[0001] 相关申请

[0002] 本申请依35U.S.C.§119要求对美国临时专利申请U.S.S.N.61/548,901(提交于2011年10月19日)；及美国临时专利申请U.S.S.N.61/663,263(提交于2012年6月22日)的优先权，两个申请的题目均为“工程改造的微生物及用于微生物油生产的方法”，其全部内容都通过引用并入本文。

[0003] 政府支持

[0004] 本发明是在政府支持下完成的，所属基金为美国能源部所授予的DE-AR0000059号基金。政府在本发明中拥有特定的权利。

[0005] 发明背景

[0006] 能持续生产的生物燃料是化石燃料的一个替代选择，可以帮助减少对容易开采的化石燃料储备的消耗，同时能够避免化石燃料相关的污染以及温室气体排放，由此能满足不断增长的对可持续获得的能源的需要。发展适合于将碳源有效转化为脂质的方法及产油生物体是微生物生物燃料生产得到广泛应用的前提条件。

[0007] 本发明特定方面的概述

[0008] 如果能达到高的转化产率，那么异养生物的微生物油生产是从可再生资源经济有效生产生物燃料的一个最有前途的路径。由可再生原料的经济有效的微生物油生产的关键是高的碳水化合物向油转化的产率。随着使能技术应用于此，代谢工程已经出现，并且有大量的实例证明成功的途径工程改造能显著地提高微生物生物催化剂在化学、药学和燃料产品的合成中的效能。

[0009] 先前在对微生物进行工程改造用于油生产上的努力聚焦于扩增脂肪酸合成途径中推测的限速步骤。这样的规模扩增有一个显著的缺陷，就是不断增加的碳流进入脂肪酸合成途径会增加了细胞中饱和脂肪酸的水平，由此激活了脂肪酸生物合成中强烈的负反馈循环。

[0010] 本发明的一些方面提供了微生物工程改造的策略，其组合了上游的代谢物形成途径(本文也称为“推”代谢途径)的扩增以及类似的下游产物隔离(sequestering)途径(本文也称为：“拉”代谢途径)中代谢流的增加。本发明的一些方面提供了微生物中推-和-拉修饰的平衡组合，使得大量碳流的扩增进入脂质合成途径，而中间代谢物的浓度不会显著偏离其稳态生理水平，因此避免了对脂质合成的反馈抑制。

[0011] 本公开的一些方面涉及这样的认识，即单一分支修饰如仅推的修饰或仅拉的修饰的对转化效率的效应通常是有限的，因为细胞中有合成产率的补偿性的调控，并且微生物细胞中脂质生物合成的推和拉步骤的和谐调控对脂质生产产生惊人的协同效应。

[0012] 例如，本公开的一些方面提供了遗传修饰的产油微生物，其包含了脂质生物合成途径的不同修饰的组合，本文也称为推拉修饰。在一些实施方式中，本文提供的微生物包含了产生脂质合成中需要的代谢物或中间产物的产率增加的修饰，以及使得细胞中脂质合成的产物的隔离的修饰，如甘油三酯向储存形式的脂质，由此减少了其一些产物如脂肪酸或甘油二酯对脂质合成的反馈抑制。在一些实施方式中，代谢性推和代谢性拉的途径中修饰的组合使得脂质生产有协同性的增加。在一些实施方式中，推修饰使得脂质合成的元件块或脂质合成的代谢物在细胞中的水平增加。在一些实施方式中，拉修饰减少了对脂质合成的反馈抑制。

[0013] 本发明的一些方面提供了包含遗传修饰的微生物，所述修饰同时影响脂质生物合成的推和拉途径。例如，推和拉修饰被引入到产油的模式微生物中——产油酵母解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中。研究甘油三酯(TAG)合成途径中最后一步的甘油二脂乙酰转移酶(DGA1)的过表达，作为示例性的拉修饰。DGA1过表达使得脂质生产比对照微生物中增加4倍，脂质含量达到细胞干重(DCW)的33.8％。研究脂肪酸合成的第一个关键步骤中乙酰基-CoA羧基水解酶(ACC1)作为示例性的推修饰。ACC1过表达使得脂质含量是对照的2倍，达到17.9％的脂质含量。对串联基因表达构建体中同时共表达ACC1和DGA1进行研究作为示例性的推-拉修饰。ACC1和DGA1同时过表达进一步使脂质含量增加到41.4％，表明ACC1+DGA1共表达具有协同效应。

[0014] 在2L生物反应器发酵中，探索了ACC1+DGA1转化子的脂质生产特征，120hr后，脂质含量达到61.7％。发酵过程的脂质积累期中的总体的产率和生产效率分别为0.195g/g和0.143g/L/hr，最大产率和生产效率为0.270g/g和0.253g/L/hr。该研究表明了产油酵母解脂耶氏酵母具有极佳的脂质生产能力，也证明了对脂质合成途径中两个重要步骤进行代谢工程改造的效应，所述改造将流转移至脂质合成并产生TAG合成的驱动力。

[0015] 本发明的一些方面提供了用于产油微生物，例如产油酵母的新型过表达平台。本发明的一些方面提供了表达构建体，其包含启动子(驱动包括编码序列和内含子的转录物的转录)，例如翻译延长因子-1α(TEF)启动子，其位于包含内含子和编码序列的核酸上游。本公开的一些方面提供了能够比无内含子TEF启动子增加表达至少17倍的含内含子的表达构建体。

[0016] 本公开的一些方面提供了分离的产油细胞，其包含了增加DGA1基因产物的表达的遗传修饰。在一个实施方式中，所述分离的产油细胞进一步包含增加ACC1基因产物的表达的遗传修饰。在一些实施方式中，所述分离的产油细胞进一步包含了增加SCD基因产物的表达的遗传修饰。在一些实施方式中，所述分离的产油细胞进一步包含了增加ACL基因产物的表达的遗传修饰。在一些实施方式中，所述遗传修饰包含了增加基因表达的核酸构建体，所述核酸构建体包含(a)包含在合适的同源或异源启动子控制下的、编码基因产物的核酸序列的表达盒，和/或(b)当插入细胞基因组时，调控基因产物的表达水平的核酸序列。在一些实施方式中，启动子是诱导型或组成型的启动子。在一些实施方式中，启动子为TEF启动子。在一些实施方式中，所述表达构建体进一步包含内含子。在一些实施方式中，所述内含子在转录起始位点的下游。在一些实施方式中，内含子在编码基因产物的核酸序列之内。在一些实施方式中，所述核酸构建体抑制或破坏对编码所述基因产物的原生基因的天然调控，导致原生基因的过表达。在一些实施方式中，对原生基因的天然调控的抑制或破坏是通过对调控基因表达的调控区域或调控区域的部分进行删除、破坏、突变和/或置换而介导的。在一些实施方式中，所述基因产物是转录物。在一些实施方式中，所述基因产物是蛋白质。在一些实施方式中，所述核酸构建体插入细胞的基因组内。在一些实施方式中，基因产物的表达增加赋予细胞将碳源转化为脂质，例如脂肪酸，脂肪酸衍生物和/或甘油三酯(TAG)的有益表型。在一些实施方式中，所述有益表型包括修饰的脂肪酸谱、修饰的TAG谱、增加的脂肪酸和/或甘油三酯合成速率、增加的转化产率、增加的细胞中甘油三酯积累，和/或细胞的脂质小体中增加的甘油三酯积累。在一些实施方式中，所述细胞的脂肪酸或TAG的合成速率比相同细胞类型的未修饰细胞增加至少2倍。在一些实施方式中，所述细胞的脂肪酸或TAG的合成速率比相同细胞类型的未修饰细胞增加至少5倍。在一些实施方式中，所述细胞的脂肪酸或TAG的合成速率比相同细胞类型的未修饰细胞增加至少10倍。在一些实施方式中，细胞将碳源转化为脂肪酸或TAG的转化率在大约0.025g/g-大约0.32g/g(例如，所产生的脂质g/所消耗的碳源g)的范围内。在一些实施方式中，细胞将碳源转化为脂肪酸或TAG的转化率为至少大约0.11g/g。在一些实施方式中，细胞将碳源转化为脂肪酸或TAG的转化率为至少大约0.195g/g。在一些实施方式中，细胞将碳源转化为脂肪酸或TAG的转化率为至少大约0.24g/g。在一些实施方式中，细胞将碳源转化为脂肪酸或TAG的转化率为至少大约0.27g/g。在一些实施方式中，所述细胞包含脂质小体或液泡。在一些实施方式中，细胞为细菌细胞、藻类细胞、真菌细胞或酵母细胞。在一些实施方式中，所述细胞为产油酵母细胞。在一些实施方式中，细胞为解脂耶氏酵母细胞。

[0017] 本公开的一些方面提供了包含产油细胞，例如本文所描述的产油细胞的培养物。在一些实施方式中，所述培养物进一步包含碳源。在一些实施方式中，所述碳源包含可发酵糖。在一些实施方式中，所述可发酵糖为C6糖。在一些实施方式中，所述碳源包含葡萄糖。
在一些实施方式中，所述碳源包含有机酸。在一些实施方式中，所述有机酸是醋酸。在一些实施方式中，醋酸浓度为至少5％vol/vol、至少10％vol/vol、至少15％vol/vol、至少
20％vol/vol、至少25％vol/vol或至少30％vol/vol。在一些实施方式中，所述碳源包含醋酸盐。在一些实施方式中，醋酸盐的浓度为至少1％vol/vol。在一些实施方式中，醋酸盐的浓度为至少2％vol/vol。在一些实施方式中，醋酸盐的浓度为至少3％vol/vol。在一些实施方式中，醋酸盐的浓度为至少4％vol/vol。在一些实施方式中，醋酸盐的浓度为至少5％vol/vol。在一些实施方式中，所述培养物包含甘油。在一些实施方式中，甘油浓度为大约2％vol/vol。在一些实施方式中，所述培养物包含溶解氧水平为至少5％、至少
10％、至少15％或至少20％。在一些实施方式中，所述培养物显示的pH在pH7.0-pH7.5范围内。在一些实施方式中，所述培养物包含硫酸铵。在一些实施方式中，所述培养物包含以
1:2比率的硫酸铵和醋酸。在一些实施方式中，所述培养物显示5g/l-60g/l之间的脂质滴度。在一些实施方式中，所述培养物显示0.04g/l/h-0.60g/l/h之间的脂质生产。在一些实施方式中，所述培养物显示0.1g/l/h-1g/l/h之间的最大脂质生产效率。

[0018] 本公开的一些方面提供了方法，包含将碳源和分离的产油细胞接触，所述细胞包含增加DGA1基因产物的表达的遗传修饰；以及将碳源与细胞接触在适合细胞将至少部分碳源转化为脂肪酸或甘油三酯的条件下进行孵育。在一些实施方式中，所述产油细胞进一步包含增加ACC1基因产物的表达的遗传修饰。在一些实施方式中，所述产油细胞进一步包含增加SCD基因产物的表达的遗传修饰。在一些实施方式中，所述产油细胞进一步包含增加ACL基因产物的表达的遗传修饰。在一些实施方式中，所述分离的产油细胞是如本文所描述的工程改造的分离的产油细胞。在一些实施方式中，所述碳源包含可发酵糖。在一些实施方式中，所述碳源包含葡萄糖。在一些实施方式中，所述碳源包含醋酸盐。在一些实施方式中，醋酸盐的浓度为至少1％vol/vol、至少2％vol/vol、至少3％vol/vol、至少4％vol/vol或至少5％vol/vol。在一些实施方式中，所述碳源包含醋酸。在一些实施方式中，醋酸的浓度为至少5％vol/vol、至少10％vol/vol、至少15％vol/vol、至少20％vol/vol、至少25％vol/vol或至少30％vol/vol。在一些实施方式中，所述方法包括将细胞与溶解氧接触，所述溶解氧水平为至少5％、至少10％、至少15％或至少20％。在一些实施方式中，所述的接触和/或孵育是在pH7.0-pH7.5的pH范围内进行的。权利要求53-69中任一项的方法，其中所述方法包括将细胞与硫酸铵接触。在一些实施方式中，所述方法包括将细胞与比率为1:2的硫酸铵和醋酸接触。在一些实施方式中，所述方法进一步包含将细胞与甘油接触。在一些实施方式中，所述方法包括将细胞与浓度为大约2％vol/vol的甘油接触。在一些实施方式中，与分离的产油细胞接触的碳源是在反应器中进行孵育。在一些实施方式中，将碳源与分离的产油细胞接触，并在分批补料过程中进行孵育，使碳源转化为脂肪酸或甘油三酯。在一些实施方式中，将碳源与分离的产油细胞接触，并在连续过程中进行孵育，使碳源转化为脂肪酸或甘油三酯。在一些实施方式中，所述方法进一步包括在孵育步骤中一次或多次地将额外量的碳源或一定量的额外碳源与接触分离产油细胞的碳源接触。在一些实施方式中，通过溶剂萃取法从接触分离的产油细胞的碳源中萃取脂肪酸或甘油三酯。在一些实施方式中，溶剂萃取包括氯仿甲醇萃取。在一些实施方式中，溶剂萃取包括己烷萃取。在一些实施方式中，将脂肪酸或甘油三酯与接触分离的产油细胞的碳源分离，并随后通过酯交换反应进行精炼。

[0019] 本公开的一些方面提供了方法，其包括通过增加细胞中DGA1基因产物的表达以在产油细胞中修饰脂肪酸谱、甘油三酯谱、脂肪酸合成速率、甘油三酯合成速率、脂肪酸衍生物积累的程度、脂肪酸衍生物分泌速率、碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的转化率、和/或碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物转化的有效产率。在一些实施方式中，所述方法进一步包括增加细胞中ACC1基因产物、SCD基因产物和/或ACL基因产物的表达。在一些实施方式中，脂肪酸衍生物积累的程度是脂肪酸衍生物在脂质小体中积累的程度。在一些实施方式中，所述脂肪酸衍生物是甘油三酯。在一些实施方式中，对产油细胞中脂肪酸谱、甘油三酯谱、脂肪酸合成速率、甘油三酯合成速率、脂肪酸衍生物积累的程度、脂肪酸衍生物分泌速率、碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的转化率、和/或碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物转化的有效产率的修饰包含增加产油细胞中的脂肪酸合成速率、甘油三酯合成速率、脂肪酸衍生物积累的程度、脂肪酸衍生物分泌速率、碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的转化率、和/或碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物转化的有效产率。在一些实施方式中，对细胞中碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的转化效率的修饰包含使转化效率增加至少2倍。在一些实施方式中，对细胞中碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的转化效率的修饰包含使转化效率增加至少3倍。在一些实施方式中，对细胞中碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的转化效率的修饰包含使转化效率增加至少4倍。在一些实施方式中，对细胞中碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的转化效率的修饰包含使转化效率增加至少5倍。在一些实施方式中，所述细胞为酵母细胞。在一些实施方式中，所述酵母细胞为耶氏酵母属细胞。在一些实施方式中，所述产油酵母是解脂耶氏酵母。

[0020] 本公开的一些方面提供了分离的核酸分子，其包括:a)编码SEQ ID NO:2(解脂耶氏酵母DGA1)的核苷酸序列，或b)与a)的核苷酸序列至少85％相同的核苷酸序列。在一些实施方式中，编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1。本公开的一些方面提供了表达盒，其包含如本文描述的分离的核酸分子以及异源启动子。在一些实施方式中，启动子是组成型启动子或诱导型启动子。在一些实施方式中，所述异源启动子为翻译延长因子(TEF)启动子。在一些实施方式中，所述异源启动子包含内含子。在一些实施方式中，所述异源启动子进一步包含起始密码子。在一些实施方式中，内含子位于编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列的翻译起始位点的下游。本公开的一些方面提供了载体，其包含如本文所描述的表达盒。本公开的一些方面提供了细胞，其包含如本文所描述的表达盒或本文描述的载体的至少一部分。

[0021] 本申请的主体要素在一些情况下涉及相关产品、对特定问题的备选解决方案，和/或单一系统或物品的大量不同用途。

[0022] 本发明的其他优势、特征以及用途在特定非限制性实施方式的具体描述、附图以及权利要求条款中更显而易见。

[0023] 附图简述

[0024] 图1.解脂耶氏酵母中脂质合成的主要代谢途径总览。

[0025] 图2.培养50小时后不同启动子控制下β-半乳糖苷酶的酶活性。

[0026] 图3.ACC1+DGA1转化子的生物反应器发酵(MTYL065)。

[0027] 图4.2-L生物反应器发酵过程中ACC1+DGA1转化子的脂肪酸谱(FAP)。

[0028] 图5.在2-L生物反应器中生长并以醋酸盐为碳源的ACC+DGA转化子的脂肪酸谱。

[0029] 图6.在醋酸盐上的ACC+DGA1解脂耶氏酵母的脂肪酸生产情况。

[0030] 图7.组合表达构建程序。为构建含有同脂质积累基因靶标的组合的质粒采用的克隆途径和策略。这些质粒随后转化入解脂耶氏酵母以研究脂质积累情况。

[0031] 图8.通过pMT053整合与pMT092比较TEFin-DGA盒的转录表达。

[0032] 图9.表达组合构建体的解脂耶氏酵母菌株之间的相对脂质生产效率和产率，通过将总脂肪酸含量以对照菌株标准化测出。在图下方指示了是(+)或否(-)存在相应基因靶标的转化的过表达盒。以最初培养100小时内相对脂质积累来计算生产效率(浅灰色条形)。产率是通过将脂质积累除以所消耗的糖计算的。培养基的C/N比率为20。结果为多个实验的平均值。

[0033] 图10.靶标基因在菌株MTYL089中的转录表达。表达根据肌动蛋白表达进行内部标准化，并且是与对照(MTYL038)菌株相比较，表达测定在生长66小时后进行。

[0034] 图11.过表达ACC、D9、ACL12和DGA的MTYL089菌株在批式生物反应器的发酵情况。C/N摩尔比率为100。所有取样都进行三次重复。

[0035] 图12.2-L发酵结束时MTYL089的显微镜成像。普通光学显微镜成像(左图)显示了大部分细胞是酵母形式，包含大的液泡。荧光显微成像(右图)表明这些液泡是由中性脂质组成的。

[0036] 图13.MTYL065和MTYL089两种菌株之间的脂肪酸谱对比。取自各个发酵终点的脂肪酸谱，相对总的脂肪酸含量进行标准化。

[0037] 图14.氮(mM)、非脂质和脂质滴度(g/L)的变化趋势。

[0038] 图15.脂质滴度(g/L)、脂质含量(％)和C/N比率的趋势。主坐标轴显示了脂质滴度和脂质含量，以细胞干重％表示。次坐标轴显示了C/N比率。C/N比率在终点时由于醋酸盐快速消耗有所下降。

[0039] 图16.上图——在没有荧光的油浸显微镜(100X)下观察到的“浮游细胞”。下图——荧光下相同视野显示了明亮的红色脂质小体。

[0040] 本发明特定实施方式详述

[0041] 液体生物燃料作为化石燃料的替代品非常有前途，可以帮助减轻对于气候变化的顾虑，并且缓解了供应的不确定性(1)。生物柴油、航空油料和其他油衍生燃料对于航空和重型货车运输是尤其必需的。目前这些产品都是只在蔬菜油中生产，这是一条成本高又不可持续的途径(2)。一个有吸引力的可能性是将可再生的碳水化合物原料非光合作用地转化为油(3)。对于生物柴油，对于油原料从蔬菜油向微生物油生产的转变具有大量的其他优势：能适应多样的物料，在对土地的需求上非常灵活，有效的加工循环转换，并且很容易进行规模扩大(4)。用于微生物生产的生物平台也更容易在遗传上进行操纵，利于进一步的优化。

[0042] 由碳水化合物转化为油的经济有效微生物技术的关键是高碳水化合物向油的转化产率。随着使能技术应用于此，代谢工程已经出现，并且有大量的实例证明成功的途径工程改造能显著地提高微生物催化剂在化学、药学和燃料产品的合成中的效能(5)。先前在工程改造具有高脂质合成的微生物的努力集中于扩大脂肪酸合成途径中推测的限速步骤(6)。然而这些努力都产生了好坏参半的结果，可以是因为调控脂肪酸流导致饱和脂肪酸水平升高，饱和脂肪酸是脂肪酸生物合成酶的有力的变构抑制剂，也为脂肪酸生物合成创造了负反馈循环(7)。本文描述了结合上游代谢物形成途径的扩大和类似地增加下游代谢物消耗途径中代谢流的方法。如果得到平衡，则这种推-和-拉策略可产生大的代谢流的扩增，而中间产物代谢物的浓度不会明显偏离其的稳态生理水平。

[0043] 产油酵母解脂耶氏酵母是生物柴油生产的一个有吸引力候选者，其也在其他工业应用中有广泛用途：柠檬酸生产、蛋白质生产(例如，蛋白酶和酯酶)以及生物修复(8-10)。随着对其基因组的完全测序和遗传工程工具不断完善，要完成对解脂耶氏酵母的工程改造相对容易(11)。而且还发现解脂耶氏酵母在培养基中生长旺盛，能够在多种底物上生长，并且也可用于在农业工业废品、工业甘油及工业脂肪上生产脂质(12-14)。其具有极佳的脂质积累能力，通常能积累高达36％细胞干重(DCW)的脂质(15)。

[0044] 已经开始对解脂耶氏酵母中从头开始的脂质合成的代谢途径进行完整的作图，图1中阐明了目前的脂质合成模型：进入糖酵解过程的葡萄糖会进入线粒体，用作TCA循环中的丙酮酸；然而，多余的乙酰-CoA是通过柠檬酸穿梭途径从线粒体进入细胞溶胶的。然后细胞溶胶中的乙酰-CoA被乙酰-CoA羧化酶(ACC)转化为丙二酰-CoA，这是脂肪酸合成的第一个步骤。在脂肪酸合成后，甘油三酯(TAG)合成沿着肯尼迪途径进行，这是在内质网(ER)和脂质小体中进行的。酰基-CoA是酰基化成甘油-3-磷酸骨架以形成溶血磷脂酸(LPA)的前体，后者进一步酰基化形成磷脂酸(PA)。随后PA去磷酸化形成二脂酰甘油(DAG)，最后二脂酰甘油酰基转移酶(DGA)进行一步酰化反应产生TAG。

[0045] 乙酰-CoA从线粒体向细胞溶胶的运输是通过以下进行的：ATP-通过柠檬酸穿梭的柠檬酸裂解酶(ACL)介导的柠檬酸裂解产生乙酰-CoA和草酰乙酸(OAA)。然后乙酰-CoA羧化酶(ACC)催化进行脂质生物合成的第一个关键步骤，将细胞溶胶中乙酰-CoA转化为丙二酰-CoA，后者是脂肪酸链延伸的主要前体。然后完整的脂肪酰-CoA链被运输到内质网(ER)或脂质小体膜，通过肯尼迪途径进行甘油三酯(TAG)的最后组装。解脂耶氏酵母中生产的超过80％的储存脂质都是TAG形式(16)。细胞溶胶OAA被苹果酸脱氢酶转化为苹果酸并运输回线粒体，以完成柠檬酸穿梭循环。NADPH形式的还原性等价物可由磷酸戊糖途径或转氢酶途径中的苹果酸酶来提供。在解脂耶氏酵母中，有高的PPP代谢流且苹果酸酶过表达没有效果，这表明前者是NADPH的主要来源(4,17)。

[0046] 细胞内脂质积累可经由两种方法进行：从头开始的脂质合成或外源脂肪酸和脂质的外部并入。在营养供应耗尽时又有多余碳源存在下，最常发生脂质的积累。在培养中，这种状态通常与静止期的开始相吻合。在实践中，最常用的限制性营养是氮，因为在培养基组合物中非常容易控制氮的含量(15)。除了这些可诱导的条件，脂质合成途径是受到高度调节的，这样生物体能够使细胞生长与能量储存达到平衡。例如，仅仅是ACC就在多个水平上受到多种因素的调节(7)。

[0047] 这种紧密的调节在特定情况下也可以进行规避。通过消除过氧化物酶体氧化途径及对甘油代谢进行工程改造，解脂耶氏酵母能够通过从头脂质积累达到40％-70％脂质(18,19)。Δ6-和Δ12-去饱和酶基因的共表达使得细胞产生显著量的γ-亚麻酸(GLA)(20)。然而，在解脂耶氏酵母中工程改造脂质生物合成途径相对而言依然没有得到很好的探索，人们依然在发展用于有效工程改造脂质生产途径以使产率最大化的策略。

[0048] 本公开的一些方面提供了工程改造的微生物，用于生产生物燃料或生物燃料前体。术语“生物燃料”指的是衍生于生物学来源如活细胞、微生物、真菌或植物的燃料。该术语包括例如直接由生物学来源获得，例如，通过常规萃取、蒸馏或精炼方法得到的燃料，以及通过加工获自生物学来源的生物燃料前体而生产的燃料，如通过化学修饰如酯交换步骤进行加工。直接获得的生物燃料的实例为酒精类，如乙醇、丙醇和丁醇，脂肪和油。可通过加工生物燃料前体(例如脂质)而获得的生物燃料的实例为生物柴油(例如通过对脂质进行酯交换反应产生)以及绿色柴油/改性油染料(例如通过对油进行脱氢反应产生)。生物柴油，也称为脂肪酸甲酯(或乙酯)是现今在经济上最重要的生物燃料之一，可以通过对脂质进行酯交换反应在工业规模上进行生产，在所述酯交换反应中，氢氧化钠和甲醇(或乙醇)与脂质如甘油三酯发生反应，产生生物柴油和甘油。

[0049] 生物柴油的工业规模生产的原料包括动物脂肪、植物油、棕榈油、麻、大豆、油菜籽、亚麻、向日葵、油质和产油藻类。在其他方法中，由微生物将生物质转化为生物燃料前体如脂质，随后将所述前体进行萃取并进一步加工生成生物燃料。术语“生物质”指的是通过培养和/或繁殖活细胞或生物体(例如微生物)产生的物质。生物质可以包含细胞、微生物和/或细胞间内含物，例如细胞脂肪酸和TAGS，以及细胞外物质。细胞外物质包括但不限于细胞分泌的化合物，例如分泌到细胞外的脂肪酸或TAG。用于生物燃料生产的重要的生物质类型为藻类生物质和植物衍生的生物质，例如玉米秸秆和木纤维。在一些实施方式中，用于生物燃料或生物燃料前体生产的生物质可包含植物衍生的糖类，例如蔗糖或玉米衍生糖类。

[0050] 本公开的一些方面涉及脂质的微生物来源的工程改造和开发，其可用于例如经济上可行的工业规模生物柴油生产。术语“脂质”指的是脂肪酸及其衍生物。相应地，脂质的实例包括脂肪酸(FA，包括饱和及不饱和)；甘油酯或甘油脂，也称为酰基甘油(如单甘油酯(单酰基甘油)、甘油二酯(二酰基甘油)、甘油三酯(三酰基甘油，TAG，或中性脂肪)；磷酸甘油酯(甘油磷酸酯)；非甘油酯(鞘脂，固醇脂，包括胆固醇和类固醇激素，异戊烯醇脂包括萜类，脂肪醇，蜡和聚酮化合物)；以及复合脂质衍生物(糖连接的脂质或糖脂，和蛋白连接的脂质)。脂质是活细胞和微生物细胞质膜中至关重要的部分。一些细胞和微生物还生产脂质用于储存能量，例如以三酰基甘油的形式，存在于脂质小体、脂肪滴或液泡中。

[0051] 本发明的一些方面涉及工程改造的微生物用于生物燃料或生物燃料前体的生产。在一些实施方式中，本文提供的微生物经过工程改造以优化其脂质代谢以生产脂质。术语“脂质代谢”指的是涉及脂质的制造或降解的分子过程。脂肪酸合成、脂肪酸氧化、脂肪酸去饱和、TAG合成、TAG储存以及TAG降解都是细胞中脂质代谢组成部分的实例。因此，术语“脂肪酸代谢”指的是涉及脂肪酸合成、产生、转化或降解的所有细胞或生物体的过程。脂肪酸合成、脂肪酸氧化、脂肪酸去饱和、TAG合成以及TAG降解都是细胞中脂肪酸代谢组成部分的实例。

[0052] 术语“三酰基甘油”(TAG，有时也称为甘油三酯)指的是如下分子，其包含通过酯键共价连接于三个脂肪酸分子(为一元的脂肪族羧酸)的甘油的单个分子，在甘油分子的三个羟基(OH)基团上分别连接一个脂肪酸分子。三酰基甘油是代谢能量的高度浓缩的储备，因为其特征为体积小、不含水，并且是生物柴油生产的合适的原料。

[0053] 许多细胞和生物体都以脂肪酸和脂肪酸衍生物的形式储存代谢能量，如TAG。脂肪酸及其衍生物，如TAG，提供了储存代谢能量的理想形式。在C-C键中包含的能量可通过β-氧化反应得到有效释放，这在形式上是等价于脂肪酸生物合成的逆反应的一个反应过程，但是是由不同的酶组成的不同分子途径介导和调节的。微生物可由外部供应、内部转换及从头合成而获取脂肪酸。本发明的一些方面涉及基于微生物有效地从外部供应的碳源合成及储存脂肪酸或脂肪酸衍生物如TAG的能力，鉴别用于生物燃料或生物燃料前体生产的微生物。

[0054] 天然脂肪酸分子通常具有4-28个碳原子的无分支的脂肪链或尾巴。如果脂肪链的所有碳原子都是经由C-C单键连接，则脂肪酸被称为“饱和的”，如果两个或更多个碳原子是经由C-C双键连接，则脂肪酸被称为“不饱和的”。不饱和脂肪酸在膜的流动性、细胞活性、代谢和控制基因转录的核内事件中起重要作用。

[0055] 酵母中的脂肪酸谱主要由C16和C18脂肪酸组合，例如棕榈酸(C16)、棕榈油酸(C16)、硬脂酸(C18)和油酸(C18)。棕榈酸是无支链的饱和脂肪酸，脂肪链具有16个碳原子(碳原子/不饱和键：16.0)。硬脂酸是无支链的饱和脂肪酸，脂肪链有18个碳原子(18.0)。棕榈油酸是单不饱和脂肪，脂肪链有16个碳原子(16.1)。油酸是单不饱和脂肪，脂肪链有
18个碳原子(18.1)。酵母中有少数脂肪酸种类包括C14和C26脂肪酸，这些在蛋白质修饰中起至关重要的作用或分别作为鞘脂及GPI锚定物的组成部分。

[0056] 脂肪酸的从头合成利用了大量代谢物、乙酰-CoA、ATP和NADPH，因此与依赖于这些化合物的其他细胞过程相竞争。脂肪酸延伸循环中有两个还原步骤都需要NADPH，这将脂肪酸合成与细胞的代谢状态关联起来，使脂肪酸合成被限制在细胞具有高的能量负荷(表现为ATP/AMP比率增加，还原性当量升高及乙酰-CoA库升高)的条件下。几乎所有亚细胞细胞器都参与到脂肪酸代谢中，这表明脂肪酸平衡的维持需要在多种水平上进行调节。生成用于脂质生物合成的代谢物、乙酰-CoA、ATP或NADPH的脂质合成步骤在本文中有时被称为脂质合成的“推步骤”。例如通过过表达介导如代谢物生产过程的基因产物对增加细胞中脂质生物合成的代谢物、乙酰-CoA、ATP或NADPH的生产的这些过程进行扩增，在本文有时被称为“推修饰”。

[0057] 包括酵母在内的大多数生物体能够由多种碳源从头合成脂肪酸。在起始步骤中，乙酰-CoA由乙酰-CoA羧化酶(ACC；在酵母中由ACC1和HFA1编码)通过将CO2添加到丙二酰-CoA上进行羧化。生物素是该反应中一个至关重要的辅助因子，其通过生物素：载脂蛋白连接酶(在酵母中由BPL1/ACC2编码)这种酶的作用共价连接于ACC载脂蛋白上。ACC是一种具有三重功能的酶，其具有生物素羧基运载蛋白(BCCP)结构域、生物素-羧化酶(BC)结构域和羧基转移酶(CT)结构域。在多数细菌中，这些结构域是作为单独的多肽表达，并组装成异聚体复合物。相反，包括线粒体ACC变体(酵母中的Hfa1)在内的真核ACC是在单多肽上具有上述这些功能。由ACC产生的丙二酰-CoA在由脂肪酸合成酶、FAS和延伸酶催化的循环系列反应中作为两个碳原子的供体发挥作用。

[0058] 从头开始的脂肪酸合成的直接产物是饱和脂肪酸。已知在包括酵母在内的真核细胞中，饱和脂肪酸是不饱和脂肪酸的前体。通常不饱和脂肪酸是通过由特殊的酶类(称为去饱和酶)对饱和脂肪酸中的C-C单键进行去饱和作用而产生的。对掌控饱和脂肪酸向不饱和脂肪酸的转化的控制机制还没有得到深入了解。在真核细胞中，不饱和脂肪酸在膜的流动性、细胞活性、代谢和控制基因转录的细胞核事件的调控中起重要作用。通常，酵母脂肪酸的大约80％为单不饱和脂肪酸，这意味着它们在其脂肪链上含有一个不饱和键。

[0059] 脂肪酸是脂肪酸合成的有效抑制剂，脂肪酸对脂肪酸合成的反馈抑制是对微生物进行工程改造用于油生产的主要障碍。本公开的一些方面是基于这样的认识，即尽管脂质合成的推修饰通常不能盖过脂肪酸介导的脂质合成的反馈抑制，然而推修饰(例如ACC1过表达)与拉修饰(例如DGA1过表达)的组合能有效地绕过反馈抑制，由此全面实现脂质合成途径的碳流增加，例如在细胞的脂质小体或液泡中储存的TGA。

[0060] 本公开的一些方面提供了工程改造微生物用于油生产的策略。在一些实施方式中，这些策略采用了对产油微生物如解脂酵母进行遗传工程改造，以同时扩增脂质合成的推和拉步骤。如本文所公开的，使用这些策略使得产油酵母宿主细胞中的脂质生产得到显著增加。

[0061] 本公开的一些方面基于这样的认识，即推-和-拉修饰如同时扩增生产脂质合成途径的代谢物生产的代谢步骤及隔离脂质合成的合成产物介导的反馈抑制的代谢步骤，导致进入脂质合成途径的碳流比只有推或只有拉修饰的工程改造情况得到显著增加。本发明的一些方面涉及一项惊人的发现，即DGA1基因产物在产油微生物如解脂耶氏酵母中的过表达导致向脂质合成途径中碳流的极大增加，同时过表达ACC1基因产物与DGA1过表达产生协同作用，导致推-和-拉修饰的微生物具有碳流特性极大地增强，这一点适合于由多种碳底物进行工业规模的油生产。

[0062] 对微生物中的代谢物生成步骤(如丙二酰-CoA的产生)以及产物隔离代谢步骤(如二酰基甘油酰基化成为三酰基甘油)进行平衡的调控会使得进入脂质合成的净碳流有显著增加，这一发现对在工程改造的细胞的帮助下以可再生碳源转化为生物燃料或生物燃料前体为目标的过程具有重要意义。基于本发明的一些方面，现在对微生物如产油酵母(如解脂耶氏酵母)的脂质合成代谢进行修饰是可以的，以这样的方式进行：赋予高度希望的表型以进行工业规模的碳水化合物向生物燃料或生物燃料前体的转化，例如脂肪酸合成、TAG合成，以及脂质小体或液泡中脂肪酸和TAG储存的极大增加。

[0063] 根据本发明的一些方面，在根据本文提供的方法微生物中修饰脂质代谢使得能够生成优化的用于生物燃料或生物燃料前体生产过程的微生物，所述方法为例如同时过表达介导代谢物生成(推)步骤的基因产物以及介导产物隔离(拉)步骤的基因产物。本发明的一些方面提供了用于工程改造微生物中脂肪酸代谢的策略和方法，使得微生物中脂肪酸及脂肪酸衍生物的合成速率及累积得到增加，这是通过同时扩增脂质生物合成的推步骤和拉步骤而进行的。

[0064] 本发明的一些方面提供了方法，其包括遗传修饰，使得调控用于生物燃料或生物燃料前体生产的微生物的脂质代谢的基因产物表达和/或活性得到调制。根据本发明的一些方面，这些遗传修饰的目标是增加碳水化合物向脂肪酸和/或TAG的转化，以优化所修饰的微生物用于由碳源(例如碳水化合物)的大规模生产脂质。根据本发明的一些方面所提供的一些修饰，如对特定基因产物的过表达、敲除、敲低、激活和/或抑制可单独发挥作用或与本领域技术人员已知的其他修饰组合而发挥作用。术语“修饰”指的是遗传操纵，例如对特定基因产物的过表达、敲除、敲低、激活和/或抑制；以及非遗传操纵，例如对生长培养基、底物、底物预处理、pH、温度、转化过程等等的操纵。

[0065] 基因表达的修饰——在本文也称作对基因表达的调制——可以是对天然的表达调节的破坏或抑制，对给定基因的过表达、表达的抑制或完全消除。将异源启动子插入原生基因序列，如原生DGA1或ACC1基因序列的上游，或在启动子内部删除调控序列，如介导饱和脂肪酸对DGA1或ACC1基因的反馈抑制的调控序列，这些都是对表达的天然调控的破坏或抑制的实例。用于调制基因表达的策略可包括遗传改变，例如通过重组技术如基因靶向或病毒转导进行；或非遗传改变，例如对已知会导致基因表达上调或下调的环境进行改变；或调制子的瞬时递送，例如将药物或小RNA分子递送至靶标细胞。用于对微生物进行遗传和非遗传改变的方法对本领域技术人员已知，在例如以下著作中有所描述：J.Sambrook和D.Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press；3rd edition(January15,2001)；David C.Amberg,Daniel J.Burke； 和 Jeffrey N.Strathern,Methods in Yeast Genetics:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(April2005)；John N.Abelson,Melvin I.Simon,Christine Guthrie,和Gerald R.Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Part A,Volume194(Methods in Enzymology Series,194),Academic Press(March11,2004)；
Christine Guthrie和Gerald R.Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology,Part B,Volume350(Methods in Enzymology,Vol350),Academic Press；
1st edition(July2,2002)；Christine Guthrie 和 Gerald R.Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology,Part C,Volume351,Academic Press；
1st edition(July9,2002)；Gregory N.Stephanopoulos,Aristos A.Aristidou 和Jens Nielsen,Metabolic Engineering:Principles and Methodologies,Academic Press；1edition(October16,1998)；以 及 Christina Smolke,The Metabolic Pathway Engineering Handbook:Fundamentals,CRC Press；1edition(July28,2009)，其以全部并入本文作为参考。宿主细胞包括细菌、酵母、藻类、昆虫、哺乳动物和植物细胞。

[0066] 如本文所使用的，术语“过表达”指的是给定基因产物在给定细胞、细胞类型或细胞状态中表达水平相比于参考细胞得到增加，所述参考细胞为例如相同细胞类型的野生型细胞或相同细胞类型但缺乏特定修饰(例如遗传修饰)的细胞。解脂耶氏酵母细胞中DGA1和/或ACC1基因的驱动的持续表达显示浓度饱和脂肪酸，这样的浓度会在野生型细胞中抑制DGA1或ACC1基因表达，这是基因过表达的一个实例。

[0067] 本发明一些方面提供了用于操纵微生物中二酰基甘油酰基转移酶1(DGA1)基因产物的活性用于生物燃料或生物燃料前体生产的方法。DGA1基因编码酰基转移酶，其催化三酰基甘油(TAG)形成的最后一步，使用酰基-CoA作为酰基供体对二酰基甘油进行酰基化作用。此酰基转移酶反应的结果是产生了三酰基甘油，其不会显示像脂肪酸本身那样的对脂肪酸合成的抑制反馈效应。TAG通常储存在产脂细胞的脂质小体或液泡中。在一些实施方式中，所述的操纵为过表达。在一些实施方式中，所述操纵是通过将用于生物燃料或生物燃料前体生产的微生物与包含编码DGA1基因产物(例如DGAT2蛋白质)并可操作地连接于异源启动子如组成型或诱导型启动子的核酸的表达构建体接触而产生效应的。在一些实施方式中，编码DGA1基因产物的核酸包含SEQ ID NO:1的编码序列。在一些实施方式中，所述DGA1为解脂耶氏酵母DGA1,例如包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的解脂耶氏酵母DGA1。在一些实施方式中，所述微生物为解脂耶氏酵母。在一些实施方式中，对微生物中DGA1基因产物活性的操纵能够赋予其有益的表型以将碳水化合物大规模地转化为脂质，所述表型为例如增加的脂肪合成速率、增加的碳水化合物至脂质的转化效率、增加的脂质储存和、增加的生长速率、对碳源或脂质产物浓度升高的耐受性增加。DGA1基因及基因产物序列对于本领域技术人员是已知的。示例性地，代表基因和基因产物序列可在NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中以索引号XM_504700找到。

[0068] DGA1核酸及蛋白质序列的合适序列的非限制性实例在下文提供。其他的合适的DGA1序列，包括来自其他物种的序列对本领域技术人员是清楚的，本发明在此方面并不受到限制。

[0069] >gi|50554582|ref|XM_504700.1|解脂耶氏酵母YALI0E32769p(YALI0E32769g)mRNA,完全cds

[0070] ATGACTATCGACTCACAATACTACAAGTCGCGAGACAAAAACGACACGGCACCCAAAATCGCGGGAATCCGATATGCCCCGCTATCGACACCATTACTCAACCGATGTGAGACCTTCTCTCTGGTCTGGCACATTTTCAGCATTCCCACTTTCCTCACAATTTTCATGCTATGCTGCGCAATTCCACTGCTCTGGCCATTTGTGATTGCGTATGTAGTGTACGCTGTTAAAGACGACTCCCCGTCCAACGGAGGAGTGGTCAAGCGATACTCGCCTATTTCAAGAAACTTCTTCATCTGGAAGCTCTTTGGCCGCTACTTCCCCATAACTCTGCACAAGACGGTGGATCTGGAGCCCACGCACACATACTACCCTCTGGACGTCCAGGAGTATCACCTGATTGCTGAGAGATACTGGCCGCAGAACAAGTACCTCCGAGCAATCATCTCCACCATCGAGTACTTTCTGCCCGCCTTCATGAAACGGTCTCTTTCTATCAACGAGCAGGAGCAGCCTGCCGAGCGAGATCCTCTCCTGTCTCCCGTTTCTCCCAGCTCTCCGGGTTCTCAACCTGACAAGTGGATTAACCACGACAGCAGATATAGCCGTGGAGAATCATCTGGCTCCAACGGCCACGCCTCGGGCTCCGAACTTAACGGCAACGGCAACAATGGCACCACTAACCGACGACCTTTGTCGTCCGCCTCTGCTGGCTCCACTGCATCTGATTCCACGCTTCTTAACGGGTCCCTCAACTCCTACGCCAACCAGATCATTGGCGAAAACGACCCACAGCTGTCGCCCACAAAACTCAAGCCCACTGGCAGAAAATACATCTTCGGCTACCACCCCCACGGCATTATCGGCATGGGAGCCTTTGGTGGAATTGCCACCGAGGGAGCTGGATGGTCCAAGCTCTTTCCGGGCATCCCTGTTTCTCTTATGACTCTCACCAACAACTTCCGAGTGCCTCTCTACAGAGAGTACCTCATGAGTCTGGGAGTCGCTTCTGTCTCCAAGAAGTCCTGCAAGGCCCTCCTCAAGCGAAACCAGTCTATCTGCATTGTCGTTGGTGGAGCACAGGAAAGTCTTCTGGCCAGACCCGGTGTCATGGACCTGGTGCTACTCAAGCGAAAGGGTTTTGTTCGACTTGGTATGGAGGTCGGAAATGTCGCCCTTGTTCCCATCATGGCCTTTGGTGAGAACGACCTCTATGACCAGGTTAGCAACGACAAGTCGTCCAAGCTGTACCGATTCCAGCAGTTTGTCAAGAACTTCCTTGGATTCACCCTTCCTTTGATGCATGCCCGAGGCGTCTTCAACTACGATGTCGGTCTTGTCCCCTACAGGCGACCCGTCAACATTGTGGTTGGTTCCCCCATTGACTTGCCTTATCTCCCACACCCCACCGACGAAGAAGTGTCCGAATACCACGACCGATACATCGCCGAGCTGCAGCGAATCTACAACGAGCACAAGGATGAATATTTCATCGATTGGACCGAGGAGGGCAAAGGAGCCCCAGAGTTCCGAATGATTGAGTAA(SEQ ID NO:1)

[0071] >gi|50554583|ref|XP_504700.1|YALI0E32769p[解脂耶氏酵母]

[0072] MTIDSQYYKSRDKNDTAPKIAGIRYAPLSTPLLNRCETFSLVWHIFSIPTFLTIFMLCCAIPLLWPFVIAYVVYAVKDDSPSNGGVVKRYSPISRNFFIWKLFGRYFPITLHKTVDLEPTHTYYPLDVQEYHLIAERYWPQNKYLRAIISTIEYFLPAFMKRSLSINEQEQPAERDPLLSPVSPSSPGSQPDKWINHDSRYSRGESSGSNGHASGSELNGNGNNGTTNRRPLSSASAGSTASDSTLLNGSLNSYANQIIGENDPQLSPTKLKPTGRKYIFGYHPHGIIGMGAFGGIATEGAGWSKLFPGIPVSLMTLTNNFRVPLYREYLMSLGVASVSKKSCKALLKRNQSICIVVGGAQESLLARPGVMDLVLLKRKGFVRLGMEVGNVALVPIMAFGENDLYDQVSNDKSSKLYRFQQFVKNFLGFTLPLMHARGVFNYDVGLVPYRRPVNIVVGSPIDLPYLPHPTDEEVSEYHDRYIAELQRIYNEHKDEYFIDWTEEGKGAPEFRMIE(SEQ ID NO:2)[0073] 本发明的一些方面提供了用于在用于生物燃料或生物燃料前体生产的微生物如解脂耶氏酵母中操纵乙酰-CoA羧化酶(ACC)基因产物的方法。ACC基因产物介导了乙酰-CoA向丙二酰-CoA的转化，其中前者为脂肪酸合成中主要的C2-前体，此步骤被认为是脂肪酸合成中第一个关键步骤，因此被认为也是脂肪酸合成中的限速步骤(见Cao Y,Yang J,Xian M,Xu X,Liu W.Increasing unsaturated fatty acid contents in Escherichia coli by coexpression of three different genes.Appl Microbiol Biotechnol.2010)。在一些实施方式中，ACC活性操纵是将ACC进行过表达。在一些实施方式中，所述操纵是通过将用于生物燃料或生物燃料前体生产的微生物与包含编码ACC基因产物(例如ACC1蛋白)的核酸的表达构建体接触而实现，所述核酸可操作地连接于异源启动子如组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，编码ACC基因产物的核酸包含SEQ ID NO:3的编码序列。
在一些实施方式中，ACC基因产物是包含SEQ ID NO:4氨基酸序列的ACC1蛋白质。在一些实施方式中，微生物中ACC的过表达增加了脂肪酸合成速率及/或赋予微生物有益的表型，用于将碳水化合物大规模转化为生物燃料或生物燃料前体，例如增加的脂质合成速率、增加的碳水化合物向脂质转化效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、增加的对特定物质如碳源、生物燃料或生物燃料前体的浓度的耐受性。ACC基因及基因产物序列对本领域技术人员是已知的。示例性地，代表基因和基因产物序列可在NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中在登记号GeneID:855750和2909424的条目下,或以索引号NC_006069找到。

[0074] 合适的ACC核酸序列和蛋白质序列的非限制性实例在下文提供。其他的合适的ACC序列，包括来自其他物种的序列对本领域技术人员是清楚的，本发明在此方面并不受到限制。

[0075] ACC编码核酸序列：

[0076] atgcgactgcaattgaggacactaacacgtcggtttttcaggtgagtaaacgacggtggccgtggc cacgacagccgaggcgtcacgatgggccagacgagcacattctcgccgccacaacctcgccagca caagaaactaacccagtatggcttcaggatcttcaacgccagatgtggctcccttggtggacccca acattcacaaaggtctcgcctctcatttctttggactcaattctgtccacacagccaagccctcaaaa gtcaaggagtttgtggcttctcacggaggtcatacagttatcaacaaggtgagtatttgacgtttaga ctgtataacaggcggccgcagtgcaacaacgaccaaaaagggtcgaaaaagggtcgaaaacgg acacaaaagctggaaaacaagagtgtaatacattcttacacgtccaattgttagacaaacacggct gttcggtcccaaaaccaccagtatcacctattttccacttgtgtctcggatctgatcataatctgatct caagatgaaatttacgccaccgacatgatattgtgattttcggattctccagaccgagcagattcca gcaataccaccacttgcccaccttcagcggcctctcggcgcgattcgccactttccccaacgagtgtt actaacccaggtcctcatcgctaacaacggtattgccgcagtaaaggagatccgttcagtacgaaa atgggcctacgagacctttggcgacgagcgagcaatctcgttcaccgtcatggccacccccgaaga tctcgctgccaacgccgactacattagaatggccgatcagtacgtcgaggtgcccggaggaaccaa caacaacaactacgccaacgtcgagctgattgtcgacgtggctgagcgattcggcgtcgatgccgt gtgggccggatggggccatgccagtgaaaatcccctgctccccgagtcgctagcggcctctccccg caagattgtcttcatcggccctcccggagctgccatgagatctctgggagacaaaatttcttctacca ttgtggcccagcacgcaaaggtcccgtgtatcccgtggtctggaaccggagtggacgaggttgtgg ttgacaagagcaccaacctcgtgtccgtgtccgaggaggtgtacaccaagggctgcaccaccggtc ccaagcagggtctggagaaggctaagcagattggattccccgtgatgatcaaggcttccgaggga ggaggaggaaagggtattcgaaaggttgagcgagaggaggacttcgaggctgcttaccaccagg tcgagggagagatccccggctcgcccatcttcattatgcagcttgcaggcaatgcccggcatttgga ggtgcagcttctggctgatcagtacggcaacaatatttcactgtttggtcgagattgttcggttcagc gacggcatcaaaagattattgaggaggctcctgtgactgtggctggccagcagaccttcactgcca tggagaaggctgccgtgcgactcggtaagcttgtcggatatgtctctgcaggtaccgttgaatatct gtattcccatgaggacgacaagttctacttcttggagctgaatcctcgtcttcaggtcgaacatccta ccaccgagatggtcaccggtgtcaacctgcccgctgcccagcttcagatcgccatgggtatccccct cgatcgaatcaaggacattcgtctcttttacggtgttaaccctcacaccaccactccaattgatttcga cttctcgggcgaggatgctgataagacacagcgacgtcccgtcccccgaggtcacaccactgcttg 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cgctctagaggtgattggaaccaccaactcggatctcaaccacattttcatcaacttctcagccgtct ttgctctgaagcccgaggaggttgaagctgcctttggcggtttcctggagcgatttggccgacgtctg tggcgacttcgagtcaccggtgccgagatccgaatgatggtatccgaccccgaaactggctctgctt tccctctgcgagcaatgatcaacaacgtctctggttacgttgtgcagtctgagctgtacgctgaggcc aagaacgacaagggccagtggattttcaagtctctgggcaagcccggctccatgcacatgcggtct atcaacactccctaccccaccaaggagtggctgcagcccaagcggtacaaggcccatctgatgggt accacctactgctatgacttccccgagctgttccgacagtccattgagtcggactggaagaagtatg acggcaaggctcccgacgatctcatgacttgcaacgagctgattctcgatgaggactctggcgagc tgcaggaggtgaaccgagagcccggcgccaacaacgtcggtatggttgcgtggaagtttgaggcc aagacccccgagtaccctcgaggccgatctttcatcgtggtggccaacgatatcaccttccagattg gttcgtttggccctgctgaggaccagttcttcttcaaggtgacggagctggctcgaaagctcggtatt cctcgaatctatctgtctgccaactctggtgctcgaatcggcattgctgacgagctcgttggcaagta caaggttgcgtggaacgacgagactgacccctccaagggcttcaagtacctttacttcacccctgag tctcttgccaccctcaagcccgacactgttgtcaccactgagattgaggaggagggtcccaacggc gtggagaagcgtcatgtgatcgactacattgtcggagagaaggacggtctcggagtcgagtgtctg cggggctctggtctcattgcaggcgccacttctcgagcctacaaggatatcttcactctcactcttgtc acctgtcgatccgttggtatcggtgcttaccttgttcgtcttggtcaacgagccatccagattgagggc cagcccatcattctcactggtgcccccgccatcaacaagctgcttggtcgagaggtctactcttccaa cttgcagcttggtggtactcagatcatgtacaacaacggtgtgtctcatctgactgcccgagatgatc tcaacggtgtccacaagatcatgcagtggctgtcatacatccctgcttctcgaggtcttccagtgcct gttctccctcacaagaccgatgtgtgggatcgagacgtgacgttccagcctgtccgaggcgagcag tacgatgttagatggcttatttctggccgaactctcgaggatggtgctttcgagtctggtctctttgac aaggactctttccaggagactctgtctggctgggccaagggtgttgttgttggtcgagctcgtcttgg cggcattcccttcggtgtcattggtgtcgagactgcgaccgtcgacaatactacccctgccgatcccg ccaacccggactctattgagatgagcacctctgaagccggccaggtttggtaccccaactcggcctt caagacctctcaggccatcaacgacttcaaccatggtgaggcgcttcctctcatgattcttgctaact ggcgaggcttttctggtggtcagcgagacatgtacaatgaggttctcaagtacggatctttcattgtt gatgctctggttgactacaagcagcccatcatggtgtacatccctcccaccggtgagctgcgaggtg gttcttgggttgtggttgaccccaccatcaactcggacatgatggagatgtacgctgacgtcgagtct cgaggtggtgtgctggagcccgagggaatggtcggtatcaagtaccgacgagacaagctactgga caccatggctcgtctggatcccgagtactcctctctcaagaagcagcttgaggagtctcccgattctg aggagctcaaggtcaagctcagcgtgcgagagaagtctctcatgcccatctaccagcagatctccg tgcagtttgccgacttgcatgaccgagctggccgaatggaggccaagggtgtcattcgtgaggctct tgtgtggaaggatgctcgtcgattcttcttctggcgaatccgacgacgattagtcgaggagtacctca ttaccaagatcaatagcattctgccctcttgcactcggcttgagtgtctggctcgaatcaagtcgtgg aagcctgccactcttgatcagggctctgaccggggtgttgccgagtggtttgacgagaactctgatg ccgtctctgctcgactcagcgagctcaagaaggacgcttctgcccagtcgtttgcttctcaactgaga aaggaccgacagggtactctccagggcatgaagcaggctctcgcttctctttctgaggctgagcgg gctgagctgctcaaggggttgtga(SEQ ID NO:3)

[0077] >gi|50548503|ref|XP_501721.1|YALI0C11407p[解脂耶氏酵母]

[0078] MRLQLRTLTRRFFSMASGSSTPDVAPLVDPNIHKGLASHFFGLNSVHTAKPSKVKEFVASHGGHTVINKVLIANNGIAAVKEIRSVRKWAYETFGDERAISFTVMATPEDLAANADYIRMADQYVEVPGGTNNNNYANVELIVDVAERFGVDAVWAGWGHASENPLLPESLAASPRKIVFIGPPGAAMRSLGDKISSTIVAQHAKVPCIPWSGTGVDEVVVDKSTNLVSVSEEVYTKGCTTGPKQGLEKAKQIGFPVMIKASEGGGGKGIRKVEREEDFEAAYHQVEGEIPGSPIFIMQLAGNARHLEVQLLADQYGNNISLFGRDCSVQRRHQKIIEEAPVTVAGQQTFTAMEKAAVRLGKLVGYVSAGTVEYLYSHEDDKFYFLELNPRLQVEHPTTEMVTGVNLPAAQLQIAMGIPLDRIKDIRLFYGVNPHTTTPIDFDFSGEDADKTQRRPVPRGHTTACRITSEDPGEGFKPSGGTMHELNFRSSSNVWGYFSVGNQGGIHSFSDSQFGHIFAFGENRSASRKHMVVALKELSIRGDFRTTVEYLIKLLETPDFEDNTITTGWLDELISNKLTAERPDSFLAVVCGAATKAHRASEDSIATYMASLEKGQVPARDILKTLFPVDFIYEGQRYKFTATRSSEDSYTLFINGSRCDIGVRPLSDGGILCLVGGRSHNVYWKEEVGATRLSVDSKTCLLEVENDPTQLRSPSPGKLVKFLVENGDHVRANQPYAEIEVMKMYMTLTAQEDGIVQLMKQPGSTIEAGDILGILALDDPSKVKHAKPFEGQLPELGPPTLSGNKPHQRYEHCQNVLHNILLGFDNQVVMKSTLQEMVGLLRNPELPYLQWAHQVSSLHTRMSAKLDATLAGLIDKAKQRGGEFPAKQLLRALEKEASSGEVDALFQQTLAPLFDLAREYQDGLAIHELQVAAGLLQAYYDSEARFCGPNVRDEDVILKLREENRDSLRKVVMAQLSHSRVGAKNNLVLALLDEYKVADQAGTDSPASNVHVAKYLRPVLRKIVELESRASAKVSLKAREILIQCALPSLKERTDQLEHILRSSVVESRYGEVGLEHRTPRADILKEVVDSKYIVFDVLAQFFAHDDPWIVLAALELYIRRACKAYSILDINYHQDSDLPPVISWRFRLPTMSSALYNSVVSSGSKTPTSPSVSRADSVSDFSYTVERDSAPARTGAIVAVPHLDDLEDALTRVLENLPKRGAGLAISVGASNKSAAASARDAAAAAASSVDTGLSNICNVMIGRVDESDDDDTLIARISQVIEDFKEDFEACSLRRITFSFGNSRGTYPKYFTFRGPAYEEDPTIRHIEPALAFQLELARLSNFDIKPVHTDNRNIHVYEATGKNAASDKRFFTRGIVRPGRLRENIPTSEYLISEADRLMSDILDALEVIGTTNSDLNHIFINFSAVFALKPEEVEAAFGGFLERFGRRLWRLRVTGAEIRMMVSDPETGSAFPLRAMINNVSGYVVQSELYAEAKNDKGQWIFKSLGKPGSMHMRSINTPYPTKEWLQPKRYKAHLMGTTYCYDFPELFRQSIESDWKKYDGKAPDDLMTCNELILDEDSGELQEVNREPGANNVGMVAWKFEAKTPEYPRGRSFIVVANDITFQIGSFGPAEDQFFFKVTELARKLGIPRIYLSANSGARIGIADELVGKYKVAWNDETDPSKGFKYLYFTPESLATLKPDTVVTTEIEEEGPNGVEKRHVIDYIVGEKDGLGVECLRGSGLIAGATSRAYKDIFTLTLVTCRSVGIGAYLVRLGQRAIQIEGQPIILTGAPAINKLLGREVYSSNLQLGGTQIMYNNGVSHLTARDDLNGVHKIMQWLSYIPASRGLPVPVLPHKTDVWDRDVTFQPVRGEQYDVRWLISGRTLEDGAFESGLFDKDSFQETLSGWAKGVVVGRARLGGIPFGVIGVETATVDNTTPADPANPDSIEMSTSEAGQVWYPNSAFKTSQAINDFNHGEALPLMILANWRGFSGGQRDMYNEVLKYGSFIVDALVDYKQPIMVYIPPTGELRGGSWVVVDPTINSDMMEMYADVESRGGVLEPEGMVGIKYRRDKLLDTMARLDPEYSSLKKQLEESPDSEELKVKLSVREKSLMPIYQQISVQFADLHDRAGRMEAKGVIREALVWKDARRFFFWRIRRRLVEEYLITKINSILPSCTRLECLARIKSWKPATLDQGSDRGVAEWFDENSDAVSARLSELKKDASAQSFASQLRKDRQGTLQGMKQALASLSEAERAELLKGL(SEQ ID NO:4).

[0079] 本发明的一些方面提供了用于在用于生物燃料或生物燃料前体生产的微生物中操纵硬脂酰-CoA-去饱和酶(SCD)活性的方法。SCD是一种Δ9去饱和酶，其能够在偶联于CoA的硬脂酸的C9和C10之间插入双键，这是生成去饱和脂肪酸及其衍生物的一个关键步骤，这在本文其他地方有更详尽的描述。在一些实施方式中，所述操纵是进行过表达。在一些实施方式中，所述操纵是通过将用于生物燃料或生物燃料前体生产的微生物与包含编码SCD基因产物(例如SCD蛋白)的核酸的表达构建体接触而实现，所述核酸可操作地连接于异源启动子如组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，编码SCD基因产物的核酸包含SEQ ID NO:5的编码序列。在一些实施方式中，SCD基因产物是解脂耶氏酵母的SCD，例如包含SEQ ID NO:6氨基酸序列的解脂耶氏酵母SCD。在一些实施方式中，所述微生物为解脂耶氏酵母在一些实施方式中，微生物中对SCD活性的操纵赋予微生物有益的表型，用于将碳水化合物大规模转化为生物燃料或生物燃料前体，例如增加的脂质合成速率、增加的碳水化合物向脂质转化效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、增加的对碳源或脂质产物浓度升高的耐受性。硬脂酰-CoA去饱和酶基因及基因产物序列对本领域技术人员是已知的。示例性地，代表基因和基因产物序列可在NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中在登记号GeneID:852825的条目下找到。

[0080] 合适的SCD核酸序列和蛋白质序列的非限制性实例在下文提供。其他的合适的SCD序列，包括来自其他物种的序列对本领域技术人员是清楚的，本发明在此方面并不受到限制。

[0081] >gi|50548052|ref|XM_501496.1|解脂耶氏酵母YALI0C05951p(YALI0C05951g)mRNA,完整cds

[0082] ATGGTGAAAAACGTGGACCAAGTGGATCTCTCGCAGGTCGACACCATTGCCTCCGGCCGAGATGTCAACTACAAGGTCAAGTACACCTCCGGCGTTAAGATGAGCCAGGGCGCCTACGACGACAAGGGCCGCCACATTTCCGAGCAGCCCTTCACCTGGGCCAACTGGCACCAGCACATCAACTGGCTCAACTTCATTCTGGTGATTGCGCTGCCTCTGTCGTCCTTTGCTGCCGCTCCCTTCGTCTCCTTCAACTGGAAGACCGCCGCGTTTGCTGTCGGCTATTACATGTGCACCGGTCTCGGTATCACCGCCGGCTACCACCGAATGTGGGCCCATCGAGCCTACAAGGCCGCTCTGCCCGTTCGAATCATCCTTGCTCTGTTTGGAGGAGGAGCTGTCGAGGGCTCCATCCGATGGTGGGCCTCGTCTCACCGAGTCCACCACCGATGGACCGACTCCAACAAGGACCCTTACGACGCCCGAAAGGGATTCTGGTTCTCCCACTTTGGCTGGATGCTGCTTGTGCCCAACCCCAAGAACAAGGGCCGAACTGACATTTCTGACCTCAACAACGACTGGGTTGTCCGACTCCAGCACAAGTACTACGTTTACGTTCTCGTCTTCATGGCCATTGTTCTGCCCACCCTCGTCTGTGGCTTTGGCTGGGGCGACTGGAAGGGAGGTCTTGTCTACGCCGGTATCATGCGATACACCTTTGTGCAGCAGGTGACTTTCTGTGTCAACTCCCTTGCCCACTGGATTGGAGAGCAGCCCTTCGACGACCGACGAACTCCCCGAGACCACGCTCTTACCGCCCTGGTCACCTTTGGAGAGGGCTACCACAACTTCCACCACGAGTTCCCCTCGGACTACCGAAACGCCCTCATCTGGTACCAGTACGACCCCACCAAGTGGCTCATCTGGACCCTCAAGCAGGTTGGTCTCGCCTGGGACCTCCAGACCTTCTCCCAGAACGCCATCGAGCAGGGTCTCGTGCAGCAGCGACAGAAGAAGCTGGACAAGTGGCGAAACAACCTCAACTGGGGTATCCCCATTGAGCAGCTGCCTGTCATTGAGTTTGAGGAGTTCCAAGAGCAGGCCAAGACCCGAGATCTGGTTCTCATTTCTGGCATTGTCCACGACGTGTCTGCCTTTGTCGAGCACCACCCTGGTGGAAAGGCCCTCATTATGAGCGCCGTCGGCAAGGACGGTACCGCTGTCTTCAACGGAGGTGTCTACCGACACTCCAACGCTGGCCACAACCTGCTTGCCACCATGCGAGTTTCGGTCATTCGAGGCGGCATGGAGGTTGAGGTGTGGAAGACTGCCCAGAACGAAAAGAAGGACCAGAACATTGTCTCCGATGAGAGTGGAAACCGAATCCACCGAGCTGGTCTCCAGGCCACCCGGGTCGAGAACCCCGGTATGTCTGGCATGGCTGCTTAG(SEQ ID NO:5)

[0083] >gi|50548053|ref|XP_501496.1|YALI0C05951p[解脂耶氏酵母]

[0084] MVKNVDQVDLSQVDTIASGRDVNYKVKYTSGVKMSQGAYDDKGRHISEQPFTWANWHQHINWLNFILVIALPLSSFAAAPFVSFNWKTAAFAVGYYMCTGLGITAGYHRMWAHRAYKAALPVRIILALFGGGAVEGSIRWWASSHRVHHRWTDSNKDPYDARKGFWFSHFGWMLLVPNPKNKGRTDISDLNNDWVVRLQHKYYVYVLVFMAIVLPTLVCGFGWGDWKGGLVYAGIMRYTFVQQVTFCVNSLAHWIGEQPFDDRRTPRDHALTALVTFGEGYHNFHHEFPSDYRNALIWYQYDPTKWLIWTLKQVGLAWDLQTFSQNAIEQGLVQQRQKKLDKWRNNLNWGIPIEQLPVIEFEEFQEQAKTRDLVLISGIVHDVSAFVEHHPGGKALIMSAVGKDGTAVFNGGVYRHSNAGHNLLATMRVSVIRGGMEVEVWKTAQNEKKDQNIVSDESGNRIHRAGLQATRVENPGMSGMAA(SEQ ID NO:6)

[0085] 本发明的一些方面提供了用于在用于生物燃料或生物燃料前体生产的微生物中操纵ATP-柠檬酸裂解酶(ACL)活性的方法。ACL通过裂解作为TCA循环产物从线粒体中穿梭出来的柠檬酸而提供细胞溶胶乙酰-CoA。ACL基因产物将柠檬酸裂解为草酰乙酸和乙酰-CoA，由此为ACC提供了乙酰-CoA底物，后者随后介导乙酰-CoA(这是脂肪酸合成中的主要C2-前体)向丙二酰-CoA的转化,这一过程被视为脂肪酸合成中的第一关键步骤并在本文其他地方会有更详尽的描述。在一些实施方式中，ACL基因产物是由分别的基因编码的两个亚基组成的蛋白质。在一些实施方式中，ACL基因产物是由相同基因编码的两个亚基组成的。在一些实施方式中，所述操纵是进行过表达。在一些实施方式中，所述操纵是通过将用于生物燃料或生物燃料前体生产的微生物与包含编码ACL基因产物(例如ACL蛋白)的核酸的表达构建体接触而实现，所述核酸可操作地连接于异源启动子如组成型或诱导型启动子。在一些实施方式中，编码ACL基因产物的核酸包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的编码序列。在一些实施方式中，所述ACL是解脂耶氏酵母的ACL，例如包含SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10氨基酸序列的解脂耶氏酵母ACL。在一些实施方式中，所述微生物为解脂耶氏酵母。在一些实施方式中，微生物中对ACL活性的操纵赋予微生物有益的表型，用于将碳水化合物大规模转化为生物燃料或生物燃料前体，例如增加的脂质合成速率、增加的碳水化合物向脂质转化效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、增加的对碳源或脂质产物浓度升高的耐受性。ATP-柠檬酸裂解酶基因及基因产物序列对本领域技术人员是已知的。示例性地，代表基因和基因产物序列可在NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中在GeneID:2912101和2910381的条目下找到。

[0086] 合适的ACL核酸序列和蛋白质序列的非限制性实例在下文提供。其他的合适的ACL序列，包括来自其他物种的序列对本领域技术人员是清楚的，本发明在此方面并不受到限制。

[0087] ATP柠檬酸裂解酶(解脂耶氏酵母)亚基1，ACL1DNA

[0088] YALI0E34793g

[0089] XM_504787

[0090] atgtctgccaacgagaacatctcccgattcgacgcccctgtgggcaaggagcaccccgcctacgag ctcttccataaccacacacgatctttcgtctatggtctccagcctcgagcctgccagggtatgctgga cttcgacttcatctgtaagcgagagaacccctccgtggccggtgtcatctatcccttcggcggccagt tcgtcaccaagatgtactggggcaccaaggagactcttctccctgtctaccagcaggtcgagaagg ccgctgccaagcaccccgaggtcgatgtcgtggtcaactttgcctcctctcgatccgtctactcctcta ccatggagctgctcgagtacccccagttccgaaccatcgccattattgccgagggtgtccccgagcg acgagcccgagagatcctccacaaggcccagaagaagggtgtgaccatcattggtcccgctaccg tcggaggtatcaagcccggttgcttcaaggttggaaacaccggaggtatgatggacaacattgtcg cctccaagctctaccgacccggctccgttgcctacgtctccaagtccggaggaatgtccaacgagct gaacaacattatctctcacaccaccgacggtgtctacgagggtattgctattggtggtgaccgatac cctggtactaccttcattgaccatatcctgcgatacgaggccgaccccaagtgtaagatcatcgtcct ccttggtgaggttggtggtgttgaggagtaccgagtcatcgaggctgttaagaacggccagatcaa gaagcccatcgtcgcttgggccattggtacttgtgcctccatgttcaagactgaggttcagttcggcc acgccggctccatggccaactccgacctggagactgccaaggctaagaacgccgccatgaagtct gctggcttctacgtccccgataccttcgaggacatgcccgaggtccttgccgagctctacgagaaga tggtcgccaagggcgagctgtctcgaatctctgagcctgaggtccccaagatccccattgactactc ttgggcccaggagcttggtcttatccgaaagcccgctgctttcatctccactatttccgatgaccgag gccaggagcttctgtacgctggcatgcccatttccgaggttttcaaggaggacattggtatcggcgg tgtcatgtctctgctgtggttccgacgacgactccccgactacgcctccaagtttcttgagatggttct catgcttactgctgaccacggtcccgccgtatccggtgccatgaacaccattatcaccacccgagct ggtaaggatctcatttcttccctggttgctggtctcctgaccattggtacccgattcggaggtgctctt gacggtgctgccaccgagttcaccactgcctacgacaagggtctgtccccccgacagttcgttgata ccatgcgaaagcagaacaagctgattcctggtattggccatcgagtcaagtctcgaaacaaccccg atttccgagtcgagcttgtcaaggactttgttaagaagaacttcccctccacccagctgctcgactac gcccttgctgtcgaggaggtcaccacctccaagaaggacaacctgattctgaacgttgacggtgct attgctgtttcttttgtcgatctcatgcgatcttgcggtgcctttactgtggaggagactgaggactac ctcaagaacggtgttctcaacggtctgttcgttctcggtcgatccattggtctcattgcccaccatctc gatcagaagcgactcaagaccggtctgtaccgacatccttgggacgatatcacctacctggttggc caggaggctatccagaagaagcgagtcgagatcagcgccggcgacgtttccaaggccaagactc gatcatag(SEQ ID NO:7)[0091] ATP柠檬酸裂解酶(解脂耶氏酵母)亚基1，ACL1蛋白质

[0092] YALI0E34793p

[0093] XP_504787

[0094] MSANENISRFDAPVGKEHPAYELFHNHTRSFVYGLQPRACQGMLDFDFICKRENPSVAGVIYPFGGQFVTKMYWGTKETLLPVYQQVEKAAAKHPEVDVVVNFASSRSVYSSTMELLEYPQFRTIAIIAEGVPERRAREILHKAQKKGVTIIGPATVGGIKPGCFKVGNTGGMMDNIVASKLYRPGSVAYVSKSGGMSNELNNIISHTTDGVYEGIAIGGDRYPGTTFIDHILRYEADPKCKIIVLLGEVGGVEEYRVIEAVKNGQIKKPIVAWAIGTCASMFKTEVQFGHAGSMANSDLETAKAKNAAMKSAGFYVPDTFEDMPEVLAELYEKMVAKGELSRISEPEVPKIPIDYSWAQELGLIRKPAAFISTISDDRGQELLYAGMPISEVFKEDIGIGGVMSLLWFRRRLPDYASKFLEMVLMLTADHGPAVSGAMNTIITTRAGKDLISSLVAGLLTIGTRFGGALDGAATEFTTAYDKGLSPRQFVDTMRKQNKLIPGIGHRVKSRNNPDFRVELVKDFVKKNFPSTQLLDYALAVEEVTTSKKDNLILNVDGAIAVSFVDLMRSCGAFTVEETEDYLKNGVLNGLFVLGRSIGLIAHHLDQKRLKTGLYRHPWDDITYLVGQEAIQKKRVEISAGDVSKAKTRS(SEQ ID NO:8)

[0095] ATP柠檬酸裂解酶(解脂耶氏酵母)亚基2，ACL2DNA

[0096] YALI0D24431g

[0097] XM_503231

[0098] atgtcagcgaaatccattcacgaggccgacggcaaggccctgctcgcacactttctgtccaaggcg cccgtgtgggccgagcagcagcccatcaacacgtttgaaatgggcacacccaagctggcgtctctg acgttcgaggacggcgtggcccccgagcagatcttcgccgccgctgaaaagacctacccctggctg ctggagtccggcgccaagtttgtggccaagcccgaccagctcatcaagcgacgaggcaaggccgg cctgctggtactcaacaagtcgtgggaggagtgcaagccctggatcgccgagcgggccgccaagc ccatcaacgtggagggcattgacggagtgctgcgaacgttcctggtcgagccctttgtgccccacg accagaagcacgagtactacatcaacatccactccgtgcgagagggcgactggatcctcttctacc acgagggaggagtcgacgtcggcgacgtggacgccaaggccgccaagatcctcatccccgttgac attgagaacgagtacccctccaacgccacgctcaccaaggagctgctggcacacgtgcccgagga ccagcaccagaccctgctcgacttcatcaaccggctctacgccgtctacgtcgatctgcagtttacgt atctggagatcaaccccctggtcgtgatccccaccgcccagggcgtcgaggtccactacctggatct tgccggcaagctcgaccagaccgcagagtttgagtgcggccccaagtgggctgctgcgcggtcccc cgccgctctgggccaggtcgtcaccattgacgccggctccaccaaggtgtccatcgacgccggccc cgccatggtcttccccgctcctttcggtcgagagctgtccaaggaggaggcgtacattgcggagctc gattccaagaccggagcttctctgaagctgactgttctcaatgccaagggccgaatctggacccttg tggctggtggaggagcctccgtcgtctacgccgacgccattgcgtctgccggctttgctgacgagct cgccaactacggcgagtactctggcgctcccaacgagacccagacctacgagtacgccaaaaccg tactggatctcatgacccggggcgacgctcaccccgagggcaaggtactgttcattggcggaggaa tcgccaacttcacccaggttggatccaccttcaagggcatcatccgggccttccgggactaccagtc ttctctgcacaaccacaaggtgaagatttacgtgcgacgaggcggtcccaactggcaggagggtct gcggttgatcaagtcggctggcgacgagctgaatctgcccatggagatttacggccccgacatgca cgtgtcgggtattgttcctttggctctgcttggaaagcggcccaagaatgtcaagccttttggcaccg gaccttctactgaggcttccactcctctcggagtttaa(SEQ ID NO:9)[0099] 柠檬酸裂解酶(解脂耶氏酵母)亚基2，ACL2蛋白质

[0100] YALI0D24431p

[0101] XP_503231

[0102] MSAKSIHEADGKALLAHFLSKAPVWAEQQPINTFEMGTPKLASLTFEDGVAPEQIFAAAEKTYPWLLESGAKFVAKPDQLIKRRGKAGLLVLNKSWEECKPWIAERAAKPINVEGIDGVLRTFLVEPFVPHDQKHEYYINIHSVREGDWILFYHEGGVDVGDVDAKAAKILIPVDIENEYPSNATLTKELLAHVPEDQHQTLLDFINRLYAVYVDLQFTYLEINPLVVIPTAQGVEVHYLDLAGKLDQTAEFECGPKWAAARSPAALGQVVTIDAGSTKVSIDAGPAMVFPAPFGRELSKEEAYIAELDSKTGASLKLTVLNAKGRIWTLVAGGGASVVYADAIASAGFADELANYGEYSGAPNETQTYEYAKTVLDLMTRGDAHPEGKVLFIGGGIANFTQVGSTFKGIIRAFRDYQSSLHNHKVKIYVRRGGPNWQEGLRLIKSAGDELNLPMEIYGPDMHVSGIVPLALLGKRPKNVKPFGTGPSTEASTPLGV(SEQ ID NO:10)

[0103] 本发明的一些方面提供了用于油生产的产油微生物，其包含本文描述的任意修饰，例如本文描述的DGA1修饰、如本文所描述的ACC1修饰及/或如本文所描述的SCD修饰。在一些实施方式中，提供了修饰的产油微生物，其包含如本文描述的推修饰以及如本文描述的拉修饰。在一些实施方式中，推修饰包含ACC1基因产物的过表达。在一些实施方式中，拉修饰包含DGA1和/或SCD基因产物。

[0104] 本发明的一些方面提供了核酸，其编码的基因产物赋予微生物如解脂耶氏酵母生产生物燃料或生物燃料前体所需要的和/或希望的表型。在一些实施方式中，所述核酸是来源于解脂耶氏酵母的核酸。在一些实施方式中，所述核酸编码DGA1基因产物如DGA1蛋白质。在一些实施方式中，所述核酸编码ACC1基因产物如ACC1蛋白质。在一些实施方式中，所述核酸编码去饱和酶如Δ9去饱和酶。在一些实施方式中，所述核酸编码解脂耶氏酵母Δ9去饱和酶(SCD)。在一些实施方式中，提供了编码基因产物的组合的核酸，例如在多顺反子中，其包含过表达代表脂质生物合成中的推修饰的基因产物(如ACC1基因产物)和过表达代表了脂质生物合成中的拉修饰的基因产物(例如DGA1和/或SCD基因产物)。

[0105] 术语“核酸”指的是包含多个相连的核苷酸的分子。“核酸”和“核酸分子”可交换使用，指代寡核糖核苷酸以及寡脱氧核糖核苷酸。该术语还包括多核苷(即多核苷酸减去磷酸)及任何其他含有核酸的有机碱。所述有机碱包括腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及肌苷。所述核酸可以为单链或双链。所述核酸可以为天然或非天然存在的。核酸可获自天然来源，或可使用核酸合成仪进行合成(即合成的)。核酸的分离在本领域是常规进行的，合适的方法可见于标准分子生物学课本(例如见Maniatis的Handbook of Molecular Biology)。如本文所描述的，所述核酸可以为DNA或RNA如基因组DNA、线粒体DNA、mRNA、cDNA、rRNA、miRNA、PNA或LNA或其组合。非天然存在的核酸如细菌人工染色体(BAC)及酵母人工染色体(YAC)也可根据本发明的一些方面而使用。

[0106] 本发明的一些方面涉及核酸衍生物的用途。特定核酸衍生物的用途可通过防止其被消化而增加本发明核酸的稳定性，尤其是在其接触可以含有核酸酶的生物学样品的情况下。如本文所使用的，核酸衍生物是非天然存在的核酸或其单元。核酸衍生物可以含有非天然存在的元素如非天然存在的核苷酸和非天然存在的骨架连接。根据本发明的一些方面的核酸衍生物可含有骨架修饰，例如但不限于，硫代磷酸酯键、磷酸二酯修饰的核酸、磷酸二酯和硫代磷酸酯核酸的组合、甲基膦酸酯、烷基膦、磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，p-乙氧基，及其组合。核酸的骨架组合物可以为同源或异源的。

[0107] 根据本发明的一些方面，核酸衍生物可以在糖和/或碱基部分含有置换或修饰。例如，一些核酸衍生物可以包括这样的核酸，其的骨架糖在3'位置共价附着至低分子量有机基团而不是羟基基团，在5'位置也并非附着至磷酸基团(例如2'-O-烷基化核糖基团)。
核酸衍生物可以包括非核糖的糖类如阿拉伯糖。核酸衍生物可含有置换的嘌呤或嘧啶，如C-5丙炔修饰的碱基、5-甲基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、2-硫尿嘧啶和假异胞嘧啶。

[0108] 在一些实施方式中，核酸可以包含肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、DNA、RNA或上述核酸的共-核酸如DNA-LNA共-核酸。

[0109] 如本文所使用的，术语“分离的核酸分子”指的是不在天然环境下的核酸分子，例如这样的核酸：(i)通过本领域已知的方法从细胞或微生物如细菌或真菌中被提取和/或纯化的核酸，所述方法为例如对宿主细胞进行碱裂解并随后例如使用硅吸附步骤对核酸进行纯化；(ii)例如通过聚合酶链反应(PCR)在体外扩增的核酸；(iii)通过克隆而重组生产的核酸，例如将核酸克隆至表达载体；(iv)经过片断化并通过大小被分离的核酸，例如通过体外酶消化或通过剪切并随后进行凝胶分离；或(v)例如通过化学合成而合成的核酸。在一些实施方式中，术语“分离的核酸分子”指的是(vi)在化学上与任何天然存在的核酸有极大不同的核酸。在一些实施方式中，可通过本领域已知的重组DNA技术容易地对分离的核酸进行操纵。因此，克隆入载体的核酸或递送到宿主细胞中并整合进入宿主基因组的核酸被认为是分离的，但以其天然状态在天然宿主中的核酸则不是。分离的核酸可以大体上得到纯化，但不一定需要如此。例如，在克隆或表达载体内分离的核酸不是纯化的，因为其可以含有少量百分比的其居留的细胞中的物质。然而如本文所使用的术语一样，这样的核酸也是分离的。

[0110] 本发明的一些方面涉及这样的核酸，其编码的基因产物赋予微生物需要的或期望的表型，用于生物燃料或生物燃料前体生产，所述核酸连接于启动子或其他转录激活元件。在一些实施方式中，编码基因产物并连接于启动子的核酸是包含在表达载体或表达构建体中的。如本文所使用的，术语“表达载体”或“表达构建体”指的是重组或合成生成的核酸构建体，具有一系列特异的核酸元件允许特定核酸在宿主微生物如产油酵母中的转录。在一些实施方式中，表达载体可为质粒、病毒或核酸片段的部分。在一些实施方式中，表达载体包括可操作地连接于启动子的待转录的编码核酸。启动子是一种核酸元件，其促进待转录核酸的转录。启动子通常位于其控制转录的核酸序列的相同链上，并位于其上游(或5’)。
在一些实施方式中，表达载体包括可操作地连接于异源启动子的待转录的编码核酸。异源启动子是并非天然可操作连接于给定核酸序列的启动子。例如，解脂耶氏酵母中的DGA1基因天然可操作地连接于解脂耶氏酵母DGA1基因启动子。因此例如在表达构建物中野生型解脂耶氏酵母DGA1基因启动子之外的任何启动子(其可操作地连接于DGA1基因)或其部分因此在上下文中就是异源启动子。例如，连接于编码DGA1基因产物的核酸的TEF1启动子对于DGA1来说就是异源启动子。

[0111] 在一些实施方式中，表达载体包括编码核酸，例如编码DGA1,ACC1和/或SCD基因产物的核酸，其可操作地连接于组成型启动子。术语“组成型启动子”指的是允许相连的基因得到持续转录的启动子。在一些实施方式中，表达载体包括编码核酸，例如编码DGA1,ACC1和/或SCD基因产物的核酸，其可操作地连接于诱导型启动子。术语“诱导型启动子”在本文可与术语“条件型启动子”交换使用，指的是只在一些在生物或非生物因素下才允许与其相连的基因进行转录的启动子。药物诱导启动子如四环素/强力霉素诱导的启动子、他莫昔芬诱导启动子以及依赖于重组事件而被激活的启动子，例如cre-介导的loxP位点的重组，这些都是本领域熟知的诱导型启动子的实例。

[0112] 本公开的一些方面涉及惊人的发现，即产油微生物中给定基因产物在异源启动子下过表达可通过在相应表达构建物中包含内含子得到显著增强。本发明的一些方面提供了内含子增强的组成型启动子用于在产油微生物中的基因过表达，并且提供了这种内含子增强启动子的表达构建体和载体。在一些实施方式中，提供了内含子增强的TEF启动子，其包含TEF启动子序列、转录起始位点、转录起始位点下游的内含子序列以及编码合适序列，例如编码DGA1,ACC1和/或SCD基因产物的核酸序列。在一些实施方式中，所述内含子位于翻译起始位点的下游，但仍然位于基因序列的开放阅读框之内，例如，位于起始密码子之后，但在编码所述基因产物核酸序列的终止位点之前。在一些实施方式中，所述内含子紧接着位于翻译起始位点如ATG起始密码子下游，但仍然在编码序列的其余部分的上游。为了阐述清楚，提供如下所示的内含子增强表达构建体的非限制的示例性结构：

[0113] 5’—TEF启动子—转录起始位点–内含子--DGA1编码序列--3’。下文提供了另一个内含子增强表达构建体的非限制的示例性结构:

[0114] 5’—TEF启动子—转录起始位点–起始密码子—内含子--DGA1编码序列–终止密码子--3’。ACC1和SCD基因产物的表达构建体分别具有DGA1编码序列置换ACC或SCD编码序列。

[0115] 合适的TEF启动子序列及合适的内含子序列对本领域技术人员是清楚的。一些无内含子TEF启动子序列在例如美国专利#6,265,185中已经公开。下文提供了一些示例代表性序列。然而，要理解的是本发明在此方面不限于此。

[0116] 示例性TEF启动子序列:

[0117] agagaccgggttggcggcgcatttgtgtcccaaaaaacagccccaattgccccaattgaccc caaattgacccagtagcgggcccaaccccggcgagagcccccttctccccacatatcaaacctccc ccggttcccacacttgccgttaagggcgtagggtactgcagtctggaatctacgcttgttcagacttt gtactagtttctttgtctggccatccgggtaacccatgccggacgcaaaatagactactgaaaatttt tttgctttgtggttgggactttagccaagggtataaaagaccaccgtccccgaattacctttcctcttc ttttctctctctccttgtcaactcacacccgaaatcgttaagcatttccttctgagtataagaatcattc aaa(SEQ ID NO:11)

[0118] 示例性内含子序列：

[0119] gtgagtttcagaggcagcagcaattgccacgggctttgagcacacggccgggtgtggtccc attcccatcgacacaagacgccacgtcatccgaccagcactttttgcagtactaaccgcag(SEQ ID NO:12)

[0120] 在启动子和内含子序列之间含有起始密码子(ATG)的示例性TEF启动子-内含子序列：

[0121] agagaccgggttggcggcgcatttgtgtcccaaaaaacagccccaattgccccaattgaccc caaattgacccagtagcgggcccaaccccggcgagagcccccttctccccacatatcaaacctccc ccggttcccacacttgccgttaagggcgtagggtactgcagtctggaatctacgcttgttcagacttt gtactagtttctttgtctggccatccgggtaacccatgccggacgcaaaatagactactgaaaatttt tttgctttgtggttgggactttagccaagggtataaaagaccaccgtccccgaattacctttcctcttc ttttctctctctccttgtcaactcacacccgaaatcgttaagcatttccttctgagtataagaatcattc aaaATGgtgagtttcagaggcagcagcaattgccacgggctttgagcacacggccgggtgtggt cccattcccatcgacacaagacgccacgtcatccgaccagcactttttgcagtactaaccgcag

[0122] (SEQ ID NO:13)

[0123] 将表达载体或表达构建物递送入微生物如酵母细胞的方法对本领域技术人员是熟知的。包括表达载体在内的核酸可通过生物相关领域技术人员熟知的多种方法递送入原核及真核微生物中。根据本发明的一些方面将核酸递送入微生物的方法包括但不限于不同的化学、电化学及生物学方法，例如热激转化、电穿孔、转染如脂质体介导的转染、DEAE-葡聚糖-介导的转染或磷酸钙转染。在一些实施方式中，使用媒介物或载体将核酸构建体如包含DGA1、ACC1和/或SCD编码核酸序列的组合的表达构建体引入宿主微生物用于转移遗传物质。用于将遗传物质转移至微生物的方法对本领域技术人员是已知的，包括例如质粒、人工染色体和病毒载体。用于构建核酸构建体包括含有组成型或诱导型异源启动子的表达构建体、敲除或敲低构建体的方法，以及将核酸或核酸构建体递送至微生物的方法及载体对本领域技术人员是熟知的，在例如下列著作中有所描述：J.Sambrook和D.Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press；3rd edition(January15,2001)；David C.Amberg,Daniel J.Burke； 和 Jeffrey N.Strathern,Methods in Yeast Genetics:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(April2005)；John N.Abelson,Melvin I.Simon,Christine Guthrie,和Gerald R.Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Part A,Volume194(Methods in Enzymology Series,194),Academic Press(March11,2004)；
Christine Guthrie和Gerald R.Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology,Part B,Volume350(Methods in Enzymology,Vol350),Academic Press；
1st edition(July2,2002)；Christine Guthrie 和 Gerald R.Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology,Part C,Volume351,Academic Press；
1st edition(July9,2002)；Gregory N.Stephanopoulos,Aristos A.Aristidou 和Jens Nielsen,Metabolic Engineering:Principles and Methodologies,Academic Press；1edition(October16,1998)；以 及 Christina Smolke,The Metabolic Pathway Engineering Handbook:Fundamentals,CRC Press；1edition(July28,2009)，其以全部并入本文作为参考。

[0124] 在一些实施方式中，编码基因产物的基因的原生启动子例如原生DGA1、ACC1或SCD启动子赋予了微生物需要的或希望的表型，在微生物中，这些启动子得到修饰以改变其转录活性的调节。在一些实施方式中，经过修饰的启动子相比于未修饰的对等物转录活性增加。如本文所使用的，术语“经修饰启动子”指的是其核苷酸序列受到人为改变的启动子。单独的核苷酸删除、插入或突变或其组合都是所述人为改变的实例。人为的启动子改变可以以靶向的方式实现，例如通过同源重组手段如基因靶向、敲除、敲入、定点诱变或人工锌指核酸酶介导的策略实现。备选地，这样的改变可通过随机或准随机事件实现，如辐射或非靶向核苷酸整合并随后进行筛选。启动子修饰一般是不断改进的以调制相应启动子转录激活特性。例如，在对细胞内脂肪酸水平升高作出应答时介导DGA1、ACC1或SCD启动子的抑制的调节元件的破坏或删除会导致相应的基因甚至在细胞内脂肪酸水平升高的条件下持续转录激活。类似地，组成型激活的转录激活元件插入条件型启动子区域可以对相应的基因在正常的抑制性条件下的过表达产生影响。用于在微生物中靶向破坏原生启动子例如原生DGA1、ACC1或SCD启动子，例如用于靶向破坏使得转录速率增加的方法对本领域技术人员是熟知的。

[0125] 本发明的一些方面涉及微生物如解脂耶氏酵母的工程改造，以显示用于生物燃料或生物燃料前体的大规模生产所需要和/或希望的表型。本发明的一些方面涉及脂质合成途径的代谢工程改造以产生就生物燃料生产而优化的微生物。本发明的一些方面涉及代谢改造，其包含调制那些调节进入脂质合成途径的碳流的基因的表达的遗传修饰的组合，以产生就生物燃料生产而优化的微生物。在一些实施方式中，所述遗传修饰的组合包括推修饰和拉修饰。在一些实施方式中，推修饰包含增加细胞中用于脂质合成的代谢物乙酰-CoA、ATP或NADPH水平的遗传修饰，例如ACC1基因产物的过表达。在一些实施方式中，拉修饰是降低脂质合成中那些显示有反馈抑制功能的产物或中间产物，如脂肪酸水平的遗传修饰。在一些实施方式中，拉修饰包含DGA1和/或SCD基因产物的过表达。

[0126] 本发明的一些方面提供了通过调制解脂耶氏酵母的原生脂质代谢极大地增加解脂耶氏酵母介导的碳源向脂质转化效率的方法。显著而意外地，相比于仅仅分别调制推或拉过程的单独的修饰，根据本发明提供的一些方法的脂质代谢的推-和-拉修饰的组合能使得进入脂质合成途径的碳流有显著的增加。

[0127] 本发明的一些方面涉及工程改造和/或优化用于大规模生物燃料或生物燃料前体生产的微生物。在一些实施方式中，提供了工程改造的微生物，其已经通过本发明的一些方面提供的方法或使用了本发明的一些方面提供的核酸或蛋白质进行操纵，所述核酸或蛋白质为例如本文提供的表达构建体或表达构建体组合，其导致介导脂质合成推过程的基因产物(例如ACC1产物)与介导脂质合成拉过程的基因产物(例如DGA1和/或SCD基因产物)的组合的过表达。在一些实施方式中，提供了工程改造的微生物，其过表达的基因产物的推-和-拉的组合，根据本发明的一些实施方式赋予所述微生物用于生物燃料或生物燃料前体生产必需的及/或希望的表型。在一些实施方式中，提供了微生物，其包含的DGA1、ACC1和/或SCD基因产物活性得到增加。在一些实施方式中，所述微生物显示了增加的脂肪酸合成速率、增加的TAG储存及/或此外的必需或希望的特征。

[0128] 如本文在微生物脂质合成的上下文中所使用的，例如在本文描述的产油微生物的脂肪酸合成速率的上下文中所使用的，术语“增加的合成速率”或“合成速率增加”指的是在工程改造的微生物中合成速率相比于相同种属野生型微生物中相应的合成速率得到增加。例如，在本文描述的工程改造的解脂耶氏酵母微生物中，TAG合成速率增加指的是脂质合成速率比野生型TAG合成速率得到增加。在一些实施方式中，增加的脂质合成速率，例如TAG或总脂质合成速率指的是细胞培养物例如工程改造的微生物培养物中脂肪酸合成速率。在一些实施方式中，增加的脂质合成速率是脂质合成如TAG合成或总脂质合成速率为至少0.01g/L/h(脂质克每升培养基每小时)、至少0.004g/L/h、至少0.05g/L/h、至少0.1g/L/h、至少0.14g/L/h、至少0.15g/L/h、至少0.2g/L/h、至少0.3g/L/h、至少0.4g/L/h、至少0.5g/L/h、至少0.6g/L/h、至少0.7g/L/h、至少0.8g/L/h、至少0.9g/L/h、至少1g/L/h、至少2g/L/h、至少3g/L/h、至少4g/L/h、至少5g/L/h、至少6g/L/h、至少7g/L/h、至少
8g/L/h、至少9g/L/h、至少10g/L/h或至少25g/L/h。

[0129] 在一些实施方式中，本上下文中合成速率为生物反应器进行一个完整的运行周期中测量的合成速率，例如由生物反应器运行总时间内或脂质测量的总时间内合成的脂质例如TAG总量计算合成速率。这种合成速率的类型在本文有时候称作“总脂质生产效率”或“总体脂质生产效率”，通常以g/L/h(每小时运行时间每升培养基生产的脂质克数)为单位提供。在一些实施方式中，提供了工程改造的微生物，例如工程改造的解脂耶氏酵母，其过表达ACC1基因产物、DGA1基因产物及/或SCD基因产物，与野生型微生物如野生型解脂耶氏酵母相比，总脂质生产效率显示了至少5倍的增加、至少6倍的增加、至少7倍的增加、至少8倍的增加、至少9倍的增加、至少10倍的增加、至少12倍的增加、至少10倍的增加、至少12.5倍的增加、至少15倍的增加、至少20倍的增加、至少30倍的增加、至少40倍的增加、至少50倍的增加、至少60倍的增加、至少70倍的增加、至少80倍的增加、至少90倍的增加、至少100倍的增加、至少500倍的增加,或至少1000倍的增加。

[0130] 在一些实施方式中，增加的总脂质合成速率或增加的总脂质生产效率为至少0.01g/L/h、至少0.004g/L/h、至少0.05g/L/h、至少0.1g/L/h、至少0.14g/L/h、至少0.15g/L/h、至少0.2g/L/h、至少0.3g/L/h、至少0.4g/L/h、至少0.5g/L/h、至少0.6g/L/h、至少
0.7g/L/h、至少0.8g/L/h、至少0.9g/L/h、至少1g/L/h、至少2g/L/h、至少3g/L/h、至少4g/L/h或至少5g/L/h。

[0131] 在一些实施方式中，合成速率是在例如优化的生长条件下有营养物的存在下测量的最大合成速率或峰合成速率。这种类型的合成速率在本文有时候称为“最大脂质生产效率”。在一些实施方式中，增加的最大脂质合成速率是脂质合成如TAG合成的速率为至少0.2g/L/h、至少0.3g/L/h、至少0.4g/L/h、至少0.5g/L/h、至少0.6g/L/h、至少0.7g/L/h、至少0.8g/L/h、至少0.9g/L/h、至少1g/L/h、至少2g/L/h、至少3g/L/h、至少4g/L/h、至少5g/L/h、至少6g/L/h、至少7g/L/h、至少8g/L/h、至少9g/L/h、至少10g/L/h,或至少25g/L/h。

[0132] 在一些实施方式中，工程改造的微生物是产油酵母如解脂耶氏酵母。在一些实施方式中，本发明提供的工程改造的酵母显示了一种或多种高度所需的且预期外的表型特征，例如：增加的碳-油转化率或效率，增加的脂质小体中的脂质积累。

[0133] 在一些实施方式中，本发明的某些方面提供的工程改造的微生物，例如工程改造的酵母，显示的碳-油转化率(本文也称为“脂质产率”)在大约0.02g/g(生产的油、脂质或TAG(g)/碳(g)，例如消耗的葡萄糖、醋酸盐或醋酸)-大约0.3g/g的范围内。在一些实施方式中，本发明的某些方面提供的工程改造的微生物，例如工程改造的酵母，显示的碳-油转化率为大约0.010g/g、大约0.02g/g、大约0.025g/g、大约0.03g/g、大约0.04g/g、大约0.05g/g、大约0.06g/g、大约0.07g/g、大约0.075g/g、大约0.08g/g、大约0.09g/g、大约0.1g/g、大约0.11g/g、大约0.12g/g、大约0.13g/g、大约0.14g/g、大约0.15g/g、大约0.16g/g、大约0.17g/g、大约0.18g/g、大约0.19g/g、大约0.2g/g、大约0.21g/g、大约0.22g/g、大约0.23g/g、大约0.24g/g、大约0.25g/g、大约0.26g/g、大约0.27g/g、大约0.28g/g、大约0.29g/g、大约0.3g/g、大约0.31g/g、大约0.32g/g或接近理论值。在一些实施方式中，本发明的某些方面提供的工程改造的微生物，例如工程改造的酵母，显示的碳-油转化率为至少大约0.010g/g(生产的脂质(g)/碳(g)，例如，消耗的葡萄糖、醋酸盐或醋酸)、至少大约0.02g/g、至少大约0.025g/g、至少大约0.03g/g、至少大约0.04g/g、至少大约0.05g/g、至少大约0.06g/g、至少大约0.07g/g、至少大约0.075g/g、至少大约0.08g/g、至少大约0.09g/g、至少大约0.1g/g、至少大约0.11g/g、至少大约0.12g/g、至少大约0.13g/g、至少大约0.14g/g、至少大约0.15g/g、至少大约0.16g/g、至少大约0.17g/g、至少大约0.18g/g、至少大约0.19g/g、至少大约0.2g/g、至少大约0.21g/g、至少大约
0.22g/g、至少大约0.23g/g、至少大约0.24g/g、至少大约0.25g/g、至少大约0.26g/g、至少大约0.27g/g、至少大约0.28g/g、至少大约0.29g/g、至少大约0.3g/g、至少大约0.31g/g、至少大约0.32g/g或接近理论值。

[0134] 如本文使用的术语“脂质滴度”在微生物脂质合成的上下文中，例如在本文描述的产油微生物进行脂肪酸合成的上下文中，指的是每份体积的包含所述产油微生物的微生物培养物合成的脂质的量。在一些实施方式中，改造的微生物例如本文描述的改造的解脂耶氏酵母微生物可达到或确实达到的脂质滴度为至少1g/L(脂质克数每升微生物培养物)、至少2g/L、至少3g/L、至少4g/L、至少5g/L、至少6g/L、至少7g/L、至少8g/L、至少9g/L、至少10g/L、至少15g/L、至少20g/L、至少25g/L、至少30g/L、至少40g/L、至少50g/L、至少60g/L、至少70g/L、至少80g/L、至少90g/L、至少100g/L、至少200g/L或至少250g/L。

[0135] 在一些实施方式中，如本文所提供的工程改造的微生物在碳-油转化中显示了增加的脂质滴度。如本文在微生物脂质合成的上下文中例如在本文描述的产油微生物进行脂肪酸合成的上下文中所使用的术语“增加的脂质滴度”指的是每份体积的包含所述产油微生物的微生物培养物中合成的脂质的量相比于相同种属的野生型微生物在相同条件(例如，在相同生长基质中、具有相同的C/N比率、等量的氧气、相同的pH、相同的营养物，等等)下相应的脂质滴度得到增加。例如，本文描述的工程改造的微生物解脂耶氏酵母达到的增加的脂质滴度指的是脂质滴度相比于同一条件下野生解脂耶氏酵母达到的脂质滴度得到增加。在一些实施方式中，增加的脂质滴度指的是脂质滴度为至少1g/L(脂质克数每升微生物培养物)、至少2g/L、至少3g/L、至少4g/L、至少5g/L、至少6g/L、至少7g/L、至少8g/L、至少9g/L、至少10g/L、至少15g/L、至少20g/L、至少25g/L、至少30g/L、至少40g/L、至少50g/L、至少60g/L、至少70g/L、至少80g/L、至少90g/L、至少100g/L、至少200g/L或至少250g/L。

[0136] 本发明的一些方面提供了工程改造的微生物用于油生产，其可使用多种碳源，包括但不限于可发酵糖类，例如C6糖，如葡萄糖和有机酸，例如醋酸和/或其他盐，例如醋酸盐。

[0137] 本发明的一些方面涉及本文提供的遗传修饰的微生物的培养物。在一些实施方式中，所述培养物包括本文提供的遗传修饰的微生物以及基质，例如液体基质。在一些实施方式中，所述培养物包含本文提供的遗传修饰的微生物以及碳源，例如可发酵碳水化合物源或有机酸或其盐。在一些实施方式中，所述培养物包含了本文提供的遗传修饰的微生物以及构成盐度、渗透压以及pH条件的盐和/或缓冲液，适合于微生物的存活、生长和/或碳水化合物向生物燃料或生物燃料前体的转化。在一些实施方式中，所述培养物包含其他的组分例如添加剂。添加剂的非限制性实例为营养物、酶、氨基酸、白蛋白、生长因子、酶抑制剂(例如蛋白酶抑制剂)、脂肪酸、脂质、激素(例如地塞米松和赤霉酸)、痕量元素、无机化合物(例如还原试剂如镁)、氧化还原调节剂(例如抗氧化剂)、稳定试剂(例如二甲基亚砜)、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、明胶、抗生素(例如，布雷菲德菌素A)、盐(如NaCl)、螯合剂(例如EDTA、EGTA)和酶(如纤维素酶、分散酶、透明质酸酶或脱氧核糖核酸酶)。在一些实施方式中，所述培养物可以包含诱导或抑制条件型或诱导型启动子调控的转录的药物，例如多西环素、四环素，他莫昔芬，IPTG，激素，或金属离子。

[0138] 虽然特定培养条件如碳源浓度会取决于要培养的工程改造的微生物自身，然而用于生成微生物培养物的通用方法和培养物条件对本领域技术人员是已知的，在例如以下著作中有所描述：J.Sambrook和D.Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press；3rd edition(January15,2001)；David C.Amberg,Daniel J.Burke； 和 Jeffrey N.Strathern,Methods in Yeast Genetics:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(April2005)；John N.Abelson,Melvin I.Simon,Christine Guthrie,和Gerald R.Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Part A,Volume194(Methods in Enzymology Series,194),Academic Press(March11,2004)；
Christine Guthrie和Gerald R.Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology,Part B,Volume350(Methods in Enzymology,Vol350),Academic Press；
1st edition(July2,2002)；Christine Guthrie 和 Gerald R.Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology,Part C,Volume351,Academic Press；1st edition(July9,2002)，其以全部并入本文作为参考。为生成油，本文描述的工程改造的微生物培养物在适合油积累的条件下进行培养。

[0139] 在一些实施方式中，所述遗传修饰的微生物显示了相对于相同种类野生型微生物和/或相对于其他微生物(例如通常发现会污染用于碳源向生物燃料或生物燃料前体转化的微生物培养物的那些微生物)的生长优势。在一些实施方式中，本发明的某些方面提供的工程改造的微生物的生长和/或增殖优势转化为使用非灭菌培养和发酵条件用于生物燃料或生物燃料前体的生产的可能性，因为培养物中污染性微生物过度生长的问题能得到缓解或完全消除。在一些实施方式中，本发明的某些方面提供的工程改造的微生物是在非灭菌条件下培养的，用于生物燃料或生物燃料前体生产。例如，在一些实施方式中，非灭菌原料、非灭菌的培养基、非灭菌的补充物或非灭菌的生物反应器(例如在非灭菌环境中的开放式反应器)被用于生物燃料或生物燃料前体生产。

[0140] 根据本发明的一些方面，多种不同的微生物都可进行遗传修饰并用于工业规模的生物燃料或生物燃料前体生产，例如来自多种酵母来源如产油酵母、细菌、藻类和真菌的微生物。合适的酵母细胞的非限制性实例为来自以下种属的细胞：解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、多形汉逊(Hansenula polymorpha)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、贝酵母(S.bayanus)、乳酸克鲁维酵母(S.K.lactis)、Waltomyces lipofer、高山被孢霉(Mortierella alpine)、黄被孢霉(Mortierella isabellina)、多形汉逊、鲁氏毛霉(Mucor rouxii)、皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneu)、粘红酵母酿酒(Rhodotorula glutinis)、糖化酵母(Saccharomyces diastasicus)、西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)和裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。合适的细菌的非限制性实例有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌(Salmonella)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、链霉菌属(Streptomyces)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、红球菌属(Rhodococcus sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)和产碱杆菌(Alcaligenes sp)。合适的真菌细胞的非限制性实例可以培养自，例如，Aspergillus shirousamii、黑曲霉(Aspergillus niger)和里氏木霉(Trichoderma reesei)等种属。合适的藻细胞的非限制性实例为来自以下种属的细胞：富油新绿藻(Neochloris oleoabundans)、斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)、微绿球藻属(Nannochloropsis sp.)、杜氏盐藻(Dunaliella tertiolecta)、小球藻(Chlorella vulgaris)、浮水小球藻(Chlorella emersonii)和极大螺旋藻(Spirulina maxima)。

[0141] 本发明的一些方面提供了用于生产生物燃料或生物燃料前体的方法，所述方法使用了本文提供的遗传修饰的微生物。在一些实施方式中，提供了以工业规模生产生物燃料或生物燃料前体的方法。

[0142] 使用本文提供的方法和/或遗传修饰的微生物可以将多种碳源转化为生物燃料或生物燃料前体。在一些实施方式中，碳源包含碳水化合物。糖类、淀粉以及纤维都是适合于本文提供的转化方法的碳水化合物来源的实例。根据本发明的一些方面，碳水化合物来源可包含精炼的和/或粗制的糖、淀粉和/或纤维，或这些物质的任意组合。糖的非限制性的实例为可发酵糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖和乳糖。淀粉的非限制性实例为直链淀粉和支链淀粉。纤维的非限制性实例为植物纤维如纤维素、半纤维素和木纤维。本发明的一些方面涉及工业副产品、中间产物、或废品的用作碳源用途，例如植物粗提取物、糖蜜、秸秆或污水作为碳源。在一些实施方式中，碳源来自藻类。在一些实施方式中，藻类生物质特别生产为用作微生物介导的生物燃料或生物燃料前体生产中的碳源。

[0143] 在一些实施方式中，提供了用于生产生物燃料或生物燃料前体的方法，包括使用便宜、丰富且易得的碳源原料作为碳源。在一些实施方式中，纤维素或半纤维素被用作碳源。在一些实施方式中，纤维素或半纤维素来自工业副产品或废品。在一些实施方式中，纤维素或半纤维素直接来源于植物或藻类生物质。植物或藻类生物质是最丰富的原料之一，并且包含显著量的不可发酵糖和纤维，例如纤维素和本纤维素。在一些实施方式中，对生物质原料进行预处理以将不可发酵糖或纤维转化为可发酵糖类，这样使其能够用于微生物生长及微生物介导的生物燃料或生物燃料前体生产。在一些实施方式中，生物质原料的预处理包括使纤维素和/或半纤维素组分解聚为单体糖，所使用的预处理方法对本领域技术人员是熟知的，例如使用稀释酸或氨纤维膨胀(AFEX)法(见例如，Yang B,Wyman CE.Dilute acid and autohydrolysis pretreatment.Methods Mol Biol.2009；581:103-14；Balan V,Bals B,Chundawat SP,Marshall D,Dale BE,Lignocellulosic biomass pretreatment using AFEX Methods Mol Biol.2009；581:61-77)。其他用于将生物质多聚体解聚为单体糖的方法对本领域技术人员是熟知的，并且预期会在本发明的一些实施方式中使用。

[0144] 在一些实施方式中，使用了稀释酸法对含有不可发酵糖的生物质原料进行预处理，将不可发酵糖解聚为单体的可发酵糖。在一些实施方式中，在适度温和的温度下用稀释的硫酸对生物质处理一段限定的时间。例如，在一些实施方式中，用大约0.5％、大约1％、大约2％、大约3％、大约4％、大约5％或大约6％的硫酸对生物质进行处理。在一些实施方式中，在大约30℃、大约37℃、大约40℃、大约50℃、大约60℃、大约70℃、大约80℃、大约90℃、大约100℃、大约110℃、大约120℃、大约130℃、大约140℃、大约150℃、大约175℃、大约200℃或大约200℃以上的温度下对生物质进行处理。

[0145] 在一些实施方式中，所得的水解物含有不溶的木质素及溶解的纤维素和半纤维素多聚物。后者产物可使用本领域技术人员熟知的方法进一步处理，如使用纤维素酶或其他水解酶处理生产六碳糖和五碳糖，如葡萄糖和木糖单体。在一些实施方式中，用稀释酸对不可发酵糖进行预处理导致一些副产品的生成，包括毒性化合物，其抑制没有根据本发明的方面进行工程改造的微生物的生长、降低其活力且/或抑制其的生物燃料或生物燃料生产。在一些实施方式中，用有助于微生物生长、生物燃料或生物燃料生产的基质对预处理过的原料进行洗涤和补充，且/或对原料过石灰(over-limed)以脱毒。

[0146] 在一些实施方式中，使用AFEX法对含有不可发酵糖的生物质原料预处理以将不可发酵糖解聚成单体可发酵糖。在一些实施方式中，在高温高压下用液态氨对生物质进行一段限定时间的处理。在一些实施方式中，对生物质的处理为大约10分钟、大约20分钟、大约30分钟、大约40分钟、大约50分钟、大约60分钟、大约70分钟、大约80分钟、大约90分钟或更长。在一些实施方式中，在大约30℃、大约37℃、大约40℃、大约50℃、大约60℃、大约70℃、大约80℃、大约90℃、大约100℃、大约110℃、大约120℃、大约130℃、大约140℃、大约150℃、大约175℃、大约200℃或大约200℃以上的温度下对生物质进行处理。在一些实施方式中，AFEX预处理使原料中所含的结晶纤维素转化为无定形、可发酵的形式。在一些实施方式中，经过AFEX预处理的生物原料不含有显著量的抑制微生物生长和/或生物燃料或生物燃料生产的毒性副产品，并且不经过预先的脱毒步骤就可以用作微生物生物燃料或生物燃料生产。

[0147] 在一些实施方式中，经过或不经过预处理的生物质原料，都用水解或解聚糖多聚物的酶进行处理，例如使用纤维素酶或半纤维素酶进行处理。在一些实施方式中，将原料与所述酶在液相中接触，并在允许酶催化解聚或水解反应的温度下孵育一段时间，时间足以水解或解聚生物质原料中显著量的不可发酵糖或纤维。在一些实施方式中，在孵育进行水解和解聚后，通过例如离心的方法将原料与酶接触的液相(含有可溶的、可发酵糖部分)与包含不可发酵糖和纤维的固相相分离。在一些实施方式中，随后将原料的液体部分与微生物，例如本文的一些方面提供的微生物接触，以转化为生物燃料或生物燃料前体。在一些实施方式中，不可发酵糖或纤维的酶转化是在综合的生物过程中进行的，例如，所产生的可发酵糖向生物燃料或生物燃料前体的微生物转化过程也在同时且/或在同一个反应器中发生。在一些实施方式中，首先进行酶转化，随后将接触了酶的原料与用于生物燃料或生物燃料前体生产的微生物接触.在一些实施方式中，酶和微生物转化在同时且在同一个反应器中进行。

[0148] 在一些实施方式中，如本文提供的工程改造的微生物例如过表达DGA1、ACC1和/或SCD基因产物的解脂耶氏酵母，以醋酸盐为主要碳源生长。在一些实施方式中，微生物生长的溶液中醋酸浓度为大约1％、大约2％、大约3％、大约4％、大约5％、大约6％、大约7％、大约8％、大约9％、大约10％vol/vol、大约20％vol/vol、大约25％vol/vol,或大约
30％vol/vol。在一些实施方式中，醋酸盐的浓度为3％-10％wt/vol之间。在一些实施方式中，将包含如本文提供的遗传修饰的微生物并以醋酸盐或醋酸为主要碳源的细胞培养物与甘油接触或“穿刺(spike)”混入甘油。在一些实施方式中，间歇地将遗传修饰的微生物与甘油接触。在一些实施方式中，连续或半连续地将微生物与甘油接触。在一些实施方式中，将微生物与浓度为大约0.5％、大约1％、大约2％、大约3％、大约4％或大约5％vol/vol的甘油接触。将本文提供的工程改造的微生物与甘油接触为TAG的生产提供代谢物，并为由碳水化合物生产脂肪酸提供还原性部分。在一些实施方式中，甘油穿刺是在使用了醋酸盐之外的碳源，例如任何本文描述的碳源的物燃料或生物燃料生产方法中进行的。

[0149] 在一些实施方式中，如本文提供的工程改造的微生物，例如过表达DGA1基因产物，且/可选地表达ACC1和/或SCD基因产物的解脂耶氏酵母是在碳源例如醋酸盐或醋酸上生长的，在生长过程中或培养阶段可以得到更新(replenished)，例如在培养一定时间段之后例如8小时后、24小时后或48小时后通过将微生物与添加量的碳源或与一定量的此外的碳源接触而更新。在一些实施方式中，如本文提供的工程改造的微生物在包含低碳氮(C/N)比的培养基中起始培养第一个6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66或72小时，例如C/N比率为大约10、大约20、大约25、大约30、低于大约30、低于25或低于20。在一些实施方式中，低C/N比率是通过向培养基中补充氮源实现的，如补充氨以达到所需的C/N比率。在一些实施方式中，例如在其中碳源(例如醋酸盐或醋酸)加料于如本文所述的产油微生物培养物的实施方式中，在碳源中补充了氮源，如氨。在一些实施方式中，在起始培养一段时间后停止用氮源进行补充，例如在培养的第一个6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66或72小时之后，由此使得培养物中工程改造的微生物能消耗氮源，这样进而增加了C/N比率。C/N比率的这一变化可通过向没有补充氮源的培养物中加料额外的碳源，例如通过加料不补充氨或任何其他氮源的醋酸或醋酸盐而得到增强或加速。在一些实施方式中，本文描述的工程改造的微生物进行油生产的优化的C/N比率在80-120的范围内。

[0150] 在一些实施方式中，用于大规模微生物介导的碳水化合物向脂质转化的发酵过程可在反应器中施行。如本文所使用的，术语“生物反应器”和“发酵罐”在本文交换使用，指的是封闭或部分封闭的空间，其中发生生物学和/或化学反应，所述反应至少有一部分涉及活体生物或活体生物的一部分。“大规模生物反应器”或“工业规模反应器”是用于在商业或准商业规模上生成产品如生物燃料或生物燃料前体(如脂肪酸和/或TAG)的反应器。大规模生物反应器通常具有的容积在升、数百升、数千升或者更大的范围内。

[0151] 根据本发明的某些方面的生物反应器可包含微生物或微生物培养物。在一些实施方式中，生物反应器可包含本发明的某些方面提供的任意微生物的孢子和/或任意种类的休眠细胞类型，例如干粉状态的细胞。在一些实施方式中，将合适的碳水化合物源加入这样的生物反应器可导致休眠细胞的活化，例如导致酵母孢子的出牙并随后至少部分地将碳水化合物源转化为生物燃料或生物燃料前体。

[0152] 根据本发明的某些方面的一些生物反应器可包括细胞培养系统，其中微生物与移动的液体和/或气泡接触。根据本发明的某些方面的微生物或微生物培养物可悬浮生长或贴附于固相载体而生长。载体细胞的非限制性实例包括微载体(例如聚合物球、微珠以及微盘，可以为多孔或无孔的)、负荷特异性化学基团(例如季铵基团)的交联珠子(例如葡聚糖)、2D微载体(包括捕获在非多孔多聚物纤维中的细胞)、3D微载体(例如载体纤维、中空纤维、多管反应器、和可包含多孔纤维的半透膜)、离子交换能力减弱的微载体、胶囊细胞、毛细管以及絮凝物。载体可由物质如葡聚糖、明胶、玻璃和纤维素制造。

[0153] 根据本发明方面的工业规模的碳水化合物向脂质转化的过程可以连续、半连续或非连续的模式操作。根据本发明的操作模式的非限制性实例为批式、补料批式、延长批式、重复批式、取出/注满、旋转壁、转瓶和/或灌注的操作模式。

[0154] 在一些实施方式中，可使用允许底物原料如碳水化合物源的连续或半连续更新，和/或产物如分泌的脂质、包含脂质的有机相和/或显示了所需的脂质含量的细胞与反应器进行连续或半连续分离的生物反应器。

[0155] 根据本发明的生物反应器的非限制性实例为：搅拌槽发酵罐、由旋转混合设备搅拌的生物反应器、恒化器、由振荡设备搅拌的生物反应器、气升式发酵罐、堆积床反应器、固定床反应器、流化床反应器、采用波式诱导搅拌的生物反应器、离心式生物反应器、滚瓶以及中空纤维生物反应器、滚轮设备(例如台式设备、载车式设备和/或自动控制的这些种类)、垂直堆放的平板、转瓶、搅拌或摇瓶、振荡的多孔板、MD瓶、T-瓶、Roux瓶、多表面组织培养繁殖器、修饰的发酵罐以及包被的珠子(例如，由血清蛋白质、硝酸纤维素或羧甲基纤维素包被珠子以防止细胞附着)。

[0156] 根据本发明的方面的生物反应器和发酵罐可选地包含感受器和/或控制系统以测量和/或调整反应参数。反应参数的非限制性实例为：生物学参数例如生长速率、细胞大小、细胞数量、细胞密度、细胞类型或细胞状态，化学参数如pH、氧化还原势能、反应底物和/或产物的浓度、溶解气体的浓度如氧气浓度和CO2浓度、营养物浓度、代谢物浓度、葡萄糖浓度、谷氨酰胺浓度、丙酮酸浓度、磷石灰浓度、寡肽的浓度、氨基酸的浓度、维生素的浓度、激素的浓度、添加剂的浓度、血清浓度、离子强度、离子的浓度、相对湿度、摩尔浓度、渗透压、其他化学物例如缓冲试剂、佐剂或反应副产物的浓度，物理/机械参数如密度、电导率、搅拌度、压力和流速、剪切力、剪切速率、粘度、颜色、浑浊度、光吸收、混合速率、转化率以及热动力学参数如温度、光强度/质量等等。

[0157] 机械和电子领域的相关技术人员对能够测量如本文所述的参数的传感器是熟知的。能够基于如本文所描述的传感器的输入信号调整反应器中参数的控制系统对生物反应器工程领域的技术人员是熟知的。

[0158] 根据本发明的某些方面的用于向生物燃料或生物燃料前体转化所采用的碳源类型取决于所采用的特定微生物。本发明的某些方面提供的一些微生物能够有效地转化特定的碳水化合物源，但是相同的微生物可不能高效地加工不同的碳水化合物来源或根本无法加工。根据本发明的方面，例如产油酵母解脂耶氏酵母能有效地将糖类如葡萄糖、果糖、蔗糖和/或乳糖，及富含糖类的碳水化合物，例如糖蜜和植物纤维转化为脂肪酸及其衍生物。

[0159] 在一些实施方式中，由碳源原料生成的生物燃料或生物燃料前体如脂肪酸或三酰基甘油是由本发明的某些方面提供的微生物例如产油酵母如解脂耶氏酵母细胞分泌的，或至少由其分泌的。在一些实施方式中，根据本发明的某些方面的微生物与在生物反应器中的水溶液中的碳水化合物源接触，并且分泌的生物燃料或生物燃料前体形成了可以与水相相分离的有机相。如本文使用的，术语有机相指的是包含非极性、有机化合物例如脂肪酸、TAG和/或其他非极性脂质的液相。根据本发明的有机相可以进一步含有微生物、碳水化合物或在相应生物反应器中其他相的中发现的其他化合物。用于进行工业规模的相分离的方法对本领域一般技术人员是熟知的。在一些实施方式中，有机相是持续或半持续虹吸出去。在一些实施方式中，采用了包含分离器的生物反应器，分离器能够连续或半连续地萃取有机相。

[0160] 在一些实施方式中，根据本发明的某些方面，生物燃料或生物燃料前体在细胞中积累。在一些实施方式中，例如通过离心、沉淀或过滤的方式，连续或半连续地将积累了所需量的生物燃料或生物燃料前体的细胞从生物反应器中分离。细胞分离可进一步例如基于细胞物理特征如细胞大小或密度，通过本领域技术人员熟知的方法实现。随后可使用本领域技术人员熟知的标准萃取方法如溶剂正己烷萃取法，从相应的细胞中萃取积累的生物燃料或生物燃料前体。在一些实施方式中，以3倍于所收集的细胞体积的正己烷收集和萃取微生物细胞。在一些实施方式中，对萃取的生物燃料或生物燃料前体进行进一步的精炼。在一些实施方式中，使用本领域技术人员熟知的方法例如酯交换步骤将生物燃料前体如三酰基甘油转化为生物燃料如生物柴油。

[0161] 本发明的这些和其他实施方式的功能和优势将从下文实施例得到更全面的理解。以下实施例意欲阐述本发明的益处，但并未示例说明本发明的全部范围。因此，要理解的是实施例章节不意欲限制本发明的范围。
实施例

[0162] 实施例1.

[0163] 材料和方法

[0164] 酵母菌株、生长及培养条件

[0165] 用于本研究的解脂耶氏酵母菌株来自野生型解脂耶氏酵母W29菌株(ATCC20460)。用于所有转化的营养缺陷型Po1g(Leu-)获自Yeastern Biotech公司(Taipei,Taiwan)。本研究使用的所有菌株列于表1。

[0166] 表1.解脂耶氏酵母菌株的总脂肪酸含量、产率和分布。50mL培养物在100小时之后的总脂肪酸含量表示为平均值±S.D.(n＝3)(C/N摩尔比率为20)。脂肪酸谱表示为脂肪酸相对于总脂肪酸的百分比，误差低于2.5％。

[0167]

[0168]

[0169] 大肠埃希氏菌的培养基和生长条件在之前由Sambrook等人描述(21),解脂耶氏酵母的培养基和生长条件由Barth和Gaillardin描述(11)。Rich培养基(YPD)的制备方法如下：20g/L Bacto蛋白质(Difco Laboratories,Detroit,MI),10g/L酵母提取物(Difco),20g/L葡萄糖(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。YNB基质是由1.7g/L酵母酵母氮源(不含氨基酸)(Difco),0.69g/L CSM-Leu(MP Biomedicals,Solon,OH),和20g/L葡萄糖制备的。选择性YNB平板含有1.7g/L酵母氮源(不含氨基酸)、0.69g/L CSM-Leu、20g/L葡萄糖和15g/L Bacto琼脂(Difco)。

[0170] 摇瓶实验是使用以下基质进行的：1.7g/L酵母氮源(无氨基酸),1.5g/L酵母提取物和50g/L葡萄糖。从冻存储备物中将预培养物接种于YNB培养基(Falcon管中5mL，200rpm,28℃，24hr)。将过夜培养物接种于250mL Erlenmeyer摇瓶中的50mL培养基中，达到光学密度(A600)为0.05，孵育100小时(200rpm,28℃)，之后取出并分析生物质、糖含量和脂质含量。

[0171] 在2升带档板的搅拌罐生物反应器中进行生物反应器规模的发酵。所使用的基质含有1.5g/L酵母含氮碱基(无氨基酸及硫酸铵),2g/L硫酸铵,1g/L酵母提取物和90g/L葡萄糖。从选择性平板上挑取起始预培养物接种于YPD基质(在250mL Erlenmeyer摇瓶中40mL,200rpm，28℃，24hr)。将来自过夜预培养物中的对数期生长的细胞转移入生物反应器，直至在2L反应器中的光学密度(A600)为0.1(2.5vvm通风，pH6.8，28℃,搅拌转速250rpm)。将在不同时间点的样品储存于-20℃用于随后的脂质分析。通过HPLC确定糖有机酸含量。将样品在60℃下干燥两夜后通过重量分析测量确定生物质。

[0172] 质粒构建

[0173] 在本研究中一直使用的是标准分子遗传技术(21)。在克隆中使用的限制性酶和Phusion High-Fidelity DNA聚合酶获自New England Biolabs(Ipswich,MA)。来自酵母转化子的基因组DNA是使用Yeastar Genomic DNA试剂盒(Zymo Research,Irvine,CA)制备的。所有构建的质粒都通过测序得到确认。PCR产物和DNA片段是用PCR Purification试剂盒或QIAEX II试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)进行纯化。所使用的质粒描述于表3。所使用的引物描述于表4。

[0174] 使用引物MT078和MT079从解脂耶氏酵母Po1g基因组DNA上扩增翻译延长因子-1α(TEF)的启动子区域(登记号：AF054508)而构建质粒pMT010。将扩增子插入起始载体pINA1269(也称为pYLEX1，获自Yeastern Biotech公司(Taipei,Taiwan))的SalI和KpnI位点之间。反向引物MT079中还包括MluI和NsiI位点，这样为多克隆位点又添加了新的限制性位点。

[0175] 从解脂耶氏酵母Po1g基因组DNA上扩增TEF启动子及含有ATG起始密码子和113bp的内源内含子的5’编码区(登记号：CR382129)而构建质粒pMT015。引物MT118和MT122被用于此扩增，并被插入起始载体pMT010的SalI和MluI位点之间。为了进行克隆，删除了一些内含子使得能够并入SnaBI限制性位点。因此将基因克隆入此质粒需要删除基因的ATG起始密码子，而向5’引物的起始端添加了TAACCGCAG，在5’末端添加平末端连接位点。

[0176] 使用引物MT170和MT171从大肠杆菌中扩增编码β-半乳糖苷酶的LacZ基因并将其插入起始载体pINA1269的PmlI和BamHI位点中而构建pMT025质粒。使用引物MT168和MT169扩增LacZ基因并将其插入pMT010的MluI和NsiI位点中而构建质粒pMT038。因为LacZ含有多个MluI位点，所以使用了AscI作为MT168上的5’限制性位点，因为MT168上有一个匹配的突出。扩增LacZ基因并将其插入pMT015的SnaBI和NsiI位点中而构建质粒pMT037。使用了引物MT172和MT169，其中正向引物MT127删除了LacZ的ATG起始密码子，相反，是以序列TAACCGCAG开始的，这段序列补全了pMT015的内含子序列。

[0177] 使用引物MT080和MT081从解脂耶氏酵母Po1g基因组DNA(登记号：XM_501721)上扩增ACC1基因并将其插入pMT010的MluI和NsiI位点中而构建pMT013。使用引物MT222和MT137从pMT013上扩增ACC1基因及其终止子并将此序列插入经过PmlI和ClaI消化的起始载体pINA1269，而构建质粒pMT040。

[0178] 使用引物MT271和MT272从解脂耶氏酵母Po1g基因组DNA(登记号:XM_504700)上扩增DGA1基因，而构建质粒pMT053。经过扩增的基因经过NsiI消化并被插入PMT015，插入方式与pMT037的构建相同。

[0179] 为产生能够同时表达ACC1和DGA1两者的单一质粒，使用引物MT220和MT265从pMT053扩增启动子-基因-终止子的表达盒。然后将此片段用DpnI和AseI进行消化并插入经NruI和AseI消化的pMT040中，产生串联基因构建体pMT065。选择使用AseI限制性位点以利于筛选，因为其位于氨苄青霉素抗性标记之内。由于NruI是平末端限制性位点，所以扩增子的插入并不会增加总的NruI位点数，这样有利于后续插入。

[0180] 用NotI或SacII对质粒进行线性化并将其在染色体上整合入Po1g，这是根据Chen等人描述的一步醋酸锂转化法(22)进行的。将转化子铺于选择性培养基上并通过对制备的基因组DNA的PCR进行验证。然后将经验证的转化子以冷冻储备液储存于-80℃，或在选择性YNB平板上储存于4℃。

[0181] RNA提取及转录物定量

[0182] 在酵母菌株在YNB上生长24小时后，收集细胞，并用液氮冷冻，保存于80℃。在液氮中破碎样品，根据制造商说明书，使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)从解脂耶氏酵母中提取总RNA，在提取步骤中用无RNA酶的DNA酶进行处理。用分光光度计在260nm处对提取的RNA进行定量。使用具有SYBR Green的iScript One-step RT-PCR试剂盒ΔCT(Bio-Rad,Hercules,CA)进行qRT-PCR分析。相对定量基于2 法，其中使用编码肌动蛋白的ACT1作为内参。样品都以三次重复进行分析。

[0183] β-半乳糖苷酶测定

[0184] LacZ酶活性是使用β-gal测定试剂盒进行测量的(来自Sigma-Aldrich)。将细胞重悬于PBS缓冲液并通过加入500μm玻璃珠(Sigma-Aldrich)涡旋振荡2分钟裂解细胞。将40μL的细胞裂解物转移至340μL反应混合物中，其含有47mg/mL ONPG,0.6M Na2HPO4-7H2O,0.4M NaH2PO4-H2O,0.1M KCl,0.01M MgSO4-7H2O。在37℃孵育反应物使得颜色发生变化，最终使用500μL1M碳酸钠淬灭反应。然后用分光光度计测量420nm处的吸收值。基于酶活除以孵育时间和细胞干重计算酶单位。

[0185] 脂质分析

[0186] 使用Folch等人的方法提取总的脂质(23)。将测定量的细胞生物质(大约1mg)重悬于1mL的氯仿:甲醇(2:1)溶液中并涡旋振荡1小时。离心后，将500μL转移至125μL生理盐水溶液中。移除上层水层并使下层液相挥发，重悬于100μL正己烷中。然后将样品储存于-20℃直至进行酯交换反应。

[0187] 向每个样品中加入溶于甲醇中的1mL2％(wt/vol)的硫酸，进行总脂质提取物的酯交换反应。然后将样品在60℃下孵育2小时。此后，对样品进行部分挥发，并通过加入1mL正己烷，涡旋振荡10min，对脂肪酸甲酯(FAME)进行萃取。然后将800μL的所述正己烷转移入玻璃管分装，用于GC分析。

[0188] FAME的GC分析是使用配有火焰离子化检测器和毛细管柱HP-INNOWAX(30m x0.25mm)的Bruker450-GC设备进行的。GC烘箱条件如下：150℃(1min)，在10min中逐渐增高至230℃，在230℃下保持2min。分流比为10:1。通过与商业化的FAME标准品进行比较而对脂肪酸进行鉴别和定量，结果相对十三酸甲酯(C13:0)进行标准化。总的脂质含量以五种FAME的总脂肪酸含量之和计算：棕榈酸甲酯(C16：0)，甲基棕榈烯酸(C16：1)，硬脂酸甲酯(C18：0)，油酸甲酯(C18：1)，亚油酸甲酯(C18：2)(Sigma-Aldrich)。向氯仿-甲醇萃取的液体中加入十三烷酸作为内部标准物，这在整个分析过程中都存在，并进行酯交换成为其甲基酯形式。

[0189] 结果和讨论

[0190] 使用翻译延伸因子-1α的表达增强内含子建立高效的表达平台

[0191] 在解脂耶氏酵母中，大量的启动子可用于基因表达，包括诱导型和组成型启动子(24)。TEF启动子最初是作为强的组成型启动子得到鉴定的；然而，随后的克隆和鉴定的结果表明其相对可诱导XPR2启动子表达较低(25)。最近，杂交hp4d启动子由于有强的准组成型表达，逐渐受到欢迎(26)，已经用于大量要求蛋白质高表达的应用中(20,27,28)。

[0192] 对TEF的基因组序列的分析表明在开放阅读框5’区域中紧接着起始密码子后有一段122-bp的剪接体内含子。经常发现启动子-临近的间接体内含子极大地影响在大量生物体内相应的基因表达(29)。我们推测TEF的强表达依赖于此内含子，并且通过将此内含子与启动子一起包含到表达载体中而达到更强的表达效果。事实上，对TEF启动子进行最初筛选和分离可以依赖于在cDNA文库中富集的内含子增强作用，一旦内含子被剪切，这一特征便不会得到注意。

[0193] 构建表达LacZ的质粒pMT025、pMT037和pMT038以比较三个启动子的相对表达：合成杂合启动子(php4d)、无内含子的TEF启动子(pTEF),以及有内含子的TEF启动子(pTEFin)。显著地，在培养50小时之后TEFin启动子显示了比无内含子的TEF启动子的表达有17倍的增加，比hp4d启动子的表达有5倍的增加。

[0194] 在其他系统中观察到的内含子增强有极大的不同：从在人细胞和酵母中仅仅有2倍的增加，到玉米中超过1000倍的增加(30,31)。人们认为内含子能以多种方式增强基因表达：通过包含调节元件，促进mRNA的输出以及增加转录起始速率等方式(29)。具有内含子的基因作为一组基因，通常相对无内含子基因显示了更高的表达水平。例如，在酿酒酵母中，具有内含子的基因仅仅占总基因数的不到4％，却表达了细胞中生成的总RNA的27％(32)。解脂耶氏酵母基因组的10.6％的基因中都含有内含子，而酿酒酵母中只有4.5％的基因具有内含子(33)。利用所述内源过程以增强我们需要的基因，这一手段为使表达最大化的一个简单的方式，可应用于很宽泛的真核生物体范围。例如，半子囊酵母之间的剪接序列有很高的序列同源性(34)。虽然研究一直在更多地解释内含子的功能、进化及目的，但是将内含子用于生物技术目的还是相对而言未打开的机会。

[0195] ACC1和DGA1的过表达导致脂质积累有显著增加

[0196] 将TEF启动子与其表达增强内含子一同使用为解脂耶氏酵母的基因表达提供了优秀的平台。因此我们使用这一方法过表达DGA1(pMT053)，显示这一基因在解脂耶氏酵母和酿酒酵母二者中的脂质积累都十分重要(19,35)。ACC1已经具有两个内源的启动子-邻近的内含子，并未与TEFin启动子一同克隆。相反，将其与TEF和hp4d启动子一同克隆(分别为pMT013和pMT040)。生长速率和脂质生产在这二者之间相对而言非常类似(数据未显示)，因此将php4d-ACC1用于脂质实验并用于ACC1+DGA1的串联基因构建(pMT065)。选择hp4d启动子也是为了使ACC1+DGA1构建体中这两个平行的基因表达盒同源重组的可能性达到最小。使用串联基因构建方式在解脂酵母中使两个基因同时共表达已经在他处成功进行(20)。

[0197] ACC1和DGA1的过表达对脂质生产的效应在摇瓶实验中首次得到评估。对照LacZ菌株只产生了8.77％(g/g DCW)的脂质，这与摇瓶中以葡萄糖作为唯一底物的野生型菌株表现类似(36)。ACC1和DGA1转化子都比对照表现更好，分别积累了17.9％和33.8％的脂质含量。尤其是DGA1，显示了几乎两倍于ACC1的脂质积累，大约是对照的4倍。由对照生成的生物质比其他菌株显著更高，提示ACC1和DGA1的表达可以破坏了解脂耶氏酵母的生长潜力。与理论最大产率(0.32g/g(37))相比，总体的油产率相对低。脂肪酸谱也有轻微的变化，其中ACC1产生了显著更多的亚油酸而DGA1维持了更高比例的硬脂酸。油酸比例在所有转化子中都保持相对平缓。

[0198] ACC1+DGA1比两种单一基因转化子都有改进，能够达到41.4％的脂质含量，比对照有4.7倍提高。生物质的生产相比于单一转化子得到提高，但比对照还是较少。油产率有成比例的提高，达到0.114g/g,或35％的理论产率。

[0199] 在真核生物体中，ACC的过表达只对脂质生产产生有限的改进。在非产油酵母多形汉逊中异源表达来自产油真菌鲁氏毛霉的ACC1仅仅使脂肪酸含量有40％的增加，含量从3.8％增加至5.3％(38)。在植物中，拟南芥ACC1的过表达导致酶活性有极大的增加，但最终的脂质含量增加不超过30％(39,40)。推测因为真核细胞中维持对该酶的强的代谢和调节控制，所以改进很有限。ACC表达和活性被大量转录因子、蛋白质激酶和代谢物所影响(41)。例如，在解脂念珠菌(耶氏酵母)中，乙酰-CoA合成酶突变体中酰基-CoA的积累导致ACC活性降低8倍(42)。然而，解脂耶氏酵母可以代表真核生物中的一个调节例外，这大部分导致其产油特质，因为我们在这里通过过表达内源ACC1而达到了2倍的脂质增加。

[0200] DGA的作用仅仅是最近才被发现对于脂质合成有重要作用。在解脂耶氏酵母中，DGA1p主要定位于脂质小体的膜表面，并且与甘油三酯酯酶(TGL3)协调作用以平衡TAG在脂质小体中的流入和流出(16)。因此，预期TAG的储存严重依赖于DGA1p的相对其TGL3p对应物的活性(和丰度)。还有假设认为DGA使代谢流从磷脂合成中转移走，由此创造了驱动力进行脂质合成，因为更多的代谢流需要用来生产仍然必需的磷脂(6)。因此，DGA1的过表达在脂质积累上产生显著效应。在产油Δsnf2突变体中进行DGA1的过表达导致酿酒酵母中积累了高达27％的脂质含量，即增加2.3倍(35)。在植物中，拟南芥DGAT过表达导致叶子中脂质含量增加20倍，总体脂质含量增加2倍(43)。

[0201] 脂肪酸和TAG合成途径之间的平衡在于酰基-CoA中间产物，因为这些中间产物既是脂肪酸(上游)途径的产物和反馈抑制剂也是TAG(下游)途径的主要前体。上游途径的上调增加脂肪酸合成的通量，尤其是对于ACC，其将代谢流从任何会竞争使用细胞溶胶乙酰-CoA的途径转移出。下游途径的上调通过消耗酰基-CoA中间产物创造驱动力，并且增加TAG在脂质小体中的储存速率。然而，当单独受到调制时，其会导致不平衡，这会对细胞新陈代谢和生长产生不利的效应。

[0202] 通过共表达ACC1和DGA1,上游和下游途径都同时被上调，这导致脂质生产的增加，而不会干扰到中间产物介导的调控。这种方法还将ACC产生的脂质合成的高代谢流与由DGA介导的TAG向脂质小体内的隔离提供的驱动力相结合。结果是脂质积累的协同性增加，高出对照几乎5倍。事实上，将过生产和驱动力与代谢沉没相偶联已经是代谢工程的最近努力中的一种非常强有力的策略，尤其是用于生物燃料(44-46)。

[0203] ACC1+DGA1转化子的发酵表现

[0204] 为进一步对ACC1+DGA1转化子(MTYL065)进行定性并探索其脂质积累特征，使用2L搅拌罐生物反应器进行大规模发酵。增加葡萄糖浓度，将硫酸铵浓度减少，达到C/N摩尔比为100。用于脂质积累的最佳C/N摩尔比率通常在80-120的范围内(15)，

[0205] 在120小时的发酵过程中，葡萄糖得到完全的消耗，最终的生物质达到28.49g/L(图3)。最终脂质含量为61.7％DCW，相比于摇瓶实验，脂质积累有50％的增加。这在与其他糖发酵相比时具有优势(28,47-49)，也比离体脂质积累的方案中得到的值更具有优势(19,50)。总体的产率和生产效率分别为0.195g/g和0.143g/L/hr；然而，在70-100小时间观察到的最大脂质生产中，达到的产率为0.270g/g，生产效率为0.253g/L/hr(表2)。在这个时期生产的几乎所有生物质都是由脂质含量的增加引起的。所达到的总体和最大产率分别为TAG合成理论产率的60.9％和84.3％。

[0206] 表2.ACC1+DGA1转化子在2L生物反应器发酵中计算的产率和生产效率。产率是由产生的脂质(克)除以消耗的葡萄糖(克)计算的。生产效率是通过每小时生产的脂质浓度计算的。最大值是从70-100hrs两个时间点之间计算。

[0207]

[0208]

[0209] 脂肪酸谱在规模扩大的过程中发生巨大的变化(图4)。此过程中观察到硬脂酸的相对消耗和棕榈酸和油酸的富集，油酸最终构成了总脂肪酸的49.3％。油酸和硬脂酸之间的比率在整个发酵过程中稳定增加(数据未显示)，最终以4.6的比率结束。从摇瓶实验中1.3的比率来看，这是一个巨大的变化。用醋酸作为碳源也进行了类似的实验。在134小时分析脂肪酸谱，结果显示于图5。

[0210] 在其他2L发酵中也观察到高的油酸相对浓度(高达58.5％)(51),这一点与积累了超过50％脂质含量的其他产油酵母的形式更加相似(15)。在脂质快速生产的条件下，油酸可以更快速地得到储存并更容易积累，因为已知DGA1p具有对于不同酰基-CoA的多种特异性；在酿酒酵母中,C18:1是最优选的底物，对其的活性是对C18:0的两倍(52)。进一步地，高油酸浓度也可以是对生物反应器中达到的更高通风速率的应答，这一点在摇瓶发酵中不容易见到。

[0211] 在ACC1+DGA1菌株中见到的高脂质含量、产率和生产效率表明解脂耶氏酵母天生能为脂质合成途径提供高的代谢流。在得到进一步修饰和过程优化后。具有工程改造的脂质合成通路的解脂耶氏酵母可以在强烈有效的脂质从头合成中产生有前景的突破。

[0212] 表3.本研究应用的菌株和质粒菌株

[0213]

[0214]

[0215] 表4.本研究使用的引物

[0216]

[0217]

[0218] RT-

[0219] PCR

[0220] Actin

[0221] Actin

[0222] LacZ

[0223] LacZ

[0224] ACC1

[0225] ACC1

[0226] DGA

[0227] DGA

[0228] 使用工程改造的ACC+DGA菌株由醋酸生产脂质

[0229] 解脂耶氏酵母天然生长在机酸醋酸盐上。醋酸盐作为底物有很大的吸引力，因为其可由同型乙酸生物体通过非光合碳固定途径从二氧化碳或一氧化碳以高产率生产。醋酸以乙酰-CoA的形式进入细胞代谢途径，乙酰-CoA是经由乙酰-CoA羧化酶(ACC)进行脂质合成的主要前体。由此，ACC+DGA菌株看上去是以醋酸盐为底物进行脂质生产的一个有前景的候选物，因为利用乙酰-CoA的酶过表达直接与脂质积累的强驱动力相偶联。

[0230] 使用ACC+DGA菌株在2升生物反应器中发酵，以醋酸盐作为碳底物(图6)。在氧气含量高的情况下，观察到醋酸盐迅速被消耗，同时生成的生物质的量很低，因此在氮和氧都受限的条件下进行发酵，以使脂质生产和产率达到最大化。

[0231] 130小时后，油生产的最终滴度为5.5g/L，这占总的生物质细胞干重(8.9g/L)的62％。以醋酸盐为底物的总体脂质产率为0.152g油/g醋酸盐。在脂质生产期(90-130小时之间)，产率为0.27g油/g醋酸盐时达到最大脂质生产，这是理论最大产率的96％。

[0232] 与以葡萄糖为底物的发酵特征的对比显示，尽管生物质产率和生长速率较低，但是脂质积累和最大脂质产率达到最大。

[0233] 表5.以葡萄糖和醋酸盐为底物的发酵情况对比

[0234]葡萄糖 醋酸盐
指数生长速率 0.0982hr-1 0.0368hr-1
总体生物质产率 0.316g/g 0.246g/g
总体脂质产率 0.195g/g 0.152g/g
脂质生产期 70-120小时 90-130小时
最大脂质产率 0.249g/g 0.270g/g
最大生产效率 0.258g/L/小时 0.103g/L/小时
最终脂质滴度 17.6g/L 5.5g/L

[0235] 结论

[0236] 脂质生物合成是一个受到严密调控的代谢途径。要进行工业相关的脂质生产的应用，需要进行周全的代谢工程以使产率和生产效率最大化。产油酵母解脂耶氏酵母的用途受益于其具有高的脂质积累能力，并且将其用作脂质代谢途径工程改造的工具。本文中我们显示，脂质合成途径中两个重要基因ACC1和DGA1的内含子增强的过表达提供了朝向脂质生产的驱动力，甚至在中等C/N比率下。由于这两种酶进行了脂质合成的初始和最后的步骤，所以对向TAG的碳流入同时进行推和拉，使得生产增强，而可以导致抑制的中间产物的积累达到最小化。所得的ACC1+DGA1菌株能够通过从头合成积累高达其DCW的62％作为脂质，总体的体积生产效率为0.143g/L/小时。

[0237] 以下概念(a)途径基因的强过表达，(b)上游和下游途径的平衡，(c)将代谢流转移至想要的途径，以及(d)朝向最终产品的驱动力，是代谢工程实践中最重要的策略，使得代谢网络得到工程改造和优化，以生成想要的产品。在脂质积累这一点上履行这些概念可容易地延伸至大量其他生物学平台，包括微藻。这些策略是发展有力、有效、商品规模的生物学衍生化学品和燃料生产技术的基础。其在脂质生物合成上的应用开启了微生物油过生产以及经济有效的生物燃料制造的道路。

[0238] 参考文献

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[0291] 实施例2.

[0292] 解脂耶氏酵母中脂质合成基因的组合表达

[0293] 细胞代谢的研究可以用代谢工程得到阐明。代谢工程是使用重组DNA技术对生物体中代谢途径的操纵(Bailey1991)。通过操纵和工程改造特定的代谢网络，可鉴别和阐明其中的控制因子和限速步骤。在特定生物体或途径的现有知识和工具的基础上，能够评估新型的干扰如何使用以重新定向和控制所需产品的生成。

[0294] 脂质合成是用于代谢工程研究的极佳途径，具有范围广泛的应用，从健康、癌症和医药到生物化学品和生物燃料的生产(Beopoulos等人2011；Courchesne等人2009；Kohlwein和Petschnigg2007)。用于脂质生物合成的生理学、酶学和代谢在从细菌到人的广泛范围的生物体中都得到了深入的研究，形成了比较和探索性分析的强有力的知识基础(Kurat等人2006；Ohlrogge and Jaworski1997)。脂质代谢在细胞生理学的许多方面都起到不可或缺的作用，从细胞生长和增殖到能量储存和代谢(Kohlwein和Petschnigg2007；
Tehlivets等人2007)。为利用这些途径用于医药和工业目的，了解何种干扰对总体过程起到最大影响是非常重要的。

[0295] 产油酵母解脂耶氏酵母是研究脂质代谢的极佳的模式生物。作为产油酵母，解脂耶氏酵母能在富碳环境中天然积累高达36％的脂质(Beopoulos等人2009)。这些脂质以脂质小体中甘油三酯的形式储存(TAG)。其是研究最深入的“非常规”的酵母种属，可以使用其测序的基因组和一系列遗传工具(Barth和Gaillardin1997)。已经将其用于大量工业应用，并将其视为蛋白质分泌、疏水底物利用、脂质代谢和线粒体呼吸方面的模式生物(Beckerich等人1998；Beopoulos等人2009；Coelho等人2010；Kerscher等人2002)。解脂耶氏酵母天然积累了大量脂质，同时大量工程改造方面的努力已经成功地进一步增加或改进了其脂质积累特征(Beopoulos等人2008；Chuang等人2010；Dulermo和Nicaud2011；Zhang等人2011)。然而，为此目的所检验的遗传操纵的数量和种类仍然相对有限，解脂耶氏酵母作为脂质过生产平台的潜能相对而言开发的还很少。

[0296] 通过多种手段和策略将大量目的基因靶标与脂质积累相关联(Courchesne等人2009)。乙酰-CoA羧化酶(ACC)通常被认为是脂肪酸生物合成中的限速步骤，控制了进入该途径的代谢流。其负责生产丙二酰-CoA，后者可用于脂肪酸延伸中。ACC利用细胞溶胶乙酰-CoA作为其主要的代谢前体。大多数真核细胞中供应细胞溶胶乙酰-CoA的酶都是ATP柠檬酸裂解酶(ACL)。ACL裂解柠檬酸，后者作为TCA循环的产物穿梭出线粒体，形成乙酰-CoA和草酰乙酸。在脂肪酸合成酶复合体完成脂肪酸生产后，酰基-CoA分子可进一步通过在内质网上进行延伸和去饱和得到进一步操纵。这些过程帮助修饰酰基-CoA链的化学特性，以利于进行储存或在其他代谢途径中利用。例如Δ9-去饱和酶(D9)之类的酶将硬脂酰-CoA分子转化为油酰-CoA分子，后者似乎在脂质调控和代谢中都非常重要(Dobrzyn和Ntambi2005)。脂质装配和储存中的最后一步是二酰基甘油(DAG)通过二酰基甘油酰基转移酶(DGA)向TAG的转化。这一步骤在内质网和脂质小体表面都有发生，在后者上进行的这一步骤根据生物体对能量的需要建立了TAG装配和降解的动态平衡(Athenstaedt等人
2006)。在解脂耶氏酵母中,已经鉴定出大量执行此项功能的DGA基因(Zhang等人2011)。

[0297] 这些酶步骤都显示了与脂质积累的有意义的关系。ACC控制进入脂质合成的代谢流，在细菌大肠埃希氏菌中ACC的过表达使得脂肪酸合成增加6倍(Davis等人2000)。受ACL控制的柠檬酸穿梭在产油真菌中观察到的与非产油真菌相比是有差异的，因此推测其为高代谢流进入脂质生物合成途径的必要途径(Boulton和Ratledge1981；Vorapreeda等人2012)。还认为ACL的灭活导致柠檬酸积累和分泌，这也是脂质生产中不期望的现象(Papanikolaou和Aggelis2002；Papanikolaou等人2002)。D9参与了癌症代谢，其在哺乳动物肿瘤细胞中上调。其是脂质生成的一个潜在的强的正向调控子，促进了癌症细胞中所见的迅速生长所必须的脂质生产(Dobrzyn和Ntambi2005；Hulver等人2005；Ntambi和Miyazaki2004)。DGA是脂质储存的最后关键步骤，酿酒酵母Δsnf2突变体中DGA的过表达导致脂质积累有巨大的增加(Kamisaka等人2007)。这些结果产生了一些有意义的结果和含义，同时对其在单个模式生物体中的分布的分析可使我们能系统地鉴别它们能如何贡献、合作，以达到增加的脂质生产。

[0298] 这里我们观察了脂质生物合成中涉及的几个重要基因的影响，并且探索了其对产油酵母解脂耶氏酵母中脂质积累增加做出的贡献。通过单独或组合过表达基因靶标，我们能够探索基因如何能通过脂质生物合成途径正向影响代谢流。进一步地，我们研究了两种候选菌株的脂质生成表现，以阐明细胞中代谢流达到平衡对达到高生成效率的重要性。

[0299] 材料和方法

[0300] 酵母菌株、生长和培养条件

[0301] 本研究使用的解脂耶氏酵母菌株衍生于野生型的解脂耶氏酵母W29菌株(ATCC20460)。在所有转化中使用的营养缺陷型Po1g(Leu-)都来自Yeastern Biotech公司(Taipei,Taiwan)。本研究中使用的所有菌株都列于表6。将构建的质粒用SacII线性化，并根据Chen等人描述的一步醋酸锂转化法(Chen等人1997)在染色体上插入Po1g。除了MTYL088和MTYL089之外，MTYL转化子是根据其对应整合的质粒而命名。为构建菌株MTYL088和MTYL089，菌株MTYL078和MTYL079经历了两轮额外的转化：(1)以URA KO表达盒转化并用选择性的5-FOA筛选，以敲除内源的URA；(2)用经过SacII线性化的PMT092转化。将转化子铺板于选择性基质上，并通过制备基因组DNA的PCR进行验证。然后将经验证的转化子以甘油储备物冷冻储存于-80℃，在选择性YNB平板上于4℃储存。为每个菌株设计的基因过表达情况的总结在表7中有所描述。

[0302] Sambrook等人先前已经描述了大肠埃希氏菌的基质和生长条件(Sambrook和Russell2001)，用于解脂耶氏酵母的基质和生长条件由Barth和Gaillardin等人 描述 (Barth和Gaillardin1997)。 富 营养 基 质(YPD) 是用 20g/L Bacto蛋 白胨(Difco Laboratories,Detroit,MI)、10g/L 酵 母 提 取 物 (Difco)、20g/L葡 萄 糖(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)制备的。YNB基质是以1.7g/L酵母氮源(无氨基酸)(Difco)、0.69g/LCSM-Leu(MP Biomedicals,Solon,OH)和20g/L葡萄糖制成的。选择性YNB平板含有1.7g/L酵母氮源(无氨基酸)、0.69g/L CSM-Leu,20g/L葡萄糖和15g/L Bacto琼脂(Difco)。使用以下基质进行摇瓶实验：1.7g/L酵母氮源(无氨基酸)、1.5g/L酵母提取物和50g/L葡萄糖。从冻存储备物中将预培养物接种于YNB培养基(Falcon管中5mL，200rpm，28℃，24hr)。将过夜培养物接种于250mL Erlenmeyer摇瓶中的50mL培养基中，达到光学密度(A600)为0.05，孵育100小时(200rpm，28℃)，之后取出并分析生物质、糖含量和脂质含量。

[0303] 在2升带板的搅拌罐生物反应器中进行生物反应器规模的发酵。所使用的基质含有1.7g/L酵母氮源(无氨基酸及硫酸铵)、2g/L硫酸铵、1g/L酵母提取物和90g/L葡萄糖。从选择性平板上，起始预培养物接种于YPD基质(250mL Erlenmeyer摇瓶中40mL，200rpm，
28℃，24hr)。将来自过夜预培养物中的对数期生长的细胞转移入生物反应器，直至在2L反应器中的光学密度(A600)为0.1(2.5vvm通风，pH6.8，28℃，搅拌转速250rpm)。将在不同时间点的样品储存于-20℃用于随后的脂质分析。通过HPLC确定糖有机酸含量。将样品洗涤并在60℃下干燥两夜后通过重量分析测量确定生物质。

[0304] 遗传技术

[0305] 在本研究中一直使用的是标准分子遗传技术(Sambrook和Russell2011)。在克隆中使用的限制性酶和Phusion High-Fidelity DNA聚合酶获自New England Biolabs(Ipswich,MA)。来自酵母转化子的基因组DNA是使用Yeastar Genomic DNA试剂盒(Zymo Research,Irvine,CA)制备的。所有构建的质粒都通过测序得到验证。用PCR Purification试剂盒或QIAEX II试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)纯化PCR产物和DNA片段。
所使用的质粒描述于表6中有描述。所使用的引物在描述于表9。

[0306] URA3删除

[0307] 为增加解脂耶氏酵母菌株中标记物的可用性，扩增编码尿嘧啶原养型乳清苷-5'-磷酸脱羧酶(URA3,登记号:AJ306421)的基因并将其用作敲除盒的基础，生成URA营养缺陷菌株。分别使用引物对MT310-MT311和MT312-MT313扩增URA开放阅读框的上游和下游序列。将引物设计成使两个扩增子携带23bp重叠区域。纯化两个扩增子后，将产物进行混合，并使用引物MT310和MT313进行PCR以产生上游和下游扩增子融合而成的456bp的扩增子。随后将所述DNA进行纯化并随后转化入Po1g。然后将转化的细胞铺板于含有尿嘧啶和5-氟乳清酸(5-FOA)的选择性基质平板上。将生长的克隆重新铺于5-FOA平板以对URA营养缺陷型进行再选择，并通过制备的基因组DNA的PCR进行验证。所得的ΔLEU2ΔURA3菌株命名为MTYL100。

[0308] 质粒构建

[0309] 质粒pMT010、pMT015、pMT038、pMT040、pMT013和pMT065的构建在上文有描述，与这里描述的方法类似。使用引物MT252和MT253，从解脂耶氏酵母Po1g基因组DNA扩增ACL1基因(登记号:XM_504787)并将其插入pMT010的MluI和NsiI位点中而构建表达ATP:柠檬酸裂解酶亚基1的质粒pMT047。类似地，使用引物MT254和MT255，从解脂耶氏酵母Po1g基因组DNA扩增ACL2基因(登记号:XM_503231)并将其插入pMT010的MluI和NsiI位点中而构建表达ATP:柠檬酸裂解酶亚基2的质粒pMT049。用引物MT283和MT284，从Po1g基因组DNA扩增表达Δ9脂肪酸去饱和酶(D9)(登记号:XM_501496)的质粒pMT061并使用限制性位点PmlI和BamHI插入pINA1269，使之受到php4d启动子的控制。

[0310] 为产生表达多个基因的质粒(pMT050、pMT065、pMT066、pMT073、pMT074、pMT075,pMT078、pMT079)，使用引物MT220和MT265从一个质粒上扩增启动子-基因-终止子表达盒。然后将其用DpnI和AseI消化并插入经过NruI和AseI消化的第二个质粒，产生串联基因构建体pMT065。选择使用AseI限制性位点以利于筛选，因为其位于氨苄青霉素抗性标记之内。因为NruI是一个平末端限制性位点，所以扩增子的插入并不会增加总的NruI位点数，这样有利于后续使用相同的步骤进行迭代插入。用于这些质粒的组合构建的总体序列和方案描述于图7中。为了构建互补的载体，选择pACYCDUET-1作为互补的穿梭载体，因为其利用了不同的骨架、选择性标记物及复制起点。使用引物对MT316-MT317，从解脂耶氏酵母Po1g基因组DNA扩增LIP2(登记号:XM_500282)的上游序列，并使用限制性位点BamHI和EcoRI将其整合入pDUET。使用引物对MT318-MT319，扩增LIP2的下游序列，并使用限制性位点KpnI和AvrII将其整合入pDUET。使用引物对MT314-MT315，从质粒JMP62-URA扩增用于酵母尿嘧啶原养型的选择性标记物，并使用限制性位点PvuI和KpnI将其整合入pDUET。所得的质粒pMT091含有多克隆位点，上游和下游两侧为LIP2序列和URA3标记物。用限制性酶SacII消化对质粒进行线性化，并将整合载体与质粒骨架分开，使外部及不期望的DNA的整合达到最小化。互补质粒的用途要求在起始的pINA1269骨架上构建表达盒并随后使用限制性酶亚克隆将所述表达盒转移至pMT091。所述大的多克隆位点和差异化抗生素标记物有利于克隆和选择过程。

[0311] RNA提取和转录定量

[0312] 收集生长42小时的摇瓶培养物，在10,000g下离心5min。将每种沉淀在1.0ml的Trizol反应剂(Invitrogen)中重悬，加入100μL的酸洗的玻璃珠(Sigma-Aldrich)。在4℃下将试管漩涡振荡15min进行细胞裂解。然后将离心管在4℃下于12,000g离心10min，将上清液收集在一个新2-mL管中。然后加入200μL氯仿，用手摇晃离心管10秒钟。再次将离心管在4℃下于12,000g离心10min。将400μL的上层水相转移至新管，然后加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(pH4.7)(Ambion,Austin,TX)。再次用手摇离心管10秒钟，并在4℃下于12,000g离心10min。将250μL的上层相转移至有等体积冰乙醇及1/10体积醋酸钠(pH5.2)的新管中。将离心管在-20℃下冷冻三十分钟以促进沉淀。然后将离心管以12,000g离心5分钟，用70％乙醇洗涤两次，并在60℃烘箱内干燥，最终重悬于无RNA酶的水中。使用NanoDrop ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies,Wilmington,DE)分析RNA的量，并将样品储存于-80℃冰箱中。使用具有SYBR Green的iScript
One-step RT-PCR试剂盒(Bio-Rad,Hercules,CA)、Bio-Rad iCycler iQ Real-Time PCR Detection System进行qRT-PCR分析。使用实时定量PCR Miner分析荧光结果，用使用REST2009(Qiagen)确定相对定量并进行统计分析，其中使用肌动蛋白作为参考基因，将MTYL038作为参考菌株(Zhao和Fernald2005)。样品重复分析四次。

[0313] 脂质萃取和定量

[0314] 使用Folch等人的方法萃取总脂质(Folch等人1957)。将测定量的细胞生物质(大约1mg)重悬于1mL的氯仿:甲醇(2:1)溶液中，涡旋振荡1小时。离心后，将其中500μL转移至125μL生理盐水溶液中。移除上层水层并使下层液相挥发，重悬于100μL正己烷中。然后将样品储存于-20℃直至进行酯交换反应。

[0315] 向每个样品中加入1mL2％(wt/vol)的硫酸(溶于甲醇中)，进行总脂质提取物的酯交换反应。然后将样品在60℃下孵育2小时。此后，对样品进行部分挥发，并加入1mL正己烷，涡旋振荡10min，对脂肪酸甲酯(FAME)进行萃取。然后将800μL的所述正己烷转移入玻璃管分装，用于GC分析。

[0316] FAME的GC分析是使用配有火焰离子化检测器和毛细管柱HP-INNOWAX(30m x0.25mm)的Bruker450-GC设备进行的。GC烘箱条件如下：150℃(1min)，在10min中逐渐增高至230℃，在230℃下保持2min。分流比为10:1。通过与商业化的FAME标准品进行比较对脂肪酸进行鉴别和定量，结果以对十三酸甲酯(C13:0)进行标准化。总的脂质含量以五种FAME的总脂肪酸含量之和计算：棕榈酸甲酯(C16：0)、甲基棕榈烯酸(C16：1)、硬脂酸甲酯(C18：0)、油酸甲酯(C18：1)、亚油酸甲酯(C18：2)(Sigma-Aldrich)。向氯仿-甲醇萃取液体中加入十三烷酸作为内部标准物，这在整个分析过程中都存在，并被转酯化成为其甲基酯形式。

[0317] 结果和讨论

[0318] 互补载体的构建使得DGA表达有备选方法。

[0319] 为提供备选和互补的方法在解脂耶氏酵母中表达基因，从亲本菌株Po1g中敲除URA标记物。作为互补整合载体设计的一部分，细胞外酯酶LIP2被选作对接位点，因为这一基因已经得到很好的定性，而且可以对脂质合成和积累具有可忽略的或中性的效应。因此，在整合互不载体的过程中，LIP2将被敲除。在构建互补载体用于基因表达时，有必要检验基因的表达是否根据所用的载体而受影响。为测试这一点，将编码二酰基甘油酰基转移酶(DGA)的基因克隆到pMT015和pMT091这两个载体中。尽管在两个载体中表达盒都是相同的，但是对接位点是不同的：pBR322是pMT015(以及所有基于pINA1269的载体)的对接位点，LIP2基因是pMT091的对接位点。在这些载体转化并验证基因组整合时，对两种菌株都提取RNA并进行RT-PCR实验，检验两种情况下DGA相对于对照菌株(MTYL038)的过表达情况。如图8所示，两种菌株在DGA表达上相对于MTYL038对照菌株显示了32倍的增加。这些结果证实pMT091用作互补载体、LIP2用作备选的对接位点进行基因表达没有产生可检测的来自可能表观遗传现象的干扰。

[0320] 对组合构建体进行全面调查鉴别出具有选定基因的改进的菌株.

[0321] 为研究基因靶标的贡献和相互作用，在多种中间产物基因表达组合间进行了调查，测试转化菌株的脂质生产能力。表7描述了13个构建的菌株及其相应的基因上调情况。脂质测量都是在培养100小时后进行的，以对比脂质生产效率而不仅仅是脂质积累。用于工业目的，总体的生产效率是比总脂质含量更重要的测量，因为生长慢但有高产率的菌株仍然不如快速生长而具有中等高产率的菌株有用。对脂质生产效率和产率的完整调查结果在图9中说明。

[0322] 检验只含有单个基因过表达的菌株(MTYL040、MTYL053、MTYL050、MTYL061)，发现ACC和DGA在生产效率和产率上都有明显的改进。ACL和D9在生产效率或产率上都没有显著的增加。这些结果表明，对于解脂耶氏酵母，ACC和DGA显示了对脂质生物合成的控制，也是限速步骤，而ACL和D9并未显示类似的现象。

[0323] ACC和DGA的效应在上文有深入讨论，但DGA通过隔离脂质并消耗酰基-CoA中间产物创造驱动力，而ACC通过将代谢流转移至脂质合成并更迅速地调动细胞溶胶的乙酰-CoA库而增加产率。当两个基因在菌株MTYL065中组合时，其通过在脂质合成途径中建立推-和-拉的动态关系产生协同应答，其中酰基-CoA为平衡的中间产物。

[0324] 当与其他基因组合时，基因D9能够为脂质生产效率赋予少量的益处。例如，过表达D9和DGA的MTYL069比MTYL053具有更高的脂质生产效率，后者仅仅含有DGA过表达。类似地，过表达ACC和D9的MTYL066比单独过表达ACC的MTYL040具有更高的脂质生产效率。然而过表达ACC+D9+DGA的MTYL073却显示了比MTYL065低的脂质生产效率。在MTYL089及其缺少D9的变体MTYL088之间没有显著差异。虽然在积累和生产效率上观察到有一些益处，但是对于产率的益处并不显著。观察到的D9只在与其他基因组合时才提高脂质生产的现象似乎提示D9对于脂质合成过程没有强的调控或限速控制，但是其的酶作用提供了有利的条件，放大了其他基因的效应。作为在脂质小体膜和内质网上与膜相连的酶，D9在脂质积累期得到上调(Morin等人2011)。已经发现有很多脂质合成酶对油酸都有最高的特异性，而油酸正是D9去饱和的产物(Oelkers等人2002)。这一点在所观察到的解脂耶氏酵母以油酸为碳源会生长迅速的现象上也可以得到证明，并且在此底物上的生长得到了深入的研究(Beopoulos等人2008；Fickers等人2005)。因此，增加的油酸浓度虽然不会特异地驱动脂质生产或产率，但是却使脂肪酸库更迅速地隔离。这最终导致脂质积累速率更快，而产率不增加，因为隔离的增加只会发生在脂质合成已经收到其他操纵的上调的情况下。

[0325] 相反，将ACL与其他基因组合过表达时，脂质生产效率倾向于降低。MTYL078和MTYL079尽管过表达了ACC和/或D9，在脂质生产中却没有显示出显著的增加。具有ACC+ACL+DGA的MTYL088比对照增加了脂质生产，但相比MTYL065却没有显示出任何脂质生产上的改进。这些结果提示虽然ACL可以影响整个代谢网络中的碳流分布，但是ACL的过表达不论是独立的还是与其他脂肪合成的改进组合都不会显著促进脂质生产，而且在大多数情况下还降低了脂质的生产效率。这一点类似于观察到的这一现象——尽管ATP柠檬酸裂解酶在产油酵母中与非含有酵母中的表达有差异，但是多种生物体中该基因的活性与测量的产油性并无联系(Boulton和Ratledge1981)。

[0326] 来自脂质调查的另一项观察表明DGA与多种其他靶标一同表达通常导致生产效率和产率上类似的应答。虽然有可能在这些构建体中发生表达或活性的一些饱和的情况，但是这一趋于平稳的应答也可以由于所用的实验条件的限制，因为本调查中测量的特征是起始的总体生产效率，而不是静止期脂质积累或生产效率。进一步地，虽然菌株MTYL065清楚地表现出最强的生产效率，但产率与很多趋于平稳的菌株还是相对类似的。这表明尽管所有这些菌株都成功地将代谢流转移至脂质，产率增加，但是MTYL065却是例外的，并未达到其上游和下游途径的平衡而达到高的生产效率和产率。这些结果强调了对代谢流网络中进行平衡的扰动以达到最佳生产效率和产率的重要性，这也是对生长偶联产物进行代谢工程的一个共同的主题(Feist等人2010；Tyo等人2007)。

[0327] 对全长构建体的RT-PCR分析显示了其在MTYL089中的过表达.

[0328] 为探索该脂质调查中的平台区域，对过表达ACC+D9+ACL12+DGA的MTYL089进行进一步的研究。将两个质粒pMT079和pMT092转化入ΔLEU和ΔURA背景的解脂耶氏酵母菌株MTYL100，构建菌株。使用这两种质粒主要是处于质粒大小的考虑，因为pMT079已经包括在四个串联表达盒中，长度有23kb。基因组DNA的PCR结果确证了两个质粒都成功整合入所述菌株，并且确认每个单独的表达盒都正确整合了。对完成并验证的菌株相对对照菌株进行RT-PCR分析，确认所有五个基因都得到合适的转录过表达(图10)。DGA作为TEFin表达控制下的唯一基因有很强的过表达，这表明剪接体内含子甚至在有来自多个利用相同启动子的表达盒的潜在竞争的情况下仍然具有增强的特征。在无内含子TEF启动子控制下的ACC显示了最低的表达。也在TEF启动子控制之下的ACL的两个亚基显示了高于D9的表达，后者是受hp4d启动子控制的。由于取样刚好是在指数生长期后进行(其中hp4d能显示准-生长依赖性表达(Madzak等人2000))，所以hp4d和TEF的组成型表达似乎彼此之间相对都很接近。这些结果显示了所靶向的基因都得到充分的过表达。

[0329] MTYL089的2L发酵表明其具有强的脂质积累能力。

[0330] 在验证了菌株MTYL089中的基因表达后，在2L生物反应器发酵中测试了菌株的油生产效能。将基质的C/N比调整至100以助于促进脂质积累。C/N比决定了发酵中一旦氮耗竭，有多少量的多余的碳可用，常常需要精细的平衡以优化脂质生产，使之超过柠檬酸生产(Beopoulos等人2009)。图11显示了批式发酵过程的时间曲线。在发酵185小时后，所有90g/L的葡萄糖都已经被消耗，产生了26g/L的生物质(细胞干重)，产生的脂质含量很可观，为76.8％，生产效率为0.109g脂质/L/小时。以葡萄糖为碳源的总体脂质产率为0.227g脂质/g葡萄糖,即理论最大产率的70％。在脂质积累期(66-185小时)，达到脂质生产效率及产率的最大值，分别为0.154g脂质/L/小时和0.277g脂质/g葡萄糖，产率增加到最大理论产率的85％。

[0331] 图12中显示的发酵末期的细胞培养物显微镜成像显示了所有细胞都含有大的液泡，几乎占据了细胞的整个体积。尼罗河红染色和荧光表明这些液泡主要是由中性脂质组成的。甚至少量的菌丝细胞(通常产率不高)(Coelho等人2010)也显示了显著的脂质积累，沿着细胞的长度方向产生出多个脂质小体。

[0332] 尽管在培养物中观察到脂质的巨大的积累，但是也发现了大量不期望的特征，尤其是在与前面使用MTYL065的工作相比。首先，从75小时开始就有显著量的柠檬酸生产与脂质生产同时发生。柠檬酸是脂质生物合成途径的一个中间产物，利用ATP柠檬酸裂解酶进行酶转化，转化为草酰乙酸和脂质合成前体乙酰-CoA。尽管两种ACL酶都在MTYL089菌株中有过表达，但是还是观察到了柠檬酸的积累。有可能C/N比太高，而这一点被显示会导致柠檬酸生产而不是脂质生产(Beopoulos等人2009)；然而，我们的结果显示柠檬酸和脂质都是同时被生产的。两种产物的偶联生产与在菌株MTYL065的实验中观察到的分离的脂质生产期及其后代柠檬酸生产期不同。进一步地，C/N比与MTYL065的批式发酵相匹配，没有显示这么大量的柠檬酸生产。这表明更可能是在发酵条件下ATP生成的量不足，结合上游有大量代谢流进入此途径，导致细胞内柠檬酸库的积累，最终导致分泌。此外，在MTYL089中观察到显著较低的生产效率。由于在整个发酵过程中通风保持恒定，所以在发酵后期的阶段预期有氧受限的生长。然而，线性生长的起始在此发酵中比用MTYL065进行发酵时发生的早得多，仅仅在生物质浓度达到大约6g/L后一天就开始发生。线性生长起始较早导致发酵时间较长，因此导致较低的生产效率，尽管有着较高的脂质含量。因为通风情况也与MTYL065的发酵条件匹配，所以很可能MTYL089的代谢变化是对生长造成了更大的限制。在另一方面，MTYL089显示了相比于MTYL065的0.195g脂质/g葡萄糖更好的总体脂质产率，为0.227g/g。最终前者的发酵得到相比后者的17.6g/L更高的滴度，为20.2g/L脂质。

[0333] 表8总结了菌株MTYL065和MTYL089的2L发酵之间的关键表现特征对比。脂肪酸谱的对比(图13)表明在菌株间的脂肪酸分布只有轻微变化，对单不饱和的脂肪酸棕榈油酸和油酸有更强的偏好。ACL和D9过表达的其他效应似乎增加了代谢流进入脂质合成，但是是以生长速率为相当大的代价。此外，由于细胞代谢生成的ATP没有匹配的增加，所以柠檬酸被以副产物的形式分泌，而不是在脂质合成途径中利用。由于脂质合成和储存能与生长强有力地竞争资源，所以严密的调控通常对管理此活性是有必要的(Tehlivets等人2007)。这四种基因靶标的过表达为这一调控开启了很多，因此，我们观察的是细胞生长和脂质生产在争夺优先权上的强烈竞争。作为代谢工程中的共同主题，使具体产物的生产最大化常常要求在使代谢流进入期望的产物与生物的总体健康和生长之间进行平衡。MTYL065和MTYL089之间的对比清楚地表明了这一需要，MTYL065是一个示例，其中有更优化的代谢流经过脂质合成途径。

[0334] 结论

[0335] 尽管脂质生物合成的组分已经得到充分的理解，但对于基因扰动，尤其是组合之后如何影响此途径的能力和经过此途径的代谢流，还有很多是未知的。通过研究产油酵母解脂耶氏酵母，我们能够利用具有天然脂质生产能力的宿主生物体研究代谢工程改造能将脂质生产效率和产率改进到何种程度。我们检验了四种基因靶标——ACC、D9、ACL、DGA——并能够用携带所有四个靶标过表达的菌株在2L生物反应器中达到76.8％的脂质含量，这是很可观的。通过进一步通过组合过表达来研究这些基因靶标，我们能够将这些基因对脂质生产的正面影响排序，其中DGA和ACC产生最强的正面贡献，D9只是在与其他基因组合时产生微小的贡献，最后，ACL并未作出任何显著的正面贡献。我们还能够探索个体效应之间可以的相互作用，鉴定出ACC和DGA之间有最强的协同相互作用。微生物脂质的生产具有广泛的应用范围，其因为能够用于生产生物柴油而迅速获得关注。脂质合成中央途径的代谢工程改造将在这些未来技术和方法能够取得成功上至关重要。

[0336] 参考文献

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[0374] 表6.本研究使用的菌株和质粒

[0375]

[0376]

[0377]

[0378] 表7.列出了用于检验脂质积累的所有菌株，标明了存在(+)或不存在(-)四种靶标的过表达盒:乙酰-CoA羧化酶(ACC)、二酰基甘油酰基转移酶(DGA)、ATP:柠檬酸裂解酶(ACL12)以及Δ9-去饱和酶(D9)。

[0379]

[0380] 表8.菌株MTYL065和MTYL089之间发酵特征的比较。两个发酵过程中C/N比均为100，在2L生物反应器中进行。葡萄糖生物反应器初始时装有90g/L的葡萄糖。

[0381]

[0382] 表9.用于本研究的引物。相关限制性位点以黑体表示。

[0383]

[0384] 实施例3.

[0385] 材料和方法

[0386] 酵母菌株、生长和培养条件

[0387] 如实施例1中所讨论的，本节描述的实验中使用解脂耶氏酵母的ACC+DGA1转化子菌株(MTLY065)。YPD基质如实施例1中所描述的方法进行制备。用于生物反应器中的基质成分为酵母氮源(无氨基酸、无硫酸铵)(Amresco)、酵母提取物(Difco)、硫酸铵(Macron Chemicals)、醋酸钠(Macron Chemicals)以及醋酸(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)。在2L带档板的搅拌罐反应器中进行生物反应器反应。用于生物反应器的接种物如实施例1中所描述的方法进行制备。

[0388] 生物反应器操作：醋酸盐、醋酸和硫酸铵加料

[0389] 反应器中起始机制组合物如下:30g/L醋酸钠、2.5g/L酵母提取物、4.25g/L酵母氮源以及2.4g/L的硫酸铵。用于本节描述的实验的酵母提取物和酵母氮源浓度比实施例1中讨论的要高一些。选择碳氮比(C/N)为20以提供足够的氮，用于生物质生产。通过级联控制在所有时间点都维持反应器中为20％的恒定溶解氧水平。使用的pH设定点为7.3。

[0390] 为生成高的细胞密度(这将在随后成为脂质积累的平台)，设计并实施了一项策略，其中通过加料醋酸补充30g/L醋酸钠的碳源。使用醋酸具有几项优势，其有双重用途：为生长和分裂的细胞提供碳来源；同时提供对pH的控制。为了在生长起始阶段维持低的C/N比率，与醋酸同时加料氮源。生长的起始阶段包括在加料15g/L硫酸铵每升30％(vol/vol)醋酸。后续的供料含有纯的100％醋酸(无硫酸铵)，这样，随着氮被细胞消耗且从基质中耗尽，C/N比会增加，产生改进的脂质积累。

[0391] 在反应进行起始的工作体积为1.6L。在起初60h之内，加入了1L的酸和硫酸铵溶液。在随后的40h中加入了大约200ml的纯醋酸。在除了每24h取样用于测量目的之外的任何时间点都不移除培养物体积。为了抵消进入反应器的额外的体积，允许液体挥发。高的通风速率(2.5vvm)产生足够的挥发，有助于维持反应器的体积。甚至是在有挥发的情况下，培养液体积也在运行过程中有轻微上升，到大约1.8L。

[0392] 每24小时测量一次培养液的光学密度(OD)。将样品储存于-20℃用于脂质分析。HPLC分析得到反应器中醋酸水平。用YSI7100铵电极(YSI Life Sciences)测量铵含量。
用实施例1中讨论的方法确定生物质。

[0393] 脂质分析

[0394] 脂质分析包括直接酯交换操作流程，该流程根据美国专利7,932,077以及Griffiths等人LIPIDS(2010)45:1053–1060进行调整，二者的全部内容都并入本文作为参考。所述操作流程采用了0.5N甲醇钠和18M的硫酸(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)。甲醇钠是使用氢氧化钠(Macron Chemicals)和甲醇(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)自制生成的。首先将500μl的0.5N甲醇钠加入1mg细胞样品沉淀，接着漩涡振荡1小时。此后，加入40μl硫酸和500μl正己烷，接着进行另一个30min的漩涡振荡步骤以将转酯化的甲酯溶解进入正己烷。在8000rpm下将反应混合物离心1min，并将800μl的上层正己烷相转移至GC试样管并在GC-FID中进行分析。GC柱子、操作方法以及最后的分析都按照实施例1中讨论的方法进行，除了其中使用了十七烷酸甘油三酯作为对照而不是十三烷酸。

[0395] 结果和讨论

[0396] 生物反应器反应结果总结于表10。

[0397] 表10.用醋酸盐进行生物反应器反应的结果

[0398]脂质滴度 55g/L
脂质含量 67％
总体脂质生产效率 0.56g/L/h

[0399]最大脂质生产效率 1g/L/h
总体脂质产率(g脂质/g醋酸盐) 0.16g/g
最大脂质产率 0.24g/g

[0400] 图14和15显示了一个代表性的醋酸生物反应器反应中氮、非脂质和脂质滴度、脂质含量和C/N比率的趋势。在将氮加料入反应器时，非脂质生物质在生长的初始阶段不断升高。48h后，由于脂质有积累，所以几乎所有生物质都有增长。在此阶段，细胞合成脂质的产率为0.24g/g，合成速率为1g/L/h，生产的最终脂质滴度为55g/L，这比实施例1中描述的实验中达到的滴度高至少10倍。然而，最终脂质含量和总体脂质产率非常类似于实施例1中的脂质含量和总体脂质产率。这些数字大多取决于所采用的微生物菌株。几乎70％的脂质是油酸，其与实施例1中描述的发现相一致。

[0401] 本文讨论的反应目的是通过采用上文提到的操作策略和优化的过程条件使用ACC+DGA1突变体使脂质产率最大化。此反应的结果与实施例1中显示的结果的对比显示于下文表11。在这些用醋酸进行的反应中观察到滴度提高了10倍，总体生产效率提高了14倍。

[0402] 表11.以醋酸进行的反应与实施例1中显示的反应之间的对比

[0403]葡萄糖(实施例1) 醋酸(实施例1)醋酸(本节)
脂质滴度 17.6g/L 5.5g/L 55g/L
总体脂质生产效率 0.14g/L/h 0.04g/L/h 0.56g/L/h
最大脂质生产效率 0.26g/L/h 0.10g/L/h 1g/L/h
总体脂质产率 0.19g/g 0.15g/g 0.16g/g
最大脂质产率 0.25g/g 0.27g/g 0.24g/g

[0404] 离心中具有高脂质含量(超过80％)的细胞浮于上部，而不是沉积下来。在显微镜下，这些细胞似乎充满了油。图16显示了用尼罗河红染色后这种细胞在油浸显微镜(100x)下状态。亮点为脂质液泡。

[0405] 在本文说明书中提到的所有出版物、专利和序列数据库条目都以其全文并入本文作为参考，如特定地或单独地指出单独的出版物或专利以通过参考并入本文。在有冲突的情况下，以本申请(包括本文的任何定义)为主。

[0406] 等同替换及范围

[0407] 本领域技术人员使用不超过常规实验会认识到或能够确定很多本文描述的发明的特定实施方式的等同替换。本发明的范围不意欲受到上文描述的限制，但在附随的权利要求提出了所述范围。

[0408] 除非在上下文中明显指出是相反或其他的，否则在权利要求条款中如“一”、“一个”和“这个”可以指一个或超过一个。除非从上下文中明显表明是相反或其他的，否则如果组成员中超过一个或多个都在给定产品或过程中存在、被其采用或与其相关，则在组的一个或多个成员之间有“或”这个字的权利要求或描述被认为是适当的。本发明包括实施方式，其中确切地组的一个成员在给定产品或过程中存在、被其采用或与其相关。本发明还包括实施方式，其中超过一个或所有组成员都在给定产品或过程中存在、被其采用或相与其关。

[0409] 进一步地，要理解的是，本发明包括所有变动、组合和排列，其中来自一个或多个权利要求或来自描述相关部分的一个或多个限制、元素、条款、描述性术语等等被引入另一权利要求中。例如，任何依赖于另一权利要求的权利要求都能得到修饰以包括在依赖于相同基础权利要求的任何其他权利要求中存在的一个或多个限制。进一步地，当权利要求提到某一组合物时，要理解的是包括使用所述组合物用于本文公开的任意目的方法，以及根据本文公开的任何制造方法用于制造所述组合物的方法，或包括本领域已知的其他方法，除非有其他说明，或除非对本领域普通技术人员很明显地会有矛盾或不一致的产生。

[0410] 当元素以表的形式如以马库什组格式呈递时，要理解的是这些元素的每个亚组也是公开的，而且任何元素都可以从该组移除。还要注意的是术语“包含”意欲为开放状态，允许包括其他的元素或步骤。应当理解的是，通常如果发明或发明的方面被称为包含特定元素、特征、步骤等等，则该发明或发明的方面的特定实施方式包括或基本上包括这些元素、特征、步骤等等。为了简明起见，这些实施方式在本文的这些文字中没有特定提出。因此，对于本发明每个包含一个或多个元素、特征、步骤等等的实施方式，本发明还提供了包含或基本上包含这些元素、特征、步骤等等的实施方式。

[0411] 当给出范围时，包括区间端点。进一步地，要理解的是除非有其他说明或从上下文和/或本领域普通技术人员的理解中明显不是如此，否则以范围表示的数值可包含本发明不同实施方式中陈述的范围内的任何特定数值，直到范围下限的十分之一单位，除非上下文清楚地有其他说明。还要理解的是除非有其他说明或从上下文和/或本领域普通技术人员的理解中明显不是如此，否则以范围表示的数值可包含给定范围内的任意子集，其中子集的区间端点被表示为与范围下限的十分之一单位有相同的精确度。

[0412] 此外，要理解的是本发明的任何特定实施方式可以从一项或多项权利要求中明确排除。当给出范围时，范围内的任何数值都可从一项或多项权利要求中明确排除。本发明的任何实施方式、元素、特征、应用或组合物的方法和/或本发明的方法都可从任何一项或多项权利要求中排除。为了简洁起见，所有其中一个或多个元素、特征、目的或方面得到排除的实施方式在本文没有明确提出。