为了将感兴趣的蛋白与污染物分离并提纯，可以利用物理化学特 性如分子大小，表面上的电荷或该蛋白的溶解度。蛋白化学领域中常 用的提纯方法包括，例如，盐析、超滤、等电沉淀、电泳、离子交换 色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等。在必须从活组织、细胞或血液中 提纯出感兴趣的蛋白的情况中，其中存在许多不同的蛋白，这些方法 常常需要以复合方式结合。然而，可以一种通过利用某类蛋白所共有 的特性具备更高特异性的提纯方法。
譬如，已知一种利用阴离子交换色谱提纯的独特方法，其中二价 的阳离子结合蛋白被吸附在阴离子交换树脂上，并且随后用二价阳离 子洗脱下来从而特异性地纯化所述二价阳离子结合蛋白，如日本专利 公开号200180/1990所公开的。按照这种方法，螯合剂如乙二胺四乙 酸(EDTA)被加入到含有二价阳离子结合蛋白的溶液中以首先除去二价 离子。随后，所得的溶液与阴离子交换树脂如MonoQ接触，使二价阳 离子结合蛋白被吸附到阴离子交换树脂上。最后，加入氯化钠和氯化 钙从阴离子交换树脂上洗脱下二价阳离子结合蛋白。然而，大多数的 天然蛋白在生理条件下带有负电荷，因此许多污染物而不是感兴趣的 蛋白被优先吸附到阴离子交换树脂上，由此妨碍了所需蛋白的有效纯 化。所以，这种通过使所需蛋白吸附在阴离子交换树脂上的提纯方法 优选用于少量的蛋白溶液或提纯过程的后期。
日本专利公开号258286/1995公开了一种通过阴离子交换法纯化 钙离子结合维生素K依赖性蛋白的方法，其中向含有维生素K依赖性 蛋白的溶液中加入氯化钙且令所得的溶液经过阴离子交换树脂，从被 污染蛋白中分离出所需的蛋白。然而，这种方法的缺陷在于必须使大 体积的含有所需蛋白的馏份经过树脂，因此后续操作变得烦琐，尤其 是当以大规模进行时。
膜联蛋白V，一种钙离子结合蛋白，是不带有糖链的约34kDa分子 量的简单蛋白，其具有生理活性，如抗凝活性、角膜上皮伸展活性和 磷脂酶A2抑制活性。已知膜联蛋白V分布在不同的组织中并且在包括 人胎盘在内的活机体中分泌(Chem.Pharma.Bull.，38，1957-1960， 1990)。膜联蛋白V被称作钙离子结合蛋白，因为它具有通过钙离子结 合脂质膜的能力。
业已从人体或动物的器官中提取出膜联蛋白V(日本专利公开号 174023/1987)。然而，现今，它可以在大肠杆菌和酵母中利用基因重 组技术生产(日本专利公开号20095/1989和219875/1991)。
在含膜联蛋白V的溶液用沉淀法、膜过滤法和离心法的预处理之 后，膜联蛋白V按照惯例通过硫酸铵分级、阴离子交换色谱、疏水色 谱和亲和色谱的联合来提纯(Jurgen Romisch等，Biochem.J.272， 223-229，1990；T.R.Hawthorne等，Journal of Biotechnology 36， 129-143，1994)。

然而，这些方法的缺点在于纯化步骤复杂和烦琐，需要花费大量 的劳动和时间，因此可能会遇到再现性和收率方面的障碍，致使它们 不适合在工业规模中膜联蛋白V的纯化。此外，作为大规模的纯化方 法，这些方法的缺点还在于从经济上考虑，因为它们使用相当昂贵的 肝素琼脂糖来提高膜联蛋白V的纯化程度。先前，本发明人提供了一 种制备膜联蛋白V的方法，其通过预处理蛋白溶液而在某种程度上除 去污染物和随后对所得的溶液进行阴离子交换色谱(日本专利出版号 219875/1991)。该方法可以保证以工业规模纯化膜联蛋白V，但没有 超越本发明的方法。
如上所述，对于在工业规模中使用，常规方法在成本、效率和操 作性的立场上看都成问题。
本发明的目的在于提供一种以简便和有效的方式、从含有钙离子 结合蛋白和污染物的液体样本中无需任何预处理(如加入螯合剂)分离 和纯化钙离子结合蛋白的方法。
本发明的另一目的在于提供通过本发明的方法获得的高纯度的膜 联蛋白V。
在该情况中，本发明人研究达到了上述目的并且发现膜联蛋白V， 一种钙离子结合蛋白，在氯化钙的存在下和约中性的pH下吸附到SP- 琼脂糖阳离子交换载体上。本发明人还发现，膜联蛋白V对SP-琼脂糖 阳离子交换载体的吸附尤其是在钙离子的存在下发生，但在非钙离子 的其他二价离子(如镁离子)的存在下很少观察到吸附。鉴于这些发 现，本发明人将氯化钙加入到大量的产膜联蛋白V的细胞的匀浆中， 这些细胞通过基因重组技术生产并且使所得的匀浆与用含有氯化钙的 氯化铵缓冲液平衡的SP-琼脂糖阳离子交换载体接触。冲洗之后，洗脱 是通过降低或消除氯化钙水平进行或利用含有氯化钠的氯化铵缓冲液 在钙离子的存在下进行，以便连续纯化出具有高纯度的膜联蛋白V。而 且，通过在pH9.0下进行所述的阳离子交换色谱可以成功地除去痕量 的残余蛋白酶。
所以，本发明涉及一种通过阳离子交换色谱利用SP-琼脂糖阳离子 交换载体在氯化钙的存在下纯化天然或通过基因重组技术生产的钙离 子结合蛋白的方法。
本发明还涉及天然或由基因重组技术生产的、因而通过本发明的 方法获得的钙离子结合蛋白。
附图简述
图1A和1B是膜联蛋白V结构基因的克隆和用该基因转化的酵母 细胞的制备的流程示意图。
图2表示对于下面物质的凝胶过滤色谱的结果：(a)阳离子交换色 谱之前的样品，(b)经过阳离子交换色谱的级份，和(c)洗涤后从阳离 子交换色谱洗脱出的级份。
图3表示对于洗涤后从阳离子交换色谱洗脱出的级份的凝胶过滤 色谱的结果。
图4表示膜联蛋白VI从SP-琼脂糖的洗脱模式。
图5是一张表示膜联蛋白VI的SDS-PAGE的结果的相片，第1道： BioRad预染色的标记蛋白；磷酸化酶B(116,000)，BSA(80,000)，卵 清蛋白(52,500)，碳酸酐酶(34,900)，大豆胰蛋白酶抑制剂 (29,900)，溶菌酶(21,800)；第2道：膜联蛋白VI标准品；第3道： 用DEAE-Toyopearl(样品)洗脱；第4道：SP-琼脂糖，5号级份；第5 道：7号级份；第6道：9号级份；第7道：16号级份；第8道：，51 号级份；第9道：54号级份；和第10道：57号级份。
图6表示凝集因子X从SP-琼脂糖的洗脱模式。
图7是一张表示凝集因子X的SDS-PAGE的结果的照片。第1道： BioRad预染色的标记蛋白；磷酸化酶B(116,000)，BSA(80,000)，卵 清蛋白(52,500)，碳酸酐酶(34,900)，大豆胰蛋白酶抑制剂 (29,900)，溶菌酶(21,800)；第2道：市售凝集因子X；第3道：4 号级份；第4道：7号级份；第5道：11号级份；和第6道：12号级 份。
实施本发明的最佳方式
本发明的方法包含一种步骤，其中含有钙离子结合蛋白的液体样 品与阳离子交换载体在钙离子的存在下接触，随后是一个其中降低或 消除钙离子的浓度和/或提高抗衡离子(盐)的浓度的步骤，从而洗脱和 回收所述的蛋白。本发明的方法能够制备具有高纯度的钙离子结合蛋 白。与阳离子交换载体接触的过程可以在一个批次中或通过色谱进 行。当采用色谱时，可以根据生产规模适当选择柱的大小。
在此所用的阳离子交换载体包括，但不限于，SP-琼脂糖、CM-琼 脂糖、CM-纤维素、SE-纤维素、S-Spherodex、SP-Spherosil等，它 们全部都可以商购。其中，优选使用SP-琼脂糖。
与载体接触的蛋白溶液的量可以根据该溶液的浓度或载体的吸附 能力而变化。在SP-琼脂糖的情况中，例如，可以使用0.1-30g/L的 蛋白载体。优选使用15-20g/L的蛋白载体。
在与阳离子交换载体吸附时的流速可以是1-150cm/小时，优选 15-100cm/小时，更优选50-80cm/小时。另一方面，在从阳离子交换 载体洗脱被吸附蛋白时的流速可以是1-150cm/小时，优选30-100cm/ 小时，更优选30-80cm/小时。
可以用来吸附或从阳离子交换载体洗脱的缓冲液包括任何离子交 换色谱中常用的缓冲液，包括氯化铵缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸 盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液。其中，优选使用氯化铵缓冲液。缓冲液 的浓度可以在5-100mM的范围内，优选10-40mM。缓冲液可以在pH5-10 下使用，优选在pH8-9.5下，这些条件下可以除去蛋白酶。更优选地， 使用20mM(约pH9.0)氯化铵缓冲液。
作为钙离子的来源，可以使用任何可以产生钙离子的物质，包括 氯化钙、碳酸钙，优选氯化钙。
当将大量的氯化钙加入到组织或细胞或血浆的匀浆中时，疏水蛋 白或高分子量化合物有时会由于盐析沉积。所以，钙离子可以优选以 不但使钙离子结合蛋白结合到并从阳离子交换载体分离而且在含有钙 离子结合蛋白的液体样品中不形成沉淀的量使用。
为了使钙离子结合蛋白吸附到阳离子交换载体上，钙离子可以以 5-100mM的浓度优选使用。更加优选地，可以使用浓度为10-30mM的 钙离子。在与缓冲剂联合用来吸附到和自阳离子交换载体洗脱时，可 以优选使用含有20mM氯化钙的20mM氯化铵缓冲液(pH9.0)。
可以通过消除或降低缓冲液中的钙离子水平或者加入其他除钙离 子之外的抗衡离子，或采用这两种方法，把被吸附的钙离子结合蛋白 从载体上洗脱下来。抗衡离子包括Na+、Li+、K+离子等。优选地，可以 通过向氯化铵缓冲液中加入1-500mM，更优选50-500mM，特别更优选 50-300mM氯化钠进行洗脱，首选向含有20mM氯化钙的20mM氯化铵缓 冲液(pH9.0)中加入200mM氯化钠。或者，只要通过降低氯化钙水平 至低于5mM就可以从载体上洗脱下被吸附的钙离子结合蛋白。
本发明的方法，甚至在单独使用时，也可以提供80％或更高纯度 的钙离子结合蛋白的纯化。然而，它与其它提纯方法联合使用时将可 以更加有效。譬如，在含有钙离子结合蛋白的液体样品被不溶性物质 污染的情况中，适宜在本发明的方法之前进行预处理以除去此类物 质，例如离心、盐析、膜过滤等。
除了上述方法以外，多种色谱方法的其它提纯过程，包括阴离子 交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱、吸附色谱等，可以 与本发明的方法一起进行以提供更高纯度的钙离子结合蛋白。本发明 的方法可以在上述方法的任何阶段使用。优选地，当把含有钙离子结 合蛋白的样品预处理除去不溶性物质之后，可以采用本发明的方法并 且进而进行阴离子交换色谱。更加具体地说，将通过阳离子交换色谱 获得的含膜联蛋白V级分上样到Q-琼脂糖柱上，该柱用含有50mM氯化 钠的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)平衡，并且冲洗后，用浓度自 50mM-500mM氯化钠的线性梯度进行洗脱，得到具有非常高纯度的膜联 蛋白V。
通过本发明方法纯化的钙离子结合蛋白通常包括膜联蛋白I、II、 III、IV、V、VI和VII，但可以是任何具有结合钙离子的能力的蛋白， 如凝集因子X。
本发明的方法可以有效地应用于得自天然或通过遗传工程化产生 钙离子结合蛋白的动物的血液、体液和组织匀浆，以及细胞匀浆和重 组细胞的培养上清液，包括植物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细 胞和动物细胞。优选地，本发明的方法可以应用在生产钙离子结合蛋 白的重组酵母细胞中。更加优选地，本发明的方法可以应用在产生膜 联蛋白V的酵母细胞的细胞匀浆或培养上清液中。
由此制备的膜联蛋白V，具有特有的生理活性，可以单独或与药学 可接受载体、稀释剂、稳定剂或防腐剂一起配制为药物制剂成为任何 常规剂型，例如注射剂、滴眼剂、口服制剂、栓剂等。
按照本发明，提供了一种纯化具有高纯度钙离子结合蛋白的有效 方法。还提供了通过本发明的方法获得的基本上不含有污染物的钙离 子结合蛋白。
按照本发明的方法，大多数在生理条件下带有负电荷的蛋白经过 阳离子交换载体，然而可以与钙离子形成复合物的钙离子结合蛋白优 先吸附到载体上。因此，本发明的方法能够一次性处理大量的样品同 时不会损害阳离子交换载体对污染蛋白而不是所需蛋白的吸附能力。
实施例
制备实施例：生产膜联蛋白V的重组酵母细胞的制备
产膜联蛋白V的重组酵母细胞按照专利申请(日本专利公开号 219875/1991)的所述公开内容制备。图1示意表示重组酵母细胞的制 备，其中术语“CPB-I”用来指“膜联蛋白V”。
(1)膜联蛋白结构基因的克隆
从人胎盘cDNA文库(Clontech Laboratories，Inc.)，通过免疫 筛选利用抗膜联蛋白V单克隆抗体分离出带有膜联蛋白V结构基因的 噬菌体。随后从噬菌体制备DNA并用限制性内切酶EcoRI消化产生片 段，其随后插入到pUC118运载体的EcoRI位点构建pMKT7。
(2)表达质粒的构建
质粒pMKT7用限制性内切酶NcoI和SacI消化，并且通过琼脂糖 电泳分离含有膜联蛋白V结构基因的DNA片段。合成连接体的加入使 该DNA片段的两个末端转化为XhoI和BamHI位点。将所得的DNA片段 插入到表达运载体pPS1的XhoI和BamHI位点以构建表达运载体 pAPCPBI。
(3)重组酵母细胞的制备
通过醋酸锂技术用表达质粒pAPCPBI转化宿主酵母细胞(啤酒糖酵 母AH22)。转化之后，分离出现在不含有亮氨酸的琼脂培养基上的克隆 并且测定表达水平。选择那些具有高表达水平的克隆并重复铺板在琼 脂培养基上，分离克隆并且测定表达水平，得到具有稳定性的重组酵 母细胞。
实施例1：重组膜联蛋白V的纯化
(1)产膜联蛋白V的重组酵母细胞的培养
在28℃下将产膜联蛋白V的重组酵母细胞在2L合成选择培养基上 培养3天。随后将重组酵母细胞接种在88L选择培养基中并且在28℃ 下培养2天。随后将重组酵母细胞转移至810L的半合成培养基(40g 蔗糖，5g酵母提取物，5g硫酸铵和0.5g硫酸镁七水合物，在1L培养 基中)并且在28℃下继续培养24小时。
(2)纯化之前大量膜联蛋白V的预处理
大量培养溶液经0.1μm膜滤器过滤收集重组酵母细胞，其用 French压式细胞匀浆器进行物理上的破裂。破裂的细胞混悬液用膜滤 器过滤并用超滤器浓缩滤液。向浓缩物中加入乙酸以便等电沉淀(pH 9.0)。所形成的沉淀用膜滤器过滤除去沉淀。随后，滤液的pH用氨调 至9.0，随后用超滤器再次浓缩该滤液(预处理溶液)。
(3)阳离子交换色谱(通过降低或消除氯化钙水平洗脱)
向预处理溶液中加入氯化钙溶液得到20mM的终浓度并且经过使用 SP-琼脂糖(Pharmacia)的阳离子交换色谱。具体地说，将添加了氯化 钙的预处理溶液加载在用20mM氯化铵缓冲液(pH9.0)平衡的柱上，该 缓冲液含有20mM氯化钙和50mM氯化钠。用缓冲液洗涤后，该柱子进 一步用含20mM氯化钙的20mM氯化铵缓冲液(pH9.0)洗涤。随后，用 20mM氯化铵缓冲液(pH9.0)洗脱膜联蛋白V。
(4)阳离子交换色谱(通过提高氯化钠水平洗脱)
如步骤(3)所述，向预处理溶液中加入氯化钙溶液达到20mM的终 浓度，并且随后用SP-琼脂糖进行阳离子交换色谱。具体而言，将添加 有氯化钙的预处理溶液加载在用20mM氯化铵缓冲液(pH9.0)平衡的柱 子上，该缓冲液含有20mM氯化钙和50mM氯化钠。用缓冲液洗涤后， 通过从50mM至最多300mM的氯化钠的浓度的线性梯度和20mM氯化铵 缓冲液(pH9.0)洗脱出膜联蛋白V，该缓冲液含有20mM氯化钙(吸附 和洗脱时的流速：56.7cm/小时)。
图2分别表示下列物质通过凝胶过滤色谱获得的洗脱模式：(a)阳 离子交换色谱之前的样品，(b)经过阳离子交换色谱的级份，和(c)从 阳离子交换色谱洗脱出的级份。进行凝胶过滤色谱，其中将20μL样本 上样至用10mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)平衡的TSKgel G3000 SWx1(7.8mm(ID)×30cm)，该缓冲液中含有0.14M NaCl，流速为 125.6cm/小时。对于从阳离子交换色谱洗脱出的级分的凝胶过滤色谱 的结果如表1所示，其中纯度是由洗脱模式获得。
(5)阴离子交换色谱(与常规技术对比)
对预处理溶液进行阴离子交换色谱。将预处理溶液加载在用10mM 磷酸钠缓冲液(pH7.4)平衡的Q-琼脂糖(Pharmacia)柱上，该缓冲液 含有50mM氯化钠。冲洗后，通过从50mM至最多300mM的氯化钠浓度 的线性梯度洗脱出膜联蛋白V。洗脱级分的凝胶过滤色谱的结果如表1 所示。
在用其它纯化方法进一步提纯之后测定由常规技术获得的膜联蛋 白V和通过本发明的方法获得的膜联蛋白V的抗凝活性。以与日本药 典(第13版，900-901页)中有关肝素钠的定量法相同的方式进行抗凝 活性的测定。计算抗凝活性，其中由1mg的标准样本(通过常规技术提 纯的膜联蛋白V)引起的凝集时间的延长被定义为一个单位(U)。所以， 观察到通过本发明的方法获得的膜联蛋白V没有失活(表1)。
                         表1   阴离子交换色谱   阳离子交换色谱   纯度(％)   81.86   100   活性(U/mg)   0.9-1.0   0.9-1.0
实施例2：重组膜联蛋白V的纯化
按照实施例1所述纯化的重组膜联蛋白V，但在步骤(4)的阳离子 交换色谱中，所不同的是，用含有20mM氯化钙和50mM氯化钠的20mM 柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)代替含有20mM氯化钙和50mM氯化钠的20mM 氯化铵缓冲液(pH9.0)，并且用20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)代替 50mM至最多300mM的氯化钠的线性梯度浓度和含有20mM氯化钙的 20mM氯化胺缓冲液(pH9.0)。流速也改变为在吸附时是15.6至 54.6cm/小时并且洗脱时为39cm/小时。
图3表示由阳离子交换色谱洗脱出的级分的凝集过滤色谱得到的 洗脱模式。
实施例3：胎盘源膜联蛋白VI的纯化
将除羊膜和脐带以外的一个胎盘(约500g)切为小片，用2L生理盐 水冲洗，并且用碎肉机切碎。加入400mL的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)之后，其中含有5mM氯化钙、0.1％Triton X-100和5mM苯甲脒， 切碎物用旋转混合器匀浆。该匀浆在10,000rpm下离心20分钟收集沉 淀，将其重新悬浮在300mL的含有50mMEDTA的50mM Tris-HCl缓冲 液(pH7.4)并且匀浆。再次在10,000rpm下将该匀浆离心20分钟并 且回收上清液的提取物(约300mL)，向其中加入63g硫酸铵制成硫酸 铵的30％饱和溶液。离心除去沉淀之后，向上清液中加入54g的硫酸 铵(60％饱和硫酸铵)并且回收沉淀的膜联蛋白VI级分。当盐浓度提高 至80％的硫酸铵的饱和度时，在所形成的沉淀中膜联蛋白V可以优先 被回收。
将用硫酸铵的60％饱和溶液形成的沉淀溶于50mM Tris-HCL缓冲 液(pH7.4)并相对于相同缓冲液透析。使透析溶液(80mL)吸附在用相 同缓冲液平衡的DEAE-Toyopearl(3×20cm)。用相同缓冲液洗涤之 后，通过相同缓冲液(180mL)至含有0.3M NaCl的50mM Tris-HCl缓 冲液(pH7.4)(180mL)的线性梯度(各级分：4mL/管)进行洗脱。感兴 趣的膜联蛋白VI洗脱在级分46-50中。这些膜联蛋白VI级分相对于 20mM氯化铵(pH9.0)透析，向其中加入氯化钙制成最终合有20mM氯 化钙的20mM氯化铵缓冲液(pH9.0)。透析溶液吸附至用20mM氯化铵 缓冲液(pH9.0)平衡的SP-琼脂糖FF(1.5×8cm)，该缓冲液含有20mM 氯化钙(图4；级分1-15)。用相同缓冲液洗涤后，用补充有0.5M NaCl的相同缓冲液进行洗脱(图4；级分45-70)。通过非还原性SDS-PAGE 分析各阶段的样本并且结果如图5所示。
实施例4：凝集因子X的纯化
市售凝集因子X(约1mg)相对于20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0) 透析，向其中加入十分之一量的200mM氯化钙最终制成含有20mM氯化 钙的20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)。该透析溶液吸附在用20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡的SP-琼脂糖FF(0.8×7cm)，该缓冲 液含有20mM氯化钙。用含20mM氯化钙的20mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0) 洗涤之后，用含有0.3M氯化钙的20mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)进 行洗脱。在所有阶段中，加入5mM苯甲脒(因为苯甲脒本身在A280具 有UV吸收，洗脱模式不详述；图6)。通过非还原性SDS-PAGE分析各 阶段的级分，结果如图7所示。