代谢途径产物的生成方法 |
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| 申请号 | CN201380037848.5 | 申请日 | 2013-07-17 | 公开(公告)号 | CN104540935A | 公开(公告)日 | 2015-04-22 |
| 申请人 | 耶达研究及发展有限公司; | 发明人 | 龙·米洛; 利奥尔·泽尔布施; 尼瓦·安东诺夫斯基; | ||||
| 摘要 | 公开了多种编码虾青素途径的酶的分离多聚核苷酸序列。所述多聚核苷酸包括：(i)编码八氢番茄红素脱氢酶(crtI)的多聚核苷酸和第一转录 调控序列 ；(ii)编码β-番茄红素环化酶(lcy-B)的多聚核苷酸和第二转录调控序列；(iii)编码β-胡萝卜素 酮 化酶(crtW)的多聚核苷酸和第三转录调控序列；并且其中选择所述第一、第二和第三调控序列，以致所述lcy-B和所述crtW的表达高于所述crtI的表达 水 平。还公开了使用所述多种多聚核苷酸生成虾青素的方法以及含高水平虾青素的细菌细胞。 | ||||||
| 权利要求 | 1.编码虾青素途径的酶的多种分离多聚核苷酸序列，其包含： |
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| 说明书全文 | 代谢途径产物的生成方法[0001] 技术领域和发明背景 [0002] 本发明在其一些实施方案中，涉及生成代谢途径产物例如虾青素的生物技术方法。 [0003] 细菌中的天然蛋白质丰度跨5个数量级。蛋白质表达水平的平衡处于天然生物系统正常运行的核心并且往往对于代谢工程成果至关重要。虽然对细胞内蛋白质水平的操纵，例如强烈的过表达和低表达，广泛用于阐明生物系统的功能，但是平行微调许多基因的水平的能力则是主要突出的挑战。与天然生物系统相反，选择在进化期间平衡蛋白质水平时，合成系统的表达可导致蛋白质浓度不平衡。因此，合成途径在首次引入时很少发挥最佳作用并且必须微调酶水平。 [0004] 图15A基于两步代谢途径模型示意性描绘了与酶浓度不平衡相关的主要挑战。首先，酶低表达可限制途径流量并因此限制产物合成速率(蓝色区域)。另一个极端，过度表达可能引起蛋白质负担，导致限制生长的细胞资源耗尽(紫色区域)。最后，酶生成和消耗中间代谢产物之间的不平衡可导致代谢瓶颈和高浓度的潜在毒性途径中间产物(绿色区域)。 [0005] 控制细胞内蛋白质丰度的方法包括改变启动子K.Hammer,I.Mijakovic,P.R.Jensen,Synthetic promoter libraries–tuning of gene expression,Trends inBiotechnology 24,53-55(2006)]或核糖体结合位点(RBS)[H.M.Salis,E.A.Mirsky,C.A.Voigt,Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression,Nat Biotechnol 27,946-950(2009)；H.H.Wang 等，Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution,Nature460,894-898(2009)]序列，调节转录产物的稳定性和改变成熟蛋白质的降解速率。 [0006] 类胡萝卜素，例如虾青素为天然色素，是造成活体中所见黄色、橙色和红色的原因。类胡萝卜素在自然界中广泛分布并且在不同生命系统中，具有两种主要生物功能：它们在光合作用中用作捕光色素，并且它们防御光氧化损伤。 [0007] 虾青素是最昂贵的商业用类胡萝卜素化合物(现今的市场价值高于3,500$/kg)。其主要在各种水生动物中用作提供色素沉着的营养补充剂。在远东，还用于饲养家禽以引起鸡的典型色素沉着。对于食品行业也是可取且有效的无毒色素并且在化妆品中有价值。 最近，报道称虾青素是人类中的有效抗氧化剂并且因此是可取的食品添加剂。 [0008] 虽然虾青素在各种细菌、真菌和藻类中合成，但是对生物系统用于其生成的关键限制是其产量低。低产量的其中一个原因是虾青素途径复杂，由此为了有效表达，必须在细胞中表达所述途径的7个基因。微调这些基因中每一个的表达量对于优化虾青素表达是不可缺少的。 [0009] Lemuth等，[Microbial Cell Factories 10,29,2011]教导了虾青素在大肠杆菌(E.coli)中的表达。 [0010] Salis等，Nature Biotechnology，2009年第27卷No.10，第946-950页，教导了核糖体结合位点的序列。 [0011] 美国专利申请No.20120015849教导了创建包括人工启动子库和/或经修饰核糖体结合位点库的DNA文库和用所述文库转化细菌宿主细胞以获得对于目标染色体基因而言有一系列表达水平的一群细菌克隆的方法。 发明内容[0012] 根据本发明一些实施方案的一方面，提供了多种编码虾青素途径的酶的分离多聚核苷酸序列，其包含： [0013] (i)编码八氢番茄红素脱氢酶(crtI)的多聚核苷酸和第一转录调控序列； [0014] (ii)编码β-番茄红素环化酶(lcy-B)的多聚核苷酸和第二转录调控序列； [0015] (iii)编码β-胡萝卜素酮化酶(crtW)的多聚核苷酸和第三转录调控序列；并且[0016] 其中选择所述第一、第二和第三调控序列，以致所述lcy-B和所述crtW的表达高于所述crtI的表达水平。 [0017] 根据本发明一些实施方案的一方面，提供了包含多于2mg/g细胞干重的虾青素的细菌细胞。 [0018] 根据本发明一些实施方案的一方面，提供了包含多于5mg/g细胞干重的虾青素的细菌细胞。 [0019] 根据本发明一些实施方案的一方面，提供了一种生成虾青素的方法，包括表达编码虾青素途径的酶的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包含： [0020] (i)编码八氢番茄红素脱氢酶(crtI)的多聚核苷酸和第一转录调控序列； [0021] (ii)编码β-番茄红素环化酶(lcy-B)的多聚核苷酸和第二转录调控序列； [0022] (iii)编码β-胡萝卜素酮化酶(crtW)的多聚核苷酸和第三转录调控序列；并且[0023] 其中选择所述第一、第二和第三调控序列，以致所述lcy-B和所述crtW的表达高于所述crtI的表达水平。 [0024] 根据本发明一些实施方案的一方面，提供了一种生成虾青素的方法，包括表达编码虾青素途径的酶的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包含： [0025] (i)编码异戊烯焦磷酸(idi)的多聚核苷酸和第一转录调控序列； [0026] (ii)编码牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸合成酶(crtE)的多聚核苷酸和第二转录调控序列； [0027] (iii)编码前八氢番茄红素焦磷酸合成酶(crtB)的多聚核苷酸和第三转录调控序列； [0028] (iv)编码八氢番茄红素脱氢酶(crtI)的多聚核苷酸和第四转录调控序列； [0029] (v)编码β-番茄红素环化酶(lcy-B)的多聚核苷酸和第五转录调控序列； [0030] (vi)编码β-胡萝卜素酮化酶(crtW)的多聚核苷酸和第六转录调控序列；和[0031] (vii)编码β-胡萝卜素羟化酶(crtZ)的多聚核苷酸和第七转录调控序列，[0032] 其中选择所述第四、第五和第六调控序列，以致所述lcy-B和所述crtW的表达高于所述crtI的表达水平。 [0033] 根据本发明一些实施方案的一方面，提供了多种编码虾青素途径的酶的分离多聚核苷酸序列，其包含： [0034] (i)编码异戊烯焦磷酸(idi)的多聚核苷酸和第一转录调控序列； [0035] (ii)编码牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸合成酶(crtE)的多聚核苷酸和第二转录调控序列； [0036] (iii)编码前八氢番茄红素焦磷酸合成酶(crtB)的多聚核苷酸和第三转录调控序列； [0037] (iv)编码八氢番茄红素脱氢酶(crtI)的多聚核苷酸和第四转录调控序列； [0038] (v)编码β-番茄红素环化酶(lcy-B)的多聚核苷酸和第五转录调控序列； [0039] (vi)编码β-胡萝卜素酮化酶(crtW)的多聚核苷酸和第六转录调控序列；和[0040] (vii)编码β-胡萝卜素羟化酶(crtZ)的多聚核苷酸和第七转录调控序列，[0041] 其中选择所述第四、第五和第六调控序列，以致所述lcy-B和所述crtW的表达高于所述crtI的表达水平。 [0042] 根据本发明的一些实施方案，所述多种分离多聚核苷酸序列进一步包含以下至少一种： [0043] (iv)编码异戊烯焦磷酸(idi)的多聚核苷酸和第四转录调控序列；或[0044] (v)编码牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸合成酶(crtE)的多聚核苷酸和第五转录调控序列；或 [0045] (vi)编码前八氢番茄红素焦磷酸合成酶(crtB)的多聚核苷酸和第六转录调控序列；或 [0046] (vii)编码β-胡萝卜素羟化酶(crtZ)的多聚核苷酸和第七转录调控序列。 [0047] 根据本发明的一些实施方案，所述第一调控序列、所述第二调控序列和所述第三调控序列的每一个均为核糖体结合位点(RBS)。 [0048] 根据本发明一些实施方案的一方面，第一调控序列、第二调控序列和第三调控序列的每一个均为启动子。 [0049] 根据本发明的一些实施方案，选择第一调控序列、第二调控序列和第三调控序列，以致所述lcy-B和所述crtW的表达比所述crtI的表达水平高至少10倍。 [0050] 根据本发明的一些实施方案，选择(i)的RBS序列，以致使所述crtI的表达达到具有如SEQ ID NO:4、5、6或7中所列序列的RBS至少80％的程度； [0051] 其中选择(ii)的RBS序列，以致使所述lcy-B的表达达到具有如SEQ ID NO:2或3中所列序列的RBS至少80％的程度； [0052] 其中选择(iii)的RBS序列，以致使所述crtW的表达达到具有如SEQ ID NO:2或3中所列序列的RBS至少80％的程度。 [0053] 根据本发明的一些实施方案，选择(iv)的RBS序列，以致使所述crtI的表达达到具有如SEQ ID NO:4、5、6或7中所列序列的RBS至少80％的程度； [0054] 其中选择(v)的RBS序列，以致使所述lcy-B的表达达到具有如SEQ ID NO:2或3中所列序列的RBS至少80％的程度； [0055] 其中选择(vi)的RBS序列，以致使所述crtW的表达达到具有如SEQ ID NO:2或3中所列序列的RBS至少80％的程度。 [0056] 根据本发明的一些实施方案，选择(i)的RBS序列，以致使所述idi的表达达到具有如SEQ ID NO:5中所列序列的RBS至少80％的程度； [0057] 其中选择(ii)的RBS序列，以致使所述crtE的表达达到具有如SEQ ID NO:5中所列序列的RBS至少80％的程度； [0058] 其中选择(iii)的RBS序列，以致使所述crtB的表达达到具有如SEQ ID NO:3中所列序列的RBS至少80％的程度； [0059] 其中选择(iv)的RBS序列，以致使所述crtI的表达达到具有如SEQ ID NO:7中所列序列的RBS至少80％的程度； [0060] 其中选择(v)的RBS序列，以致使所述lcy-B的表达达到具有如SEQ ID NO:2中所列序列的RBS至少80％的程度； [0061] 其中选择(v)的RBS序列，以致使所述crtW的表达达到具有如SEQ ID NO:3中所列序列的RBS至少80％的程度；并且 [0062] 其中选择(vi)的RBS序列，以致使所述crtZ的表达达到具有如SEQ ID NO:6中所列序列的RBS至少80％的程度。 [0063] 根据本发明的一些实施方案，选择(i)的RBS序列，以致使所述idi的表达达到具有如SEQ ID NO:6中所列序列的RBS至少80％的程度； [0064] 其中选择(ii)的RBS序列，以致使所述crtE的表达达到具有如SEQ ID NO:3中所列序列的RBS至少80％的程度； [0065] 其中选择(iii)的RBS序列，以致使所述crtB的表达达到具有如SEQ ID NO:7中所列序列的RBS至少80％的程度； [0066] 其中选择(iv)的RBS序列，以致使所述crtI的表达达到具有如SEQ ID NO:5中所列序列的RBS至少80％的程度； [0067] 其中选择(v)的RBS序列，以致使所述lcy-B的表达达到具有如SEQ ID NO:2中所列序列的RBS至少80％的程度； [0068] 其中选择(v)的RBS序列，以致使所述crtW的表达达到具有如SEQ ID NO:2中所列序列的RBS至少80％的程度；并且 [0069] 其中选择(vi)的RBS序列，以致使所述crtZ的表达达到具有如SEQ ID NO:2中所列序列的RBS至少80％的程度。 [0070] 根据本发明的一些实施方案，所述多种多聚核苷酸序列进一步包含： [0071] (viii)编码脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)的多聚核苷酸和第八转录调控序列。 [0072] 根据本发明的一些实施方案，选择第八转录调控序列，以致使所述DXS的表达达到具有如SEQ ID NO:6中所列序列的RBS至少80％的程度。 [0073] 根据本发明的一些实施方案，所述多种多聚核苷酸序列包含在单个表达载体中。 [0074] 根据本发明的一些实施方案，所述多种多聚核苷酸序列包含在多个表达载体中。 [0075] 根据本发明的一些实施方案，每个RBS侧面为间隔序列。 [0076] 根据本发明的一些实施方案，在每个RBS上游的间隔序列与如SEQ ID NO:8中所列序列至少80％同源。 [0077] 根据本发明的一些实施方案，在每个RBS上游的间隔区与如SEQ ID NO:9中所列序列至少80％同源。 [0078] 根据本发明的一些实施方案，细菌细胞为大肠杆菌细胞。 [0079] 根据本发明的一些实施方案，虾青素在细菌细胞内的内含体中表达。 [0080] 根据本发明的一些实施方案，细菌细胞经遗传修饰。 [0081] 根据本发明的一些实施方案，细菌细胞表达本发明的多种多聚核苷酸。根据本发明的一些实施方案，第一调控序列、第二调控序列、第三调控序列、第四调控序列、第五调控序列、第六调控序列和第七调控序列的每一个均为RBS。 [0082] 根据本发明的一些实施方案，选择调控序列，以致lcy-B和crtW的表达比crtI的表达水平高至少10倍。 [0083] 根据本发明的一些实施方案，选择(iv)的RBS序列，以致使所述crtI的表达达到具有如SEQ ID NO:4、5、6或7中所列序列的RBS至少80％的程度； [0084] 其中选择(v)的RBS序列，以致使所述lcy-B的表达达到具有如SEQ ID NO:2或3中所列序列的RBS至少80％的程度； [0085] 其中选择(vi)的RBS序列，以致使所述crtW的表达达到具有如SEQ ID NO:2或3中所列序列的RBS至少80％的程度。 [0086] 根据本发明的一些实施方案，选择(i)的RBS序列，以致使所述idi的表达达到具有如SEQ ID NO:5中所列序列的RBS至少80％的程度； [0087] 其中选择(ii)的RBS序列，以致使所述crtE的表达达到具有如SEQ ID NO:5中所列序列的RBS至少80％的程度； [0088] 其中选择(iii)的RBS序列，以致使所述crtB的表达达到具有如SEQ ID NO:3中所列序列的RBS至少80％的程度； [0089] 其中选择(iv)的RBS序列，以致使所述crtI的表达达到具有如SEQ ID NO:7中所列序列的RBS至少80％的程度； [0090] 其中选择(v)的RBS序列，以致使所述lcy-B的表达达到具有如SEQ ID NO:2中所列序列的RBS至少80％的程度； [0091] 其中选择(vi)的RBS序列，以致使所述crtW的表达达到具有如SEQ ID NO:3中所列序列的RBS至少80％的程度；并且 [0092] 其中选择(vii)的RBS序列，以致使所述crtZ的表达达到具有如SEQ ID NO:6中所列序列的RBS至少80％的程度。 [0093] 根据本发明的一些实施方案，选择(i)的RBS序列，以致使所述idi的表达达到具有如SEQ ID NO:6中所列序列的RBS至少80％的程度； [0094] 其中选择(ii)的RBS序列，以致使所述crtE的表达达到具有如SEQ ID NO:3中所列序列的RBS至少80％的程度； [0095] 其中选择(iii)的RBS序列，以致使所述crtB的表达达到具有如SEQ ID NO:7中所列序列的RBS至少80％的程度； [0096] 其中选择(iv)的RBS序列，以致使所述crtI的表达达到具有如SEQ ID NO:5中所列序列的RBS至少80％的程度； [0097] 其中选择(v)的RBS序列，以致使所述lcy-B的表达达到具有如SEQ ID NO:2中所列序列的RBS至少80％的程度； [0098] 其中选择(vi)的RBS序列，以致使所述crtW的表达达到具有如SEQ ID NO:2中所列序列的RBS至少80％的程度；并且 [0099] 其中选择(vii)的RBS序列，以致使所述crtZ的表达达到具有如SEQ ID NO:2中所列序列的RBS至少80％的程度。 [0100] 根据本发明的一些实施方案，所述方法进一步包括向细胞内引入编码脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)的多聚核苷酸。 [0101] 根据本发明的一些实施方案，选择编码DXS的多聚核苷酸的RBS序列，以致使所述DXS的表达达到具有如SEQ ID NO:6中所列序列的RBS至少80％的程度。 [0102] 根据本发明的一些实施方案，表达在细菌细胞中实现。 [0103] 根据本发明的一些实施方案，每个RBS侧面为间隔序列。 [0104] 根据本发明的一些实施方案，每个RBS上游的间隔序列与如SEQ ID NO:8中所列序列至少80％同源。 [0105] 根据本发明的一些实施方案，每个RBS上游的间隔区与如SEQ ID NO:9中所列序列至少80％同源。 [0106] 根据本发明的一些实施方案，每个多聚核苷酸包含在单个表达载体上。 [0107] 根据本发明的一些实施方案，所述方法进一步包括在表达后分离虾青素。 [0108] 根据本发明一些实施方案的一方面，提供了一种分离多聚核苷酸，包含： [0109] (i)与第一种酶编码序列操作性连接的第一RBS； [0110] (ii)与第二种酶编码序列操作性连接的第二RBS；和 [0111] (iii)与第三种酶编码序列操作性连接的第三RBS； [0112] 其中选择第二RBS，以致第二种酶编码序列的表达水平高于第一种酶编码序列的表达水平； [0113] 其中选择第三RBS，以致第三种酶编码序列的表达水平高于第二种酶编码序列的表达水平； [0114] 其中第一种酶、第二种酶和第三种酶为不同酶类和相同目标产物的生物合成途径的各个部分。 [0115] 根据本发明的一些实施方案，分离多聚核苷酸进一步包含： [0116] (iv)与第四种酶编码序列操作性连接的第四RBS。 [0117] 根据本发明的一些实施方案，第四种酶与第一、第二和第三种酶不同并且是相同产物的生物合成途径的一部分。 [0118] 根据本发明的一些实施方案，分离多聚核苷酸进一步包含： [0119] (v)与第五种酶编码序列操作性连接的第五RBS。 [0120] 根据本发明的一些实施方案，第五种酶与第一、第二、第三和第四种酶不同并且是相同目标产物的生物合成途径的一部分。 [0121] 根据本发明的一些实施方案，分离多聚核苷酸进一步包含： [0122] (vi)与第六种酶编码序列操作性连接的第六RBS。 [0123] 根据本发明的一些实施方案，第六种酶与第一、第二、第三、第四和第五种酶不同并且是相同目标产物的生物合成途径的一部分。 [0124] 根据本发明的一些实施方案，每个RBS侧面为间隔序列。 [0125] 根据本发明的一些实施方案，每个RBS上游的间隔序列与如SEQ ID NO:8中所列序列至少80％同源。 [0126] 根据本发明的一些实施方案，每个RBS上游的间隔区与如SEQ ID NO:9中所列序列至少80％同源。 [0127] 根据本发明的一些实施方案，目标产物为蛋白质。 [0129] 根据本发明的一些实施方案，提供了一种选择多聚核苷酸序列合成最佳量的目标产物的方法，所述目标产物为包含至少3种酶的生物合成途径的产物，所述方法包括： [0130] (a)在允许于细胞内合成目标产物的条件下，将本文所述的多聚核苷酸引入细胞；并且 [0131] (b)测量目标产物的量，其中目标产物的量指示要选择的多聚核苷酸序列。 [0133] 除非另有定义，本文使用的所有技术和/或科学术语具有本发明所属领域中技术人员通常所理解的相同含义。虽然与本文所述相似或等效的方法和材料可用于本发明的实践或试验，但是下面描述了示例性方法和/或材料。如有冲突，以专利说明书为准，包括定义。另外，材料、方法和实例仅为说明性而非旨在为必要限制性。附图说明 [0134] 本文仅以举例的方式，参考附图描述了本发明的一些实施方案。现详细地具体参考附图，强调所示细节是举例而言并且是为了说明性讨论本发明的实施方案。在这点上，连同附图一起所做的描述使得可如何实践本发明的实施方案对于本领域中的技术人员显而易见。 [0135] 图中： [0136] 图1说明了多基因构建体组合装配的模块化克隆策略。研发了通过直接选择正确装配的构建体消除假阳性克隆的方法。每个目标基因与侧面为NheI(‘N’)和PciI(‘P’)限制位点的氯霉素(chloramphenicol)(Cm)抗性盒接合。指定用于装配的序列含有上游SpeI(‘S’)限制位点。为将第一靶序列装配到载体中，先用SpeI和PciI消化DNA，接着进行连接和转化。将细胞接种于补充了Cm的选择性琼脂上。因为骨架载体不包括Cm抗性，所以只有恰当装配(即含有指定序列和抗性标记)的克隆将能够形成菌落。为并入下一靶序列，从细胞中提取出装配产物并用NheI和PciI消化，从构建体有效地去除了抗性标记。与第一靶序列一样，使用SpeI和PciI消化第二靶序列并装配到载体中。重要的是，NheI和SpeI限制位点的黏性末端相容并且连接在一起形成瘢痕，NheI或SpeI(‘x’)不可裂解的序列。第二轮装配后，如今新的构建体含有靶序列和Cm抗性，使得能够再次直接选择阳性构建体。可以重复这一系列的事件以装配多基因操纵子。 [0137] 图2说明了靶ORF的RBS调节。所需编码序列与抗性盒配对，然后装配到在插入位点上游含有RBS的载体上。条码和非条码装配依赖于相同基因座，但是由于技术原因在限制位点上不同。 [0138] 图3说明了pNiv骨架质粒。RRNB终止子位于多克隆位点上游，以将整个装配过程中的泄露表达减到最少。 [0139] 图4为隔离RBS单元设计的示意图。已经示出了侧翼序列的组成以影响指定RBS的表达水平。为了将这种次级效应减到最低，在RBS序列的上游和下游引物恒定间隔区和标签序列。 [0140] 图5说明了pSB4K5:Ptac-表达质粒。杂合Ptac启动子位于pSB4K5质粒骨架上，在多克隆位点上游。 [0141] 图6A-D为说明使用不同荧光蛋白和诱导条件对RBS组的流式细胞术荧光测量的图表。 [0142] 图7为比较预测RBS活性与实验荧光测量的图表。CFP(蓝色)、YFP(绿色)和mCherry(红色)报告基因各自与RBS序列(A-F，如字母所示)配对。x-轴表示每个序列的预测RBS活性，而y-轴表示测量的荧光水平。荧光水平经标准化，所以预测动态范围的中点-(预测最大-预测最小/2)-与实验测量的每个报告基因的动态范围中点-(测量最大-测量最小/2)相对应。 [0143] 图8说明了单管组合装配。在装配反应中使用pNiv:RBS质粒与6种不同RBS序列的等摩尔混合物。使靶编码序列与质粒混合物连接以产生6种不同产物，全部含有相同编码序列，但是位于其上游的RBS不同。 [0144] 图9说明了RBS调节基因的合成操纵子的装配。 [0145] 图10说明了具有条码RBS位点的合成操纵子的装配。在每个装配步骤，与新装配的RBS调节编码序列相对应的条码堆叠在操纵子的3’末端。 [0146] 图11说明了条码RBS混合物的单管组合装配。目标插入片段与pRBS-条码混合物连接，所得文库含有在其上游具有不同RBS序列的靶编码序列。 [0147] 图12为三色报告基因操纵子-质粒图谱。 [0148] 图13为说明了操纵子中第二基因(mCherry)对第一基因(YFP)的依赖性的图表。用颜色指示了控制mCherry的RBS序列(蓝色为RBS A，红色为RBS C，而绿色为RBS E)，并且控制YFP的RBS序列对应于形状(星号为RBS A，圆形为RBS B，三角形为RBS C，矩形为RBS D，十字形为RBS E，而星形为RBS F)。翻译偶联的作用显而易见，其中YFP的表达水平调节mCherry的表达。YFP和mCherry水平之间的依赖性对数等分向量上遵循线性趋势，斜率为～1/3。 [0149] 图14为类胡萝卜素生物合成操纵子-质粒图谱。 [0150] 图15A-D说明对于平衡的途径功能，需要调节酶表达水平。(A)使用基于可逆Michaelis–Menten动力学，由两种酶组成的简单量化模型描绘了酶表达不平衡的结果。只有以白色示出的酶浓度区间的一个小区域持续最优生成。(B)一小组的RBS序列跨蛋白质表达的7个数量级。采用6个预先表征的RBS序列并且与诱导型启动子下游的目标基因配对。 [0151] #8(RBS-A)：AGGAGGTTTGGA(SEQ ID NO:2) [0152] #1(RBS-B)：AACAAAATGAGGAGGTACTGAG(SEQ ID NO:3) [0153] #17(RBS-C)：AAGTTAAGAGGCAAGA(SEQ ID NO:4) [0154] #27(RBS-D)：TTCGCAGGGGGAAG(SEQ ID NO:5) [0155] #20(RBS-E)：TAAGCAGGACCGGCGGCG(SEQ ID NO:6) [0156] “失效-RBS”(RBS-F)：CACCATACACTG(SEQ ID NO:7) [0157] (C)与所述RBS序列组(15)配对的YFP的流式细胞术荧光测量。(D)多基因构建体组合装配的模块化克隆策略，其使得能够为装配部分编条码并直接选择正确装配的构建体。每个目标基因与氯霉素(Cm)抗性盒接合并且与RBS序列库配对。一旦第一基因装配到载体中，就选择恰当装配的克隆的Cm抗性。为插入下一个基因，去除标记并且将另一部分装配到载体中。新形成的构建体含有两个RBS修饰基因和抗性标记，使得能够再次直接选择阳性构建体。可重复这一系列步骤以简单地装配RBS调节多基因操纵子的组合文库。 [0158] 图16A-D说明3种荧光蛋白的RBS调节跨一个颜色空间。(A)CFP、YFP和mCherry组合性地与本组RBS的3个代表(序列‘A’、‘C’和‘E’)接合，并将基因装配在一起。所得操纵子库仅在调节基因表达的RBS序列上不同。(B)经操纵子库转化的大肠杆菌菌落的荧光显微成像。观察到的颜色表示分配给每种荧光蛋白的3种主要颜色的相加性组合。不规则的菌落形状是接触相邻菌落边界的结果。隐匿弱RBS的一些菌落呈黑色。插图：亮视野图像。(C)含三色RBS调节操纵子的大肠杆菌菌落的荧光成像。图像排列在3D网格上，其中在每根轴上的位置与荧光蛋白的RBS强度相对应。(D)从双色操纵子库取样的克隆的YFP和mCherry荧光水平。示出了通过条码测序测定的RBS组成(见支持的在线文本)。相同基因型(各自用不同颜色标记)在荧光空间中聚在一起。翻译偶联的作用也显而易见，其中YFP的表达水平调节mCherry的表达，高达半个数量级。 [0159] 图17A-C说明类胡萝卜素积聚图随生物合成基因的RBS序列改变。(A)生成了在调节类胡萝卜素生物合成途径的7个基因的每一个的RBS序列上不同的合成操纵子库。(B)经操纵子库转化的大肠杆菌菌落的双目显微镜成像。菌落的颜色与积聚的类胡萝卜素的组成相对应，各自具有特征颜色。(C)从转化文库取样的克隆的类胡萝卜素积聚图和RBS组成。通过测序测定每个取样克隆的RBS组成(条码中的RBS编码指图3A中所示基因的顺序)并且使用HPLC分析每个克隆的类胡萝卜素图。不同基因型产生不同表现型，即不同的类胡萝卜素积聚图。圆形区指示根据右侧描述的代谢途径(15)，类胡萝卜素中间产物的生成产量。 具体实施方式[0160] 本发明在一些实施方案中，涉及一种生成代谢途径的产物例如虾青素的生物技术方法。 [0161] 在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应理解本发明在其应用上不一定限于以下描述中列出或通过实施例例证的详情。本发明能够有其它实施方案或以各种方式实践或进行。 [0162] 调节重组酶的表达对于优化代谢途径必不可少。存在两种达到平衡表达水平的主要策略。合理设计牵涉计算或估计所述途径的每种组分的相对量和绝对量。然而，这些尝试往往受缺乏关于动力学、能量学和途径组分调节的足够信息而限制。可选地，基于调控元件随机诱变的策略可为表达空间取样并且筛选或选择所需表现型。然而，即使大量突变体也不确保表达空间的足够覆盖率：往往，绝大部分基因型聚集在一小部分表现型空间中。而且，随机诱变往往产生大文库，在其中筛选所需表现型可能有挑战性或甚至不可行。 [0163] 本发明人介绍了利于使用一组紧凑的调控元件探查表现型空间的策略。通过采用一小组表征清除的RBS序列调节合成操纵子中多个基因的表达，本发明人能够有效地为每根轴上跨几个数量级的多维表达空间取样。重要的是，RBS组的小尺寸限制了库中遗传变异体的数量并且使得能够快速筛选。 [0164] 通过调节类胡萝卜素生物合成中所涉基因的核糖体结合位点，本发明人证明途径代谢产物的积聚明显根据调节其组成酶的RBS序列变化。本发明人发现虾青素生物合成途径的组合装配导致产量比传统装配和选择方法增加4倍，从而例证了使用一小组经表征的调控元件为表达空间取样的强度。 [0165] 本文提出的策略可以各种方式扩展。具体地，其他调控元件可进一步调节基因表达。例如，通过采用小启动子库控制操纵子的转录，可使整体表达空间的跨度进一步增加几个数量级。 [0166] 为了测定最优生成代谢途径产物所需的代谢途径酶类的比例，本发明人已经生成了包含至少3个不同RBS序列的多聚核苷酸构建体，每个RBS具有不同强度。以不同排列将编码代谢途径相关酶类的序列引入该构建体中允许筛选最佳RBS-酶组合。 [0167] 因此，根据本发明的一方面，提供了一种分离多聚核苷酸，包含 [0168] (i)与第一种酶编码序列操作性连接的第一RBS； [0169] (ii)与第二种酶编码序列操作性连接的第二RBS；和 [0170] (iii)与第三种酶编码序列操作性连接的第三RBS； [0171] 其中选择所述第二RBS，以致第二种酶的表达水平高于第一种酶的表达水平； [0172] 其中选择所述第三RBS，以致第三种酶的表达水平高于第二种酶的表达水平； [0173] 其中第一种酶、第二种酶和第三种酶为不同酶类和相同目标产物的生物合成途径的各个部分。 [0174] 短语“一种分离多聚核苷酸”指呈RNA序列、互补多聚核苷酸序列(cDNA)、基因组多聚核苷酸序列和/或复合多聚核苷酸序列(例如，以上的组合)的形式，分离和提供的单链或双链核酸序列。 [0175] 如本文所使用，短语“互补多聚核苷酸序列”指使用逆转录酶或任何其他RNA依赖型DNA聚合酶，由信使RNA逆转录产生的序列。随后可使用DNA依赖型DNA聚合酶在体内或体外扩增这种序列。 [0176] 如本文所使用，短语“基因组多聚核苷酸序列”指源自(分离自)染色体的序列并且因此表示染色体的连续部分。 [0177] 如本文所使用，短语“复合多聚核苷酸序列”指至少部分互补并且至少部分为基因组的序列。复合序列可包括编码本发明多肽所需的一些外显子序列，以及置于之间的一些内含子序列。内含子序列可具有任何来源，包括其他基因，并且通常将包括保守剪接信号序列。这种内含子序列可进一步包括顺式作用表达调控元件。 [0178] “核糖体结合位点”(RBS)是通常包含约4-16个碱基对的短核苷酸序列并且通过将核糖体置于mRNA分子上起作用，以翻译编码的蛋白质。 [0179] 核酸当处于与另一核酸序列的功能关系中时“可操作地连接”。例如，如果启动子影响序列的转录；则其与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点如此定位以利于翻译，则其与编码序列可操作地连接。核酸序列的连接可通过连接在方便的限制位点实现。如果不存在这种位点，可根据常规实践，例如装配PCR，使用合成寡核苷酸适配子或接头。 [0180] 在以引用的方式并入本文的Salis等，Nature Biology，2009年第27卷No.10，第946-950页，包括其补充信息中，可找到示例性RBS的序列及其相对强度。优选地，将RBS选择为其强度不受下游序列影响的RBS。本文也公开了选择RBS相对强度的方法。例如，可通过将其连接到编码可检标记的多聚核苷酸序列并且在细胞中表达标记，测定RBS的相对强度。所述标记可为荧光蛋白、磷光蛋白或可使用抗体检测的任何蛋白。可检蛋白的量与RBS的强度相关联。 [0181] 例如，示例性RBS序列包括： [0182] (RBS-A)：AGGAGGTTTGGA(SEQ ID NO:2) [0183] (RBS-B)：AACAAAATGAGGAGGTACTGAG(SEQ ID NO:3) [0184] (RBS-C)：AAGTTAAGAGGCAAGA(SEQ ID NO:4) [0185] (RBS-D)：TTCGCAGGGGGAAG(SEQ ID NO:5) [0186] (RBS-E)：TAAGCAGGACCGGCGGCG(SEQ ID NO:6) [0187] (RBS-F)：CACCATACACTG(SEQ ID NO:7) [0188] 另外的RBS序列如下： [0189] AGGAAA、(SEQ ID NO.70)、AGAAAA(SEQ ID NO.71)、AGAAGA(SEQ ID NO.72)、AGGAGA(SEQ ID NO.73)、AAGAAGGAAA(SEQ ID NO.74)、AAGGAAAA(SEQ ID NO.75)、AAGGAAAG(SEQ ID NO.76)、AAGGAAAU(SEQ ID NO.77)、AAGGAAAAA(SEQ ID NO.78)、AAGGAAAAG(SEQ ID NO.79)、AAGGAAAAU(SEQ ID NO.80)、AAGGAAAAAA(SEQ ID NO.81)、AAGGAAAAAG(SEQ ID NO.82)、AAGGAAAAAU(SEQ ID NO.83)、AAGGAAAAAAA(SEQ ID NO.84)、AAGGAAAAAAG(SEQ ID NO.85)、AAGGAAAAAAU(SEQ ID NO.86)、AAGGAAAAAAAA(SEQ ID NO.87)、AAGGAAAAAAAG(SEQ ID NO.88)、AAGGAAAAAAAU(SEQ ID NO.89)、AAGGAAAAAAAAA(SEQ ID NO.90)、AAGGAAAAAAAAG(SEQ ID NO.91)、AAGGAAAAAAAAU(SEQ ID NO.92)、AAGGAAAAAAAAAA(SEQ ID NO.93)、AAGGAAAAAAAAAG(SEQ ID NO.94)、AAGGAGGAAA(SEQ ID NO.95)和AAGGAAAAAAAAAU(SEQ ID NO.96)。 [0190] 根据一个实施方案，第三RBS比第二RBS强至少2倍、3倍、5倍或甚至10倍。 [0191] 根据另一实施方案，第二RBS比第一RBS强至少2倍、3倍、5倍或甚至10倍。 [0192] 应认识到，根据特定代谢途径的酶的数量和根据在所用特定细胞系统中天然表达的酶的数量，多聚核苷酸可包含另外的RBS并且编码另外的酶。因此，分离多聚核苷酸可包含与代谢途径中存在的不同酶编码序列操作性连接的第四、第五或第六RBS。 [0193] 因为在转录调控元件(例如RBS)两侧的序列可影响表达水平，所以可将位于其上游和下游的间隔序列-10-50bp，例如约20bp的恒定序列，插入表达构建体中。 [0194] 如本文所使用，术语“间隔序列”指所讨论的序列上游或下游的任何序列(例如，对于基因A B C而言，基因B侧面为A和C基因序列)。在一些实施方案中，侧翼序列仅在DNA片段的单侧(3'或5')存在，但是在优选实施方案中，其在侧接序列的每一侧上。 [0195] 可置于RBS上游的示例性序列是与(SEQ ID NO:8)至少70％同源、至少80％同源、至少90％同源或100％同源的序列。可置于RBS下游的示例性序列是与(SEQ ID NO:9)至少70％同源、至少80％同源、至少90％同源或100％同源的序列。 [0196] 如上文所提及，本发明进一步考虑到将稳定mRNA序列插入表达构建体中。 [0197] “稳定mRNA”是用于影响基因表达的核酸序列插入片段。这些插入片段通常位于基因或核酸序列的转录和翻译起始位点之间。 [0198] 稳定mRNA序列在本领域中众所周知并且参考Carrier等(1999)Biotechnol.Prog.15:58-64。优选的mRNA稳定序列包括序列： [0199] GGTCGAGTTATCTCGAGTGAGATATTGTTGACG，(SEQ ID NO.97)；GGTGGACTTATCTCGAGTGAGATATTGTTGACG，(SEQ ID NO.98)；CCTCGAGTTATCTCGAGTGAGATATTGTTGACG，(SEQ ID NO.99)；GCTCGAGTTATCTCGAGTGAGATATTGTTGACG，(SEQ ID NO.100)；CGTCGAGTTATCTCGAGTGAGATATTGTTGACG，(SEQ ID NO.101)；GGTGGAGTTATCTCGAGTGAGATATTGTTGACG，(SEQ ID NO.102)和GCTGGACTTATCTCGAGTGAGATATTGTTGACG，(SEQ ID NO.103)。 [0200] 本发明的多聚核苷酸可包括附加序列(例如启动子)，以致它们可用作表达构建体。另外，多聚核苷酸可包括致使这种载体适于在原核生物、真核生物或优选在二者(例如，穿梭载体)中复制和整合的序列。如下文所述，典型的克隆载体含有转录和翻译起始序列(例如启动子、增强子)及转录和翻译终止子(例如多腺苷酸化信号)。 [0201] 根据一个实施方案，多聚核苷酸中的每个酶编码序列均与启动子操作性连接。在一个实施方案中，相同启动子控制多聚核苷酸中编码的每种酶的表达。根据另一实施方案，不同启动子控制多聚核苷酸中编码的酶的表达。 [0202] 下文描述了特定启动子的实例。 [0203] 根据一个实施方案，表达构建体编码可选标记。 [0204] 如本文所使用，术语“可选标记”指能够在宿主细胞中表达，允许轻松选择那些含有引入核酸或载体的宿主的基因。这种可选标记的实例包括但不限于抗菌剂(例如，卡那霉素(kanamycin)、红霉素(erythromycin)、放线菌素(actinomycin)、氯霉素和四环素(tetracycline))。因此，术语“可选标记”指提供宿主细胞已经占有外源多聚核苷酸序列或已经发生了一些其它反应的指示的基因。通常，可选标记是赋予宿主细胞抗菌抗性或代谢优势，以使得含有外源DNA的细胞区别于转化期间尚未接受任何外源序列的细胞的基因。 [0205] 正如提到的那样，本文所述的多聚核苷酸编码为相同产物生物合成途径的一部分的酶。 [0206] 如本文所使用，短语“生物合成途径”或“代谢途径”指将底物转化为目标产物的细胞或细胞(无细胞)系统，其中所述系统包含多种酶类并且可能另外包含受一种或多种酶作用的底物、酶催化反应的产物、酶利用的辅助因子等。所述系统可存在于完整细胞或细胞裂解产物中。 [0207] 已知许多代谢途径并且已经在微生物系统方面有描述，并且可在公共数据库中访问；见，例如Smolke编辑，The Metabolic Pathway Engineering Handbook:Tools and Applications,CRC Press,New York(2009)；Stephanopoulos、Nielsen和Aristidou编 辑，Metabolic Engineering:Principles and Methodology,Academic Press,New York(1998)；Greenberg,Metabolic Pathways:Energetics,Tricarboxylic Acid Cycle,and Carbohydrates,Academic Press,New York(1967)；和D.M.Greenberg的标题为“Metabolic pathways”的多卷丛书第1-7卷，其各自以引用的方式并入本文。 [0208] 在一个实施方案中，所述途径指导食品、药品或燃料的生产。 [0210] a)抗生素；例如放线菌素、博来霉素(bleomycin)、利福霉素(rifamycin)、氯霉素、碳青霉烯(carbapenems)、四环素、林肯霉素(lincomycin)、红霉素、链霉素(streptomycin)、环己酰亚胺、嘌呤霉素(puromycin)、环丝氨酸、杆菌肽、青霉素(penicillin)、头孢菌素(cephalosporin)、万古霉素(vancomycin)、多粘菌素(polymyxin)和短杆菌肽； [0211] b)生物表面活性剂；例如鼠李糖脂、槐糖脂、糖脂和脂肽； [0213] d)氨基酸；例如L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸(羟脯氨酸)、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-酪氨酸和D-对羟基苯甘氨酸； [0215] f)脂肪酸；例如花生四烯酸、多不饱和脂肪酸(PUBA)和.α.-亚油酸； [0216] g)醇和多元醇；例如丙三醇、甘露醇、赤藓醇、木糖醇、聚-3-羟基丁酸醋、异丁醇和1-丁醇； [0218] i)核苷酸；例如5'-鸟苷酸和5'-肌苷酸； [0219] j)维生素；例如维生素C、维生素F、维生素B2、维生素原D2、维生素B12、叶酸、烟酰胺、生物素、2-酮基-L-古洛糖酸和维生素原Q10； [0220] k)色素；例如虾青素、.β.-胡萝卜素、番茄红素、红曲红素(monascorubrin)和红斑素(rubropunctatin)； [0221] l)糖和多糖；例如核糖、山梨糖、黄原胶、结冷胶和葡聚糖； [0222] 和[0066]m)生物聚合物和塑料；例如聚羟基脂肪酸酯(PHA)、聚-.γ.-谷氨酸和1,3-丙二醇。 [0223] 目标生物合成途径的其他实例包括各种大肠杆菌代谢产物的合成。 [0224] “代谢产物”是代谢期间使用或生成的任何物质(例如酶、底物或产物)。本文，虽然并非总是如此，但是代谢产物常常是目标途径中酶的产物。 [0225] 示例性大肠杆菌代谢产物包括但不限于2,3-二羟基苯甲酸、2-酮戊二酸酯、3-磷酸甘油酸酯、4-羟基苯甲酸酯、6-磷酸葡萄糖酸酯、乙酰乙酰-CoA、乙酰-CoA、乙酰磷酸酯、腺嘌呤、腺苷、腺苷磷硫酸、ADP、ADP-葡萄糖、丙氨酸、AMP、邻氨基苯甲酸酯、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸盐、ATP、氨甲酰天冬氨酸盐、顺乌头酸、柠檬酸盐、瓜氨酸、CMP、辅酶A、CTP、环状AMP、胞苷、胞嘧啶、dAMP、dATP、dCTP、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧核糖-5-P、dGMP、二氢乳清酸、二羟丙酮磷酸、dTDP、dTTP、赤藓糖-4-磷酸、FAD、黄素单核苷酸、果糖-1,6-二磷酸、果糖-6-磷酸、延胡索酸盐、GDP、葡糖酸盐、葡糖酸内酯、葡糖胺-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-1-磷酸、谷氨酸盐、谷氨酰胺、谷胱甘肽、谷胱甘肽二硫化物、甘油醛-3-磷酸、甘油酸酯、甘油-3-磷酸、GMP、GTP、鸟嘌呤、鸟苷、组氨酸、组氨醇、高半胱氨酸、肌苷二磷酸、肌苷单磷酸、肌苷三磷酸、异亮氨酸、赖氨酸、苹果酸酯、丙二酰-CoA、甲硫氨酸、肌醇、N-乙酰-葡萄糖胺-1P、N-乙酰-鸟氨酸、NAD+、NADH、NADP+、NADPH、鸟氨酸、草酰乙酸酯、苯丙氨酸、苯丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸、脯氨酸、丙酰-CoA、PRPP、丙酮酸盐、羟基喹啉、核黄素、核糖-5-磷酸、核酮糖-5-磷酸、S-腺苷-L-甲硫氨酸、丝氨酸、莽草酸、莽草酸酯、琥珀酸酯、琥珀酰-CoA、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、UDP、UDP-葡萄糖、UDP-葡糖醛酸、UDP-N-乙酰葡萄糖胺、尿苷、UTP、缬氨酸和木酮糖-5-磷酸。 [0226] 在某些实施方案中，目标途径提供了莽草酸和/或莽草酸酯(莽草酸酯为莽草酸的阴离子形式)及其合成中间产物类异戊二烯或萜(例如青蒿二烯、法泥烯、番茄红素、虾青素、维生素A、薄荷醇、β-胡萝卜素)、聚-3-羟基丁酸酯、异丁醇和1-丁醇的合成。 [0227] 在目标生物合成途径中，许多反应可受酶催化。可按括号内提供的酶分类号鉴别的广义类的酶包括但不限于： [0228] (EC 1)氧化还原酶；例如脱氢酶、氧化酶、还原酶、氧化还原酶、合成酶、加氧酶、单加氧酶、双加氧酶、脂加氧酶、氢化酶、转氢酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、环氧酶、羟化酶、脱甲基酶、去饱和酶、岐化酶、羟基转移酶、脱卤素酶和脱碘酶； [0229] (EC2)转移酶；例如转氨酶、激酶、双激酶、甲基转移酶、羟甲基转移酶、甲酰基转移酶、亚胺甲基转移酶、羧基转移酶、氨甲酰转移酶、脒基转移酶、转醛醇酶、转酮醇酶、乙酰转移酶、酰基转移酶、棕榈酰转移酶、琥珀酰转移酶、丙二酰转移酶、没食子酰基转移酶、二芥子酰基转移酶、巴豆酰基转移酶、十四烷酰转移酶、羟基肉桂酰基转移酶、阿魏酰转移酶、分枝酰转移酶、苯甲酰转移酶、胡椒基转移酶、三甲基十三酰转移酶、肉豆蔻酰转移酶、香豆酰转移酶、硫解酶、氨酰转移酶、磷酸化酶、己糖基转移酶、戊糖基转移酶、唾液酸转移酶、吡啶酶、二磷酸化酶、环转移酶、硫酸化酶、腺苷转移酶、羧乙烯基转移酶、异戊烯基转移酶、氨基羧丙基转移酶、二甲丙烯基转移酶、反式法尼基转移酶、反式六异戊二烯转移酶、顺式十异戊二烯转移酶、反式五异戊二烯转移酶、九异戊二烯转移酶、牦牛儿基牦牛儿基转移酶、氨基羧丙基转移酶、肟基转移酶、嘌呤转移酶、磷酸歧化酶、磷酸转移酶、核苷酸转移酶、聚合酶、磷酸胆碱转移酶、磷酰基变位酶、硫基转移酶、磺基转移酶和CoA-转移酶； [0230] (EC3)水解酶；例如脂肪酶、酯酶、淀粉酶、肽酶、水解酶、内酯酶、脱酰酶、脱乙酰基酶、脱镁叶绿酸酶、解聚酶、巯基酯酶、磷酸酶、二磷酸酶、三磷酸酶、核苷酸酶、植酸酶、磷酸二酯酶、磷脂酶、硫酸酯酶、环化酶、寡核苷酸酶、核糖核酸酶、核酸外切酶、核酸内切酶、糖苷酶、核苷酶、糖基化酶、氨基肽酶、二肽酶、羧肽酶、金属羧肽酶、ω-肽酶、丝氨酸肽链内切酶、半胱氨酸肽链内切酶、天冬氨酸肽链内切酶、金属肽链内切酶、苏氨酸肽链内切酶、氨基酶、酰胺酶、脱琥珀酰酶、脱甲酰基酶、酰化酶、脱亚氨酶、脱氨基酶、双水解酶、环化水解酶、腈水解酶、ATP酶、GTP酶、卤化酶、脱卤素酶和磺基水解酶； [0231] (EC 4)裂解酶；例如脱羧酶、羧化酶、羧基激酶、醛缩酶、环氧裂解酶、酮酸裂解酶、碳-碳裂解酶、脱水酶、水合酶、合成酶、内切裂解酶、外切裂解酶、氨裂解酶、脒裂解酶、胺裂解酶、碳-硫裂解酶、碳-卤化物裂解酶、磷-氧裂解酶和脱氯化氢酶； [0232] (EC 5)异构酶；例如异构酶、消旋酶、变位酶、互变异构酶、磷酸变位酶、葡糖磷酸变位酶、氨基变位酶、环异构酶、环化酶、拓扑异构酶；和 [0233] (EC 6)连接酶；例如合成酶、tNRA-连接酶、酸-硫醇连接酶、酰胺合成酶、肽合成酶、环连接酶、羧化酶、DNA-连接酶、RNA-连接酶和环化酶。 [0234] 更多特定类别的酶包括但不限于如以下提供的氧化还原酶、转移酶、裂解酶、异构酶和连接酶亚类。示例性氧化还原酶包括但不限于： [0235] (EC 1.1)作用于供体的CH--OH基团和受体的氧化还原酶； [0236] (EC 1.2)作用于供体的醛基或氧基和受体的氧化还原酶； [0237] (EC 1.3)作用于供体的CH--OH基团和受体的氧化还原酶； [0238] (EC 1.4)作用于供体的CH--NH2基团和受体的氧化还原酶； [0239] (EC 1.5)作用于供体的CH--NH基团和受体的氧化还原酶； [0240] (EC 1.6)作用于NADH或NADPH和受体的氧化还原酶； [0241] (EC 1.7)作用于作为供体的其他含氮化合物和受体的氧化还原酶； [0242] (EC 1.8)作用于供体的硫基和受体的氧化还原酶； [0243] (EC 1.9)作用于供体的血红素基团和受体的氧化还原酶； [0244] (EC 1.1)作用于作为供体的联苯酚和相关物质及受体的氧化还原酶； [0245] (EC 1.11)作用于作为受体的过氧化物的氧化还原酶； [0246] (EC 1.12)作用于作为供体的氢和受体的氧化还原酶； [0247] (EC 1.13)作用于单个供体的氧化还原酶，并入了分子氧，并入一个或两个氧原子； [0249] (EC 1.15)作用于作为受体的超氧化物自由基的氧化还原酶； [0250] (EC 1.16)氧化金属离子和受体的氧化还原酶； [0251] (EC 1.17)作用于CH或CH2基团和受体的氧化还原酶； [0252] (EC 1.18)作用于作为供体的铁硫蛋白和受体的氧化还原酶； [0253] (EC 1.19)作用于作为供体的还原型类黄酮和受体的氧化还原酶； [0254] (EC 1.2)作用于供体中的磷或砷和受体的氧化还原酶；和 [0255] (EC 1.21)作用于X--H和Y--H形成X--Y键并且作用于受体的氧化还原酶；其中用于每个供体类别的受体可包括但不限于NAD、NADP、血红素蛋白、氧、二硫化物、醌、铁硫蛋白、黄素、含氮基团、细胞色素、分子氮和H+。 [0256] 示例性转移酶包括但不限于： [0257] (EC 2.1)转移一碳基团的转移酶； [0258] (EC 2.2)转移醛或酮基的转移酶； [0259] (EC 2.3)酰基转移酶； [0260] (EC 2.4)糖基转移酶； [0261] (EC 2.5)转移除甲基以外的烷基或芳基的转移酶； [0262] (EC 2.6)转移含氮基团的转移酶； [0263] (EC 2.7)转移含磷基团的转移酶； [0264] (EC 2.8)转移含硫基团的转移酶；和 [0265] (EC 2.9)转移含硒基团的转移酶。 [0266] 示例性水解酶包括但不限于： [0267] (EC 3.1)作用于酯键的水解酶； [0268] (EC 3.2)糖基化酶； [0269] (EC 3.3)作用于醚键的水解酶； [0270] (EC 3.4)作用于肽键的水解酶(肽酶)； [0271] (EC 3.5)作用于除肽键以外的碳-氮键的水解酶； [0272] (EC 3.6)作用于酸酐的水解酶； [0273] (EC 3.7)作用于碳-碳键的水解酶； [0274] (EC 3.8)作用于卤键的水解酶； [0275] (EC 3.9)作用于磷-氮键的水解酶； [0276] (EC 3.1)作用于硫-氮键的水解酶； [0277] (EC 3.11)作用于碳-磷键的水解酶； [0278] (EC 3.12)作用于硫-硫键的水解酶；和(EC 3.13)作用于碳-硫键的水解酶。 [0279] 示例性裂解酶包括但不限于： [0280] (EC 4.1)碳-碳裂解酶； [0281] (EC 4.2)碳-氧裂解酶； [0282] (EC 4.3)碳-氮裂解酶； [0283] (EC 4.4)碳-硫裂解酶； [0284] (EC 4.5)碳-卤化物裂解酶；和 [0285] (EC 4.6)磷-氧裂解酶。 [0286] 示例性异构酶包括但不限于： [0287] (EC 5.1)消旋酶和差向异构酶； [0288] (EC 5.2)顺-反-异构酶； [0289] (EC 5.3)分子内异构酶； [0290] (EC 5.4)分子内转移酶(变位酶)；和 [0291] (EC 5.5)分子内裂解酶。 [0292] 示例性连接酶包括但不限于： [0293] (EC 6.1)形成碳-氧键的连接酶； [0294] (EC 6.2)形成碳-硫键的连接酶； [0295] (EC 6.3)形成碳-氮键的连接酶； [0296] (EC 6.4)形成碳-碳键的连接酶； [0297] (EC 6.5)形成磷酸酯键的连接酶；和 [0298] (EC 6.6)形成氮-金属键的连接酶。 [0299] 同工酶(也称为同功酶)是在氨基酸序列上不同，但是催化相同化学反应的酶。在目标途径的某些时刻，可能存在两种或更多种同工酶。同工酶可表现出不同动力学参数和/或不同调控性质。 [0300] 目标途径或相关途径中涉及的酶也可根据酶的作用分类。细胞或细胞裂解产物中的直接参与酶(1类)催化所述途径中的反应。途径典型的是，这种直接酶是一系列之一，其中第一种酶的产物为第二种酶的底物，第二种酶的产物为第三种酶的底物，以此类推，最终产生目标产物。细胞或细胞裂解产物中的间接参与酶(2类)在相关途径中，通常在用于目标途径的底物生成中反应。 [0301] 用于本文所述方法中的目标途径通常将包含至少一种酶、至少两种酶、至少三种酶、至少四种酶或更多，例如1-50种酶、1-40种酶、1-30种酶、1-20种酶、1-10种酶、1-5种酶、1-2种酶、2-50种酶、2-40种酶、2-30种酶、2-20种酶、2-10种酶、2-5种酶、2-4种酶、5-50种酶、5-40种酶、5-30种酶、5-20种酶、5-10种酶、5-8种酶、10-50种酶、10-40种酶、 10-30种酶或10-20种酶，这些包括在内。 [0302] 途径中的酶可为自然存在的，或经修饰以优化特定目标特征，例如底物特异性、反应动力学、溶解性和/或对反馈抑制的不敏感性。另外，在一些情况下，表达酶的基因将优化供宿主细胞中的密码子使用。在一些实施方案中，整个途径包含来自一种生物的酶，然而不需要这样，并且也考虑到了来自多种生物的复合酶。出于某些目的，途径可为宿主细胞内源的，但是也不需要这样，并且可将整个途径或途径的组分引入宿主细胞中。在完整细胞中提供所述系统时，在细胞中可存在目标途径的整套酶。 [0303] 应认识到，可从各种来源获得编码与本文所述实施方案相关的酶的基因。正如本领域的普通技术人员将意识到那样，这些靶酶的同源基因存在于许多物种并且可通过同源性搜索，例如通过在NCBI互联网网站(ncbi.nlm.nih.gov)上可访问的蛋白质BLAST搜索鉴定。正如本领域的普通技术人员将理解那样，可由来自含有指定酶的任何来源的DNA，例如使用简并引物，PCR扩增编码这些酶的基因。在一些实施方案中，编码指定酶的基因可以是合成的(人工的)，例如由糖、氮化合物、磷酸盐和DNA合成所需的其他化合物/试剂合成的DNA。获得编码此处讨论的酶的基因的任何方式均与本文所述实施方案的方方面面相容。 [0304] 所述途径的产物可能稳定或相对不稳定，但是在某些情况下，最终产物足够稳定，以致可从细胞、细胞裂解产物或反应混合物中分离。 [0305] 可以各种方式，例如通过生成有色或荧光产物的酶测定法或通过高效液相色谱(HPLC)法测量反应中生成的产物的量。在某些实施方案中，利用测量生成的特定产物的活性或浓度的测定法测量产物。如果产物为蛋白质，则可能在RNA或蛋白质水平上量化。 [0306] 本领域的技术人员将很清楚将多聚核苷酸引入宿主细胞并且特别是引入大肠杆菌、芽孢杆菌和泛菌宿主细胞中的方法。在CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY第1卷，编辑Ausubel等John Wiley&Sons Inc,(1987)第7章和Sambrook,J.等，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中公开了通用转化技术。也参考Ferrari等，Genetics，在Hardwood等编辑的BACILLUS中第 57-72页，Plenum Publishing Corp.1989；Chang 等，(1979)Mol.Gen.Genet.168:11-15； Smith 等，(1986)Appl.and Env.Microbiol.51:634 和 Potter,H.(1988)Anal Biochem 174:361-373，其中公开了转化方法，包括电穿孔、原生质体转化和集合；转导和原生质体融合。特别优选转化方法。适合细菌细胞维护和生长的方法众所周知并且参考Manual of Methods of General Bacteriology，编 辑P.Gerhardt 等，American Society for Microbiology,Washington,DC(1981) 和 T.D.Brock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology第2版(1989)Sinauer Associates,Sunderland Mass。 [0307] 如本文所使用，在将核酸序列插入细胞的上下文中使用的术语“引入”意指“转染”、“转化”或“转导”并且包括指核酸序列并入真核或原核细胞中，其中核酸序列可并入细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化为能独立复制的复制子或瞬时表达(例如，转染mRNA)。 [0308] 如本文所使用，在提及细胞时使用的术语“转化”、“稳定转化”和“转基因”意指细胞有非天然(异源)核酸序列整合到其基因组中或作为保持两代或更多代的附加体质粒。 [0309] 基于对插入DNA构建体中提供的可选标记的表现型反应，选择转化宿主细胞。在一些实施方案中，可从宿主细胞切除可选标记。(Cherepanov等(1995)Gene 158:9-14)。 [0310] 用于途径工程的宿主细胞包括各种异养和自养微生物，包括但不限于细菌、真菌和原生动物。在某些实施方案中，宿主细胞包括对于其意味着，已知多肽可通过其送往细胞区室或外部外区室的宿主细胞。在一些实施方案中，所述细胞可为重组表达本文所述任何一种或多种核酸的任何类型的细胞。这种细胞包括原核和真核细胞。在一些实施方案中，所述细胞为细菌细胞，例如埃希氏菌属(Escherichia spp.)、链霉菌属(Streptomyces spp.)、发酵单胞菌属(Zymonas spp.)、醋酸杆菌属(Acetobacter spp.)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter spp.)、集胞藻属(Synechocystis spp.)、根瘤菌属(Rhizobium spp.)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium spp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、黄单孢菌属(Xanthomonas spp.)、乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)、乳球菌属(Lactococcus spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、产碱菌属(Alcaligenes spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、气单胞菌属(Aeromonas spp.)、固氮菌属(Azotobacter spp.)、丛毛单胞菌属(Comamonas spp.)、分支杆菌属(Mycobacteriumspp.)、红球菌属(Rhodococcus spp.)、葡糖杆菌属(Gluconobacter spp.)、罗尔斯顿菌属(Ralstonia spp.)、嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus spp.)、小月菌属(Microlunatus spp.)、地杆菌属(Geobacter spp.)、地芽孢杆菌属(Geobacillus spp.)、节杆菌属(Arthrobacter spp.)、黄杆菌属(Flavobacterium spp.)、沙雷氏菌属(Serratia spp.)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora spp.)、栖热菌属(Thermus spp.)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas spp.)、色杆菌属(Chromobacterium spp.)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium spp.)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora spp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium spp.)和泛菌属(Pantoea spp.)。细菌细胞可为革兰氏阴性(gram negative)细胞例如大肠杆菌(E.coli)细胞或革兰氏阳性(gram positive)细胞例如芽孢杆菌属。在其他实施方案中，所述细胞为真菌细胞例如酵母细胞，例如酵母属(Saccharomyces spp.)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces spp.)、毕赤酵母属(Pichia spp.)、法夫酵母属(Paffia spp.)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces spp.)、念珠菌属(Candida spp.)、蓝状菌属(Talaromyces spp.)、酒香酵母属(Brettanomyces spp.)、管囊酵母菌属(Pachysolen spp.)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces spp.)、解脂耶氏酵母属(Yarrowia spp.)和工业多倍体酵母菌株。真菌的其他非限制性实例包括曲霉属(Aspergillus spp.)、青霉属(Pennicilium spp.)、镰刀菌属(Fusariumspp.)、根霉菌属(Rhizopus spp.·)、支顶孢菌属(Acremonium spp.)、脉抱菌属(Neurospora spp.)、粪壳菌属(Sordaria spp.)、巨座壳属(Magnaporthe spp.)、异水霉属(Allomyces spp.·)、黑粉菌属(Ustilago spp.)、葡萄孢属(Botrytis spp.)和木霉属(Trichoderma spp.)。在其他实施方案中，所述细胞为藻类细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。应认识到，与本文所述实施方案相容的一些细胞可表达本文所述一个或多个基因的内源性拷贝以及重组拷贝。 目标种类包括但不限于酿酒酵母(S.cerevisiae)、大肠杆菌、假单胞菌属、克雷白杆菌属(Klebsiella)和集胞藻属。 [0311] 在特定途径中选择适当RBS酶组合后，多聚核苷酸可作为单独表达载体或在单个表达载体上引入细胞系统中，以便制备商业量的该产物。然后可分离最终产物。可利用熟练的从业者众所周知的各种方法获得与本文所述实施方案相关的分离多肽。可通过免疫色谱法、HPLC、尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法和免疫亲和色谱法从细胞中纯化多肽。 [0312] 所述反应可利用大型反应器、小型反应器，或可多路复用以进行多种同时合成。连续反应将使用进料机构引入源源不断的试剂，并且可分离作为所述工艺的一部分的终产物。间歇式系统也令人感兴趣，其中可随时间引入附加试剂以延长活性合成的时间段。反应器可以任何模式运行，例如间歇式、扩展间歇式、半间歇式、半连续、加料-间歇式和连续，并且可根据应用目的选择。 [0313] 所述反应可具有任何体积，小规模(例如，通常至少约1ml并且不超过约15ml)或扩大规模反应(例如，其中反应体积为至少约15ml，通常至少约50ml，更通常至少约100ml，并且可为500ml、1000ml或更高，高达数千升体积)。反应可在任何规模下进行。 [0314] 使用本文所述的策略，本发明人已经揭示了用于合成虾青素的最佳RBS-酶组合。 [0315] 因此，根据本发明的另一方面，提供了一种生成虾青素的方法，包括表达编码虾青素途径的酶的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包含： [0316] (i)编码八氢番茄红素脱氢酶(crtI)的多聚核苷酸和第一转录调控序列； [0317] (ii)编码β-番茄红素环化酶(lcy-B)的多聚核苷酸和第二转录调控序列； [0318] (iii)编码β-胡萝卜素酮化酶(crtW)的多聚核苷酸和第三转录调控序列；并且[0319] 其中选择所述第一、第二和第三调控序列，以致lcy-B和crtW的表达高于crtI的表达水平。 [0320] 本发明的方法考虑到了表达至少一种、至少两种、至少三种、至少四种编码虾青素途径的酶的附加多聚核苷酸。 [0321] 附加多聚核苷酸包括： [0322] (iv)编码异戊烯焦磷酸(idi)的多聚核苷酸和第四转录调控序列； [0323] (v)编码牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸合成酶(crtE)的多聚核苷酸和第五转录调控序列； [0324] (vi)编码前八氢番茄红素焦磷酸合成酶(crtB)的多聚核苷酸和第六转录调控序列； [0325] 和 [0326] (vii)编码β-胡萝卜素羟化酶(crtZ)的多聚核苷酸和第七转录调控序列。 [0327] 如本文所使用，术语“虾青素”指其三种立体异构体(3R,3′R)、(3R,3′S)(内消旋)和(3S,3′S)的任一种，也称为3,3'-二羟基-β-胡萝卜素-4,4'-二酮，其具有分子式C40H52O4。 [0328] 为了在生物细胞中生成虾青素，所述细胞优选表达虾青素途径的酶。 [0329] 下文列出了示例性酶。 [0330] 牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸合成酶(crtE或GGPP合成酶)：术语“crtE”指能够将法尼基二磷酸(FPP)转化为牦牛儿基牦牛儿基二磷酸GGPP的酶(EC2.5.1.29)。下面和以引用的方式并入本文的美国专利申请No.20110039299的表15中列出了crtE的非限制性实例的基因库入藏号。本发明的crtE也指同源物(例如，使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件，使用默认参数测定，与下文所列crtE序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％或者说更高100％同源的多肽)。同源物也可能指缺失、插入或取代变体，包括其氨基酸取代及其生物活性多肽片段。 [0331] 牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸合成酶的核苷酸序列的说明性实例包括但不限于：(ATHGERPYRS；拟南芥(Arabidopsis thaliana))、(BT005328；拟南芥)、(NM__119845；拟南芥)、(NZ_AAJM01000380，基因座ZP__00743052；苏云金芽孢杆菌以色列血清型(Bacillus thuringiensis serovar israelensis)，ATCC 35646sq1563)、(CRGGPPS；长 春 花(Catharanthus roseus))、(NZ_AABF02000074，基因座ZP.sub.--00144509；具核梭杆菌多形亚种(Fusobacterium nucleatum subsp.Vincentii)，ATCC 49256)、(GFGGPPSGN；藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi))、(AY371321；银杏(Ginkgo biloba))、(AB055496；巴西橡胶(Hevea brasiliensis))、(AB017971；智人(Homo sapiens))、(MCI276129；卷枝毛霉(Mucor circinelloidesf.lusitanicus))、(AB016044；小家鼠(Mus musculus))、(AABX01000298，基因座NCU01427；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa))、(NCU20940；粗糙脉孢菌),(NZ_AAKL01000008，基因座ZP.sub.--00943566；茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)UW551)、(AB118238；褐家鼠(Rattus norvegicus))、(SCU31632；酿酒酵母)、(AB016095；细长聚球藻(Synechococcus elongates))、(SAGGPS；白芥子(Sinapis alba))、(SSOGDS；嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius))、(NC__007759，基因座YP__461832；酸养互营菌(Syntrophus aciditrophicus)SB)和(NC.sub.--006840，基因座YP.sub.--204095； 费氏弧菌(Vibrio fischeri)ES114)。根据特定实施方案，GGPP合成酶包含源自成团泛菌(Pantoea agglomerans)的序列-基因库：AAA21260.1(SEQ ID NO:62)。 [0332] 前八氢番茄红素焦磷酸合成酶(crtB)：如本文所使用，术语“crtB”指将GGPP转化为八氢番茄红素的酶(EC＝2.5.1.32)，也称为八氢番茄红素合成酶。以引用的方式并入本文的美国专利申请No.20110039299的表18中列出了crtB的非限制性实例的基因库入藏号。本发明的crtB也指同源物(例如，使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件，使用默认参数测定，与美国专利申请No.20110039299的表18中列出的crtE序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％或者说更高100％同源的多肽)。同源物也可能指缺失、插入或取代变体，包括其氨基酸取代及其生物活性多肽片段。 [0333] 根据特定实施方案，crtB包含源自成团泛菌的序列-基因库：AAA21264.1(SEQ ID NO:63)。 [0334] 八氢番茄红素脱氢酶(crtI)：如本文所使用，术语“crtI”指将八氢番茄红素转化为番茄红素的酶(EC＝1.14.99)。以引用的方式并入本文的美国专利申请No.20110039299的表17A和17B中列出了crtI的非限制性实例的基因库入藏号。本发明的crtE也指同源物(例如，使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件，使用默认参数测定，与美国专利申请No.20110039299的表17A和17B中列出的crtI序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％或者说更高100％同源的多肽)。同源物也可能指缺失、插入或取代变体，包括其氨基酸取代及其生物活性多肽片段。 [0335] 根据特定实施方案，crtI包含源自成团泛菌的序列-基因库：AAA21263.1(SEQ ID NO:64)。 [0336] 异戊烯焦磷酸异构酶(idi)：如本文所使用，术语“idi”指催化相对惰性的异戊烯焦磷酸(IPP)转化为更具反应性的亲电子二甲基丙烯焦磷酸酯(DMAPP)的异构酶(EC＝5.3.3.2)。也称为异戊烯基二磷酸δ-异构酶。以引用的方式并入本文的美国专利申请No.20110039299的表13中列出了idi的非限制性实例的基因库入藏号。本发明的idi也指同源物(例如，使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件，使用默认参数测定，与美国专利申请No.20110039299的表13中列出的idi序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％或者说更高100％同源的多肽)。同源物也可能指缺失、插入或取代变体，包括其氨基酸取代及其生物活性多肽片段。 [0337] 根据特定实施方案，idi包含源自雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的序列-基因库：AAC32208.1(SEQ ID NO:65)。 [0338] β-番茄红素环化酶(lcy-B)：如本文所使用，术语“lcy-B”指催化番茄红素转化为胡萝卜素的酶。以引用的方式并入本文的美国专利申请No.20110039299的表23中列出了lcy-B的非限制性实例的基因库入藏号。本发明的lcy-B也指同源物(例如，使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件，使用默认参数测定，与美国专利申请No.20110039299的表23中列出的lcy-B序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％或者说更高100％同源的多肽)。同源物也可能指缺失、插入或取代变体，包括其氨基酸取代及其生物活性多肽片段。 [0339] 根据特定实施方案，lcy-B包含源自番茄(Solanum lycopersicum)的序列-基因库：ABR57232.1(SEQ ID NO:66)。 [0340] β-胡萝卜素羟化酶(crtZ)：如本文所使用，术语“crtZ”指催化胡萝卜素转化为玉米黄质的酶和/或催化角黄素转化为虾青素的酶(EC 1.14.13)。以引用的方式并入本文的美国专利申请No.20110039299的表20中列出了crtZ的非限制性实例的基因库入藏号。本发明的crtZ也指同源物(例如，使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件，使用默认参数测定，与美国专利申请No.20110039299的表20中列出的crtZ序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％或者说更高100％同源的多肽)。同源物也可能指缺失、插入或取代变体，包括其氨基酸取代及其生物活性多肽片段。 [0341] 根据特定实施方案，crtZ包含源自菠萝泛菌(Pantoea ananatis)的序列-Swiss-Prot：P21688.1(SEQ ID NO:67)。 [0342] β-胡萝卜素酮化酶(crtW)：如本文所使用，术语“crtW”指催化胡萝卜素转化为角黄素的酶和/或催化玉米黄质转化为虾青素的酶。以引用的方式并入本文的美国专利申请No.20110039299的表19中列出了crtW的非限制性实例的基因库入藏号。本发明的crtW也指同源物(例如，使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件，使用默认参数测定，与美国专利申请No.20110039299的表19中列出的crtW序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％或者说更高100％同源的多肽)。同源物也可能指缺失、插入或取代变体，包括其氨基酸取代及其生物活性多肽片段。根据特定实施方案，crtW包含源自葛仙米(Nostoc sphaeroides)的序列-基因库：BAB74888.1(SEQ ID NO:68)。 [0343] 优选地，所述细胞也表达1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(dxs)。 [0344] 如本文所使用，术语“1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(dxs)”指催化丙酮酸盐和D-甘油醛3-磷酸转化为D-1-脱氧木酮糖5-磷酸(DOXP)的酶。(EC 2.2.1.7)。示例性入藏号包括以引用的方式并入本文的美国专利申请No.20040268436的表3中列出的入藏号。本发明的dxs也指同源物(例如，使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件，使用默认参数测定，与美国专利申请No.20040268436的表3中列出的dxs序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％或者说更高100％同源的多肽)。同源物也可能指缺失、插入或取代变体，包括其氨基酸取代及其生物活性多肽片段。根据特定实施方案，dxs包含源自大肠杆菌的序列-Swiss-Prot：A7ZX72.1(SEQ ID NO:69)。 [0345] 以引用的方式并入本文的美国专利申请No.20110039299中描述了也可在宿主系统中表达的虾青素途径另外的酶。 [0346] 各种原核或真核细胞或真核细胞均可作为宿主表达系统，用于表达本发明的多肽。这些包括但不限于微生物，例如经含有多肽编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；哺乳动物表达系统，例如CHO细胞；真菌，例如经含有多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；经重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或经含有多肽编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的藻类和植物细胞系统。上文进一步描述了另外的宿主表达系统。 [0347] 根据优选实施方案，虾青素途径的酶在细菌细胞中表达。 [0348] 在一个实施方案中，宿主细胞为细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌。在另一实施方案中，宿主细胞为革兰氏阴性细菌。在一些优选实施方案中，术语指泛菌属、芽孢杆菌属的细胞和大肠杆菌细胞。 [0349] 如本文所使用，术语“芽孢杆菌属”包括本领域中技术人员已知的所有成员，包括但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短小芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。公认芽孢杆菌属继续进行分类重组。因此，意图是所述属包括已经重新分类的种，包括但不限于诸如嗜热脂肪芽孢杆菌的生物，现命名为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”。将在氧的存在下生成抗性内生孢子视为芽孢杆菌属的定义性特征，虽然这种特性也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌(Brevibacillus)、线芽孢杆菌(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌(Halobacillus)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌(Thermobacillus)、嗜热脲芽孢杆菌(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌(Virgibacillus)。 [0350] 如本文所使用，术语“泛菌属”包括本领域中技术人员已知的所有成员，包括但不限于成团泛菌(P.agglomerans)、分散泛菌(P.dispersa)、斑点泛菌(P.punctata)、柠檬泛菌(P.citrea)、土壤泛菌(P.terrea)、菠萝泛菌(P.ananas)和斯氏泛菌(P.sterartii)。公认泛菌属继续进行分类重组。因此，意图是所述属包括已经重新分类的种，包括但不限于诸如草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)的生物。 [0351] 将本发明的多聚核苷酸序列插入表达载体(即，核酸构建体)中以使得虾青素途径的多肽能够在所述细胞中表达。 [0352] 需要使用表达载体在特定细胞系统中表达的酶的数量将取决于在该特定细胞系统中内源性表达的那些酶的数量。因此，例如若特定细胞系统内源性表达crtW到足够程度，可能不需要使用重组方法外源性表达该酶。 [0353] 本发明考虑到在单个表达载体上插入编码虾青素途径的1、2、3、4、5、6、7或8种多肽的多聚核苷酸序列。因此，可通过引入编码所有必需酶的单个表达载体或编码虾青素途径的各种多肽组合的多个载体实现多肽的表达。 [0354] 本发明人已经发现为了虾青素的最佳表达，应选择与编码虾青素途径的组分的多聚核苷酸操作性连接的转录调控元件，以确保特定比例的表达。 [0355] 根据特定实施方案，应操纵Icy-B和crtW的表达，以致其表达水平高于crtI的表达水平。优选地，Icy-B和crtW的表达水平为crtI表达水平的至少2倍。根据另一实施方案，Icy-B和crtW的表达水平为crtI表达水平的至少5倍。根据另一实施方案，Icy-B和crtW的表达水平为crtI表达水平的至少10倍。根据另一实施方案，Icy-B和crtW的表达水平为crtI表达水平的至少20倍。根据另一实施方案，Icy-B和crtW的表达水平为crtI表达水平的至少50倍。根据另一实施方案，Icy-B和crtW的表达水平为crtI表达水平的至少100倍。 [0356] 如本文所使用，短语“转录调控元件”指与多聚核苷酸的蛋白质编码区操作性连接，控制其转录的碱基序列。 [0357] 转录调控元件的实例包括但不限于启动子、增强子、mRNA稳定性影响序列和核糖体结合位点(RBS)。 [0358] 为了本申请的目的，“启动子”或“启动子区”是转录起始期间，由DNA依赖型RNA聚合酶识别并结合的核酸序列。启动子，和其他转录和翻译调控元件一起，是表达指定基因或成组基因(操纵子)所必需的。启动子可能是受IPTG诱导的可调控启动子(例如Ptrc)或组成型启动子。 [0359] 用于根据本发明产生人工启动子的启动子序列包括下面表1中所列的前体启动子。表中的所有启动子均相对于β-内酰胺酶启动子Pbla进行表征并且启动子强度以“Pbla-单位”给出。(Deuschle等，EMBO Journal 5(11):2987-2994(1986))。以引用的方式并入本文的美国专利申请No.20120015849中提供了启动子的更多实例及其核酸序列。一般而言，用于本发明的启动子包括在转录起始位点(+1)上游200-20个碱基对(bp)，优选 150-25bp，更优选100-30bp和最优选50-30bp的启动子序列。 [0360] 在Sommer等，(2000)Microbiol.146:2643-2653中公开了另外的用于本发明的启动子，其中教导了Ptac的序列和含1或2个碱基对变化的变体。 [0361] 表1 [0362]启动子 来源 相对活性 B-内酰胺酶(bla) 大肠杆菌 1 P-共有序列(con) 合成DNA 4 PTac1(Trc) 2个启动子的杂交 17 PLacUV5 Lac的突变体 3.3 Plac 大肠杆菌LacZ基因 5.7 PL 噬菌体λ 37 PA1 噬菌体T7 22 PA2 噬菌体T7 20 PA3 噬菌体T7 76 PJ5 噬菌体T3 9 PG25 噬菌体T3 19 PN25 噬菌体T3 30 PD/E20 噬菌体T3 56 PH207 噬菌体T3 55 [0363] 可使用测量RNA聚合酶与特定DNA片段结合的动力学并且也允许对转录起始的测量的体外方法量化启动子强度(Hawley D.K等，PROMOTERS第3章：STRUCTURE AND FUNCTION.R.L/Rodriguez和M.J.Chamberlin编辑，Praeger Scientific.New York)。进一步地，如下文进一步描述，可通过将启动子连接到编码可检蛋白质(例如荧光标记)的多聚核苷酸序列，量化启动子强度。体内方法也用于量化启动子强度。在这种情况下，所述方法是使启动子与报告基因融合并测量RNA合成的效率。 [0364] 正如提到那样，转录调控元件可包含上文进一步描述的核糖体结合位点(RBS)。 [0365] 根据特定实施方案，与crtI连接的RBS是对于相同核酸序列而言，在相同实验和转录条件下(即在相同细胞中、相同时间、相同温度下、用相同启动子等)，致使核酸序列的表达达到具有如SEQ ID NO:4、5、6或7中所列序列的RBS至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的程度的RBS。 [0366] 根据特定实施方案，与lcyB连接的RBS是对于相同核酸序列而言，在相同实验和转录条件下(即在相同细胞中、用相同启动子等)，致使核酸序列的表达达到具有如SEQ ID NO:2或3中所列序列的RBS至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的程度的RBS。 [0367] 根据特定实施方案，与crtW连接的RBS是对于相同核酸序列而言，在相同实验和转录条件下(即在相同细胞中、用相同启动子等)，致使核酸序列的表达达到具有如SEQ ID NO:2或3中所列序列的RBS至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的程度的RBS。 [0368] 本发明人考虑到的一个特定序列组合如下： [0369] 与编码idi的多聚核苷酸序列连接的RBS是对于相同核酸序列而言，在相同实验和转录条件下(即在相同细胞中、用相同启动子等)，致使核酸序列的表达达到具有如SEQ ID NO:5中所列序列的RBS至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的程度的RBS。 [0370] 与编码crtE的多聚核苷酸序列连接的RBS是对于相同核酸序列而言，在相同实验和转录条件下(即在相同细胞中、用相同启动子等)，致使核酸序列的表达达到具有如SEQ ID NO:5中所列序列的RBS至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的程度的RBS。 [0371] 与编码crtB的多聚核苷酸序列连接的RBS是对于相同核酸序列而言，在相同实验和转录条件下(即在相同细胞中、用相同启动子等)，致使核酸序列的表达达到具有如SEQ ID NO:3中所列序列的RBS至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的程度的RBS。 [0372] 与编码crtI的多聚核苷酸序列连接的RBS是对于相同核酸序列而言，在相同实验和转录条件下(即在相同细胞中、用相同启动子等)，致使核酸序列的表达达到具有如SEQ ID NO:7中所列序列的RBS至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的程度的RBS。 [0373] 与编码lcy-B的多聚核苷酸序列连接的RBS是对于相同核酸序列而言，在相同实验和转录条件下(即在相同细胞中、用相同启动子等)，致使核酸序列的表达达到具有如SEQ ID NO:2中所列序列的RBS至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的程度的RBS。 [0374] 与编码crtW的多聚核苷酸序列连接的RBS是对于相同核酸序列而言，在相同实验和转录条件下(即在相同细胞中、用相同启动子等)，致使核酸序列的表达达到具有如SEQ ID NO:3中所列序列的RBS至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的程度的RBS。 [0375] 与编码crtZ的多聚核苷酸序列连接的RBS是对于相同核酸序列而言，在相同实验和转录条件下(即在相同细胞中、用相同启动子等)，致使核酸序列的表达达到具有如SEQ ID NO:6中所列序列的RBS至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的程度的RBS。 [0376] 另一示例性序列组合如下： [0377] 与编码idi的多聚核苷酸序列连接的RBS是对于相同核酸序列而言，在相同转录条件下(即在相同细胞中、用相同启动子等)，致使核酸序列的表达达到具有如SEQ ID NO:6中所列序列的RBS至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的程度的RBS。 [0378] 与编码crtE的多聚核苷酸序列连接的RBS是对于相同核酸序列而言，在相同实验和转录条件下(即在相同细胞中、用相同启动子等)，致使核酸序列的表达达到具有如SEQ ID NO:3中所列序列的RBS至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的程度的RBS。 [0379] 与编码crtB的多聚核苷酸序列连接的RBS是对于相同核酸序列而言，在相同实验和转录条件下(即在相同细胞中、用相同启动子等)，致使核酸序列的表达达到具有如SEQ ID NO:7中所列序列的RBS至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的程度的RBS。 [0380] 与编码crtI的多聚核苷酸序列连接的RBS是对于相同核酸序列而言，在相同实验和转录条件下(即在相同细胞中、用相同启动子等)，致使核酸序列的表达达到具有如SEQ ID NO:5中所列序列的RBS至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的程度的RBS。 [0381] 与编码lcy-B的多聚核苷酸序列连接的RBS是对于相同核酸序列而言，在相同实验和转录条件下(即在相同细胞中、用相同启动子等)，致使核酸序列的表达达到具有如SEQ ID NO:2中所列序列的RBS至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的程度的RBS。 [0382] 与编码crtW的多聚核苷酸序列连接的RBS是对于相同核酸序列而言，在相同实验和转录条件下(即在相同细胞中、用相同启动子等)，致使核酸序列的表达达到具有如SEQ ID NO:2中所列序列的RBS至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的程度的RBS。 [0383] 与编码crtZ的多聚核苷酸序列连接的RBS是对于相同核酸序列而言，在相同实验和转录条件下(即在相同细胞中、用相同启动子等)，致使核酸序列的表达达到具有如SEQ ID NO:2中所列序列的RBS至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的程度的RBS。 [0384] 如上文所提及，本发明人进一步考虑表达DXS。优选地，与编码DXS的多聚核苷酸序列连接的RBS是对于相同核酸序列而言，在相同实验和转录条件下(即在相同细胞中、用相同启动子等)，致使核酸序列的表达达到具有如SEQ ID NO:6中所列序列的RBS至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的程度的RBS。 [0385] 使用本文所述的方法表达虾青素，本发明人获得包含超过2mg/g细胞干重的虾青素，包含超过3mg/g细胞干重的虾青素，包含超过4mg/g细胞干重的虾青素，包含超过5mg/g细胞干重的虾青素，包含超过10mg/g细胞干重的虾青素的细菌细胞(大肠杆菌细胞)。 [0386] 在允许表达大量重组多肽的有效条件下培养转化细胞。有效培养条件包括但不限于允许蛋白质生成的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。有效培养基指在其中培养细胞以生成本发明的重组多肽的任何培养基。这种培养基通常包括具有可同化碳、氮和磷酸来源及适当盐、矿物、金属和其他营养例如维生素的水溶液。可在传统发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定盘和培养皿中培养本发明的细胞。培养可在适于重组细胞的温度、pH和氧含量下进行。这种培养条件在本领域中普通技术人员的专业知识范围内。 [0387] 培养预定时间后，实现虾青素的回收并且可进行分光光度分析或通过HPLC分析。 [0388] 本文使用的短语“回收虾青素”指收集含有虾青素的所有发酵培养基而不需要暗指分离或纯化附加步骤。 [0389] 为了在培养后从细菌细胞或培养液收集类胡萝卜素和/或虾青素，例如，可通过离心等从培养液分离细菌细胞并用适当有机溶剂从中萃取。这种有机溶剂的实例包括甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、甲乙酮、甲基异丁基酮、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺和二甲亚砜。其中优选丙酮。进一步地，可通过利用液相色谱法等实现分离和纯化至更高纯度。例如，液相色谱法可能基于离子交换、疏水性相互作用和分子筛的分离原理。优选反相色谱法和正相色谱法。可选地，从细胞萃取可通过超临界流体萃取进行。 [0390] 可选地，完成培养后，例如可通过离心分离、倾析或过滤的方式，从培养液分离出细菌细胞。为获得的细菌细胞加水，以使其变成具有适宜粘度的浆液。为了防止类胡萝卜素例如虾青素分解，可向浆液添加适当添加剂。这种添加剂的实例包括但不限于抗氧化剂例如抗坏血酸。之后，借助于磨床，使用玻璃珠或氧化锆珠或高压匀浆器匀化制备的浆液，并干燥供稍后使用。优选的干燥方法为喷雾干燥。 [0391] 给将细菌细胞直接添加到农场养殖的鱼等的饲料中。可选地，使用之前可将其从如上所述的极性溶剂等中萃取出来。萃取类胡萝卜素例如虾青素后剩余的并且含有少许色素的细胞体可在家禽饲养中用作蛋白质和维生素的理想供给源。 [0392] 应认识到，为清楚起见，在独立实施方案的上下文中描述的本发明某些特征，也可在单个实施方案中以组合提供。相反，为简便起见，在单个实施方案的上下文中描述的本发明各种特征，也可单独或以任何适合的子组合或如其所应，在描述的本发明任何其他实施方案中提供。除非没有那些要素，所述实施方案无效，不得将各实施方案的上下文中描述的某些特征视为那些实施方案的基本特征。 [0394] 实施例 [0395] 现参考下列实施例，实施例与以上描述一起以非限制方式说明了本发明的一些实施方案。 [0396] 通常，本文使用的命名和用于本发明的实验室程序包括分子、生物化学、微生物和重组DNA技术。文献中透彻地解释了这种技术。见，例如，"Molecular Cloning:A laboratory Manual"Sambrook 等，(1989)；"Current Protocols in Molecular Biology"第I-III卷Ausubel,R.M.编辑(1994)；Ausubel等，"Current Protocols in Molecular Biology"，John Wiley 和 Sons、Baltimore、Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning"，John Wiley 和 Sons，New York (1988)；Watson等，"Recombinant DNA"，Scientific American Books，New York；Birren等(编辑)"Genome Analysis:A Laboratory Manual Series"，第1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；美国专利No.4,666,828、4,683,202、4,801,531、 5,192,659和5,272,057中提出的方法论；"Cell Biology:A Laboratory Handbook"，第 I-III 卷 Cellis,J.E. 编 辑 (1994)；"Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique"，Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994)， 第 3 版；"Current Protocols in Immunology"第I-III 卷Coligan J.E.编 辑(1994)；Stites等( 编 辑 )，"Basic and Clinical Immunology"( 第 8 版 )，Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi( 编 辑 )，"Selected Methods in Cellular Immunology",W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；在专利和科学文献中广泛描述了可用的免疫测定法，见，例如美 国 专 利 No.3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、 3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、 4,879,219、5,011,771 和 5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J. 编 辑(1984)；“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D. 和 Higgins S.J. 编 辑 (1985)； "Transcription and Translation"Hames,B.D.和Higgins S.J.编辑(1984)；"Animal Cell Culture"Freshney,R.I. 编 辑 (1986)；"Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press,(1986)；"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984) 和"Methods in Enzymology" 第 1-317 卷，Academic Press；"PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications"，Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak 等，"Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual"CSHL Press(1996)；其全部以引用的方式并入，如同本文完全阐述一样。本文件全篇提供了其他一般参考文献。据信其中的程序在本领域中众所周知并且是为了读者方便儿提供。其中所含的全部信息以引用的方式并入本文。 [0397] 通用材料和方法 [0398] 菌株、培养基和试剂：除非另有说明，用于克隆和构建体装配的菌株为大肠杆菌DH5α。为了纯化质粒DNA，在37℃下于补充了适合抗生素的LB培养基中培养细胞并且使用标准试剂盒(Qiagen,Germany)从培养物中纯化DNA。所有引物均由Sigma Aldrich,Israel合成。在下文，表2中可找到引物的详细描述。表2 [0399] [0400] [0401] [0402] 使用Phusion聚合酶(Finnzymes,Finland)进行PCR反应。使用克隆管理人 员 专 业 套件 (Clone manager professional suite)(Scientific&Educational Software,State Line,US-PA)设计克隆程序。除非另有说明，限制酶购自New England BioLabs(Beverly,US-MA)。使用T4DNA连接酶(Fermentas,Lithuania)进行连接反应。在下文，表3中可找到所有实验、试剂、供应商和相关产品编码的详细描述。 [0403] 表3 [0404] [0405] [0406] “无本底”装配：总体克隆方案：研发“无本底”装配策略，目的是为了促进多个DNA序列连续装配到单个构建体中。根据下面描述的方法论生成所有DNA构建体。“无本底”装配遵守在“生物砖标准装配的等幂载体设计”(worldwide webdspacedotmitdotedu/handle/1721.1/21168)中描述的原理，也称为生物砖标准。除保持生物砖系统中描述的主要特征外，还增加了附加特征，消除了在整个多步骤装配过程中筛选和验证中间构建体装配正确的需要。 [0407] 所述方法的关键特征是氯霉素抗性标记(CmR)的串联：组成型启动子后面是氯霉素乙酰转移酶编码序列，指定用于装配的每个DNA序列。装配过程之前，使用PCR重叠延伸R R使Cm盒与DNA序列配对。当使用标准限制-连接过程将DNA靶序列(现与Cm 配对)装配到载体中时，仅恰当装配的克隆能够在补充了Cm的琼脂板上形成菌落。 [0408] 因为抗性盒侧面为限制位点(图1)，所以在为下一个装配循环制备载体时，可容易地去除。以这种方式，可能在使用单个抗性标记的同时进行多轮装配。图1中描述了“无本底”装配策略的总体方案。 [0409] 氯霉素抗性盒的构建：抗性盒含有组成型启动子和作物抗性标记的氯霉素乙酰转移酶基因。使用pSB3C5质粒作为模板(BioPart:BBa_P1004)，经PCR扩增所述盒。因为添加了限制位点，所以抗性盒侧面为5’的NheI位点及其3'的PciI位点(上文，表1)。 [0410] 抗性盒与靶序列配对：使用标准装配PCR反应，使指定用于装配的每个DNA序列与Cm抗性盒接合。在靶序列上游添加含NsiI位点的绝缘子序列，而在下游添加序列GCTAGCGTTG (SEQ ID NO:1)。后一个序列含NheI(有下划线)位点和Cm抗性盒起点的20bp同源区(黑体)。同源序列使得能够在靶序列和所述盒之间进行重叠延伸PCR，有效地使得目标序列能够与抗性标记配对。PCR反应使用序列特异性正向引物和一般反向引物(Cm-R，表1)进行。所得到的PCR产物(即与抗性盒串联的靶序列)经凝胶纯化并且可亚克隆至载体中或用适合的限制酶直接消化。 [0411] 选择一组紧凑的RBS序列以跨过表达空间：为找到一小组跨过大部分表达空间的RBS序列，使用Salis等的论文，Nature Biotechnology 27,946-950(2009)中经实验分析的正向工程化RBS系列。首先，用计算机计算与各基因连接的每个RBS序列的预期翻译速率[Salis实验室：在salisdotpsudotedu/software/上的核糖体结合位点计算器]。选择强度似乎受下游序列影响最小的RBS序列。从该有限组，挑选实验上跨过最大表达空间的5个RBS序列[Salis等，Nature Biotechnology 27,946-950(2009)]。 [0412] 这些RBS序列为： [0413] #8(RBS-A)：AGGAGGTTTGGA(SEQ ID NO:2) [0414] #1(RBS-B)：AACAAAATGAGGAGGTACTGAG(SEQ ID NO:3) [0415] #17(RBS-C)：AAGTTAAGAGGCAAGA(SEQ ID NO:4) [0416] #27(RBS-D)：TTCGCAGGGGGAAG(SEQ ID NO:5) [0417] #20(RBS-E)：TAAGCAGGACCGGCGGCG(SEQ ID NO:6) [0418] “失效-RBS”(RBS-F)：CACCATACACTG(SEQ ID NO:7) [0419] 侧翼“绝缘子”序列：因为在RBS侧面的序列可影响表达水平，所以使用绝缘子序列-位于每个RBS上游和下游～20bp的恒定序列。先前已经报道这种分离序列在所述启动子的情况下，对降低侧翼序列的效应有效。将上游绝缘子序列当作是19个碱基对，在大肠杆菌中非天然存在：TAATAGAAATAATTTTGTTTAACTTTA(SEQ ID NO:8)，而将下游绝缘子序列当作是ATGCATCATCACCATCACCAC(SEQ ID NO:9)，编码6His-标签的序列。 [0420] 靶ORF的RBS调节：为了克隆靶编码序列用于RBS调节，首先将其经PCR扩增并且与如上所述的Cm抗性标记配对。一旦靶基因与抗性盒配对，产物就连接到线性BlueScript KS+质粒中。然后使用NsiI和PciI(非条码装配)或NsiI和XhoI从质粒上切除靶ORF。然后将所得到的含靶序列和抗性标记的片段装配到在插入位点上游含RBS序列的RBS骨架载体(RBS骨架)上。所得到的构建体含所需RBS，后面是靶ORF和抗性标记，如图2所述。 [0421] pNiv-骨架质粒：使用Bluescript Ks+作为基础构建骨架质粒。消除LacZ基因并且原有多个克隆位点同含EcoRI、SpeI和PciI限制位点的新位点交换(图3)。为了将整个装配过程中的泄露基因表达减到最少，在新克隆位点上游插入强RRNB终止子(用pENTER11-Gateway作为模板通过PCR扩增)。所有DNA序列修饰均通过使用PCR突出延伸法实现。 [0422] pNiv:RBS-A-YFP到pNiv:RBS-F-YFP-质粒组：6个核心RBS序列的每一个和侧翼绝缘子序列均作为合成寡脱氧核苷酸购买。每个核心RBS序列侧面为上游和下游绝缘序列并且在装配PCR反应中与YFP报告基因融合(见表1)。所得到的6种RBS-YFP反应产物(即，RBS-A到RBS-F)受限制并且连接到骨架质粒pNiv中，以产生6种指定质粒pNiv:[RBS-A到RBS-F]-YFP-见图4。 [0423] 表达质粒：DNA装配过程在不含指定启动子的pNiv骨架质粒上进行。一旦所述装配过程完成，就将所得到的产物亚克隆到表达质粒-pSB4K5:Ptac中。这种质粒源自pSB4K5，具有低拷贝pSC101复制起点(BioPart：BBa_I50042)和卡那霉素抗生素抗性标记(BioPart：BBa_P1003)的生物砖标准载体。使用标准装配方法将LacIq砖块(BioPart：BBa_C0012)和Tac启动子(BioPart：BBa_K301000)装配到pSB4K5上，多克隆位点的上游，以产生pSB4K5:Ptac(图5)。 [0424] 使用流式细胞术实验测量RBS表达调节：为了在体内表达水平上量化RBS序列的作用，使用先前描述的克隆策略使YFP报告基因置于pSB4K5:Ptac质粒上每个RBS序列的上游。用pSB4K5:Ptac-[RBS-A to RBS-F]-YFP质粒转化大肠杆菌MG1655细胞并且在37℃下于补充了0.2％葡萄糖的最小培养基中培养，直至指数生长中期(OD＝～0.3)。使用BD LSR II流式细胞仪量化荧光。用蓝色激光器(488nm)和530±30nm发射滤光片测量YFP荧光并且用黄色激光器(560nm)和610±20nm发射滤光片测量mCherry荧光。每次实验记录到～100,000个细胞(图6A-D)。图7中说明了预测RBS强度与实验测量之间的相关性。 [0425] pNiv-RBS混合物制备：分别用NsiI和PciI消化6种pNiv-RBS-YFP质粒的每一种，将从骨架载体去除YFP。用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)处理消化产物并且经凝胶纯化。制备所得6种线性载体的等摩尔混合物，每种载体仅在克隆位点上游的RBS序列上不同。这种载体混合物(pRBS混合物)用于进行与任何靶标的单管组合装配(图8)。 [0426] RBS混合物的组合装配：对于任何目标编码序列而言，如上所述克隆编码序列。为了使编码序列与RBS组组合配对，将编码序列亚克隆到线性pRBS载体混合物中。这样产生连接产物的混合物：全部含有相同编码序列，但是上游具有各种RBS序列(RBS-A到RBS-F)(图8)。 [0427] 装配受RBS调节的合成操纵子：所得到的文库，含构建体混合物，全部具有相同编码序列，但是上游具有各种RBS序列(RBS-A到RBS-F)，可用作载体或插入片段。首先，通过使用NheI和PciI限制所述混合物，去除抗性盒并且可将质粒文库用作向其中装配更多受RBS调节的编码序列的载体。可选地，通过用SpeI和PciI消化所述混合物，可能切除编码序列(连同上游RBS一起)并将其用作插入片段，进行更多轮装配。 [0428] 为了装配操纵子库-其中每种变体含有相同基因组合，但具有不同RBS组合，如上所述构建每个所需基因的RBS调节混合物。然后进行迭代装配步骤，其中在每一步，连同操纵子一起添加受RBS调节的附加编码序列。在每一步，如图9所示用NheI和PciI消化前一轮的产物，去除Cm抗性盒。用CIP处理反应产物并且经凝胶纯化。纯化产物，无Cm抗性的线性载体，在下一装配步骤中用作载体。 [0429] 为了将受RBS调节的附加编码序列装配到操纵子上，使用SpeI和PciI消化指定插入片段的RBS调节混合物，产生在编码序列和抗性盒上游含有RBS序列混合物的DNA片段。该片段连接到操纵子库中(已经隐匿了第一受RBS调节的编码序列)。该装配过程产生了受RBS调节的编码序列的组合混合物，其中每个变体在编码序列上游具有不同RBS组成。将所述文库转化到大肠杆菌DH5α中并接种于补充了Cm的LB琼脂板上。与最后并入的基因配对的抗性盒确保了只有含新添加RBS调节序列的构建体将继续更多轮装配。 [0430] 通过直接从所述板上刮下菌落并且提取编码操纵子库的质粒，从所述板回收来自新构建操纵子库的质粒DNA。因此，通过重复该过程N轮，其中在每一轮向组合操纵子库添加一个受RBS调节的附加编码序列，本发明人依次装配了按预定顺序含N个相同编码序列并且受6个RBS的不同组合驱动的质粒组合混合物。 [0431] 条码RBS混合物-方法：因为受RBS调节的编码序列的操纵子库以组合方式构造，所以需要为整个操纵子上的所有RBS序列测序，以便测定特定克隆的RBS组成。为了促进该过程并且消除为分布在操纵子上的所有RBS测序的需要，本发明人为每个RBS分配了3碱基对条码序列。这些条码使其能够在如图10所述的堆叠条码的3’末端，使用单次测序反应，容易地测定每个克隆的全部RBS组成。 [0432] 条码计算如下：为每个RBS(A-F)分配一个数字(1-6)，然后将数字编码在2-字母DNA码中。给定的2-字母码字(例如，b1b2)通过公式b1+4*b2映射到特定数字，其中b1和b2是分配给码字碱基的数值(见下表)。对于本实例而言，AT变为0+4*2＝8。 [0433] 表4 [0434]碱基 数值 A 0 G 1 T 2 C 3 [0435] 添加第三碱基，作为校对碱基。由前两个碱基计算该碱基，如下：b3＝(b1+5*b2)％4，其中‘％’表示模运算符。该校对碱基允许检测任何单碱基突变或测序错误。下面的表5提供了每个RBS的条码值。注意，虽然此处仅使用了6个RBS，但是使用3bp方案可能编码总计多达16个RBS。所述方法也可升级到更高的文库尺寸，码长呈对数比例增加。 [0436] 表5 [0437]代码[带校对碱基] 数值 RBS-A AAA 0 RBS-B GAG 1 RBS-C TAT 2 RBS-D CAC 3 RBS-E AGG 4 RBS-F GGT 5 [0438] 为pNiv-RBS组添加条码：含RBS-YFP插入片段(RBS-A到RBS-F)的6种pNiv质粒的每一种均用作PCR反应的模板，其中使用指定引物(表2)添加了条码碱基和限制位点。在条码区的上游添加了XhoI限制位点，而在下游添加了SalI和PstI位点。分别用NsiI和XhoI消化6种pNiv-RBS-YFP-条码质粒的每一种，去除YFP编码序列。如上文所述，制备所得6种线性载体的等摩尔混合物(即，pRBS-混合物)。 [0439] 使用条码RBS混合物单管组合装配：除由限制酶的不同用途引起的少数技术变化外，条码RBS质粒组的用途依赖于如上所述的相同基因座。首先如上所述克隆靶编码序列并使用NsiI和XhoI消化。插入片段与pRBS-条码混合物连接并且在DH5α细胞中转化。下面在图11中描述了所述过程的示意图描述。 [0440] 为简单起见，图11所示装配过程仅含装配到操纵子中的两个编码序列，每一个均具有特定RBS。所述过程可迭代扩展附加装配周期。而且，可使用组合RBS混合物代替特定RBS。 [0441] 亚克隆到表达质粒中：完成装配过程后，将所得到的操纵子亚克隆到含指定启动子的表达载体中。这通过使用在最终操纵子侧面的指定限制位点得到。而且，因为表达质粒具有不同于和操纵子配对的Cm标记的抗性标记，所以在经抗生素选择时，仅阳性菌落可以生长，而经自我连接表达质粒或文库供体质粒转化的克隆不能。 [0442] RGB-三色报告基因系统 [0443] 菌株和生长条件：用于克隆和构建体装配过程的菌株为大肠杆菌DH5α。为了测量荧光，将质粒转化到在37℃下于补充了0.2％葡萄糖和氯霉素(34μg/ml)的最小培养基中生长的大肠杆菌K12MG1655中。 [0444] 基因：由下列质粒pRSETB-YFP、pRSETB-CFP和pRSETB-mcherry通过PCR扩增mYFP、mCFP和mCherry。通过引入单个沉默突变除去mCherry基因上的PstI限制位点(见表1)。 [0445] 装配过程：首先使mYFP、mCherry和CFP与如上所述的抗性盒配对。如上一部分所述，使用条码RBS组装配操纵子。用NheI和XhoI限制酶消化pRBS-mYFP-条码1，以便将其用作载体，而用SpeI和SalI消化pRBS-mCherry-条码2，以便将其用作插入片段。连接这两种限制产物，产生新产物pRBS-mYFP-RBS-mCherry-条码2-条码1。用NheI和XhoI消化这种产物作为载体，而用SpeI和SalI消化pRBS-mCFP-条码3作为插入片段，连接所得到的产物以在pNiv质粒中装配下列操纵子：pRBS-mYFP-mcherry-mCFP-条码3-条码2-条码1。接下来，操纵子经消化、亚克隆至如上所述的表达质粒中。 [0446] RGB荧光库的测量 [0447] 自动化荧光测量：使细胞在自动化机器人平台(Evoware II,Tecan)中，在装有M9+0.2％葡萄糖的96孔板上生长。每15min用机器人臂将板转移到多孔荧光计(Infinite M200-pro,Tecan)中。每次测量中，在600nm下为OD取样，通过在587nm下激发和在620nm下发射测量为mCherry取样并且通过在520nm下激发和在555nm下发射测量为YFP取样。 [0448] 数据分析：通过减去装有无细胞的培养基的孔，本底校正OD和荧光的原始数据。 [0449] 由于需要大的动态范围，不可能分析在低细菌浓度下具有弱RBS的孔。因此，本发明人选择在指数生长中期至后期操作。在减去培养基后用酶标仪测量，分析细胞OD600值为0.1左右，相当于1cm标准路径长度下～0.2的OD600。对于每个测量点，将活性定义为集中在测量时间的1h时窗期间荧光的增量除以那段时间内测量的平均OD： [0450] [0451] 其中A为RBS活性，F为荧光测量值并且τ＝30min。结果反映了1h内荧光的增量除以细胞的数量。通过平均每个样品在OD 0.1左右的5次测量，计算平均活性： [0452] [0453] 所有分析步骤均使用自定义Haskell软件进行。 [0454] 细菌菌落的荧光显微镜检查：使用装备有用于照明的 NikonIntensilight(C-HGFIE)的Nikon ECLIPSE E800显微镜得到荧光图像。用Chroma滤光片立方体套装为荧光蛋白成像：mCherry(激发滤光片530–560nm，发射滤光片590–650，暴露 30ms)、青色荧光蛋白(mCFP)(激发滤光片426–446nm，发射滤光片460–500nm，暴露60ms)和黄色荧光蛋白(mYFP)(激发滤光片490–510nm，发射滤光片520–550nm，暴露800ms)。 用相机和NIS-Elements BR3.22软件拍摄图像。覆盖不同通道以给出所示图形。 [0455] 翻译偶联：先前证实了单个操纵子中连续基因的翻译依赖于上游基因，这是一种称为翻译偶联的现象。具体地，基因的表达水平受在其之前的基因的表达水平调节。对于大肠杆菌以及其他原核生物中的各种操纵子，观察到翻译偶联。虽然已经证实了翻译偶联多年，但是仅粗略量化而其根本机制还在争论中。 [0456] 图16D中所示的RGB网格展示了翻译偶联。YFP的荧光仅取决于控制它的RBS的强度，而mCherry的荧光取决于控制它的RBS和YFP的荧光。为进一步分析这种效应，本发明人利用其中YFP受6种RBS(A-F)之一控制，而mCherry受弱RBS(E)、中等强度RBS(C)或强RBS(A)控制的克隆。然后测量每种文库变体的YFP和mCherry的荧光，并且按照相互绘图。 [0457] 获得的网格(图13)明确展示了翻译偶联：第一基因(即YFP)表达水平仅取决于控制它的RBS的强度；使用的RBS越强，测量到的YFP荧光越强。相反，第二基因(mCherry)表达水平取决于控制它的RBS和控制第一基因的RBS。即，共用mCherry的相同RBS的克隆根据上游YFP表达水平显示出不同的mCherry荧光水平。排除了交叉荧光为这种效应的原因的可能：含单个荧光蛋白(YFP或mCherry)的克隆即使对于高水平表达也未在交互荧光通道产生信号。发现在本系统中YFP表达水平最大增强mCherry翻译～6倍。YFP和mCherry水平之间的依赖性在对数等分向量上显示出线性相关性(图13)。线性回归给出的斜率为～1/3(95％置信区间0.26-0.36)。 [0458] 类胡萝卜素生物合成途径的RBS调节 [0459] 菌株和生长条件：用于克隆和构建体装配过程的菌株为大肠杆菌DH5α。为了类胡萝卜素表达，使转化细胞在37℃下于补充了氯霉素(34μg/ml)的LB培养基中生长。 [0460] 虾青素生物合成途径的基因 [0461] 对于虾青素生物合成，使用下列基因： [0462] ●来自成团泛菌的牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸合成酶(crtE)-基因库：AAA21260.1(SEQ ID NO:62)。 [0463] ●来自成团泛菌的前八氢番茄红素焦磷酸合成酶(crtB)-基因库：AAA21264.1(SEQ ID NO:63)。 [0464] ●来自成团泛菌的八氢番茄红素脱氢酶(crtI)-基因库：AAA21263.1(SEQ ID NO:64)。 [0465] ●来自雨生红球藻的异戊烯焦磷酸(idi)-基因库：AAC32208.1(SEQ ID NO:65)。 [0466] ●来自番茄的β-番茄红素环化酶(lcy-B)-基因库：ABR57232.1(SEQ ID NO:66)。 [0467] ●来自菠萝泛菌的β-胡萝卜素羟化酶(crtZ)-Swiss-Prot：P21688.1(SEQ ID NO:67)。 [0468] ●来自葛仙米的β-胡萝卜素酮化酶(crtW)-基因库：BAB74888.1(SEQ ID NO:68)。 [0469] ●来自大肠杆菌的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(dxs)-Swiss-Prot：A7ZX72.1(SEQ ID NO:69)。 [0470] 使用装配PCR合成crtZ，使用Johnson Lab Oligo标记计算用于装配PCR的引物(34)。通过引入沉默突变从所列基因除去限制位点EcoRI、SpeI、NsiI、NheI、PstI和PciI。 [0471] 装配过程：通过PCR扩增idi、crtE、crtB、crtI、lcy-B、crtW、crtZ和dxs，然后与如上所述的抗性盒配对。向如上所述每个基因添加RBS。在迭代过程中根据生物合成途径中基因的顺序装配所述文库。将整个操纵子亚克隆到所述表达质粒中。 [0472] 类胡萝卜素分析 [0473] 类胡萝卜素提取：使携带具有类胡萝卜素途径的生物合成基因的质粒的大肠杆菌细胞在装有100ml LB培养基的摇瓶中的悬浮培养物中生长。培养在37℃下进行。48h后从培养物中取出20ml样品并通过离心收获细胞。用冷水洗涤细胞团块并通过剧烈振荡，用丙酮(20ml)提取类胡萝卜素。通过离心(15,000g)去除提取物的不溶性组分并且将上清液转移到圆底玻璃烧瓶中并使用旋转式蒸发器蒸发。使干燥的提取物重新溶剂化于1.5ml丙酮中并且取50μl样品做HPLC分析。 [0474] 通过HPLC分析类胡萝卜素：在安装有Borwin软件、P4987泵和MD-915光电二极管阵列检测器的高压搅拌的Jasco平台上进行HPLC分析。通过在YMC包ODS-A柱(250×4.6mm，5μm，12nm)上注射50μl，分析样品。溶剂A：75％甲醇水溶液，溶剂B：乙酸乙酯。以下列梯度使用0.6ml/min的溶剂流量：15-85％的B(0-24min)、85％(24-30min)、85-15％(30-34min)、15％(34-74540min)。用光电二极管阵列检测器(300-900nm)在线记录洗脱的类胡萝卜素的光谱。通过用可信标准化合物进行联合色谱法并且分析其紫外-可见光谱鉴定类胡萝卜素化合物。为了量化类胡萝卜素化合物，将完整峰面积与可信标准作比较。用分光光度法(Jasco V-570仪器)测定标准溶液的浓度(35)。对于另外的鉴定，收集通过HPLC分离的峰值物并直接注入质谱仪中(装备有Z-喷雾ESI接口和Waters Masslynx v4.1软件的Micromass Quattro Ultima串联四极质谱计)。由获得的全扫描(ESI(+)，m/z 100-1000)质谱分析相应的质量(36)。 [0475] 照片：使用双目显微镜(WILD M8；Heerbrugg,Switzerland)在可见光下拍摄图16中出现的菌落图片。 [0476] 结果 [0477] 选择先前已经发现跨蛋白质表达的几个数量级的6个RBS序列(9,14)(图15B)。首先，通过将每个序列置于YFP报告基因的上游并使用流式细胞术测量荧光信号，在表达水平上量化不同RBS序列的作用(15)。按表达水平将所述6个RBS降序标记为‘A’到‘F’。 如图15C所示，一小组RBS可跨蛋白质表达水平的几个数量级。接下来，本发明人问到是否可能使用这一小组RBS序列装配同时跨越几个基因的表达空间的文库。生成操纵子库，其中每个成员含有相同基因，但是受不同RBS序列的翻译调控。为达到这个目的，本发明人使每个目标基因与一组RBS序列组合配对并且装配这些RBS-基因构建体以生成合成操纵子库(15)。 [0478] 研发了强化生物砖(16)克隆策略以促进所述装配过程。使用绕过对耗时筛选步骤的需要的正向选择程序，迭代装配遗传部分。简言之，将氯霉素(Cm)抗性盒连接到要装配的所有遗传部分。每一步，将一个附加遗传部分插入构建体中(图15D)，而抗性盒使得能够直接选择恰当装配的构建体。然后通过切除抗性盒“回收”载体用于下一迭代(图15D)。这种策略绕过了中间筛选步骤并且使得能够快速有效的构建操纵子。然后将所得到的操纵子库转化到细胞中并筛选所需表现型。通过为位于基因3’UTR的条码测序(如材料和方法中所述)，进行特定克隆的RBS组成的推断。所述装配过程期间，通过将短小识别序列迭代地串联到操纵子的3’UTR，生成条码。库中的每个遗传变体均含有不同条码序列，在单次测序反应中可由条码序列推断出操纵子中所有基因的RBS组成。 [0479] 为测试RBS组合是否可跨越多维表达空间，构建了三色报告基因系统。CFP、YFP和mCherry各自与本组RBS的代表(RBS序列‘A’、‘C’和‘E’)随机配对并一起装配到操纵子3 中。因此所得到的操纵子库含有3＝27种遗传变体，其中每个成员含顺序相同，但是受不同RBS序列调控的3个基因(图16A)。转化后，菌落显示出不同的颜色图案(图16B)，这是由荧光报告基因的差异表达引起。观察到的颜色空间表明，RBS序列的组合装配可明显调节操纵子内多个基因的表达水平(图16C)。本发明人通过为样品克隆测序并且量化其荧光水平证实，观察到的不同颜色归因于RBS序列的不同组合(15)。另外，本发明人测量了由YFP和mCherry组成的操纵子的荧光水平并且发现了如图16D所示9个集群的网格。每个集群含有具有相同RBS的克隆。而且，集群的分布证明RBS调节在表达空间的每个维度上跨～100倍。显著地，YFP的表达水平仅取决于调控它的RBS序列。在YFP(位于该操纵子的首位)上游具有相同RBS的所有菌落垂直排列并且显示出类似的蛋白质表达水平。然而，mCherry荧光(位于YFP下游)取决于其RBS和上游基因的表达水平(图16D)。发现了超过两个数量级，幂律指数为～1/3的偶联，显示上游基因的表达每增加10倍，表达增加约2倍(图16D)。依赖性并非由于交叉荧光(15)，而是操纵子中相邻基因之间翻译偶联的表现(17)。 [0480] 该三色报告基因系统证明，RBS序列的组合装配可跨越大部分的表达空间。本发明人问到，这种表达调节对代谢途径的操作具有什么影响。为解决这个问题，将构成类胡萝卜素生物合成途径的7个基因克隆到大肠杆菌中。该外源代谢途径的终产物为虾青素，因其有效的抗氧化性而知名的高价值叶黄素(19)。为探究组合RBS调节对大肠杆菌中虾青素生物合成的影响，使类胡萝卜素途径的每个基因与RBS组随机配对并装配到合成操纵子7 (图17A)中。在单根试管中，所得到的文库含6种遗传变体。如图17B所示，经转化的大肠杆菌菌落显示出各种各样的颜色和强度。将每个菌落的颜色图案归因于各自具有独特颜色的不同类胡萝卜素中间产物的差异聚集。 [0481] 通过测序测定克隆样品的RBS组成并且使用HPLC分析类胡萝卜素图谱(15)。图17C显示，在其RBS组成上不同的克隆呈现出不同的类胡萝卜素图谱。一些克隆主要积累单一产物，而其他克隆生成显著水平的各种类胡萝卜素。使用当前的组合RBS方法，可能将虾青素生产率增加到2.6mg/g细胞干重，约为先前在大肠杆菌中生成的两倍之多。而且，将dxs-进入类胡萝卜素途径的基因并入受RBS调节的操纵子中，使虾青素产量增加到5.8mg/g细胞干重。这代表虾青素产量比先前报道的最佳结果增加4倍。 [0482] 虽然已经连同其特定实施方案描述了本发明，但是很明显对于本领域的技术人员而言，许多替代方案、修改和变化将显而易见。相应地，其意图是包括属于所附权利要求的精神和广泛范围内的所有此类替代方案、修改和变化。 [0483] 本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请以引用到说明书中的方式整体并入本文，如同特别单独地指出将每个单独的出版物、专利或专利申请以引用的方式并入本文一样。另外，本申请中对任何参考文献的引用或鉴定均不得解释为承认此类参考文献可用作本发明的先前技术。就使用小节标题来说，不得将其解释为必要限制。 [0484] 参考文献 [0485] 1.P.Lu,C.Vogel,R.Wang,X.Yao,E.M.Marcotte,Absolute protein expression profiling estimates the relative contributions of transcriptional and translational regulation,Nat 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