構造を、MS及び¹H NMR分析によって確認した。

化合物158(7.2g、7.61mmol)を減圧下でP₂O₅上で乾燥させた。乾燥させた化合物を無水DMF(50mL)中に溶解した。これに、1H−テトラゾール(0.43g、6.09mmol)及びN−メチルイミダゾール(0.3mL、3.81mmol)及び2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(3.65mL、11.50mmol)を添加した。反応混合物をアルゴン雰囲気下で4時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル(200mL)で希釈した。反応混合物を飽和NaHCO₃及びブラインで洗浄した。有機相を分離し、乾燥させ(Na₂SO₄)、濾過し、蒸発させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ヘキサン中の50〜90%酢酸エチルで溶出して、化合物159(7.82g、80.5%)を得た。この構造を、LCMS及び³¹P NMR分析によって確認した。

標準のオリゴヌクレオチド合成手順を用いて、GalNAc₃−9共役基を含むオリゴマー化合物160を調製した。3単位の化合物159を固体支持体に、続いてヌクレオチドホスホラミダイトにカップリングした。保護されたオリゴマー化合物をアンモニア水で処理して、化合物160を得た。共役基GalNAc₃−9(GalNAc₃−9_a)のGalNAc₃クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。特定の実施形態において、切断可能部分は、−P(=O)(OH)−A_d−P(=O)(OH)−である。GalNAc₃−9(GalNAc₃−9_a−CM)の構造は、以下に示される:

実施例53:化合物18(GalNAc₃−1a及びGalNAc₃−3a)の調製のための代替手順

ラクトン161をジアミノプロパン(3〜5当量)またはモノBoc保護ジアミノプロパン(1当量)と反応させて、アルコール162aまたは162bを得た。非保護プロパンジアミンを上述の反応で用いた場合、過剰なジアミンを高真空下で蒸発させて除去し、CbzClを用いて162a中の遊離アミノ基を保護して、カラムクロマトグラフィーによって精製した後に、白色の固体として162bを得た。アルコール162bをTMSOTfの存在下で化合物4とさらに反応させ163aを得て、触媒水素化を用いてCbz基を除去することにより、これを163bに変換した。ペンタフルオロフェニル(PFP)エステル164を、三酸113(実施例48を参照のこと)をDMF(0.1〜0.5M)中のPFPTFA(3.5当量)及びピリジン(3.5当量)と接触させることによって調製した。トリエステル164をアミン163b(3〜4当量)及びDIPEA(3〜4当量)と直接反応させて、化合物18を得た。上述の方法は、中間体精製を大幅に促進し、実施例4に記載される手順を用いて形成される副生成物の形成を最小限に抑える。 実施例54:化合物18(GalNAc₃−1a及びGalNAc₃−3a)の調製のための代替手順

先の実施例53に概説される手順を用いて酸113からトリPFPエステル164を調製し、モノBoc保護ジアミンと反応させて、本質的に定量的な収率で165を得た。Boc基を塩酸またはトリフルオロ酢酸で除去して、トリアミンを得て、これをDIPEAなどの好適な塩基の存在下でPFP活性化酸166と反応させて、化合物18を得た。

DMF中のPFPTFA(1〜1.2当量)及びピリジン(1〜1.2当量)で処理することにより、PFP保護Gal−NAc酸166を対応する酸から調製した。次いで、アセトニトリル及び水中のTEMPO(0.2当量)及びBAIBを用いて酸化することにより、前駆酸を対応するアルコールから調製した。先の実施例47に記載される条件を用いて1,6−ヘキサンジオール(または1,5−ペンタンジオールもしくは他のn値の他のジオール)(2〜4当量)及びTMSOTfと反応させることにより、前駆アルコールを糖中間体4から調製した。 実施例55:生体内におけるSRB−1を標的とする3’−共役基または5’−共役基のいずれかを含むオリゴヌクレオチド(GalNAc₃−1、3、8、及び9の比較)の用量依存的試験

以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるSRB−1のアンチセンス阻害について試験した。非共役ISIS 353382を標準物として含めた。さまざまなGalNAc₃共役基のそれぞれは、ホスホジエステル連結2’−デオキシアデノシンヌクレオシド(切断可能部分)によってそれぞれのオリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端のいずれかで結合された。

大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^mCは、5−メチルシトシンを示す。下付き文字「e」は、2’−MOE修飾ヌクレオシドを示し、「d」は、β−D−2’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「s」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部(PS)を示し、「o」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部(PO)を示し、「o’」は、−O−P(=O)(OH)−を示す。共役基は、太字で表示されている。

GalNAc₃−1_aの構造は、先の実施例9に示される。GalNAc₃−9の構造は、先の実施例52に示される。GalNAc₃−3の構造は、先の実施例39に示される。GalNAc₃−8の構造は、先の実施例47に示される。 処理

6週齢の雄Balb/cマウス(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)に、ISIS 353382、655861、664078、661161、665001、または生理食塩水を、以下に示される投与量で1回、皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。最終投与の72時間後にマウスを屠殺して、リアルタイムPCR及びRIBOGREEN(登録商標)RNA定量化試薬(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を用いて、肝臓におけるSRB−1 mRNAレベルを標準プロトコルに従って決定した。以下の結果は、生理食塩水(対照)に対して標準化された各処理群のSRB−1 mRNAレベルの平均パーセントとして提示される。

表40に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でSRB−1 mRNAレベルを低下させた。実際には、3’末端にホスホジエステル連結GalNAc₃−1及びGalNAc₃−9共役体(ISIS 655861及びISIS 664078)ならびに5’末端に連結されたGalNAc₃−3及びGalNAc₃−8共役体(ISIS 661161及びISIS 665001)を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド(ISIS 353382)と比較して、力価の大幅な改善を示した。さらに、3’末端にGalNAc₃−9共役体を含むISIS 664078は、3’末端にGalNAc₃−1共役体を含むISIS 655861と比較して、本質的に等効力であった。それぞれ、GalNAc₃−3またはGalNAc₃−9を含む5’共役アンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 661161及びISIS 665001は、3’共役アンチセンスオリゴヌクレオチド(ISIS 655861及びISIS 664078)と比較して、力価を増加させた。

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスとの比較で相対的に測定した。総ビリルビン及びBUNも評価した。体重の変化を評価したが、生理食塩水群との有意な変化は見られなかった。ALT、AST、総ビリルビン、及びBUN値が、以下の表に示される。

実施例56:生体内におけるSRB−1を標的とする3’−共役基または5’−共役基のいずれかを含むオリゴヌクレオチドの用量依存的試験(GalNAc₃−1、2、3、5、6、7、及び10の比較)

以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるSRB−1のアンチセンス阻害について試験した。非共役ISIS 353382を標準物として含めた。3’末端にGalNAc₃共役基を結合させたISIS 655861を除いて、さまざまなGalNAc₃共役基のそれぞれは、ホスホジエステル連結2’−デオキシアデノシンヌクレオシド(切断可能部分)によってそれぞれのオリゴヌクレオチドの5’末端に取り付けられた。

大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^mCは、5−メチルシトシンを示す。下付き文字「e」は、2’−MOE修飾ヌクレオシドを示し、「d」は、β−D−2’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「s」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部(PS)を示し、「o」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部(PO)を示し、「o’」は、−O−P(=O)(OH)−を示す。共役基は、太字で表示されている。

GalNAc₃−1_aの構造は、先の実施例9に示される。GalNAc₃−2_aの構造は、先の実施例37に示される。GalNAc₃−3_aの構造は、先の実施例39に示される。GalNAc₃−5_aの構造は、先の実施例49に示される。GalNAc₃−6_aの構造は、先の実施例51に示される。GalNAc₃−7_aの構造は、先の実施例48に示される。GalNAc₃−10_aの構造は、先の実施例46に示される。 処理

6週齢の雄Balb/cマウス(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)に、ISIS 353382、655861、664507、661161、666224、666961、666981、666881、または生理食塩水を、以下に示される投与量で1回皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。最終投与の72時間後にマウスを屠殺して、リアルタイムPCR及びRIBOGREEN(登録商標)RNA定量化試薬(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を用いて、肝臓におけるSRB−1 mRNAレベルを決定した。以下の結果は、生理食塩水(対照)に対して標準化された各処理群のSRB−1 mRNAレベルの平均パーセントとして提示される。

表43に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でSRB−1 mRNAレベルを低下させた。実際には、共役アンチセンスオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド(ISIS 353382)と比較して、力価の大幅な改善を示した。5’共役アンチセンスオリゴヌクレオチドは、3’共役アンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して、力価のわずかな増加を示した。

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスとの比較で相対的に測定した。総ビリルビン及びBUNも評価した。体重の変化を評価したが、生理食塩水群との有意な変化は見られなかった。ALT、AST、総ビリルビン、及びBUN値が、以下の表44に示される。

実施例57:生体内におけるApoC IIIを標的とする3’−共役基を含むオリゴヌクレオチドの作用持続時間試験

マウスに以下に示される用量を1回注入し、ApoC−III及び血漿トリグリセリド(血漿TG)レベルを42日間にわたって監視した。各群におけるヒトAPOC−IIIを発現する3匹のトランスジェニックマウスを用いて、この試験を実行した。

大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^mCは、5−メチルシトシンを示す。下付き文字「e」は、2’−MOE修飾ヌクレオシドを示し、「d」は、β−D−2’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「s」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部(PS)を示し、「o」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部(PO)を示し、「o’」は、−O−P(=O)(OH)−を示す。共役基は、太字で表示されている。

GalNAc₃−1_aの構造は、先の実施例9に示される。

上の表に見られるように、作用持続時間は、非共役オリゴヌクレオチドと比較して、3’−共役基の付加によって増加した。共役完全PSオリゴヌクレオチド647535と比較して、共役混成PO/PSオリゴヌクレオチド647536の作用持続時間がさらに増加した。 実施例58:生体内におけるSRB−1を標的とする3’−共役基を含むオリゴヌクレオチドの用量依存的試験(GalNAc₃−1及びGalNAc₄−11の比較)

以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるSRB−1のアンチセンス阻害について試験した。非共役ISIS 440762を非共役標準物として含めた。共役基のそれぞれは、ホスホジエステル連結2’−デオキシアデノシンヌクレオシド(切断可能部分)によってそれぞれのオリゴヌクレオチドの3’末端に取り付けられた。

GalNAc₃−1_aの構造は、先の実施例9に示される。GalNAc₃−11_aの構造は、先の実施例50に示される。 処理

6週齢の雄Balb/cマウス(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)に、ISIS 440762、651900、663748、または生理食塩水を、以下に示される投与量で1回、皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。最終投与の72時間後にマウスを屠殺して、リアルタイムPCR及びRIBOGREEN(登録商標)RNA定量化試薬(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を用いて、肝臓におけるSRB−1 mRNAレベルを決定した。以下の結果は、生理食塩水(対照)に対して標準化された各処理群のSRB−1 mRNAレベルの平均パーセントとして提示される。

表47に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でSRB−1 mRNAレベルを低下させた。3’末端にホスホジエステル連結GalNAc₃−1及びGalNAc₄−11共役体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド(ISIS 651900及びISIS 663748)は、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド(ISIS 440762)と比較して、力価の大幅な増加を示した。2つの共役オリゴヌクレオチド、すなわちGalNAc₃−1とGalNAc₄−11は、等効力であった。

大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^mCは、5−メチルシトシンを示す。下付き文字「e」は、2’−MOE修飾ヌクレオシドを示し、「k」は、6’−(S)−CH₃二環式ヌクレオシドを示し、「d」は、β−D−2’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「s」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部(PS)を示し、「o」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部(PO)を示し、「o’」は、−O−P(=O)(OH)−を示す。共役基は、太字で表示されている。

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスとの比較で相対的に測定した。総ビリルビン及びBUNも評価した。体重の変化を評価したが、生理食塩水群との有意な変化は見られなかった。ALT、AST、総ビリルビン、及びBUN値が、以下の表48に示される。

実施例59:生体内におけるFXIを標的とするGalNAc₃−1共役ASOの影響

以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、複数回投与試験においてマウスにおけるFXIのアンチセンス阻害について試験した。ISIS 404071を非共役標準物として含めた。共役基のそれぞれは、ホスホジエステル連結2’−デオキシアデノシンヌクレオシドの切断可能部分によってそれぞれのオリゴヌクレオチドの3’末端に取り付けられた。

大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^mCは、5−メチルシトシンを示す。下付き文字「e」は、2’−MOE修飾ヌクレオシドを示し、「d」は、β−D−2’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「s」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部(PS)を示し、「o」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部(PO)を示し、「o’」は、−O−P(=O)(OH)−を示す。共役基は、太字で表示されている。

GalNAc₃−1_aの構造は、先の実施例9に示される。 処理

6週齢の雄Balb/cマウス(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)に、ISIS 404071、656172、656173、またはPBS処理対照を、以下に示される投与量で週2回3週間、皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。最終投与の72時間後にマウスを屠殺して、リアルタイムPCR及びRIBOGREEN(登録商標)RNA定量化試薬(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を用いて、肝臓におけるSRB−1 mRNAレベルを決定した。ELISAを用いて血漿FXIタンパク質レベルも測定した。PBS処理対照に対して標準化する前に(RIBOGREEN(登録商標)を用いて)FXI mRNAレベルを全RNAとの比較で相対的に決定した。以下の結果は、各処理群のFXI mRNAレベルの平均パーセントとして提示される。データをPBS処理対照に対して標準化し、「%PBS」で表示する。前記方法と同様の方法を用いてED₅₀を測定し、以下に提示する。

表50に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でFXI mRNAレベルを低下させた。3’−GalNAc₃−1共役基を含むオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド(ISIS 404071)と比較して、力価の大幅な増加を示した。これら2つの共役オリゴヌクレオチドの間では、PS連結部のうちのいくつかをPO(ISIS 656173)と置き換えることによって、力価がさらに増加した。

表50aに例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でFXIタンパク質レベルを低下させた。3’−GalNAc₃−1共役基を含むオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド(ISIS 404071)と比較して、力価の大幅な増加を示した。これら2つの共役オリゴヌクレオチドの間では、PS連結部のうちのいくつかをPO(ISIS 656173)と置き換えることによって、力価がさらに増加した。

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスとの比較で相対的に測定した。総ビリルビン、総アルブミン、CRE、及びBUNも評価した。体重の変化を評価したが、生理食塩水群との有意な変化は見られなかった。ALT、AST、総ビリルビン、及びBUN値が、以下の表に示される。

実施例60:生体外におけるSRB−1を標的とする共役ASOの影響

以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、複数回投与試験において初代マウス肝細胞におけるSRB−1のアンチセンス阻害について試験した。ISIS 353382を非共役標準物として含めた。共役基のそれぞれは、ホスホジエステル連結2’−デオキシアデノシンヌクレオシドの切断可能部分によってそれぞれのオリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端に取り付けられた。

大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^mCは、5−メチルシトシンを示す。下付き文字「e」は、2’−MOE修飾ヌクレオシドを示し、「d」は、β−D−2’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「s」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部(PS)を示し、「o」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部(PO)を示し、「o’」は、−O−P(=O)(OH)−を示す。共役基は、太字で表示されている。

GalNAc₃−1_aの構造は、先の実施例9に示される。GalNAc₃−3aの構造は、先の実施例39に示される。GalNAc₃−8aの構造は、先の実施例47に示される。GalNAc₃−9aの構造は、先の実施例52に示される。GalNAc₃−6aの構造は、先の実施例51に示される。GalNAc₃−2aの構造は、先の実施例37に示される。GalNAc₃−10aの構造は、先の実施例46に示される。GalNAc₃−5aの構造は、先の実施例49に示される。GalNAc₃−7aの構造は、先の実施例48に示される。 処理

上に列記されるオリゴヌクレオチドを、25,000細胞/ウェルの密度でプレーティングし、かつ0.03、0.08、0.24、0.74、2.22、6.67、または20nMの修飾オリゴヌクレオチドで処理した初代マウス肝細胞において生体外で試験した。約16時間の処理期間後、RNAを細胞から単離し、mRNAレベルを定量的リアルタイムPCRによって測定し、RIBOGREEN(登録商標)によって測定された総RNA含有量に従ってSRB−1 mRNAレベルを調整した。

標準的方法を用いてIC₅₀を計算し、結果を表53に提示する。結果は、オリゴヌクレオチドの細胞への進入を人工的に促進するために試薬も電気穿孔技法も用いない自由取り込み条件下で、GalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチドは、GalNAc共役体を含まない親オリゴヌクレオチド(ISIS 353382)よりも肝細胞において著しく強力であったことを示す。

^a複数回の実行の平均。 実施例61:GalNAc₃−12を含むオリゴマー化合物175の調製

化合物169は、市販のものである。ベンジル(ペルフルオロフェニル)グルタレートを化合物171に添加することによって化合物172を調製した。PFP−TFA及びDIEAをDMF中の5−(ベンジルオキシ)−5−オキソペンタン酸に添加することによって、ベンジル(ペルフルオロフェニル)グルタレートを調製した。実施例46に例証される一般的手順を用いて、GalNAc₃−12共役基を含むオリゴマー化合物175を化合物174から調製した。共役基GalNAc₃−12(GalNAc₃−12_a)のGalNAc₃クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。特定の実施形態において、切断可能部分は、−P(=O)(OH)−A_d−P(=O)(OH)−である。GalNAc₃−12(GalNAc₃−12_a−CM−)の構造は、以下に示される:

実施例62:GalNAc₃−13を含むオリゴマー化合物180の調製

実施例2に示される一般的手順を用いて、化合物176を調製した。実施例49に例証される一般的手順を用いて、GalNAc₃−13共役基を含むオリゴマー化合物180を化合物177から調製した。共役基GalNAc₃−13(GalNAc₃−13_a)のGalNAc₃クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。特定の実施形態において、切断可能部分は、−P(=O)(OH)−A_d−P(=O)(OH)−である。GalNAc₃−13(GalNAc₃−13_a−CM−)の構造は、以下に示される:

実施例63:GalNAc₃−14を含むオリゴマー化合物188の調製

化合物181及び185は、市販のものである。実施例46に例証される一般的手順を用いて、GalNAc₃−14共役基を含むオリゴマー化合物188を化合物187から調製した。共役基GalNAc₃−14(GalNAc₃−14_a)のGalNAc₃クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。特定の実施形態において、切断可能部分は、−P(=O)(OH)−A_d−P(=O)(OH)−である。GalNAc₃−14(GalNAc₃−14_a−CM−)の構造は、以下に示される:

実施例64:GalNAc₃−15を含むオリゴマー化合物197の調製

化合物189は、市販のものである。実施例31に示される一般的手順を用いて、化合物195を調製した。標準のオリゴヌクレオチド合成手順を用いて、GalNAc₃−15共役基を含むオリゴマー化合物197を化合物194及び195から調製した。共役基GalNAc₃−15(GalNAc₃−15_a)のGalNAc₃クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。特定の実施形態において、切断可能部分は、−P(=O)(OH)−A_d−P(=O)(OH)−である。GalNAc₃−15(GalNAc₃−15_a−CM−)の構造は、以下に示される:

実施例65:生体内におけるSRB−1を標的とする5’−共役基を含むオリゴヌクレオチドの用量依存的試験(GalNAc₃−3、12、13、14、及び15の比較)

以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるSRB−1のアンチセンス阻害について試験した。非共役ISIS 353382を標準物として含めた。GalNAc₃共役基のそれぞれは、ホスホジエステル連結2’−デオキシアデノシンヌクレオシド(切断可能部分)によってそれぞれのオリゴヌクレオチドの5’末端に取り付けられた。

大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^mCは、5−メチルシトシンを示す。下付き文字「e」は、2’−MOE修飾ヌクレオシドを示し、「d」は、β−D−2’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「s」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部(PS)を示し、「o」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部(PO)を示し、「o’」は、−O−P(=O)(OH)−を示す。共役基は、太字で表示されている。

GalNAc₃−3_aの構造は、先の実施例39に示される。GalNAc₃−12aの構造は、先の実施例61に示される。GalNAc₃−13aの構造は、先の実施例62に示される。GalNAc₃−14aの構造は、先の実施例63に示される。GalNAc₃−15aの構造は、先の実施例64に示される。 処理

6〜8週齢のC57bl6マウス(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)に、ISIS 353382、661161、671144、670061、671261、671262、または生理食塩水を、以下に示される投与量で1回または2回、皮下注入した。2回投与されたマウスは、第1の投与の3日後に第2の投与を受けた。各処理群は、4匹の動物からなった。最終投与の72時間後にマウスを屠殺して、リアルタイムPCR及びRIBOGREEN(登録商標)RNA定量化試薬(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を用いて、肝臓におけるSRB−1 mRNAレベルを標準プロトコルに従って決定した。以下の結果は、生理食塩水(対照)に対して標準化された各処理群のSRB−1 mRNAレベルの平均パーセントとして提示される。

表55に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でSRB−1 mRNAレベルを低下させた。単回用量を受けた動物と2回の用量を受けた動物との間で標的ノックダウンの著しい差は観察されなかった(ISIS 353382の投与量30及び2×15mg/kg、ならびにISIS 661161の投与量5及び2×2.5mg/kgを参照のこと)。ホスホジエステル連結GalNAc₃−3、12、13、14、及び15共役体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド(ISIS 335382)と比較して、力価の大幅な増加を示した。

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスとの比較で相対的に測定した。総ビリルビン及びBUNも評価した。体重の変化を評価したが、生理食塩水群との有意な差は見られなかった(データ示されず)。ALT、AST、総ビリルビン、及びBUN値が、以下の表56に示される。

実施例66:5’−GalNAc₃クラスターを含むSRB−1を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害へのさまざまな切断可能部分の影響

以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるSRB−1のアンチセンス阻害について試験した。GalNAc₃共役基のそれぞれは、ホスホジエステル連結ヌクレオシド(切断可能部分(CM))によってそれぞれのオリゴヌクレオチドの5’末端に取り付けられた。

大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^mCは、5−メチルシトシンを示す。下付き文字「e」は、2’−MOE修飾ヌクレオシドを示し、「d」は、β−D−2’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「s」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部(PS)を示し、「o」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部(PO)を示し、「o’」は、−O−P(=O)(OH)−を示す。共役基は、太字で表示されている。

GalNAc₃−3_aの構造は、先の実施例39に示した。GalNAc₃−13aの構造は、先の実施例62に示した。 処理

6〜8週齢のC57bl6マウス(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)に、ISIS 661161、670699、670700、670701、671165、または生理食塩水を、以下に示される投与量で1回、皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。最終投与の72時間後にマウスを屠殺して、リアルタイムPCR及びRIBOGREEN(登録商標)RNA定量化試薬(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を用いて、肝臓におけるSRB−1 mRNAレベルを決定した。以下の結果は、生理食塩水(対照)に対して標準化された各処理群のSRB−1 mRNAレベルの平均パーセントとして提示される。

表58に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でSRB−1 mRNAレベルを低下させた。さまざまな切断可能部分を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドはすべて、同様の力価を示した。

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスとの比較で相対的に測定した。総ビリルビン及びBUNも評価した。体重の変化を評価したが、生理食塩水群との有意な差は見られなかった(データ示されず)。ALT、AST、総ビリルビン、及びBUN値が、以下の表56に示される。

実施例67:GalNAc₃−16を含むオリゴマー化合物199の調製

実施例7及び9に例証される一般的手順を用いて、GalNAc₃−16共役基を含むオリゴマー化合物199を調製する。共役基GalNAc₃−16(GalNAc₃−16_a)のGalNAc₃クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。特定の実施形態において、切断可能部分は、−P(=O)(OH)−A_d−P(=O)(OH)−である。GalNAc₃−16(GalNAc₃−16_a−CM−)の構造は、以下に示される:

実施例68:GalNAc₃−17を含むオリゴマー化合物200の調製

実施例46に例証される一般的手順を用いて、GalNAc₃−17共役基を含むオリゴマー化合物200を調製した。共役基GalNAc₃−17(GalNAc₃−17_a)のGalNAc₃クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。特定の実施形態において、切断可能部分は、−P(=O)(OH)−A_d−P(=O)(OH)−である。GalNAc₃−17(GalNAc₃−17_a−CM−)の構造は、以下に示される:

実施例69:GalNAc₃−18を含むオリゴマー化合物201の調製

実施例46に例証される一般的手順を用いて、GalNAc₃−18共役基を含むオリゴマー化合物201を調製した。共役基GalNAc₃−18(GalNAc₃−18_a)のGalNAc₃クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。特定の実施形態において、切断可能部分は、−P(=O)(OH)−A_d−P(=O)(OH)−である。GalNAc₃−18(GalNAc₃−18_a−CM−)の構造は、以下に示される:

実施例70:GalNAc₃−19を含むオリゴマー化合物204の調製

実施例52に例証される一般的手順を用いて、GalNAc₃−19共役基を含むオリゴマー化合物204を化合物64から調製した。共役基GalNAc₃−19(GalNAc₃−19_a)のGalNAc₃クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。特定の実施形態において、切断可能部分は、−P(=O)(OH)−A_d−P(=O)(OH)−である。GalNAc₃−19(GalNAc₃−19_a−CM−)の構造は、以下に示される:

実施例71:GalNAc₃−20を含むオリゴマー化合物210の調製

PFP−TFA及びDIEAを、トリフリン酸無水物を6−アミノヘキサン酸に添加することによって調製したアセトニトリル中の6−(2,2,2−トリフルオロアセトアミド)ヘキサン酸に添加することによって、化合物205を調製した。反応混合物を80℃に加熱し、その後、室温まで下げた。実施例52に例証される一般的手順を用いて、GalNAc₃−20共役基を含むオリゴマー化合物210を化合物208から調製した。共役基GalNAc₃−20(GalNAc₃−20_a)のGalNAc₃クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。特定の実施形態において、切断可能部分は、−P(=O)(OH)−A_d−P(=O)(OH)−である。GalNAc₃−20(GalNAc₃−20_a−CM−)の構造は、以下に示される:

実施例72:GalNAc₃−21を含むオリゴマー化合物215の調製

化合物211は、市販のものである。実施例52に例証される一般的手順を用いて、GalNAc₃−21共役基を含むオリゴマー化合物215を化合物213から調製した。共役基GalNAc₃−21(GalNAc₃−21_a)のGalNAc₃クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。特定の実施形態において、切断可能部分は、−P(=O)(OH)−A_d−P(=O)(OH)−である。GalNAc₃−21(GalNAc₃−21_a−CM−)の構造は、以下に示される:

実施例73:GalNAc₃−22を含むオリゴマー化合物221の調製

ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリドを用いて、化合物220を化合物219から調製した。実施例52に例証される一般的手順を用いて、GalNAc₃−21共役基を含むオリゴマー化合物221を化合物220から調製する。共役基GalNAc₃−22(GalNAc₃−22_a)のGalNAc₃クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。特定の実施形態において、切断可能部分は、−P(=O)(OH)−A_d−P(=O)(OH)−である。GalNAc₃−22(GalNAc₃−22_a−CM−)の構造は、以下に示される:

実施例74:5’−GalNAc₃共役体を含むSRB−1を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害へのさまざまな切断可能部分の影響

以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるSRB−1のアンチセンス阻害について試験した。GalNAc₃共役基のそれぞれは、それぞれのオリゴヌクレオチドの5’末端に取り付けられた。

すべての表において、大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^mCは、5−メチルシトシンを示す。下付き文字「e」は、2’−MOE修飾ヌクレオシドを示し、「d」は、β−D−2’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「s」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部(PS)を示し、「o」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部(PO)を示し、「o’」は、−O−P(=O)(OH)−を示す。共役基は、太字で表示されている。

GalNAc₃−3_aの構造は、先の実施例39に示した。GalNAc₃−17aの構造は、先の実施例68に示し、GalNAc₃−18aの構造は、実施例69に示した。 処理

6〜8週齢のC57BL/6マウス(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)に、表60に列記されるオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水を、以下に示される投与量で1回、皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。最終投与の72時間後にマウスを屠殺して、リアルタイムPCR及びRIBOGREEN(登録商標)RNA定量化試薬(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を用いて、肝臓におけるSRB−1 mRNAレベルを決定した。以下の結果は、生理食塩水(対照)に対して標準化された各処理群のSRB−1 mRNAレベルの平均パーセントとして提示される。

表61に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でSRB−1 mRNAレベルを低下させた。GalNAc共役体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、同様の力価を示し、GalNAc共役体を欠く親オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であった。

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスとの比較で相対的に測定した。総ビリルビン及びBUNも評価した。体重の変化を評価したが、生理食塩水群との有意な変化は見られなかった(データ示されず)。ALT、AST、総ビリルビン、及びBUN値が、以下の表62に示される。

実施例75:5’−共役基を含むオリゴヌクレオチドの薬物動態分析

実施例65、66、及び74に記載される処理手順に従って得た肝臓試料を用いて、上の表54、57、及び60におけるASOのPKを評価した。肝臓試料を切り刻み、標準のプロトコルを用いて抽出し、内部標準とともにIP−HPLC−MSによって分析した。適切なUVピークを統合することによってすべての代謝物の合わせた組織レベル(μg/g)を測定し、適切な抽出イオンクロマトグラム(EIC)を用いて、共役体を欠く全長ASO(この場合、ISIS番号353382の「親」)の組織レベルを測定した。

上の表63における結果は、特にGalNAc₃共役基を有するオリゴヌクレオチドとGalNAc₃共役基を有しないオリゴヌクレオチドとの間の投薬の違いを考慮に入れた場合、オリゴヌクレオチド投与の72時間後に、GalNAc₃共役基を含むオリゴヌクレオチドの肝臓組織レベルが、GalNAc₃共役基を含まない親オリゴヌクレオチド(ISIS 353382)の肝臓組織レベルよりも高かったことを示す。さらに、72時間までに、GalNAc₃共役基を含む各オリゴヌクレオチドの40〜98%が親化合物に代謝され、GalNAc₃共役基がオリゴヌクレオチドから切断されたことを示す。 実施例76:GalNAc₃−23を含むオリゴマー化合物230の調製

化合物222は、市販のものである。44.48mL(0.33mol)の化合物222をピリジン(500mL)中の塩化トシル(25.39g、0.13mol)で16時間処理した。その後、反応物を蒸発させて油状物とし、EtOAc中に溶解し、水、飽和NaHCO₃、ブラインで洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥させた。酢酸エチルを濃縮乾固させ、カラムクロマトグラフィーによって精製し、EtOAc/ヘキサン(1:1)、続いて、CH₂Cl₂中の10%メタノールで溶出して、無色の油状物として化合物223を得た。LCMS及びNMRは、その構造と一致した。10g(32.86mmol)の1−トシルトリエチレングリコール(化合物223)を、DMSO(100mL)中のアジ化ナトリウム(10.68g、164.28mmol)で、室温で17時間処理した。その後、反応混合物を水上に注ぎ、EtOAcで抽出した。有機層を水で3回洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥させた。有機層を濃縮乾固させて、5.3gの化合物224(92%)を得た。LCMS及びNMRは、その構造と一致した。1−アジドトリエチレングリコール(化合物224、5.53g、23.69mmol)及び化合物4(6g、18.22mmol)を、4Aモレキュラーシーブ(5g)及びジクロロメタン(100mL)中のTMSOTf(1.65mL、9.11mmol)で、不活性雰囲気下で処理した。14時間後、反応物を濾過して前記モレキュラーシーブを除去し、有機層を飽和NaHCO₃、水、ブラインで洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥させた。有機層を濃縮乾固させ、カラムクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の2〜4%メタノールの勾配で溶出して、化合物225を得た。LCMS及びNMRは、その構造と一致した。化合物225(11.9g、23.59mmol)をパールマン触媒上で、EtOAc/メタノール(4:1、250mL)中で水素化した。8時間後、触媒を濾去し、溶媒を除去乾固して、化合物226を得た。LCMS及びNMRは、その構造と一致した。

化合物227を生成するために、DMF(100mL)中のニトロメタントリスプロピオン酸(4.17g、15.04mmol)及びヒューニッヒ塩基(10.3mL、60.17mmol)の溶液をペンタフルオロトリフルオロアセテート(9.05mL、52.65mmol)で液滴処理した。30分間後、反応物を氷水上に注ぎ、EtOAcで抽出した。有機層を水、ブラインで洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥させた。有機層を濃縮乾固させ、その後、ヘプタンから再結晶化して、白色の固体として化合物227を得た。LCMS及びNMRは、その構造と一致した。化合物227(1.5g、1.93mmol)及び化合物226(3.7g、7.74mmol)をアセトニトリル(15mL)中で、室温で2時間撹拌した。その後、反応物を蒸発乾固し、カラムクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の2〜10%メタノールの勾配で溶出して、化合物228を得た。LCMS及びNMRは、その構造と一致した。化合物228(1.7g、1.02mmol)をエタノール(100mL)中のラネーニッケル(約2g、湿性)で、水素雰囲気下で処理した。12時間後、触媒を濾去し、有機層を蒸発させて固体にし、これを次のステップで直接使用した。LCMS及びNMRは、その構造と一致した。この固体(0.87g、0.53mmol)をDMF(5mL)中のベンジルグルタル酸(0.18g、0.8mmol)、HBTU(0.3g、0.8mmol)、及びDIEA(273.7μL、1.6mmol)で処理した。16時間後、DMFを減圧下で65℃で除去して油状物とし、この油状物をジクロロメタン中に溶解した。有機層を飽和NaHCO₃、ブラインで洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥させた。有機層を蒸発させた後、化合物をカラムクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の2〜20%メタノールの勾配で溶出して、カップリング生成物を得た。LCMS及びNMRは、その構造と一致した。ベンジルエステルをパールマン触媒で、水素雰囲気下で1時間脱保護した。その後、この触媒を濾去し、溶媒を除去乾固して、酸を得た。LCMS及びNMRは、その構造と一致した。酸(486mg、0.27mmol)を乾燥DMF(3mL)中に溶解した。ピリジン(53.61μL、0.66mmol)を添加し、反応物をアルゴンでパージした。ペンタフルオロトリフルオロアセテート(46.39μL、0.4mmol)を反応混合物に緩徐に添加した。反応物の色が淡黄色からワイン色に変化し、少しの煙を発し、この煙をアルゴン流で吹き飛ばした。反応物を室温で1時間撹拌させた(反応の完了をLCMSによって確認した)。この溶媒を減圧下(回転蒸発)で70℃で除去した。残渣をDCMで希釈し、1N NaHSO₄、ブライン、飽和重炭酸ナトリウム、及び再度ブラインで洗浄した。有機物をNa₂SO₄上で乾燥させ、濾過し、濃縮乾固させて、黄色の脆い泡状物として225mgの化合物229を得た。LCMS及びNMRは、その構造と一致した。

実施例46に例証される一般的手順を用いて、GalNAc₃−23共役基を含むオリゴマー化合物230を化合物229から調製した。GalNAc₃−23共役基(GalNAc₃−23_a)のGalNAc₃クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。GalNAc₃−23(GalNAc₃−23_a−CM)の構造は、以下に示される:

実施例77:GalNAc₃共役体を含むSRB−1を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるSRB−1のアンチセンス阻害について試験した。

GalNAc₃−1_aの構造は、先の実施例9に示され、GalNAc₃−3_aは、実施例39に示され、GalNAc₃−9aは、実施例52に示され、GalNAc₃−10aは、実施例46に示され、GalNAc₃−19_aは、実施例70に示され、GalNAc₃−20_aは、実施例71に示され、GalNAc₃−23_aは、実施例76に示される。 処理

6〜8週齢のC57BL/6マウス(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)のそれぞれに、表64に列記されるオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水を、以下に示される投与量で1回、皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。最終投与の72時間後にマウスを屠殺して、リアルタイムPCR及びRIBOGREEN(登録商標)RNA定量化試薬(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を用いて、肝臓におけるSRB−1 mRNAレベルを決定した。以下の結果は、生理食塩水(対照)に対して標準化された各処理群のSRB−1 mRNAレベルの平均パーセントとして提示される。

表65に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でSRB−1 mRNAレベルを低下させた。

標準のプロトコルを用いて、血清中の肝臓トランスアミナーゼレベル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)も測定した。総ビリルビン及びBUNも評価した。体重の変化を評価したが、生理食塩水群との有意な変化は見られなかった(データ示されず)。ALT、AST、総ビリルビン、及びBUN値が、以下の表66に示される。

実施例78:GalNAc₃共役体を含むアンギオテンシノーゲンを標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験において正常血圧のSprague Dawleyラットにおけるアンギオテンシノーゲン(AGT)のアンチセンス阻害について試験した。

GalNAc₃−1_aの構造は、先の実施例9に示した。 処理

6週齢の雄Sprague Dawleyラットのそれぞれに、表67に列記されるオリゴヌクレオチドまたはPBSを、以下に示される投与量で週1回、合計3回の投与で、皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。最終投与の72時間後にラットを屠殺した。リアルタイムPCR及びRIBOGREEN(登録商標)RNA定量化試薬(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を用いて、肝臓におけるAGT mRNAレベルを決定した。全アンギオテンシノーゲンELISA(カタログ番号JP27412、IBL International,Toronto,ON)を用いて、1:20,000で希釈したAGT血漿タンパク質レベルを測定した。以下の結果は、PBS対照に対して標準化された各処理群の肝臓におけるAGT mRNAレベルまたは血漿におけるAGTタンパク質レベルの平均パーセントとして提示される。

表68に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式で肝臓におけるAGT mRNA及び血漿タンパク質レベルを低下させ、GalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチドは、GalNAc共役体を欠く親オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であった。

標準のプロトコルを用いて、屠殺時に血漿中の肝臓トランスアミナーゼレベル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、ならびに体重も測定した。結果が以下の表69に示される。

実施例79:GalNAc₃共役体を含むAPOC−IIIを標的とするオリゴヌクレオチドの生体内における作用持続時間

以下の表70に列記されるオリゴヌクレオチドを、単回投与試験においてマウスにおける作用持続時間について試験した。

GalNAc₃−1_aの構造は、先の実施例9に示され、GalNAc₃−3_aは、実施例39に示され、GalNAc₃−7_aは、実施例48に示され、GalNAc₃−10_aは、実施例46に示され、GalNAc₃−13_aは、実施例62に示される。 処理

ヒトAPOC−IIIを発現する6〜8週齢のトランスジェニックマウスのそれぞれに、表70に列記されるオリゴヌクレオチドまたはPBSを1回皮下注入した。各処理群は、3匹の動物からなった。投薬前に血液を採取して、ベースライン、ならびに投与後72時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、及び6週間時点のレベルを決定した。実施例20に記載されるように、血漿トリグリセリド及びAPOC−IIIタンパク質レベルを測定した。以下の結果は、ベースラインレベルに対して標準化された各処理群の血漿トリグリセリド及びAPOC−IIIレベルの平均パーセントとして提示され、親オリゴヌクレオチドの投与量がGalNAc共役基を含むオリゴヌクレオチドの投与量の3倍であったにもかかわらず、GalNAc共役基を含むオリゴヌクレオチドが共役基を有しない親オリゴヌクレオチド(ISIS 304801)よりも長い作用持続時間を示したことを示す。

実施例80:GalNAc₃共役体を含むα−1抗トリプシン(A1AT)を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

以下の表72に列記されるオリゴヌクレオチドを、マウスにおけるA1ATの用量依存的阻害試験において試験した。

GalNAc₃−1_aの構造は、先の実施例9に示され、GalNAc₃−3_aは、実施例39に示され、GalNAc₃−7_aは、実施例48に示され、GalNAc₃−10_aは、実施例46に示され、GalNAc₃−13_aは、実施例62に示される。 処理

6週齢の雄C57BL/6マウス(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)のそれぞれに、表72に列記されるオリゴヌクレオチドまたはPBSを、以下に示される投与量で週1回、合計3回の投与で、皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。最終投与の72時間後にマウスを屠殺した。リアルタイムPCR及びRIBOGREEN(登録商標)RNA定量化試薬(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を用いて、肝臓におけるA1AT mRNAレベルを決定した。マウスα1−抗トリプシンELISA(カタログ番号41−A1AMS−E01、Alpco,Salem,NH)を用いて、A1AT血漿タンパク質レベルを決定した。以下の結果は、PBS対照に対して標準化された各処理群の肝臓におけるA1AT mRNA及び血漿タンパク質レベルの平均パーセントとして提示される。

表73に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式で肝臓におけるA1AT mRNA及びA1AT血漿タンパク質レベルを低下させた。GalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチドは、親(ISIS 476366)よりも著しく強力であった。

標準のプロトコルを用いて、屠殺時に血漿中の肝臓トランスアミナーゼ及びBUNレベルを測定した。体重及び臓器重量も測定した。結果が以下の表74に示される。体重は、ベースラインと比較した%として示される。臓器重量は、PBS対照群と比較した体重の%として示される。

実施例81:生体内におけるGalNAc₃クラスターを含むA1ATを標的とするオリゴヌクレオチドの作用持続時間

表72に列記されるオリゴヌクレオチドを、単回投与試験においてマウスにおける作用持続時間について試験した。 処理

6週齢の雄C57BL/6マウスのそれぞれに、表72に列記されるオリゴヌクレオチドまたはPBSを1回皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。投薬の前日に血液を採取して、ベースライン、ならびに投与後5、12、19、及び25日時点のレベルを決定した。ELISAを用いて血漿A1ATタンパク質レベルを測定した(実施例80を参照のこと)。以下の結果は、ベースラインレベルに対して標準化された各処理群の血漿A1ATタンパク質レベルの平均パーセントとして提示される。結果は、GalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチドがGalNAc共役体を欠く親(ISIS 476366)よりも強力であり、かつより長い作用持続時間を有したことを示す。さらに、5’−GalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチド(ISIS 678381、678382、678383、及び678384)は、概して、3’−GalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチド(ISIS 656326)よりもさらに強力であり、さらに長い作用持続時間を有した。

実施例82:GalNAc₃共役体を含むSRB−1を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体外におけるアンチセンス阻害

処理の2時間前に、初代マウス肝細胞を15,000細胞/ウェルで96ウェルプレートに播種した。表76に列記されるオリゴヌクレオチドをウィリアムE培地に2、10、50、または250nMで添加し、細胞を37℃、5%CO₂で一晩インキュベートした。オリゴヌクレオチド添加の16時間後に細胞を溶解し、RNease 3000 BioRobot(Qiagen)を用いて全RNAを精製した。リアルタイムPCR及びRIBOGREEN(登録商標)RNA定量化試薬(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を用いて、SRB−1 mRNAレベルを標準のプロトコルに従って決定した。Prism 4ソフトウェア(GraphPad)を用いて、IC₅₀値を決定した。結果は、さまざまな異なるGalNAc共役基及びさまざまな異なる切断可能部分を含むオリゴヌクレオチドが、生体外自由取り込み実験において、GalNAc共役基を欠く親オリゴヌクレオチド(ISIS 353382及び666841)よりも著しく強力であることを示す。

GalNAc₃−1_aの構造は、先の実施例9に示され、GalNAc₃−3_aは、実施例39に示され、GalNAc₃−5_aは、実施例49に示され、GalNAc₃−6_aは、実施例51に示され、GalNAc₃−7_aは、実施例48に示され、GalNAc₃−8_aは、実施例47に示され、GalNAc₃−9_aは、実施例52に示され、GalNAc₃−10_aは、実施例46に示され、GalNAc₃−12_aは、実施例61に示され、GalNAc₃−13_aは、実施例62に示され、GalNAc₃−14_aは、実施例63に示され、GalNAc₃−15_aは、実施例64に示され、GalNAc₃−17_aは、実施例68に示され、GalNAc₃−18_aは、実施例69に示され、GalNAc₃−19_aは、実施例70に示され、GalNAc₃−20_aは、実施例71に示され、GalNAc₃−23_aは、実施例76に示される。 実施例83:GalNAc₃クラスターを含む、第XI因子を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

以下の表77に列記されるオリゴヌクレオチドを、マウスにおける第XI因子の用量依存的阻害試験において試験した。

GalNAc₃−1_aの構造は、先の実施例9に示され、GalNAc₃−3_aは、実施例39に示され、GalNAc₃−7_aは、実施例48に示され、GalNAc₃−10_aは、実施例46に示され、GalNAc₃−13_aは、実施例62に示される。 処理

6〜8週齢のマウスのそれぞれに、以下に列記されるオリゴヌクレオチドまたはPBSを、以下に示される投与量で週1回、合計3回の投与で、皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。最終投与の72時間後にマウスを屠殺した。リアルタイムPCRを用いて肝臓における第XI因子mRNAレベルを測定し、標準のプロトコルに従ってシクロフィリンに対して標準化した。肝臓トランスアミナーゼ、BUN、及びビリルビンも測定した。以下の結果は、PBS対照に対して標準化された各処理群の平均パーセントとして提示される。

表78に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式で肝臓における第XI因子mRNAを低下させた。結果は、GalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチドが、GalNAc共役体を欠く親(ISIS 404071)よりも強力であったことを示す。さらに、5’−GalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチド(ISIS 663086、678347、678348、及び678349)は、3’−GalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチド(ISIS 656173)よりもさらに強力であった。

実施例84:GalNAc₃共役体を含む第XI因子を標的とするオリゴヌクレオチドの生体内における作用持続時間

表77に列記されるオリゴヌクレオチドを、単回投与試験においてマウスにおける作用持続時間について試験した。 処理

6〜8週齢のマウスのそれぞれに、表77に列記されるオリゴヌクレオチドまたはPBSを1回皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。投薬の前日に尾採血によって血液を採取して、ベースライン、ならびに投与後3、10、及び17日間時点のレベルを決定した。R & D Systems(Minneapolis,MN)の第XI因子捕捉及びビオチン化検出抗体(それぞれ、カタログ番号AF2460及びBAF2460)、ならびにOptEIA試薬セットB(カタログ番号550534、BD Biosciences,San Jose,CA)を用いて、第XI因子血漿タンパク質レベルをELISAによって測定した。以下の結果は、ベースラインレベルに対して標準化された各処理群の第XI因子血漿タンパク質レベルの平均パーセントとして提示される。結果は、GalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチドが、GalNAc共役体を欠く親(ISIS 404071)よりも強力であり、より長い作用持続時間を有したことを示す。さらに、5’−GalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチド(ISIS 663086、678347、678348、及び678349)は、3’−GalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチド(ISIS 656173)よりもさらに強力であり、さらに長い作用持続時間を有した。

実施例85:GalNAc₃共役体を含む、SRB−1を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

表76に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるSRB−1のアンチセンス阻害について試験した。 処理

6〜8週齢のC57BL/6マウスのそれぞれに、表76に列記されるオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水を、以下に示される投与量で週1回、合計3回の投与で、皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。最終投与の48時間後にマウスを屠殺して、リアルタイムPCR及びRIBOGREEN(登録商標)RNA定量化試薬(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を用いて、SRB−1 mRNAレベルを決定した。以下の結果は、生理食塩水(対照)に対して標準化された各処理群の肝臓におけるSRB−1 mRNAレベルの平均パーセントとして提示される。

表80及び81に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でSRB−1 mRNAレベルを低下させた。

標準のプロトコルを用いて、肝臓トランスアミナーゼレベル、総ビリルビン、BUN、及び体重も測定した。各処理群の平均値が以下の表82に示される。

実施例86:GalNAc₃クラスターを含む、TTRを標的とするオリゴヌクレオチドの生体内におけるアンチセンス阻害

以下の表83に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてヒトTTR遺伝子を発現するトランスジェニックマウスにおけるヒトトランスサイレチン(TTR)のアンチセンス阻害について試験した。 処理

8週齢のTTRトランスジェニックマウスのそれぞれに、以下の表に列記されるオリゴヌクレオチド及び投与量またはPBSを、週1回3週間、合計3回の投与で、皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。最終投与の72時間後にマウスを屠殺した。この実験を通してさまざまな時点で尾採血を実行し、血漿TTRタンパク質、ALT、及びASTレベルを測定し、表85〜87に報告した。動物を屠殺した後、血漿ALT、AST、及びヒトTTRレベルを測定し、体重、臓器重量、及び肝臓におおけるヒトTTR mRNAレベルも測定した。臨床分析器(AU480、Beckman Coulter,CA)を用いて、TTRタンパク質レベルを測定した。標準のプロトコルに従ってリアルタイムPCR及びRIBOGREEN(登録商標)RNA定量化試薬(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を用いて、肝臓におけるヒトTTR mRNAレベルを決定した。表84〜87に提示される結果は、各処理群の平均値である。mRNAレベルは、PBS群の平均と比較した平均値である。血漿タンパク質レベルは、ベースラインでのPBS群の平均値と比較した平均値である。体重は、個々の処理群それぞれを屠殺するまでのベースラインからの平均体重変化率である。示される臓器重量は、動物の体重に対して標準化されており、各処理群の平均標準化臓器重量は、PBS群の平均標準化臓器重量との比較で提示される。

表84〜87において、「BL」は、第1の投与の直前に測定したベースラインを示す。表84及び85に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でTTR発現レベルを低下させた。GalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチドは、GalNAc共役体を欠く親(ISIS 420915)よりも強力であった。さらに、GalNAc共役体及び混成PS/POヌクレオシド間連結部を含むオリゴヌクレオチドは、GalNAc共役体及び完全PS連結部を含むオリゴヌクレオチドよりもさらに強力であった。

表85の説明文を実施例74で見つけることができる。GalNAc₃−1の構造は、実施例9に示される。GalNAc₃−3_aの構造は、実施例39に示される。GalNAc₃−7_aの構造は、実施例48に示される。GalNAc₃−10_aの構造は、実施例46に示される。GalNAc₃−13_aの構造は、実施例62に示される。GalNAc₃−19_aの構造は、実施例70に示される。

実施例87:GalNAc₃クラスターを含むTTRを標的とするオリゴヌクレオチドの単回投与による生体内における作用持続時間

ISIS番号420915及び660261(表83を参照のこと)を、単回投与試験においてマウスにおける作用持続時間について試験した。ISIS番号420915、682883、及び682885(表83を参照のこと)も、単回投与試験においてマウスにおける作用持続時間について試験した。 処理

ヒトTTRを発現する8週齢の雄トランスジェニックマウスのそれぞれに、100mg/kgのISIS番号420915または13.5mg/kgのISIS番号660261を1回皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。投薬前に尾採血を実行して、ベースライン、ならびに投与後3、7、10、17、24、及び39日目のレベルを決定した。実施例86に記載されるように、血漿TTRタンパク質レベルを測定した。以下の結果は、ベースラインレベルに対して標準化された各処理群の血漿TTRレベルの平均パーセントとして提示される。

処理

ヒトTTRを発現する雌トランスジェニックマウスのそれぞれに、100mg/kgのISIS番号420915、10.0mg/kgのISIS番号682883、または10.0mg/kgの682885を1回皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。投薬前に尾採血を実行して、ベースライン、ならびに投与後3、7、10、17、24、及び39日目のレベルを決定した。実施例86に記載されるように、血漿TTRタンパク質レベルを測定した。以下の結果は、ベースラインレベルに対して標準化された各処理群の血漿TTRレベルの平均パーセントとして提示される。

表88及び89における結果は、GalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチドが、共役体を欠く親オリゴヌクレオチド(ISIS 420915)よりも強力であり、より長い作用持続時間を有することを示す。 実施例88:GalNAc₃共役体を含むSMNを標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるスプライシング調節

表90に列記されるオリゴヌクレオチドを、マウスにおけるヒト運動ニューロン生存(SMN)のスプライシング調節について試験した。

GalNAc₃−7_aの構造は、先の実施例48に示した。「X」は、Gene Tools(Philomath,OR)によって生成された5’一次アミンを示し、GalNAc₃−7_bは、以下に示すように、リンカーの−NH−C₆−O部分を欠くGalNAc₃−7_aの構造を示す。

ISIS番号703421及び703422は、モルホリノオリゴヌクレオチドであり、これら2つのオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドは、モルホリノヌクレオチドである。 処理

ヒトSMNを発現する6週齢のトランスジェニックマウスに、表91に列記されるオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水を1回皮下注入した。各処理群は、2匹の雄及び2匹の雌からなった。投与の3日後にマウスを屠殺して、標準のプロトコルに従ってリアルタイムPCRを用いて、エキソン7を有する場合とエキソン7を有しない場合の肝臓におけるヒトSMN mRNAレベルを決定した。Ribogreen試薬を用いて総RNAを測定した。SMN mRNAレベルを総mRNAに対して標準化し、さらに生理食塩水処理群の平均に対して標準化した。結果として生じたエキソン7を含むSMN mRNAとエキソン7を欠くSMN mRNAとの平均比が、表91に示される。結果は、スプライシングを調節し、かつGalNAc共役体を含む完全修飾オリゴヌクレオチドが、GlaNAc共役体を欠く親オリゴヌクレオチドよりも肝臓におけるスプライシングの改変に著しく強力であることを示す。さらに、この傾向は、2’−MOE及びモルホリノ修飾オリゴヌクレオチドを含む複数の修飾化学でも維持される。

実施例89:GalNAc₃共役体を含むアポリポタンパク質A(Apo(a))を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

以下の表92に列記されるオリゴヌクレオチドを、トランスジェニックマウスにおけるApo(a)の用量依存的阻害に関する試験で試験した。

GalNAc₃−7_aの構造は、実施例48に示される。 処理

8週齢の雌C57BL/6マウス(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)のそれぞれに、表92に列記されるオリゴヌクレオチドまたはPBSを、以下に示される投与量で週1回、合計6回の投与で、皮下注入した。各処理群は、3〜4匹の動物からなった。第1の投与の前日に、かつ各投与後週1回、尾採血を実行して、血漿Apo(a)タンパク質レベルを決定した。最終投与の2日後にマウスを屠殺した。リアルタイムPCR及びRIBOGREEN(登録商標)RNA定量化試薬(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を用いて、肝臓におけるApo(a)mRNAレベルを決定した。ELISAを用いてApo(a)血漿タンパク質レベルを決定し、肝臓トランスアミナーゼレベルを決定した。表93におけるmRNA及び血漿タンパク質の結果は、PBS処理群と比較した処理群の平均パーセントとして提示される。血漿タンパク質レベルをさらにPBS群のベースライン(BL)値に対して標準化した。平均絶対トランスアミナーゼレベル及び体重(ベースライン平均と比較した%)が表94に報告される。

表93に例証されるように、オリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式で肝臓におけるApo(a)mRNA及び血漿タンパク質レベルを低下させた。さらに、GalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチドは、GalNAc共役体を欠く親オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であり、より長い作用持続時間を有した。表94に例証されるように、トランスアミナーゼレベル及び体重はオリゴヌクレオチドの影響を受けず、オリゴヌクレオチドが良好な耐容性を示したことを示す。

実施例90:GalNAc₃クラスターを含むTTRを標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

以下の表95に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてヒトTTR遺伝子を発現するトランスジェニックマウスにおけるヒトトランスサイレチン(TTR)のアンチセンス阻害について試験した。 処理

TTRトランスジェニックマウスのそれぞれに、表96に列記されるオリゴヌクレオチド及び投与量またはPBSを、週1回3週間、合計3回の投与で、皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。第1の投与の前に、尾採血を実行して、ベースライン(BL)での血漿TTRタンパク質レベルを決定した。最終投与の72時間後にマウスを屠殺した。臨床分析器(AU480、Beckman Coulter,CA)を用いて、TTRタンパク質レベルを測定した。標準のプロトコルに従ってリアルタイムPCR及びRIBOGREEN(登録商標)RNA定量化試薬(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を用いて、肝臓におけるヒトTTR mRNAレベルを決定した。表96に提示される結果は、各処理群の平均値である。mRNAレベルは、PBS群の平均と比較した平均値である。血漿タンパク質レベルは、ベースラインでのPBS群の平均値と比較した平均値である。「BL」は、第1の投与の直前に測定したベースラインを示す。表96に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でTTR発現レベルを低下させた。GalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチドは、GalNAc共役体を欠く親(ISIS 420915)よりも強力であり、ホスホジエステルまたはデオキシアデノシンの切断可能部分を含むオリゴヌクレオチドは、共役体を欠く親と比較して、力価の著しい改善を示した(ISIS番号682883及び666943対420915、ならびに実施例86及び87を参照のこと)。

表95の説明文を実施例74で見つけることができる。GalNAc₃−3_aの構造は、実施例39に示される。GalNAc₃−7_aの構造は、実施例48に示される。GalNAc₃−10_aの構造は、実施例46に示される。GalNAc₃−13_aの構造は、実施例62に示される。

実施例91:非ヒト霊長類におけるGalNAc₃共役体を含む第VII因子を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

以下の表97に列記されるオリゴヌクレオチドを、非終末用量増加試験(non−terminal,dose escalation study)においてサルにおける第VII因子のアンチセンス阻害について試験した。 処理

処置した(non−naive)サルのそれぞれに、増加用量の表97に列記されるオリゴヌクレオチドまたはPBSを、0、15、及び29日目に皮下注入した。各処理群は、4匹の雄及び1匹の雌からなった。第1の投与の前とその後のさまざまな時点で、血液採取を実行して、血漿第VII因子タンパク質レベルを決定した。ELISAによって第VII因子タンパク質レベルを測定した。表98に提示される結果は、第1の投与の直前に測定したベースライン(BL)でのPBS群の平均値と比較した各処理群の平均値である。表98に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式で第VII因子の発現レベルを低下させ、GalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチドは、サルにおいてGalNAc共役体を欠くオリゴヌクレオチドよりも著しく強力であった。

表97の説明文を実施例74で見つけることができる。GalNAc₃−10_aの構造は、実施例46に示される。

実施例92:GalNAc₃共役体を含むApo−CIIIを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる初代肝細胞におけるアンチセンス阻害

初代マウス肝細胞を15,000細胞/ウェルで96ウェルプレートに播種し、マウスApoC−IIIを標的とする表99に列記されるオリゴヌクレオチドを、0.46、1.37、4.12、または12.35、37.04、111.11、もしくは333.33nMまたは1.00μmで添加した。オリゴヌクレオチドとともに24時間インキュベートした後、細胞を溶解し、RNeasy(Qiagen)を用いて全RNAを精製した。標準のプロトコルに従ってリアルタイムPCR及びRIBOGREEN(登録商標)RNA定量化試薬(Molecular Probes,Inc.)を用いて、ApoC−III mRNAレベルを決定した。Prism 4ソフトウェア(GraphPad)を用いて、IC₅₀値を決定した。結果は、切断可能部分がホスホジエステルであるかホスホジエステル連結デオキシアデノシンであるかにかかわらず、GalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチドが、共役体を欠く親オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であったことを示す。

GalNAc₃−1_aの構造は、先の実施例9に示され、GalNAc₃−3_aは、実施例39に示され、GalNAc₃−7_aは、実施例48に示され、GalNAc₃−10_aは、実施例46に示され、GalNAc₃−13_aは、実施例62に示され、GalNAc₃−19_aは、実施例70に示される。 実施例93:混成ウイング及び5’−GalNAc₃共役体を含むSRB−1を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

表100に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるSRB−1のアンチセンス阻害について試験した。

GalNAc₃−3_aの構造は、先の実施例39に示され、GalNAc₃−7aの構造は、先の実施例48に示される。下付き文字「e」は、2’−MOE修飾ヌクレオシドを示し、「d」は、β−D−2’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「k」は、6’−(S)−CH₃二環式ヌクレオシド(cEt)を示し、「s」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部(PS)を示し、「o」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部(PO)を示す。上付き文字「m」は、5−メチルシトシンを示す。 処理

6〜8週齢のC57BL/6マウス(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)に、表100に列記されるオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水を、以下に示される投与量で1回、皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。最終投与の72時間後にマウスを屠殺した。リアルタイムPCRを用いて、肝臓におけるSRB−1 mRNAレベルを測定した。標準のプロトコルに従って、SRB−1 mRNAレベルをシクロフィリンmRNAレベルに対して標準化した。結果は、生理食塩水対照群と比較した各処理群のSRB−1 mRNAレベルの平均パーセントとして提示される。表101に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でSRB−1 mRNAレベルを低下させ、GalNAc共役体を含み、かつ完全cEtまたは混成糖修飾のいずれかのウイングを有するギャップマーオリゴヌクレオチドは、共役体を欠き、かつ完全cEt修飾ウイングを含む親オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であった。

体重、肝臓トランスアミナーゼ、総ビリルビン、及びBUNも測定し、各処理群の平均値が表101に示される。体重は、オリゴヌクレオチド投与の直前に測定したベースライン体重(%BL)と比較した平均体重率として示される。

実施例94:2’−糖修飾及び5’−GalNAc₃共役体を含むSRB−1を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

表102に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるSRB−1のアンチセンス阻害について試験した。

下付き文字「m」は、2’−O−メチル修飾ヌクレオシドを示す。完全な表の説明文については、実施例74を参照されたい。GalNAc₃−3_aの構造は、先の実施例39に示し、GalNAc₃−7aの構造は、先の実施例48に示した。 処理

実施例93に記載されるプロトコルを用いて試験を完了した。結果が以下の表103に示され、GalNAc共役体を含む2’−MOE修飾オリゴヌクレオチドと2’−OMe修飾オリゴヌクレオチドとが両方ともに、共役体を欠くそれぞれの親オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であったことを示す。体重、肝臓トランスアミナーゼ、総ビリルビン、及びBUNの測定結果は、これらの化合物がすべて良好な耐容性を示したことを示す。

実施例95:二環式ヌクレオシド及び5’−GalNAc₃共役体を含むSRB−1を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

表104に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるSRB−1のアンチセンス阻害について試験した。

下付き文字「g」は、フルオロ−HNAヌクレオシドを示し、下付き文字「l」は、2’−O−CH₂−4’橋を含むロックドヌクレオシドを示す。他の省略形については、実施例74の表の説明文を参照されたい。GalNAc₃−1_aの構造は、先の実施例9に示し、GalNAc₃−3_aの構造は、先の実施例39に示し、GalNAc₃−7aの構造は、先の実施例48に示した。 処理

実施例93に記載されるプロトコルを用いて試験を完了した。結果が以下の表105に示され、GalNAc共役体及びさまざまな二環式ヌクレオシド修飾を含むオリゴヌクレオチドが、共役体を欠くが二環式ヌクレオシド修飾を含む親オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であったことを示す。さらに、GalNAc共役体及びフルオロ−HNA修飾を含むオリゴヌクレオチドは、共役体を欠くがフルオロ−HNA修飾を含む親よりも著しく強力であった。体重、肝臓トランスアミナーゼ、総ビリルビン、及びBUNの測定結果は、これらの化合物がすべて良好な耐容性であったことを示した。

実施例96:GalNAc₃共役基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの血漿タンパク質結合

ApoC−IIIを標的とする表70に列記されるオリゴヌクレオチド及びApo(a)を標的とする表106におけるオリゴヌクレオチドを限外濾過アッセイにおいて試験して、血漿タンパク質結合を評価した。

表の説明文については、実施例74を参照されたい。GalNAc₃−7aの構造は、先の実施例48に示される。

Ultrafree−MC限外濾過ユニット(30,000NMWL、低結合再生セルロース膜、Millipore,Bedford,MA)を300μLの0.5%Tween 80で事前に条件付け、2000gで10分間遠心分離し、その後、H₂O中の300μLの300μg/mL対照オリゴヌクレオチド溶液で事前に条件付け、2000gで16分間遠心分離した。これらの試験で用いる表70及び106の各試験オリゴヌクレオチドのフィルターへの非特異的結合を評価するために、300μLのH₂O中の250ng/mL溶液オリゴヌクレオチド(pH7.4)を事前に条件付けたフィルターに設置し、2000gで16分間遠心分離した。ELISAアッセイによって濾過していない試料及び濾過した試料を分析して、オリゴヌクレオチド濃度を決定した。3つの複製物を用いて各試料の平均濃度を得た。濾過していない試料と比較した濾過した試料の平均濃度を用いて、血漿の不在下でフィルターによって回収されたオリゴヌクレオチドの割合(%回収)を決定する。

薬物を使用していない健常なヒト志願者、カニクイザル、及びCD−1マウス由来のK3−EDTA中に収集された凍結全血漿試料をBioreclamation LLC(Westbury,NY)から購入した。試験オリゴヌクレオチドを、2つの濃度(5μg/mL及び150μg/mL)で血漿の1.2mLの一定分量に添加した。各スパイクした血漿試料の一定分量(300μL)を事前に条件付けられたフィルターユニット内に設置し、37°Cで30分間インキュベートした直後に2000gで16分間遠心分離した。ELISAによって、濾過してスパイクした血漿試料及び濾過していないスパイクした血漿試料の一定分量を分析して、各試料中のオリゴヌクレオチドの濃度を決定した。1つの濃度ごとに3つの複製物を用いて、各試料中の結合オリゴヌクレオチド及び非結合オリゴヌクレオチドの平均割合を決定した。濾過していない試料の濃度と比較した濾過した試料の平均濃度を用いて、血漿タンパク質に結合されていない血漿中のオリゴヌクレオチドの割合(%非結合)を決定する。各オリゴヌクレオチドの%非結合を%回収で割ることによって、最終非結合オリゴヌクレオチド値を非特異的結合に対して補正する。最終%非結合値を100から差し引くことによって、最終%結合オリゴヌクレオチド値を決定する。各種の血漿において試験した2つの濃度のオリゴヌクレオチド(5μg/mL及び150μg/mL)の結果が表107に示される。結果は、GalNAc共役基が血漿タンパク質結合に大きな影響を与えないことを示す。さらに、完全PSヌクレオシド間連結部を有するオリゴヌクレオチドも混成PO/PS連結部を有するオリゴヌクレオチドも血漿タンパク質に結合し、完全PS連結部を有するオリゴヌクレオチドは、混合PO/PS連結部を有するオリゴヌクレオチドよりも若干高い程度に血漿タンパク質に結合する。

実施例97:GalNAc₃共役基を含むTTRを標的とする修飾オリゴヌクレオチド

GalNAc共役体を含む表108に示されるオリゴヌクレオチドを、TTRを標的とするように設計した。

表108の説明文を実施例74で見つけることができる。GalNAc₃−1の構造は、実施例9に示した。GalNAc₃−3_aの構造は、実施例39に示した。GalNAc₃−7_aの構造は、実施例48にした。GalNAc₃−10_aの構造は、実施例46に示した。GalNAc₃−13_aの構造は、実施例62に示した。GalNAc₃−19_aの構造は、実施例70に示した。 実施例98:hPMBCアッセイにおけるGalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチドの炎症誘発作用の評価

表109に列記されるオリゴヌクレオチドを、実施例23及び24に記載されるようにhPMBCアッセイにおいて炎症誘発作用について試験した(オリゴヌクレオチドの説明については、表30、83、95、及び108を参照のこと)。ISIS 353512は、正の対照として用いられる高レスポンダーであり、他のオリゴヌクレオチドは、表83、95、及び108に記載されるものである。1人の志願ドナー由来の血液を用いて表109に示される結果を得た。結果は、混合PO/PSヌクレオシド間連結部を含むオリゴヌクレオチドが、完全PS連結部を有する同一のオリゴヌクレオチドと比較して、著しく低い炎症誘発応答をもたらしたことを示す。さらに、GalNAc共役基は、このアッセイにおいて大きく影響しなかった。

実施例99:アシアロ糖タンパク質受容体に対するGalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチドの結合親和性

アシアロ糖タンパク質受容体に対する表110に列記されるオリゴヌクレオチド(オリゴヌクレオチドの説明については、表76を参照のこと)の結合親和性を、競合的受容体結合アッセイにおいて試験した。競合相手のリガンドであるα1−酸性糖タンパク質(AGP)を、50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)中で1Uノイラミニダーゼ−アガロースとともに37℃で16時間インキュベートし、シアル酸アッセイまたはサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)のいずれかで90%を超える脱シアル化を確認した。Atsma et al.(J Lipid Res.1991 Jan;32(1):173−81を参照のこと)の手順に従って、一塩化ヨウ素を用いてAGPをヨウ素化した。この方法において、脱シアル化α1−酸性糖タンパク質(de−AGP)を、10mM塩化ヨウ素、Na¹²⁵I、及び0.25M NaOH中の1Mグリシンに添加した。室温で10分間インキュベートした後、3KDMWCOスピンカラムを利用してこの混合物を2回濃縮することによって、¹²⁵I標識de−AGPを遊離¹²⁵Iから分離した。このタンパク質を、Agilent SEC−3カラム(7.8×300mm)及びβ−RAMカウンタを装備したHPLCシステムにおいて標識効率及び純度について試験した。¹²⁵I標識de−AGP及びASOを含有するさまざまなGalNAcクラスターを利用した競合実験を以下のとおりに実行した。ヒトHepG2細胞(10⁶細胞/mL)を、2mLの適切な成長培地中の6ウェルプレートにプレーティングした。10%ウシ胎児血清(FBS)、2mM L−グルタミン、及び10mM HEPESを補充したMEM培地を用いた。細胞を、それぞれ、5%及び10%CO₂で、37℃で16〜20時間インキュベートした。実験前に細胞をFBSを有しない培地で洗浄した。細胞を、2%FBSを有する適切な成長培地を含有する1mLの競合混合物、10⁻⁸M ¹²⁵I標識de−AGP、及び10⁻¹¹〜10⁻⁵Mの範囲の濃度のASOを含有するGalNAcクラスターとともに、37℃で30分間インキュベートした。10⁻²M GalNAc糖の存在下で非特異的結合を決定した。細胞をFBSを有しない培地で2回洗浄して、非結合¹²⁵I標識de−AGP及び競合相手であるGalNAc ASOを除去した。1%β−メルカプトエタノールを含有するQiagenのRLT緩衝液を用いて、細胞を溶解した。10分間の短時間凍結/解凍サイクル後に溶解物を丸底アッセイチューブに移し、γ−カウンタでアッセイした。非特異的結合を差し引いた後に、¹²⁵Iタンパク質カウントを最も低いGalNAc−ASO濃度カウントの値で割った。非線形回帰アルゴリズムを用いた単一部位競合結合等式に従って阻害曲線を当てはめて、結合親和性(K_D)を計算した。

表110における結果を5つの異なる日に実行した実験から得た。上付き文字「a」の付いたオリゴヌクレオチドの結果は、2つの異なる日に実行した実験の平均である。結果は、5’末端にGalNAc共役基を含むオリゴヌクレオチドがヒトHepG2細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に結合し、3’末端にGalNAc共役基を含むオリゴヌクレオチドよりも1.5〜16倍高い親和性を有することを示す。

実施例100:生体内におけるApo(a)を標的とするGalNAc共役基を含むオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

以下の表111aに列記されるオリゴヌクレオチドを、単回投与試験においてマウスにおける作用持続時間について試験した。

GalNAc₃−7_aの構造は、実施例48に示した。 処理

ヒトApo(a)を発現する雌トランスジェニックマウスのそれぞれに、表111bに列記されるオリゴヌクレオチド及び投与量またはPBSを、週1回、合計6回の投与で、皮下注入した。各処理群は、3匹の動物からなった。投薬の前日に血液を採取して、血漿中のApo(a)タンパク質のベースラインレベル、ならびに第1の投与後72時間、1週間、及び2週間時点のレベルを決定した。第1の投与後3週間、4週間、5週間、及び6週間時点でさらに血液を採取する。ELISAを用いて血漿Apo(a)タンパク質レベルを測定した。表111bにおける結果は、ベースラインレベル(%BL)に対して標準化された各処理群の血漿Apo(a)タンパク質レベルの平均パーセントとして提示され、結果は、GalNAc共役基を含むオリゴヌクレオチドがApo(a)発現の強力な減少を示したことを示す。この強力な影響は、完全PSヌクレオシド間連結部を含むオリゴヌクレオチド及び混成PO及びPS連結部を含むオリゴヌクレオチドにおいて観察された。

実施例101:安定した部分を介して連結されたGalNAcクラスターを含むオリゴヌクレオチドによるアンチセンス阻害

表112に列記されるオリゴヌクレオチドを生体内におけるマウスAPOC−III発現の阻害について試験した。C57Bl/6マウスのそれぞれに、表112に列記されるオリゴヌクレオチドまたはPBSを1回皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。ISIS 440670で処理した各マウスは、2、6、20、または60mg/kgの投与を受けた。ISIS 680772または696847で処理した各マウスは、0.6、2、6、または20mg/kgを受けた。ISIS 696847のGalNAc共役基は、安定した部分(容易に切断可能なホスホジエステル含有結合の代わりにホスホロチオエート連結部)を介して連結されている。投与の72時間後に動物を屠殺した。リアルタイムPCRを用いて、肝臓におけるAPOC−III mRNAレベルを測定した。標準のプロトコルに従って、APOC−III mRNAレベルをシクロフィリンmRNAレベルに対して標準化した。結果は、生理食塩水対照群と比較した各処理群のAPOC−III mRNAレベルの平均パーセントとして表112に提示される。結果は、GalNAc共役基を含むオリゴヌクレオチドが、共役基を欠くオリゴヌクレオチドよりも著しく強力であったことを示す。さらに、切断可能部分を介してオリゴヌクレオチドに連結されたGalNAc共役基を含むオリゴヌクレオチド(ISIS 680772)は、安定した部分を介してオリゴヌクレオチドに連結されたGalNAc共役基を含むオリゴヌクレオチド(ISIS 696847)よりもさらに強力であった。

GalNAc₃−7_aの構造は、実施例48に示した。 実施例102:GalNAc共役体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの肝臓における分布

GalNAc共役体を含まないISIS 353382(表36を参照のこと)及びGalNAc共役体を含むISIS 655861(表36を参照のこと)の肝臓における分布を評価した。雄balb/cマウスに、ISIS 353382または655861を、表113に列記される投与量で1回、皮下注入した。2匹の動物からなった18mg/kgのISIS 655861群を除いて、各処理群は、3匹の動物からなった。投与の48時間後に動物を屠殺して、オリゴヌクレオチドの肝臓における分布を決定した。1細胞あたりのアンチセンスオリゴヌクレオチド分子の数を測定するために、ルテニウム(II)トリス−ビピリジン標識(MSD TAG、Meso Scale Discovery)を、アンチセンスオリゴヌクレオチドを検出するために用いるオリゴヌクレオチドプローブに共役させた。表113に提示される結果は、1細胞あたり100万オリゴヌクレオチド分子を1単位として表した各処理群のオリゴヌクレオチドの平均濃度である。結果は、等価用量で、GalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチドが、全肝臓及び肝細胞において、GalNAc共役体を含まないオリゴヌクレオチドよりも高い濃度で存在したことを示す。さらに、GalNAc共役体を含むオリゴヌクレオチドは、非実質肝臓細胞において、GalNAc共役体を含まないオリゴヌクレオチドよりも低い濃度で存在した。1細胞あたりの肝細胞及び非実質肝臓細胞におけるISIS 655861の濃度が同様であった一方で、肝臓は、約80体積%肝細胞であった。したがって、肝臓内に存在するISIS 655861オリゴヌクレオチドの大部分が肝細胞内に見られる一方で、肝臓内に存在するISIS 353382オリゴヌクレオチドの大部分は、非実質肝臓細胞内に見られた。

実施例103:GalNAc₃共役体を含むAPOC−IIIを標的とするオリゴヌクレオチドの生体内における作用持続時間

以下の表114に列記されるオリゴヌクレオチドを、単回投与試験においてマウスにおける作用持続時間について試験した。

GalNAc₃−3_aの構造は、実施例39に示され、GalNAc₃−19_aは、実施例70に示される。 処理

ヒトAPOC−IIIを発現する雌トランスジェニックマウスのそれぞれに、表114に列記されるオリゴヌクレオチドまたはPBSを1回皮下注入した。各処理群は、3匹の動物からなった。投薬前に血液を採取して、ベースライン、ならびに投与後3、7、14、21、28、35、及び42日間のレベルを決定した。実施例20に記載されるように、血漿トリグリセリド及びAPOC−IIIタンパク質レベルを測定した。表115における結果は、ベースラインレベルに対して標準化された各処理群の血漿トリグリセリド及びAPOC−IIIレベルの平均パーセントとして提示される。実施例79の表71における結果と以下の表115における結果の比較は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部及びホスホロチオエートヌクレオシド間連結部の両方を含むオリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部のみを含む等価オリゴヌクレオチドよりも増加した作用持続時間を示したことを示す。

実施例104:5’−GalNAc₂共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成

化合物120は市販されており、化合物126の合成は実施例49に記載されている。化合物120(1g、2.89mmol)、HBTU(0.39g、2.89mmol)、及びHOBt(1.64g、4.33mmol)を、DMF(10mL)中に溶解し、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(1.75mL、10.1mmol)を添加した。約5分後、アミノヘキサン酸ベンジルエステル(1.36g、3.46mmol)をこの反応物に添加した。3時間後、反応混合物を100mLの1M NaHSO4に注ぎ、2×50mL酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、40mL飽和NaHCO₃で3回、ブラインで2回洗浄し、Na₂SO₄で乾燥させ、濾過し、濃縮した。この生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(DCM:EA:Hex=1:1:1)によって精製して、化合物231を得た。LCMS及びNMRは、その構造と一致した。化合物231(1.34g、2.438mmol)をジクロロメタン(10mL)中に溶解し、トリフルオロ酢酸(10mL)を添加した。室温で2時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮し、トルエン(3×10mL)と共蒸発させた。残渣を減圧下で乾燥させて、トリフルオロ酢酸塩として化合物232を得た。化合物166の合成は、実施例54に記載される。化合物166(3.39g、5.40mmol)をDMF(3mL)中に溶解した。化合物232(1.3g、2.25mmol)の溶液をDMF(3mL)中に溶解し、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(1.55mL)を添加した。反応物を室温で30分間撹拌し、その後、水(80mL)に注ぎ、水層をEtOAc(2×100mL)で抽出した。有機相を分離し、飽和NaHCO₃水溶液(3×80mL)、1M NaHSO₄(3×80mL)、及びブライン(2×80mL)で洗浄し、その後、乾燥させ(Na₂SO₄)、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物233を得た。LCMS及びNMRは、その構造と一致した。化合物233(0.59g、0.48mmol)をメタノール(2.2mL)及び酢酸エチル(2.2mL)中に溶解した。パラジウム炭素(10重量%Pd/C、湿性、0.07g)を添加し、反応混合物を水素雰囲気下で3時間撹拌した。セライトパッドを通して反応混合物を濾過し、濃縮して、カルボン酸を得た。カルボン酸(1.32g、1.15mmol、クラスター遊離酸)をDMF(3.2mL)中に溶解した。これに、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(0.3mL、1.73mmol)及びPFPTFA(0.30mL、1.73mmol)を添加した。室温で30分間撹拌した後、反応混合物を水(40mL)に注ぎ、EtOAc(2×50mL)で抽出した。上述のように標準の後処理を完了して、化合物234を得た。LCMS及びNMRは、その構造と一致した。実施例46に記載される一般的手順を用いて、オリゴヌクレオチド235を調製した。共役基GalNAc₂−24のGalNAc₂クラスター部分(GalNAc₂−24_a)をオリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。GalNAc₂−24(GalNAc₂−24_a−CM)の構造は、以下に示される:

実施例105:GalNAc₁−25共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成

化合物166の合成は、実施例54に記載される。実施例46に記載される一般的手順を用いて、オリゴヌクレオチド236を調製した。

あるいは、以下に示されるスキームを用いてオリゴヌクレオチド236を合成し、実施例10に記載される手順を用いて、化合物238を用いてオリゴヌクレオチド236を形成した。

共役基GalNAc₁−25のGalNAc₁クラスター部分(GalNAc₁−25_a)をオリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。GalNAc₁−25(GalNAc₁−25_a−CM)の構造は、以下に示される:

実施例106:5’−GalNAc₂または5’−GalNAc₃共役体を含むSRB−1を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

表116及び117に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるSRB−1のアンチセンス阻害について試験した。 処理

6週齢の雄C57BL/6マウス(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)に、2、7、もしくは20mg/kgのISIS番号440762;または0.2、0.6、2、6、もしくは20mg/kgのISIS番号686221、686222、もしくは708561;または生理食塩水を1回皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。最終投与の72時間後にマウスを屠殺した。リアルタイムPCRを用いて、肝臓におけるSRB−1 mRNAレベルを測定した。標準のプロトコルに従って、SRB−1 mRNAレベルをシクロフィリンmRNAレベルに対して標準化した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、用量依存的様式でSRB−1 mRNAレベルを低下させ、ED₅₀結果が、表116及び117に提示される。以前の研究において、三価GalNAc共役オリゴヌクレオチドが二価GalNAc共役オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であり、これは、次いで、一価GalNAc共役オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であったことが示されたが(例えば、Khorev et al.,Bioorg.& Med.Chem.,Vol.16,5216−5231(2008)を参照のこと)、表116及び117に示されるように、一価、二価、及び三価GalNAcクラスターを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、同様の力価でSRB−1 mRNAレベルを低下させた。

表の説明文については、実施例93を参照されたい。GalNAc₃−13aの構造は、実施例62に示し、GalNAc₂−24aの構造は、実施例104に示した。

表の説明文については、実施例93を参照されたい。GalNAc₁−25aの構造は、実施例105に示した。

実施例75に記載される手順を用いて、表116及び117における肝臓中のオリゴヌクレオチドの濃度も評価した。以下の表117a及び117bに示される結果は、肝臓組織のオリゴヌクレオチド(μg)/g単位のUVによって測定された各処理群の平均総アンチセンスオリゴヌクレオチド組織レベルである。結果は、GalNAc共役基を含むオリゴヌクレオチドがGalNAc共役基を欠く同一の用量のオリゴヌクレオチドよりも著しく高いレベルで肝臓に蓄積したことを示す。さらに、それらのそれぞれの共役基に1、2、または3個のGalNAcリガンドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドはすべて同様のレベルで肝臓に蓄積した。上記のKhorev et al.の文献参照を考慮すると、これは意外な結果であり、上の表116及び117に示される活性データと一致する。

実施例107:GalNAc₁−26またはGalNAc₁−27共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成

DMF中HBTU及びDIEAを用いて、オリゴヌクレオチド239を化合物47(実施例15を参照のこと)と酸64(実施例32を参照のこと)とのカップリングによって合成する。結果として生じたアミド含有化合物をホスフィチル化し、その後、実施例10に記載される手順を用いて、オリゴヌクレオチドの5’末端に付加する。共役基GalNAc₁−26のGalNAc₁クラスター部分(GalNAc₁−26_a)をオリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。GalNAc₁−26(GalNAc₁−26_a−CM)の構造は、以下に示される:

GalNAc₁共役基をオリゴヌクレオチドの3’末端に付加するために、実施例7に記載される手順を用いて、化合物47と64の反応から形成されたアミドを固体支持体に付加する。その後、実施例9に記載される手順を用いて、オリゴヌクレオチド合成を完了して、オリゴヌクレオチド240を形成する。

共役基GalNAc₁−27のGalNAc₁クラスター部分(GalNAc₁−27_a)をオリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。GalNAc₁−27(GalNAc₁−27_a−CM)の構造は、以下に示される:

実施例108:生体内におけるApo(a)を標的とするGalNAc共役基を含むオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

以下の表118に列記されるオリゴヌクレオチドを、マウスにおける単回投与試験において試験した。

GalNAc₃−7_aの構造は、実施例48に示される。 処理

ヒトApo(a)を発現する雄トランスジェニックマウスのそれぞれに、表119に列記されるオリゴヌクレオチド及び投与量またはPBSを1回皮下注入した。各処理群は、4匹の動物からなった。投薬の前日に血液を採取して、血漿中のApo(a)タンパク質のベースラインレベル及び第1の投与後の1週間時点のレベルを決定した。週1回約8週間、さらに血液を採取する。ELISAを用いて血漿Apo(a)タンパク質レベルを測定した。表119における結果は、ベースラインレベル(%BL)に対して標準化された各処理群の血漿Apo(a)タンパク質レベルの平均パーセントとして提示され、結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがApo(a)タンパク質の発現を低下させたことを示す。さらに、GalNAc共役基を含むオリゴヌクレオチドは、共役基を含まないオリゴヌクレオチドよりもさらに強力なApo(a)発現の減少を示した。

実施例109:GalNAc₁−28またはGalNAc₁−29共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成

オリゴヌクレオチド241を実施例71に記載される手順と同様の手順を用いて合成して、ホスホラミダイト中間体を形成し、続いて、実施例10に記載される手順を用いてオリゴヌクレオチドを合成する。共役基GalNAc₁−28のGalNAc₁クラスター部分(GalNAc₁−28_a)をオリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。GalNAc₁−28(GalNAc₁−28_a−CM)の構造は、以下に示される:

GalNAc₁共役基をオリゴヌクレオチドの3’末端に付加するために、実施例71に記載される手順と同様の手順を用いてヒドロキシル中間体を形成し、その後、実施例7に記載される手順を用いてこれを固体支持体に付加する。その後、実施例9に記載される手順を用いてオリゴヌクレオチド合成を完了させて、オリゴヌクレオチド242を形成する。

共役基GalNAc₁−29のGalNAc₁クラスター部分(GalNAc₁−29_a)をオリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。GalNAc₁−29(GalNAc₁−29_a−CM)の構造は、以下に示される:

実施例110:GalNAc₁−30共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成

GalNAc₁−30共役基を含むオリゴヌクレオチド246(式中、Yが、O、S、置換もしくは無置換C₁〜C₁₀アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニル、またはアルキニルから選択される)を上に示されるように合成する。共役基GalNAc₁−30のGalNAc₁クラスター部分(GalNAc₁−30_a)を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。特定の実施形態において、Yは、切断可能部分の一部である。特定の実施形態において、Yは、安定した部分の一部であり、切断可能部分は、オリゴヌクレオチド上に存在する。GalNAc₁−30_aの構造は、以下に示される:

実施例111:GalNAc₂−31またはGalNAc₂−32共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成

GalNAc₂−31共役基を含むオリゴヌクレオチド250(式中、Yが、O、S、置換もしくは無置換C₁〜C₁₀アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニル、またはアルキニルから選択される)を上に示されるように合成する。共役基GalNAc₂−31のGalNAc₂クラスター部分(GalNAc₂−31_a)を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの5’末端に直接隣接したY含有基は、切断可能部分の一部である。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの5’末端に直接隣接したY含有基は、安定した部分の一部であり、切断可能部分は、オリゴヌクレオチド上に存在する。GalNAc₂−31_aの構造は、以下に示される:

GalNAc₂−32共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成は、以下に示される。

GalNAc₂−32共役基を含むオリゴヌクレオチド252(式中、Yが、O、S、置換もしくは無置換C₁〜C₁₀アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニル、またはアルキニルから選択される)を上に示されるように合成する。共役基GalNAc₂−32のGalNAc₂クラスター部分(GalNAc₂−32_a)を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの5’末端に直接隣接したY含有基は、切断可能部分の一部である。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの5’末端に直接隣接したY含有基は、安定した部分の一部であり、切断可能部分は、オリゴヌクレオチド上に存在する。GalNAc₂−32_aの構造は、以下に示される:

実施例112:GalNAc₁共役体を含む修飾オリゴヌクレオチド

SRB−1を標的とする表120のオリゴヌクレオチドをGalNAc₁共役基で合成して、GalNAcリガンドを含有する共役基を含むオリゴヌクレオチドの力価をさらに試験した。

実施例113:CFBを標的とするオリゴヌクレオチドによるインビボでのアンチセンス阻害 表121に列挙するオリゴヌクレオチドを、マウスにおけるヒト補体B因子(CFB)のアンチセンス阻害について、用量依存的試験で調べた。

GalNAc₃−3_aの構造は上記実施例39で示した。

処置 ヒトCFBを発現するトランスジェニックマウス(Jackson Laboratory,メイン州バーハーバー)に、表122に列挙するオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水を週に1回、3週にわたって皮下注射した(合計4回)。ISIS番号588540を投与した4つの処置群には、1回あたり6、12、25、または50mg/kgを与えた。ISIS番号687301を投与した4つの処置群には、1回あたり0.25、0.5、2、または6mg/kgを与えた。各処置群は4匹からなった。最後の投与の2日後にマウスを屠殺し、肝臓及び腎臓のヒトCFB及びシクロフィリンmRNAレベルを、リアルタイムPCRを用いて標準的プロトコルに従って決定した。CFB mRNAレベルをシクロフィリンレベルに対して標準化し、各処置群の平均を使って、ヒトCFB転写産物発現の50%阻害を達成する用量(ED₅₀)を決定した。結果は、2つの異なるプライマープローブセットを使って実施した4回の実験の平均であり、これを表122に示す。

血清中の肝臓トランスアミナーゼレベル、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)を、標準的プロトコルを使って、生理食塩水注射マウスとの比較で相対的に測定した。総ビリルビン、BUN、及び体重も評価した。その結果から、どの処置群にも生理食塩水処置群との比較で有意な変化がないことがわかった(データ省略)。これは、どちらのオリゴヌクレオチドも耐容性が非常に高かったことを示している。

実施例114:CFBを標的とするオリゴヌクレオチドによるインビボでのアンチセンス阻害 表123に列挙するオリゴヌクレオチドを、マウスにおけるヒトCFBのアンチセンス阻害について、用量依存的試験で調べた。

処置 ヒトCFBを発現するトランスジェニックマウス(Jackson Laboratory,メイン州バーハーバー)に、0.6、1、6、または18mg/kgの表123に列挙したオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水を1回皮下注射した。各処置群は4匹または5匹からなった。この投薬の72時間後にマウスを屠殺し、肝臓のヒトCFB及びシクロフィリンmRNAレベルを、リアルタイムPCRを用いて標準的プロトコルに従って決定した。CFB mRNAレベルをシクロフィリンレベルに対して標準化し、各処置群の平均を使って、ヒトCFB転写産物発現の50%阻害を達成する用量(ED₅₀)を決定した。結果を表123に示す。

GalNAc₃−7_aの構造は上記実施例48で示した。

実施例115:MOEギャップマーによるHepG2細胞におけるヒト補体B因子(CFB)のアンチセンス阻害 ヒト補体B因子(CFB)核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、CFB mRNAに対するそれらの効果をインビトロで試験した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、培養条件が類似する一連の実験で試験した。各実験に関する結果を以下に示す別々の表に掲載する。1ウェルあたり20,000細胞の密度の培養HepG2細胞を、エレクトロポレーションにより、4,500nMアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約24時間の処理期間後に、細胞からRNAを単離し、定量リアルタイムPCRによってCFB mRNAレベルを測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3459(フォワード配列AGTCTCTGTGGCATGGTTTGG,本明細書では配列番号810と呼ぶ;リバース配列GGGCGAATGACTGAGATCTTG,本明細書では配列番号811と呼ぶ;プローブ配列TACCGATTACCACAAGCAACCATGGCA,本明細書では配列番号812と呼ぶ)を使ってmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定される全RNA含有量に従ってCFB mRNAレベルを調整した。結果を、無処理対照細胞との比較で、CFBの阻害パーセントとして表す。

以下の表に示す新設計のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5−10−5MOEギャップマーとして設計された。これらの5−10−5MOEギャップマーは20ヌクレオシド長であり、中央のギャップセグメントは10個の2’−デオキシヌクレオシドで構成され、5’側と3’側にそれぞれ5個のヌクレオシドを含むウイングセグメントが隣接している。5’ウイングセグメント中の各ヌクレオシドと3’ウイングセグメント中の各ヌクレオシドは2’−MOE修飾を有する。ヌクレオシド間連結部は、各ギャップマーの全体を通して、ホスホロチオエート(P=S)連結部である。シトシン残基は、各ギャップマーの全体を通してすべて、5−メチルシトシンである。「開始部位」とは、ヒト遺伝子配列中で当該ギャップマーの標的になる最も5’側のヌクレオシドを示す。「終止部位」とは、ヒト遺伝子配列中で当該ギャップマーの標的になる最も3’側のヌクレオシドを示す。以下の表に示す各ギャップマーは、本明細書において配列番号1と呼ぶヒトCFB mRNA(GENBANKアクセッション番号NM_001710.5)もしくは本明細書において配列番号2と呼ぶヒトCFBゲノム配列(ヌクレオチド31852000から31861000までを切り出したGENBANKアクセッション番号NT_007592.15)、またはその両方を標的とする。「n/a」は、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドが当該特定遺伝子配列を100%の相補性では標的としないことを示す。

実施例116:MOEギャップマーによるHepG2細胞におけるヒト補体B因子(CFB)のアンチセンス阻害 ヒト補体B因子(CFB)核酸を標的とする新たなアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、CFB mRNAに対するそれらの効果をインビトロで試験した。1ウェルあたり20,000細胞の密度の培養HepG2細胞を、エレクトロポレーションにより、4,500nMアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約24時間の処理期間後に、RNAを細胞から単離し、CFB mRNAレベルを定量リアルタイムPCRで測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3460_MGB(フォワード配列CGAAGCAGCTCAATGAAATCAA,本明細書では配列番号813と呼ぶ;リバース配列TGCCTGGAGGGCCTTCTT,本明細書では配列番号814と呼ぶ;プローブ配列AGACCACAAGTTGAAGTC,本明細書では配列番号815と呼ぶ)を使って、mRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定される全RNA含有量に従ってCFB mRNAレベルを調整した。結果を、無処理対照細胞との比較で、CFBの阻害パーセントとして表す。

以下の表に示す新設計のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5−10−5MOEギャップマーとして設計された。これらの5−10−5MOEギャップマーは20ヌクレオシド長であり、中央のギャップセグメントは10個の2’−デオキシヌクレオシドで構成され、5’側と3’側にそれぞれ5個のヌクレオシドを含むウイングセグメントが隣接している。5’ウイングセグメント中の各ヌクレオシドと3’ウイングセグメント中の各ヌクレオシドは2’−MOE修飾を有する。ヌクレオシド間連結部は、各ギャップマーの全体を通して、ホスホロチオエート(P=S)連結部である。シトシン残基は、各ギャップマーの全体を通してすべて、5−メチルシトシンである。「開始部位」とは、ヒト遺伝子配列中で当該ギャップマーの標的になる最も5’側のヌクレオシドを示す。「終止部位」とは、ヒト遺伝子配列中で当該ギャップマーの標的になる最も3’側のヌクレオシドを示す。以下の表に示す各ギャップマーは、本明細書において配列番号1と呼ぶヒトCFB mRNA(GENBANKアクセッション番号NM_001710.5)もしくは本明細書において配列番号2と呼ぶヒトCFBゲノム配列(ヌクレオチド31852000から31861000までを切り出したGENBANKアクセッション番号NT_007592.15)、またはその両方を標的とする。「n/a」は、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドが当該特定遺伝子配列を100%の相補性では標的としないことを示す。