[0001] 本发明涉及在延长的时期保持稳定的饮料的制备方法。

[0002] 发明背景

[0003] 混浊(haze)是饮料行业众所周知的现象。混浊可出现在啤酒、葡萄酒和果汁中。混浊形成可发生在酿造工艺期间的不同阶段。在由T.Nagodawithana和G.Reed所编的“Enzymes in food processing”，第三版，Academic press Inc.，San Diego，第V章，第
448-449页中，已提出：啤酒中的混浊是啤酒蛋白和多酚原花青素之间相互作用的结果。其中解释道：在啤酒中，混浊经常在冷却啤酒时形成。啤酒经常在冷却条件下发酵、成熟、冷稳定化并被最终包装。为了实现清澈，经常冷过滤啤酒。尽管进行了过滤，啤酒在被包装并被分销给消费者且在饮用(serving)前再次冷却之后可经常变雾浊。最后，当不冷却或不再冷却啤酒时，混浊可同样形成于其中并且可产生沉淀。混浊形成是不期望的，因为由混浊形成引起的雾浊类似于由微生物腐败产生的雾浊，这是不期望的，尤其是对于嫩啤酒(bright beers)。

[0004] WO2002/046381公开了通过向饮料中加入脯氨酸特异性内切蛋白酶来减少饮料中的混浊的方法。WO2002/046381还公开了：通过用脯氨酸特异性内切蛋白酶减少混浊，饮料中仍然存在高含量的抗氧化物，例如多酚。这些抗氧化物多酚作为健康改善成分被认为是有价值的。

[0005] WO2003/104382公开了：除了加入脯氨酸特异性内切蛋白酶以减少饮料中的混浊之外，通过向饮料中加入辅助的外切蛋白酶和/或内切蛋白酶可增加肽的溶解性，其中假定：剩余多肽与多酚之间的相互作用被进一步减少。

[0006] 除了蛋白质，多酚也被认为涉及混浊形成。蛋白质沉淀被认为由少量多酚刺激(Minussi等人，Trends in Food Science and Technology 2002，第13卷，第205-216页)。US 4,411,914公开了：啤酒的胶体稳定性可以通过加入多酚氧化酶来氧化多酚，然后除去产生的沉淀来改进。

[0007] 我们发现，单独加入脯氨酸特异性内切酶或多酚氧化酶之后，延长的储存后饮料(例如啤酒)中仍可形成混浊。

[0008] 本发明的目标是生产稳定的饮料。

[0009] 本发明涉及制备饮料的方法，所述方法包含：向所述饮料中加入脯氨酸特异性蛋白酶和多酚氧化酶，并制备所述饮料。

[0010] 有利地，已发现：同样在延长的储存之后，用脯氨酸特异性蛋白酶和多酚氧化酶处理的饮料(例如啤酒)比利用单独的一种所述酶生产的饮料中形成较少混浊。

[0011] 发明详述

[0012] 本公开涉及制备饮料的方法，所述方法包含：向所述饮料中加入脯氨酸特异性蛋白酶和多酚氧化酶，并制备所述饮料。

[0013] 当在本文中使用时，词语“饮料”包括处于其制备的所有阶段的饮料。饮料不仅是随时可消费的饮料，而且也可以是饮料的任何中间形式。饮料的中间形式可以不是完全液态的。例如，词语“饮料”包含啤酒制备中使用的麦芽汁(wort)。

[0014] 在一种实施方式中，饮料是啤酒。本文所公开的方法中的啤酒可以是由麦芽浆制备的啤酒，所述麦芽浆来自未出芽的(unmalted)谷物，以及出芽的(malted)谷物；或者所述麦芽浆来自出芽的和未出芽的谷物的混合物。可由其制备啤酒的谷物的实例是大麦和小麦。此外，可利用辅助物例如玉米、水稻或木薯来制备啤酒。本文所使用的啤酒可具有所有可能的乙醇含量，例如0-12体积/体积％之间，例如1-10体积/体积％或2-8体积/体积％之间。存在多种制备啤酒的方法，这是本领域技术人员已知的。典型地，制备啤酒的方法包含：制备麦芽浆并从所述麦芽浆中分离麦芽汁的阶段、发酵阶段、成熟阶段和稳定化阶段。一些制备啤酒的方法包含过滤啤酒的阶段。在一些方法中，发酵被称为主发酵。发酵阶段是啤酒酿造中旨在通过加入的酵母将可用糖发酵成乙醇的阶段。成熟阶段也被称为二次发酵，其旨在将不期望的风味组分例如二酮转化成更好的味觉组分。稳定化旨在促进多酚-蛋白质聚集体的形成并使能够沉淀。任选地，制备啤酒的方法包含过滤步骤，例如在稳定化之后。通常在稳定化和/或过滤之后将啤酒包装在例如瓶、罐或桶中。

[0015] 通常，可在啤酒酿造期间检查一些参数。例如，可通过测量所制备的啤酒的密度来确定发酵阶段的结束。发酵阶段的结束通常被认为是成熟阶段的开始。可通过测量啤酒中存在的二乙酰含量的量来确定成熟阶段的结束和因此稳定化阶段的开始。然而，事实上，二乙酰含量可因期望啤酒的类型而异。

[0016] 在另一实施方式中，本文所公开方法中的饮料是葡萄酒或果汁。葡萄酒通常由葡萄制备。果汁可以是由例如红莓、草莓、苹果、梨、西红柿、柑橘类水果、蔬菜等得到的汁。

[0017] 脯氨酸特异性蛋白酶和多酚氧化酶可在饮料制备中的任何合适阶段期间加入饮料中。脯氨酸特异性蛋白酶和多酚氧化酶不需要同时加入，但可以在饮料制备期间的不同阶段加入。因为多酚氧化酶的活性需要氧，所以在饮料制备中的至少某一阶段期间，饮料中必须存在氧。如果饮料是啤酒，那么可在制备啤酒方法中的发酵阶段期间加入脯氨酸特异性蛋白酶和/或多酚氧化酶。或者，可在制备啤酒方法中的发酵阶段之前加入脯氨酸特异性蛋白酶和/或多酚氧化酶。还可在制备啤酒方法中的发酵阶段之后(例如在冷稳定化阶段期间或之后)向啤酒中加入脯氨酸特异性蛋白酶和/或多酚氧化酶。

[0018] 在本文所公开方法的一种实施方式中，饮料是果汁或葡萄酒。

[0019] 在制备果汁的方法中，可在浸渍或脱果胶期间加入脯氨酸特异性蛋白酶和多酚氧化酶。

[0020] 在制备葡萄酒的方法中，可在乙醇发酵期间或之后或者在苹果乳酸发酵之后加入脯氨酸特异性蛋白酶和多酚氧化酶。

[0021] 因为混浊形成经常出现在酸性饮料例如啤酒、果汁和葡萄酒中，所以脯氨酸特异性蛋白酶和多酚氧化酶的活性的最适pH有利地为pH低于7的pH，但这不是必须的。例如，脯氨酸特异性蛋白酶的最适pH在3和7之间。多酚氧化酶的最适pH可在4和7之间。根据材料和方法部分中列出的程序测量脯氨酸特异性蛋白酶和/或多酚氧化酶活性的最适pH。

[0022] 在制备啤酒的方法中，发酵阶段开始时啤酒中的pH可为约5至6，且在发酵期间，pH经常降低至约pH 4。

[0023] 加入饮料中的脯氨酸特异性蛋白酶和多酚氧化酶的量可在宽的范围之间变化，除其它因素外，其还取决于制造饮料的起始材料(例如如果为啤酒，则起始材料为大麦、小麦)中存在的蛋白质和多酚的量。加入饮料中的脯氨酸特异性蛋白酶和多酚氧化酶的合适量可在0.1mg/l至200mg/l之间，例如0.5mg/l和100mg/l之间，例如1mg/l和50mg/l之间，0.05mg/l至10mg/l之间。

[0024] 在本说明书中，词语混浊、浊度和雾浊可互换使用。混浊、浊度或雾浊可作为蛋白质-多酚或多酚-多酚相互作用的结果而形成。

[0025] 多酚被定义为具有下述化学结构的化合物，所述化学结构包含至少两个芳环，所述芳环被至少一个羟基基团取代；或者所述化学结构包含至少一个芳环，所述芳环被至少两个羟基基团取代。多酚的实例是单宁和类黄酮，例如儿茶素、黄酮醇和花青素。

[0026] 词语肽或蛋白质在本文中可互换使用。肽或蛋白质是氨基酸单体的聚合物。

[0027] 脯氨酸特异性内切蛋白酶在本文中被定义为：在蛋白质或肽的链中包含脯氨酸-残基的位置切割蛋白质或肽的内切蛋白酶。

[0028] 来自国际生物化学与分子生物学联盟(IUBMB)的所有酶的国际认可分类和命名体制包含蛋白酶。可在IUBMB网站找到蛋白酶EC编号的更新的IUBMB文本。在这个体系中，根据催化单一反应的事实对酶进行定义。这个体系将蛋白酶分成内切蛋白酶和外切蛋白酶。内切蛋白酶是水解内部肽键的那些酶，外切蛋白酶水解邻近末端α-氨基的肽键(“氨肽酶”)或水解末端羧基和倒数第二个氨基酸之间的肽键(“羧肽酶”)。基于催化机制，内切蛋白酶被分成亚-亚类。亚-亚类有丝氨酸内切蛋白酶(EC 3.4.21)、半胱氨酸内切蛋白酶(EC 3.4.22)、天冬氨酸内切蛋白酶(EC 3.4.23)、金属内切蛋白酶(EC 3.4.24)和苏氨酸内切蛋白酶(EC 3.4.25)。WO2002/046381公开了能够由Aspergillus niger获得的脯氨酸特异性内切蛋白酶。脯氨酸特异性内切蛋白酶属于丝氨酸内切蛋白酶(EC 3.4.21)的亚类。本发明的方法中的脯氨酸特异性内切蛋白酶属于酶分类EC 3.4.21.26。

[0029] 本发明的方法中合适的脯氨酸特异性蛋白酶可以是脯氨酸特异性内切蛋白酶或脯氨酸特异性寡肽酶，优选地脯氨酸特异性内切蛋白酶。合适的脯氨酸特异性内切蛋白酶或脯氨酸特异性寡肽酶可来源于任何合适的微生物，例如Flavobacterium meningosepticum，Sphingomonas capsulata，Penicillium sp.， 例 如 Penicillium chrysogenum或Aspergillus sp.例如A.niger。

[0030] 本发明的方法中的多酚氧化酶属于E.C.酶分类E.C 1.10.3.1(儿茶酚氧化酶)、EC 1.10.3.2(漆酶)或E.C.1.14.18.1(单酚单氧化酶)。多酚氧化酶是氧化单酚或二酚或其衍生物的酶的组。多酚氧化酶广泛分布在自然界并出现在植物、细菌和真菌中。本文所公开方法中的多酚氧化酶可来源于Trametes sp.例如Trametes versicolor和Trametes villosa，Agaricus bisporus，Streptomyces coelicolor，Pleurotus sp.例如P.ostreatus，Pycnoporus，Polyporus，Myceliophthora thermophilia，Aspergillus sp，Neurospora和Bacillus sp.。

[0031] 可根据本领域已知的方法通过发酵工艺生产本文所公开的酶脯氨酸特异性蛋白酶和多酚氧化酶。为了最大化生产，可在合适的宿主生物体中表达酶，所述生物体例如是Bacillus、Pichia或Aspergillus sp.，例如Bacillus subtili、Pichia pastoris、Penicillium chrysogenum、Aspergillus niger或Aspergillus oryzae。可通过众所周知的方法从发酵液中回收酶，例如硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱。高效液相色谱(HPLC)可被用于纯化。

[0032] 在一种实施方式中，本公开还涉及通过本文所公开的方法能够得到的饮料。有利地发现：本发明的饮料是稳定的，即，与利用单独的脯氨酸特异性蛋白酶或多酚氧化酶制备的饮料相比，在储存期间形成较少混浊。附图说明

[0033] 图1.最多6个月的储存后，在H25散射角测量的20℃啤酒中的混浊。在脯氨酸TM特异性内切蛋白酶(Brewers Clarex )、多酚氧化酶(Laccase M120)、Brewers Clarex和Laccase M120存在时，或者不加入酶时(对照)制备啤酒。

[0034] 图2.最多6个月的储存后，在H90散射角测量的20℃啤酒中的混浊。在脯氨酸TM特异性内切蛋白酶(Brewers Clarex )、多酚氧化酶(Laccase M120)、Brewers Clarex和Laccase M120存在时，或者不加入酶时(对照)制备啤酒。

[0035] 图3.最多6个月的储存后，在H25散射角测量的0℃啤酒中的混浊。在脯氨酸TM特异性内切蛋白酶(Brewers Clarex )、多酚氧化酶(Laccase M120)、Brewers Clarex和Laccase M120存在时，或者不加入酶时(对照)制备啤酒。

[0036] 图4.最多6个月的储存后，在H90散射角测量的0℃啤酒中的混浊。在脯氨酸TM特异性内切蛋白酶(Brewers Clarex )、多酚氧化酶(Laccase M120)、Brewers Clarex和Laccase M120存在时，或者不加入酶时(对照)制备啤酒。
实施例

[0037] 材料&方法

[0038] 来自A.niger的脯氨酸特异性内切蛋白酶

[0039] 使用来自A.niger的脯氨酸特异性内切蛋白酶的商业样品Brewers TMClarex (5PPU/g产品)。在pH为4.6的柠檬酸盐/磷酸二钠缓冲液中，在37℃下，基于合成肽Z-Gly-Pro-pNA测量脯氨酸特异性内切蛋白酶的活性。

[0040] 采用分光光度法在405nM监测反应产物。一个单位(1PPU)被定义为：在这些试验条件下，每分钟释放1μmol对硝基苯胺的酶的量。

[0041] 多酚氧化酶

[0042] Laccase M120(不 少 于108,000POU/g产 品 )是 由 Amano Enzyme(Chipping Norton，英国)得到的多酚氧化酶。

[0043] 根据来自Amano的指示(E211：漆酶活性测试方法＝P-4AA方法)，通过监测测试条件下505nm处醌-亚胺染料吸光度的增加来测量漆酶活性。

[0044] 4-氨基-安替比林+苯酚+O2→醌-亚胺染料+H2O

[0045] 一个漆酶单位(POU)被定义为：1ml反应混合物中所含酶的量，所述反应混合物的吸光度在测试条件下以0.1/分钟的速率增加。

[0046] 浊度测量

[0047] 利用Haffman's VOS Rota 90/25双角度浊度仪或等效设备测量浊度或混浊。90°和25°这两个角度被表示为H90和H25。

[0048] 根据Analytica EBC方法9.29，使用AEPA-1标准品进行仪器校准。以EBC单位表示混浊测量的结果。

[0049] 实施例1：用脯氨酸特异性内切蛋白酶、多酚氧化酶和这两种酶的组合处理的啤酒中的混浊形成

[0050] 以中试规模生产啤酒。所有实验中的打浆(mashing)方案完全相同。在发酵开TM始时加入酶。使用单独的Brewers Clarex 和多酚氧化酶作为对照。此外，试验Brewers TM
Clarex 和多酚氧化酶的组合。在麦芽汁中12ppm的标准氧浓度下以及24ppm的双倍氧浓度下进行所有实验。发酵之后是冷成熟/稳定化和随后的过滤。然后不使用PVPP或二氧化硅将啤酒装瓶并储存在20℃。

[0051] 在以下条件下测定啤酒混浊：20℃和0℃且60℃下强化(forcing)6天随后在0℃冷却过夜。

[0052] 于20℃储存以及于0℃冷却24小时数月后测量实时保质期。

[0053] 如上所示测量啤酒的浊度。

[0054] 强化之后，与利用单独的脯氨酸特异性内切蛋白酶(Brewers ClarexTM)或多酚氧化酶制造的啤酒相比，利用脯氨酸特异性内切蛋白酶和多酚氧化酶的组合制造的啤酒具有较低浊度。

[0055] 实施例2：用脯氨酸特异性内切蛋白酶、多酚氧化酶和这两种酶的组合处理的啤酒中的混浊形成

[0056] 根据标准的酿造程序，以中试规模生产啤酒。使用2013年收获的100％Pilsner Malt。该麦芽代表高品质麦芽。研磨之后，将麦芽转移至麦芽浆转化容器。使用如下所示的标准打浆模式提取麦芽：

[0057] 62℃5分钟，

[0058] 66℃30分钟，

[0059] 72℃20分钟，

[0060] 在78℃下泵醪(mashing off)持续5分钟。

[0061] 泵醪之后，随后通过Lautertun过滤麦芽浆并煮沸产生的麦芽汁。使用Polaris Pellets 90型计算至30BU。

[0062] 煮沸之后，冷却麦芽汁。加酵母用的麦芽汁(pitching wort)为12°P。使氧水平达到12ppm，这对于12°P麦芽汁是正常水平。通过加入标准酿造酵母启动发酵。在12℃持续发酵直至表观浸出物≤3.5％。然后，将温度增加至室温用于二乙酰休止(rest)2-3天直至二乙酰水平<0.1mg/l。随后的成熟阶段为在0℃下持续一周。之后，对啤酒进行过滤、通以二氧化碳、装瓶并巴氏灭菌。

[0063] 进行下述试验：

[0064] 1.不加入酶的对照

[0065] 2. 3g/Hl的Brewers Clarex

[0066] 3. 0.3g/Hl的Laccase M120

[0067] 4. 3g/Hl的Brewers Clarex和0.3g/Hl的Laccase M120

[0068] 氧化处理之后，向加酵母用的麦芽汁中加入酶。

[0069] 在20℃下储存瓶子，每个月在20℃和0℃下测量啤酒中的混浊。对于0℃下的测量，首先将瓶子在0℃下储存24小时。使用如上所述的Haffman’s VOS Rota 90/25双角度浊度仪进行所有的混浊测量。结果如图1至4中所示，其显示：与利用单独的Brewers Clarex或Laccase生产的啤酒的混浊值相比，利用Brewers Clarex和Laccase M120生产的啤酒在延长的时期具有较低的混浊值。

[0070] 实施例3：用脯氨酸特异性内切蛋白酶、多酚氧化酶和这两种酶的组合处理的啤酒中的多酚

[0071] 以中试规模生产啤酒。所有实验中的打浆方案完全相同。在发酵开始时加入脯氨酸特异性内切蛋白酶和多酚氧化酶的组合。作为对照，向发酵中加入单独的脯氨酸特异性内切蛋白酶或多酚氧化酶。在麦芽汁中12ppm的标准氧浓度下并在24ppm的双倍氧浓度下进行所有实验。发酵之后是冷成熟和随后的过滤。

[0072] 分析啤酒中的多酚。

[0073] 利用Brewers Clarex和多酚氧化酶的组合制造的啤酒在最终的啤酒中显示出较低的多酚含量。