一种提高人凝血酶原复合物中FⅦ收率的方法 |
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| 申请号 | CN201610429456.9 | 申请日 | 2016-06-16 | 公开(公告)号 | CN106085992A | 公开(公告)日 | 2016-11-09 |
| 申请人 | 武汉中原瑞德生物制品有限责任公司; | 发明人 | 辛叶; 梁华; 肖雷; 王玉兵; 徐建生; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了用于提取人凝血酶原复合物的平衡液以及提取人凝血酶原复合物的方法。所述用于提取人凝血酶原复合物的平衡液包括：0.10mol/L～0.15mol/L的 氯化钠 ；以及0.01mol/L～0.02mol/L的枸橼酸钠，所述平衡液的pH值为6.8～7.2。利用本发明的平衡液能够有效地提取人凝血酶原复合物，且收率及纯度较高，尤其是凝血因子Ⅶ(FⅦ)的收率较高。此外，得到的人凝血酶原复合物 稳定性 较好。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种用于提取人凝血酶原复合物的平衡液，其特征在于，包括：0.10mol/L～ |
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| 说明书全文 | 一种提高人凝血酶原复合物中FⅦ收率的方法技术领域背景技术[0002] 人凝血酶原复合物(prothrombin complex concentrate,PCC)主要包含凝血因子Ⅱ(Factor Ⅱ,FⅡ)、凝血因子Ⅶ(Factor Ⅶ,FⅦ)、凝血因子Ⅸ(Factor Ⅸ,FⅨ)、凝血因子Ⅹ(Factor Ⅹ,FⅩ)四种凝血因子，传统上其主要用于乙型血友病的治疗。随着临床应用的认可，PCC在止血方面的作用也日益受到临床医生的重视，而其止血作用的发挥很大程度上依赖于FⅦ。PCC中FⅦ含量越高，则止血效果越好。 [0003] CN 101439047A公开了一种提高人凝血酶原复合物稳定性FVII得率的工艺方法，包括：新鲜低温冰冻健康人的血浆→澄清过滤→调整离子强度→凝胶吸附→洗涤、洗脱→超滤→S/D病毒灭活→凝胶吸附→洗涤、洗脱→超滤→除菌过滤、分装→冻干→干热灭活。 [0004] 然而，目前获得人凝血酶原复合物的方法仍有待改进。 发明内容[0005] 本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了用于提取人凝血酶原复合物的平衡液以及提取人凝血酶原复合物的方法。 [0006] 需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的： [0007] 发明人发现，专利CN 101439047A中，如将1000L去冷沉淀血浆调节电导至2～12ms/cm，经计算大约需加入100～5600L注射用水。这种方法不仅增加了下游工作的麻烦，而且会对白蛋白、静注人免疫球蛋白等主产品的生产造成不利影响，同时由于分离容量大幅度增加而造成生产成本的增加。 [0008] 有鉴于此，发明人发现，在不调节血浆离子强度的前提下，通过提高平衡液的离子强度能够达到提高人凝血酶原复合物吸附率的目的，尤其是FⅦ。进一步地，通过提高氯化钠的浓度，以提高平衡液的离子强度。 [0009] 为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种用于提取人凝血酶原复合物的平衡液。根据本发明的实施例，所述平衡液包括：0.10mol/L～0.15mol/L的氯化钠；以及0.01mol/L～0.02mol/L的枸橼酸钠，所述平衡液的pH值为6.8～7.2。发明人发现，在不调节血浆离子强度的前提下，通过提高平衡液的离子强度能够达到提高人凝血酶原复合物吸附率的目的，尤其是FⅦ。进一步地，通过提高氯化钠的浓度，以提高平衡液的离子强度。由此，利用根据本发明实施例的用于提取人凝血酶原复合物的平衡液能够有效地提取人凝血酶原复合物，且收率及纯度较高，尤其是FⅦ的收率较高。此外，得到的人凝血酶原复合物稳定性较好。 [0010] 在本发明的另一方面，本发明提出了一种提取人凝血酶原复合物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)利用前面所描述的平衡液对凝胶进行平衡，得到第一湿胶；(2)将所述第一湿胶与血浆进行接触；(3)用第一洗涤液洗涤步骤(2)所得到的凝胶，弃滤液；以及(4)利用第一洗脱液洗脱步骤(3)所得到的凝胶，收集滤液，以便得到所述人凝血酶原复合物。 [0011] 发明人发现，利用前面所描述的平衡液对凝胶进行平衡，使得到的湿胶的离子强度接近平衡液的离子强度，由此，将湿胶与血浆接触后，凝胶能够充分吸附血浆中的人凝血酶原复合物，尤其是FⅦ。接着，利用洗涤液洗涤凝胶，以除去吸附力弱的杂蛋白以及黏附的其他成分。然后，利用洗脱液洗脱下人凝血酶原复合物。由此，利用根据本发明实施例的方法能够有效地提取人凝血酶原复合物，且收率及纯度较高，尤其是FⅦ的收率较高。此外，得到的人凝血酶原复合物稳定性较好。而且，该方法操作简便、成本低，适于工业化生产。 [0012] 根据本发明的实施例，所述第一洗涤液包括：0.15mol/L～0.20mol/L的氯化钠；以及0.01mol/L～0.02mol/L的枸橼酸钠，所述第一洗涤液的pH值为6.8～7.2。由此，利用该洗涤液能够充分除去吸附力弱的杂蛋白以及黏附的其他成分，使得到的人凝血酶原复合物纯度较高。 [0013] 根据本发明的实施例，所述第一洗脱液包括：1.5mol/L～2.0mol/L的氯化钠；以及0.02mol/L～0.03mol/L的枸橼酸钠，所述第一洗脱液的pH值为6.8～7.2。由此，利用该洗脱液能够充分洗脱下人凝血酶原复合物，尤其是FⅦ，使其收率较高。 [0014] 根据本发明的实施例，所述血浆为去冷沉淀血浆。由此，所得到的人凝血酶原复合物的稳定性较好。 [0015] 根据本发明的实施例，基于1L所述血浆，所述凝胶的用量为0.5g～2.5g，优选1.5g。由此，能够充分吸附血浆中的人凝血酶原复合物，尤其是FⅦ，使其收率较高。 [0016] 根据本发明的实施例，所述去冷沉淀血浆是通过采用下列方式获得的：用水将冰冻血浆进行化浆，得到浆液；将所述浆液在0℃～4℃下进行离心，收集上清液，以便得到所述去冷沉淀血浆。由此，利用根据本发明实施例的方法能够有效地提取人凝血酶原复合物，且收率及纯度较高，尤其是FⅦ的收率较高。 [0017] 根据本发明的实施例，步骤(2)进一步包括：(2-1)将所述第一湿胶与血浆在15℃～20℃下搅拌40～60min，优选在17℃下搅拌40min，得到混合液；以及(2-2)将所述混合液置于层析柱中，弃流出液，收集凝胶。由此，利用根据本发明实施例的方法能够有效地提取人凝血酶原复合物，且收率及纯度较高，尤其是FⅦ的收率较高。 [0018] 根据本发明的实施例，步骤(4)进一步包括：(4-1)将所述滤液进行病毒灭活，得到灭活产物；(4-2)利用第二平衡液对凝胶进行第二平衡，得到第二湿胶；(4-3)将所述灭活产物与所述第二湿胶进行接触；(4-4)用第二洗涤液洗涤步骤(4-3)所得到的凝胶，弃滤液；(4-5)利用第二洗脱液洗脱步骤(4-4)所得到的凝胶，收集第二滤液；以及(4-6)将所述第二滤液与抑制剂混合，并将所得到的混合液进行冻干及干热，以便得到所述人凝血酶原复合物。由此，能够除去所得到的人凝血酶原复合物中的病毒，且能够防止人凝血酶原复合物的活化。 [0019] 根据本发明的实施例，所述第二平衡液包括：0.05mol/L～0.10mol/L的氯化钠；以及0.01mol/L～0.02mol/L的枸橼酸钠，所述第二平衡液的pH值为6.8～7.2。由此，能够使灭活产物充分吸附于凝胶上。 [0020] 根据本发明的实施例，所述第二洗涤液包括：0.05mol/L～0.10mol/L的氯化钠；0.01mol/L～0.02mol/L的枸橼酸钠，所述第二洗涤液的pH值为6.8～7.2。由此，能够有效地除去杂质。 [0021] 根据本发明的实施例，所述第二洗脱液包括：1.5mol/L～2.0mol/L的氯化钠；以及0.02mol/L～0.03mol/L枸橼酸钠，所述第二洗脱液的pH值为6.8～7.2。由此，能够有效地将人凝血酶原复合物洗脱下来。 [0022] 根据本发明的实施例，所述抑制剂包括：0.2IU肝素/IU FⅨ；以及22g/L甘氨酸。由此，能够有效地防止人凝血酶原复合物活化。 [0023] 根据本发明的实施例，步骤(4-3)进一步包括：(4-3-1)将所述灭活产物与第二湿胶在15℃～20℃下搅拌40～60min，优选在17℃下搅拌50min，得到第二混合液；以及(4-3-2)将所述第二混合液置于层析柱中，弃流出液，收集凝胶。由此，能够使灭活产物中的人凝血酶原复合物充分附着于凝胶上，使得人凝血酶原复合物的收率及纯度较高，尤其是FⅦ的收率较高。 [0024] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。 具体实施方式[0025] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。 [0026] 需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。 [0027] 本发明提出了用于提取人凝血酶原复合物的平衡液及提取人凝血酶原复合物的方法，下面将分别对其进行详细描述。 [0028] 用于提取人凝血酶原复合物的平衡液 [0029] 在本发明的一个方面，本发明提出了一种用于提取人凝血酶原复合物的平衡液。根据本发明的实施例，所述平衡液包括：0.10mol/L～0.15mol/L的氯化钠；以及0.01mol/L～0.02mol/L的枸橼酸钠，所述平衡液的pH值为6.8～7.2。 [0030] 目前主要采用离子交换吸附工艺提取人凝血酶原复合物，但是人凝血酶原复合物中的FⅦ收率较低。为了提高人凝血酶原复合物，尤其是FⅦ的收率，发明人进行了大量实验，意外地发现，离子交换吸附工艺中所使用的平衡液的离子强度和血浆的离子强度显著影响人凝血酶原复合物中FⅦ的吸附率，进而影响其最终收率。当血浆的离子强度与平衡液的离子强度接近时，人凝血酶原复合物的收率较高，尤其是FⅦ。 [0031] 发明人惊奇地发现，在不调节血浆离子强度的前提下，通过提高平衡液的离子强度能够达到提高人凝血酶原复合物吸附率的目的，尤其是FⅦ。进一步地，通过提高氯化钠的浓度，以提高平衡液的离子强度。由此，发明人得到平衡液中的最优组分及含量。其中，氯化钠主要起到调节离子强度的作用，当平衡液中氯化钠浓度为0.10mol/L～0.15mol/L(例如0.11mol/L、0.12mol/L、0.13mol/L、0.14mol/L)时，人凝血酶原复合物吸附凝胶的效率较高，尤其是FⅦ，从而使其收率较高。然而，氯化钠浓度低于0.10mol/L时，FⅦ无法充分吸附在凝胶上，使得人凝血酶原复合物中FⅦ的收率较低。此外，由于提高了平衡液的离子强度，从源头上就减少了杂蛋白的吸附，从而使得PCC的纯度较高。由此，利用根据本发明实施例的用于提取人凝血酶原复合物的平衡液能够有效地提取人凝血酶原复合物，且收率及纯度较高，尤其是FⅦ的收率较高。此外，得到的人凝血酶原复合物稳定性较好。 [0032] 提取人凝血酶原复合物的方法 [0033] 在本发明的另一方面，本发明提出了一种提取人凝血酶原复合物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)利用前面所描述的平衡液对凝胶进行平衡，得到第一湿胶；(2)将所述第一湿胶与血浆进行接触；(3)用第一洗涤液洗涤步骤(2)所得到的凝胶，弃滤液；以及(4)利用第一洗脱液洗脱步骤(3)所得到的凝胶，收集滤液，以便得到所述人凝血酶原复合物。 [0034] 发明人发现，利用平衡液对凝胶进行平衡，使得到的湿胶的离子强度接近平衡液的离子强度，由此，将湿胶与血浆接触后，凝胶能够有效地吸附血浆中的人凝血酶原复合物，尤其是FⅦ。接着，利用洗涤液洗涤凝胶，以除去吸附力弱的杂蛋白以及黏附的其他成分。然后，利用洗脱液洗脱下人凝血酶原复合物。由此，利用根据本发明实施例的方法能够有效地提取人凝血酶原复合物，且收率及纯度较高，尤其是FⅦ的收率较高。此外，得到的人凝血酶原复合物稳定性较好。而且，该方法操作简便、成本低，适于工业化生产。 [0035] 根据本发明的实施例，所述第一洗涤液包括：0.15mol/L～0.20mol/L的氯化钠；以及0.01mol/L～0.02mol/L的枸橼酸钠，所述第一洗涤液的pH值为6.8～7.2。由此，利用该洗涤液能够充分除去吸附力弱的杂蛋白以及黏附的其他成分，使得到的人凝血酶原复合物纯度较高。 [0036] 根据本发明的实施例，所述第一洗脱液包括：1.5mol/L～2.0mol/L的氯化钠；以及0.02mol/L～0.03mol/L的枸橼酸钠，所述第一洗脱液的pH值为6.8～7.2。由此，利用该洗脱液能够充分洗脱下人凝血酶原复合物，尤其是FⅦ，使其收率较高。 [0037] 根据本发明的实施例，基于1L所述血浆，所述凝胶的用量为0.5g～2.5g，优选1.5g。发明人发现，血浆与凝胶的比例关系显著影响人凝血酶原复合物的收率，尤其是FⅦ，随着凝胶量的增加，洗脱下的人凝血酶原复合物越多，尤其是FⅦ。进而，发明人经过大量实验得到上述最优比例关系。凝胶量较少，无法充分吸附血浆中的人凝血酶原复合物，使其收率较低；凝胶量较大，无法增加人凝血酶原复合物的吸附率，且容易导致吸附杂蛋白增多，使得到的人凝血酶原复合物的纯度下降。由此，利用根据本发明实施例的方法能够有效地提取人凝血酶原复合物，且收率及纯度较高，尤其是FⅦ的收率较高。此外，得到的人凝血酶原复合物稳定性较好。而且，该方法操作简便、成本低，适于工业化生产。 [0038] 需要说明的是，本发明对血浆的来源不作严格限定，只要能够提供人凝血酶原复合物即可。根据本发明的具体实施例，所述血浆为去冷沉淀血浆。发明人发现，与新鲜冰冻血浆相比，去冷沉淀血浆中的人凝血酶原复合物较稳定，能够有效地减少在提取过程中人凝血酶原复合物的损伤。此外，去冷沉淀血浆还可以“一血多用”，即可以收集提取过程中的弃液中的白蛋白、静丙。 [0039] 根据本发明的具体实施例，所述去冷沉淀血浆是通过采用下列方式获得的：用水将冰冻血浆进行化浆，得到浆液；将所述浆液在0℃～4℃下进行离心，收集上清液，以便得到所述去冷沉淀血浆。 [0040] 根据本发明的实施例，步骤(2)进一步包括：(2-1)将所述第一湿胶与血浆在15℃～20℃下搅拌40～60min，优选在17℃下搅拌40min，得到混合液；以及(2-2)将所述混合液置于层析柱中，弃流出液，收集凝胶。通过搅拌，能够使得血浆与凝胶充分接触，便于吸附。发明人意外地发现，搅拌时的温度对FⅦ活化有重要影响，温度较低时FⅦ易活化，输注人体后会增加血栓性疾病的风险。由此，利用根据本发明实施例的方法能够有效地提取人凝血酶原复合物，且收率及纯度较高，尤其是FⅦ的收率较高。此外，得到的人凝血酶原复合物稳定性较好。而且，该方法操作简便、成本低，适于工业化生产。 [0041] 根据本发明的实施例，步骤(4)进一步包括：(4-1)将所述滤液进行病毒灭活，得到灭活产物；(4-2)利用第二平衡液对凝胶进行第二平衡，得到第二湿胶；(4-3)将所述灭活产物与所述第二湿胶进行接触；(4-4)用第二洗涤液洗涤步骤(4-3)所得到的凝胶，弃滤液；(4-5)利用第二洗脱液洗脱步骤(4-4)所得到的凝胶，收集第二滤液；以及(4-6)将所述第二滤液与抑制剂混合，并将所得到的混合液进行冻干及干热，以便得到所述人凝血酶原复合物。 [0042] 为降低可能的病毒传播的风险并保证制品的安全性，发明人采用两步病毒灭活措施。首先，需要将滤液进行灭活，以杀死病毒。然后，通过洗涤、洗脱，以除去灭活过程中所使用的有机试剂以及灭活的病毒等杂质，以进一步纯化人凝血酶原复合物。接着，将滤液与抑制剂混合，以防止人凝血酶原复合物活化。最后，将所得到的混合液进行冻干及干热，以进一步将病毒灭活，以便得到人凝血酶原复合物。 [0043] 根据本发明的实施例，在步骤(4-1)之前，将滤液进行超滤及透析处理；在步骤(4-6)之前，将第二滤液进行超滤及透析处理，以过滤除去杂质。由此，使得到的人凝血酶原复合物的纯度较高。 [0044] 根据本发明的具体实施例，所述病毒灭活是通过下列方式进行的：把S/D原液按1：10的比例(S/D原液用量为过滤后的混合液量的1/10)加入到滤液中，使Tween-80含量为 1％、TNBP含量为0.3％，并充分搅拌将混合液缓慢升温至24～26℃。进行6小时灭活处理，每 0.5小时记录1次温度。 [0045] 根据本发明的实施例，所述第二平衡液包括：0.05mol/L～0.10mol/L的氯化钠；以及0.01mol/L～0.02mol/L的枸橼酸钠，所述第二平衡液的pH值为6.8～7.2。由此，能够使灭活产物充分吸附于凝胶上。发明人发现，利用第一平衡液进行步骤(4-2)的操作，所得到的湿胶对灭活产物中的人凝血酶原复合物的吸附率降低。通过深入研究发现，灭活产物的离子强度低于平衡液的离子强度，若利用第一平衡液平衡凝胶，所得到的湿胶的离子强度较低，无法充分吸附人凝血酶原复合物。有鉴于此，发明人经过大量实验调整平衡液中氯化钠及枸橼酸钠的浓度，发现当氯化钠浓度为0.05mol/L～0.1mol/L(例如0.06mol/L、0.07mol/L、0.08mol/L、0.09mol/L)、枸橼酸钠的浓度为0.01mol/L～0.02mol/L，pH值为6.8～7.2时，吸附效果较好，所得到的人凝血酶原复合物的收率及纯度较高，尤其是FⅦ的收率较高。 [0046] 根据本发明的实施例，所述第二洗涤液包括：0.05mol/L～0.10mol/L的氯化钠；0.01mol/L～0.02mol/L的枸橼酸钠，所述第二洗涤液的pH值为6.8～7.2。由此，利用该洗涤液能够充分除去吸附力弱的有机溶剂、灭活病毒及其他杂质，使得到的人凝血酶原复合物纯度较高。 [0047] 根据本发明的实施例，所述第二洗脱液包括：1.5mol/L～2.0mol/L的氯化钠；以及0.02mol/L～0.03mol/L枸橼酸钠，所述第二洗脱液的pH值为6.8～7.2。由此，利用该洗脱液能够充分洗脱下人凝血酶原复合物，尤其是FⅦ，使其收率较高。 [0048] 根据本发明的实施例，所述抑制剂包括：0.2IU肝素/IU FⅨ；以及22g/L甘氨酸。发明人经过大量实验得到上述最优抑制剂种类及含量，由此，能够有效地抑制人凝血酶原复合物活化，降低活化的人凝血酶原复合物输入到人体后导致血栓性疾病的风险。 [0049] 本领域技术人员能够理解的是，0.2IU肝素/IU FⅨ是指PCC中每1.0IUFⅨ肝素添加量为0.2IU。 [0050] 根据本发明的实施例，步骤(4-3)进一步包括：(4-3-1)将所述灭活产物与第二湿胶在15℃～20℃下搅拌40～60min，优选在17℃下搅拌50min，得到第二混合液；以及(4-3-2)将所述第二混合液置于层析柱中，弃流出液，收集凝胶。由此，能够使灭活产物中的人凝血酶原复合物充分附着于凝胶上，使得人凝血酶原复合物的收率及纯度较高，尤其是FⅦ的收率较高。 [0051] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。 [0052] S/D原液的制备(以1L为例)：将110mlTween-80溶于857ml注射用水中，充分溶解后，加入33.3ml TNBP，继续搅拌至清亮后即得1L S/D溶液，降温至30℃以下备用。 [0053] 血浆：来自恩施天源单采血浆站有限公司，批号：20150914、20151015、20151120。 [0054] 检测方法： [0055] A、电导率检测是通过电导率仪来实现，电导率仪购自梅特勒，型号为FE30Kplus，其检测范围在0.00～199.9ms/cm。 [0056] B、效价检测：采用凝固法。仪器：法国STAGO公司全自动血凝仪，型号：STA Compact Max。具体方法： [0057] 1)取1ml注射用水溶解标准品，再加生理盐水将其稀释到1IU/ml，最后用稀释液将标准品稀释至1/2、1/4、1/6、1/8。将效价检测所需的乏因子血浆、凝血质控品、APTT/PT、Desorb U(以上试剂均为STAGO原装试剂)等装载至血凝仪上，上机检测。仪器会自动绘制出凝血因子效价对数值与凝固时间对数值的标准曲线。 [0058] 2)按标示量加入注射用水溶解PCC样品，再加生理盐水将其稀释到1IU/ml，最后用稀释液将样品稀释至1/3、1/4、1/6，上机检测。 [0059] 3)根据标准曲线计算各凝血因子效价，取三种稀释梯度(RSD<10％)的平均值。 [0060] 实施例1 [0061] 在该实施例中，按照下列方法提取人凝血酶原复合物： [0062] (1)提供冰冻血浆，酒精消毒血浆袋表明，注射用水化浆。 [0063] (2)将血浆在0～4℃条件下，用管式离心机进行分离，收集500L上清(即去冷沉淀血浆)，调节其pH至7.3。 [0064] (3)将去冷沉淀血浆升温至15～20℃。 [0065] (4)按照1.5kg干胶/1000L去冷沉淀血浆的比例将预先用平衡液平衡好的湿胶加入到去冷沉淀血浆中，17℃搅拌吸附40分钟。将血浆及凝胶转入层析柱中，收集凝胶，流出液用于白蛋白、静丙等的生产。平衡液中氯化钠浓度为0.10mol/L，枸橼酸钠浓度为0.015mol/L，pH:7.2。 [0066] (5)用洗涤液洗涤凝胶3次，弃滤液，最后用洗脱液洗脱3次，收集滤液。洗涤液中氯化钠浓度为0.17mol/L，枸橼酸钠浓度为0.015mol/L，pH:7.0。洗脱液中氯化钠浓度为1.6mol/L，枸橼酸钠浓度为0.03mol/L，pH:7.0。 [0067] (6)将洗脱后的滤液用0.2～1.0μm的滤芯过滤，通过Millipore Pellicon超滤系统将滤液进行超滤浓缩(膜包截留分子量为10kD)，再用透析液等体积透析4次。透析液中枸橼酸钠浓度为0.01mol/L，pH:7.0。 [0068] (7)以500ml/min的速度把S/D原液按1：10的比例(S/D原液用量为超滤透析后滤液的1/10)加入到超滤透析后的滤液中，使Tween-80含量为1％、TNBP含量为0.3％，并充分搅拌将混合液缓慢升温至24～26℃，保温进行6小时灭活处理，每0.5小时记录1次温度。 [0069] (8)按照1.3kg干胶/1000L去冷沉淀血浆的比例向灭活的产物中加入预先用下述平衡液平衡好的湿胶，17℃搅拌吸附50分钟。平衡液中氯化钠浓度为0.05mol/L，枸橼酸钠浓度为0.015mol/L，pH:7.0。 [0070] (9)用洗涤液洗涤凝胶6次，弃滤液，再用洗脱液洗脱3次，收集滤液。洗涤液中氯化钠浓度为0.06mol/L，枸橼酸钠浓度为0.015mol/L，pH:7.0。洗脱液中氯化钠浓度为1.6mol/L，枸橼酸钠浓度为0.03mol/L，pH:7.0。 [0071] (10)将洗脱后收集的滤液用0.2～1.0μm的滤芯过滤，通过Millipore Pellicon超滤系统将滤液进行超滤浓缩(膜包截留分子量为10kD)，再用透析液等体积透析4次。透析结束后进行再浓缩，浓缩液FⅨ效价在25IU/ml左右。透析液中枸橼酸钠浓度为0.01mol/L，pH:7.0。 [0072] (11)向浓缩液中加入0.2IU肝素/IU FⅨ、22g/L甘氨酸，混合后进行冻干，得到冻干产物。 [0073] (12)将冻干产物在100℃下干热30min，以获得人凝血酶原复合物。 [0074] 实施例2 [0075] 在该实施例中，按照下列方法提取人凝血酶原复合物： [0076] (1)提供冰冻血浆，酒精消毒血浆袋表明，注射用水化浆。 [0077] (2)将血浆在0～4℃条件下，用管式离心机进行分离，收集500L上清(即去冷沉淀血浆)，调节其pH至7.3。 [0078] (3)将去冷沉淀血浆升温至15～20℃。 [0079] (4)按照1.5kg干胶/1000L去冷沉淀血浆的比例将预先用平衡液平衡好的湿胶加入到去冷沉淀血浆中，17℃搅拌吸附40分钟。将血浆及凝胶转入层析柱中，收集凝胶，流出液用于白蛋白、静丙等的生产。平衡液中氯化钠浓度为0.12mol/L，枸橼酸钠浓度为0.015mol/L，pH:7.2。 [0080] (5)用洗涤液洗涤凝胶3次，弃滤液，最后用洗脱液洗脱3次，收集滤液。洗涤液中氯化钠浓度为0.17mol/L，枸橼酸钠浓度为0.015mol/L，pH:7.0。洗脱液中氯化钠浓度为1.8mol/L，枸橼酸钠浓度为0.03mol/L，pH:7.0。 [0081] (6)将洗脱后的滤液用0.2～1.0μm的滤芯过滤，通过Millipore Pellicon超滤系统将滤液进行超滤浓缩(膜包截留分子量为10kD)，再用透析液等体积透析5次。透析液中枸橼酸钠浓度为0.01mol/L，pH:7.0。 [0082] (7)以500ml/min的速度把S/D原液按1：10的比例(S/D原液用量为超滤透析后滤液的1/10)加入到超滤透析后的滤液中，使Tween-80含量为1％、TNBP含量为0.3％，并充分搅拌将混合液缓慢升温至24～26℃，保温6小时灭活处理，每0.5小时记录1次温度。 [0083] (8)按照1.25kg干胶/1000L去冷沉淀血浆的比例向灭活的产物中加入预先用下述平衡液平衡好的湿胶，17℃搅拌吸附50分钟。平衡液中氯化钠浓度为0.06mol/L，枸橼酸钠浓度为0.015mol/L，pH:7.0。 [0084] (9)用洗涤液洗涤凝胶6次，弃滤液，再用洗脱液洗脱3次。洗涤液中氯化钠浓度为0.075mol/L，枸橼酸钠浓度为0.015mol/L，pH:7.0。洗脱液中氯化钠浓度为1.6mol/L，枸橼酸钠浓度为0.03mol/L，pH:7.0。 [0085] (10)将洗脱后收集的滤液用0.2～1.0μm的滤芯过滤，通过Millipore Pellicon超滤系统将滤液进行超滤浓缩(膜包截留分子量为10kD)，再用透析液等体积透析4次。透析结束后进行再浓缩，浓缩液FⅨ效价在25IU/ml左右。透析液中枸橼酸钠浓度为0.01mol/L，pH:7.0。 [0086] (11)向浓缩液中加入0.2IU肝素/IU FⅨ、22g/L甘氨酸，混合后进行冻干，得到冻干产物。 [0087] (12)将冻干产物在100℃下干热30min，以获得人凝血酶原复合物。 [0088] 实施例3 [0089] 在该实施例中，按照下列方法提取人凝血酶原复合物： [0090] (1)提供冰冻血浆，酒精消毒血浆袋表明，注射用水化浆。 [0091] (2)将血浆在0～4℃条件下，用管式离心机进行分离，收集500L上清(即去冷沉淀血浆)，调节其pH至7.3。 [0092] (3)将去冷沉淀血浆升温至15～20℃。 [0093] (4)按照1.5kg干胶/1000L去冷沉淀血浆的比例将预先用平衡液平衡好的湿胶加入到去冷沉淀血浆中，17℃搅拌吸附40分钟。将血浆及凝胶转入层析柱中，收集凝胶，流出液用于白蛋白、静丙等的生产。平衡液中氯化钠浓度为0.15mol/L，枸橼酸钠浓度为0.015mol/L，pH:7.2。 [0094] (5)用洗涤液洗涤凝胶3次，弃滤液，最后用洗脱液洗脱3次，收集滤液。洗涤液中氯化钠浓度为0.17mol/L，枸橼酸钠浓度为0.015mol/L，pH:7.0。洗脱液中氯化钠浓度为2.0mol/L，枸橼酸钠浓度为0.03mol/L，pH:7.0。 [0095] (6)将洗脱后的滤液用0.2～1.0μm的滤芯过滤，通过Millipore Pellicon超滤系统将滤液进行超滤浓缩(膜包截留分子量为10kD)，再用透析液等体积透析5次。透析液中枸橼酸钠浓度为0.01mol/L，pH:7.0。 [0096] (7)以500ml/min的速度把S/D原液按1：10的比例(S/D原液用量为超滤透析后滤液的1/10)加入到超滤透析后的滤液中，使Tween-80含量为1％、TNBP含量为0.3％，并充分搅拌将混合液缓慢升温至24～26℃，保温6小时灭活处理，每0.5小时记录1次温度。 [0097] (8)按照1.2kg干胶/1000L去冷沉淀血浆的比例向灭活的产物中加入预先用下述平衡液平衡好的湿胶，17℃搅拌吸附50分钟。平衡液中氯化钠浓度为0.075mol/L，枸橼酸钠浓度为0.015mol/L，pH:7.0。 [0098] (9)用洗涤液洗涤凝胶6次，弃滤液，再用洗脱液洗脱3次，收集滤液。洗涤液中氯化钠浓度为0.08mol/L，枸橼酸钠浓度为0.015mol/L，pH:7.0。洗脱液中氯化钠浓度为1.6mol/L，枸橼酸钠浓度为0.03mol/L，pH:7.0。 [0099] (10)将洗脱后收集的滤液用0.2～1.0μm的滤芯过滤，通过Millipore Pellicon超滤系统将滤液进行超滤浓缩(膜包截留分子量为10kD)，再用透析液等体积透析4次。透析结束后进行再浓缩，浓缩液FⅨ效价在25IU/ml左右。透析液中枸橼酸钠浓度为0.01mol/L，pH:7.0。 [0100] (11)向浓缩液中加入0.2IU肝素/IU FⅨ、22g/L甘氨酸，混合后进行冻干，得到冻干产物。 [0101] (12)将冻干产物在100℃下干热30min，以获得人凝血酶原复合物。 [0102] 对比例1 [0103] 按照实施例1的方法提取人凝血酶原复合物，区别在于， [0104] 1、步骤(3)中，调节所得到的去冷沉淀血浆的离子强度，具体如下： [0105] 以50转/分钟低速搅拌去冷沉淀血浆，以不低于5L/分钟的流速向其中加入10～25℃注射用水170L，调整其离子强度，使电导为10ms/cm。 [0106] 2、步骤(4)中，平衡液中氯化钠浓度为0.075mol/L。 [0107] 对比例2 [0108] 按照实施例1的方法提取人凝血酶原复合物，区别在于，步骤(4)中，平衡液中氯化钠浓度为0.075mol/L。 [0109] 对比例3 [0110] 按照实施例2的方法提取人凝血酶原复合物，区别在于， [0111] 1、步骤(3)中，调节所得到的去冷沉淀血浆的离子强度，具体如下： [0112] 以50转/分钟低速搅拌去冷沉淀血浆，以不低于5L/分钟的流速向其中加入10～25℃注射用水330L，调整其离子强度，使电导为8ms/cm。 [0113] 2、步骤(4)中，平衡液中氯化钠浓度为0.05mol/L。 [0114] 对比例4 [0115] 按照实施例2的方法提取人凝血酶原复合物，区别在于，步骤(4)中，平衡液中氯化钠浓度为0.05mol/L。 [0116] 对比例5 [0117] 按照实施例3的方法提取人凝血酶原复合物，区别在于， [0118] 1、步骤(3)中，调节所得到的去冷沉淀血浆的离子强度，具体如下： [0119] 以50转/分钟低速搅拌去冷沉淀血浆，以不低于5L/分钟的流速向其中加入10～25℃注射用水600L，调整其离子强度，使电导为6ms/cm。 [0120] 2、步骤(4)中，平衡液中氯化钠浓度为0.025mol/L。 [0121] 对比例6 [0122] 按照实施例3的方法提取人凝血酶原复合物，区别在于，步骤(4)中，平衡液中氯化钠浓度为0.025mol/L。 [0123] 结果分析 [0124] 将实施例1～3以及对比例1～6的步骤(7)所得到的人凝血酶原复合物进行效价测定，结果如表1所示。可以看出，平衡液的离子强度低于去冷沉淀血浆离子强度时，所得到的 |
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