一种双酶共固定化方法及由该方法制备得到的固定化酶 |
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| 申请号 | CN201611025341.X | 申请日 | 2016-11-18 | 公开(公告)号 | CN106497910A | 公开(公告)日 | 2017-03-15 |
| 申请人 | 青岛啤酒股份有限公司; | 发明人 | 董建军; 侯同刚; 余俊红; 王建勋; 尹花; 王乔; 常宗明; 黄淑霞; 咸漠; 胡淑敏; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提出一种双酶共固定化方法及由该方法制备得到的固定化酶，属于 生物 工程 领域，能够获得高催化效率、低成本的固定化多酶。该双酶共固定化方法包括向含有待固定化的α-乙酰乳酸脱羧酶和脯 氨 酸内切酶的缓冲溶液中加入氯化 钙 溶液，在设定 温度 下充分反应，离心分离，洗涤，得到形成具有纳米花结构的固定化酶。本发明能够应用于 啤酒 生产中，尤其是应用在啤酒生产过程中的 清酒 的最后过滤阶段中。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种双酶共固定化方法，其特征在于，向含有待固定化的α-乙酰乳酸脱羧酶和脯氨酸内切酶的缓冲溶液中加入氯化钙溶液，在设定温度下充分反应，离心分离，洗涤，得到形成具有纳米花结构的固定化酶。 |
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| 说明书全文 | 一种双酶共固定化方法及由该方法制备得到的固定化酶技术领域背景技术[0002] 酶制剂作为生物工程研究的硕果之一，在啤酒行业得到了普及。通过使用酶制剂，可以弥补麦芽中酶活力的不足，改善麦汁成分，提高啤酒发酵度，缩短发酵周期，增加产量等。在生产过程中补充外加酶，始终贯穿于啤酒生产的全过程之中，它可使操作简便，效益提高。如发酵液中添加脯氨酸内切酶，可以增强啤酒的非生物稳定性；向发酵液中添加α-乙酰乳酸脱羧酶，可以方便快捷的降低双乙酰含量等。 [0003] 酶制剂一般是以液态形式加入到糖化或发酵罐等罐体中，这种外源酶一旦加入就难以分离并再利用，由于酶制剂价格一般比较高，单次利用对成本不利。另外，添加到发酵罐内的酶制剂不会经过蒸煮过程变性析出，一般在成品酒经巴氏灭菌后仍存在一定的酶活力，在啤酒存放过程中，会受到残余酶的作用，使得啤酒口味会变甜、寡淡。酶制剂的这些限制因素导致了其应用受到一定影响。 [0004] 将酶细胞固定化是改善上述酶制剂问题有效手段之一。固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，克服了游离酶的上述不足之处，呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点，因此酶或细胞的固定化受到研究者日益重视。 [0005] 随着科技不断发展，人们根据传统酶固定化技术存在的问题，不断探索改进、完善和发展新的酶固定化方法。过去几十年里，固定化酶技术的研究主要集中在单酶固定化。近年来，多酶共固定化由于具有可增加反应的局部浓度、提高反应收率等优点而得到研究者的广泛关注。固定化酶与游离酶相比更适于多酶体系的使用，不仅可利用多酶体系中的协同效应使酶催化反应速率大大提高，而且还可以控制反应按一定顺序进行，因此将会在工业生产中发挥巨大的作用。但目前由于固定化多酶成本较高，在工业上的应用还很少，因此如何提供一种多酶的固定化方法，以获得高催化效率、低成本的固定化多酶，将是本领域所研究的重要课题。 发明内容[0006] 本发明提供了一种双酶共固定化方法及由该方法制备得到的固定化酶，能够获得高催化效率、低成本的固定化多酶。 [0007] 为了达到上述目的，本发明的一方面提供了一种双酶共固定化方法，向含有待固定化的α-乙酰乳酸脱羧酶和脯氨酸内切酶的缓冲溶液中加入氯化钙溶液，在设定温度下充分反应，离心分离，洗涤，得到形成具有纳米花结构的固定化酶。 [0008] 作为优选技术方案，所述固定化酶的结构为α-乙酰乳酸脱羧酶-磷酸钙-脯氨酸内切酶，其中磷酸钙为载体，每毫克载磷酸钙可固定化酶的含量为0.92-47.68mg。 [0009] 作为优选技术方案，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为4mmol/L，在所述磷酸盐缓冲溶液中，α-乙酰乳酸脱羧酶和脯氨酸内切酶的总浓度为0.1-4.8mg/ml，优选为2.4mg/ml。 [0010] 作为可选技术方案，所述氯化钙溶液的浓度为0.1-0.5mol/L，优选为0.1-0.3mol/L，进一步优选为0.2mol/L。 [0011] 作为可选技术方案，所述缓冲溶液与所述氯化钙溶液的体积比为1:1-200:1，优选为30:1-80:1，进一步优选为50:1。 [0012] 作为可选技术方案，所述设定温度为0-60℃，优选为0-40℃；反应时间为1-24小时，优选为4-18小时，进一步优选为12小时。 [0013] 本发明的另一方面提供了一种如上述任一项技术方案所述的双酶共固定化方法制备得到的固定化酶。 [0014] 本发明的再一方面提供了一种如上述技术方案所述的固定化酶在啤酒生产过程中的应用。 [0015] 作为可选技术方案，所述固定化酶在啤酒生产过程中的清酒的最后过滤阶段添加。 [0016] 与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于： [0017] 1、由本发明实施例提供的共固定化方法制备得到的固定化酶可大大拓宽了双酶在同时工作时对pH以及温度的耐受性，从而有利于满足后续工序的操作条件； [0018] 2、α-乙酰乳酸脱羧酶的底物为α-乙酰乳酸，产物为乙偶姻，而脯氨酸内切酶作用于富含脯氨酸片段的特殊多肽，产物为多肽水解后的小肽，因此两种酶各自的底物和产物均不会对彼此的酶活性产生影响，从而有利于提高固定化酶的催化效率； [0020] 图1为本发明对比例所提供的固定化酶在总酶浓度为0mg/ml时的电镜照片； [0021] 图2为本发明实施例所提供的固定化酶在总酶浓度为0.1mg/ml时的电镜照片； [0022] 图3为本发明实施例所提供的固定化酶在总酶浓度为2.4mg/ml时的电镜照片； [0023] 图4为本发明实施例所提供的固定化酶在总酶浓度为4.8mg/ml时的电镜照片。 具体实施方式[0024] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0025] 本发明一方面的实施例提供了一种双酶共固定化方法，向含有待固定化的α-乙酰乳酸脱羧酶和脯氨酸内切酶的缓冲溶液中加入氯化钙溶液，在设定温度下充分反应，离心分离，洗涤，得到形成具有纳米花结构的固定化酶。 [0026] 在一优选实施例中，所述固定化酶的结构为α-乙酰乳酸脱羧酶-磷酸钙-脯氨酸内切酶，其中磷酸钙为载体，每毫克载磷酸钙可固定化酶的含量为0.92-47.68mg。在本实施例中，所得到的固定化酶为α-乙酰乳酸脱羧酶-磷酸钙-脯氨酸内切酶中，磷酸钙由上述方法中的氯化钙反应得到。 [0027] 在一优选实施例中，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为4mmol/L，在所述磷酸盐缓冲溶液中，α-乙酰乳酸脱羧酶和脯氨酸内切酶的总浓度为0.1-4.8mg/ml，优选为2.4mg/ml。在本实施例中，具体限定了磷酸盐缓冲溶液的浓度以及α-乙酰乳酸脱羧酶和脯氨酸内切酶的总浓度，这主要是因为如果酶的总浓度或缓冲溶液的浓度太大或太小，均会导致生成的固定化酶的结构不具备纳米花结构，进而导致比表面积变小，催化活性变低。可以理解的是，本领域技术人员可根据实际情况在上述范围内进行合理选择，例如α-乙酰乳酸脱羧酶和脯氨酸内切酶的总浓度还可以为0.6mg/ml、1.2mg/ml、 1.8mg/ml、2.4mg/ml、3.0mg/ml、3.6mg/ml、4.2mg/ml、4.8mg/ml，当然也可以为上述范围内的其它任一值。 [0028] 在一可选实施例中，所述氯化钙溶液的浓度为0.1-0.5mol/L，优选为0.1-0.3mol/L，进一步优选为0.2mol/L。在本实施例中，限定了氯化钙溶液的浓度，这主要是考虑到氯化钙浓度的偏低或过高也均会最终得到的固定化酶产生影响，例如偏低则无沉淀产生，过高则影响固定化酶的纳米结构，从而导致比表面积变小，催化活性变低。可以理解的是，本领域技术人员可根据实际情况在上述范围内进行合理选择，例如，氯化钙溶液的浓度还可以为0.15mol/L、0.2mol/L、0.25mol/L、0.3mol/L、0.35mol/L、0.4mol/L、0.45mol/L、0.5mol/L，当然也可以为上述范围内的其它任一值。 [0029] 在一可选实施例中，所述缓冲溶液与所述氯化钙溶液的体积比为1:1-200:1，优选为30:1-80:1，进一步优选为50:1。在本实施例中，进一步限定了缓冲溶液与氯化钙溶液的体积比，这样有利于在加入到氯化钙溶液中反应生成符合要求的具有纳米花结构的固定化酶。可以理解的是，缓冲溶液与氯化钙溶液的体积比还可以为20:1、40:1、60:1、80:1、100:1、120:1、140:1、160:1、180:1、200:1，当然也可以为上述范围内的其它任一值。 [0030] 在一可选实施例中，所述设定温度为0-60℃，优选为0-40℃；反应时间为1-24小时，优选为4-18小时，进一步优选为12小时。在本实施例中，为了有利于上述方法的进行，生成符合要求的具有纳米花结构的固定化酶，还对温度和反应时间进行了优选，可以理解的是，本领域技术人员可根据实际情况进行选择，例如，设定温度还可以为10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，反应时间还可以为2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时、 24小时等，当然也可以为上述范围内的其它任一值。 [0031] 本发明另一方面的实施例提供了一种如上述任一实施例所述的双酶共固定化方法制备得到的固定化酶。由本发明实施例提供的固定化酶大大拓宽了双酶在同时工作时对pH以及温度的耐受性，从而有利于满足后续工序的操作条件。 [0032] 本发明再一方面的实施例提供了一种如上述实施例所述的固定化酶在啤酒生产过程中的应用。在本实施例中，由上述实施例制备得到的固定化酶可主要应用于啤酒生产中。在一可选实施例中，尤其适用于添加到啤酒生产过程中的清酒的最后过滤阶段中。这样在同一载体上同时固定两种酶，不仅有利于提高固定化酶的催化效率，而且还可节约固定化酶的生产成本以及使用过程中的操作成本。可以理解的是，本实施例提供的固定化酶不仅可应用到啤酒生产过程中，还可根据需要应用到其它应用中，例如饮料食品中。 [0033] 为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的双酶共固定化方法及由该方法制备得到的固定化酶，下面将结合具体实施例进行描述。其中，在下述实施例中主要对比了初始酶浓度对最终产物形态的影响，因此保持了氯化钙浓度一致。 [0034] 实施例1 [0035] 向含有25ml浓度为0.00mg/ml的α-乙酰乳酸脱羧酶和25ml浓度为0.00mg/ml的脯氨酸内切酶的PBS(4mmol/L,pH＝7.4)缓冲溶液中加入0.9ml、0.2mol/L的氯化钙溶液，于25℃反应12小时，12000rpm离心10min，并且用蒸馏水离心洗涤三次，得到不含α-乙酰乳酸脱羧酶-磷酸钙-脯氨酸内切酶(PSEP-Ca3(PO4)2–ALDC)的固定化载体，其电镜照片如图1所示。图中可见，当不含有初始酶时，形成的载体主要为堆积的片层状结构，结构偏致密，比表面积不高。 [0036] 实施例2 [0037] 向含有25ml浓度为0.05mg/ml的α-乙酰乳酸脱羧酶和25ml浓度为0.05mg/ml的脯氨酸内切酶的PBS(4mmol/L,pH＝7.4)缓冲溶液中加入0.9ml、0.2mol/L的氯化钙溶液，于25℃反应12小时，12000rpm离心10min，并且用蒸馏水离心洗涤三次，得到α-乙酰乳酸脱羧酶-磷酸钙-脯氨酸内切酶(PSEP-Ca3(PO4)2–ALDC)固定化酶，所制备得到的固定化酶中，每毫克载磷酸钙可固定化酶的含量为13.38mg，其电镜照片如图2所示。图中可见，在该初始酶浓度下，相比于不含酶的结构，片层结构疏松，比表面积增大。此时，已经固载部分的两种酶活约为游离酶活性的30％。 [0038] 实施例3 [0039] 向含有25ml浓度为1.2mg/ml的α-乙酰乳酸脱羧酶和25ml浓度为1.2mg/ml的脯氨酸内切酶的PBS(4mmol/L,pH＝7.4)缓冲溶液中加入0.9ml、0.2mol/L的氯化钙溶液，于25℃反应12小时，12000rpm离心10min，并且用蒸馏水离心洗涤三次，得到α-乙酰乳酸脱羧酶-磷酸钙-脯氨酸内切酶(PSEP-Ca3(PO4)2–ALDC)固定化酶，所制备得到的固定化酶中，每毫克载磷酸钙可固定化酶的含量为28.84mg，其电镜照片如图3所示。图中可见，在该初始酶浓度下，片层结构进一步疏松，形成蜂窝状，具备较好的纳米花结构，比表面积进一步增大。此时，已经固载部分的两种酶活约与游离酶活性基本一致，甚至比游离酶活性更高。 [0040] 实施例4 [0041] 向含有25ml浓度为2.4mg/ml的α-乙酰乳酸脱羧酶和25ml浓度为2.4mg/ml的脯氨酸内切酶的PBS(4mmol/L,pH＝7.4)缓冲溶液中加入0.9ml、0.2mol/L的氯化钙溶液，于25℃反应12小时，12000rpm离心10min，并且用蒸馏水离心洗涤三次，得到α-乙酰乳酸脱羧酶-磷酸钙-脯氨酸内切酶(PSEP-Ca3(PO4)2–ALDC)固定化酶，所制备得到的固定化酶中，每毫克载磷酸钙可固定化酶的含量为41.75mg，其电镜照片如图4所示。图中可见，在该初始酶浓度下，片层结构又偏向致密堆积形态。此时，已经固载部分的两种酶活为游离酶活性的80％左右。 |
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