用于抵消因子Xa抑制的组合物和方法 |
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| 申请号 | CN201480006917.0 | 申请日 | 2014-01-23 | 公开(公告)号 | CN104994868A | 公开(公告)日 | 2015-10-21 |
| 申请人 | 辉瑞公司; 费城儿童医院; | 发明人 | R·卡米雷; J·弗鲁比斯; D·D·彼德曼; | ||||
| 摘要 | 本公开提供了通过施用FXa的变体，用于抵消对象中的直接活化因子X(FXa) 抑制剂 的效应的组合物和方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种用于降低或预防用直接因子Xa抑制剂治疗的对象中的出血的方法，其包括给 |
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| 说明书全文 | 用于抵消因子Xa抑制的组合物和方法[0001] 相关申请的交叉引用 [0002] 本申请要求于2013年1月31日提交的美国临时申请号61/759,332的利益，所述美国临时申请的内容整体援引加入本文。 技术领域[0003] 根据37CFR§1.821，以计算机可读形式(CRF)经由EFS-Web作为文件名PC072006_SEQLIST_ST25.txt同时提交的序列表援引加入本文。序列表的电子拷贝于2013年12月18日创建，具有7千字节的文件大小。 背景技术[0004] 药理学抗凝是患有血栓前状况的患者的治疗主体。过去五十年，唯一可用的经口抗凝血药是华法林，维生素K环氧化物还原酶(VKOR)的抑制剂，其再利用氧化的维生素K。华法林具有许多缺点，包括无法预测的药物代谢动力学，其需要频繁监控凝血参数和剂量调整。然而，在紧急出血或需要急诊手术的情况下，存在允许快速和完全逆转的解毒药。 [0005] 经口直接FXa抑制剂是新出现的抗凝血药，当与标准治疗例如华法林相比较时，其具有简化患有血栓前疾病的给药方案和止血监控的潜力。尽管这些药物具有许多超过华法林的优点，但这些新型抗凝血药没有完全有效的逆转试剂。 [0006] 然而，由于害怕难控制的出血，对其效应的特异性对抗措施的缺乏是关键的未满足的临床需要，其可以限制这些试剂的广泛采用。发明内容 [0007] 通过提供用于抵消直接活化因子X(FXa)抑制剂的效应的组合物和方法，申请人已解决该关键的未满足的临床需要。 [0008] 根据一些实施方案，本公开提供了通过施用包含因子Xa变体的组合物，用于降低或预防用直接因子Xa(FXa)抑制剂治疗的对象中的出血的方法，所述因子Xa变体含有至少一种修饰，包括在位置16处(使用胰凝乳蛋白酶编号系统)使用Thr、Leu、Phe、Asp或Gly取代野生型氨基酸，或者在位置17处(使用胰凝乳蛋白酶编号系统)使用Leu、Ala或Gly取代野生型氨基酸。在某些实施方案中，用包含FXa变体的组合物治疗导致出血降低至少50％。根据某些实施方案，直接因子Xa抑制剂包括利伐沙班或阿哌沙班。在一些实施方案中，直接FXa抑制剂的血浆浓度通常为治疗量或超治疗量。例如，在一些实施方案中，利伐沙班的血浆浓度可以是约500nM或更高，并且阿哌沙班的血浆浓度可以是约250nM或更高。 根据某些实施方案，FXa变体含有取代I16L。在一些实施方案中，在比因子Xa抑制剂的血浆浓度低至少100倍的血浆浓度下，FXa变体能够抵消直接因子Xa抑制剂的效应。在一些实施方案中，包含FXa变体的组合物在计划的手术前、在损伤后、或者在用直接FXa抑制剂的有意或意外药物过量后施用。在一些实施方案中，在用FXa变体的第一个剂量后，使用止血测定监控对象中的止血，并且如果通过预定时间未获得足够的止血，则施用FXa变体的至少一次第二个剂量，以实现充分止血。根据一些实施方案，预定时间是施用FXa变体的第一个剂量后约15分钟、30分钟、45分钟或60分钟。其他时间也是可能的。在一些其他实施方案中，除FXa变体之外还施用至少第二种促凝血剂，包括例如不同的FXa变体、因子IX、因子XIa、因子XIIa、因子VIII、因子VIIa、FEIBA或凝血酶原复合物浓缩剂(PCC)。 [0009] 根据一些实施方案，本公开提供了通过施用包含因子Xa变体的组合物，用于增加用直接因子Xa(FXa)抑制剂治疗的对象中，响应外源或固有凝血途径的活化而产生的凝血酶量的方法，所述因子Xa变体含有至少一种修饰，包括在位置16处(使用胰凝乳蛋白酶编号系统)使用Thr、Leu、Phe、Asp或Gly取代野生型氨基酸，或者在位置17处(使用胰凝乳蛋白酶编号系统)使用Leu、Ala或Gly取代野生型氨基酸。根据某些实施方案，直接因子Xa抑制剂包括利伐沙班或阿哌沙班。在一些实施方案中，直接FXa抑制剂的血浆浓度通常为治疗量或超治疗量。例如，在一些实施方案中，利伐沙班的血浆浓度可以是约500nM或更高，并且阿哌沙班的血浆浓度可以是约250nM或更高。根据某些实施方案，FXa变体含有取代I16L。根据某些实施方案，所产生的凝血酶量增加约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或更多。在一些实施方案中，FXa变体能够在比因子Xa抑制剂的血浆浓度低至少100倍的血浆浓度下抵消直接因子Xa抑制剂的效应。在一些实施方案中，包含FXa变体的组合物在计划的手术前、在损伤后、或者在用直接FXa抑制剂的有意或意外药物过量后施用。在一些实施方案中，在用FXa变体的第一个剂量后，使用止血测定监控对象中的止血，并且如果通过预定时间未获得足够的止血，则施用FXa变体的至少一次第二个剂量，以实现充分止血。根据一些实施方案，预定时间是施用FXa变体的第一个剂量后约15分钟、30分钟、45分钟或60分钟。其他时间也是可能的。 在一些其他实施方案中，除FXa变体之外还施用至少第二种促凝血剂，包括例如不同的FXa变体、因子IX、因子XIa、因子XIIa、因子VIII、因子VIIa、FEIBA或凝血酶原复合物浓缩剂(PCC)。 [0010] 根据一些实施方案，本公开提供了通过施用包含因子Xa变体的组合物，用于减少用直接因子Xa(FXa)抑制剂治疗的对象中的凝血时间(如例如使用PT或INR、或一些其他测定测量的)的方法，所述因子Xa变体含有至少一种修饰，包括在位置16处(使用胰凝乳蛋白酶编号系统)使用Thr、Leu、Phe、Asp或Gly取代野生型氨基酸，或者在位置17处(使用胰凝乳蛋白酶编号系统)使用Leu、Ala或Gly取代野生型氨基酸。根据某些实施方案，直接因子Xa抑制剂包括利伐沙班或阿哌沙班。在一些实施方案中，直接FXa抑制剂的血浆浓度通常为治疗量或超治疗量。例如，在一些实施方案中，利伐沙班的血浆浓度可以是约500nM或更高，并且阿哌沙班的血浆浓度可以是约250nM或更高。根据某些实施方案，FXa变体含有取代I16L。根据某些实施方案，凝血时间减少约5％、10％、15％、20％、30％、40％、 50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，FXa变体能够在比因子Xa抑制剂的血浆浓度低至少100倍的血浆浓度下抵消直接因子Xa抑制剂的效应。在一些实施方案中，包含FXa变体的组合物在计划的手术前、在损伤后、或者在用直接FXa抑制剂的有意或意外药物过量后施用。在一些实施方案中，在用FXa变体的第一个剂量后，使用止血测定监控对象中的止血，并且如果通过预定时间未获得足够的止血，则施用FXa变体的至少一次第二个剂量，以实现充分止血。根据一些实施方案，预定时间是施用FXa变体的第一个剂量后约15分钟、30分钟、45分钟或60分钟。其他时间也是可能的。在一些其他实施方案中，除FXa变体之外还施用至少第二种促凝血剂，包括例如不同的FXa变体、因子IX、因子XIa、因子XIIa、因子VIII、因子VIIa、FEIBA或凝血酶原复合物浓缩剂(PCC)。 附图说明 [0011] 图1A-B显示了利伐沙班对游离wt-FXa或FXaI16L的抑制。A)wt-FXa(2nM)或B)I16L FXa (6nM)对肽基底物(SpecXa；200uM)水解的初速度在增加浓度的利伐沙班下进行测 定。Ki值在每个图上给出。 [0012] 图2A-B显示了在凝血酶原酶中装配的wt-FXa或FXaI16L的利伐沙班抑制。16L 在PCPS(20uM)和FVa(40nM)的存在下，A)wt-FXa(2nM)或B)FXaI (6nM)对肽基底物 (SpecXa；200uM)水解的初速度在增加浓度的利伐沙班下进行测定。 [0013] 图3显示了不同浓度的FXaI16L对逆转利伐沙班的凝血酶生成效应的作用。 [0014] 图4A-D显示了FXaI16L对逆转利伐沙班的效应的作用。在增加浓度的FXaI16L的存在和不存在下，正常人血浆与500nM利伐沙班一起温育。在数据分析后，标绘生成的峰凝血酶(A和C)和总凝血酶(ETP；B和D)。 [0015] 图5A-B显示了FXaI16L逆转高剂量利伐沙班的效应。在增加浓度的FXaI16L的存在和不存在下，正常人血浆与7.5uM利伐沙班一起温育。在数据分析后，标绘生成的峰凝血酶(A)和总凝血酶(ETP；B)。 [0016] 图6A-B显示了FXaI16L或FXaI16T逆转250nM阿哌沙班的效应。在增加浓度的FXaI16LI16T或FXa 的存在和不存在下，正常人血浆与250nM阿哌沙班一起温育。在数据分析后，标绘生成的峰凝血酶(A)和总凝血酶(ETP；B)。 [0017] 图7A-B显示了FXaI16L或FXaI16T逆转高剂量阿哌沙班的效应。在增加浓度的FXaI16LI16T或FXa 的存在和不存在下，正常人血浆与2.0uM阿哌沙班一起温育。在数据分析后，标绘生成的峰凝血酶(A)和总凝血酶(ETP；B)。 [0019] 图9A-B显示了FXaI16L校正在阿哌沙班的存在下的全血凝固。全血血栓弹力图用I16L于评价FXa 逆转典型(A)和高(B)剂量阿哌沙班效应的能力。 [0020] 图10A-B显示了FXaI16L在凝血酶生成测定中抵消利伐沙班。图10A显示了利伐沙I16L班的剂量应答，并且图10B显示了在利伐沙班的存在下，FXa 的剂量应答。 [0021] 图11显示了FXaI16L在小鼠尾部修剪出血模型中抵消利伐沙班。 [0022] 图12证实了施用于小鼠的利伐沙班延迟使用ROTEM测量的全血的凝固时间，并且I16L用FXa 的施用剂量应答性抵消利伐沙班的效应。 [0023] 图13显示了施用于小鼠的利伐沙班阻止在通过激光引起的提睾肌中的血管损伤I16L部位处的血块形成，并且FXa 的施用抵消利伐沙班的效应。使用活体显微镜检查以及针对纤维蛋白和血小板的荧光标记的抗体，显现血块形成。图13A显示了在未经处理的小鼠中的血块形成。图13B显示了利伐沙班延迟且降低血小板累积且阻止纤维蛋白沉积。相比I16L 之下，图13C显示了在施用利伐沙班和FXa 的小鼠中，在损伤部位处发生血块形成。 [0024] 图14是野生型人因子X前蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。信号肽对应于氨基酸1-23。前肽对应于氨基酸24-40。活化因子X(FXa)的成熟轻链对应于氨基酸41-179。活化FXa的成熟重链(在活化肽去除后)对应于氨基酸235-488。活化肽(AP)对应于氨基 酸183-234。 [0025] 图15是编码野生型人因子X前蛋白的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)。编码序列对应于核苷酸58-1524。 具体实施方式[0026] 本公开提供了用于抵消有此需要的对象中的直接FXa抑制剂的抗凝效应的组合物和方法。申请人已发现某些FXa变体以剂量依赖性方式快速且完全抵消直接FXa抑制剂的效应。更具体而言，申请人已发现在以治疗浓度且甚至是超治疗浓度的FXa抑制剂的存在下，相对少量的FXa变体在体内恢复正常凝血活性。通过提供快速和有效的直接FXa抑制剂的抗凝效应的解毒药，申请人的公开因此促成实现这些有利的抗凝血药的承诺。 [0027] 凝血因子X(FX)是酶原，其在通过固有因子IX/因子VIII或外源途径(组织因子/因子VIIa)活化后，变成FXa，其为凝血酶原酶的蛋白酶部分。在Arg-Ile易断裂键的蛋白酶解切割后，释放活化肽(AP)，酶原中一系列充分确定的结构变化驱动至成熟活性丝氨酸蛋白酶的活化过程(参见Toso等人，(2008)J.Biol.Chem.283，18627-18635；Bunce等人，(2011)Blood 117，290-298；和Ivanciu等人，(2011)Nat.Biotechnol.29，1028-1033，整体援引加入本文)。成熟FXa具有轻链和含有催化结构域的重链。成熟FXa在凝血酶原酶复合物形成(其包括活化辅因子，因子Va(FVa)的结合)后变成活性丝氨酸蛋白酶。 [0028] 已开发了多种形式的FX，其在活化切割后获得酶原样FXa变体。即，一旦被切割，所得到的FXa变体就具有弱活性位点功能，并且对通过循环抑制剂(即抗凝血酶III和TFPI)的失活更有抵抗力。FXa变体因此在血浆中具有比野生型FXa更长的半衰期。FXa变体结合FVa、脂质膜和钙，以形成完全活性的凝血酶原酶复合物，其有效活化凝血酶原。 [0029] 酶原样FXa变体以酶原样构象循环，并且看起来不是血栓形成的(参见Toso等人，(2008)J.Biol.Chem.283，18627-18635和Ivanciu等人，(2011)Nat.Biotechnol.29， 1028-1033，整体援引加入本文)。此类FXa变体的例子在国际专利公开WO2007/059513中得到描述，所述国际专利公开整体援引加入本文。 [0030] 凝血酶是胰蛋白酶样酶，其属于具有胰凝乳蛋白酶样折叠的蛋白酶的S1肽酶家族。凝血蛋白酶含有催化结构域，其与彼此及消化的祖先丝氨酸蛋白酶是高度同源的。结构同源性/相同性如此之大(>70％)，使得凝血酶(包括因子Xa)的催化结构域中的残基根据胰凝乳蛋白酶原中的相应残基进行编号。(胰凝乳蛋白酶编号系统；参见Bajaj和Birktoft，Methods Enzymol.1993；222:96-128，表2，以及Bode W，Mayr I，Bauman Y等人The refined 1.9 crystal structure of human alpha-thrombin:interaction with D-Phe-Pro-Arg chloromethylketone and significance of the Tyr-Pro-Trp insertion segment.EMBO J 1989；8(11):3467-3475，所述两个参考文献均整体援引加入本文)。相应地，氨基酸在本文中可以根据胰凝乳蛋白酶编号系统提及，所述胰凝乳蛋白酶编号系统是本领域技术人员众所周知的。 [0031] 根据本公开，FXa变体可以是包含氨基酸取代的FXa蛋白质，在体内或在体外与野生型FXa蛋白质相比较，所述氨基酸取代使得变体更酶原样。本公开的FXa变体在凝血酶原酶形成后基本上恢复野生型FXa活性。可用于本公开的方法中的FXa变体的例子是包含选自下述的修饰的变体：根据胰凝乳蛋白酶编号系统，a)在位置16处的Ile是Thr、Leu、Phe、Asp或Gly，以及b)在位置17处的Val是Leu、Ala或Gly。胰凝乳蛋白酶编号系统中的氨基酸16和17分别在SEQ ID NO:1(人因子X前蛋白)的氨基酸235和236处存在。在I16L I16T 某些实施方案中，FXa变体是FXa 和FXa (本文使用的用于FXa变体的命名法叙述在根 据胰凝乳蛋白酶编号系统的编号位置处的原始氨基酸，随后为取代氨基酸)。FXa变体可以是任何哺乳动物FXa的变体。然而，特别感兴趣的是人FXa的FXa变体。 [0032] 在某些实施方案中，活化成本公开的变体FXa的FX变体可以通过插入非天然细胞内蛋白酶解切割位点进一步修饰。在非限制性例子中，为了在哺乳动物细胞中表达“活化的”酶原样FXa变体，非天然细胞内蛋白酶解切割位点可以插入在变体FX酶原的SEQ ID NO:1的位置234(胰凝乳蛋白酶编号系统中的位置15)处的Arg和在对应于SEQ ID NO:1的位置235(胰凝乳蛋白酶编号系统中的位置16)的位置处的氨基酸之间。在某些实施方案中，非天然细胞内蛋白酶切割位点是Arg-Lys-Arg或Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg(SEQ ID NO:3)。这些切割位点由细胞内的蛋白酶(PACE/弗林蛋白酶样酶)有效识别且被去除。该切割可以导致经加工的变体FXa，其中分子的成熟重链现在在对应于SEQ ID NO:1的位置 235(胰凝乳蛋白酶编号系统中的位置16)的位置处的氨基酸处开始。在所述位置处的该切割位点的引入允许FX至FXa的细胞内转换。 [0033] 在某些实施方案中，FX变体活化肽(AP)的整个氨基酸序列(即SEQ ID NO:1的氨基酸183-234)替换为非天然细胞内蛋白酶切割位点。根据某些实施方案，非天然细胞内蛋白酶切割位点是Arg-Lys-Arg或Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg(SEQ ID NO:3)。如上所述，该修饰允许由细胞表达的FX变体的细胞内切割。细胞内切割将FX变体转换为活化的酶原样FXa变体，其随后被细胞分泌用于后续纯化。这种方法避免细胞外切割的需要，否则例如在分离蛋白质后或仅在血液凝固前活化变体凝血因子需要所述细胞外切割。 [0034] 在某些实施方案中，本公开的FXa变体衍生自包含天然野生型人信号序列和/或前肽序列的FX变体前蛋白。在其他实施方案中，来自非人物种的FX信号序列和/或前肽可以用于代替相应的天然氨基酸序列。此外，在另外其他实施方案中，来自其他人或非人分泌蛋白质的信号序列和/或前肽序列可以用于代替相应的天然氨基酸序列。 [0035] 在示例性实施方案中，FXa变体包含SEQ ID NO:1的氨基酸41-179和氨基酸235-488，其中在位置235处的氨基酸(野生型序列中的异亮氨酸)由选自下述的不同氨 基酸取代：苏氨酸(Thr)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、天冬氨酸(Asp)或甘氨酸(Gly)。 这些取代可以分别使用命名法I235T、I235L、I235F、I235D和I235G进行书写，其中第一个字母是异亮氨酸的单字母代码，并且最后一个字母是取代到野生型序列内的氨基酸的单字母代码。因为SEQ ID NO:1的位置235等价于胰凝乳蛋白酶编号系统的位置16，所以相同取代可以书写为I16T、I16L、I16F、I16D和I16G。在一个实施方案中，FXa变体包含SEQ ID NO:1的氨基酸41-179和氨基酸235-488，其中在位置235处的氨基酸由Thr取代(即 I235T或I16T)。在一个实施方案中，FXa变体包含SEQ ID NO:1的氨基酸41-179和氨基酸 235-488，其中在位置235处的氨基酸由Leu取代(即I235L或I16L)。在一个实施方案中，FXa变体包含SEQ ID NO:1的氨基酸41-179和氨基酸235-488，其中在位置235处的氨基 酸由Phe取代(即I235F或I16F)。在一个实施方案中，FXa变体包含SEQ ID NO:1的氨基 酸41-179和氨基酸235-488，其中在位置235处的氨基酸由Asp取代(即I235D或I16D)。 在一个实施方案中，FXa变体包含SEQ ID NO:1的氨基酸41-179和氨基酸235-488，其中在位置235处的氨基酸由Gly取代(即I235G或I16G)。 [0036] 根据另一个示例性实施方案，FXa变体包含SEQ ID NO:1的氨基酸41-179和氨基酸235-488，其中在位置236处的氨基酸(野生型序列中的缬氨酸)由选自下述的不同 氨基酸取代：亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)或甘氨酸(Gly)。这些取代可以分别使用命名法V236L、V236A和V236G进行书写，其中第一个字母是缬氨酸的单字母代码，并且最后一个字母是取代到野生型序列内的氨基酸的单字母代码。因为SEQ ID NO:1的位置236等价于胰凝乳蛋白酶编号系统的位置17，所以相同取代可以书写为V17L、V17A和V17G。在一个实施方案中，FXa变体包含SEQ ID NO:1的氨基酸41-179和氨基酸235-488，其中在位置236处的氨基酸由Leu取代(即V236L或V17L)。在一个实施方案中，FXa变体包含SEQ ID NO:1 的氨基酸41-179和氨基酸235-488，其中在位置236处的氨基酸由Ala取代(即V236A或 V17A)。在一个实施方案中，FXa变体包含SEQ ID NO:1的氨基酸41-179和氨基酸235-488，其中在位置236处的氨基酸由Gly取代(即V236G或V17G)。 [0037] 在其他实施方案中，本公开的FXa变体包括前述段落中所述的那些具体变体，可以包括蛋白质的轻链和/或成熟重链的不同同种型(isoform)。FXa变体成熟重链的非限制性示例性同种型包括成熟重链的α和β版本。Jesty等人，J Biol Chem.1975Jun 25；250(12):4497-504，援引加入本文。本公开的组合物可以包括FXa变体蛋白质，在其中呈现α和β成熟重链同种型中一个或另一个或两者。 [0038] 根据另外其他实施方案，FXa变体蛋白质的同种型包括前述段落中所述的那些具体变体，可以包括这样的同种型，其中可变数目的氨基酸(例如1、2、3、4、5、6个或更多个氨基酸)从蛋白质的轻链和/或成熟重链的羧基末端缺失或添加。 [0039] 根据某些实施方案，本公开的FXa变体包括与SEQ ID NO:1中的野生型FXa的氨基酸序列相比较，具有某一最小程度的同源性或序列相同性的蛋白质。因此，例如，FXa变体包括含有轻链和成熟重链的蛋白质，其与SEQ ID NO:1中的野生型FXa轻链和成熟重链具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同源性或相同性，其中此类FXa变体还包括在对应于SEQ ID NO:1的位置235的氨基酸位置处由Thr、Leu、Phe、Asp或Gly的取代，或者在对应于SEQ ID NO:1的位置236的氨基酸位置处由Leu、Ala或Gly的取代，并且进一步地其中此类FXa变体是酶原的，直至并入凝血酶原酶复合物内。在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中，野生型FXa轻链序列对应于氨基酸41-179，并且野生型FXa成熟重链序列对应于氨基酸235-488。氨基酸序列同源性或相同性百分比可以使用软件容易地进行测定，所述软件例如在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)处可获得的Protein BLAST。 [0040] 根据其他非限制性实施方案，本公开的FXa变体还可以包括含有一种或多种翻译后修饰的FXa变体，所述翻译后修饰包括但不限于一个或多个O联或N联碳水化合物基团或者可变数目的γ羧基谷氨酸(Gla)残基。本公开的FXa变体可以进一步包括化学修饰的FXa变体蛋白质。在本公开的方法中有用的其他FXa变体也是可能的。 [0041] 如本文使用的，术语FXaI16x指活化的因子X的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中的位置235(对应于胰凝乳蛋白酶编号系统中的位置16)的氨基酸从野生型序列中的氨基酸(异亮氨酸)变成指定为“x”的不同氨基酸。在一些非限制性示例性实施方案中，氨基酸“x”可以是苏氨酸(Thr或T)、亮氨酸(Leu或L)、苯丙氨酸(Phe或F)、天冬氨酸(Asp或D)或甘氨酸(Gly或G)。 [0042] 如本文使用的，术语FXaV17y指活化的因子X的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中的位置236(对应于胰凝乳蛋白酶编号系统中的位置17)的氨基酸从野生型序列中的氨基酸(缬氨酸)变成指定为“y”的不同氨基酸。在一些非限制性示例性实施方案中，氨基酸“y”可以是亮氨酸(Leu或L)、丙氨酸(Ala或A)或甘氨酸(Gly或G)。 [0043] 术语FXaI16x和FXaV17y不受SEQ ID NO:1中所示的蛋白质序列限制。相反，这些术语另外包括本文描述的多种同种型和同源蛋白质，具有在胰凝乳蛋白酶编号系统中的位置16和7处的指定取代突变，所述蛋白质表现为酶原，直至掺入凝血酶原酶复合物内。 [0044] 本公开的FXa变体可以通过用于表达蛋白质的任何技术产生。 [0045] “分离的蛋白质”、“分离的多肽”或“分离的变体”是这样的蛋白质、多肽或变体，通过其起源或衍生来源，其(1)不与在其天然状态伴随它的天然结合的组分结合，(2)不含来自相同物种的其他蛋白质，(3)通过来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然界中不存在。因此，化学合成的或在不同于它天然源于其的细胞的细胞系统中合成的多肽将是与其天然结合组分“分离的”。通过使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术分离，蛋白质还可以致使基本上不含天然结合的组分。 [0046] 当样品的至少约60-75％显示出单一种类的多肽时，蛋白质或多肽是“基本上纯的”、“基本上同质的”或“基本上纯化的”。多肽或蛋白质可以是单体或多聚的。基本上纯的多肽或蛋白质通常包含约50％、60％、70％、80％或90％W/W的蛋白质样品，更通常约95％，并且可以是超过99％纯的。蛋白质纯度或同质性可以通过本领域众所周知的许多方法进行指示，所述方法例如蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后基于用本领域众所周知的染剂的凝胶染色来显现单一多肽条带。出于某些目的，更高的分辨率可以通过使用HPLC或本领域众所周知的用于纯化的其他方法来提供。 [0047] 本公开的方法可用于抵消直接FXa抑制剂。直接FXa抑制剂是与FXa直接结合且选择性结合FXa超过其他蛋白酶的抑制剂。直接FXa抑制剂是就凝血酶原而言的FXa的非竞争性抑制剂。它们结合底物结合裂缝且就小肽底物而言竞争性抑制FXa，所述小肽底物也结合该区域。它们以高皮摩尔亲和力抑制FXa且在血浆中是高度蛋白质结合的。直接FXa抑制剂的例子是利伐沙班、阿哌沙班、贝曲西班、达瑞沙班、依度沙班和奥米沙班。在某些实施方案中，直接FXa抑制剂选自利伐沙班和阿哌沙班。 [0048] 根据本公开，FXa变体可以用于抵消直接FXa抑制剂，其结合FXa或结合已形成凝血酶原酶的FXa。直接FXa抑制剂可以需要或不需要FXa的辅因子用于抑制。根据本公开I16L I16T的方法，将FXa变体例如FXa 和FXa 施用于其血液含有直接FXa抑制剂的对象。 [0049] 本公开涵盖FXa变体抵消直接FXa抑制剂的用途，包括但不限于合成抑制剂、小分子抑制剂、经口可用抑制剂或可逆抑制剂。FXa抑制剂可以是这些特点的任何组合，例如经口可用、合成、可逆的小分子抑制剂。在某些实施方案中，直接FXa抑制剂可以选自利伐沙班、阿哌沙班、贝曲西班、达瑞沙班、依度沙班和奥米沙班(参见Perzborn等人，Nat Rev Drug Discov.2011Jan；10(1):61-75；Turpie，Arterioscler Thromb Vasc Biol.2007Jun；27(6):1238-47；Pinto等人，Expert Opin.Ther.Patents 22:645-661(2012)；Pinto,等人，J.Med.Chem.50:5339-5356(2007)，所述参考文献各自援引加入本文)。在某些实施方案中，直接FXa抑制剂选自利伐沙班或阿哌沙班。 [0050] 在一些实施方案中，本公开的FXa变体可以施用于对象，以逆转直接FXa抑制剂的效应，其中此类抑制剂以治疗浓度存在。在其他实施方案中，本公开的FXa变体可以施用于对象，以逆转直接FXa抑制剂的效应，其中此类抑制剂以超治疗浓度存在。超治疗浓度是高于通常视为安全地实现特定对象或对象类别中的抗凝所需的浓度。直接FXa抑制剂的超治疗浓度可以起因于意外或有意药物过量。直接FXa抑制剂的超治疗浓度还可以起因于特定对象中出乎意料的效应，例如出乎意料地对这些药物的高敏感性，或出乎意料的缓慢清除速率，由于例如药物相互作用或其他因素。何种浓度为特定对象或对象类别中的直接FXa抑制剂的治疗浓度或超治疗浓度的测定在本领域普通技术人员的知识内。 [0051] 根据本公开，FXa变体用于抵消一种或多种直接FXa抑制剂，其选择性结合FXa超过其他胰蛋白酶样蛋白酶至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1,000倍、至少5,000倍或至少10,000倍。 [0052] 直接FXa抑制剂可以以约2x10-7M或更少的Ki结合FXa变体。“Ki”指特定抑制剂-靶相互作用的抑制剂常数，其是产生半数最大抑制所需的浓度。可以通过使用本领域已知的方法测定Ki。本公开因此考虑抵消直接FXa抑制剂，其以下述Ki结合不含凝血酶原-8 -8 -9 -9酶复合物的FXa变体：约2x10 M或更少、约1x10 M或更少、约9x10 M或更少、约8x10 M或-9 -9 -9 -9 -9 更少、约7x10 M或更少、约6x10 M或更少、约5x10 M或更少、约4x10 M或更少、约3x10 M-9 -9 -10 -10 或更少、约2x10 M或更少、约1x10 M或更少、约9x10 M或更少、约8x10 M或更少、约 -10 -10 -10 -10 -10 7x10 M或更少、约6x10 M或更少、约5x10 M或更少、约4x10 M或更少、约3x10 M或更 -10 -10 -11 -11 -11 少、约2x10 M或更少、约1x10 M或更少、约9x10 M或更少、约8x10 M或更少、约7x10 M-11 -11 -11 -11 或更少、约6x10 M或更少、约5x10 M或更少、约4x10 M或更少、约3x10 M或更少、约 -11 -11 -12 -12 -12 2x10 M或更少、约1x10 M或更少、约9x10 M或更少、约8x10 M或更少、约7x10 M或更 -12 -12 -12 -12 -12 少、约6x10 M或更少、约5x10 M或更少、约4x10 M或更少、约3x10 M或更少、约2x10 M-12 或更少、或约1x10 M或更少。根据本公开的方法待由FXa变体抵消的直接FXa抑制剂可以与野生型FXa结合，其Ki比它结合FXa变体小至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、或至少50倍。直接FXa抑制剂可以结合野生型FXa，其Ki比不含凝血酶原酶复合物的FXa变体的Ki小至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。直接FXa抑制剂可以结合包含野生型FXa的凝血酶原酶复合物，其Ki与它结合包含FXa变体的凝血酶原酶复合物大约相同。 [0053] 在一个方面，本公开提供了通过施用FXa变体抵消对象中的直接FXa抑制剂效应的方法，所述对象正在出血(内部或外部)或处于出血的危险中(例如在计划手术的过程中)。在一些实施方案中，直接FXa抑制剂可以以治疗浓度或更高浓度(即，超治疗浓度)存在于对象中。在一些实施方案中，治疗浓度可以是敏感个体中的药物过量。本公开的方法因此可用于提供对直接FXa抑制剂的药物过量的解毒药。在多个实施方案中，治疗对象可以是人或兽医对象。 [0054] 基于过度降低的凝血能力的症状或体征的存在，可以检测直接抑制剂药物过量。非限制性例子包括胃肠道出血的证据，包括黑柏油样便、血便和呕血。其他例子包括鼻出血，以及对来自微小切口和擦伤的瘀血或出血的趋势或严重性增加。 [0055] 在临床背景下，直接抑制剂药物过量可以直接地或通过下述进行检测：测量对象血液凝固的能力，且检测与预期抗凝程度的偏差。血液凝固潜力可以以本领域普通技术人员熟悉的方式进行测量。例如，当对象的凝血酶原时间过度延长时，可以怀疑药物过量。在某些实施方案中，当表示为国际标准化比率(INR)的凝血酶原时间测量为大于约1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、12、14、16、 18、20或更大时，证实药物过量。 [0056] 每当需要抵消直接FXa抑制剂的效应时，包括但不限于在计划手术前、导致外部或内部出血的损伤后或者直接FXa抑制剂药物过量后，可以施用FXa变体。根据本公开，当需要抵消效应时，例如在计划手术前、导致外部或内部出血的损伤后或者直接FXa抑制剂药物过量后，FXa变体可以施用至少约12小时、至少约6小时、至少约3小时、至少约2小时、至少约1小时、至少约30分钟、至少约10分钟、或至少约5分钟。 [0057] 根据另一个实施方案，本公开提供了施用FXa变体以实现患有急性大出血的对象中由于FXa抑制疗法的获得性凝血病的紧急逆转的方法。在一些实施方案中，对象是成人患者。在其他实施方案中，对象是儿科人患者。 [0058] 在一些实施方案中，急性大出血由创伤引起。在其他实施方案中，急性大出血在手术或其他类型的干预操作期间发生。示例性非限制性干预操作包括切口、引流、血管手术、阑尾切除术、疝切开术或疝修补术、腹部手术、胆囊切除术、环钻术(钻孔)、腰椎穿刺、心脏起搏器插入、髋部骨折手术及其他。在另外其他实施方案中，急性大出血可以是没有明显原因的自发性出血。 [0059] 无限制地，急性大出血的部位包括胃肠道出血、皮下或肌内出血、膀胱出血、关节积血、硬膜下血肿、鼻出血、腹膜出血、子宫出血及其他部位的出血。 [0060] 用本公开的FXa变体的有效治疗可以逆转直接FXa抑制剂的效应。此类效应通过FXa变体的成功逆转可以以多种方式进行测定，并且可以使用不同测定、方法或终末点进行测量或监控。 [0061] 在一些实施方案中，使用对来自用FXa变体治疗的对象的血液或血浆进行的测试或测定，监控用FXa变体治疗逆转直接FXa抑制剂的效应。血样可以在用FXa变体治疗后的预定时间取自对象。随后对由其制备的血液或血浆实施一种或多种测试，以测定某些止血药效学参数是否已正常化，尽管存在直接FXa抑制剂。如果发现正常化，则对象无需进一步用FXa变体治疗。然而，如果未发现正常化，则可能需要依照本公开的方法用FXa变体的进一步治疗，以逆转直接FXa抑制剂的效应。用于监控用FXa变体治疗的有效性的测试包括这样的测试，其直接或间接测量凝血的能力或者测量直接FXa抑制剂的活性。非限制性示例性测试包括凝血酶原时间或相关国际标准化比率、凝血酶原酶诱导的凝血时间测定、血栓弹力描记术(thromboelastometry)、血栓弹力图、生色抗FXa测定、凝血酶生成测定、凝血酶原片段1+2水平、凝血酶-抗凝血酶III复合物水平、活化部分凝血活酶时间和部分凝血活酶时间。其他测试在本领域普通技术人员的知识内也是可能的。 [0062] 根据一些实施方案，通过施用FXa变体逆转对象中的直接FXa抑制剂的效应降低对象中的出血。在一些实施方案中，与不存在用FXa变体治疗相比较，在直接FXa抑制剂的存在下，用FXa变体治疗使对象中的出血降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在其他实施方案中，用FXa变体治疗使对象中的出血降低约5％-10％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、 40％-45％、45％-50％、50％-55％、55％-60％、60％-65％、65％-70％、70％-75％、 75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％、或95％-100％。 [0063] 根据一些实施方案，通过施用FXa变体逆转对象中的直接FXa抑制剂的效应降低对象中的直接FXa抑制剂的活性。在一些实施方案中，与不存在用FXa变体治疗相比较，在直接FXa抑制剂的存在下，用FXa变体治疗使对象中的直接FXa抑制剂的活性降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在其他实施方案中，用FXa变体治疗使对象中的直接FXa抑制剂的活性降低约5％-10％、10％-15％、15％-20％、 20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％、45％-50％、50％-55％、 55％-60％、60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、 90％-95％、或95％-100％。 [0064] 使用生色抗FXa测定，例如Asmis等人，Thromb Res.，129:492-498(2012)，或Barrett等人，Thromb Haemost.104:1263-71(2010)中所述的那种(所述参考文献各自援引加入本文)，可以监控直接FXa抑制剂的活性。 [0065] 根据一些实施方案，通过施用FXa变体逆转对象中的直接FXa抑制剂的效应增加对象的血液或血浆中产生的凝血酶量。在一些实施方案中，与不存在FXa变体的情况相比较，在直接FXa抑制剂的存在下，用FXa变体治疗使对象中的凝血酶生产增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、至少50倍或更多。使用凝血酶生成测定(TGA)或本领域普通技术人员熟悉的其他技术，可以测定对象的血液或血浆中的凝血酶产生。 [0066] 根据一些实施方案，通过施用FXa变体逆转对象中的直接FXa抑制剂的效应增加对象的凝血。在一些实施方案中，与不存在FXa变体的情况相比较，在直接FXa抑制剂的存在下，用FXa变体治疗使对象中的凝血增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、至少50倍或更多。 [0067] 根据一些实施方案，通过施用FXa变体逆转对象中的直接FXa抑制剂的效应降低对象中的凝血时间。在一些实施方案中，与不存在用FXa变体治疗相比较，在直接FXa抑制剂的存在下，用FXa变体治疗使对象中的凝血时间降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在其他实施方案中，用FXa变体治疗使对象中的凝血时间降低约5％-10％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、 35％-40％、40％-45％、45％-50％、50％-55％、55％-60％、60％-65％、65％-70％、 70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％、或95％-100％。 [0068] 根据一些实施方案，凝血时间通过测量对象的凝血酶原时间(PT)进行测定，所述凝血酶原时间随着止血恢复而减少。PT是在添加组织因子后血清凝固花费的时间量。PT因此测量外源凝血系统支持凝血的能力。PT可以取决于实验室用于运行测试的特定试剂，但正常PT为约11至13秒。凝血时间还可以使用国际标准化比率(INR)进行表示，所述国际标准化比率消除在凝血时间测量中的实验室间可变性。使用INR，0.8至1.1的比率指示正常凝血。在FXa变体施用于需要逆转直接FXa抑制剂的效应的对象后，PT或INR可以在预定时间进行测定。 [0069] 在一些实施方案中，用FXa变体治疗以逆转直接FXa抑制剂的效应使对象的PT降低约25秒、24秒、23秒、22秒、21秒、20秒、19秒、18秒、17秒、16秒、15秒、14秒、13秒、12秒、11秒、10秒或更少。在其他实施方案中，用FXa变体治疗使对象的INR降低至约4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1、3.0、2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1、 2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7或更少。根据其他实施方案，用FXa变体治疗使对象中的PT或INR降低约5％-10％、10％-15％、15％-20％、 20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％、45％-50％、50％-55％、 55％-60％、60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、 90％-95％、或95％-100％。 [0070] 凝血酶原时间可以在FXa变体施用后的预定时间进行测量。因此，在一些非限制性实施方案中，PT在FXa施用后15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、45分钟、50分钟、60分钟或更久进行测量。其他时间根据本领域普通技术人员的知识也是可能的。 [0071] 凝血时间还可以使用一步凝血酶原酶诱导的凝血时间(PiCT)测定进行测量， 如 Graff 等 人，Monitoring effects of direct FXa-inhibitors with a new one-step prothrombinase-induced clotting time(PiCT)assay:comparative in vitro investigation with heparin，enoxaparin，fondaparinux and DX 9065a， Int J Clin Pharmacol Ther.，45:237-43(2007) 和 Harder 等 人，Monitoring direct FXa-inhibitors and fondaparinux by prothrombinase-induced Clotting Time(PiCT):relation to FXa-activity and influence of assay modifications，Thromb Res.,123:396-403(2008)中所述，所述参考文献各自援引加入本文。 [0072] 在另外其他实施方案中，血栓弹力描记术或血栓弹力图方法可以用于分析血块形成或凝血时间。 [0073] 根据一些实施方案，通过施用FXa变体逆转对象中的直接FXa抑制剂的效应增加对象的血液或血浆中的凝血酶原片段1□+□2(PF1□+□2)水平。在一些实施方案中，与不存在FXa变体的情况相比较，在直接FXa抑制剂的存在下，用FXa变体治疗使对象中的PF1□+□2增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、 1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、至少50倍或更多。 [0074] 根据一些实施方案，通过施用FXa变体逆转对象中的直接FXa抑制剂的效应增加对象的血液或血浆中的凝血酶-抗凝血酶III复合物(TAT)水平。在一些实施方案中，与不存在FXa变体的情况相比较，在直接FXa抑制剂的存在下，用FXa变体治疗使对象中的TAT增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、至少50倍或更多。 [0075] 根据一些实施方案，通过施用FXa变体逆转对象中的直接FXa抑制剂的效应降低对象中的活化部分凝血活酶时间(aPTT)。在一些实施方案中，与不存在用FXa变体治疗相比较，在直接FXa抑制剂的存在下，用FXa变体治疗使对象中的活化部分凝血活酶时间(aPTT)降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在其他实施方案中，用FXa变体治疗使对象中的aPTT降低约5％-10％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％、45％-50％、50％-55％、 55％-60％、60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、 90％-95％、或95％-100％。 [0076] 根据一些实施方案，通过施用FXa变体逆转对象中的直接FXa抑制剂的效应降低对象中的部分凝血活酶时间(PTT)。在一些实施方案中，与不存在用FXa变体治疗相比较，在直接FXa抑制剂的存在下，用FXa变体治疗使对象中的部分凝血活酶时间(PTT)降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在其他实施方案中，用FXa变体治疗使对象中的PTT降低约5％-10％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％、45％-50％、50％-55％、55％-60％、 60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％、或 95％-100％。 [0077] 在其他实施方案中，临床终末点可以依赖测定止血在用FXa变体治疗以逆转直接FXa抑制剂效应的对象中是否已充分恢复。例如，当对象呈现急性出血时，当在用FXa变体治疗后发生现有出血的及时停止时，临床止血功效可以评分为“极佳的”；当出血停止存在1-2小时延迟时，评分为“良好的”；当出血停止存在>2小时延迟时，评分为“有问题的”；并且当不存在对出血的作用时，评分为“无”。当用FXa变体的治疗测定为小于良好时，则可以施用另外剂量的FXa变体，以实现足够的止血。在进一步例子中，当对象经历干预操作时，当在操作期间获得正常止血时，临床止血功效可以评分为“极佳的”；当如通过失血的数量或质量(例如轻微渗出)判断的，操作内止血轻度异常时，评分为“良好的”；当如通过失血的数量或质量(例如可控制的出血)判断的，操作内止血中度异常时，评分为“有问题的”； 并且当如通过失血的数量或质量(例如严重难治性出血)判断的，操作内止血重度异常时，评分为“无”。 [0078] 直接FXa抑制剂的治疗有效剂量依赖医学领域熟练从业者众所周知的众多因素。利伐沙班的典型治疗血浆浓度为约500nM。然而，根据本公开，可以施用FXa变体以抵消更低或更高浓度的抑制剂。在待用FXa变体治疗的对象中的利伐沙班的血浆浓度可以低于或高于典型治疗浓度，例如约100nM、约200nM、约300nM、约400nM、约500nM、约600nM、约 700nM、约800nM、约900nM或约1,000nM。 [0079] 阿哌沙班的典型治疗血浆浓度为约250nM。在某些实施方案中，FXa变体施用于具有下述血浆浓度的阿哌沙班的对象：约100nM、约200nM、约300nM、约400nM、约500nM、约600nM、约700nM、约800nM、约900nM或约1,000nM。 [0080] 同样地，根据本公开，在药物过量的情况下，例如当抑制剂的血浆浓度比典型治疗血浆浓度高至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％、或至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、或至少50倍时，FXa变体可以用于抵消直接FXa抑制剂。 [0081] 在比直接FXa抑制剂的血浆浓度低的血浆浓度下，FXa变体令人惊讶地有效抵消直接FXa抑制剂。根据本公开，FXa变体在下述变体与抑制剂的血浆浓度比下抵消直接FXa抑制剂的效应：约1-10、约1-25、约1-50、约1-100、约1-250、约1-500、约1-1,000、约 1-2,500、约1-5,000或约1-10,000。在某些实施方案中，在比直接FXa抑制剂的血浆浓度低至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少250倍、至少500倍、至少1,000倍、至少2,500倍、至少5,000倍、或至少10,000倍的血浆浓度下，FXa变体抵消直接FXa抑制剂的效应。 [0082] 在其他实施方案中，通过将直接抑制剂的血浆浓度乘以范围为约0.1x10-4至-4 -4 -4 -4 -4 约1000x10 、约4x10 至约40x10 、约20x10 至约200x10 、或其他范围的换算因子， 来计算足以逆转直接FXa抑制剂效应的FXa变体的血浆浓度。在另外其他实施方案中， -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 换算因子可以为约0.1x10 、0.5x10 、1x10 、2x10 、3x10 、4x10 、5x10 、6x10 、7x10 、-4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 8x10 、9x10 、10x10 、11x10 、12x10 、13x10 、14x10 、15x10 、16x10 、17x10 、18x10 、-4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 19x10 、20x10 、21x10 、22x10 、23x10 、24x10 、25x10 、26x10 、27x10 、28x10 、-4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 29x10 、30x10 、31x10 、32x10 、33x10 、34x10 、35x10 、36x10 、37x10 、38x10 、-4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 39x10 、40x10 、45x10 、50x10 、55x10 、60x10 、65x10 、70x10 、75x10 、80x10 、-4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 85x10 、90x10 、95x10 、100x10 、110x10 、120x10 、130x10 、140x10 、150x10 、-4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 160x10 、170x10 、180x10 、190x10 、200x10 、250x10 、300x10 、350x10 、400x10 、-4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 450x10 、500x10 、550x10 、600x10 、650x10 、700x10 、750x10 、800x10 、850x10 、-4 -4 -4 900x10 、950x10 、或1000x10 ，以及这些数目之间的范围。根据技术人员的知识，例如通过放射性免疫测定(RIA)或其他方法，可以测量FXa直接抑制剂的血浆浓度。 [0083] 实现足以逆转直接FXa抑制剂的药物过量的FXa变体的靶血浆浓度在本领域普通技术人员的知识内。在非限制性例子中，有关药物代谢动力学参数，例如对象血浆容量或其他参数的估计量，可以基于对象性别、高度和重量或其他因素进行制备，并且用于计算需要施用多少FXa变体以实现靶浓度。在施用FXa变体后，血浆浓度可以根据本领域普通技术人员的知识进行监控，并且该信息用于维持任何所需范围内的浓度。 [0084] 本公开的组合物和方法包括“治疗有效量”或“预防有效量”的FXa变体。“治疗有效量”指在所需剂量和时间段下有效实现所需治疗结果的量。FXa变体的治疗有效量可以根据诸如下述因素而改变：疾病状态，个体的年龄、性别和重量，以及FXa变体在个体中引发所需应答的能力。治疗有效量也是其中FXa变体的任何毒性或有害效应由治疗有利效应超过的量。“预防有效量”指在所需剂量和时间段下有效实现所需预防结果的量。例如，剂量可以在计划手术前给予。 [0085] 剂量方案可以进行调整，以提供最佳所需应答(例如治疗或预防应答)。例如，可以施用单次推注，可以在一段时间内施用几个分份剂量，或剂量可以如通过治疗情况的紧迫指示的按比例降低或增加。尤其有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物，以易于施用和剂量一致性。如本文使用的剂量单位形式指物理上不连续的单位，适合作为用于待治疗的哺乳动物对象的单位剂量；每个单位含有计算为与所需药学载体结合产生所需疗效的活性化合物的预定数量。本公开的剂量单位形式的规格通过下述指出且直接取决于下述：(a)FXa变体的独特特征和待实现的特定治疗或预防效应，和(b)在用于个体治疗的此类FXa变体的配制领域中固有的局限性。 [0086] 在某些实施方案中，所施用的FXa变体的治疗或预防有效量为约0.0001-50mg/kg、约0.001-50mg/kg、约0.001-5mg/kg、约0.001-0.5mg/kg、约0.001-0.05mg/kg、约0.01-5mg/kg或约0.01-0.5mg/kg。 [0087] 在某些实施方案中，本公开的FXa变体的治疗或预防有效血清浓度为约0.0003-300nM、约 0.003-300nM、约0.03-300nM、约 0.003-30nM、约0.03-30nM 或 约 0.3-3nM。例如在血液或血浆中的FXa变体浓度可以通过本领域已知的任何方法进行测量。 [0088] 应当指出剂量值可以随FXa抑制剂浓度而改变。应进一步理解对于任何特定对象，根据个体需要和施用或监督组合物施用的个人的专业判断，具体剂量方案应在一段时间内进行调整，并且本文所述的剂量方案仅是示例性的，并且不预期限制要求保护的组合物的范围或实践。 [0089] 本公开的另一个方面提供了包含FXa变体或包含此类FXa变体的组合物的试剂盒。除FXa变体或组合物之外，试剂盒还可以包括诊断试剂或另外的治疗试剂。试剂盒还可以包括治疗方法的使用说明书，以及包装材料例如但不限于冰、干冰、泡沫聚苯乙烯、泡沫、塑料、玻璃纸、收缩包装、气泡包装、卡纸板和淀粉花生。在一个实施方案中，试剂盒包括FXa变体或包含其和一种或多种治疗试剂的组合物，所述治疗试剂可以用于本文描述的方法中。 [0090] FXa变体可以例如在包含其的组合物中一次或多次施用于对象，直至恢复足够的止血或者一种或多种直接FXa抑制剂不再有效。当使用多重施用时，它们可以每小时、每天或以任何其他适当间隔包括例如多重日剂量进行施用。多重剂量可以在时间表上施用，例如每10分钟、每15分钟、每20分钟、每30分钟、每小时、每两小时、每三小时、每四小时、每天三次、每天两次、每天一次、每两天一次、每三天一次和每周一次。FXa变体可以例如经由微型泵连续施用。FXa变体可以例如经由肠胃外途径(例如静脉内、皮下、腹膜内或肌内)施用。FXa变体一般作为如下所述的药物组合物的一部分进行施用。 [0091] 在另一个实施方案中，FXa变体可以与另一种促凝血剂共施用，所述另一种促凝血剂包括另一种FXa变体、因子IX、因子XIa、因子XIIa、因子VIII、因子VIIa、FEIBA和凝血酶原复合物浓缩剂(PCC)。 [0092] 本公开的FXa变体与另外的治疗试剂的共施用(组合疗法)涵盖施用包含FXa变体的药物组合物和另外的治疗试剂，以及施用两种或更多种分开的药物组合物，一种即包含FXa变体并且另一种或多种包含一种或多种另外的治疗试剂。共施用或组合疗法进一步包括同时或顺次或两者施用FXa变体和一种或多种另外的治疗试剂。例如，FXa变体可以每三天施用一次，而另外的治疗试剂每天施用一次，与FXa变体相同或不同时间。FXa变体可以在用另外的治疗试剂治疗前或后进行施用。类似地，本公开的FXa变体的施用可以是治疗方案的一部分，所述治疗方案包括其他治疗模式包括手术。可以施用组合疗法以预防状况的复发。组合疗法可以从每小时多次施用到每周多次。施用可以在时间表上施用，例如每10分钟、每15分钟、每20分钟、每30分钟、每小时、每两小时、每三小时、每四小时、每天三次、每天两次、每天一次、每两天一次、每三天一次、每周一次，或可以例如经由微型泵连续施用。组合疗法可以例如经由肠胃外途径(例如静脉内、皮下、腹膜内或肌内)施用。 [0093] 在进一步方面，本公开提供了包含FXa变体的组合物用于抵消对象中的直接FXa抑制剂。组合物可以包含药学可接受的载体、媒介物或生理学相容的其他成分。此类载体、媒介物及其他成分的非限制性例子包括溶剂(例如水、乙醇、盐水、磷酸盐缓冲盐水)、去污剂、表面活性剂、分散介质、包衣、抗菌剂或抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂、糖(例如蔗糖、右旋糖、乳糖)、多元醇(例如甘油、甘露醇、山梨糖醇)、盐(例如氯化钠、氯化钾)、湿润剂、乳化剂、防腐剂、缓冲剂以及能够增强FXa变体的稳定性或有效性的试剂。 [0094] 用于根据本公开使用的组合物可以采取施用于对象的任何合适形式，例如液体溶液(例如可注射和可输注溶液)。组合物可以例如在小瓶或预填充注射器中，以准备施用于对象的预混合形式提供。此类形式不需要在施用前用稀释剂重构。可替代地，组合物可以以需要在施用前用稀释剂(例如无菌水或盐水)重构的冻干形式提供。如果是后者，则稀释剂可以在分开容器中与冻干产物一起提供。根据本领域普通技术人员的知识，组合物可以配制用于在冷藏或室温下贮存。组合物的形式至少部分取决于预期施用模式。在某些实施方案中，施用模式是肠胃外的，包括例如静脉内、皮下、腹膜内或肌内施用。 [0095] 治疗组合物通常在制造和贮存条件下必须是无菌且稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳剂、分散体、在脂质体中或其他适合高药物浓度的有序结构。无菌可注射溶液可以通过下述进行制备：根据需要，掺入在适当溶剂中以所需量的FXa变体与上文列举的成分之一或组合，随后为无菌过滤。一般地，分散体通过将活性化合物掺入无菌媒介物内进行制备，所述无菌媒介物含有基本分散介质以及来自上文列举那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其获得来自其先前无菌过滤溶液的活性成分加上任何另外所需成分的粉末。溶液的适当流动性可以通过下述得到维持：例如通过使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需粒子大小和通过使用表面活性剂。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂来实现，所述试剂例如单硬脂酸盐和明胶。 [0096] 本公开进一步考虑本文的组合物中的任一种均可施用于用直接FXa抑制剂治疗的对象。 [0097] 应当理解本文描述的例子和实施方案仅用于举例说明性目的，并且根据其的多种修饰或变化对于本领域技术人员将是显而易见的，并且应包括在本发明的真正范围内，并且可以无需背离本发明的真正范围而作出。 [0098] 实施例 [0099] 实施例1-FXaI16L针对利伐沙班的敏感性 [0100] 为了测试FXaI16L针对利伐沙班的敏感性，建立抑制测定。利伐沙班是野生型FXaI16L的有效抑制剂，显示出0.582nM的抑制常数(Ki)(图1A)。由于FXa 的酶原样性质，利伐沙班以降低～15倍的亲和力与该变体结合(Ki＝9.3nM)(图1B)。相比之下，当变体在凝血酶原酶复合物(即，在添加FVa和磷脂囊泡后)中装配时，利伐沙班的Ki几乎恢复至与I16L 野生型酶(wt FXa，Ki＝2.67nM(图2A)；FXa ，Ki＝3.4nM(图2B)可比较的值。 [0101] 实施例2-FXa变体抵消利伐沙班和阿哌沙班 [0102] 凝血酶生成测定(TGA)用于评价酶原样FXa变体是否可以在更生理学的环境中逆转直接FXa抑制剂的效应。TGA测量在凝血起始后的一段时间内在血浆中的凝血酶产生，并且如先前所述(参见Bunce等人，(2011)Blood 117，290-298，整体援引加入本文)进行。在500nM利伐沙班的存在或不存在下，正常人血浆中的凝血酶生成在37℃下测量90分钟。 I16L I16L 为了评估FXa 是否可以逆转利伐沙班的效应，将渐增量的FXa 加入含有500nM利伐沙 班的血浆中。凝血酶生成用2.0pM组织因子/4uM磷脂以及CaCl2和凝血酶荧光底物起始。 [0103] 数据证实与不存在利伐沙班的血浆相比较，在500nM利伐沙班的存在下，血浆的I16L凝血酶生成谱基本上降低。相比之下，从0.03到1nM的渐增浓度的FXa 恢复凝血酶生成I16L (图3)。这些数据显示在纳摩尔和亚纳摩尔范围内的出乎意料低浓度的FXa 可以逆转抑I16L 制剂的效应。在500nM利伐沙班(典型的治疗血浆浓度)的存在下，FXa 的剂量应答分 I16L 析显示在这些条件下在1-3nM FXa 之间，凝血酶生成的峰高(图4A和C)和产生的总凝 血酶(ETP)(图4B和D)基本上达到最大值，并且完全恢复至正常水平。进一步实验显示即I16L 使在高浓度利伐沙班(7.5μM；超治疗的)的存在下，FXa 在相对低剂量(≤3.0nM)下 在恢复生成的峰凝血酶(图5A)以及总凝血酶(图5B)方面仍是非常有效的。 [0104] 还进行相似实验，以评估FXa酶原样变体是否可以逆转另一种直接FXa抑制剂阿I16L I16T哌沙班的效应。在这些实验中，还比较FXa 与另一种酶原样FXa变体FXa 的有效性。 I16T I16L I16L FXa 类似于FXa ，然而，当在凝血酶原酶复合物中装配时，与FXa 相比较，它具有固有更低的活性，具有更长的血浆半衰期，并且具有降低～3-5倍的活性。与利伐沙班数据一I16L 致，在250nM阿哌沙班(典型的治疗血浆浓度)的存在下，FXa 可以以剂量依赖性方式恢I16L 复生成的峰凝血酶(图6A)和总凝血酶(图6B)，其看起来在1-3nM FXa 之间达到最大 I16T 值。FXa 也有效逆转阿哌沙班的效应；然而，看起来需要更高浓度的该变体，以完全恢复凝血酶生成(图6)。即使在高浓度阿哌沙班(2μM)的存在下，两种变体仍是有效的。然而，在这些条件下，看起来需要更高浓度的两种变体，以完全恢复凝血酶生成(图7A和B)。 [0105] 实施例3-FXaI16L抵消全血中的利伐沙班和阿哌沙班 [0106] 全血血栓弹力描记术用于评价FXaI16L变体逆转直接FXa抑制剂在全血中的效应的能力。在这种系统中，从健康志愿者中抽取血液。弃去前2mL血液，并且将以后5mL血液收集到真空采血管(BD，Franklin Lakes，NJ)内。玉米胰蛋白酶抑制剂和柠檬酸钠在血样收集前存在于收集管中，以实现血液中0.105M柠檬酸盐和25μg/mL玉米胰蛋白酶抑制剂(Haematologic Technologies，Burlington，VT)的最终浓度。对于每个供体分析两组反应。初始反应在血液收集后5分钟起始。第二个反应在第一个反应起始后1小时起始(收集后 1小时5分钟)。 [0107] 使用Thromboelastometry delta(Tem International GmbH，Munich，德国)分析血液。对于反应：(1)将6μL媒介物、蛋白质和/或抑制剂加入空杯中，将 (2)20μl 0.2M CaCl2(最终浓度11.6mM)，和(3)20μl Innovin(反应中的最终浓度 1:10,000；组织因子来源)加入杯中。将如上所述收集的全血加入反应中(300μL)，并且允许记录进行大约30-60分钟。使用制造商的软件(Rotem Gamma Software版本1.1.1)分 析收集的数据。 I16L [0108] 使用旋转血栓弹力描记术(ROTEM)，检查在利伐沙班或阿哌沙班的存在下，FXa加速全血血块形成的能力。单独的且以两种不同浓度的两种直接FXa抑制剂对全血血块形成具有重大作用：在低剂量(治疗浓度)下，全血血块形成被部分消除(图8A和图9A)，而在高剂量(超治疗浓度)下，全血血块形成几乎完全被消除(图8B和图9B)。利伐沙班或I16L 阿哌沙班对全血血块形成的作用可以被FXa 逆转。在500nM利伐沙班或250nM阿哌沙 I16L 班，0.3nM FXa 可以完全或几乎完全恢复全血凝固(图8A和图9A)。当使用更高浓度的 I16L I16L 直接FXa抑制剂时(～2uM)，0.3nM FXa 部分恢复全血凝固，并且3nM FXa 完全恢复 全血凝固(图8B和图9B)。这些数据证实在治疗和超治疗浓度的抑制剂下，在基于血浆和全血的凝血测定中，FXa酶原样变体可以有效逆转利伐沙班或阿哌沙班的抗凝效应。 I16L [0109] 当两种试剂均体内施用时，通过测试FXa 是否可以抵消利伐沙班的抗凝效应，这些研究的结果得到证实和扩展。在这些实验中，C57BL/6小鼠经由尾静脉输注利伐沙班I16L(1mg/kg)或缓冲液。随后准备小鼠，以暴露颈静脉和腔静脉。大约10分钟后，FXa (1或 2mg/kg)通过直接注射到颈静脉内进行输注。注射后五分钟，血液经由腔静脉收集到柠檬酸盐和玉米胰蛋白酶抑制剂内。随后使用稀释组织因子(Innovin，1:42,000稀释度)，通过ROTEM分析收集的血液。来自仅施用缓冲液的全血到约2分钟时凝固(图12)。1mg/kg利 I16L 伐沙班的施用将凝血时间基本上延长到约10分钟(图12)。在利伐沙班的存在下，FXa 的进一步施用以剂量依赖性方式缩短凝血时间(图12)。 [0110] 实施例4–FXaI16L在凝血酶生成测定中抵消利伐沙班 [0111] 使用自动校准血栓图像仪(CAT)系统(Thrombinoscope BV，Maastricht，荷兰)，I16L在凝血酶生成测定(TGA)中检查FXa 对逆转血浆中的利伐沙班的作用。正常人血浆得自George King Biomedical(Overland Park，KS)。在反应中，在反应一式两份的Immulon 2HB圆底96孔板中，将20μL含有4μM磷脂和1pM组织因子的PPP-Reagent LOW加入70μL合 并的含柠檬酸盐的正常人血浆(用250nM利伐沙班(在治疗血浆浓度范围内)处理)。紧 I16L I16L 在反应起始前，将10μL媒介物或FXa 以范围为0.03125nM-0.5nM FXa 的最终浓度加 入血浆中，获得120μL总反应体积。通过添加20μL含有氯化钙和荧光底物的FluCa缓冲液来起始反应。血浆反应的荧光在37℃下以20秒间隔在Fluoroskan Ascent荧光计上进行读数，并且与参考凝血酶校准物反应的那些相比较，以测定凝血酶浓度。使用CAT在37℃下连续监控荧光信号(FU)的强度。使用Thromboscope软件(Thrombinoscope BV版本)，分析凝血酶生成曲线(nM凝血酶相对于时间)，以提取滞后时间、峰高、到峰的时间和代表内源凝血酶潜力(ETP)的曲线下面积。 [0112] 用体外利伐沙班处理(5-200nM)观察到正常人血浆中的凝血酶生成的剂量依赖性抑制(图10A)。利伐沙班导致与峰凝血酶减少和ETP减少偶联的滞后时间增加。向利伐I16L沙班(250nM)抑制的人血浆添加FXa 导致凝血酶抑制的剂量依赖性逆转(图10B)：峰凝 I16L 血酶生成得到回复，滞后期更短，并且ETP增加。在低剂量的0.03125nM FXa 下，凝血酶生成恢复至与媒介物处理的正常人血浆可比较的水平。 [0113] 实施例5–FXaI16L在小鼠尾部修剪出血模型中抵消利伐沙班 [0114] 在正常小鼠中的急性出血模型中，评价FXaI16L在体内克服利伐沙班的效应的能力。结果证实酶原样FXa变体可以逆转直接FXa抑制剂的抗凝效应。 [0115] 为了确定延长出血的利伐沙班剂量，雄性C57Bl/6小鼠(The JacksonLaboratory，Bar Harbor，ME)接受以10、25或50mg/kg剂量的利伐沙班的单次静脉内注射。 三十分钟后，将小鼠用异氟烷麻醉且置于加热平台上，并且在尾部切割前小鼠的体温维持在37℃下。将尾部在37℃下浸入50mL预温的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中2分钟。作出3mm 尾部切割，并且将血液收集到PBS内共10分钟时期。通过收集到PBS内的血液的血红蛋白含量来测定出血量的定量评价。将管离心以收集红细胞，重悬浮于5mL裂解缓冲液(8.3g/L NH4Cl、1.0g/L KHCO3和0.037g/L EDTA)中，并且样品的吸光度在575nm下进行测量。使用标准曲线将吸光度值转换为总失血量(μL)。在尾部切割后，利伐沙班的施用导致剂量依赖性的失血增加(图11)。 [0116] 在该模型中，50mg/kg利伐沙班的剂量导致在尾部横切后的失血增加。小鼠用50mg/kg利伐沙班进行给药，并且30分钟后，在尾部切割前，在37℃下将50或200ug/kg I16L FXa 静脉内给药。随后将小鼠用异氟烷麻醉且置于加热平台上，并且在尾部切割前小鼠的体温维持在37℃下。将尾部在37℃下浸入50mL预温的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中2分钟。 作出3mm尾部切割，并且将血液收集到PBS内共10分钟时期，并且如所述的通过血红蛋白I16L 含量来测定出血量的评价。在该模型中，止血FXa 变体的施用减少由利伐沙班诱导的过度失血(图11)。 [0117] 实施例6–使用活体显微镜检查证实的，FXaI16L在小鼠出血模型中抵消利伐沙班[0118] 如使用活体显微镜检查显现的，证实在激光诱导的损伤后，利伐沙班抑制小鼠提I16L睾肌的微循环中的血栓形成。FXa 的进一步施用可以抵消利伐沙班在该系统中的抗凝效应。 [0119] 使用标准技术，使小鼠的提睾肌暴露且使用活体显微镜检查显现。随后使用激光诱导肌肉中的血管损伤。在损伤后，使用不同荧光标记的抗体显现血块形成，所述抗体特异性识别纤维蛋白和血小板。凝血通过来自两种类型抗体的荧光信号的存在得到指示。 [0120] 在激光损伤后，未经处理的小鼠在损伤部位处快速形成凝块，所述凝块稳定几分钟(图13A)。在视频帧中，可见与荧光信号一致的凝块，所述荧光信号与针对纤维蛋白和血小板的抗体相关(淡灰色区域重叠暗灰色区域)。然而，将1mg/kg利伐沙班施用于小鼠延迟在损伤部位处的血小板累积，并且消除任何纤维蛋白征兆(图13B)。在视频帧中，如通过暗灰色区域指示的，仅可见降低程度的血小板，这反映与抗血小板抗体相关的荧光信号的I16L存在。相比之下，当小鼠施用1mg/kg利伐沙班随后为0.5mg/kg FXa 时，在损伤部位处快速形成凝块(图13C)。在视频帧中，凝块通过荧光信号的特征性模式指示，所述荧光信号与针对血小板和纤维蛋白的抗体相关。 [0121] 除非本文另有定义，否则与本公开结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。进一步地，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。一般地，与下述结合使用的命名法和技术是本领域众所周知的和通常使用的那些：本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交。 [0122] 除非另有说明，否则本公开的方法和技术一般根据本领域众所周知的常规方法且如多种一般和更具体的参考文献中所述的进行，所述参考文献在本说明书自始 至终被引用且讨论。参见例如援引加入本文的Sambrook J.&Russell D..Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2000)；Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Wiley， John&Sons，Inc.(2002)；Harlow和Lane Using Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1998)；和Coligan等人，Short Protocols in Protein Science，Wiley，John&Sons，Inc.(2003)。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，如本领域通常完成的或如本文描述的。与下述结合使用的命名法以及实验室操作和技术是本领域众所周知的和通常使用的那些：本文描述的分析化学、合成有机化学、以及医学和药物化学。 [0123] 本文引用的所有出版物、专利、专利申请或其他文件为了所有目的在此整体引入作为参考，其程度与每个个别出版物、专利、专利申请或其他文件个别指示为了所有目的引入作为参考相同。 |
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