산성 조건하에서 안정한 단백질 가수분해물 조성물

산성 조건하에서 안정한 단백질 가수분해물 조성물 {PROTEIN HYDROLYSATE COMPOSITIONS STABLE UNDER ACIDIC CONDITIONS}

본 발명은 산성 pH 수준에서 안정한 단백질 가수분해물 조성물, 산성 pH 수준에서 안정한 단백질 가수분해물 조성물의 제조 방법, 및 산 pH 수준에서 안정한 단백질 가수분해물 조성물을 함유하는 식료품에 관한 것이다.

비만 및 비만에 연계된 질환의 비율은 미국 및 전세계에서 증가하고 있다. 근본적인 단일 원인은 없으나, 많은 사람들의 조급하고 시달리는 생활방식 및 이에 수반되는 패스트 푸드의 소비가 기여 요인일 수 있다. 대부분의 패스트 푸드는 지방 및/또는 당의 함량이 높은 경향이 있다. 그러므로, "분주한 가운데" 먹거나 마실 수 있는 영양가 높고 손쉽게 이용할 수 있는 식료품에 대한 필요성이 존재한다. 이 식료품은 미감이 양호할 뿐 아니라 영양면에서도 건전해야 한다; 즉, 산물은 저지방, 고단백이어야 하며 비타민 및 항산화제가 풍부해야한다.

대두는 단백질의 우수한 공급원이지만, "풀" 또는 "콩" 향미가 나는 경향이 있어 일부 사람들이 불쾌감 또는 거부감을 느낀다. 그러므로, "대두" 향미가 감소되고 쓴 맛 또는 떫은 맛이 감소된 단리된 대두 단백질 산물이 필요하다. 또한, 목적하는 식료품이 액체 음료인 경우에, 시재료, 즉 단리된 단백질 산물이 높은 용해도를 갖도록, 이상적으로는 액체 음료에 첨가할 단리된 단백질 산물이 더 맑거나 투명해야 한다. 부가적으로, 단리된 단백질 산물은 목적하는 액체 음료의 pH에서 안정해야 한다.

본 발명의 한 태양은 단백질 가수분해물 조성물을 제공한다. 단백질 가수분해물 조성물은 약 10,000 달톤 미만의 평균 크기를 가진 올리고펩티드의 혼합물을 함유한다. 또한, 단백질 가수분해물 조성물은 약 pH 7.0 미만의 pH 수치에서 적어도 약 60%의 고체 용해도 지수(solid solubility index) 및 적어도 약 2.5%, 일반적으로는 적어도 약 5.0%, 바람직하게는 적어도 약 7.5%, 가장 바람직하게는 적어도 약 10%의 가수분해도를 가진다.

본 발명의 다른 태양은 단백질 가수분해물 조성물의 제조 방법을 포함한다. 이 방법은, 단백질 재료의 펩티드 결합을 분해하여 약 10,000 달톤 미만의 평균 크기를 가진 올리고펩티드의 혼합물을 형성시키는 적어도 하나의 엔도펩티다제에 단백질 재료를 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 올리고펩티드의 혼합물은 단백질 가수분해물 조성물을 함유한다. 이 방법은, 단백질 가수분해물 조성물의 pH를 약 pH 7.0 미만의 수치로 강하시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 단백질 가수분해물 조성물은 적어도 약 60%의 고체 용해도 지수 및 적어도 약 2.5%, 일반적으로는 적어도 약 5.0%, 바람직하게는 적어도 약 7.5%, 가장 바람직하게는 적어도 약 10%의 가수분해도를 가진다.

본 발명의 추가의 태양은 단백질 가수분해물 조성물을 함유하는 식품 또는 음료 산물을 제공한다. 단백질 가수분해물 조성물은 약 10,000 달톤 미만의 평균 크기를 가진 올리고펩티드의 혼합물을 함유하며, 조성물은 약 7.0 미만의 pH에서 적어도 약 60%의 고체 용해도 지수 및 적어도 약 2.5%, 일반적으로는 적어도 약 5.0%, 바람직하게는 적어도 약 7.5%, 가장 바람직하게는 적어도 약 10%의 가수분해도를 가진다.

본 발명의 다른 태양 및 특징은 부분적으로는 자명할 것이고, 부분적으로는 본 명세서에 하기 언급될 것이다.

<도 1>
도 1은 세린 프로테아제 1(SP1, 원) 또는 알칼라제(등록상표)(ALCALASE ^® )(ALC, 사각형)에 의해 생성된 가수분해물의 가수분해도(%)의 함수로서 가용성 고체의 백분율을 도시한다.
<도 2>
도 2는 다양한 가수분해물의 가용성 고체의 백분율을 pH의 함수로서 나타낸다. 이 도면은 5% ALC 가수분해물(다이아몬드), 10% ALC 가수분해물(사각형) 및 5% ALC 가수분해물(삼각형)에 대하여 가용성 고체의 백분율을 pH의 함수로서 나타낸다.
<도 3>
도 3은 SP1 또는 알칼라제(등록상표)(ALC) 가수분해물의 다양한 관능 속성(sensory attribute)에 대한 진단 점수(diagnostic score)를 나타낸다. 패널 A는 중성 pH에서 2.5% 고체를 함유하는 물 중의 슬러리로서 평가자에게 제공된 표시된 가수분해물의 대조군(즉, SP1 샘플)에 대한 상이점을 나타낸다. 패널 B는 물 중의 2.5% 슬러리로서 평가자에게 제공된 표시된 가수분해물의 대조군(즉, HXP 212)에 대한 상이점을 나타낸다. 패널 C는 pH 3.0에서 1.6% 단백질로 오렌지 스포츠 음료 내에 평가자에게 제공된 표시된 가수분해물의 대조군(즉, HXP 212)에 대한 상이점을 나타낸다. 패널 D는 pH 3.8에서 1.6% 단백질로 오렌지 스포츠 음료 내에 평가자에게 제공된 표시된 가수분해물의 대조군(즉, HXP 212)에 대한 상이점을 나타낸다.
<도 4>
도 4는 SP1(밝은 회색 막대) 및 알칼라제(등록상표)(ALC)(진한 회색 막대) 가수분해물 내의 펩티드 단편의 분자량 분포를 나타낸다.

특정 엔도펩티다제로 단백질 재료를 분해하면 올리고펩티드의 혼합물을 함유하는 단백질 가수분해물 조성물이 생성되며, 여기서 올리고펩티드는 산성 pH 수준에서 가용성임을 발견하였다. 이들 단백질 가수분해물 조성물은 또한, 시재료 단백질의 경우에 비해 개선된 향미 프로파일(flavor profile) 및 관능 속성을 가진다. 이들 특성을 가진 단백질 가수분해물 조성물은 산성 pH 수준에서 안정하며, 직접음용형 음료(ready-to-drink beverage) 및 기타 식료품에 보충제로서 유용할 수 있다.

I. 단백질 가수분해물 조성물의 제조 방법

본 발명의 한 태양은 약 10,000 달톤 미만의 평균 크기를 가진 올리고펩티드의 혼합물을 함유하는 단백질 가수분해물 조성물의 제조 방법을 제공하며, 여기서 조성물은 약 pH 7.0 미만에서 적어도 60%의 고체 용해도 지수 및 적어도 2.5%, 일반적으로는 적어도 약 5.0%, 바람직하게는 적어도 약 7.5%, 가장 바람직하게는 적어도 약 10%의 가수분해도를 가진다. 본 방법은 적어도 하나의 엔도펩티다제에 단백질 재료를 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 단백질 재료가 가수분해되어 올리고펩티드의 혼합물을 형성한다. 본 방법은 가수분해물의 pH를 약 pH 7.0 미만으로 강하시키는 단계를 추가로 포함한다.

a. 가수분해성 분해

본 방법의 제1 단계는 단백질 재료를 더 작은 크기의 올리고펩티드 단편의 혼합물로 분해함을 포함한다. 일반적으로, 단백질 재료를 적어도 하나의 엔도펩티다제에 접촉시켜 올리고펩티드의 혼합물을 형성시킨다. 적합한 단백질 재료 및 적합한 엔도펩티다제의 예는 하기에 상세히 설명한다.

i. 단백질 재료

일부 구현예에서, 단백질 재료는 대두 단백질 재료일 수 있다. 다양한 대두 단백질 재료를 본 발명의 방법에 사용하여 대두 단백질 가수분해물을 생성시킬 수 있다. 일반적으로, 대두 단백질 재료는 당업계에 공지된 방법에 따라 전대두(whole soybean)로부터 유래될 수 있다. 전대두는 표준 대두(즉, 유전적으로 개질되지 않은 대두), 유전적으로 개질된 대두(예를 들어, 개질된 오일을 함유하는 대두, 개질된 탄수화물을 함유하는 대두, 개질된 단백질 서브유닛을 함유하는 대두 등) 및 그의 조합일 수 있다. 대두 단백질 재료의 적합한 예는 대두 추출물, 대두유, 대두유 분말(soymilk powder), 대두 응고물(soy curd), 대두 가루(soy flour), 대두 단백질 단리물(soy protein isolate), 대두 단백질 농축물(soy protein concentrate) 및 그의 혼합물을 포함한다.

이 구현예의 반복에서, 본 방법에 사용되는 대두 단백질 재료는 대두 단백질 단리물(단리된 대두 단백질 또는 ISP(isolated soy protein)라고도 지칭함)일 수 있다. 일반적으로, 대두 단백질 단리물은 무수(moisture-free) 기준으로 적어도 약 90% 대두 단백질의 단백질 함량을 가진다. 대두 단백질 단리물은 온전한 대두 단백질을 함유하거나 부분적으로 가수분해된 대두 단백질을 함유할 수 있다. 대두 단백질 단리물은 고함량의 저장 단백질 서브유닛, 예를 들어 7S, 11S, 2S 등을 가질 수 있다. 본 발명에서 시재료로 사용될 수 있는 대두 단백질 단리물의 비한정적인 예는, 예를 들어 솔래, LLC(Solae, LLC)(미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 상업적으로 이용가능하며, 이중에서 수프로(등록상표)(SUPRO ^® ) 500E, 수프로(등록상표) 620, 수프로(등록상표) 670, 수프로(등록상표) EX 33, 수프로(등록상표) 플러스(SUPRO ^® PLUS) 2600F IP, 수프로(등록상표) 플러스 2640DS, 수프로(등록상표) 플러스 2800, 수프로(등록상표) 플러스 3000 및 그의 조합을 포함한다.

다른 구현예에서, 대두 단백질 재료는 무수 기준으로 단백질 함량이 약 65% 내지 약 90% 미만인 대두 단백질 농축물일 수 있다. 본 발명에 유용한 적합한 대두 단백질 농축물의 예는 프로콘(등록상표)(PROCON ^® ) 제품군, 알파(등록상표)(ALPHA ^® ) 12 및 알파(등록상표) 5800을 포함하며, 이들 모두는 솔래, LLC로부터 상업적으로 이용가능하다. 대안적으로, 대두 단백질 재료의 공급원으로서 대두 단백질 단리물의 일부를 대체하기 위하여 대두 단백질 농축물을 대두 단백질 단리물과 블렌딩할 수 있다. 통상적으로, 만일 대두 단백질 농축물이 대두 단백질 단리물의 일부를 대체한다면, 대두 단백질 농축물은 중량 기준으로 많아야 대두 단백질 단리물의 최대 약 40%를 대체하며, 더욱 바람직하게는 중량 기준으로 대두 단백질 단리물의 최대 약 30%를 대체한다.

또 다른 반복에서, 대두 단백질 재료는 대두 가루일 수 있으며, 이는 무수 기준으로 약 49% 내지 약 65%의 단백질 함량을 가진다. 대두 가루는 탈지 대두 가루, 부분 탈지 대두 가루, 또는 전지 대두 가루일 수 있다. 대두 가루는 대두 단백질 단리물 또는 대두 단백질 농축물과 블렌딩될 수 있다.

또 다른 반복에서, 대두 단백질 재료는 원심분리에서의 침강을 기준으로 4개 주요 저장 단백질 분획 또는 서브유닛(15S, 11S, 7S 및 2S)으로 분리된 재료일 수 있다. 일반적으로, 11S 분획에는 글리시닌이 매우 풍부하고 7S 분획에는 베타-콘글리시닌이 매우 풍부하다.

다른 구현예에서는, 단백질 재료가 대두 이외의 식물로부터 유래될 수 있다. 비한정적인 예로서, 적합한 식물은 아마란스(amaranth), 애로루트(arrowroot), 보리, 메밀, 카놀라, 카사바, 찬나(channa)(병아리콩(garbanzo)), 콩과식물(legume), 편두(lentil), 루핀, 옥수수, 기장(millet), 귀리, 완두콩, 감자, 쌀, 호밀, 수수(sorghum), 해바라기, , 타피오카, 라이밀(triticale), 밀 및 그의 혼합물을 포함한다. 특히 바람직한 식물성 단백질은 보리, 카놀라, 루핀, 옥수수, 귀리, 완두콩, 감자, 쌀, 밀 및 그의 조합을 포함한다. 한 반복에서, 식물성 단백질 재료는 카놀라 곡분(meal), 카놀라 단백질 단리물, 카놀라 단백질 농축물 및 그의 조합일 수 있다. 다른 반복에서, 식물성 단백질 재료는 옥수수 또는 콘(corn) 단백질 분말, 옥수수 또는 콘 단백질 농축물, 옥수수 또는 콘 단백질 단리물, 옥수수 또는 콘 배아, 옥수수 또는 콘 글루텐, 옥수수 또는 콘 글루텐 곡분, 옥수수 또는 콘 가루, 제인 단백질 및 그의 조합일 수 있다. 또 다른 반복에서, 식물성 단백질 재료는 보리 분말, 보리 단백질 농축물, 보리 단백질 단리물, 보리 곡분, 보리 가루 및 그의 조합일 수 있다. 대안적인 반복에서, 식물성 단백질 재료는 루핀 가루, 루핀 단백질 단리물, 루핀 단백질 농축물 및 그의 조합일 수 있다. 다른 대안적 구현예에서, 식물성 단백질 재료는 귀리 곡분, 귀리 가루, 귀리 단백질 가루, 귀리 단백질 단리물, 귀리 단백질 농축물 및 그의 조합일 수 있다. 또 다른 반복에서, 식물성 단백질 재료는 완두콩 가루, 완두콩 단백질 단리물, 완두콩 단백질 농축물 및 그의 조합일 수 있다. 또 다른 반복에서, 식물성 단백질 재료는 감자 단백질 분말, 감자 단백질 단리물, 감자 단백질 농축물, 감자 가루 및 그의 조합일 수 있다. 추가의 구현예에서, 식물성 단백질 재료는 쌀 가루, 쌀 곡분, 쌀 단백질 분말, 쌀 단백질 단리물, 쌀 단백질 농축물 및 그의 조합일 수 있다. 다른 대안적 반복에서, 식물성 단백질 재료는 밀 단백질 분말, 밀 글루텐, 밀 배아, 밀 가루, 밀 단백질 단리물, 밀 단백질 농축물, 가용화 밀 단백질 및 그의 조합일 수 있다.

다른 구현예에서, 단백질 재료는 동물성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 한 반복에서, 동물성 단백질 재료는 난(egg)으로부터 유래될 수 있다. 적합한 난 단백질의 비한정적 예는 분말형 난, 건조 난 고형물, 건조 난백 단백질, 액상 난백 단백질, 난백 단백질 분말, 단리된 오브알부민 단백질 및 그의 조합을 포함한다. 난 단백질은 닭, 오리, 거위, 메추라기, 또는 기타 조류의 난으로부터 유래될 수 있다. 대안적인 반복에서, 단백질 재료는 유제품 공급원(dairy source)으로부터 유래될 수 있다. 적합한 유제품 단백질은 탈지 분유(non-fat dry milk powder), 유단백질 단리물, 유단백질 농축물, 산 카제인(acid casein), 카제이네이트(예를 들어, 소듐 카제이네이트, 칼슘 카제이네이트 등), 유청 단백질 단리물, 유청 단백질 농축물 및 그의 조합을 포함한다. 유단백질 재료는 젖소(cow), 염소, 양, 당나귀, 낙타, 카멜리드(camelid), 야크, 물소 등으로부터 유래될 수 있다. 추가의 반복에서, 단백질은 육상 또는 수생 동물의 골격, 근육, 기관 또는 결합 조직으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 동물성 단백질은 소 또는 다른 동물의 뼈, 결합 조직, 기관 등으로부터 추출되는 콜라겐의 부분적 가수분해에 의해 생산되는 젤라틴일 수 있다.

본 발명의 방법에는 또한, 대두 단백질 재료 및 적어도 하나의 다른 단백질 재료의 조합도 사용될 수 있을 것으로 예상된다. 즉, 대두 단백질 재료 및 적어도 하나의 다른 단백질 재료의 조합으로부터 단백질 가수분해물 조성물을 제조할 수 있다. 한 구현예에서는, 채소 단백질 재료, 동물성 단백질 재료, 유제품 단백질 재료, 난 단백질 재료 및 그의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 다른 단백질 재료 및 대두 단백질 재료의 조합으로부터 단백질 가수분해물 조성물을 제조할 수 있다. 채소 단백질 재료는 보리, 카놀라, 루핀, 옥수수, 귀리, 완두콩, 감자, 쌀, 밀, 당업계에 공지된 임의의 다른 채소 단백질, 및 그의 조합을 포함할 수 있다.

조합으로 사용된 적어도 하나의 다른 단백질 재료 및 대두 단백질 재료의 농도는 변동될 수 있으며 변동될 것이다. 대두 단백질 재료의 양은, 조합으로 사용된 총 단백질의 약 1% 내지 약 99%의 범위일 수 있다. 한 구현예에서 대두 단백질 재료의 양은, 조합으로 사용된 총 단백질의 약 1% 내지 약 20%의 범위일 수 있다. 다른 구현예에서 대두 단백질 재료의 양은, 조합으로 사용된 총 단백질의 약 20% 내지 약 40%의 범위일 수 있다. 또 다른 구현예에서 대두 단백질 재료의 양은, 조합으로 사용된 총 단백질의 약 40% 내지 약 80%의 범위일 수 있다. 추가의 구현예에서 대두 단백질 재료의 양은, 조합으로 사용된 총 단백질의 약 80% 내지 약 99%의 범위일 수 있다. 마찬가지로, 적어도 하나의 다른 단백질 재료의 양은, 조합으로 사용된 총 단백질의 약 1% 내지 약 99%의 범위일 수 있다. 한 구현예에서 적어도 하나의 다른 단백질 재료의 양은, 조합으로 사용된 총 단백질의 약 1% 내지 약 20%의 범위일 수 있다. 다른 구현예에서 적어도 하나의 다른 단백질 재료의 양은, 조합으로 사용된 총 단백질의 약 20% 내지 약 40%의 범위일 수 있다. 또 다른 구현예에서 적어도 하나의 다른 단백질 재료의 양은, 조합으로 사용된 총 단백질의 약 40% 내지 약 80%의 범위일 수 있다. 추가의 구현예에서 적어도 하나의 다른 단백질 재료의 양은, 조합으로 사용된 총 단백질의 약 80% 내지 약 99%의 범위일 수 있다.

본 발명의 방법에서, 통상적으로 단백질 재료는 물에 혼합 또는 분산되어 약 1 중량% 내지 약 20 중량% 단백질을 함유하는 슬러리를 형성한다("현행" 기준("as is" basis)). 한 구현예에서, 슬러리는 약 1 중량% 내지 약 5 중량% 단백질(현행)을 함유할 수 있다. 다른 구현예에서, 슬러리는 약 6 중량% 내지 약 10 중량% 단백질(현행)을 함유할 수 있다. 추가의 구현예에서, 슬러리는 약 11 중량% 내지 약 15 중량% 단백질(현행)을 함유할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 슬러리는 약 16 중량% 내지 약 20 중량% 단백질(현행)을 함유할 수 있다.

단백질 재료를 물에 분산시킨 후에, 단백질 재료의 슬러리를 약 70℃ 내지 약 90℃로 약 2 분 내지 약 20 분 동안 가열하여 추정상의 내인성 프로테아제 저해제를 비활성화시킬 수 있다. 가수분해 반응을 최적화하기 위하여, 특히 가수분해 반응에 사용되는 엔도펩티다제가 그의 최적 활성 수준 부근에서 기능함을 보장하기 위하여, 통상적으로 단백질 슬러리의 pH 및 온도를 조절한다. 당업계에 일반적으로 공지된 방법에 따라 단백질 슬러리의 pH를 조절하고 모니터할 수 있다. 단백질 슬러리의 pH를 약 pH 7.0 내지 약 pH 11.0의 수치로 조절하고 유지할 수 있다. 한 구현예에서는 단백질 슬러리의 pH를 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0으로 조절하여 유지할 수 있다. 다른 구현예에서는 단백질 슬러리의 pH를 약 pH 8.0 내지 약 pH 9.0으로 조절하여 유지할 수 있다. 또 다른 구현예에서는 단백질 슬러리의 pH를 약 pH 9.0 내지 약 pH 10.0으로 조절하여 유지할 수 있다. 바람직한 구현예에서는 단백질 슬러리의 pH를 약 pH 8.0 내지 약 pH 8.5로 조절하여 유지할 수 있다.

당업계에 공지된 방법에 따른 가수분해 반응 중에, 바람직하게는 단백질 슬러리의 온도를 약 30℃, 바람직하게는 적어도 약 50℃ 내지 약 80℃로 조절하여 유지한다. 일반적으로 상기 범위를 초과하는 온도는 엔도펩티다제를 비활성화시킬 수 있다. 상기 범위 미만의 온도는 엔도펩티다제의 활성을 둔화시키는 경향이 있다. 한 구현예에서는 가수분해 반응 중에 단백질 슬러리의 온도를 약 50℃ 내지 약 60℃로 조절하여 유지할 수 있다. 다른 구현예에서는 가수분해 반응 중에 단백질 슬러리의 온도를 약 60℃ 내지 약 70℃로 조절하여 유지할 수 있다. 또 다른 구현예에서는 가수분해 반응 중에 단백질 슬러리의 온도를 약 70℃ 내지 약 80℃로 조절하여 유지할 수 있다.

ii . 엔도펩티다제

일반적으로, 단백질 재료의 슬러리에 적어도 하나의 엔도펩티다제를 첨가하여 반응 혼합물을 형성시킴으로써 가수분해 반응이 개시된다. 엔도펩티다제는 단백질 재료의 단백질 내의 펩티드 결합의 분해를 촉매함으로써 더 작은 크기의 올리고펩티드의 혼합물을 형성시킨다. 엔도펩티다제는 일반적으로 폴리펩티드 쇄의 내부 영역 내의 펩티드 결합을 분해하는 효소이다.

몇 가지 엔도펩티다제가 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다. 일반적으로, 엔도펩티다제는 광범위한 활성을 가질 것이다(즉, 본질적으로 임의의 2개 아미노산 잔기 사이의 펩티드 결합을 가수분해할 것이다). 통상적으로, 엔도펩티다제는 약 7.0 내지 약 11.0의 pH, 및 약 30℃, 바람직하게는 적어도 약 50℃ 내지 약 80℃의 온도에서 최적 활성을 갖는 식품-등급 효소일 수 있다. 바람직하게는, 엔도펩티다제가 미생물 기원의 효소일 것이다. 동물 또는 식물 효소가 아닌 미생물 효소의 사용은, 미생물 효소가 광범위한 특질(pH 최적점, 온도 등)을 나타내며 상대적으로 많은 양으로 일관성있게 얻을 수 있다는 점에서 유리하다. 일반적으로, 엔도펩티다제는 세린 펩티다제 계통의 구성원일 것이다(메롭스 펩티다제 데이터베이스(MEROPS Peptidase Database), 발매(release) 8.00A 참조; http//merops.sanger.ac.uk).

한 구현예에서, 엔도펩티다제는 노보자임스(Novozymes)(덴마크 박스베르드(Bagsvaerd) 소재)로부터 상표명 알칼라제(등록상표)로 이용가능한 바실러스 리케니포르미스(Bacillus lichniformis) 유래 섭틸리신 프로테아제 또는 그의 변이체(메롭스 등록 번호 MER000309)일 수 있다. 다른 구현예에서, 엔도펩티다제는 다른 미생물로부터 유래된 섭틸리신 또는 그의 변이체일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 엔도펩티다제는 노카르디옵시스 프라시나(Nocardiopsis prasina)로부터의 세린 프로테아제(SP1)일 수 있다(원용에 의해 그 전체 내용이 본 명세서에 포함된 국제 특허 출원 제WO02005035747호). SP1의 아미노산 서열은 ADIIGGLAYT MGGRCSVGFA ATNAAGQPGF VTAGHCGRVG TQVTIGNGRG VFEQSVFPGN DAAFVRGTSN FTLTNLVSRY NTGGYATVAG HNQAPIGSSV CRSGSTTGWH CGTIQARGQS VSYPEGTVTN MTRTTVCAEP GDSGGSYISG TQAQGVTSGG SGNCRTGGTT FYQEVTPMVN SWGVRLRT(서열 번호 1)이다.

추가의 구현예에서, 엔도펩티다제는 서열 번호 1과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84% 또는 85% 동일한 아미노산 서열을 가진 세린 프로테아제 또는 그의 단편일 수 있다. 다른 구현예에서, 엔도펩티다제는 서열 번호 1과 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% 또는 92% 동일한 아미노산 서열을 가진 세린 프로테아제 또는 그의 단편일 수 있다. 또 다른 구현예에서 엔도펩티다제는 서열 번호 1과 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 가진 세린 프로테아제 또는 그의 단편일 수 있다.

본 발명을 위하여, 2개 아미노산 서열의 정렬은 EMBOSS 패키지(Rice, P., Longden, I. and Bleasby, A. (2000) EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite. Trends in Genetics 16, (6) pp276-277; http://emboss.org) 버전 2.8.0의 니들 프로그램(Needle program)을 사용하여 결정할 수 있다. 니들 프로그램은 문헌[Needleman, SB and Wunsch, CD (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453]에 기술된 전체 정렬 알고리듬(global alignment algorithm)을 실행한다. 사용된 치환 행렬은 블로섬(BLOSUM)62이고, 갭 오프닝 페널티(gap opening penalty)는 10이며, 갭 연장 페널티(gap extension penalty)는 0.5이다. 일반적으로, 서열 동일성의 백분율은 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교창(comparison window)에서 비교함으로써 결정되며, 여기서 2개 서열의 최적 정렬을 위하여 비교창 내의 아미노산 서열의 일부는 기준 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 2개 서열 모두에서 동일한 아미노산이 나타나는 위치의 수를 결정하여 일치하는 위치의 수를 산출하고, 일치하는 위치의 수를 비교창의 2개 서열 중 짧은 서열 내의 위치 총수로 나눈 후, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 백분율을 계산한다.

폴리펩티드의 기능에 영향을 주지 않으면서도 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 가진 다른 아미노산 잔기로 치환할 수 있음을, 당업자는 이해할 것이다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 가진 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 가진 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌이며; 아미드-포함 측쇄를 가진 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 가진 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판이며; 염기성 측쇄를 가진 아미노산의 그룹은 라이신, 알지닌 및 히스티딘이고; 황-포함 측쇄를 가진 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존성(conservative) 아미노산 치환 그룹은 하기의 것들을 포함한다: 발린-류신-아이소류신, 페닐알라닌-타이로신, 라이신-알지닌, 알라닌-발린, 및 아스파라긴-글루타민. 따라서, 엔도펩티다제는 서열 번호 1에 대해 적어도 하나의 보존성 아미노산 치환을 가질 수 있다. 한 구현예에서 엔도펩티다제는 서열 번호 1에 대해 약 45개의 보존성 아미노산 치환을 가질 수 있다. 다른 구현예에서 엔도펩티다제는 서열 번호 1에 대해 약 35개의 보존성 아미노산 치환을 가질 수 있다. 또 다른 구현예에서 엔도펩티다제는 서열 번호 1에 대해 약 25개의 보존성 아미노산 치환을 가질 수 있다. 또 다른 구현예에서 엔도펩티다제는 서열 번호 1에 대해 약 15개의 보존성 아미노산 치환을 가질 수 있다. 대안적인 구현예에서 엔도펩티다제는 서열 번호 1에 대해 약 10개의 보존성 아미노산 치환을 가질 수 있다. 또 다른 구현예에서 엔도펩티다제는 서열 번호 1에 대해 약 5개의 보존성 아미노산 치환을 가질 수 있다. 추가의 구현예에서 엔도펩티다제는 서열 번호 1에 대해 약 1개의 보존성 아미노산 치환을 가질 수 있다.

엔도펩티다제의 조합 또한 본 발명의 방법에 이용할 수 있을 것으로도 예상된다. 예를 들어, 알칼라제(등록상표) 및 SP1의 혼합물에 단백질 재료를 접촉시킬 수 있다. 대안적으로, 서열 번호 1과 적어도 80% 동일한 엔도펩티다제 및 SP1의 혼합물에 단백질 재료를 접촉시킬 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 범위를 이탈하지 않으면서 광범위한 세린 프로테아제의 다른 조합을 사용할 수 있다.

단백질 재료 및 엔도펩티다제(들)의 예시적 조합을 표 A에 나타낸다.

[표 A]

단백질 슬러리에 첨가되는 엔도펩티다제의 양은 단백질 재료, 목적하는 가수분해도, 및 가수분해 반응의 지속 시간에 따라 변동될 수 있으며 변동될 것이다. 일반적으로, 엔도펩티다제의 양은 시재료 단백질 킬로그램당 약 1 ㎎의 효소 단백질 내지 약 5000 ㎎의 효소 단백질의 범위일 것이다. 다른 구현예에서, 엔도펩티다제의 양은 시재료 단백질 킬로그램당 50 ㎎의 효소 단백질 내지 약 1000 ㎎의 효소 단백질의 범위일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 엔도펩티다제의 양은 시재료 단백질 킬로그램당 약 1000 ㎎의 효소 단백질 내지 약 5000 ㎎의 효소 단백질의 범위일 수 있다.

당업자가 인식하는 바와 같이, 가수분해 반응의 지속 시간은 예를 들어 엔도펩티다제의 농도 및 목적하는 가수분해도에 따라 변동될 수 있으며 변동될 것이다. 일반적으로, 가수분해 반응의 지속 시간은 수 분 내지 여러 시간, 예를 들어 약 5 분 내지 약 48 시간의 범위일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 반응의 지속 시간은 약 30 분 내지 약 120 분일 수 있다.

가수분해 반응을 종결시키기 위하여, 엔도펩티다제를 비활성화시키기에 충분한 고온으로 반응 혼합물을 가열할 수 있다. 예를 들어, 반응 혼합물을 대략 90℃의 온도로 가열하면 대부분의 프로테아제가 실질적으로 열-비활성화(heat-inactivate)될 것이다. 대안적으로, 반응 혼합물의 pH를 약 4.0로 강하시키고 약 80℃를 초과하는 온도로 반응 혼합(reaction mix)을 가열함으로써 가수분해 반응을 종결시킬 수 있다. 반응 혼합물의 pH를 강하시키기 위해 사용할 수 있는 산의 예는 구연산, 포름산, 푸마르산, 염산, 젖산, 사과산, 인산 및 그의 조합을 포함한다.

b. 가수분해물의 pH 강하

본 방법의 제2 단계는 약 pH 7.0 미만의 수치로 단백질 가수분해물의 pH를 강하시킴을 포함한다. 한 구현예에서는, 단백질 가수분해물의 pH를 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.0의 수준으로 조절할 수 있다. 다른 구현예에서는, 단백질 가수분해물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0의 수준으로 조절할 수 있다. 추가의 구현예에서는, 단백질 가수분해물의 pH를 약 pH 4.0 내지 약 pH 5.0의 수준으로 조절할 수 있다. 또 다른 구현예에서는, 단백질 가수분해물의 pH를 약 pH 3.0 내지 약 pH 4.0의 수준으로 조절할 수 있다. 다른 대안적 구현예에서는, 단백질 가수분해물의 pH를 약 pH 2.0 내지 약 pH 3.0의 수준으로 조절할 수 있다. 또 다른 대안적 구현예에서는, 단백질 가수분해물의 pH를 약 pH 1.0 내지 약 pH 2.0의 수준으로 조절할 수 있다. 바람직한 구현예에서는, 단백질 가수분해물의 pH를 약 pH 5.0 미만의 pH 수치로 조절할 수 있다.

일반적으로 단백질 가수분해물의 pH 수준을 조절하기 위하여 산성 용액이 사용될 것이다. 가수분해물의 pH를 조절하기 위해 사용할 수 있는 산의 비한정적인 예는 구연산, 포름산, 푸마르산, 염산, 젖산, 사과산, 인산 및 그의 조합을 포함한다.

II. 단백질 가수분해물 조성물

본 발명의 다른 태양은, 약 10,000 달톤 미만의 평균 크기를 가진 올리고펩티드의 혼합물을 함유하는 단백질 가수분해물 조성물을 포함한다. 부가적으로, 조성물은 약 7.0 미만의 pH에서 적어도 약 60%의 고체 용해도 지수 및 적어도 약 2.5%, 일반적으로는 적어도 약 5.0%, 바람직하게는 적어도 약 7.5%, 가장 바람직하게는 적어도 약 10%의 가수분해도를 가진다.

가수분해도(%DH)는, 분해된 펩티드 결합 대 시작점의 총 펩티드 결합 수의 백분율을 지칭한다. 예를 들어, 총 500개의 펩티드 결합을 포함하는 온전한 단백질을 50개의 펩티드 결합이 분해될 때까지 가수분해한다면, 생성된 가수분해물의 가수분해도는 10%이다. 실시예에 상세하게 설명된 o-프탈다이알데히드(OPA: o-phthaldialdehye) 방법 또는 트라이니트로벤젠 설폰산(TNBS: trinitrobenzene sulfonic) 비색법을 사용하여 가수분해도를 결정할 수 있다. 가수분해도가 높을수록 단백질 가수분해 정도가 커진다. 통상적으로, 단백질이 추가로 가수분해됨에 따라(즉, 가수분해도가 높을수록), 펩티드 단편의 분자량이 감소하며, 펩티드 프로파일이 이에 따라 변화하고, 혼합물의 점도가 감소한다. 전체 가수분해물(즉, 전체 분획)에서 가수분해도를 측정하거나, 가수분해물의 가용성 분획(즉, 가수분해물을 약 500-1000 xg에서 약 5-10 분 동안 원심분리한 후의 상등액 분획)에서 가수분해도를 측정할 수 있다.

단백질 재료의 공급원, 사용되는 엔도펩티다제(들), 및 가수분해 반응의 조건에 따라 단백질 가수분해물 조성물의 가수분해도가 변동될 수 있으며 변동될 것이다. 일반적으로, 단백질 가수분해물 조성물의 가수분해도는 약 10%를 초과할 것이다. 한 구현예에서, 단백질 가수분해물 조성물의 가수분해도는 약 10% 내지 약 15%의 범위일 수 있다. 다른 구현예에서, 단백질 가수분해물 조성물의 가수분해도는 약 15% 내지 약 20%의 범위일 수 있다. 추가의 구현예에서, 단백질 가수분해물 조성물의 가수분해도는 약 20% 내지 약 25%의 범위일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 단백질 가수분해물 조성물의 가수분해도는 약 25% 내지 약 35%의 범위일 수 있다.

고체 용해도 지수(SSI: solid solubility index) 또는 가용성 고체의 백분율은 단백질 가수분해물 조성물을 함유하는 고체(즉, 폴리펩티드 및 그의 단편)의 용해도의 척도이다. 원심분리(예를 들어, 약 5-10 분 동안 약 500-1000 xg) 전 및 후의 용액 내에서 고체의 양을 측정함으로써 가용성 고체의 양을 평가할 수 있다. 대안적으로, 당업계에 주지된 기술(예를 들어, 바이신코닌산(BCA: bicinchoninic acid) 단백질 결정 비색 에세이)을 사용하여 원심분리 전 및 후에 조성물 내의 단백질 양을 평가함으로써 가용성 고체의 양을 결정할 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 단백질 가수분해물 조성물은 약 pH 7.0 미만의 pH 수치에서 적어도 60%의 고체 용해도 지수를 가질 것이다. 한 구현예에서, 가수분해물의 고체 용해도 지수는 약 pH 7.0 미만의 pH 수치에서 약 60% 내지 약 70%의 범위일 수 있다. 다른 구현예에서, 가수분해물의 고체 용해도 지수는 약 pH 7.0 미만의 pH 수치에서 약 70% 내지 약 80%의 범위일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 가수분해물의 고체 용해도 지수는 약 pH 7.0 미만의 pH 수치에서 약 80% 내지 약 90%의 범위일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 가수분해물의 고체 용해도 지수는 약 pH 7.0 미만의 pH 수치에서 약 90% 내지 약 99%의 범위일 수 있다.

일반적으로, 단백질 가수분해물 조성물은 시재료 단백질에 비해 다양한 길이 및 분자 크기의 올리고펩티드의 혼합물을 함유할 것이다. 올리고펩티드의 분자 크기는 약 75 달톤(즉, 유리 글리신) 내지 약 100,000 달톤의 범위일 수 있다. 일반적으로, 단백질 가수분해물 조성물을 형성하는 올리고펩티드의 평균 크기는 약 10,000 달톤 미만일 것이다. 한 구현예에서, 단백질 가수분해물 조성물을 형성하는 올리고펩티드의 평균 크기는 약 8000 달톤 미만일 수 있다. 다른 구현예에서, 단백질 가수분해물 조성물을 형성하는 올리고펩티드의 평균 크기는 약 6000 달톤 미만일 수 있다. 추가의 구현예에서, 단백질 가수분해물 조성물을 형성하는 올리고펩티드의 평균 크기는 약 4000 달톤 미만일 수 있다. 대안적인 구현예에서, 단백질 가수분해물 조성물을 형성하는 올리고펩티드의 평균 크기는 약 2000 달톤 미만일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 단백질 가수분해물 조성물을 형성하는 올리고펩티드의 평균 크기는 약 1000 달톤 미만일 수 있다.

일반적으로 본 발명의 단백질 가수분해물 조성물은 실질적으로 안정하다. 본 명세서에서 사용된 "안정성"은, 시간 경과에 따른 침강물 형성이 없음을 지칭한다. 단백질 가수분해물 조성물은 실온(즉, 약 23℃)에 또는 냉장 온도(즉, 약 4℃)에서 보관할 수 있다. 한 구현예에서 단백질 가수분해물 조성물은 약 1 주 내지 약 4 주 동안 안정할 수 있다. 다른 구현예에서 단백질 가수분해물 조성물은 약 1 개월 내지 약 6 개월 동안 안정할 수 있다. 추가의 구현예에서, 단백질 가수분해물 조성물은 약 6 개월을 초과하여 안정할 수 있다.

또한, 본 발명의 단백질 가수분해물 조성물을 건조시킬 수 있다. 예를 들어, 단백질 가수분해물 조성물을 분무건조시킬 수 있다. 분무 건조기 입구의 온도는 약 260℃(500℉) 내지 약 316℃(600℉)의 범위일 수 있으며, 배기 온도는 약 82℃(180℉) 내지 약 38℃(100℉)의 범위일 수 있다. 대안적으로, 단백질 가수분해물 조성물을 진공건조시키거나, 동결건조시키거나, 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 건조시킬 수 있다.

단백질 재료가 대두인 구현예에서, 단백질 가수분해물 조성물은 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 및 45로 구성된 그룹에 상응하거나 그로부터 유래된 아미노산 서열을 가진 적어도 하나의 올리고펩티드를 함유할 수 있다. 한 구현예에서, 단백질 가수분해물 조성물은 서열 번호 2-45로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 10개의 올리고펩티드 또는 그의 단편을 함유할 수 있다. 다른 구현예에서, 단백질 가수분해물 조성물은 서열 번호 2-45로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 20개의 올리고펩티드 또는 그의 단편을 함유할 수 있다. 추가의 구현예에서, 단백질 가수분해물 조성물은 서열 번호 2-45로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 30개의 올리고펩티드 또는 그의 단편을 함유할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 단백질 가수분해물 조성물은 서열 번호 2-45로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 40개의 올리고펩티드 또는 그의 단편을 함유할 수 있다. 대안적인 구현예에서, 단백질 가수분해물 조성물은 서열 번호 2-45에 상응하는 올리고펩티드 또는 그의 단편을 함유할 수 있다.

본 발명은 대두 단백질 가수분해물에서 동정된 임의의 올리고펩티드들도 포함한다. 예를 들어, 크기배제 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 등과 같은 크로마토그래피 방법에 의해 올리고펩티드를 정제할 수 있다. 대안적으로, 당업계에 공지된 합성 방법을 사용하여 올리고펩티드를 합성할 수 있다.

단백질 가수분해물 조성물, 특히 본 발명의 대두 단백질 가수분해물은 조성물은 시재료 단백질 또는 다른 가수분해물 조성물에 대해 향상된 관능 및 미감 프로파일을 가질 수 있다. 형성된 폴리펩티드 단편의 수 및 그의 개별적인 크기에 부가하여, 통상적으로 가수분해도는 생성된 대두 단백질 가수분해물 조성물의 다른 물리적 특성 및 관능 특성에 영향을 미친다. 일반적으로, 본 발명의 대두 단백질 가수분해물 조성물은 상업적으로 이용가능한 대두 단백질 가수분해물에 비해 실질적으로 쓴 맛이 덜한 관능 속성 및 개선된 전반적 선호도 점수(liking score)를 가진다.

III. 단백질 가수분해물 조성물을 함유하는 식료품

본 발명의 추가 태양은 본 명세서에 기술된 임의의 단백질 가수분해물 조성물을 함유하는 식료품을 제공한다. 대안적으로, 식료품은 본 명세서에 기술된 임의의 단리된 폴리펩티드 또는 그의 단편을 함유할 수 있다.

목적하는 식품 또는 음료 산물에 따라 특정 단백질 가수분해물 조성물의 선택이 달라질 것이다. 일부 구현예에서 단백질 가수분해물 조성물은 대두 단백질로부터 유래될 수 있다. 다른 구현예에서 단백질 가수분해물 조성물은 채소 단백질 재료, 동물성 단백질 재료, 유제품 단백질 재료, 난 단백질 재료 및 그의 조합으로부터 유래될 수 있다. 채소 단백질 재료는 보리, 카놀라, 루핀, 옥수수, 귀리, 완두콩, 감자, 쌀, 밀, 당업계에 공지된 임의의 다른 채소 단백질 및 그의 조합을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 단백질 가수분해물 조성물은 채소 단백질 재료, 동물성 단백질 재료, 유제품 단백질 재료, 난 단백질 재료 및 그의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 다른 단백질 공급원과 대두의 조합으로부터 유래될 수 있다. 채소 단백질 재료는 보리, 카놀라, 루핀, 옥수수, 귀리, 완두콩, 감자, 쌀, 밀, 당업계에 공지된 임의의 다른 채소 단백질, 및 그의 조합을 포함할 수 있다. 대안적인 구현예에서, 단백질 가수분해물 조성물은 상이한 단백질 가수분해물의 조합을 함유할 수 있다. 부가적인 구현예에서, 단백질 가수분해물 조성물은 서열 번호 2-45로 구성된 아미노산 서열의 그룹으로부터 선택된 단리되거나 합성된 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 또한, 식료품의 제조에 사용되는 단백질 가수분해물 조성물의 가수분해도는, 예를 들어 단백질 재료의 공급원 및 목적하는 식료품에 따라 변동될 것이다.

식품 또는 음료 산물은 식용 재료를 추가로 포함할 수 있다. 적절한 식용 재료의 선택은 목적하는 식품 또는 음료 산물에 따라 변동될 것이다. 식용 재료는 식물-유래 재료, 동물-유래 재료, 또는 식물-유래 재료, 동물-유래 재료 등으로부터 단리된 생체재료(즉, 단백질, 탄수화물, 지질 등)일 수 있다.

음료는 직접음용형(RTD: ready-to-drinke) 음료일 수 있다. 음료는 실질적으로 맑은 음료, 예를 들어 쥬스 음료, 과일향 음료, 탄산 음료, 스포츠 드링크, 영양보충 음료, 체중관리 음료 또는 알코올-기제의 과일 음료일 수 있다. 상기의 실질적으로 맑은 음료는 통상적으로 약 pH 5.0 미만의 pH 수치를 가진다. 바람직한 구현예에서, 실질적으로 맑은 음료는 약 pH 4.0 미만의 pH 수치를 가질 수 있다.

대안적으로, 음료는 실질적인 혼탁 음료(cloudy beverage), 예를 들어 식사대용 드링크(meal replacement drink), 단백질 쉐이크(protein shake), 커피-기제의 음료, 영양보충 음료 또는 체중관리 음료일 수 있다. 일반적으로, 실질적인 혼탁 음료는 약 pH 7.0 미만의 pH 수치를 가질 것이다.

산물이 음료인 구현예에서, 식용 재료는 과일 쥬스, 당, 유액(milk), 탈지 분유, 카제이네이트, 대두 단백질 농축물, 대두 단백질 단리물, 유청 단백질 농축물, 유청 단백질 단리물, 단리된 유단백질, 초콜렛, 코코아 분말, 커피, 차 및 그의 조합을 포함할 수 있다. 음료는 감미료(예를 들어, 글루코스, 수크로스, 프럭토스, 말토덱스트린, 수크랄로스, 콘 시럽, 꿀, 메이플 시럽 등), 착향제(예를 들어, 과일향, 초콜렛향, 바닐라향 등), 유화제 또는 증점화제(예를 들어, 레시틴, 카라기난, 셀룰로오스 검(cellulose gum), 셀룰로오스 겔, 전분, 아라비아 고무, 잔탄 고무 등); 안정화제, 지질 재료(예를 들어, 카놀라유, 해바라기유, 고올레산 해바라기유(high oleic sunflower oil), 지방 분말 등), 보존제(예를 들어, 포타슘 소르베이트, 소르브산 등), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 소듐 아스코르베이트 등), 착색제, 비타민, 무기염류 및 그의 조합을 추가로 포함할 수 있다.

대안적 구현예에서, 식료품은 조식 바(breakfast bar), 영양 바, 에너지 바 또는 체중관리 바로서의 그래놀라 바(granola bar), 스낵 바, 시리얼 바와 같은 식품 바(food bar)일 수 있다.

정의

본 발명의 이해를 촉진하기 위하여 몇 가지 용어를 하기와 같이 정의한다.

용어 "가수분해도"는 분해되는 펩티드 결합의 총수의 백분율을 지칭한다. 용어 "엔도펩티다제"는 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 쇄의 내부 펩티드 결합을 가수분해하는 효소를 지칭한다. 엔도펩티다제의 그룹은 효소 서브클래스 EC 3.4.21-25(국제 생화학 및 분자생물학연맹(International Union of Biochemistry and Molecular Biology) 효소 분류 시스템)를 포함한다.

"식품 등급 효소"는 일반적으로 안전한 물질(GRAS: generally recognized as safe)로 승인되고 인간과 같은 유기체가 섭취할 경우에 안전한 효소이다. 통상적으로, 효소 및 그 효소가 유래될 수 있는 산물은 적용되는 법률 및 규제 지침에 따라 생산된다.

"가수분해물"은 물의 효과를 통해 화합물이 분해될 경우에 얻어지는 반응 산물이다. 단백질 가수분해물은 열적, 화학적 또는 효소적 분해 후에 생성된다. 반응 과정에서, 큰 분자가 분해되어 작은 단백질, 가용성 단백질, 올리고펩티드, 펩티드 단편 및 유리 아미노산이 된다.

용어 "폴리펩티드"는 올리고펩티드를 포함한다.

"쓴 맛", "그레인(grain)" 또는 "떫은 맛"과 같은 용어들을 기술하기 위해 사용되는 용어 "관능 속성"은 실시예 2에 구체적으로 설명된 SQS 점수 시스템에 따라 결정된다.

용어 "고체 용해도 지수"는 가용성 단백질 또는 가용성 고체의 백분율을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "대두 단백질 단리물" 또는 "단리된 대두 단백질"은, 무수 기준으로 적어도 약 90% 대두 단백질의 단백질 함량을 가진 대두 재료를 지칭한다. 대두 단백질 단리물은 대두의 깍지와 배(germ)를 자엽으로부터 제거하고, 자엽을 플레이크화하거나 분쇄하고 플레이크화되거나 분쇄된 자엽으로부터 오일을 제거하고, 대두 단백질과 자엽의 탄수화물을 자엽 섬유로부터 분리하고, 그 후 탄수화물로부터 대두 단백질을 분리함으로써 대두로부터 형성된다.

본 명세서에 사용되는 용어 "대두 단백질 농축물"은 무수 기준으로 약 65% 내지 약 90% 미만의 대두 단백질의 단백질 함량을 가진 대두 재료이다. 대두 단백질 농축물은 또한 대두 자엽 섬유, 통상적으로 무수 기준으로 약 3.5 중량% 내지 최대 약 20 중량%의 대두 자엽 섬유를 함유한다. 대두 단백질 농축물은 대두의 깍지와 배를 제거하고, 자엽을 플레이크화하거나 분쇄하고 플레이크화되거나 분쇄된 자엽으로부터 오일을 제거하고, 대두 단백질과 대두 자엽 섬유를 자엽의 용해성 탄수화물로부터 분리함으로써 대두로부터 형성된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "대두 가루"는, 입자가 100번 메쉬(미국 표준) 스크린을 통과할 수 있는 크기를 가진 탈지, 부분 탈지 또는 전지 대두 재료의 세분 형태를 지칭한다. 대두의 케이크, 칩, 플레이크, 곡분 또는 재료의 혼합물은 종래의 대두 분쇄 공정을 이용하여 대두 가루로 세분화된다. 대두 가루는 무수 기준으로 약 49% 내지 약 65%의 대두 단백질 함량을 가진다. 바람직하게는 가루가 매우 미세하게 분쇄되며, 가장 바람직하게는 가루의 약 1% 미만이 300 메시(미국 표준) 스크린에 보유되도록 분쇄된다.

본 명세서에 사용되는, 용어 "대두 자엽 섬유"는 적어도 약 70%의 식이 섬유를 함유한 대두 자엽의 다당류 부분을 지칭한다. 대두 자엽 섬유는 통상적으로 일부 소량의 대두 단백질을 함유하지만, 또한 100% 섬유일 수도 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 대두 자엽 섬유는 대두 깍지 섬유를 지칭하는 것도 아니며 그를 포함하는 것도 아니다. 일반적으로, 대두 자엽 섬유는 대두의 깍지와 배를 제거하고, 자엽을 플레이크화하거나 분쇄하고 플레이크화되거나 분쇄된 자엽으로부터 오일을 제거하고, 대두 재료와 자엽의 탄수화물로부터 대두 자엽 섬유를 분리함으로써 대두로부터 형성된다.

본 발명의 범위를 이탈하지 않으면서도 상기 화합물, 산물 및 방법에 다양한 변화가 이루어질 수 있으므로, 상기 명세서 및 하기에 제공되는 실시예에 포함된 모든 사항은 제한적 의미가 아닌 예시적인 것으로 해석되어야 함이 의도된다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 다양한 구현예를 예시한다.

실시예 1. SP1 또는 알칼라제(등록상표)에 의한 대두 단백질의 가수분해

상이한 엔도펩티다제로 대두 단백질을 가수분해할 경우에 산성 pH(즉, 그의 등전점 부근)에서 가수분해물의 용해도를 증가시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위하여 하기의 연구를 수행하였다.

가수분해 반응. 시재료는 0.1 M 소듐 포스페이트(pH 8.5)에 현탁된 10% 대두 단백질 단리물(예를 들어, 수프로(등록상표) 500E)이었다. HCl을 사용하여 단백질 슬러리의 pH를 8.0으로 조절하였다. 단백질 슬러리를 약 70℃로 가열하고 노카르디옵시스 프라시나로부터의 세린 프로테아제(SP1) 또는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)로부터의 섭틸리신(ALCALASE(등록상표))으로 혼합물을 가수분해하였다. 대두 단백질 단리물 ㎏당 19.5 ㎎, 39.0 ㎎, 78.1 ㎎, 156.3 ㎎ 또는 312.5 ㎎ 프로테아제의 농도로 각각의 엔도펩티다제를 사용하였다. 70℃에서 120 분 동안 가수분해 반응을 진행시켰다. 혼합물의 pH가 약 4.0이 되고 가수분해물 내의 대두 단백질의 최종 농도가 5%가 되도록 1 M 소듐 포메이트(pH 3.7)를 첨가하여 반응을 중지시켰다.

용해도 분석. 바이신코닌산(BCA) 기제의 단백질 에세이(예를 들어, 마이크로 BCA(상표) 단백질 에세이 키트(Micro BCA™ Protein Assay Kit); 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))를 사용하여 가용성 단백질을 측정함으로써 각각의 생성 가수분해물의 가용성 고체의 백분율 또는 고체 용해도 지수(SSI)를 결정하였다. 이를 위하여, 각각의 가수분해물을 500 xg에서 10 분 동안 원심분리하여 임의의 불용성 단편을 침전시켰다. 각각의 상등액 분획을 상이한 농도로 희석할 수 있다(즉, 증류 H ₂ O로 10-, 20-, 40- 및 80-배). 이 경우에는 10배 희석을 사용하였다. 각 희석액의 20 ㎕ 분취물을 마이크로타이터 플레이트에 옮기고 160 ㎕의 BCA 작용 시약을 첨가하였다. 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션한 후에, 562 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. BSA 표준 희석(0-1 ㎎/㎖) 곡선 또한 실행시켰다. 양성 대조군은 상업적으로 이용가능한 대두 단백질 가수분해물(즉, HXP114)이었다. 양성 대조군이 100% 가용성임을 가정하여 용해도를 계산하고 백분율로 표시하였다(즉, %SSI).

각 가수분해물에서의 가용성 고체의 백분율을 표 1에 나타낸다. 각각의 엔도펩티다제 농도에서 SP1 가수분해물은 알칼라제(등록상표) 가수분해물의 경우에 비해 증가된 용해도를 가지고 있었다.

가수분해도. o-프탈다이알데히드(OPA: o-phthaldialdehyde) 에세이를 사용하여 각 가수분해물의 가수분해도(% DH)를 결정하였다. 이를 위하여, 각 가수분해물(및 가수분해하지 않은 시재료)을 물로 50-배 희석하였다. 마이크로타이터 플레이트의 웰 안에서 각각의 20 ㎕ 분취물을 180 ㎕의 OPA 시약(4 mM 다이소듐 테트라보레이트, 0.1% SDS, 0.24 mM OPA, 0.24 mM DTT와 혼합하였다. 340 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. L-세린(0-0.5 ㎎/㎖)을 사용하는 표준 곡선도 포함되었다. 각 가수분해물의 %DH 수치로부터 가수분해하지 않은 시재료의 %DH 수치를 감산함으로써 가수분해도를 계산하였다.

표 2는 결과를 나타낸다. 각 가수분해물의 가수분해도는 각각의 프로테아제 농도에서 유사하였다. 또한, 도 1에 나타낸 바와 같이, 상이한 가수분해물에 대해 가수분해도가 증가함에 따라 가용성 고체의 백분율이 증가하였으며, 이는 이들 벤치 연구(bench study)가 가용성 펩티드의 수율을 예측한다는 것을 시사한다.

실시예 2. SP1 및 알칼라제(등록상표) 가수분해물의 SQS 및 쓴 맛 분석

SP1 가수분해물의 향미 프로파일을 알칼라제(등록상표) 가수분해물의 경우와 비교하였다. 솔래 정성 스크리닝(SQS: Solae Qualitative Screening) 시험을 사용하여 쓴 맛에 대해 2개의 제제를 시험하였다. 한 가지 농도의 엔도펩티다제만 사용한 점(즉, 300 ㎎의 프로테아제/㎏ 대두)을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 가수분해물을 제조하고, 60℃에서 120 분 동안 반응을 실행하였다. 가수분해물을 85℃로 15 분 동안 가열하여 효소를 비활성화시켰다. 본질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 가수분해도 및 가용성 고체의 백분율을 결정하였다.

표 3은 각각의 가수분해물에 대한 가수분해도 및 % 가용성 고체(SSI)를 나타낸다.

SQS 방법은 시험 샘플 및 대조군 샘플 사이의 직접 비교에 기초하며, 정성적 및 지향성(directional) 정량적 상이점 양자 모두를 제공한다. 대조군 샘플은 처리하지 않은 단리된 대두 단백질의 5% 슬러리였다. 5명 내지 10명의 평가자 패널에 각각의 시험(5% 슬러리로 희석) 및 대조군 샘플의 분취물을 제공하였다. 점수를 매기기 전에 샘플을 실온으로 평형시켰다.

평가 프로토콜은, 컵의 바닥이 테이블에 닿아있는 상태에서 컵을 3회 와류시키는 단계를 포함하였다. 샘플을 2 초 동안 정치시킨 후에, 각 시식자가 약 10 ㎖(2 티스픈)를 머금고, 그의/그녀의 입 안에서 10 초 동안 휘돌린 후에 뱉어내었다. 이어서 시식자는 표 4에 나타낸 척도에 따라 시험 샘플 및 대조군 샘플 사이의 상이점을 평가하였다.

SQS 점수는 표 5에 나타낸다. 일반적으로, SP1 가수분해물은 알칼라제(등록상표) 가수분해물에 비해 높은 SQS 점수를 가지고 있었다.

각각의 시험 샘플을 추가로 평가하여 시험 샘플이 쓴 맛에 대하여 대조군 샘플과 어떻게 상이한지에 관한 진단적 정보를 얻었다. 즉, 시험 샘플이 대조군 샘플에 비해 경미하게, 보통으로, 또는 극심하게 더 쓴 맛을 가진다면, 각각 +1, +2, +3의 점수를 배정하였다. 마찬가지로, 시험 샘플이 대조군 샘플에 비해 경미하게, 보통으로, 또는 극심하게 덜 쓴 맛을 가진다면, 각각 -1, -2, -3의 점수를 배정하였다. 이 분석은 시험 샘플 및 대조군 샘플 사이의 지향성 정량적 상이점의 평가를 제공하였다. 대조군에 비교하여 시험 샘플이 상이점을 갖지 않으면, 영(0)의 점수를 배정하였다.

표 6은 상이한 2회의 심사에 사용된 2개 가수분해물의 쓴 맛 점수를 나타낸다. 각각의 심사에서 SP1 가수분해물은 알칼라제(등록상표) 가수분해물의 경우에 비해 쓴 맛이 덜한 것으로 평가되었다.

실시예 3. SP1 및 알칼라제(등록상표) 가수분해물의 수율.

본질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 SP1 또는 알칼라제(등록상표)(ALC)(% 효소 단백질로 표시함)로 대두 단백질을 가수분해하였다. 가수분해 반응은 pH 8.0-8.5에서 30-60 분 동안 60℃에서 수행하였다. 본질적으로 전체 분획에 대한 가용성의 고체 백분율에 의해 가용성 고체의 백분율을 결정하였다. pH 4.5의 등전점에서의 단백질 재료 농도로서 수율을 계산하였다. 수율은 원심분리될 총 고체의 백분율 대 원심분리후 가용성 분획내 고체의 백분율의 비율로 정의된다.

단순화된 트라이니트로벤젠설폰산(TNBS: trinitrobenzenesulfonic acid) 방법(즉, Adler-Nissen, 1979, J. Agric. Food Chem. 27(6):1256-1262의 방법에 기초함)을 사용하여 가수분해도를 결정하였다. 이를 위하여, 0.1 g의 대두 단백질 가수분해물을 100 ㎖의 0.025 N NaOH에 용해시켰다. 가수분해물 용액의 분취물(2.0 ㎖)을 8 ㎖의 0.05 M 소듐 보레이트 완충액(pH 9.5)과 혼합하였다. 2 ㎖의 완충된 가수분해물 용액을 0.20 ㎖의 10% 트리니트로벤젠 설폰산으로 처리한 후, 실온에서 15 분 동안 어두운 곳에서 인큐베이션하였다. 4 ㎖의 0.1 M 소듐 설파이트-0.1 M 소듐 포스페이트 용액(1:99 비율)을 첨가하여 반응을 중단하고, 420 ㎚에서 흡광도를 판독하였다. 0.1 mM 글리신 용액을 표준품으로 사용하였다. 하기의 계산식을 사용하여 글리신 표준 용액에 대한 백분율 회수율을 결정하였다: (420 ㎚에서의 글리신의 흡광도 - 420 ㎚에서의 블랭크의 흡광도) × (100/0.710). 94% 이상의 수치를 허용가능한 것으로 간주하였다.

표 7은 고체에 의한 백분율 수율, 백분율 가용성 고체, 및 가수분해도를 나타낸다. SP1 또는 ALC로 제조된 가수분해물이 동일한 효소 용량 또는 유사한 가수분해도에서 유사한 수율을 가지는 것을 발견하였다. 또한, 이들 데이터는 증가된 가수분해도 또는 효소 수준이 수율을 증가시켰음을 규명한다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 상이한 가수분해도를 가진 가수분해물이 모든 pH 수준에서 동일하게 가용성이었다.

실시예 4. SP1 및 알칼라제(등록상표) 가수분해물의 관능 분석.

본질적으로 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조한 SP1 및 ALC 대두 가수분해물의 완전한 향미 프로파일 또한 평가하였다. 떫은 맛, 쓴 맛, 짠 맛 및 다른 속성에 대해 대조군 샘플과 비교하여 가수분해물의 점수를 매겼다.

시험 샘플이 대조군 샘플과 상이한 것으로 평가되면(즉, 표 4에 정의된 바와 같이 2, 3 또는 4의 SQS 점수를 가지면), 시험 샘플을 추가로 평가하여 시험 샘플이 대조군 샘플과 어떻게 상이한지에 관한 진단적 정보를 얻었다. 따라서, 시험 샘플이 대조군 샘플에 비해 경미하게, 보통으로, 또는 극심하게 더한 속성을 가졌다면(표 8에 정의되고 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이), 각각 +1, +2, +3의 점수를 배정하였다. 마찬가지로, 시험 샘플이 대조군 샘플에 비해 경미하게, 보통으로, 또는 극심하게 덜한 속성을 가졌다면(표 8에 정의되고 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이), 각각 -1, -2, -3의 점수를 배정하였다. 이 분석은 시험 샘플 및 대조군 샘플 사이의 지향성 정량적 상이점의 평가를 제공하였다.

유사한 %DH 수준을 가진 가수분해물에 대한 9개 향미 속성의 지향성 상이점을 도 3a 및 3b에 나타낸다. 모든 %DH 수준에서, TL1 가수분해물은 ALC 가수분해물에 비해 그레인 및 대두/콩과 식물 속성에서 더 큰 감소를 가졌고 떫은 맛 및 쓴 맛에서 더 작은 증가를 가졌다. 가장 높은 %DH ALC 가수분해물은 대조군에 비해 특히 쓴 맛에서 큰 증가를 가졌다.

우선, 가수분해물을 중성 pH의 물 중의 2.5% 슬러리로서 평가자에게 제공하였으며, 여기서 대조군은 SP1 가수분해물이었다. 약 12% DH를 가진 ALC 및 SP1 가수분해물 및 상업적으로 이용가능한 대두 가수분해물(즉, HXP 212)을 SP1 가수분해물 대조군 샘플과 비교하였다(도 3a 참조). ALC 샘플은 대조군에 비해 쓴 맛 및 짠 맛이 경미하게 더한 것으로 밝혀졌고; SP1 샘플은 예상대로 상이점을 나타내지 않았으며; HXP 212 샘플은 대조군에 비해 짠 맛이 경미하게 덜하고, 쓴 맛이 보통으로 더했으며, 풍미(savory)가 경미하게 더했다.

다음에, 상업적으로 이용가능한 대두 가수분해물(HXP 212)을 대조군 샘플로 사용하였다. ALC 및 SP1 가수분해물의 전체 또는 가용성 분획 및 상업적으로 이용가능한 대두 가수분해물(HXP 212)을 내부 대조군으로서 HXP 212 대조군 샘플에 또한 비교하였다(도 3b 참조). 모든 ALC 샘플이 대조군에 비해 짠 맛이 경미하게 덜하고; SP1 샘플, 0.038% ALC 가용성 분획 및 0.125% ALC 전체 분획은 모두 대조군에 비해 쓴 맛이 경미하게 덜했으며; 2가지 0.125% ALC 샘플은 모두 대조군에 비해 풍미가 경미하게 덜했다.

다음에, 가수분해물을 각각 pH 3.0 또는 pH 3.8에서 1.6% 단백질로 오렌지 스포츠 드링크 내에 평가자에게 제공하였다(도 3c 및 3d 참조). 2가지 연구 모두에서 상업적인 대두 가수분해물(HXP 212)을 대조군으로 사용하였다. 도 3c에 나타낸 바와 같이, SP1 가용성 분획은 대조군에 비해 쓴 맛이 경미하게 덜했고, 0.125% ALC 전체 분획은 대조군에 비해 신 맛 및 떫은 맛이 경미하게 더했다. 도 3c의 나머지 샘플은 유의적인 상이점을 나타내지 않았다. 도 3d에 나타낸 연구에서, 0.125% ALC 전체 분획은 대조군에 비해 떫은 맛이 경미하게 더했다. 도 3d의 나머지 샘플은 유의적인 상이점을 나타내지 않았다.

도 3c 및 3d에 대한 결과를 표 9의 속성에 따라 해석하였다.

실시예 5. SP1 및 알칼라제(등록상표) 가수분해물 내의 펩티드의 동정

SP1 또는 알칼라제(등록상표)(ALC)로 제조한 대두 가수분해물의 특질을 추가로 조사하기 위하여, 가수분해물 내의 펩티드 단편을 액체 크로마토그래피 질량분석기(LC-MS: liquid chromatography mass spectrometry)로 동정하였다.

3 ㎎의 가수분해물을 포함하는 분취물 및 0.1% 포름산(300 ㎕)을 미세원심분리관 내에서 혼합하고, 혼합물을 1-2 분 동안 보텍싱(vortexing)하여 샘플을 제조하였다. 이어서, 펩티드 단리를 위하여 전체 혼합물을 사전-세척한 C18 팁(pre-cleaned C18 tip)(메릴랜드주 콜럼비아 소재의 글리겐 코포레이션(Glygen Corp.))에 이전하였다. 60% 아세토니트릴(300 ㎕) 중의 0.1% 포름산으로 용리시켜 C18 팁을 세척하고 0.1% 포름산(600 ㎕)으로 평형시켰다. 0.1% 포름산 분획으로 용리된 재료는 폐기하고 60% 아세토니트릴(600 ㎕) 중의 0.1% 포름산으로 펩티드를 용리시켰다. 제네백(Genevac) EZ-2 증발기 내에서 10 분 동안 30℃에서 용매 혼합물을 증발시켜 펩티드 용액의 총 부피를 200 ㎕로 감소시켰다. HP-1100(휴렛 팩커드(Hewlett Packard); 캘리포니아주 팔로 알토 소재) HPLC 기기상의 C18 분석용 HPLC 컬럼(15 ㎝ × 2.1 ㎜ id, 5 ㎛; 디스커버리 바이오 와이드 포어(Discovery Bio Wide Pore), 미주리주 세인트 루이스 소재의 슈펠코(Supelco), 시그마-알드리치) 내에 상등액의 분취량(25 ㎕)을 주입하였다. 용리 프로파일을 표 8에 나타낸다. 용매 A는 0.1% 포름산이었고; 용매 B는 아세토니트릴 중의 0.1% 포름산이었으며, 유속은 0.19 ㎖/분이었고, 컬럼 온도조절장치의 온도는 25℃였다.

MS 분석을 위한 스플리터(splitter) 시스템을 사용하여 LC 용리액의 분취량(10 ㎕)을 ESI-MS 소스(source)에 전달하였다. 써모 피니간 LCQ-데카(Thermo Finnigan LCQ-Deca) 이온 트랩 질량분석기를 사용하여 동적 배제 스캔 이벤트(dynamic exclusion scan event)가 있는 데이터 의존성 MS/MS로 펩티드를 분석하였다. 모세관 온도 225℃에서 양이온 모드로 ESI-MS를 수행하였으며, 전자분사 바늘(electrospray needle)은 전압 5.0 kV로 설정하였고, 스캔 범위는 m/z 400-2000이었다. MS/MS 원 데이터를 시퀘스트(Sequest) 검색 엔진(바이오 웍스(상표)(BIO WORKS ^™ ) 소프트웨어, 펜실베니아주 피츠버그 소재의 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))으로 효소 검색 변수 없이 디콘볼루션시켰다(deconvoluted). NCBI와 같은 표준 데이터베이스를 검색하여 펩티드를 동정하였다.

표 11은 SP1 가수분해물에서 동정된 펩티드를 나타내고 표 12는 ALC 가수분해물에서 동정된 펩티드를 나타낸다. SP1 가수분해물에서는 총 37개의 구별되는 펩티드가 동정되었으며, 이중의 33개는 SP1 가수분해물에 고유한 것들이었다. ALC 가수분해물에서는 총 11개의 펩티드가 동정되었으며, 이중의 7개는 ALC 가수분해물에 고유한 것들이었다.

실시예 6. 펩티드 단편의 분자량 분포.

단리된 대두 단백질을 본질적으로 상기와 같이 SP1 또는 알칼라제(등록상표)(ALC)로 가수분해하였다. SP1은 1500 ㎎/㎏ 대두로 사용하였고, ALC는 5.0% CBS(응고물 고체 기준(Curd solid basis))로 사용하였다. 상기 실시예 3에 기술된 바와 같이 가용성 분획의 가수분해도를 결정하였다. SP1 가수분해물의 가수분해도는 15.9%였고 ALC 가수분해물의 가수분해도는 21.1%였다.

SP1 및 ALC 가수분해물 내의 펩티드 단편의 분자량 분포를 크기배제 크로마토그래피로 결정하였다. 시스템은 조르박스(Zorbax) GF-250 컬럼 및 조르박스 가드 컬럼(캘리포니아주 산타 클라라 소재의 아질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies)) 및 SPC GPEP-30 컬럼(일리노이주 다리엔 소재의 에프로젠 인코포레이티드(Eprogen Inc.))이 있는 아질런트(Agilent) 1100 HPLC 시리즈(아질런트 테크놀로지스)였다. 이동상은 포스페이트 완충 식염수 및 10% 이소프로판올을 함유하였다. 555 달톤 내지 200,000 달톤 범위의 단백질 표준품도 실행시켰다. 도 4에 나타낸 바와 같이, ALC 가수분해물에 비해 SP1 가수분해물은 더 많은 500-5000 달톤 펩티드 단편 및 더 적은 10,000-50,000 달톤 단편을 가지고 있었다.

실시예 7. 에너지 드링크 원형(Prototype).

SP1 또는 ALC 대두 가수분해물을 함유하는 원형의 오렌지 스포츠 음료를 제조하여, 향미 및 기능성에 대하여, 상업적인 대두 가수분해물(즉, HXP 212)을 함유하는 오렌지 스포츠 음료와 비교하였다. 표 13은 드링크의 조성을 나타낸다. 각각의 드링크를 2개 분획으로 나누고, 이들을 pH 3.8 또는 pH 3.2로 조절하였다. 각각의 드링크는 240 그램 제공량당 약 4.0 그램의 단백질을 가지고 있었다. 드링크를 4℃에 보관하였다.

점도계(60의 속도 및 4℃에서 스핀들(spindle) S61이 있는)를 사용하여 각 드링크의 점도를 측정하고 1 분에 판독하였다. 터비스캔 고정 위치 스캔(Turbiscan fixed position scan)을 사용하여 25 ㎜에서 1 분에 걸쳐 평균 60 스캔으로 탁도를 측정하였다. 표 14는 각 샘플의 점도(cP) 및 탁도(%Tm)를 나타낸다. 모든 드링크가 허용가능한 점도 측정치를 가졌으나, ALC 가수분해물을 포함하는 드링크가 낮은 탁도 수치를 가졌다.

샘플을 100 ㎖ 실린더에 넣어둠으로써 상이한 드링크의 침강물을 결정하였다. 침강물은 1 일 후 또는 2 주 후에(4℃에서) 측정하였다. 표 15는 각각의 침강물의 백분율을 나타낸다. ALC 가수분해물로 제조한 드링크에는 처음부터 침강물이 훨씬 많았다.

드링크의 향미는 5명의 시식자 패널에 의해 평가되었다. 시식단은 2 주 동안 냉장되어 있던 드링크에 최대 선호도(점수 = 1) 내지 최소 선호도(점수 = 6)의 순위를 매겼다. 각 드링크의 점수 합계를 표 16에 나타낸다. SP1 가수분해물을 포함하는 드링크가 가장 좋은 선호도 점수를 받았다.

요약하면, 원형 산성 드링크의 상기 예비 분석에 의해, SP1 가수분해물은 매우 양호하게 기능한 것으로 밝혀졌다.

SEQUENCE LISTING <110> Wong, Theodore Kerr, Phillip Ghosh, Parthasarathi Lombardi, Jason Lynglev, Gitte Hoff, Tine Christensen, Lars Oestergaard, Peter <120> PROTEIN HYDROLYSATE COMPOSITION STABLE UNDER ACID CONDITIONS <130> SP-1554 US PRV <160> 45 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 188 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 1 Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser 1 5 10 15 Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr 20 25 30 Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly 35 40 45 Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe 50 55 60 Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr 65 70 75 80 Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile 85 90 95 Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 100 105 110 Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val 115 120 125 Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 130 135 140 Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr 165 170 175 Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr 180 185 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 2 Ser Glu Asp Lys Pro Phe 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 3 Phe Val Asp Ala Gln Pro Lys 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 4 Ser Ala Gln Ala Val Glu Lys Leu 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 5 Ile Ser Ser Glu Asp Lys Pro Phe 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 6 Ser Arg Asp Pro Ile Tyr Ser Asn 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 7 Asn Gln Arg Ser Pro Gln Leu Gln 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 8 Ala Glu Asn Asn Gln Arg Asn Phe 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 9 Ser Arg Asp Pro Ile Tyr Ser Asn Lys 1 5 <210> 10 <2 11> 9 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 10 Val Asn Asn Asp Asp Arg Asp Ser Tyr 1 5 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 11 Glu Ile Thr Pro Glu Lys Asn Pro Gln Leu Arg 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 12 Phe Glu Ile Thr Pro Glu Lys Asn Pro Gln Leu Arg 1 5 10 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 13 Ser Arg Glu Glu Gly Gln Gln Gln Gly Glu Gln Arg Leu 1 5 10 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 14 Phe Val Asp Ala Gln Pro Gln 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 15 Ser Ala Gln Asp Val Glu Arg Leu Leu 1 5 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 16 Pro Gly Ser Ala Gln Asp Val Glu Arg Leu Leu 1 5 10 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 17 Ala Phe Pro Gly Ser Ala Gln Asp Val Glu Arg Leu Leu 1 5 10 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 18 Ala Glu Phe Gly Ser Leu 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> P RT <213> Nocardiopsis prasina <400> 19 Val Ser Ile Ile Asp Thr Asn 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 20 Pro Glu Glu Val Ile Gln His 1 5 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 21 Ile Gln Gln Gly Lys Gly Ile Phe 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 22 Pro Glu Glu Val Ile Gln His Thr Phe 1 5 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 23 Asp Gly Glu Leu Gln Glu Gly Arg Val Leu 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 24 Asn Ala Leu Lys Pro Asp Asn Arg Ile Glu 1 5 10 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 25 Ala Leu Pro Glu Glu Val Ile Gln His Thr Phe 1 5 10 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 26 Ser Leu Glu Asn Gln Leu Asp Gln Met Pro Arg 1 5 10 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 27 Asn Ala Leu Pro Glu Glu Val Ile Gln His Thr Phe 1 5 10 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 2 8 Asp Thr Ser Asn Phe 1 5 <210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 29 Leu Asp Thr Ser Asn Phe 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 30 Ala Asp Phe Tyr Asn Pro Lys 1 5 <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 31 His Glu Asn Ile Ala Arg Pro Ser 1 5 <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 32 Asn Ser Gln His Pro Glu Leu Lys 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 33 Leu His Glu Asn Ile Ala Arg Pro Ser 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 34 Asn Asn Gln Leu Asp Gln Thr Pro Arg 1 5 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 35 Asn Thr Asn Glu Asp Ile Ala Glu Lys Leu 1 5 10 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 36 Asn Ser Gln His Pro Glu Leu Gln 1 5 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 37 Asn Thr Asn Glu Asp Thr Ala Glu Lys Leu 1 5 10 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 38 Arg Ser Pro Asp Asp Glu Arg Lys Gln Ile Val 1 5 10 <210> 39 <211> 6 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 39 Ser Ile Ile Asp Thr Asn 1 5 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 40 Ser Gln Ser Asp Asn Phe Glu 1 5 <210> 41 <211> 6 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 41 Asp Phe Tyr Asn Pro Lys 1 5 <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 42 Leu Asp Gln Thr Pro Arg Val Phe 1 5 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 43 Asn Ala Leu Glu Pro Asp His Arg Val Glu 1 5 10 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 44 Leu Asp Gln Asn Pro Arg Val Phe 1 5 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Nocardiopsis prasina <400> 45 Gly Asn Pro Asp Ile Glu His Pro Glu Thr Met 1 5 10