随着核酸发酵和核酸分解等核酸工业的发展，目前已可廉价地制造核苷和5＇ -一磷酸核苷酸(NMP)，其一部分已作为药品或其原料而制造销售。此外， 核苷、核苷酸或其衍生物作为医药的开发也在积极地进行。另外，近年来，随着 糖链工程技术的发展，关于糖核苷酸(糖链的酶合成底物)合成的研究也在活跃 地进行。
这样，与NMP可廉价地制造和供应相比，虽已报告NTP有各种化学合成或 使用微生物或酶的合成方法，但以5＇-三磷酸腺苷为起始原料的NTP的廉价的 制造方法目前尚未确立，故市售的NTP极昂贵。
最近，用以糖核苷酸为底物的糖基转移酶进行的寡糖的合成技术开发正在广 泛地进行，其中引人注目的有美国Scripps研究所提出的糖核苷酸循环法(参见 PCT专利申请公报1995年第500248号、日本专利公开公报1995年第79792号)。 该方法是以NTP和糖1-磷酸为底物，使用糖核苷酸焦磷酸化酶和糖基转移酶， 在合成糖核苷酸的同时，将同时合成的糖核苷酸作为单糖供体，有效地进行糖基 转移反应，由此合成寡糖。该方法的特征在于，通过烯醇丙酮酸磷酸与丙酮酸激 酶的组合而使由糖基转移反应生成的NDP再生成NTP，然后再将再生的NTP用 作合成糖核苷酸的底物，由此可减少高价的NTP的添加量且可提高糖基转移反应 的效率，从而有望降低寡糖的制造成本。
但是，上述循环法虽然具有不必大量使用高价的NTP的优点，然而，为再生 NTP，却必须大量使用高价的烯醇丙酮酸磷酸，因此，该方法并未成为一种可满 足实用性的方法。
此外，在将NDP转换成NTP的反应中，虽可用核苷二磷酸激酶等其他酶代 替丙酮酸激酶，但依然需要高价的5＇-三磷酸腺苷(ATP)作为磷酸供体，不 是根本的解决办法。
因此，本发明提供一种不使用高价的烯醇丙酮酸磷酸或ATP的、更实用的从 NDP合成或再生NTP的方法，同时提供该方法在合成寡糖等方面的应用方法。
本发明者为达到上述目的，进行了深入的研究，结果发现，以往公知的多磷 酸激酶(Biochim.Biophys.Acta.,26,294-300(1957))具有以多磷酸为磷酸供体， 将ADP以外的NDP磷酸化、合成NTP的活性。在研究将上述发现应用于寡糖合 成时，确认其比现有的上述糖核苷酸循环法更实用，由此完成了本发明。
发明的揭示
即，本发明提供一种从ADP以外的NDP制造NTP的方法，该方法是一种特 征在于用多磷酸激酶作为酶、用多磷酸作为磷酸供体的从NDP制造NTP的方法。
此外，本发明还提供一种从其他酶反应生成的ADP以外的NDP再生NTP的 方法，该方法是一种特征在于用多磷酸激酶作为酶、用多磷酸作为磷酸供体的从 NDP再生NTP的方法。
再者，本发明还提供一种制造受体糖的糖基化化合物的方法，其中，在通过 糖基转移酶从糖核苷酸和受体糖制造该受体糖的糖基化化合物的同时，将在该反 应中生成的NMP或NDP转换成NTP，然后再转换成糖核苷酸，从而使NMP或 NDP再循环，该方法的特征在于，用多磷酸激酶作为酶，用多磷酸作为磷酸供体， 进行从NDP向NTP的转换。
图面的简单说明
图1和图2是制造受体糖的半乳糖基化化合物的反应图解。图3是制造受体 糖的葡糖醛酸基化化合物的图解。图4是制造受体糖的葡糖基化化合物的反应图 解。图5和图6是制造受体糖的岩藻糖基化化合物的反应图解。图7是制造受体 糖的甘露糖基化化合物的反应图解。图8是制造受体糖的N-乙酰氨基葡糖基化 化合物的反应图解。图9是制造受体糖的N-乙酰氨基半乳糖基化化合物的反应 图解。图10是制造受体糖的唾液酸基化化合物的反应图解。图11是制造乳糖的 反应图解。图12是制造N-乙酰乳糖胺的反应图解。
实施本发明的最佳方式
本发明的特征在于，在从NDP制造NTP时，用多磷酸激酶作为酶，用多磷 酸作为磷酸供体。这里，构成NDP和NTP的核苷的例子有鸟苷、肌苷、黄苷、 胞苷、尿苷和胸苷。
本发明中使用的多磷酸激酶若是具有以多磷酸为磷酸供体，将NDP磷酸化， 合成NTP的活性的多磷酸激酶(E.C.2.7.4.1)，则无特别限定，不限于来源于动 物、植物、微生物等特定来源的多磷酸激酶。其中，从制备酶的简便程度等考虑， 较好的是使用来源于大肠杆菌的多磷酸激酶。此外，也可利用近年来的基因工程 技术，克隆多磷酸激酶基因，以大肠杆菌等为宿主，大量生产多磷酸激酶，通过 该重组体制备酶(J.Biol.Chem.,267,22556-22561(1992))。
添加在反应系中的多磷酸激酶只要具有上述活性，可以是形式的。其具体例 子包括微生物菌体、该菌体的处理物或由该处理物得到的酶制剂等。
微生物菌体的制备可用以下方法进行：用可培养该微生物的培养基，以常法 培养后，通过离心分离等收集菌体。下面以属于芽胞杆菌属或大肠杆菌属的细菌 为例进行具体说明。可使用肉汁培养基、LB培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵 母提取物、1％食盐)或2×YT培养基(1.6％胰蛋白胨、1％酵母提取物、 0.5％食盐)等作为培养基，将菌种在该培养基上接种后，在视需要进行搅拌的 同时，在30～50℃培养10-50小时左右，然后将所得的培养液离心分离，收 集微生物菌体，由此可制成具有多磷酸激酶活性的微生物菌体。
微生物菌体处理物的例子有将上述微生物菌体通过机械性破坏(用韦林氏混 匀器、弗氏压碎器、匀浆器、研钵等)、冻融、自体消化、干燥(通过冷冻干燥、 风干等)、酶处理(用溶菌酶等)、超声波处理、化学处理(酸、碱处理等)等 一般性处理方法处理后得到的菌体破坏物或菌体细胞壁或细胞膜的变性物。
酶制剂的例子有用通常的酶的纯化手段(盐析处理、等电点沉淀处理、有机 溶剂沉淀处理、透析处理、各种色谱处理等)对上述菌体处理物中具有多磷酸激 酶活性的部分进行处理后所得的粗制酶或纯化的酶。
添加在反应液中的NDP可以是市售品。使用浓度例如可在1～200mM，最 好在10～100mM的范围内适当地进行设定。此外，添加的多磷酸也可以是市售 品。使用浓度可在换算成无机磷酸为1～1000mM，最好在10～200mM的范围 内适当地进行设定。
从NDP向NTP的转换可用以下方法进行：往pH在4～9的范围内的适当的 缓冲液中加入NDP和多磷酸，再加入0.001单位/ml以上，最好为0.001-1.0单 位/ml的多磷酸激酶，在30℃以上，最好在32-37℃反应1-50小时，视需 要，同时进行搅拌。
在将由其他酶反应生成的NDP再生成NTP时，除添加NDP外，其他反应条 件与上述反应条件相同。
通过上述合成或再生而得到的NTP可视需要用通常的核苷酸分离纯化方法 (离子交换柱层析、吸附柱层析、盐析等)进行分离纯化。此外，例如在以下所 示的存在糖核苷酸合成酶等的体系中，NTP可有效地用作底物，用于寡糖合成 等。
即，可构筑实用的受体糖的葡糖基化化合物的合成系，其中，在用葡糖基转 移酶从糖核苷酸和受体糖制造受体糖的葡糖基化化合物的同时，将在该反应中生 成的NMP或NDP转换成NTP，然后再转换成糖核苷酸，进行再循环。在该制造 受体糖的葡糖基化化合物的方法中，用多磷酸激酶作为酶，用多磷酸作为磷酸供 体，进行NDP向NTP的转换。
该合成系的特征在于，在用葡糖基转移酶将糖核苷酸的葡糖基转移至受体 糖、合成受体糖的葡糖基化化合物的同时，用多磷酸和多磷酸激酶将由转移反应 生成的NMP或NDP再生成NTP进行再利用。
此外，若从别的角度看，该合成系的特征在于，在该合成系中共存着用葡糖 基化转移酶将糖核苷酸中的葡糖基残基转移至受体糖、合成受体糖的葡糖基化化 合物的反应系和用多磷酸和多磷酸激酶将由转移反应生成的NMP或NDP再生成 NTP的反应系。
该合成系中使用的葡糖基转移酶的例子有半乳糖基转移酶、葡糖基转移酶、 岩藻糖基转移酶、甘露糖基转移酶、葡糖醛酸基转移酶、唾液酸基转移酶、N- 乙酰氨基半乳糖基转移酶和N-乙酰氨基葡糖基转移酶等。
因此，用该酶所得的受体糖的葡糖基化化合物的例子有在受体糖上加合了半 乳糖、葡萄糖、岩藻糖、甘露糖、葡糖醛酸、唾液酸、N-乙酰半乳糖胺或N- 乙酰氨基葡糖的化合物。
此外，受体糖若是具有上述葡糖基转移酶可识别为底物的糖链的化合物，则 无特别限定，其例子有单糖、寡糖、多糖、糖蛋白、糖脂等。此外，构成这些受 体糖的糖不限于通常的糖，也可包括脱氧糖、氨基酸、糖醛酸、糖化物、糖醇。
在上述合成系中NTP向糖核苷酸的转换可通过NDP-葡糖基焦磷酸化酶和糖 1-磷酸与NTP的反应来进行。此外，当由该反应得到的糖核苷酸所具有的葡糖 基残基与所需的葡糖基残基不同时，可通过其与差向异构酶、脱氢酶、合成酶等 的反应而转换成所需的糖核苷酸。
上述合成系的适用范围极为广泛，只要根据作为目的的葡糖基化生成物，从 公知的底物和酶中适当地选择构成上述合成系的要素进行使用即可，并不限于上 述列出的例子。
关于上述合成系的具体的要素组合，已有若干报道，这些文献(日本专利公 开公报1995年第79792号、PCT专利申请公报1994年第505638号、1995年第 500248号、1996年第509619号、美国专利No.5,409,817等)在本说明书中引 作参考。但在已知的报道中，在从NDP向NTP的转换中使用的磷酸供体与激酶 的组合仅例举了乙酰磷酸与乙酸激酶的组合及烯醇丙酮酸磷酸与丙酮酸激酶的 组合，在本发明中，与这些组合不同，用多磷酸作为磷酸供体，用多磷酸激酶作 为激酶。
下面说明上述合成系的适用例。
(1)在用半乳糖基转移酶从糖核苷酸和受体糖制造该受体糖的半乳糖基化 化合物的同时，将在该反应中生成的NDP转换成NTP，然后再转换成糖核苷酸， 进行再循环的受体糖的半乳糖基化化合物的制造方法(图1和图2)。
(2)在用葡糖醛酸基转移酶从糖核苷酸和受体糖制造该受体糖的葡糖醛酸 基化化合物的同时，将在该反应中生成的NDP转换成NTP，然后再转换成糖核 苷酸，进行再循环的受体糖的葡糖醛酸基化化合物的制造方法(图3)。
(3)在用葡糖基转移酶从糖核苷酸和受体糖制造该受体糖的葡糖基化化合 物的同时，将在该反应中生成的NDP转换成NTP，然后再转换成糖核苷酸，进 行再循环的受体糖的葡糖基化化合物的制造方法(图4)。
(4)在用岩藻糖基转移酶从糖核苷酸和受体糖制造该受体糖的岩藻糖基化 化合物的同时，将在该反应中生成的NDP转换成NTP，然后再转换成糖核苷酸， 进行再循环的受体糖的岩藻糖基化化合物的制造方法(图5和图6)。
(5)在用甘露糖基转移酶从糖核苷酸和受体糖制造该受体糖的甘露糖基化 化合物的同时，将在该反应中生成的NDP转换成NTP，然后再转换成糖核苷酸， 进行再循环的受体糖的甘露糖基化化合物的制造方法(图7)。
(6)在用N-乙酰氨基葡糖基转移酶从糖核苷酸和受体糖制造该受体糖的 N-乙酰氨基葡糖基化化合物的同时，将在该反应中生成的NDP转换成NTP， 然后再转换成糖核苷酸，进行再循环的受体糖的N-乙酰氨基葡糖基化化合物的 制造方法(图8)。
(7)在用N-乙酰氨基半乳糖基转移酶从糖核苷酸和受体糖制造该受体糖 的N-乙酰氨基半乳糖基化化合物的同时，将在该反应中生成的NDP转换成 NTP，然后再转换成糖核苷酸，进行再循环的受体糖的N-乙酰氨基半乳糖基化 化合物的制造方法(图9)。
此外，上述(6)和(7)的合成系也可通过NDP-Gal NAc4-差向异构酶与 NDP-Gal NAc的反应，生成NDP-Glc NAc而同时进行(参见图8和图9)。
(8)在用唾液酸转移酶从糖核苷酸和受体糖制造该受体糖的唾液酸基化化 合物的同时，将在该反应中生成的NDP转换成NTP，然后再转换成糖核苷酸， 进行再循环的受体糖的唾液酸基化化合物的制造方法(图10)。
在上述合成系中，酶的使用形式与上述多磷酸激酶同样，可以是微生物菌体、 酶制剂等。此外，本发明合成系中的最佳反应条件可在公知范围内，根据最终产 物的葡糖基化生成物进行适当的小规模试验作出决定。
具体地说，NDP-糖焦磷酸化酶、葡糖基转移酶、多磷酸激酶等各种酶可在 0.0001～100.0单位/ml，最好在0.001～10.0单位/ml的范围内进行适当地选择。 此外，NTP、糖1-磷酸、受体糖、多磷酸等底物可在0.01-1000mM，最好 在1～200mM的范围内进行适当地设定。合成反应可通过往pH在3～10范围 内的适当的缓冲液中加入各种酶和底物，在30℃以上，最好在32～37℃反应1～ 100小时而进行，反应时可根据需要同时进行搅拌。
由上述反应得到的葡糖基化生成物可用公知的方法(各种柱层析法)进行分 离纯化。
实施例
下面结合实施例对本发明作具体说明，但本发明并不限于这些实施例。实施 例中DNA的制备、用限制酶进行的酶切、用T4DNA连接酶进行的DNA连接及 大肠杆菌的转化均按《(Molecular Cloning》(Maniatis等编，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York(1982))中所述的方法进行。此外，限 制酶、AmpliTaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶由日本宝酒造株式会社购得。反 应液中核苷酸类的定量是用HPLC法进行的。具体地说，分离是通过使用YMC 公司的ODS-AQ312柱，以0.5M磷酸二氢钾溶液为洗脱液进行的。 实施例1：用多磷酸激酶合成NTP
(1)大肠杆菌多磷酸激酶基因的克隆
用齐藤和三浦的方法(Biochim.Biophys.Acta.,72,619(1963))制备大肠杆菌 K12株JM109菌(宝酒造株式会社产品)的染色体DNA。以该DNA为模板，用 常法合成下面二种引物DNA，用PCR法扩增大肠杆菌多磷酸激酶(ppk)。
引物(A)：5＇-TACCATGGGTCAGGAAAAGCTATA-3＇
引物(B)：5＇-ATGGATCCTTATTCAGGTTGTTCGAGTGA-3＇
ppk基因的PCR扩增通过用Perkin-Elmer Cetus Instrument公司的DNA热循 环仪循环处理反应液25次来进行，所述反应液(100μl)由50mM氯化钾、10mM Tris-盐酸(pH8.3)、1.5mM氯化镁、0.001％明胶、模板DNA 0.1μg、引物 DNA(A)和(B)各0.2μM、AmpliTaqDNA聚合酶2.5单位组成，各热循环 由热变性(94℃,1分钟)、退火(55℃,1.5分钟)、聚合(72℃,1.5分 钟)组成。
基因扩增后，用酚/氯仿(1∶1)混合液处理反应液，往水溶性部分中加入 2倍体积的乙醇，沉淀出DNA。按文献(《Molecular Cloning》，见上)的方 法通过琼脂糖凝胶电泳对回收的DNA沉淀物进行分离，纯化出1.9kb的DNA片 段。将该DNA用限制酶NcoⅠ和BamHⅠ酶切，用T4DNA连接酶将其与用相同的 限制酶NcoⅠ和BamHⅠ消化过的质粒pTrc99A(Pharmacia Biotech公司产品)连 接。用连接反应液转化大肠杆菌JM109菌，从所得的耐氨苄西林转化体中分离出 质粒pTrc-PPK。pTrc-PPK是在pTrc99A的trc启动子下游的NcoⅠ-BamHⅠ酶切 部位中插入了含大肠杆菌ppk基因的NcoⅠ-BamHⅠDNA片段的产物。
(2)大肠杆菌多磷酸激酶的制备
将包含质粒pTrc-PPK的大肠杆菌JM109菌接种在含100μg/ml氨苄西林的2 ×YT培养基300ml中，在37℃振荡培养。当培养物达到4×108菌/ml时，添 加IPTG，使其在培养液中的终浓度为1mM，再在30℃进行振荡培养5小时。 培养结束后，通过离心分离(9,000×g,10分钟)回收菌体，然后将其悬浮在 60ml缓冲液(50mM Tris-盐酸(pH7.5)、5mMEDTA、0.1％Triton X-100、 0.2mg/ml溶菌酶)中。在37℃保温1小时后，进行超声波处理，将菌体破碎， 再进行离心分离(20,000×g,10分钟)，除去菌体残渣。
将如此制得的上清部分在含5mM氯化镁和1mM 2-巯基乙醇的50mM Tris- 盐酸(pH7.8)中进行透析，得到粗制酶试样。粗制酶试样中多磷酸激酶比活性 为0.19单位/mg蛋白，是对照菌(包含pTrc99A的大肠杆菌JM109菌)的比活性 (0.00018单位/mg蛋白)的约1000倍。还有，按秋山等的方法(J.Biol.Chem., 267,22556-22561(1992))通过电泳将多磷酸激酶纯化至均一物质，将其作为纯化 酶试样。其比活性为0.7单位/mg蛋白。
本发明中多磷酸激酶活性的单位按以下方法测定、算出。
往含5mM氯化镁、100mM硫酸铵、5mM ADP和多磷酸(以无机磷酸计， 为150mM)的25mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.8)中加入酶试样，保温于37℃进 行反应，通过在100℃热处理1分钟使反应停止。用高压液相色谱法(HPLC) 对反应液中的ATP进行定量，将1分钟内在37℃生成1微摩尔ATP的活性作为 1个单位。
(3)NTP的合成Ⅰ
往含10mM氯化镁、100mM硫酸铵、多磷酸(以无机磷酸计，为50mM) 和5mM NTP(ADP、CDP、GDP、UDP、IDP)的25mM Tris-盐酸缓冲液 (pH7.8)中加入多磷酸激酶的纯化酶试样0.01单位/ml，在37℃反应18小时。 结果见表1。
                               表1
生成物：NTP(mM)
底物：NDP(mM)   添加多磷酸   未添加多磷酸
  ADP(5.0)      ATP(1.01)    ATP(0)
  CDP(5.0)      CTP(0.13)    CTP(0)
  GDP(5.0)      GTP(0.19)    GTP(0)
  UDP(5.0)      UTP(0.09)    UTP(0)
  IDP(5.0)      ITP(0.76)    ITP(0)
(4)NTP的合成Ⅱ
往含10mM氯化镁、100mM硫酸铵、多磷酸(以无机磷酸计，为50mM) 和25mM NDP(ADP、CDP、GDP、UDP)的100mM Tris-盐酸缓冲液 (pH7.8)中加入多磷酸激酶的纯化酶试样0.17单位/ml，在37℃反应16小时。 结果见表2。
                    表2
底物：NDP(mM)    生成物：NTP(mM)
    ADP(25.0)    ATP(12.2)
    CDP(25.0)    CTP(5.63)
    GDP(25.0)    GTP(10.8)
        UDP(25.0)    UTP(12.3)
(5)大肠杆菌多磷酸激酶的多磷酸合成(NDP生成)活性
将从底物NTP合成多磷酸(即上述实施例的逆反应)的活性以NDP的生成 作为指标进行解析。即，往含10mM氯化镁、100mM硫酸铵和5mM NDP (ATP、CTP、GTP、UTP)的25mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.8)中加入多磷 酸激酶的粗制酶试样0.01单位/ml，在37℃温育18小时。
用HPLC解析所得反应液，结果见表3。表3清楚地表明，在本反应条件下 来发现以ATP以外的NTP为底物的多磷酸合成。
                表3
底物：NTP(mM)     生成物：NDP(mM)
      ATP(5.0)    ADP(1.58)
      CTP(5.0)    CDP(＜0.01)
      GTP(5.0)    GDP(＜0.01)
      UTP(5.0)    UDP(＜0.01) 实施例2：用多磷酸激酶从UDP合成UDP-葡萄糖(UDPG)
(1)大肠杆菌UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆
用齐藤和三浦的方法(Biochim.Biophys.Acta.,72,619(1963))制备大肠杆菌 K12株JM109菌(宝酒造株式会社产品)的染色体DNA。以该DNA为模板，用 常法合成下面二种引物DNA，用PCR法扩增大肠杆菌UDP-葡萄糖焦磷酸化酶 (galU)基因(Weissborn等，J.Bacteriol.,176,2611(1994))。
引物(C)：5＇-GCGAATTCTGATATACTGGGATGCGATAC-3＇
引物(B)：5＇-ACGTCGACACCGATACGGATGTATCTT-3＇
galU基因的PCR扩增通过用Perkin-Elmer Cetus Instrument公司的DNA热循 环仪循环处理反应液25次来进行，所述反应液(100μl)由50mM氯化钾、10mM Tris-盐酸(pH8.3)、1.5mM氯化镁、0.001％明胶、模板DNA 0.1μg、引物(C) 和(D)各0.2μM、AmpliTaqDNA聚合酶2.5单位组成，各热循环由热变性(94 ℃,1分钟)、退火(55℃,1.5分钟)、聚合(72℃,1.5分钟)组成。
基因扩增后，用酚/氯仿(1∶1)混合液处理反应液，往水溶性部分中加入 2倍体积的乙醇，沉淀出DNA。按文献(《Molecular Cloning》，见上)的方 法通过琼脂糖凝胶电泳对回收的DNA沉淀物进行分离，纯化出1.0kb的DNA片 段。将该DNA用限制酶EcoRⅠ和SalⅠ酶切，用T4DNA连接酶将其与用相同的 限制酶EcoRⅠ和SalⅠ消化过的质粒pTrc99A(Pharmacia Biotech公司产品)连 接。用连接反应液转化大肠杆菌JM109菌，从所得的耐氨苄西林转化体中分离出 质粒pTrc-galU。pTrc-galU是在pTrc99A的trc启动子下游的EcoRⅠ-SalⅠ酶切部 位中插入了含大肠杆菌galU基因的EcoRⅠ-SalⅠDNA片段的产物。
(2)大肠杆菌UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的制备
将包含质粒pTrc-galU的大肠杆菌JM109菌接种在含100μg/ml氨苄西林的2 ×YT培养基300ml中，在37℃振荡培养。当培养物达到4×108菌/ml时，添 加IPTG，使其在培养液中的终浓度为1mM，再在37℃继续振荡培养2.5小时。
培养结束后，通过离心分离(9,000×g,10分钟)回收菌体，然后将其悬 浮在60ml缓冲液(50mM Tris-盐酸(pH7.5)、5mM EDTA、0.1％Triton X -100、0.2mg/ml溶菌酶)中。在37℃保温1小时后，进行超声波处理，将菌 体破碎，再进行离心分离(20,000×g,10分钟)，除去菌体残渣。将如此制 得的上清部分作为酶试样。酶试样中UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的活性与对照菌(包 含pTrc99A的大肠杆菌JM109菌)一起列在下面的表中。
             表4
菌    株       UDP-葡萄糖焦磷酸化酶活性
JM109/pTrc99A    ＜0.5(单位/mg蛋白)
JM109/pTrc-galU    20.4
UDP-葡萄糖焦磷酸化酶活性的单位按以下方法测定、算出。即，往含5mM 氯化镁、6mMUTP和6mM葡萄糖1-磷酸的50mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.0) 中加入酶试样，保温于37℃进行反应，通过在100℃热处理5分钟使酶失活。 用HPLC法对反应液中的UDPG进行定量，将1分钟内在37℃生成1微摩尔UDPG 的活性作为1个单位。
(3)UDPG的合成
往含100mM硫酸铵、10mM氯化镁、20mMUDP、30mM葡萄糖1-磷酸 和多磷酸(以无机磷酸计，为50mM)的100mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.8)中 分别加入大肠杆菌多磷酸激酶粗制酶试样(0.17单位/ml)和大肠杆菌UDPG焦 磷酸化酶的酶试样(2.0单位/ml)，在37℃保温。反应7.5小时后，用HPLC 法对反应液中的UDPG进行定量，确认有5.5mM的UDPG生成。此外，反应24 小时后，确认有10.1mM的UDPG生成。而未在上述反应液中添加多磷酸的对照 组在反应7.5小时和24小时后其UDPG的生成分别为0.23mM和0.20mM。 实施例3：寡糖的合成
(1)大肠杆菌UDP-半乳糖4-差向异构酶基因(galE)的克隆
用齐藤和三浦的方法(Biochim.Biophys.Acta.,72,619(1963))制备大肠杆菌 K12株JM109菌(宝酒造株式会社产品)的染色体DNA。以该DNA为模板，用 常法合成下面二种引物DNA，用PCR法扩增大肠杆菌UDP-半乳糖4-差向异 构酶(galE)基因。
引物(E)：5＇-TAGAATTCATACCATAAGCCTAATGGA-3＇
引物(F)：5＇-TAGGATCCTTAATCGGGATATCCCTGT-3＇
galE基因的PCR扩增通过用Perkin-Elmer Cetus Instrument公司的DNA热循 环仪循环处理反应液25次来进行，所述反应液(100μl)由50mM氯化钾、10mM Tris-盐酸(pH8.3)、1.5mM氯化镁、0.001％明胶、模板DNA 0.1μg、引物 DNA(E)和(F)各0.2μM、AmpliTaqDNA聚合酶2.5单位组成，各热循环 由热变性(94℃,1分钟)、退火(55℃,1.5分钟)、聚合(72℃,1.5分 钟)组成。
基因扩增后，用酚/氯仿(1∶1)混合液处理反应液，往水溶性部分中加入 2倍体积的乙醇，沉淀出DNA。按文献(《Molecular Cloning》，见上)的方 法通过琼脂糖凝胶电泳对回收的DNA沉淀物进行分离，纯化出1.0kb的DNA片 段。将该DNA用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，用T4DNA连接酶将其与用相同 的限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ消化过的质粒pTrc99A(Pharmacia Biotech公司产品) 连接。用连接反应液转化大肠杆菌JM109菌，从所得的耐氨苄西林转化体中分离 出质粒pTrc-galE。pTrc-galE是在pTrc99A的trc启动子下游的EcoRⅠ-BamHⅠ酶 切部位中插入了含大肠杆菌galE基因的EcoRⅠ-BamHⅠDNA片段的产物。
(2)大肠杆菌UDP-半乳糖4-差向异构酶的制备
将包含质粒pTrc-galE的大肠杆菌JM109菌接种在含100μg/ml氨苄西林的2 ×YT培养基300ml中，在37℃振荡培养。当培养物达到4×108菌/ml时，添 加IPTG，使其在培养液中的终浓度为1mM，再在37℃继续振荡培养5小时。 培养结束后，通过离心分离(9,000×g,10分钟)回收菌体，然后将其悬浮在 60ml缓冲液(50mM Tris-盐酸(pH7.5)、5mM EDTA、0.2mg/ml溶菌酶)中。 在0℃保温20分钟后，进行超声波处理，将菌体破碎，再进行离心分离(20,000 ×g,10分钟)，除去菌体残渣。
将如此制得的上清部分作为粗制酶试样。粗制酶试样中UDP-半乳糖4-差向 异构酶的比活性为26.6单位/mg蛋白，为对照菌(包含pTrc99A的大肠杆菌JM109 菌)的比活性(0.011单位/mg蛋白)的约2400倍。
在本发明中，UDP-半乳糖4-差向异构酶活性的单位按以下方法测定、算 出。即，将在含10mMUDP-葡萄糖的40mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.8)中，于1 分钟内在37℃生成1微摩尔UDP-半乳糖的活性作为1个单位。
(3)乳糖(Gal(β1-4)Glc)的合成(参见图11)
往含10mM氯化镁、10mM氯化锰、20mM葡萄糖、4mM UTP、30mM葡 萄糖1-磷酸和0.2mg/mlα-乳白蛋白的25mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.8)中加 入多磷酸，使其浓度达到150mM(以磷酸计)，再加入0.5单位/ml来源于牛奶 的半乳糖基转移酶(Sigma公司产品)、1.0单位/ml UDP-半乳糖焦磷酸化酶、 1.0单位/ml UDP-半乳糖4-差向异构酶、0.1单位/ml多磷酸激酶，在37℃保温 20小时。用糖分析装置(Dionex公司产品)对反应液进行了分析，确认有12.4mM 的乳糖生成。
(4)N-乙酰乳糖胺(Gal(β1-4)GlcNAc)的合成(参见图12)
往含10mM氯化镁、10mM氯化锰、20mMN-乙酰葡糖胺、4mM UTP、 30mM葡萄糖1-磷酸的25mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.8)中加入多磷酸，使其 浓度达到150mM(以磷酸计)，再加入0.5单位/ml来源于牛奶的半乳糖基转移 酶(Sigma公司产品)、1.0单位/ml UDP-半乳糖焦磷酸化酶、1.0单位/ml UDP- 半乳糖4-差向异构酶、0.1单位/ml多磷酸激酶，在37℃保温20小时。用糖分 析装置(Dionex公司产品)对反应液进行了分析，确认有13.6mM的N-乙酰 乳糖胺生成。
产业上应用的可能性
根据本发明，可简便且低成本地用酶从NDP合成NTP。此外，还可在与糖 核苷酸合成等组合的寡糖的酶合成系中无需在从NDP再生或转换成NTP的反应 中使用昂贵的烯醇丙酮酸磷酸或ATP等，从而可低成本地再循环合成糖核苷酸和 与其相关的寡糖。