一种分离提取糜蛋白酶的方法 |
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申请号 | CN201310659581.5 | 申请日 | 2013-12-02 | 公开(公告)号 | CN103695404A | 公开(公告)日 | 2014-04-02 |
申请人 | 青岛康原药业有限公司; | 发明人 | 刘乃山; 李静洁; 刘君; 刘振海; 刘翠珍; | ||||
摘要 | 本 发明 阐述一种分离提取糜蛋白酶的方法。该制备方法包括以下工艺步骤:(1)结晶;(2)活化;(3)盐析;(4) 透析 ;(5)冻干。本发明建立起一套规模化的生产工艺,具有简单、低成本等优点,制备的糜蛋白酶精品效价高达1200单位/毫克以上,符合《中国药典》(2010版)要求,具有极大的市场竞争 力 。 | ||||||
权利要求 | 1.一种分离提取糜蛋白酶的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)结晶;(2)活化; |
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说明书全文 | 一种分离提取糜蛋白酶的方法技术领域背景技术[0002] 糜蛋白酶是从牛胰腺或猪胰腺中分离纯化得到的一种蛋白酶。它在药理和临床上的功用主要有两方面:一、消炎:对各种炎症、炎性水肿、血肿、溃疡及血栓等有较好疗效。二、抗癌:能促进抗癌药物向病灶渗透,促使化疗药物发挥作用,局部大剂量使用时作用更强。大剂量使用可治疗多种肿瘤,如乳腺癌、宫颈癌、胃癌等,并且无任何毒副作用或不良反应。 [0003] 中国专利CN1944641A公开了一种分离提取糜蛋白酶的方法,采用亲和层析工艺从糜蛋白酶原生产高纯度糜蛋白酶,但是正如中国专利CN1013025B分析,也存在一些缺点,最主要的,亲和层析介质昂贵,可重复使用次数少,介质的使用量大,不适合规模化大生产。而中国专利CN1013025B虽然解决了亲和层析的不足,也能获得高比活的糜蛋白酶,但同样,比较起传统工艺来,生产成本太高。可是随着糜蛋白酶的应用广泛,使得国际市场对本产品的需求不断扩大,质量要求上也更加严格,要求产品有更高的质量:《中国药典》(2010版)规定,糜蛋白酶的效价不得少于1000单位/毫克。针对效价提高的要求,本发明对传统工艺进行了改进和创新。 发明内容[0004] 本发明的目的就是为了生产高质量的糜蛋白酶而又降低生产成本,对传统工艺加以改造,尤其是参数的改造,提供了一种分离提取糜蛋白酶的方法,该方法包括如下步骤: [0005] (1)结晶工序 [0006] 投料:取糜蛋白酶粗品,按5~9ml/g的比例加水溶解,调pH值至2.5~3.5,搅拌8~10小时后,静置12~16小时。 [0007] 结晶I [0008] 静置结束后搅拌,并调pH值至2.0~3.0。按1~3ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液,搅拌10~30分钟,调pH值至4.5~5.5,置20~28℃条件下,保温40~48小时,过滤,收集滤饼,滤液弃去。 [0009] 结晶II [0010] 按2~4ml/g的比例加入水溶解滤饼,调pH值至2.0~3.0,再按0.5~2.0ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液,调pH值至4.5~5.5,置20~28℃条件下,保温20~24小时,过滤,收集滤饼。 [0011] 结晶III [0012] 按2~4ml/g的比例加入水溶解滤饼,调pH值至2.0~3.0,再按0.5~2.0ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液,调pH值至4.5~5.5,置20~28℃条件下,保温20~24小时,过滤,收集滤饼。 [0013] 结晶IV [0014] 按2~4ml/g的比例加入水溶解滤饼,调pH值至2.0~3.0,再按0.5~2.0ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液,调pH值至4.5~5.5,置20~28℃条件下,保温20~24小时,过滤,收集滤饼。 [0015] (2)活化工序 [0016] 称量滤饼重量,按2~4ml/g的比例加入水溶解,调pH值至7.0~8.5。 [0018] (3)盐析工序 [0019] 活化结束后调pH值至3.0~5.0,量取活化液体积,按400~600g/L的比例加入固体硫酸铵进行盐析,放置12~16小时。 [0020] 过滤,弃滤液,收集滤饼。 [0021] (4)透析工序 [0022] 滤饼按1~1.5ml/g的比例加入水,搅拌溶解,透析4~6天。 [0023] (5)冻干工序 [0024] 收集、合并透析液,过滤,量取体积,调pH值至5.5~6.7,装盘、冻干。 [0025] 与现有技术相比,本发明的优点和积极效果是: [0026] 本发明采用盐析、多重结晶结合透析等技术来提取糜蛋白酶,通过对传统工艺的改进和创新,不仅生产出了高质量的糜蛋白酶,同时又具有简单、低成本等优点。 [0027] 本发明已建立起一套规模化的生产工艺,制备的糜蛋白酶精品效价高达1200单位/毫克以上,符合《中国药典》(2010版)要求,具有极大的市场竞争力。 具体实施方式[0028] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。 [0029] 实施例1 [0030] (1)结晶工序 [0031] 投料:取糜蛋白酶粗品20.0g,加100ml纯化水溶解,并加适量2.5mol/L H2SO4溶液调节pH2.6,搅拌8小时后,静置12小时。 [0032] 结晶I [0033] 静置结束后搅拌,并加2.5mol/L H2SO4溶液调pH2.1。加入饱和硫酸铵溶液20ml,搅拌10分钟,用5mol/L NaOH调pH4.6,置20℃条件下,保温40小时,过滤,收集滤饼,称重37.6g,滤液弃去。 [0034] 结晶II [0035] 滤饼加76ml纯化水溶解,用2.5mol/l硫酸调pH2.0,加饱和硫酸铵溶液18.8ml,用5mol/L NaOH调pH4.5,置20℃条件下,保温20小时,过滤,收集滤饼,称重33.1g。 [0036] 结晶III [0037] 滤饼加66.2ml纯化水溶解,用2.5mol/L硫酸调pH2.0,加饱和硫酸铵溶液16.6ml,用5mol/L NaOH调pH4.5,置20℃条件下,保温20小时,过滤,收集滤饼,称重 30.7g。 [0038] 结晶IV [0039] 滤饼加61.4ml纯化水溶解,用2.5mol/L硫酸调pH2.0,加饱和硫酸铵溶液15.4ml,用5mol/L NaOH调pH4.5,置20℃条件下,保温20小时,过滤,收集滤饼,称重 30.4g。 [0040] (2)活化工序 [0041] 加60.8ml纯化水溶解滤饼,加5mol/L NaOH溶液调pH7.2。 [0042] 加入磷酸盐缓冲液15.2ml,搅拌片刻,调pH7.2。加入活化剂胰蛋白酶0.5mg,活化60小时。 [0043] (3)盐析工序 [0044] 用2.5mol/L硫酸调pH3.1,量取活化液体积155ml,加入固体硫酸铵62g进行盐析,放置12小时,过滤,弃滤液,收集滤饼,称重32g。 [0045] (4)透析 [0046] 滤饼加入纯化水32ml,搅拌溶解,透析4天。 [0047] (5)冻干工序 [0048] 收集、合并透析液,过滤,量取体积153ml,调节pH5.6,装盘1盘、冻干,称重7.7g。 [0049] (6)根据《中国药典》(2010版)规定的糜蛋白酶效价检测法对本品进行检验,本品的效价为1485单位/毫克。 [0050] 实施例2 [0051] (1)结晶工序 [0052] 投料:取糜蛋白酶粗品20.3g,加180ml纯化水溶解,并加适量2.5mol/L H2SO4溶液调节pH3.2,搅拌10小时后,静置15小时。 [0053] 结晶I [0054] 静置结束后搅拌,并加2.5mol/L H2SO4溶液调pH2.8。加入饱和硫酸铵溶液60ml,搅拌30分钟,用5mol/L NaOH调pH5.4,置28℃条件下,保温48小时,过滤,收集滤饼,称重37.9g,滤液弃去。 [0055] 结晶II [0056] 滤饼加151ml纯化水溶解,用2.5mol/l硫酸调pH3.0,加饱和硫酸铵溶液75.8ml,用5mol/L NaOH调pH5.3,置26℃条件下,保温24小时,过滤,收集滤饼,称重33.3g。 [0057] 结晶III [0058] 滤饼加133.2ml纯化水溶解,用2.5mol/L硫酸调pH3.0,加饱和硫酸铵溶液66.6ml,用5mol/L NaOH调pH5.3,置26℃条件下,保温24小时,过滤,收集滤饼,称重 30.8g。 [0059] 结晶IV [0060] 滤饼加123.2ml纯化水溶解,用2.5mol/L硫酸调pH3.0,加饱和硫酸铵溶液41.6ml,用5mol/L NaOH调pH5.3,置26℃条件下,保温24小时,过滤,收集滤饼,称重 30.6g。 [0061] (2)活化工序 [0062] 加122.4ml纯化水溶解滤饼,加5mol/L NaOH溶液调pH8.4。 |