碱性蛋白包载载体、包载载体制备方法和包载方法 |
|||||||
| 申请号 | CN201610210632.X | 申请日 | 2016-04-06 | 公开(公告)号 | CN105854026A | 公开(公告)日 | 2016-08-17 |
| 申请人 | 温州生物材料与工程研究所; | 发明人 | 昝兴杰; 史鹏忠; | ||||
| 摘要 | 本 申请 公开了一种 碱 性蛋白包载载体、包载载体制备方法和包载方法，在室温下，通过聚阴离子 电解 质和 钙 盐搅拌混合，在急速搅拌或超声的过程中，迅速加入 碳 酸盐共沉淀形成微米球，然后经过洗涤、离心、干燥后得到聚阴离子 电解质 掺杂的碳酸钙微米球。再将一定浓度的碱性蛋白溶液与碳酸钙微米球混合，低温搅拌或震荡孵育15~90分钟，离心、去除上清，冻干得到包载了碱性蛋白的碳酸钙微米球，颗粒尺寸分布窄，分散性良好， 生物 相容性 好。本申请的优点是能够在温和条件下高浓度且高活性的包载碱性蛋白。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种碱性蛋白包载载体，其特征在于：该包载载体为聚阴离子电解质掺杂碳酸钙微米球，直径大小为1~5μm，扫描电镜照片显示其微球截面形貌呈蜂窝状多孔结构，测得孔径为10~80nm。 |
||||||
| 说明书全文 | 碱性蛋白包载载体、包载载体制备方法和包载方法技术领域背景技术[0002] 碳酸钙是一种用量很大，用途很广的新型无机材料，广泛应用于涂料、橡胶、塑料、造纸、油墨、食品、化妆品和医药等多个领域。碳酸钙的实际应用与其性质（如形貌、粒径、Zeta电位、比表面积等）密切相关。 [0004] 随着层层自组装技术（LBL）在制膜方面的发展，医药领域利用LBL技术制备微胶囊达到包载药物，保护药物疗效的同时，有效实现药物的缓释。利用碳酸钙为模板制备微胶囊，加入稀酸分解或乙二胺四乙酸（EDTA）络合钙离子，去除CaCO3胶体粒子形成高浓度的微胶囊，达到低生物毒性且高效的包载目的。李峻柏等（中国专利 CN 102921014 A）公开了一种制备具有协同抗肿瘤效应的生物兼容纳米药物复合载体，模板就是多孔无机纳米粒子碳酸钙。朱利民等（中国专利CN103585638 A）通过海藻酸钠、碳酸钠和氯化钙共沉淀，制备出掺杂海藻酸盐的碳酸钙微米球；唐华等（中国专利 CN 102992374 A）利用添加聚苯乙烯与碳酸钙共沉淀的方法制备出分散性好的碳酸钙微米球，这充分说明碳酸钙颗粒作为模板可以利用聚阴离子电解质达到很好的修饰。 [0005] 碱性蛋白一般是指等电点比通常的生理条件下偏碱的蛋白质，即等电点大于7的所有蛋白。在生物体内，诸多碱性蛋白的作用十分重要，比如抑肽酶等。 [0006] 然而能够高浓度且高活性的包载传递这些碱性蛋白尤为重要。文献[De Temmerman M L, Demeester J, De Vos F, et al. Encapsulation performance of layer-by-layer microcapsules for proteins[J]. Biomacromolecules, 2011, 12(4): 1283-1289.]表明，碳酸钙对于酸性蛋白能实现大量包载，文献[Balabushevich N G, Lopez de Guerenu A V, Feoktistova N A, et al. Protein-Containing Multilayer Capsules by Templating on Mesoporous CaCO3 Particles: POST- and PRE- Loading Approaches[J]. Macromolecular bioscience, 2016, 16(1): 95-105.]和文献[Hassani L N, Hindré F, Beuvier T, et al. Lysozyme encapsulation into nanostructured CaCO3 microparticles using a supercritical CO2 process and comparison with the normal route[J]. Journal of Materials Chemistry B, 2013, 1(32): 4011-4019.]也都表示碳酸钙很难大量包载碱性蛋白。这是因为在中性水溶液中，碳酸钙和碱性蛋白质均带有正电性，在共沉淀或吸附包载时，他们电性相同而相互排斥，难以达到大量包载。 [0007] 因此，通过检索，目前国内外在温和条件下利用碳酸钙高效包载碱性蛋白的研究没有报道。 发明内容[0008] 本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种能适用于在温和条件下高浓度且高活性的包载碱性蛋白的包载载体。 [0009] 本发明的第二个目的是提供一种碱性蛋白包载载体的制备方法。 [0010] 本发明的第三个目的是提供一种碱性蛋白的高效包载方法。 [0011] 为实现本发明的第一个目的，本发明的技术方案是该包载载体为聚阴离子电解质掺杂碳酸钙微米球，直径为1~5μm，呈蜂窝状多孔结构，测得孔径为10~80nm。载体能够实现对碱性蛋白包载，是因为掺杂聚阴离子电解质碳酸钙微米球的表面与碱性蛋白存在较强的静电力作用，且其多孔结构增加了微米球的比表面积，从而增加了载体对碱性蛋白的包载量。 [0013] 为实现本发明的第二个目的，其技术方案是一种碱性蛋白包载载体的制备方法，包括以下步骤：在4~40℃下，将浓度为0.1~1M的钙盐溶液和浓度为0.1~20mg/ml的聚阴离子电解质溶液混合后，搅拌混匀，之后剧烈搅拌或超声时，快速加入与钙盐溶液等摩尔量的碳酸盐溶液，搅拌30~60s，静置10~30min，生成聚阴离子电解质掺杂碳酸钙微米球，钙盐溶液、聚阴离子电解质溶液和碳酸盐溶液的体积比为（1~3）:（0.5~1.5）:（1.5~4.5），将生成的聚阴离子电解质掺杂碳酸钙微米球沉淀离心收集，然后清洗去除溶液残留。 [0015] 进一步设置是所述的聚阴离子电解质包括聚苯乙烯磺酸钠、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、硫酸软骨素、肝素钠、透明质酸、硫酸葡聚糖、羧甲基纤维素、卡拉胶、海藻酸钠中的一种或多种组合。 [0016] 进一步设置是所述剧烈搅拌是指搅拌速度在400~1500转/分钟；而超声是指频率在20~60kHz。 [0017] 为实现本发明的第三个目的，其技术方案是取聚阴离子电解质掺杂碳酸钙微米球置于离心管中，加入0.1~3mg/ml的碱性蛋白溶液，在0~30℃下孵育15~90分钟，离心，冻干即可得到包载碱性蛋白的碳酸钙微米球。 [0018] 进一步设置是所述的碱性蛋白包括等电点大于7的所有蛋白。 [0019] 本发明的优点在于：（1）该载体可以实现对于所有碱性蛋白的包载，具有很广的普适性，掺杂聚阴离子电解质碳酸钙微米球的表面与碱性蛋白存在较强的静电力作用，且其多孔结构增加了微米球的比表面积，从而大大增加了载体对碱性蛋白的包载量。 [0020] （2）该载体对于碱性蛋白的包载量高；（3）该包载方法形成的碱性蛋白载体有很好的生物相容性； （4）该碱性蛋白载体易于实现蛋白的释放，且易于进一步包载或修饰； （5）该载体的制备及碱性蛋白的包载方法简单，设备成本低，操作便捷，适用于工业化生产。 [0021] 本申请的碱性蛋白包载载体可以保证碱性蛋白具有维持生物活性的天然构象，具有对碱性蛋白包载的普遍性和高效性。制备方法和包载方法，工艺简单，条件温和，可在常温水溶液中进行。此外，该方法可以使用的修饰材料种类多，包载碱性蛋白得到的颗粒表面带有电性，易于在表面做进一步的层层组装或修饰等，碳酸钙生物毒性低，易于温和条件下去除。因此，该方法可作为蛋白传递的模板，广泛应用于蛋白及蛋白药物等的包载、传递和控释等领域，在生物医药材料领域中有很好的研究和应用前景。 附图说明[0023] 图1为本发明提供的肝素钠修饰碳酸钙微米球；图2为本发明提供的20mg肝素钠修饰碳酸钙不同pH下对1ml浓度为1.5mg/ml溶菌酶的包载情况。 具体实施方式[0024] 下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。 [0025] 实施例1本实施例涉及一种掺杂肝素钠的碳酸钙微米球对于胰凝乳蛋白的包载方法。 [0026] （1）、将2ml浓度为0.5M的氯化钙溶液和1ml浓度为6mg/ml的肝素钠混合后，搅拌1~5min，之后在900转/分钟下，快速加入3ml浓度为0.33M的碳酸钠溶液，搅拌35~40s，静置 15min，将生成的含有肝素钠的碳酸钙沉淀离心收集，用水洗3次。制备的含有肝素钠的碳酸钙微粒直径约为2~5μm。 [0027] （2）、取适量上述含有肝素钠的碳酸钙微粒置于1.5ml的离心管中，加入1ml浓度为1mg/ml的胰凝乳蛋白溶液（pH=7.2），在4℃下孵育30min，离心，冻干即可得到包载胰凝乳蛋白的肝素钠的碳酸钙微粒，蛋白包载率可达95%以上。 [0028] 实施例2本实施例涉及一种掺杂肝素钠的碳酸钙微米球对于溶菌酶的包载方法。 [0029] （1）、将2ml浓度为0.5M的氯化钙溶液和1ml浓度为6mg/ml的肝素钠混合后，搅拌1~5min，之后1000转/分钟下，快速加入3ml浓度为0.33M的碳酸钠溶液，搅拌35~40s，静置 25min，将生成的含有肝素钠的碳酸钙沉淀离心收集，用水洗3次。制备的掺杂肝素钠的碳酸钙微米球直径约为2~5μm，见图1。 [0030] （2）、取适量上述掺杂肝素钠的碳酸钙微米球置于1.5ml的离心管中，加入1ml浓度为1mg/ml的溶菌酶溶液（pH=7.2），在10℃下孵育60min，离心，冻干即可得到包载溶菌酶的掺杂肝素钠的碳酸钙微米球，蛋白包载率可达92%以上。。 [0031] 实施例3本实施例涉及一种掺杂硫酸葡聚糖的碳酸钙微米球对于溶菌酶的包载方法。 [0032] （1）、将2ml浓度为0.5M的氯化钙溶液和1ml浓度为6mg/ml的硫酸葡聚糖混合后，搅拌1~5min，之后在1200转/分钟下，快速加入3ml浓度为0.33M的碳酸钠溶液，搅拌35~40s，静置20min，将生成的掺杂硫酸葡聚糖的碳酸钙沉淀离心收集，用水洗3次。制备的掺杂硫酸葡聚糖的碳酸钙微粒直径约为2~5μm。 [0033] （2）、取适量上述掺杂硫酸葡聚糖的碳酸钙微粒置于1.5ml的离心管中，加入1ml浓度为1mg/ml的溶菌酶溶液（pH=7.2），在25℃下孵育90min，离心，冻干即可得到包载溶菌酶的掺杂硫酸葡聚糖的碳酸钙微米球，蛋白包载率可达94%以上。 [0034] 实施例4本实施例涉及一种掺杂肝素钠的碳酸钙微米球对于溶菌酶的包载方法。 [0035] （1）、将2ml浓度为0.5M的氯化钙溶液和1ml浓度为6mg/ml的肝素钠混合后，搅拌1~5min，之后在1200转/分钟下，快速加入3ml浓度为0.33M的碳酸钠溶液，搅拌35~40s，静置 15min，将生成的掺杂肝素钠的碳酸钙沉淀离心收集，用水洗3次。制备的掺杂肝素钠的碳酸钙微粒直径约为2~5μm。 [0036] （2）、取适量上述掺杂肝素钠的碳酸钙微粒置于1.5ml的离心管中，加入1ml浓度为2mg/ml的溶菌酶溶液（pH=7.0），在25℃下孵育30min，离心，冻干即可得到包载溶菌酶的掺杂肝素钠的碳酸钙微米球，蛋白包载率可达70%以上，如图2所示。 [0037] 实施例5本实施例涉及一种掺杂肝素钠的碳酸钙微米球对于溶菌酶的包载方法。 [0038] （1）、将2ml浓度为0.5M的氯化钙溶液和1ml浓度为6mg/ml的肝素钠混合后，搅拌1~5min，之后在1200转/分钟下，快速加入3ml浓度为0.33M的碳酸钠溶液，搅拌35~40s，静置 15min，将生成的掺杂肝素钠的碳酸钙沉淀离心收集，用水洗3次。制备的掺杂肝素钠的碳酸钙微粒直径约为2~5μm。 [0039] （2）、取适量上述掺杂肝素钠的碳酸钙微粒置于1.5ml的离心管中，加入1ml浓度为1.5mg/ml的溶菌酶溶液（pH=11.5），在25℃下孵育30min，离心，冻干即可得到包载溶菌酶的掺杂肝素钠的碳酸钙微米球，蛋白包载率可达98%以上，如图2所示。 |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈