[0001] 序列表的引用

[0002] 本申请包含一个计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。发明领域

[0003] 本发明涉及用于酿造的麦芽汁及非酒精饮料。更具体地，本发明涉及用于制备大麦基的饮料的方法，这些方法使用各种酶，包括不同外源性蛋白酶。

[0004] 发明背景

[0005] 啤酒酿造中的一个重要步骤是通过酵母发酵麦芽汁，这需要存在酵母营养性化合物，包括糖和氮。可以被酵母同化的麦芽汁氮的来源主要是氨基酸、铵离子以及在较小程度上的二肽和三肽。由于各种酶活性，例如包括大麦蛋白酶对大麦醇溶蛋白类的贮存蛋白的作用，这些物质在麦芽制造过程中部分地形成，并且在淀粉糖化过程中部分地形成(O’Connor-Cox(奥康纳-考克斯)和Ingledew(英格杜)，1989,ASBC Journal(ASBC杂志)，第47卷，102-108)。

[0006] 氨基酸被酵母区别地吸收，这导致氨基酸的以下分类。

[0007]组A-快速吸收 Glu、Asp、Asn、Gln、Ser、Thr、Lys、Arg
组B-中级吸收 Val、Met、Leu、Ile、His
组C-缓慢吸收 Gly、Phe、Tyr、Trp、Ala
组D-极少或没有吸收 Pro

[0008] 有时将麦芽汁氮确定为FAN(游离氨基氮)。FAN包括所有的游离伯胺并且因此还包括核苷酸胺以及其他不是氨基酸的化合物。

[0009] 已经生产了各种酶来协助自100％大麦制备麦芽汁-即，在没有麦芽的情况下-这也适于酿造。这样的一种酶混合物的一个实例是Ondea ProTM(诺维信公司(Novozymes A/S)，丹麦)。Ondea Pro包括以下酶活性：

[0010] 淀粉降解活性

[0011] 蛋白降解活性

[0012] 细胞壁降解活性

[0013] 脂质降解活性

[0014] 使用Ondea Pro制备自100％大麦的麦芽汁包括9-14mg/L/Plato FAN并且展示出与麦芽基的麦芽汁的发酵性能可比较的发酵性能，这在很大程度上落入推荐的10-18mg/L/Plato的较低的范围内(Aastrup(艾斯卓普)，2010,Scandinavian Brewer’s Review(斯堪的纳维亚酿酒评论)，第67卷，第28-33页)。

[0015] WO 2009/074650描述了一种生产酿酒麦芽汁的方法，该方法包括酶处理包含高达100％未发芽谷物的麦芽粉。该方法包括使醪液与外源性酶接触，这些外源性酶包括α-淀粉酶活性、普鲁兰酶活性、蛋白水解活性、脂解活性以及β-葡聚糖酶活性。取决于蛋白水解活性，在100％大麦麦芽汁中达到高达约10mg/L/Plato的FAN水平。

[0016] JP 2008109861描述了一种用于生产麦芽汁的方法，该方法由使用具有减少量的内切蛋白酶和增加量的外肽酶的蛋白酶表征。内切蛋白酶可以是丝氨酸型碱性蛋白酶、中性金属蛋白酶I或中性金属蛋白酶II。外肽酶可以是亮氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶或X-脯氨酰基二肽基氨肽酶。

[0017] 发明概述

[0018] 在一个方面中，本发明涉及一种制备包含高水平的游离氨基酸的麦芽汁的方法，所述方法包括以下步骤

[0019] a)在外源性酶的存在下淀粉糖化一种包含大麦的组合物，这些外源性酶包括α淀粉酶、β葡聚糖酶、普鲁兰酶、木聚糖酶及脂肪酶；并且

[0020] b)在淀粉糖化过程中或在淀粉糖化完成以后，向所述组合物中添加至少两种不同的外源性蛋白酶，其中一种蛋白酶具有内切蛋白酶活性并且另一种蛋白酶具有外肽酶活性。

[0021] 在一个方面中，将外源性蛋白酶添加至麦芽汁中。

[0022] 在一个方面中，将麦芽汁转化为啤酒。

[0023] 在一个方面中，本发明涉及在制造麦芽汁中使用至少2种不同的外源性蛋白酶。

[0024] 在一个方面中，具有内切蛋白酶活性的蛋白酶是一种金属蛋白酶。

[0025] 在又另一个方面中，该金属蛋白酶是一种与SEQ ID NO:1具有60％一致性的蛋白酶。

[0026] 在另一个方面中，具有内切蛋白酶活性的蛋白酶是一种脯氨酸和/或谷氨酰胺内切蛋白酶。

[0027] 在一个方面中，具有外肽酶活性的蛋白酶具有脯氨酸特异性活性。

[0028] 在另一个方面中，具有外肽酶活性的蛋白酶具有羧基脯氨酸特异性活性。

[0029] 在又另一个方面中，具有外肽酶活性的蛋白酶具有氨肽酶活性。

[0030] 在又另一个方面中，具有外肽酶活性的蛋白酶具有羧肽酶活性。

[0031] 在一个方面中，产生的麦芽汁包括高水平的游离氨基酸，这些游离氨基酸包括脂肪族氨基酸。

[0032] 在另一个方面中，产生的麦芽汁包括高水平的游离氨基酸，这些游离氨基酸属于组B，即中级吸收的氨基酸。

[0033] 在又另一个方面中，产生的麦芽汁包括高水平的游离氨基酸，这些游离氨基酸包括但不限于缬氨酸、异亮氨酸和/或亮氨酸。

[0034] 发明详细说明

[0035] 酿造过程是本领域中熟知的，并且通常涉及麦芽制造(malting)、淀粉糖化(mashing)和发酵的步骤。淀粉糖化是将来自磨碎的大麦麦芽和固体辅料的淀粉转化为可发酵的和不可发酵的糖类，以产生所希望的组合物的麦芽汁的过程。传统的淀粉糖化涉及将磨碎的大麦麦芽及辅料与水在设定的温度和体积下混合并孵育以使在麦芽制造过程中开始的生物化学变化得以继续。淀粉糖化过程在恒温(等温淀粉糖化)或例如以顺序方式逐渐增加至不同温度下进行一段时间以激活负责降解蛋白质和碳水化合物的内源性酶。到目前为止，在淀粉糖化中发生的最重要的变化是麦芽/大麦/辅料中的可溶性物质释放进入液体馏分以及淀粉分子转化为可发酵糖。

[0036] 在传统的淀粉糖化过程中，负责淀粉转化的主要酶是α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡聚糖酶。α-淀粉酶通过将淀粉分子分裂成许多能被β-淀粉酶攻击的更短的链而非常迅速地降解不可溶的淀粉和可溶的淀粉。产生的二糖为麦芽糖。除了在淀粉糖化过程中形成的麦芽糖之外，还产生短的支链葡萄糖寡聚物。这些短的支链葡萄糖寡聚物是非可发酵糖并且增加味道以及成品啤酒的卡路里量。

[0037] 淀粉糖化之后，当所有的淀粉已经被分解，就必须将液体提取物(麦芽汁)与残余的固体(酒糟)分离，例如通过过滤。麦芽汁分离(滤清(lautering))是重要的，因为固体含有大量蛋白、变性不足的淀粉、脂肪材料、硅酸盐及多酚(鞣酸)。滤清之前，可以将醪液温度升高至约75℃-78℃(165°F-173°F)(称为煮浆(mashing-off))。以此方式获得的麦芽汁也可以被称为“第一麦芽汁(first wort)”。收集第一麦芽汁后留在酒糟中的提取物通过在滤清饼(lauter cake)的顶部添加热水也可以被洗出。这一过程被叫做喷洒(sparging)。热水流过酒糟并溶解剩余的提取物。稀释的麦芽汁被叫做第二麦芽汁并且其提取物从第一麦芽汁的原始比重下降至例如1％-2％。用于制备麦芽汁的适合程序的非限制性实例例如由Briggs(布里格斯)等人，“Malting and brewing science,Volume I Malt and sweet wort(麦芽制造与酿造科学，第I卷，麦芽与甜麦芽汁)”，Chapman and Hall(查普曼和霍尔)，纽约，美国，ISBN 0412165805(1981)及Hough(霍夫)等人，“Malting and brewing science,Volume II Hopped wort and beer(麦芽制造与酿造科学，第II卷，加过啤酒花的麦芽汁与啤酒)”，查普曼和霍尔，纽约，美国，ISBN 0412165902(1981)描述。

[0038] 添加啤酒花后，煮沸麦芽汁。由此，许多物质(包括若干蛋白质)变性并且将发生多酚的沉淀。冷却并除去沉淀物后，可以为麦芽汁充气并用酿酒酵母发酵，以产生啤酒。典型地持续5-10天的主发酵后，除去大部分酵母并且获得所谓的生啤(green beer)。将生啤在低温下，典型地在0-5℃下储存1至12周。在这一时期过程中，剩余的酵母将与多酚一起沉淀。为了除去剩余的过量多酚，进行过滤以获得发酵啤酒。可以在装瓶之前将发酵啤酒碳化。二氧化碳不仅有助于感观的“丰满(fullness)”或“大量(body)”并且作为一种增味剂，它还作为发泡潜力的增强剂而起作用并且在延长产品的货架期中发挥重要作用。关于常规的酿造方法的另外的信息可以发现于沃尔夫冈·坤泽(Wolfgang Kunze)的Research and Teaching Institute of Brewing(酿造的研究与教学研究所)，柏林(VLB)，第二次修订版1999，ISBN 3-921690-39-0的“Technology Brewing and Malting(酿造与麦芽制造技术)”中。

[0039] 诸位发明人已经出人意料地发现制备自未发芽大麦的麦芽汁-(即使用像Ondea Pro(可获得自诺维信公司)的酶混合物处理过的)-包括非常低水平的游离氨基酸。有趣地，诸位发明人此外发现增加麦芽汁中并且特别是制备自未发芽大麦的麦芽汁中的游离氨基酸的水平是有利的。增加水平的游离氨基酸导致显著改善的酵母生长。

[0040] 另外，诸位发明人已经出人意料地发现增加脯氨酸(一种在发酵过程中被酵母吸收极少或不吸收的组D氨基酸)以及其他游离氨基酸的水平是有利的，特别是当麦芽汁制备自未发芽大麦时。

[0041] 另外，诸位发明人已经出人意料地发现根据本发明的方法使用两种不同的外源性蛋白酶导致增加的游离氨基酸水平但是不影响产生的啤酒的泡沫稳定性。

[0042] 因此，在一个方面中，本发明涉及一种制备包含高水平的游离氨基酸的麦芽汁的方法，所述方法包括以下步骤

[0043] a)在外源性酶的存在下淀粉糖化一种包含大麦的组合物，这些外源性酶包括α淀粉酶、β葡聚糖酶、普鲁兰酶、木聚糖酶及脂肪酶；并且

[0044] b)在淀粉糖化过程中或在淀粉糖化完成以后，向所述组合物中添加至少两种不同的外源性蛋白酶，其中一种蛋白酶具有内切蛋白酶活性并且另一种蛋白酶具有外肽酶活性。

[0045] 如在此使用，“一个/种(a)”可以意指一个(种)或多个(种)，取决于其使用的上下文。

[0046] 将术语“麦芽汁”理解为在淀粉糖化过程中提取麦芽粉后流出的未发酵液体。

[0047] 将术语“麦芽粉”理解为含有作为啤酒生产的基础的材料的淀粉或糖，例如但不限于大麦芽和辅料。通常，麦芽粉不含有任何添加水。

[0048] 将术语“麦芽”理解为任何发芽的谷物，特别是大麦。

[0049] 将术语“辅料”理解为麦芽粉的非麦芽部分。辅料可以是任何富淀粉植物材料，例如但不限于玉米、水稻、高粱及小麦并且还包括容易发酵的糖和/或糖浆。一些辅料的淀粉具有相对较低的糊化温度，这使得它们能够与麦芽一起淀粉糖化，而其他辅料(例如水稻、玉米和高粱)具有较高的糊化温度，此类辅料在将其添加至醪液中之前典型地分开地煮熟并用α-淀粉酶液化。可以在淀粉糖化之前将辅料糊化或它们可以照原样添加至麦芽粉中。

[0050] 在一个方面中，在淀粉糖化之前，辅料未被糊化。

[0051] 将术语“醪液”理解为含有麦芽粉的浆液的淀粉，麦芽粉包含浸泡在水中以制造麦芽汁的压碎的大麦芽、压碎的未发芽谷粒、其他含淀粉材料或其组合。“淀粉糖化”是将醪液中的淀粉转化为可发酵的和不可发酵的糖的过程。

[0052] 在此将术语“啤酒”理解为发酵的麦芽汁，即酿造自大麦芽，任选地辅料及啤酒花的酒精饮料。如在此使用，术语“啤酒”旨在至少覆盖制备自以下各项的啤酒：制备自未发芽谷物的醪液连同所有制备自发芽的谷物的醪液，以及所有制备自发芽的与未发芽的谷物的混合物的醪液。术语“啤酒”还覆盖制备自辅料的啤酒，以及具有所有可能酒精度的啤酒。

[0053] 可以在淀粉糖化过程中使用常规的机械、设备及材料。在淀粉糖化之前，将麦芽粉与水混合。优选地，添加至麦芽粉之前，可以将水预热，以便在醪液形成的时刻醪液便达到所希望的醪液温度。如果形成的醪液的温度低于所希望的淀粉糖化温度，优选供给另外的热量以达到所希望的工艺温度。优选地，所希望的淀粉糖化温度在醪液形成后15分钟内，或更优选地，在10分钟内，例如在9、8、7、6、5、4、3、2分钟内，或甚至更优选地，在1分钟内达到，或最优选地，在醪液形成时达到所希望的淀粉糖化温度。淀粉糖化过程通常应用温度的受控分段增加，其中每个步骤都偏好一个酶促作用超过另一个，最终降解蛋白质、细胞壁及淀粉。淀粉糖化温度特征曲线在本领域通常是已知的。

[0054] 淀粉糖化过程的温度特征曲线可以是一个来自常规的淀粉糖化过程特征曲线，其中设置温度以达到由麦芽酶最佳降解麦芽粉干物质。

[0055] 麦芽优选来源于选自以下列表的谷物中的一种或多种，该列表包括玉米(玉蜀黍属)、大麦(大麦属)、小麦(小麦属)、黑麦(黑麦属)、高粱(高粱属)、粟(例如狼尾草属、狗尾草属、黍属、蟋蟀草属)、燕麦(燕麦属)、小大麦(Tritordeum)(小麦-大麦杂交体)、黑小麦(Triticale)(黑麦-小麦杂交体)以及水稻(rice、orzya)。优选地，麦芽是大麦芽。麦芽粉可以包括发芽的谷物。

[0056] 麦芽粉可以优选包括辅料，例如未发芽玉米，或其他未发芽谷物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、水稻、高粱(milo)、粟和/或高粱(sorghum)，或未加工和/或精制淀粉和/或含有来源于植物的材料的糖，这些植物是像小麦、黑麦、燕麦、玉米、水稻、高粱(milo)、粟、高粱、马铃薯、甘薯、木薯、木薯淀粉、西米、香蕉、甜菜和/或甘蔗。辅料可以获得自块茎、根、茎、叶、豆类、谷类和/或完整谷物。优选的是获得自玉米和/或水稻的辅料，更优选的，辅料是玉米。醪液优选包括从1％至80％，优选从5％至80％，更优选从10％至80％，并且甚至更优选从30％至80％的辅料淀粉，最优选从30％-60％，并且甚至最优选从
40％-60％。

[0057] 术语“一致性”或“序列一致性”是两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德曼和翁施，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的一致性程度，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends in Genetics)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序所实施的。所使用的这些任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

[0058] (一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

[0059] 术语“外源性”在此用于指示添加至一种具体组合物中，但是不天然地形成所述组合物的一部分的化合物。举例来说，当添加至大麦提取物(例如麦芽汁)中时，将分离的酶认为是外源性的。

[0060] 本发明还提供了用于制备具有高水平的游离氨基酸的麦芽汁的方法。

[0061] 本发明还提供了使用具有高水平的游离氨基酸的麦芽汁用于制备大麦基的饮料的方法。

[0062] 根据本发明的包含大麦的组合物可以包括任何种类的大麦。大麦可以是发芽的或未发芽的。然而，优选的是麦芽汁或大麦基的饮料制备自大麦，其中大比例的所述大麦是未发芽大麦。因此，优选的是所述大麦基的饮料或所述麦芽汁制备自一种包含大麦的组合物，其中所述大麦由至多30％发芽大麦，优选至多20％发芽大麦，甚至更优选至多10％发芽大麦组成，又更优选地，所述组合物不包括发芽大麦。

[0063] 除了所述发芽和/或未发芽大麦之外，上述组合物还可以包括一种或多种辅料。因此，除了所述大麦之外，该组合物还可以包括一种，如2种，例如3种，如4种，例如5种，如多于5种不同辅料。所述辅料优选是富碳水化合物的并且可以例如选自下组，该组由以下各项组成：不同于大麦的谷类、糖浆及糖，例如来自由玉米和水稻辅料组成的组。不同于大麦的所述谷类可以例如选自萌芽或未萌芽谷类组成的组，其中所述谷类例如可以选自下组，该组由以下各项组成：小麦、水稻、玉米、黑麦、燕麦、高粱、小大麦和黑小麦，例如来自由小麦和黑麦组成的组。

[0064] 辅料还可以包括容易发酵的碳水化合物，例如糖或糖浆，并且它们可以在本发明的淀粉糖化过程之前、之中或之后添加至麦芽醪液中但是优选在淀粉糖化过程之后添加。

[0065] 形成醪液之前，麦芽和/或辅料优选被磨碎并且最优选是干磨或湿磨。

[0066] 在一个方面中，该辅料对于例如玉米、水稻和高粱而言具有高的糊化温度，更具体而言较高的起始糊化温度。在一个方面中，在淀粉糖化之前，辅料被糊化。在另一个方面中，在淀粉糖化之前，辅料未被糊化。

[0067] 在一个方面中，醪液包括至少20％的辅料，这些辅料具有至少65℃的淀粉糊化温度，优选起始糊化温度。在另一个方面中，醪液包括至少25％，例如至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％，如至少65％辅料，这些辅料具有至少65℃的淀粉糊化温度，优选起始糊化温度。

[0068] 优选地，这些辅料具有高糊化温度。更具体地，这些辅料具有高的起始糊化温度。

[0069] 在本发明的一个方面中，辅料是一种包含高和低糊化温度辅料的混合物。

[0070] 当加热淀粉粒的水溶液时，颗粒膨胀以形成糊。这一过程被叫做“糊化”。糊化发生的温度被叫做“糊化温度”。由于辅料中的淀粉的复杂性质并且还有淀粉糖化过程中的条件，糊化实际在特定温度范围内发生。糊化温度范围因此可以由“起始糊化温度”、“峰值糊化温度”和“结束糊化温度”表征。例如，对于玉米淀粉而言，起始糊化温度是大约62℃(峰值：67℃，结束：72℃)，并且对于水稻淀粉而言，起始糊化温度是大约68℃(峰值：74.5℃，结束：78℃)(Starch(淀粉)，第2版Industrial microscopy of starch by Eileen Maywald Snyder(艾琳迈瓦尔德斯奈德的淀粉的工业显微术))。初始糊化温度可以根据植物种类、植物种类的具体品种、以及生长条件而变化。

[0071] 糖浆可以是任何糖浆，但是优选的是所述糖浆含有麦芽糖。在优选实施例中，糖浆可以是制备自谷类的糖浆，例如大麦糖浆。糖浆还可以制备自发芽谷类(例如大麦)，并且因此，糖浆可以是大麦芽糖浆。优选的是除了水之外，糖浆含有40％至90％范围内的麦芽糖。

[0072] 根据本发明的制备包含高水平的游离氨基酸的麦芽汁的方法包括任选在一种或多种外源性酶的存在下淀粉糖化的步骤。优选的是在至少一种，优选至少2种，又更优选至少3种，甚至更优选至少4种外源性酶的存在下进行淀粉糖化。所诉外源性酶可以是描述于以下“外源性酶”部分的任何酶。

[0073] 具体地，在其中所述组合物的所述大麦包括大比例的未发芽大麦的本发明的实施例中，例如在其中所述大麦由至多30％发芽大麦，优选至多20％发芽大麦，甚至更优选至多10％发芽大麦组成，又更优选所述组合物不包括发芽大麦的本发明的实施例中，则优选的是至少一种，优选至少2种，又更优选至少3种，甚至更优选至少4种外源性酶，甚至更优选至少5种外源性酶的存在下进行淀粉糖化，其中所述外源性酶可以是描述于以下“外源性酶”部分的任何外源性酶。

[0074] 可以在淀粉糖化的任何时候和/或淀粉糖化之前添加所述外源性酶，并且因此外源性酶可以存在于整个淀粉糖化步骤过程中或仅存在于其一部分过程中。因此，可以在形成醪液之前、之中或之后，将外源性酶添加至醪液成分中，例如水和/或包含大麦的组合物。优选的是在淀粉糖化开始时添加所述外源性酶，以便它们存在于整个淀粉糖化过程中。外源性酶可以一起或分开添加。

[0075] 根据本发明的方法还包括使用至少两种不同的外源性蛋白酶，这些外源性蛋白酶可以是描述于以下“外源性蛋白酶”部分的任何外源性蛋白酶。可以在淀粉糖化之前或过程中或淀粉糖化完成之后单独地添加所述外源性蛋白酶，或添加至在滤清之后或加热麦芽汁之后立即获得的麦芽汁中。在本发明的实施例中，可以在热处理麦芽汁后将至少一种，如至少两种，例如所有不同的蛋白酶添加至麦芽汁中。还可以在热处理后立即添加它们。然而，优选地，一旦允许麦芽汁冷却至一定温度便添加它们，其中所述外源性蛋白酶不是热灭活的，例如冷却至以下温度：至多80℃，如至多70℃，如至多60℃，如至多50℃，如至多40℃，例如至多30℃，如至多20℃。在某些实施例中，可以在发酵开始时同时添加所述蛋白酶与酵母。在其中外源性蛋白酶不是热稳定的本发明的实施例中，优选的是在淀粉糖化开始时或淀粉糖化完成之后添加它们，优选在加热麦芽汁的步骤之后(参见下文)。然而，也可以在淀粉糖化开始时或淀粉糖化过程中或淀粉糖化之后添加它们，这可能在其中外源性蛋白酶是热稳定的本发明的实施例中是特别相关的。在优选实施例中，还可以在酿造周期的2个不同步骤或时间点添加外源性蛋白酶，例如可以在淀粉糖化过程中添加一种或多种蛋白酶而在淀粉糖化完成后添加另外一种或多种蛋白酶。

[0076] 因此，在本发明的一个实施例中，使用一种方法制备麦芽汁，其中初始淀粉糖化温度不超过70℃，例如初始淀粉糖化温度可以在30℃至69℃的范围内，例如在35℃至65℃的范围内。

[0077] 在本发明的优选实施例中，淀粉糖化过程中的温度不超过80℃。

[0078] 淀粉糖化后获得的麦芽汁也可以被称为“甜麦芽汁”。在常规方法中，将甜麦芽汁与或不与啤酒花煮沸，然后它可以被称为煮沸的麦芽汁。

[0079] 可以任选地在淀粉糖化之后加热所述麦芽汁。可以将麦芽汁加热/煮沸任何适合的时间量，通常在60min至120min的范围内，以便蒸发至少5％并且一些情况下甚至高达25％的麦芽汁体积。由于多种原因，延长的煮沸有时可能是不希望的，例如因为延长的煮沸需要明显的能源供应。

[0080] 麦芽汁组合物还可以是大麦麦芽汁。通常，麦芽汁组合物含有高含量的氨基氮和可发酵碳水化合物，后者主要是麦芽糖。

[0081] 根据本发明的麦芽汁优选具有高水平的游离氨基酸。所述高水平的游离氨基酸优选处于至少3mM游离氨基酸的水平。

[0082] 在一个实施例中，麦芽汁可以是甜麦芽汁，即未经受热处理的麦芽汁。优选的是所述甜麦芽汁包括至少3mM，例如至少4mM、例如至少5mM、例如至少6mM、例如至少7mM、例如至少8mM、例如至少9mM、例如至少10mM、例如至少11mM、例如至少12mM游离氨基酸。

[0083] 甚至在其中所述组合物的所述大麦包括大比例的未发芽大麦的本发明的实施例中，例如在其中所述大麦由至多30％发芽大麦，优选至多20％发芽大麦，甚至更优选至多10％发芽大麦组成，又更优选在所述组合物不包括发芽大麦的本发明的实施例中，则优选的是所述甜麦芽汁包括至少3mM，例如至少4mM、例如至少5mM、例如至少6mM、例如至少7mM、例如至少8mM、例如至少9mM、例如至少10mM、例如至少11mM、例如至少12mM游离氨基酸。

[0084] 麦芽汁还可以是煮沸的麦芽汁，在这种情况下，该麦芽汁优选包括至少3mM，例如至少4mM、例如至少5mM、例如至少6mM、例如至少7mM、例如至少8mM、例如至少9mM、例如至少10mM、例如至少11mM、例如至少12mM游离氨基酸。

[0085] 氨基酸对最终啤酒的品质具有非常实质的影响。例如，如果缺乏缬氨酸，则酵母经常通过涉及乙酰乳酸作为中间体的途径合成缬氨酸。乙酰乳酸可以积累并且氧化地分解为双乙酰，这可能形成不希望的风味。因此，优选的是根据本发明的麦芽汁包括高水平的游离缬氨酸，具体地，优选的是所述麦芽汁在与所述至少两种不同的外源性蛋白酶一起孵育之后包括高水平的游离缬氨酸。游离缬氨酸的所述高水平优选是至少35mg/L，如至少40mg/L、如至少45mg/L、如至少50mg/L、如至少55mg/L、如至少60mg/L、如至少65mg/L、如至少70mg/L、如至少80mg/L，例如至少100mg/L。在另一个方面中，优选的是根据本发明的麦芽汁包括高水平的游离异亮氨酸，具体地，优选的是所述麦芽汁在与所述至少两种不同的外源性蛋白酶一起孵育之后包括高水平的游离异亮氨酸。在另一个方面中，优选的是根据本发明的麦芽汁包括高水平的游离亮氨酸，具体地，优选的是所述麦芽汁在与所述至少两种不同的外源性蛋白酶一起孵育之后包括高水平的游离亮氨酸。在另一个方面中，优选的是根据本发明的麦芽汁包括高水平的游离的组B氨基酸，具体地，优选的是所述麦芽汁在与所述至少两种不同的外源性蛋白酶一起孵育之后包括高水平的游离的组B氨基酸。

[0086] 根据本发明制备的麦芽汁的一个主要优点在于与通过常规方法制备的麦芽汁相比，所述麦芽汁在支持酵母生长方面是优越的。

[0087] 具体地，优选的是与在不添加外源性酶的情况下以相同方式制备的麦芽汁相比，根据本发明制备的麦芽汁以一种方式支持酵母生长，这样使得将酵母接种至所述麦芽汁后28h，所述麦芽汁包括至少105％，如至少110％，例如至少120％，例如至少130％酵母细胞/ml。

[0088] 因此，优选的是与在不添加外源性酶的情况下以相同方式制备的麦芽汁相比，根5
据本发明制备的麦芽汁以一种方式支持酵母生长，这样使得将酵母以1 x 10 个细胞/ml的密度接种至所述麦芽汁后28h，所述麦芽汁包括至少105％，如至少110％，例如至少120％，例如至少130％酵母细胞/ml。

[0089] 优选地，与正常嘉士伯比尔森啤酒(Carlsberg Pilsner)(可获得自嘉士伯啤酒厂(Carlsberg Breweries)，丹麦)相比，本发明的饮料在40至50min内产生至少100％，优选至少150％，如至少200％的泡沫。根据本发明的这样一种饮料可以具体是一种制备自包含大麦的组合物的饮料，其中所有的所述大麦都是未发芽的。

[0090] 在另一个优选的实施例中，将一种或多种另外的酶添加至醪液中，所述一种或多种酶包括但不限于α淀粉酶、异淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、漆酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、植酸酶、普鲁兰酶以及酯酶。

[0091] 在一个方面中，该外源性酶是α淀粉酶。

[0092] 在另一个方面中，该外源性酶是β葡聚糖酶。

[0093] 在又另一个方面中，该外源性酶是普鲁兰酶。

[0094] 在另一个方面中，该外源性酶是木聚糖酶。

[0095] 在又另一个方面中，该外源性酶是脂肪酶。

[0096] 可以将这些酶作为酶组合物而添加。它们可以由一种酶或多于一种酶或多于一种酶组合物组成。除了这一种或多种酶之外，酶组合物还可以含有至少一种其他物质，例如但不限于还缓冲液、表面活性剂等。酶组合物可以出于任何本领域公认的形式，例如固体、液体、乳液、凝胶或糊。此类形式是本领域的普通技术人员已知的。在本发明的一个方面中，可以添加多于一种酶组合物，每种组合物都含有不同酶。在本发明的另一个方面中，可以添加一种酶组合物，该组合物含有所有必需酶。在本发明的又另一个方面中，可以添加一种酶组合物(含有一些酶)以及至少一种另一组合物(含有一些或所有剩余的酶)。可以同时或按顺序一个接一个地或甚至作为两种酶的组合与一种酶分开地一个接一个地添加这些酶。

[0097] 在淀粉糖化过程中，从麦芽粉中提取的淀粉逐渐地水解为可发酵的糖和更小的糊精。优选地，该醪液在提取麦芽汁之前对于碘测试是淀粉阴性的。通过在以下温度下煮浆(mashing-off)来结束淀粉糖化：70℃或更高，优选至少71℃、至少72℃、至少73℃、至少74℃、至少75℃、至少76℃至少77℃、至少78℃、至少79℃、至少80℃并且更优选至少81℃或甚至至少82℃或更高。

[0098] 从醪液中获得麦芽汁典型地包括从酒糟，即不可溶谷物和形成麦芽粉的一部分的壳料中精滤(straining)麦芽汁。可以使热水穿过酒糟以清洗或喷洒任何剩余的来自麦芽粉的提取物。任选地，在本发明的方法中应用热稳定的纤维素酶导致β葡聚糖水平的有效减少，有助于麦芽汁精滤，从而确保减少的周期时间和高提取物回收。优选地，提取物回收是至少80％，优选至少81％，更优选至少82％，甚至更优选至少83％，例如至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％，并且最优选至少91％。可以将麦芽汁照原样使用，或它可以被浓缩和/或干燥。可以将浓缩的和/或干燥的麦芽汁用作酿造提取物、用作麦芽汁调味品、用于非酒精麦芽饮料、麦芽醋、早餐谷物食品、用于糖果等。

[0099] 还可以将麦芽汁加工为用作糖浆。还可以使用它来生产非酒精饮料。这些方法是本领域的普通技术人员已知的。

[0100] 还可以将麦芽汁加工成非酒精饮料。一个非限制性实例披露于例如WO2010/106170中。

[0101] 还可以将麦芽汁发酵为啤酒。优选的啤酒类型包括爱尔啤酒(ale)、烈性爱尔啤酒、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、出口啤酒、麦芽酒(malt liquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒、或清淡啤酒。麦芽汁的发酵还可以包括以含有新鲜酵母，即先前未曾用于本发明的酵母或其可为回收酵母的酵母浆投入麦芽汁。应用的酵母可以为适于碑酒酿造的任何酵母，尤其是选自酵母属的酵母，例如酿酒酵母和葡萄汁酵母，包括这些有机体的天然或人工产生的变体。用于生产啤酒的麦芽汁的发酵方法是本领域的普通技术人员熟知的。

[0102] 由麦芽汁生产啤酒的第一步优选涉及如上所述加热所述麦芽汁，然后是随后阶段的麦芽汁冷却和任选地漩涡静置。冷却后，将麦芽汁转移至含有酵母的发酵罐中。优选地，所述酵母是酿酒酵母-卡氏酵母。将麦芽汁发酵并熟化任何适合的时间段，通常在1至100天的范围内。在若干天长的发酵过程中，伴随一些风味物质的产生，糖被转化为醇和CO2。

[0103] 因此，根据本发明的方法优选包括在至少一种能够发酵大麦麦芽汁的酵母的存在下孵育所述麦芽汁的步骤，该麦芽汁可以是如上所述的任何麦芽汁。这一步骤优选在加热麦芽汁后进行。在本发明的优选实施例中，可以在与酵母的所述孵育之前或过程中添加所述外源性蛋白酶，优选地，在与酵母的所述孵育开始时添加它们。

[0104] 所述酵母可以是能够发酵所述麦芽汁的任何有用的酵母，如酿酒酵母，例如卡氏酵母。

[0105] 如上所述，根据本发明方法制备的麦芽汁尤其可用于支持酵母生长。因此，根据本发明的方法具有减少的发酵时间是可能的。因此，优选的是将与酵母的孵育进行至多15天，例如至多10天。

[0106] 制备啤酒后，可以将啤酒进一步加工，例如被冷冻。它还可以被过滤和/或库存-一种产生宜人的香气和更少的酵母味的过程。还可以添加添加剂。此外，可以添加CO2。最后，在啤酒被包装(例如装瓶或装罐)之前，可以将其巴氏杀菌和/或过滤。

[0107] 可以向发酵的麦芽汁中添加硅水凝胶，以增加啤酒的胶体稳定性。该方法可以进一步包括向发酵的麦芽汁中添加硅藻土并过滤以使得啤酒鲜亮。

[0108] 酶

[0109] 外源性酶

[0110] 如上所述，麦芽汁组合物可以通过淀粉糖化大麦或其部分而制备，例如未发芽大麦仁，特别是磨碎的未发芽大麦仁或其部分。未发芽大麦仁仅含有有限量的酶或甚至缺乏对麦芽汁产生有益的酶，例如能够降解细胞壁的酶或能够将淀粉解聚为糖的酶。

[0111] 因此，优选的是根据本发明的方法包括淀粉糖化步骤，其中在一种或多种外源性酶的存在下进行淀粉糖化。

[0112] 所述一种或多种外源性酶优选选自以下各项的组：细胞壁降解酶、淀粉降解酶及脂质降解酶。

[0113] 更优选地，在淀粉糖化开始时添加所述酶。

[0114] 这些酶可以被单独地提供于不同组合物中，或它们可以被混合。在其中蛋白酶是热稳定的蛋白酶的本发明的实施例中，所有的这些酶可以优选地提供于一种包含所有这些酶的组合物中。

[0115] α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)

[0116] α-淀粉酶也可以是外源性的、微生物的并且可以被添加至本发明的方法和/或组合物中。α-淀粉酶可以是一种芽孢杆菌α-淀粉酶。熟知的芽孢杆菌α-淀粉酶包括来源于地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株的α-淀粉酶。优选的α-淀粉酶是来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，该α-淀粉酶具有如披露于WO * *99/19467中的SEQ ID NO:3的氨基酸序列，具有突变：I181+G182+N193F。

[0117] 可以按0.001至10KNU，优选0.01至5KNU，甚至更优选在0.1至2KNU之间/克的辅料的干物质的范围添加α-淀粉酶。

[0118] 一千Novoα-淀粉酶单位(KNU)等于1000NU。一KNU被定义为在标准条件(即在37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；和pH 5.6)下，将5.26g可溶性干淀粉底物Merck Amylum糊精化的酶量。

[0119] 在一个优选方面中，具有α-淀粉酶活性的酶是一种真菌来源的α-淀粉酶，例如来自黑曲霉的α-淀粉酶，或细菌来源的α-淀粉酶，例如来自芽孢杆菌的α-淀粉酶，例如来源于于地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株的α-淀粉酶。因此，α-淀粉酶可以是在酸性pH和/或低Ca2+浓度下具有增加的热稳定性的细菌α-淀粉酶变体。醪液中的α-淀粉酶活性可以例如是0.1-1.0KNU(S)/g，如0.2-0.4KNU(S)/g，例如0.25-0.35KNU(S)/g干重大麦。在本发明的一个实施例中，优选的是该α-淀粉酶具有如上所述的α-淀粉酶活性，并且与如在国际专利申请WO 99/19467中示为SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，优选至少91％，优选至少92％，优选至少93％，优选至少94％，更优选至少95％，优选至少96％，优选至少97％，更优选至少98％，并且最优选至少99％一致性。国际专利申请WO 99/19467的SEQ ID NO:1是描述于WO 99/19467中的具有突* *变I181G182，N193F的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的一种变体(并且可以从丹麦的诺维信公司作为 SC而获得)。该α-淀粉酶还可以是如在WO 99/19467的第3
页，第18行至第6页，第27行中所定义的α-淀粉酶。一种优选的α-淀粉酶是具有与WO
99/19467中的SEQ ID NO:4具有至少90％，如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或特别地至少99％一致性的氨基酸序列并且具有α-淀粉酶活性的α-淀粉酶。另一种优选的α-淀粉酶是披露于WO 99/43794中的SEQ ID NO:9的α-淀粉酶或其变体。所考虑的变体和杂交体描述于WO 96/23874、WO 97/41213及WO 99/19467中。具体考虑地是一种来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，该α-淀粉酶具有如披露于WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的氨基酸序列，具有突变：I181*+G182*+N193F。例如按以下量添加芽孢杆菌α-淀粉酶：1.0-1000NU/kg干重大麦，优选从2.0-500NU/kg干重大麦，优选10-200NU/kg干重大麦。有待用于本发明的方法中的另一种具体的α-淀粉酶可以是任何真菌α淀粉酶，例如来源于曲霉属的任何子囊菌真菌，并且优选来自黑曲霉的菌株的α淀粉酶。尤其考虑地是以下真菌α淀粉酶，这些α淀粉酶与在WO 2002/038787中示为SEQ ID NO:1的氨基酸序列展现出高一致性，例如至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或甚至至少90％一致性。可以按以下量添加真菌α-淀粉酶：1-1000AFAU/kg干重大麦，优选从2-500AFAU/kg干重大麦，优选
20-100AFAU/kg干重大麦。

[0120] 能以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测量α-淀粉酶活性，相对于酶标准而确定AFAU。1AFAU被定义为在下述标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。

[0121] 酸性α-淀粉酶是一种内-α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖-葡糖水解酶，E.C.3.2.1.1)，它水解在淀粉分子的内部区域中的α-1,4-糖苷键以形成具有不同链长度的糊精和寡糖。与碘形成的颜色的强度与淀粉的浓度成正比。使用反向比色法将酶活性测定为在指定的分析条件下淀粉浓度的减小。

[0122]

[0123] 蓝色/紫色 t＝23秒 脱色

[0124] 标准条件/反应条件：

[0125]

[0126] 普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41)

[0127] 用于根据本发明的方法中的普鲁兰酶优选是来自例如热球菌属或芽孢杆菌属，如普鲁兰多糖芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)(例如，描述于FEMS Microbiol.Letters(FEMS微生物学快报)115:97-106中的普鲁兰多糖芽孢杆菌)或脱支芽孢杆菌(Bacillus deramificans)、或Bacillus naganoencis的普鲁兰酶。普鲁兰酶还可以是一种来自例如芽孢杆菌菌株的工程化普鲁兰酶。

[0128] 优选用于根据本发明的方法中的其他普鲁兰酶包括：脱支芽孢杆菌(Bacillus deramificans)(美国专利号5,736,375)，或该普鲁兰酶可以来源于描述于PCT/DK91/00219的乌兹炽热球菌(Pyrococcus Woesei)，或该普鲁兰酶可以来源于描述于PCT/DK
92/00079的闪烁杆菌属(Fervidobacterium sp.)Ven 5，或该普鲁兰酶可以来源于描述于PCT/DK 95/00097的速生热球菌(Thermococcus celer)，或该普鲁兰酶可以来源于描述于PCT/DK 95/00211的艾比斯热网菌(Pyrodictium abyssei)，或该普鲁兰酶可以来源于描述于PCT/DK 95/00095的喷哪乌兰闪烁杆菌(Fervidobacterium pennavorans)，或该普鲁兰酶可以来源于描述于PCT/DK 95/00098的Desulforococcus mucosus。

[0129] 最 优 选 地，该 普 鲁 兰 酶 来 源 于 普 鲁 兰 多 糖 芽 孢 杆 菌 (Bacillus acidopullulyticus)。

[0130] 有待用于本发明的方法和/或组合物中的优选的普鲁兰酶是一种具有披露于WO2009/075682中的Seq ID No.3的氨基酸序列的普鲁兰酶。

[0131] 在本发明的一个方面中，该普鲁兰酶与示于WO 2009/075682中Seq ID No:3中的序列具有至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％或甚至100％的一致性。

[0132] 在本发明的一个方面中，该普鲁兰酶是热稳定的。这样的一种普鲁兰酶的一个实例是一种描述于WO 2009/075682中的普鲁兰酶。

[0133] 对于普鲁兰酶，通过找到将酶在25℃下和在64℃下，在缓冲液(pH 5)中孵育10分钟后剩余的酶活性的量而确定热稳定性。

[0134] 以0.1至3PUN/g干物质(DM)辅料的剂量添加普鲁兰酶，例如0.2至2.9、例如0.3至2.8、例如0.3至2.7、例如0.3至2.6、例如0.3至2.5、例如0.3至2.4、例如0.3至
2.3、例如0.3至2.2、例如0.3至2.1、例如0.3至2.0、例如0.3至1.9、例如0.3至1.8、例如0.3至1.7、例如0.3至1.6，最优选地，以例如0.3至1.5，优选0.4至1.4，更优选0.5至1.3，更优选0.6至1.2，更优选0.7至1.1，更优选0.8至1.0，更优选0.9至1.0的剂量添加普鲁兰酶。在本发明的一个具体实施例中，以0.3PUN/g DM辅料，例如0.4PUN/g DM辅料，例如0.5PUN/g DM辅料，例如0.6PUN/g DM辅料，例如0.7PUN/g DM辅料添加该酶。在本发明的一个特别优选的实施例中，酶剂量不大于1PUN/g DM辅料。

[0135] 一普鲁兰酶单位(PUN)是在标准条件(即，在40℃和pH 5.0下30分钟反应时间后；并且用0.2％普鲁兰(pullulan)作为底物)下，水解普鲁兰，从而以等于每分钟1微摩尔葡萄糖的还原力还原碳水化合物的酶量。

[0136] 通过在以下条件中检测增加的还原糖容量(斯莫吉-尼尔森(Somogyi-Nelson)反应)测量普鲁兰酶活性：底物：0.2％普鲁兰，pH 5.0，反应时间30分钟。通过在OD 520nm处的分光光度计分析样品。

[0137] 具有普鲁兰酶活性的外源性酶优选是一种普鲁兰酶。所述普鲁兰酶可以是本领域技术人员已知的任何普鲁兰酶。具体地，普鲁兰酶可以是能够催化普鲁兰、支链淀粉和糖原中，并且还有支链淀粉和糖原的极限糊精中的(1→6)-α-D-糖苷键的水解的任何酶。优选地，该普鲁兰酶是具有EC编号E.C.3.2.1.41的任何酶。

[0138] 有待与本发明一起使用的普鲁兰酶可以来源于普鲁兰多糖芽孢杆菌。有待用于本发明的方法和/或组合物中的一种优选的普鲁兰酶是一种具有以下氨基酸序列的普鲁兰酶，该氨基酸序列与示于国际专利申请WO 2010/043538的SEQ ID NO:1中的序列具有至少50％，例如至少55％，例如至少60％，例如至少65％，例如至少66％，例如至少70％，例如至少75％，例如至少80％，例如至少85％，例如至少86％，例如至少87％，例如至少88％，例如至少89％，例如至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少
94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％或甚至
100％的一致性。在一个实施例中，用于根据本发明的方法中的普鲁兰酶可以优选地是一种例如来自热球菌属或芽孢杆菌属，如普鲁兰多糖芽孢杆菌(例如，描述于FEMS Microbiol.Letters(FEMS微生物学快报)1 15:97-106中的普鲁兰酶)的普鲁兰酶或一种来自脱支芽孢杆菌、或B.naganoencis的普鲁兰酶。普鲁兰酶还可以是一种例如来自芽孢杆菌菌株的工程化普鲁兰酶。

[0139] 纤维素酶和/或β葡聚糖酶：

[0140] 具有β-葡聚糖酶活性的外源性酶优选是一种(1-3,1-4)-β-葡聚糖酶或纤维素酶，其中纤维素酶也可以被称为β-葡聚糖酶。所述纤维素酶可以是本领域技术人员已知的任何纤维素酶。具体地，纤维素酶可以是能够催化纤维素、地衣聚糖及谷类β-D-葡聚糖中的(1→4)-β-糖苷键内部水解的任何酶。优选地，该纤维素酶是具有EC编号E.C.3.2.1.4的任何酶。所述(1-3,1-4)-β-葡聚糖酶可以是能够催化β-D-葡聚糖中(1→3)-或(1→4)-键的内部水解的任何酶，当其还原基团被包含在有待被水解的键中的葡萄糖残基在C-3处自我取代时。优选地，(1-3,1-4)-β-葡聚糖酶是具有EC编号EC3.2.1.6的任何酶。

[0141] 有待与本发明一起使用的纤维素酶可以是微生物来源的，如一种来源于丝状真菌(例如，曲霉属、木霉属、腐质霉属、镰刀菌属)的菌株的纤维素酶。可以与本发明一起使用的纤维素酶的具体实例包括获得自特异腐质霉并且由WO 91/17244中的图14的氨基酸序列进一步定义的内切葡聚糖酶(内切葡聚糖酶I)和描述于WO 91/17243中的43kD特异腐质霉内切葡聚糖酶。有待用于本发明的方法中的具体纤维素酶可以是内切葡聚糖酶，例如内切-(1-4)-β-葡聚糖酶。尤其考虑地是示于WO 2003/062409的SEQ ID NO:2及同源序列中的β-葡聚糖酶。添加的β-葡聚糖酶活性也可以来自麦芽。在本发明的一个特别优选的实施例中，将β-葡聚糖酶与木聚糖酶作为叫做Ultraflo Max的酶共混物一起添加。Ultraflo Max是木聚糖酶和β-葡聚糖酶的酶共混物，该共混物描述于申请WO2005/059084中。可以使用的可商购纤维素酶制剂包括CELLUCLAST(R)、CELLUZYM E(R)、CEREFLO(R)及ULTRAFLO(R)(可获得自诺维信公司，丹麦)，LAMINEX(TM)及SPEZYME(R)CP(可获得自杰能科公司(Genencor Int.))以及ROHAMENT(R)7069W(可获得自罗姆公司(Rohm)，德国)。能以1.0-10000BGU/kg干重大麦，优选从10-5000BGU/kg干重大麦，优选从
50-1000BGU/kg干重大麦并且最优选从100-500BGU/kg干重大麦的量添加纤维素酶。

[0142] 一β葡聚糖酶单位(BGXU)对应于在标准条件(在pH 4.40下，在30℃下孵育10分钟)下，每分钟产生1微摩尔还原糖所需的酶量。

[0143] 一真菌β葡聚糖酶单位(FBG)是以下酶量，根据下面概述的标准条件，该酶量以等于每分钟1mol葡萄糖的还原能力释放还原性寡糖或还原碳水化合物。在形成过程中，真菌β葡聚糖酶与β葡聚糖反应成葡萄糖或还原性碳水化合物，根据斯莫吉尼尔森方法，将葡萄糖或还原性碳水化合物确定为还原糖。应该将样品稀释，以给出0.02～0.10FBG/ml之间的活性。标准反应条件是：底物：0.5％大麦β葡聚糖，温度：30℃，pH：5.0以及反应时间30min。

[0144] 然而，以内切葡聚糖酶单位(EGU)测量商业产品中的纤维素分解活性，可以将EGU转化为FBG。对于纤维素酶(celluclast)，可以通过将EGU乘以因子3.2来将EGU转化为FBG。

[0145] 木聚糖酶：

[0146] 具有木聚糖酶活性的外源性酶优选是一种木聚糖酶。所述木聚糖酶可以是本领域技术人员已知的任何木聚糖酶。具体地，木聚糖酶可以是能够催化木聚糖中的(1→4)-β-D-木糖苷键内部水解的任何酶。优选地，该木聚糖酶是一种内切-1,4-β-木聚糖酶，例如具有EC编号E.C.3.2.1.4的任何酶。

[0147] 在一个实施例中，该木聚糖酶可以是描述于国际专利申请WO2005/059084 A1中的任何木聚糖酶。在另一个实施例中，木聚糖酶活性由一种来自糖基水解酶家族10的木聚糖酶提供。在具有木聚糖酶活性的任何酶中的另一种优选的木聚糖酶与示于国际专利申请WO2009/074650的SEQ ID NO:4中的氨基酸序列具有至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，并且最优选至少99％或甚至100％一致性(描述于WO 94/21785中并且可以从丹麦的诺维信公司作为 而获得)。优选地，以0.02-0.1FXU-S/
g，更优选0.04-0.08FXU-S/g干重大麦的浓度将木聚糖酶活性添加至醪液中。能以FXU单位表示木聚糖分解活性，用雷马素(remazol)-木聚糖(用雷马素艳蓝R，Fluka(Remazol Brilliant Blue R,Fluka)染色的4-O-甲基-D-葡醛(glucurono)-D-木聚糖)作为底物在pH6.0下来确定。用雷马素-木聚糖底物孵育木聚糖酶样品。通过乙醇沉淀不降解的染色底物的背景。上清液中的剩余蓝色(如在585nm处用分光光度计确定)与木聚糖酶活性成正比，并且然后相对于酶标准在标准反应条件，即底物浓度0.45％w/v，酶浓度
0.04-0.14FXU(S)/mL，在50.0℃、pH 6.0下，及30分钟反应时间下确定木聚糖酶单位。

[0148] 脂肪酶：

[0149] 具有脂肪酶活性的酶可以是具有脂解活性的任何酶，例如脂肪酶。具体地，该脂肪酶可以是一种对甘油三酯和/或半乳糖脂，溶血磷脂和/或磷脂具有活性的脂肪酶。优选地，脂肪酶活性由一种来自镰刀菌属(包括尖孢镰刀菌和异孢镰刀菌)、曲霉属(包括塔宾曲霉(A.tubigensis))、根霉属(包括米曲霉)或嗜热霉属(包括疏棉状嗜热丝孢菌)的脂肪酶，或这些脂肪酶的变体提供。一个实例是Lipopan X(Lipopan Xtra)，一种具有取代G91A+D96W+E99K+P256V+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F(+274S)的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的变体，描述于WO 2004099400 A2中。优选地，该脂肪酶与示于国际专利申请WO2009/074650的SEQ ID NO:5中的氨基酸序列的残基1-316或1-273具有至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，并且最优选至少99％或甚至100％一致性(来自尖孢镰刀菌的脂肪酶/磷脂酶，描述于EP 869167中，可以从丹麦的诺维信、作为 F而获得)。优选地，醪液中的脂肪酶活性是0-50LU/g，例如
0-40LU/g，例如0-30LU/g，例如0-20LU/g干重大麦。在本发明的另一个优选的实施例中，该脂肪酶是Lipozyme TL或丽波脂肪酶(lipase)，这种脂肪酶对过滤速度和灰霾减少具有显著地良好作用。因此，在本发明的一个优选实施例中，该脂肪酶与示于国际专利申请WO
2009/074650的SEQ ID NO 9中的氨基酸序列具有至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，并且最优选至少99％或甚至100％一致性。该脂肪酶还可以是Lipex，Lipozyme的一种变体。因此，该脂肪酶可以是与示于国际专利申请WO 2009/074650的SEQ ID NO:10中的氨基酸序列具有至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％，并且最优选至少99％或甚至100％一致性的任何脂肪酶。脂肪酶将来自大麦的脂质(例如甘油三酯)降解为偏甘油酯和游离脂肪酸。
这导致较低的浊度和大大改进的醪液过滤及滤清特性。一脂肪酶单位(LU)是在30.0℃；pH
6.0下；用阿拉伯树胶作为乳化剂并且用三丁酸甘油脂作为底物，每分钟释放1微摩尔的可滴定丁酸的酶量。

[0150] 外源性蛋白酶

[0151] 本发明的方法包括使用至少两种不同的外源性蛋白酶。优选的是所述外源性蛋白酶中的至少一种是内切蛋白酶并且另一种是外切蛋白酶。可以在本发明的方法的任何适合的步骤添加所述外源性蛋白酶，例如淀粉糖化之前、淀粉糖化开始时，淀粉糖化过程中、加热麦芽汁之后，发酵开始时或发酵过程中。

[0152] 根据本发明的内切蛋白酶是能够催化连接位于多肽的内部(即，不在N或C末端处)的两个氨基酸的肽键的裂解的酶。

[0153] 根据本发明的外肽酶是能够催化连接两个氨基酸的肽键的裂解的酶，其中这些氨基酸中的至少一个位于多肽的末端处。

[0154] 在本发明的一个实施例中，优选的是这些蛋白酶是热稳定的。

[0155] 具体地，优选的是当在加热麦芽汁的任何时间添加时，例如如果在淀粉糖化之前或过程中添加它们，所述外源性蛋白酶是热稳定的。

[0156] 优选的是所述外源性蛋白酶在对应于其添加至其中的啤酒(或醪液或麦芽汁)的pH下是有活性的。在一个优选实施例中，这些外源性蛋白酶具有酸性pH最佳值，即具有6.0或更低的pH最佳值-例如低于5，如低于4或甚至低于3的pH最佳值。优选地，可以在发酵麦芽汁之前或过程中添加所述外源性蛋白酶。

[0157] 另外，优选的是这些外源性蛋白酶中的一种是内切蛋白酶，并且更优选地，它选自金属蛋白酶、脯氨酸特异性内切蛋白酶、或具有谷氨酰胺特异性的内切蛋白酶的组。

[0158] 因此，在一个优选实施例中，该内切蛋白酶是一种金属蛋白酶，该金属蛋白酶与示于SEQ ID NO:1中的氨基酸序列具有至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，并且最优选至少99％或甚至100％一致性(一种来自解淀粉芽孢杆菌的金属蛋白酶，描述于WO 9967370中)。优选地，这种蛋白酶在醪液中的活性是0.0005-0.002AU/g，更优选0.001-0.0015AU/g一种或多种干重谷类。可以通过使用变性血红蛋白作为底物来确定蛋白水解活性。在用于确定蛋白水解活性的安森-血红蛋白(Anson-Hemoglobin)方法中，变性血红蛋白被消化，并且用三氯乙酸(TCA)沉淀未消化的血红蛋白。通过使用酚试剂确定TCA可溶的产物的量，酚试剂可以与酪氨酸和色氨酸一起给出蓝色。一安森单位(AU)被定义为在标准条件(即25℃，pH 7.5和10min反应时间)下以初始速率消化血红蛋白，以使得每分钟释放的TCA可溶的产物的量与酚试剂给出与一毫当量的酪氨酸相同的颜色的酶量。

[0159] 因此，在另一个优选实施例中，该内切蛋白酶是一种脯氨酸特异性内切蛋白酶。根据本发明，脯氨酸特异性内切蛋白酶是能够催化脯氨酸与相邻的氨基酸之间的肽键裂解的蛋白酶，其中所述脯氨酸和所述相邻的氨基酸位于多肽的内部。更优选地，所述脯氨酸特异性内切蛋白酶能够催化脯氨酸与相邻的氨基酸之间的肽键裂解，其中所述脯氨酸位于离多肽的任一末端处多于2个氨基酸处并且所述相邻的氨基酸位于多肽的内部。脯氨酸特异性内切蛋白酶优选能够催化在脯氨酸残基的羧基末端处的所述肽键的水解，在这种情况下，所述脯氨酸特异性内切蛋白酶的一种产物是具有C末端脯氨酸残基的多肽。

[0160] 脯氨酸特异性内切蛋白酶可以是报道于J.Agic Food Chem.(农业与食品化学杂志)(第53卷(20),7950-7957,2005)中的黑曲霉来源的脯氨酰内切蛋白酶，描述于欧洲专利申请EP 0 522 428中的曲霉属的脯氨酸特异性内切蛋白酶，描述于欧洲专利申请EP 0967 285中的黄杆菌属的脯氨酸特异性内切蛋白酶，描述于WO 2009/144269中来自产黄青霉的脯氨酸特异性内切蛋白酶或由Kanatani(金谷弘)等人，1993 J.Biochem.(生物化学杂志)(113(6):790-796)描述的来自气单胞菌属的脯氨酸特异性内切蛋白酶。

[0161] 催化脯氨酸残基的NH2-末端处的多肽/肽的裂解的一种有用的脯氨酸特异性内切蛋白酶是例如描述于1998年1月15日的自然(Nature)出版物，第391卷，第301-304页中。

[0162] 因为对酶活性而言是典型的，脯氨酸特异性内切蛋白酶的活性依赖于pH。在本发明的一个优选实施例中，该脯氨酸特异性内切蛋白酶在对应于添加至其中的啤酒(或醪液或麦芽汁)的pH下具有最大脯氨酰内切蛋白酶活性。在根据本发明的方法的一个优选实施例中，该脯氨酸特异性内切蛋白酶具有酸性pH最佳值，即6.0或更低的pH最佳值-例如在3至6的范围内，如在4至6的范围内的pH最佳值。

[0163] 在一个优选实施例中，本发明的脯氨酸特异性内切蛋白酶可以分离自上述微生物物种之一，并且更优选分离自曲霉属物种。优选地，该脯氨酸特异性内切蛋白酶分离自黑曲霉的菌株。有趣地，曲霉属酶在pH 5左右具有最佳活性。该脯氨酸特异性内切蛋白酶还可以分离自一种被工程化为过表达编码脯氨酸特异性内切蛋白酶的基因的黑曲霉宿主，尽管其他宿主(例如大肠杆菌)是适合的宿主。例如，除其他之外，在大肠杆菌中克隆并过产生黄杆菌属来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶已经使得某些脯氨酸特异性内切蛋白酶能以纯形式而获得。这样的一种过生产构建体的实例提供于World Journal of Microbiology and Biotechnology(微生物学与生物技术世界杂志)，第11卷，第209-212页中。优选在自身克隆中使用黑曲霉宿主，以驱动编码黑曲霉脯氨酸特异性内切蛋白酶的表达。非常优选地，该脯氨酸特异性内切蛋白酶是如披露于欧洲专利申请EP 1326957中的内切蛋白酶。

[0164] 因此，在本发明的一个实施例中，该脯氨酸特异性内切蛋白酶是一种具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性的酶，具有与来自黑曲霉的内切蛋白酶具有至少70％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少
93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少
98％，并且最优选至少99％或甚至100％一致性的序列，该来自黑曲霉的内切蛋白酶可以从荷兰的帝斯曼食品配料公司(DSM Food specialities)作为Brewers 而获得。

[0165] 在另一个实施例中，该脯氨酸特异性内切蛋白酶来源于产黄青霉。优选地，所述脯氨酸特异性内切蛋白酶具有在4至5范围内的pH最佳值。因此，在本发明的一个实施例中，该脯氨酸特异性内切蛋白酶是一种具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性的酶，具有在4至5范围内的pH最佳值，具有与示于国际专利申请WO 2009/144269的SEQ ID NO 3中的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，并且最优选至少99％或甚至100％一致性的序列。

[0166] 在本发明的另一个实施例中，一种外源性蛋白酶是具有谷氨酰胺内切蛋白酶活性的蛋白酶，例如谷氨酰胺特异性内切蛋白酶。

[0167] 根据本发明，谷氨酰胺特异性内切蛋白酶是能够催化谷氨酰胺与相邻的氨基酸之间的肽键裂解的蛋白酶，其中所述谷氨酰胺和所述相邻的氨基酸都位于多肽/肽的内部。更优选地，所述谷氨酰胺特异性内切蛋白酶能够催化谷氨酰胺与相邻的氨基酸之间的肽键裂解，其中所述谷氨酰胺位于离任一末端处多于2个氨基酸处并且所述相邻的氨基酸位于多肽/肽的内部。谷氨酰胺特异性内切蛋白酶优选能够催化水解脯氨酸残基的羧基末端处的所述肽键，在这种情况下，所述谷氨酰胺特异性内切蛋白酶的一种产物是具有C末端谷氨酰胺的肽/多肽。

[0168] 在一个优选实施例中，该谷氨酰胺特异性内切蛋白酶是一种具有半胱氨酸类型内切蛋白酶活性的蛋白酶。具有半胱氨酸类型内切蛋白酶活性的谷氨酰胺特异性内切蛋白酶可以优选是能够通过一种机制催化多肽链中的谷氨酰胺与另一种氨基酸之间的内部、α-肽键的水解的任何酶，在该机制中，所述内切蛋白酶的活性中心处的半胱氨酸残基的巯基作为亲核体。还优选的是该谷氨酰胺特异性内切蛋白酶属于肽酶C1家族。

[0169] 有待与本发明一起使用的谷氨酰胺特异性内切蛋白酶可以来源于多种有机体，如脊椎动物、植物或微生物。在本发明的一个优选实施例中，有待与本发明一起使用的谷氨酰胺特异性内切蛋白酶来源于植物，优选来源于谷类并且更优选来源于大麦。

[0170] 因此，优选的是有待与本发明一起使用的一种外源性蛋白酶是大麦谷氨酰胺特异性内切蛋白酶，例如大麦内切蛋白酶A(EP-A)或大麦内切蛋白酶B(EP-B)。因为所述蛋白酶是大麦蛋白酶，内源性EP-A和EP-B可以存在于淀粉糖化过程中及麦芽汁中。然而，应该指出在淀粉糖化过程中仅存在非常少的内源性活性EP-A和EP-B并且在加热后存在于麦芽汁中的甚至更少。因此，取决于pH，在淀粉糖化过程中仅检测到约1％的潜在的EP-A和EP-B活性[Riis(里斯)，P.,EBC Congress Dublin(EBC国会都柏林)，2003，第867-874页(演讲编号84)]。因此，即使可能存在一些内源性EP-A和EP-B，但是外源性蛋白酶也可以是EP-A和EP-B。外源性EP-A优选是至少被部分纯化的，更优选是纯化的EP-A，可以在该方法的任何适当的时间添加EP-A。类似地，外源性EP-B优选是至少被部分纯化的，更优选是纯化的EP-B，可以在该方法的任何适当的时间添加EP-B。

[0171] 因此，在本发明的一个实施例中，该谷氨酰胺特异性内切蛋白酶是一种具有谷氨酰胺特异性内切蛋白酶活性的酶，具有与以下序列(具有UniProt身份(identity)O4675_HORVU)具有至少70％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少
96％，更优选至少97％，更优选至少98％，并且最优选至少99％或甚至100％一致性的序列。

[0172] 在本发明的另一个实施例中，该谷氨酰胺特异性内切蛋白酶是一种具有谷氨酰胺特异性内切蛋白酶活性的酶，具有与以下序列(具有UniProt标识符P25250)具有至少70％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少
92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少
97％，更优选至少98％，并且最优选至少99％或甚至100％一致性的序列。

[0173] 优选的是这些外源性蛋白酶之一是一种具有外肽酶活性的酶。具有外肽酶活性的所述酶可以是氨肽酶或羧肽酶。具体地，优选的是这些外源性蛋白酶之一具有羧肽酶活性。

[0174] 在一个优选实施例中，该外肽酶是一种氨肽酶。

[0175] 氨肽酶是蛋白酶并且被分类在酶分类编号E.C.3.4.11之下。它们能够从多肽中除去一个或多个氨基末端残基。

[0176] 在一个优选实施例中，该氨肽酶是一种披露于WO 96/28542中的氨肽酶。

[0177] 在一个实施例中，该氨肽酶是一种具有与SEQ ID NO:2具有至少60％，例如至少70％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少
92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少
97％，更优选至少98％，并且最优选至少99％或甚至100％一致性的序列的氨肽酶。

[0178] 根据本发明的羧肽酶是能够催化连接两个氨基酸的肽键的裂解的酶，其中这些氨基酸中的至少一个位于多肽或肽的C-末端处。

[0179] 该羧肽酶可以例如选自下组，该组由以下各项组成：溶酶体的Pro-Xaa羧肽酶(EC3.4.16.2)、丝氨酸类型D-Ala-D-Ala羧肽酶(EC 3.4.16.4)、羧肽酶C(EC 3.4.16.5)、羧肽酶D(EC 3.4.16.6)、羧肽酶A(EC 3.4.17.1)、羧肽酶B(EC 3.4.17.2)、赖氨酸羧肽酶(EC 3.4.17.3)、Gly-Xaa羧肽酶(EC3.4.17.4)、丙氨酸羧肽酶(EC 3.4.17.6)、胞壁酰五肽(muramoylpentapeptide)羧肽酶(EC 3.4.17.8)、羧肽酶E(EC3.4.17.10)、谷氨酸羧肽酶(EC 3.4.17.11)、羧肽酶M(EC 3.4.17.12)、胞壁酰四肽(muramoyltetrapeptide)羧肽酶(EC 3.4.17.13)、锌D-Ala-D-Ala羧肽酶(EC 3.4.17.14)、羧肽酶A2(EC 3.4.17.15)、膜Pro-Xaa羧肽酶(EC3.4.17.16)、微管蛋白基(tubulinyl)-Tyr羧肽酶(EC 3.4.17.17)、羧肽酶T(EC 3.4.17.18)、羧肽酶Taq(EC 3.4.17.19)、羧肽酶U(EC 3.4.17.20)、谷氨酸羧肽酶II(EC 3.4.17.21)、金属羧肽酶D(EC 3.4.17.22)、血管紧张素转化酶2(EC 3.4.17.23)以及组织蛋白酶X(EC 3.4.18.1)。

[0180] 羧肽酶也可以是任何上述酶，其中所述羧肽酶已经通过重组技术修饰。具体地，该羧肽酶可以是如美国专利US 6,187,579中描述的进行修饰的任何上述酶。

[0181] 在本发明的一个优选实施例中，一种外源性蛋白酶是羧肽酶Y，更优选是酵母羧肽酶Y。该外源性蛋白酶还可以被修饰为CPD-Y，特别是如美国专利US 6,187,579中描述的进行修饰的酵母羧肽酶Y并且更优选是如在其中的权利要求1至17中的任一项中所定义的修饰的CPD-Y或如在US 5,945,329的权利要求1至16中的任一项中所定义的修饰的CPD-Y。

[0182] 在本发明的另一个优选的实施例中，一种外源性蛋白酶选自下组，该组由以下各项组成：羧肽酶MI(CPD-MI)、羧肽酶MII(CPD-MII)、羧肽酶MIII(CPD-MIII)以及CPD-Y。

[0183] 因此，在本发明的一个实施例中，该外源性蛋白酶可以是一种能够以宽特异性催化多肽的C末端氨基酸的裂解的羧肽酶，例如一种被分类在EC3.4.16.5之下的酶。更优选地，所述羧肽酶能够催化多肽的C-末端氨基酸残基的裂解，其中所述C-末端氨基酸残基是Pro。此外，优选的是另外所述羧肽酶能够催化多肽的其他C-末端氨基酸的裂解。因此，在一个优选实施例中，优选的是所述羧肽酶能够催化多肽的C-末端Pro的裂解，并且另外能够催化来自多肽的一个或多个C-末端氨基酸的裂解，这个或这些C-末端氨基酸选自下组，该组由以下各项组成：Ala、Val、Ile、Met、Phe以及Ser。具体地，优选的是所述羧肽酶能够催化蛋白或肽的C-末端Pro的裂解，其中所述裂解的kcat/Km是至少1000，优选至少1500，更优选至少2000min-1mM-1。

[0184] 因此，有待与本发明一起使用的一种非常优选的外源性蛋白酶是一种羧肽酶，其中所述羧肽酶优选可以是CPD-MI，并且更优选是大麦CPD-MI。大麦CPD-MI能以kcat/Km＝2,600min-1mM-1水解蛋白或肽的C-末端脯氨酸残基(Degan(德干)，F.D.等人，Appl.Environm.Microbiol.(应用与环境微生物学)58，第2144-2152页，1992)。当末端Pro残基通过CPD-MI的作用由蛋白或肽释放时，则新暴露的残基可以容易地由多种不同羧肽酶水解，例如一种选自下组的羧肽酶，该组由以下各项组成：CPD-MI、CPD-MII、CPD-MIII及CDP-Y。

[0185] 因此，该外源性蛋白酶可以是具有以下序列的任何羧肽酶，该序列与具有UniProt标识符P07519的序列具有至少70％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少
95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，并且最优选至少99％或甚至
100％一致性。

[0186] 在另一个实施例中，该外源性蛋白酶可以是一种能够催化具有带正电侧链的C末端氨基酸的裂解的羧肽酶。具体地，所述羧肽酶可以是一种能够以比其他C末端氨基酸显著更大的效率催化来自多肽的C末端Arg或Lys残基的释放的羧肽酶。所述显著更大的效率优选意指至少两倍，优选至少3倍，例如至少4倍更有效。因此，所述羧肽酶可以是一种根据EC 3.4.16.6的酶。

[0187] 这样的一种羧肽酶可以优选是一种羧肽酶MII，更优选是大麦羧肽酶MII。因此，该外源性蛋白酶可以是具有以下序列的任何羧肽酶，该序列与具有UniProt标识符P08818的序列具有至少70％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少
96％，更优选至少97％，更优选至少98％，并且最优选至少99％或甚至100％一致性。

[0188] 在另一个实施例中，该外源性蛋白酶可以是一种能够催化来自多肽的具有芳香族侧链的C末端氨基酸(例如Phe)的裂解的羧肽酶。另外，优选的是这样的一种羧肽酶还能够催化来自多肽的其他C末端氨基酸的裂解。这样的一种羧肽酶可以优选是一种羧肽酶MIII，更优选是大麦羧肽酶MIII。因此，该外源性蛋白酶可以是具有以下序列的任何羧肽酶，该序列与具有UniProt标识符P21529的序列具有至少70％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，并且最优选至少99％或甚至100％一致性。

[0189] 因此，在本发明的一个实施例中，该外源性蛋白酶可以是一种能够以宽特异性催化来自多肽的C末端氨基酸的裂解的羧肽酶，例如一种根据EC3.4.16.5的羧肽酶。具体地，优选的是所述羧肽酶能够催化来自多肽的C末端氨基酸的裂解，其中所述C末端氨基酸可以例如选自下组，该组由以下各项组成：Ala、Val、Ile、Met、Phe、Arg及Ser。这样的一种羧肽酶可以优选是一种羧肽酶Y，更优选是酵母羧肽酶Y，甚至更优选是酿酒酵母的羧肽酶Y。酵母CPD-Y的特异性例如描述于Degan(德干)等人，1992,Applied and Envirronmental Microbiology(应用与环境微生物学)，58(7):2144-2152中。因此，该外源性蛋白酶可以是具有以下序列的任何羧肽酶，该序列与具有UniProt标识符P00729的序列具有至少70％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，并且最优选至少99％或甚至100％一致性。

[0190] 在本发明的某些实施例中，并且具体地，在其中一种外源性蛋白酶是脯氨酸特异性内切蛋白酶的本发明的这样的实施例中，则优选的是至少一种其他的外源性蛋白酶是一种能够催化C末端脯氨酸的裂解的羧肽酶。此类羧肽酶可以例如选自由CPD-MI和CPD-Y组成的组，更优选地，所述羧肽酶可以是CDP-MI，并且甚至更优选是大麦CDP-MI。

[0191] 在本发明的某些实施例中，并且具体地，在其中一种外源性蛋白酶是谷氨酰胺特异性内切蛋白酶的本发明的这样的实施例中，则优选的是至少一种其他的外源性蛋白酶是一种能够催化C末端谷氨酰胺的裂解的羧肽酶。此类羧肽酶可以例如选自由CPD-MI和CPD-Y组成的组，更优选地，选自由大麦CDP-MI和酵母CDP-Y组成的组。

[0192] 在本发明的某些实施例中，该内切蛋白酶是 并且该外肽酶是氨肽酶AP1。

[0193] 在本发明的某些其他实施例中，该内切蛋白酶是 并且该外肽酶是氨肽酶AP1及外肽酶XDPAP。

[0194] 由麦芽汁生产啤酒的第一步优选涉及如上所述加热所述麦芽汁，然后是随后阶段的麦芽汁冷却和任选地漩涡静置。冷却后，将麦芽汁转移至含有酵母的发酵罐中。优选地，所述酵母是酿酒酵母-卡氏酵母。将麦芽汁发酵并熟化任何适合的时间段，通常在1至100天的范围内。在若干天长的发酵过程中，伴随一些风味物质的产生，糖被转化为醇和CO2。

[0195] 因此，根据本发明的方法优选包括孵育大麦麦芽汁的步骤，该麦芽汁可以是如在此描述的任何麦芽汁。这一步骤优选在加热麦芽汁后进行。在本发明的优选实施例中，可以在与酵母的所述孵育之前或过程中添加所述外源性蛋白酶，优选地，在与酵母的所述孵育开始时添加它们。

[0196] 所述酵母可以是能够发酵所述麦芽汁的任何有用的酵母，如酿酒酵母，例如卡氏酵母。

[0197] 如上所述，根据本发明方法制备的麦芽汁尤其可用于支持酵母生长。因此，根据本发明的方法具有减少的发酵时间是可能的。因此，优选的是将与酵母的孵育进行至多15天，例如至多10天。

[0198] 制备啤酒后，可以将啤酒进一步加工，例如被冷冻。它还可以被过滤和/或库存-一种产生宜人的香气和更少的酵母味的过程。还可以添加添加剂。此外，可以添加CO2。最后，在啤酒被包装(例如装瓶或装罐)之前，可以将其巴氏杀菌和/或过滤。

[0199] 实例

[0200] 在此的实例示意本发明的优选实施例并且不应被认为限制本发明。

[0201] 除非另有说明，否则进行基本分子生物技术用于如描述于Sambrook(萨姆布鲁克)和Russel(拉塞尔)(2001)中的操纵核酸和细菌。

[0202] 实例1

[0203] 在50-μl的麦芽汁或啤酒样品中确定游离氨基酸的水平。根据由美国的沃特斯公司(Waters)提供的UPLC氨基酸分析应用解决方案的建议进行氨基酸分析。根据制造商的说明，使用AccQ标签超衍生试剂盒(AccQ Tag Ultra Derivatization Kit)(可获得自沃特斯公司，美国)进行分析。使用的所有设备(包括仪器、化学剂及试剂盒)都获得自沃特斯公司，美国。通过与氨基酸标准比较获得自UPLC的峰面积计算氨基酸浓度。

[0204] 在两种不同的可商购啤酒中确定单独的氨基酸的水平，即作为制备自麦芽的嘉士伯比尔森啤酒(可获得自嘉士伯啤酒厂，丹麦)和作为缺乏麦芽的情况下制备自大麦的Clim8啤酒(可获得自哈尔博公司(Harboe)，丹麦)。使用可获得自丹麦的诺维信公司的酶混合物Ondea Pro制备Clim8啤酒。

[0205] 结果示于表1中。如显而易见的，与大麦酿造的啤酒相比，在麦芽基的啤酒中所有氨基酸的水平更高，并且与大麦酿造的啤酒相比，在麦芽基的啤酒中整体水平超过12倍更高。显著地，与大麦酿造的啤酒相比，在麦芽基的啤酒中的Val的水平高得多。

[0206] 表1.商业啤酒的比较

[0207]

[0208]

[0209] 实例2：

[0210] 内切蛋白酶和外肽酶的组合对游离氨基酸含量的影响。

[0211] 酶：

[0212] 使用可获得自丹麦的诺维信公司的Ondea Pro(Seq ID No:1的内切蛋白酶)与作为SEQ ID No:2的氨肽酶的外肽酶来测试将内切蛋白酶与外肽酶组合对游离氨基酸含量的影响。

[0213] Ondea Pro含有一种内切蛋白酶。

[0214] 以不同浓度添加这些酶–参见表2。

[0215] 淀粉糖化：

[0216] 将50g研磨的大麦(空隙0.2mm)与200ml H2O(54℃)、3mlCaCl2·H2O(11g/500ml)一起添加至烧杯中，并且根据表1，添加内切蛋白酶和外肽酶。然后，使用Lochner LB电子淀粉糖化装置进行淀粉糖化：

[0217] 54℃，持续30min

[0218] 64℃，持续60min

[0219] 80℃，持续10min

[0220] 20℃

[0221] 用水将混合物调节至300g并且使用沃特曼(whatman)过滤器5971/2过滤麦芽汁。

[0222] 表2.向淀粉糖化中添加Ondea Pro、内切蛋白酶及外肽酶

[0223]

[0224] EP：酶蛋白

[0225] 游离氨基氮(FAN)

[0226] 根据制造商的方案，用Skalar SAN++系统在麦芽汁样品中测量游离氨基氮(FAN)(Skalar methods(Skalar方法)；Catnr.149-203)(表3)。

[0227] 与仅有Ondea Pro(84.94mg/L)的样品1相比，添加氨肽酶或内切蛋白酶都导致增加的FAN量(高达102mg/L)。

[0228] 表3.麦芽汁样品中的FAN量

[0229]

[0230] L：低浓度(＝4mg EP/kg)；H：高浓度(＝8mg EP/kg)

[0231] 。

[0232] 游离氨基酸分析

[0233] 根据制造商的方案，通过Dionex summit HPLC测量不同游离氨基酸(FAA)的量。使用来自菲罗门公司(Phenomenex)的 3μm C18 柱，并且OPA试剂、FMOC
试剂和硼酸盐缓冲液获得自安捷伦科技公司(Agilent Technologies)并且用于衍生化。使用之前，将麦芽汁样品稀释5倍。通过与氨基酸标准比较获得自HPLC的峰面积计算氨基酸浓度。这些氨基酸标准获得自西格玛公司(Sigma)(AAS18)，含有20种氨基酸中的17种。
对于剩余的三种(Asn、Gln及Trp)，制备0.1N HCl中的2.5mM溶液。未测量半胱氨酸的量。

[0234] 类似于FAN测量，添加额外的内切蛋白酶和/或氨肽酶增加FAA的量。(表4)。

[0235] 表4.麦芽汁中的不同氨基酸的浓度(mg/L)

[0236]

[0237]

[0238] 与Ondea Pro一起添加外肽酶导致特定氨基酸(缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸)的增加。相比之下，与Ondea Pro一起添加额外的内切蛋白酶导致所有氨基酸的整体增加。