一种制备人凝血酶原复合物的方法 |
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| 申请号 | CN201610379619.7 | 申请日 | 2016-05-30 | 公开(公告)号 | CN105821024A | 公开(公告)日 | 2016-08-03 |
| 申请人 | 成都蓉生药业有限责任公司; | 发明人 | 余伟; 鲁涛; 牟蕾; 李伟; 王黔川; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种人凝血酶原复合物的制备方法，它包括如下步骤：(1)预纯化；(2)S/D病毒灭活；(3)精制纯化；(4)配制，除菌，分装，冻干，干 热处理 ，即可。本发明方法FIX回收率高达约58?67万IU/吨 血浆 ，且对人血 白蛋白 和免疫球蛋白的非特异性 吸附 少，不会导致宝贵的血浆资源浪费，且无需采用柱层析等高成本的方法，成本低廉，应用前景良好。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种人凝血酶原复合物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种制备人凝血酶原复合物的方法技术领域[0001] 本发明属于血液制品领域，具体涉及一种制备人凝血酶原复合物的方法。 背景技术[0002] 人凝血酶原复合物，主要用于治疗先天性和获得性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ缺乏症(单独或联合缺乏)包括：1.凝血因子Ⅸ缺乏症(乙型血友病)，以及Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ凝血因子缺乏症；2.抗凝剂过量、维生素K缺乏症；3.肝病导致的出血患者需要纠正凝血功能障碍时；4.各种原因所致的凝血酶原时间延长而拟作外科手术患者，但对凝血因子V缺乏者可能无效；5.治疗已产生因子Ⅷ抑制物的甲型血友病患者的出血症状；6.逆转香豆素类抗凝剂诱导的出血。 [0003] 人凝血酶原复合物是从健康人血浆中分离的血浆制品，合适的反应条件和保护剂的使用对工艺中FIX收率有显著性影响，但是目前制备人凝血酶原复合物的方法存在FIX回收率低，对血浆中其他有效成分影响大的问题。 [0004] 如，魏舒等，“冻干人凝血酶原复合物的生产工艺研究”，中国输血杂志，2008,21(4):282～284公开了一种人凝血酶原复合物生产工艺，制品经过S/D病毒灭活时未采取合适的保护剂，凝血因子II、VII、IX和X活性回收率分别损失20％左右。 [0005] 公告号102151289B的专利申请公开了一种制备人凝血酶原复合物的方法，其FIX回收率仅为45～49万IU/吨血浆，且未采取降低人血白蛋白和免疫球蛋白的非特异性吸附的步骤，导致宝贵的血浆资源浪费。 [0006] 公开号为104109202A的专利申请也公开了一种制备人凝血酶原复合物的方法，其FIX回收率较高，但是其工艺中多步澄清过滤增加操作难度和生产成本，并且按照柱床体积与上样的血浆量的比例为1：10～1:50来计算，要实现1吨血浆/批的处理，使用凝胶量为20～100L，按Capto DEAE市场价格计算，凝胶成本为300～1500万元，远远高于每吨血浆实现人凝血酶原复合物价值，因此，成本太高，实际应用价值不大。 [0007] 因此，需要提供一种成本低廉的、FIX回收率高的方法。 发明内容[0008] 本发明提供了一种人凝血酶原复合物的制备方法。 [0009] 去冷沉淀上清血浆：即去冷沉淀血浆。 [0010] 本发明人凝血酶原复合物的制备方法，它包括如下步骤： [0011] (1)预纯化 [0012] 取去冷沉淀上清血浆，调节温度和pH分别为10～15℃和7.0～7.4，按照每1L上清血浆使用1.4～1.6g A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶，吸附；收集凝胶，依次采用平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液处理凝胶，收集洗脱液，超滤透析； [0013] (2)S/D病毒灭活； [0014] (3)精制纯化 [0015] 将制品温度和pH分别调节至10～15℃和7.0～7.4，按照每1L上清血浆使用1.2～1.5g A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶，吸附；收集凝胶，依次采用平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液处理凝胶，收集洗脱液，超滤透析； [0017] 步骤(1)和步骤(3)中，平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液均是含有NaCl和枸橼酸钠的溶液。 [0018] 优选地， [0019] 平衡缓冲液中，NaCl、枸橼酸钠的浓度分别为0.08mol/L、0.01mol/L； [0020] 洗涤缓冲液中，NaCl、枸橼酸钠的浓度分别为0.17～0.23mol/L、0.01mol/L； [0021] 洗脱缓冲液中，NaCl、枸橼酸钠的浓度分别为2.0mol/L、0.015mol/L。 [0022] 步骤(1)中，吸附的时间为45～60min。 [0024] 步骤(2)中，所述S/D病毒灭活的方法是：取步骤(1)制得的制品，加入肝素钠，再加入Tween-80和TNBP使Tween-80和TNBP的最终浓度分别为1％(w/v)和0.3％(v/v)，待制品温度达到24℃开始计时，控制温度24～26℃，时间6小时。其中，肝素钠的加入量为1～3IU/ml制品。 [0025] 步骤(3)中，吸附的时间为30～60min。 [0027] 步骤(4)中，配置时加入肝素钠，肝素钠加入量是制品中FIX含量的0.1～0.3倍。 [0028] 步骤(4)中，干热处理的条件是80℃干热处理72小时。 [0029] 本发明方法FIX回收率高达约58-67万IU/吨血浆，且对人血白蛋白和免疫球蛋白的非特异性吸附少，不会导致宝贵的血浆资源浪费，且无需采用柱层析等高成本的方法，成本低廉，应用前景良好。 [0031] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明 [0032] 图1为人凝血酶原复合物的制备流程图。 具体实施方式[0034] 实验试剂：枸橼酸钠，氯化钠，甘氨酸，盐酸赖氨酸，DEAE Sephadex A50凝胶均为市售品。 [0035] 实施例1 本发明人凝血酶原复合物的制备方法 [0036] 一、制备方法 [0037] (1)预纯化 [0038] 将原料血浆融化，离心去除冷沉淀，将冷上清血浆升温至10℃，用醋酸缓冲液将pH调整到7.0。按1.4g A50凝胶干粉/L冷上清血浆比例添加溶胀后的凝胶，吸附时间为45min。收集凝胶，依次采用平衡、洗涤和洗脱缓冲液处理凝胶。收集的洗脱液经澄清过滤后，再进行超滤透析，完成后计量制品的体积。 [0039] (2)S/D病毒灭活 [0040] 按1IU/ml制品比例加入肝素钠后，再根据制品的体积加入S/D储备液，使最终Tween～80和TNBP的浓度分别为1％和0.3％。待制品温度达到24℃开始计时，控制温度24～26℃，时间6小时，每半个小时记录制品温度一次。 [0041] (3)精制纯化 [0042] 将制品温度和pH分别调整到10℃和7.0，按1.2g A50凝胶干粉/L冷上清血浆比例添加溶胀后的凝胶，吸附时间为30min。收集凝胶，依次采用平衡液、洗涤液和洗脱缓冲液液处理凝胶。收集的洗脱液经澄清过滤后，再进行超滤透析，透析结束后，对制品进行计量，并抽样检测原液pH、蛋白浓度和FIX活性。按照分装规格添加透析缓冲液，按0.1IU/IU FIX加入肝素钠，混匀。除菌分装后的制品应立即冻干。 [0043] (4)干热处理 [0044] 冻干后的制品经80℃、72小时干热处理，以灭活可能残留的污染病毒。干热处理完成后即得人凝血酶原复合物成品，检定结果如表1所示。 [0045] 其中，平衡液含0.08mol/L NaCl和0.01mol/L枸橼酸钠，温度值为10℃，pH值为7.0； [0046] 洗涤液含0.17mol/L NaCl和0.01mol/L枸橼酸钠，温度值为10℃，pH值为7.0； [0047] 洗脱液含2.0mol/L NaCl和0.015mol/L枸橼酸钠，温度值为10℃，pH值为7.0； [0048] 首次透析液含0.015mol/L枸橼酸钠，温度值为15℃，pH值为7.0； [0049] 二次透析液含0.1mol/L NaCl，0.015mol/L枸橼酸钠，20g/L甘氨酸和5g/L盐酸赖氨酸，温度值为15℃，pH值为6.9； [0051] 二、检测 [0052] 1、检测方法 [0053] (1)FIX收率的检测方法：按《中国药典》2015年版三部“人凝血因子IX效价测定法(通则3519)”检定。 [0054] (2)人血白蛋白和免疫球蛋白的检测方法：按贝克曼库尔特IMMAGE800特定蛋白分析系统及其配套试剂检测白蛋白和免疫球蛋白含量。 [0055] 2、检测结果 [0056] (1)FIX回收率 [0057] 经检测，本发明工艺的FIX回收率为58万(FIX IU/吨血浆)。 [0058] (2)人血白蛋白和免疫球蛋白的收率 [0059] 结果如下表： [0060]产品名称 白蛋白 免疫球蛋白 吸附后血浆 95％ 94％ 回洗液 5％ 4％ 总收率 100％ 98％ [0061] 可以看出，采用本发明方法制备人凝血酶原复合物，白蛋白和免疫球蛋白的回收率高达100％和98％。 [0062] 实施例2 本发明人凝血酶原复合物的制备方法 [0063] 一、制备方法 [0064] ⑴预纯化 [0065] 将原料血浆融化，离心去除冷沉淀，将冷上清血浆升温至13℃，用醋酸缓冲液将pH调整到7.2。按1.5g A50凝胶干粉/L冷上清血浆比例添加溶胀凝胶，吸附时间为50min。收集凝胶，依次采用平衡、洗涤和洗脱缓冲液处理凝胶。收集的洗脱液经澄清过滤后，再进行超滤透析，完成后计量制品的体积。 [0066] ⑵S/D病毒灭活 [0067] 按2IU/ml制品比例加入肝素钠后，再加入S/D储备液使最终Tween～80和TNBP的浓度分别为1％和0.3％。待制品温度达到24℃开始计时，控制温度24～26℃，时间6小时，每半个小时记录制品温度一次。 [0068] ⑶精制纯化 [0069] 将制品温度和pH分别调整到13℃和7.2，按1.3g A50凝胶干粉/L冷上清血浆比例添加溶胀凝胶，吸附时间为45min。收集凝胶，依次采用平衡液、洗涤液和洗脱缓冲液液处理凝胶。收集的洗脱液经澄清过滤后，再进行超滤透析，透析结束后，对制品进行计量，并抽样检测原液pH、蛋白浓度和FIX活性。按照分装规格添加透析缓冲液，按0.2IU/IU FIX加入肝素钠，混匀。除菌分装后的制品应立即冻干。 [0070] ⑷干热处理 [0071] 冻干后的制品经80℃、72小时干热处理，以灭活可能残留的污染病毒。 [0072] 干热处理完成后即得人凝血酶原复合物成品，检定结果如表1所示。 [0073] 其中，平衡液含0.08mol/L NaCl和0.01mol/L枸橼酸钠，温度值为13℃，pH值为7.2； [0074] 洗涤液含0.20mol/L NaCl和0.01mol/L枸橼酸钠，温度值为13℃，pH值为7.2； [0075] 洗脱液含2.0mol/L NaCl和0.015mol/L枸橼酸钠，温度值为13℃，pH值为7.2； [0076] 首次透析液含0.015mol/L枸橼酸钠，温度值为20℃，pH值为7.2； [0077] 二次透析液含0.1mol/L NaCl，0.015mol/L枸橼酸钠，20g/L甘氨酸和5g/L盐酸赖氨酸，温度值为20℃，pH值为7.0； [0078] S/D储备液含200g吐温80和60ml磷酸三丁酯加注射用水至1L的方法制备。 [0079] 二、检测 [0080] 1、检测方法 [0081] (1)FIX收率的检测方法：按《中国药典》2015年版三部“人凝血因子IX效价测定法(通则3519)”检定。 [0082] (2)人血白蛋白和免疫球蛋白的检测方法：按贝克曼库尔特IMMAGE800特定蛋白分析系统及其配套试剂检测白蛋白和免疫球蛋白含量。 [0083] 2、检测结果 [0084] (1)FIX回收率 [0085] 经检测，本发明工艺的FIX回收率为67万(FIX IU/吨血浆)。 [0086] (2)人血白蛋白和免疫球蛋白的收率 [0087] 结果如下表： [0088]产品名称 白蛋白 免疫球蛋白 吸附后血浆 94％ 98％ 回洗液 7％ 4％ 总收率 101％ 102％ [0089] 可以看出，采用本发明方法制备人凝血酶原复合物，白蛋白和免疫球蛋白的回收率高达101％和102％。 [0090] 实施例3 本发明人凝血酶原复合物的制备方法 [0091] 一、制备方法 [0092] ⑴预纯化 [0093] 将原料血浆融化，离心去除冷沉淀，将冷上清血浆升温至15℃，用醋酸缓冲液将pH调整到7.4。按1.6g A50凝胶干粉/L冷上清血浆比例添加溶胀凝胶，吸附时间为60min。收集凝胶，依次采用平衡、洗涤和洗脱缓冲液处理凝胶。收集的洗脱液经澄清过滤后，再进行超滤透析，完成后计量制品的体积。 [0094] ⑵S/D病毒灭活 [0095] 按3IU/ml制品比例加入肝素钠后，再加入S/D储备液使最终Tween～80和TNBP的浓度分别为1％和0.3％。待制品温度达到24℃开始计时，控制温度24～26℃，时间6小时，每半个小时记录制品温度一次。 [0096] ⑶精制纯化 [0097] 将制品温度和pH分别调整到15℃和7.4，按1.5g A50凝胶干粉/L冷上清血浆比例添加溶胀凝胶，吸附时间为60min。收集凝胶，依次采用平衡液、洗涤液和洗脱缓冲液液处理凝胶。收集的洗脱液经澄清过滤后，再进行超滤透析，透析结束后，对制品进行计量，并抽样检测原液pH、蛋白浓度和FIX活性。按照分装规格添加透析缓冲液，按0.3IU/IU FIX加入肝素钠，混匀。除菌分装后的制品应立即冻干。 [0098] ⑷干热处理 [0099] 冻干后的制品经80℃、72小时干热处理，以灭活可能残留的污染病毒。 [0100] 干热处理完成后即得人凝血酶原复合物成品，检定结果如表1所示。 [0101] 其中，平衡液含0.08mol/L NaCl和0.01mol/L枸橼酸钠，温度值为15℃，pH值为7.4； [0102] 洗涤液含0.23mol/L NaCl和0.01mol/L枸橼酸钠，温度值为15℃，pH值为7.4； [0103] 洗脱液含2.0mol/L NaCl和0.015mol/L枸橼酸钠，温度值为15℃，pH值为7.4； [0104] 首次透析液含0.015mol/L枸橼酸钠，温度值为25℃，pH值为7.4； [0105] 二次透析液含0.1mol/L NaCl，0.015mol/L枸橼酸钠，20g/L甘氨酸和5g/L盐酸赖氨酸，温度值为25℃，pH值为7.1； [0106] S/D储备液含200g吐温80和60ml磷酸三丁酯加注射用水至1L的方法制备。 [0107] 二、检测 [0108] 1、检测方法 [0109] (1)FIX收率的检测方法：按《中国药典》2015年版三部“人凝血因子IX效价测定法(通则3519)”检定。 [0110] (2)人血白蛋白和免疫球蛋白的检测方法：按贝克曼库尔特IMMAGE800特定蛋白分析系统及其配套试剂检测白蛋白和免疫球蛋白含量。 [0111] 2、检测结果 [0112] (1)FIX回收率 [0113] 经检测，本发明工艺的FIX回收率为63万(FIX IU/吨血浆)。 [0114] (2)人血白蛋白和免疫球蛋白的收率 [0115] 结果如下表： [0116]产品名称 白蛋白 免疫球蛋白 吸附后血浆 93％ 98％ 回洗液 10％ 5％ 总收率 103％ 103％ [0117] 可以看出，采用本发明方法制备人凝血酶原复合物，白蛋白和免疫球蛋白的回收率高达103％和103％。 [0118] 将本发明方法制备得到的产品进行质量检测，检测结果如下： [0119] 表1 成品检定结果 [0120] [0121] 实验结果说明，本发明方法制备的人凝血酶原复合物凝血因子含量均衡，安全、有效。 [0122] 本发明所建立的人凝血酶原复合物制备方法，反应条件温和，对S/D处理、冻干及干热处理过程中合理使用保护剂，有效的实现了凝血因子的分离纯化，降低了凝血因子激活的风险；并且工艺稳定性高，批件差异小，凝血因子含量均衡，能很好的发挥临床使用效果；再者采用S/D病毒灭活和80℃、72小时干热处理的两步病毒灭活方法，制品病毒安全性得到极大提高。本发明能稳定且可靠的制备出安全、有效的制品。 [0123] 为了进一步说明本发明的有益效果，下面从技术提高带来的商业价值来阐述： [0124] 现有技术中，采用吸附法制备人凝血酶原复合物的方法，FIX回收率仅为45～49万IU/吨血浆，而本发明吸附法的回收率高达58～67万IU/吨血浆，也就是说，采用本发明方法制备人凝血酶原复合物，每吨血浆比现有方法可以多收9～22万IU/吨血浆。 [0125] 按照每年投浆600吨来计算，采用本发明方法，可多回收5400～12000万IU FIX,以市场价格约0.8元/IU计算，可增加4320～15000万元收入。 [0126] 综上，本发明方法FIX回收率高，且对人血白蛋白和免疫球蛋白的非特异性吸附少，不会导致宝贵的血浆资源浪费，且未采用柱层析等高成本的方法，成本低廉，应用前景良好。 |
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