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一种用乙酸铵提纯糜蛋白酶的方法
申请号	CN201611136415.7	申请日	2016-12-12	公开(公告)号	CN106591269A	公开(公告)日	2017-04-26
申请人	青岛冠龙生物制药有限公司;			发明人	刘乃山; 刘君; 夏衬来;
摘要	本发明公开了采用一种用乙酸铵提纯糜蛋白酶的方法，其特征是糜蛋白酶粗品（有效成分低于10%）在5‑15℃条件下，用乙酸铵溶液提取，再用有机溶剂乙醇沉淀，最后用丙酮脱水得糜蛋白酶中间品。此技术去除了糜蛋白酶粗品中杂质成分的80%以上；得到的糜蛋白酶中间品在后续工序中通过树脂柱吸附纯化，节约了树脂使用量，降低了生产成本；避免了糜蛋白酶因杂质过多，导致树脂柱体堵塞、甚至发生柱体胀裂危险的隐患。
权利要求	1.一种用乙酸铵提纯糜蛋白酶的方法，其特征在于糜蛋白酶粗品采用低温条件下乙酸铵溶液提取，有机溶剂乙醇沉淀，最后用丙酮脱水得糜蛋白酶中间品，其主要步骤如下：（1）将糜蛋白酶粗品投入20%的乙酸铵溶液中，在低温条件下搅拌2-2.5小时，离心，留取上清液；（2 ）离心渣再加入30%的乙酸铵溶液，在低温条件下搅拌，离心, 留取上清液；（3）合并两次上清液，加入95%乙醇，搅拌，置低温环境下，静置；（4）离心，收集沉淀物，用丙酮脱水，离心，将沉淀物真空干燥，得糜蛋白酶中间品。 2.根据权利要求书1步骤（1）（2）所述，其特征在于，乙酸铵溶液配制方法为：将300g乙酸铵溶解于1000ml 70%的乙醇溶液中，即得30%的乙酸铵溶液。 3.根据权利要求书1步骤（1）所述，其特征在于，糜蛋白酶粗品用乙酸铵溶液提取，糜蛋白酶粗品与乙酸铵提取液比例（g/ml）为1-3:15-35；低温条件：5-8℃；搅拌时间：1-2.5小时。 4.根据权利要求书1步骤（2）所述，其特征在于，糜蛋白酶粗品用乙酸铵溶液提取，糜蛋白酶粗品与乙酸铵提取液比例（g/ml）为1-3:15-30；低温条件：5-8℃；搅拌时间：1-2.5小时。 5.根据权利要求书1步骤（3）合并后的上清液用乙醇沉淀，其特征在于，上清液与乙醇的比例（ml/ml）为1-2:1.5-4.5；低温环境温度：5-8℃；静置时间：10-24小时。
说明书全文	一种用乙酸铵提纯糜蛋白酶的方法技术领域 [0001] 本发明涉及生物技术领域，利用糜蛋白酶蛋白质溶于一定浓度盐溶液中的特性，在5-8℃条件下用30%的乙酸铵溶液提纯糜蛋白酶，有机溶剂乙醇沉淀，最后用丙酮脱水得糜蛋白酶中间品。背景技术 [0002] 糜蛋白酶又称胰凝乳蛋白酶，它对肽链的分解作用具有选择性：即在酪氨酸、苯丙氨酸等的羧基端的肽链处。本品为白色棒状晶体，能溶解于生理盐水或纯化水，固体状态下比较稳定，可保存较长时间而不失活。但在水溶液中极不稳定，溶液pH在5～8时，其活力最强，也最易失活力。其分子量约42000。在等电点时的pH约为4.5。 [0003] 本品为胰腺分泌的一种蛋白分解酶，能迅速分解变形蛋白质，作用、用途与糜蛋白酶相似，比糜蛋白酶分解能力强，毒性低、不良反应小。能消化脓汁及坏死组织，净化创面，从而使正常组织中分泌血清，去除异物，助长新生肉芽的生长，促进治疗。本品与糜蛋白酶或化学药剂共同治疗各种炎症具有协同作用，故常用于外科创伤治剂。也可用于眼科消肿治疗。发明内容 [0004] 本发明提出的乙酸铵提纯糜蛋白酶的具体方法，包括以下步骤：1）30%乙酸铵溶液的配制：将300g乙酸铵溶解于1000ml 70%的乙醇溶液中，即得30%的乙酸铵溶液。 [0005] 2）将糜蛋白酶粗品投入1-3:15-35（g/ml）比例的30%的乙酸铵溶液中，在5-15℃条件下搅拌1-2.5小时，离心，留取上清液。 [0006] 3）离心渣按干粉1-3：15-30 (g/ml) 比例加入10%的乙酸铵溶液，在5-10℃条件下搅拌1-2.5小时，离心, 留取上清液。 [0007] 4）合并两次上清液，按1-2:1.5-4.5(ml/ml)比例加入95%乙醇，搅拌30-60分钟，置低温5-10℃下静置10-24小时。 [0008] 5）离心，收集沉淀物，用适量丙酮脱水，离心，将沉淀物放入以五氧化二磷作吸水剂的真空干燥箱中干燥，得糜蛋白酶中间品。 [0009] 本发明公开了乙酸铵提纯糜蛋白酶的技术方法，其优点和积极效果在于糜蛋白酶粗品经过10%乙酸铵溶液溶解、有机溶剂乙醇沉淀，丙酮脱水后，可以有效去除糜蛋白酶粗品中的杂质成分，使其在树脂处理过程中节约树脂用量，降低生产成本，另外还可以避免因糜蛋白酶粗品杂质过多导致堵塞柱体、甚至发生柱体胀裂危险的隐患。具体实施例 [0010] 1）30%乙酸铵溶液的配制：将300g乙酸铵溶解于1000ml 70%的乙醇溶液中，即得30%的乙酸铵溶液。 [0011] 2）将400g糜蛋白酶粗品15L的30%的乙酸铵溶液中，在5-10℃条件下搅拌3小时。离心，留取上清液。 [0012] 3）离心渣加入8L的30%的乙酸铵溶液，在5-10℃条件下搅拌2小时。离心, 留取上清液。 [0013] 4）合并两次上清液，加入40L的95%乙醇，搅拌50分钟，置低温5-10℃下静置过夜。 [0014] 5）离心，收集沉淀物，用适量丙酮脱水，离心，将沉淀物置有五氧化二磷作吸水剂的真空干燥箱中干燥，得糜蛋白酶中间品120g。 [0015] 本发明的优点和积极效果400g糜蛋白酶粗品经本发明乙酸铵提纯后得到120g糜蛋白酶中间品，经后续协和树脂吸附工序，与400g糜蛋白酶粗品直接通过协和树脂吸附，进行了操作时间、成本、成品效价的对比试验，结果如下： 400g糜蛋白酶粗品 120g糜蛋白酶中间品流速10L/h 流速20L/h 协和树脂吸附所需时间 15h 协和树脂吸附所需时间3.5h树脂需用量 3000g 树脂需用量 800g 糜蛋白酶重量 31.6g 糜蛋白酶重量35.4 通过比较，充分证明了本发明相对于传统技术的优势，不仅在效价方面略胜一筹，还去除了杂质，节省了后续协和工序中的树脂用量，节省整个工序的时间，从而降低生产成本。 [0016] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容、依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

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