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复合酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途
申请号 CN201310495325.7 申请日 2008-04-03 公开(公告)号 CN104152423A 公开(公告)日 2014-11-19
申请人 纳幕尔杜邦公司; 发明人 H.G.达穆德; A.J.金尼; K.G.里普; Q.Q.朱;
摘要 本 发明 涉及复合酶及其在制备多不饱和 脂肪酸 中的用途。本发明公开了编码复合酶(即，具有至少两种独立的和可分的酶活性的单一多肽)的分离核酸 片段 和包含此类片段的重组构建体以及使用这些复合酶在 植物 和含油 酵母 中制备长链多不 饱和脂肪酸 (PUFA)的方法。
权利要求

1.包含单一多肽的复合酶，所述多肽具有至少两种独立的和可分的酶活性，其中所述酶活性是Δ4去饱和酶和C20/22延伸酶，并且其中所述Δ4去饱和酶和C20/22延伸酶通过连接相连接，并且所述连接选自SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：235、SEQ ID NO：
438、SEQ ID NO：472、SEQ ID NO：445和SEQ ID NO：504。
2.编码权利要求1的复合酶的分离多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：
(a)编码具有与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO∶96或SEQ ID NO：97至少80％相同的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；
(b)如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93或SEQ ID NO：410所示出的核苷酸序列；或
(c)在严格条件下与如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93或SEQ ID NO：410所示出的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
3.权利要求2的分离多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：
22、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：97的核苷酸序列。
4.权利要求3的分离多核苷酸，其中所述多核苷酸包含如SEQ ID NO∶11、SEQ ID NO：
205、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93或SEQ ID NO：410所示出的核苷酸序列。
5.包含权利要求2-4中任一项的分离多核苷酸的重组构建体，所述多核苷酸被可操作地连接到至少一种调控序列上。
6.包含权利要求5的重组构建体的宿主细胞。
7.权利要求6的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞。
8.权利要求7的宿主细胞，其中所述植物细胞是油料种子植物细胞。
9.权利要求6的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母细胞。
10.权利要求9的宿主细胞，其中所述宿主细胞是含油酵母细胞。
11.权利要求10的宿主细胞，其中所述宿主细胞是耶氏酵母细胞。
12.用于转化细胞的方法，所述方法包括使用权利要求5的重组构建体来转化细胞以及选择那些用所述重组构建体转化过的细胞。
13.用于生产转化过的植物的方法，所述方法包括使用权利要求5的重组构建体来转化植物细胞以及从所述转化过的植物细胞再生植物。
14.包含权利要求5的重组构建体的植物。
15.权利要求14的植物，其中所述植物是油料种子植物。
16.权利要求15的植物，其中所述植物是大豆植物或向日葵植物。
17.获自权利要求14的植物的种子，其中所述种子包含所述重组构建体。
18.用于将二十碳五烯酸转化成二十二碳六烯酸的方法，所述方法包括：
a)提供包含权利要求5的重组构建体的重组微生物宿主细胞，和二十碳五烯酸源；并且
b)使(a)的宿主细胞在使得能产生二十二碳六烯酸的条件下生长。
说明书全文

复合酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途

[0001] 本申请是申请日为2008年4月3日的中国专利申请200880018608.X“复合酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途”的分案申请。
[0002] 相关申请
[0003] 本专利申请要求于2007年4月3日提交的第60/909790号美国临时申请和2008年2月12日提交的第61/027898号美国临时申请的优先权，该临时申请的公开内容全文以引用方式并入本文。

技术领域

[0004] 本发明属于生物技术领域。更具体地讲，本发明涉及编码复合酶的多核苷酸序列及其在合成长链多不饱和脂肪酸(PUFA)中的用途。

背景技术

[0005] PUFA的重要性无可争议。例如，某些PUFA是健康细胞的重要生物成分并被公认为是：“必需”脂肪酸，其不能由哺乳动物从头合成，而是必须从饮食中获得或者通过进一步延长和去饱和亚油酸(LA；18：2ω-6)或α-亚麻酸(ALA；18：3ω-3)来获得；在质膜中它们可以例如磷脂或三酰基甘油之类的形式存在；正常发育(尤其是在发育中的婴儿脑中)和组织形成及修复的必需物质；以及哺乳动物中几种重要的具有生物活性的类二十烷酸(如前列环素、类花生酸、白三烯和前列腺素)的前体。而且，摄入大量长链ω-3 PUFA产生心血管保护效果(Dyerberg等人，Amer.J.Clin.Nutr.28：958-966(1975)；Dyerberg等人，Lancet.2(8081)：117-119(1978)；Shimokawa，H.，World Rev.Nutr.Diet
88：100-108(2001)；von Schacky等人，World Rev.Nutr.Diet 88：90-99(2001))。大量的其他研究证明，针对多种症状和疾病(如哮喘、牛皮癣、湿疹、糖尿病、癌)施用ω-3和/或ω-6 PUFA赋予了广泛的健康益处。
[0006] 目前正在研究包括植物、藻类、真菌和酵母在内的多种不同宿主作 为经由多种不同途径商业化生产PUFA的手段。虽然宿主生物的天然PUFA生产能力有时对给定方法来说是必要的，但基因工程也已证明能够完全改变一些宿主的天然能力(甚至那些不能天然产生LA和ALA脂肪酸的宿主)以产生高水平的不同长链ω-3/ω-6 PUFA。不管该效应是天然能力的结果还是重组技术的结果，花生四烯酸(ARA；20：4ω-6)、二十碳五烯酸(EPA；20：5ω-3)和二十二碳六烯酸(DHA；22：6ω-3)均需要Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径(该途径存在于一些生物中，如类眼虫物种，并且其特征在于产生二十碳二烯酸(EDA；20：2ω-6)和/或二十碳三烯酸(ETrA；20：3ω-3))或Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径(该途径主要存在于藻类、苔藓、真菌、线虫动物和人类中，并且其特征在于产生γ-亚麻酸(GLA；18：3ω-6)和/或硬脂艾杜糖酸(STA；18：4ω-3))的表达(图1)。还已知，Δ6延伸酶是C18/20延伸酶。
[0007] 迄今已鉴定的Δ8去饱和酶能够将EDA转化成二高γ-亚麻酸(DGLA(也称为HGLA)；20：3，n-6)并将ETrA转化成二十碳四烯酸(ETA；20：4，n-3)。ARA和EPA随后分别通过Δ5去饱和酶进行的反应由DGLA和ETA合成。然而DHA合成需要随后表达附加的C20/22延伸酶和Δ4去饱和酶。迄今已鉴定的大多数C20/22延伸酶主要能将EPA转化成DPA，其次能将花生四烯酸(ARA；20：4ω-6)转化成二十二碳四烯酸(DTA；22：4ω-6)，然而迄今已鉴定的大多数Δ4去饱和酶主要能将DPA转化成DHA，其次能将成二十二碳四烯酸(DTA；22：4ω-6)转化成ω-6二十二碳五烯酸(DPAn-6；22：5ω-6)。
[0008] 基于C20/22延伸酶和Δ4去饱和酶在DHA合成中的作用，已经投入相当大的努力鉴定和研究这些来自不同来源的酶。同样，已将多个C20/22延伸酶公开于公开文献和专利文献(例如巴夫藻CCMP459(GenBank登录号AAV33630)、绿藻(GenBank登录号AAV67798)和假微型海链藻(GenBank登录号AAV67800))中。同样，已经公开了以下Δ4去饱和酶：小眼虫(SEQ ID NO：13；GenBank登录号AAQ19605；Meyer等人，Biochemistry，42(32)：
9779-9788(2003))；假微型海链藻(SEQ ID NO：29；GenBank登录号AAX14506；Tonon等人，FEBS J.，272(13)：3401-3412(2005))；金黄色破囊壶菌(SEQ ID NO：27；GenBank登录号AAN75707)；海洋破囊壶菌(GenBank登录号CAD42496；美国专利公开7,087,432)；
聚合裂殖壶菌(SEQ ID NO：28；PCT公开WO 2002/090493)；鲁兹巴夫藻(GenBank登录号AAQ98793)；和绿光等鞭金藻(SEQ ID NO：30；GenBank登录号AAV33631；Pereira等人，Biochem.J.，384(2)：357-366(2004)；PCT公开WO 2002/090493)]。
[0009] 申请人的受让人有多个关于含油酵母(即，解脂耶氏酵母)中PUFA生产的专利申请，包括例如：美国专利公开7,238,482和7,125,672；美国专利申请11/265,761(提交于2005年11月2日)；美国专利申请11/264,784(提交于2005年11月1日)；美国专利申请11/264,737(提交于2005年11月1日)。
[0010] 与此相关，PCT公开WO 2004/071467(公布于2004年8月26日)关于植物中的PUFA生产，而PCT公开WO 2004/071178(公布于2004年8月26日)关于膜联蛋白启动子以及它们在植物转基因表达中的用途。它们都是申请人的受让人的共同未决的专利申请。

发明内容

[0011] 本发明涉及包括具有至少两种独立的和可分的酶活性的单一多肽的复合酶(multizyme)。
[0012] 在第二实施方案中复合酶的酶活性可选自脂肪酸延伸酶、脂肪酸去饱和酶、酰基转移酶、酰基CoA合酶和硫酯酶。更具体地讲，酶活性可包括连接到至少一种脂肪酸去饱和酶的至少一种脂肪酸延伸酶。
[0013] 在第三实施方案中复合酶可包括连接到第二酶活性的第一酶活性，并且所述连接选自多肽键SEQ ID NO：198(EgDHAsyn1接头)、SEQ ID NO：200(EgDHAsyn2接头)、SEQ ID NO：235(EaDHAsyn1接头)、SEQ ID NO：438、SEQ ID NO：445、SEQ ID NO：472、和SEQ ID NO：504。
[0014] 在第四实施方案中，本发明涉及编码DHA合酶的分离多核苷酸，所述多核苷酸包括：
[0015] (a)编码具有DHA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法在与如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、或SEQ ID NO：97所示出的氨基酸序列进行比较时，所述多肽具有至少80％的氨基酸同一性；
[0016] (b)编码具有DHA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTN比对方法在与如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、或SEQ ID NO：410 所示出的核苷酸序列进行比较时，所述核苷酸序列具有至少80％的序列同一性；
[0017] (c)编码具有DHA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在严格条件下与如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、或SEQ ID NO：410所示出的核苷酸序列杂交；或
[0018] (d)(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100％互补。
[0019] 在第五实施方案中，本发明涉及编码具有DHA合酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包括SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、或SEQ ID NO：410。
[0020] 在第六实施方案中，本发明涉及具有DHA合酶活性的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、或SEQ ID NO：97。
[0021] 在第七实施方案中，本发明涉及编码C20延伸酶的分离多核苷酸，所述多核苷酸包括：
[0022] (a)编码具有C20延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法在与如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：202(EgDHAsyn1 C20延伸酶结构域)、SEQ ID NO：204(EgDHAsyn2 C20延伸酶结构域)、SEQ ID NO：231(EaDHAsyn1 C20延伸酶结构域)、SEQ ID NO：232(EaDHAsyn2 C20延伸酶结构域)或SEQ ID NO：233(EaDHAsyn3 C20延伸酶结构域)所示出的氨基酸序列进行比较时，所述多肽具有至少80％的氨基酸同一性；
[0023] (b)编码具有C20延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTN比对方法在与如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：201(EgDHAsyn1 C20延伸酶结构域)、SEQ ID NO：206(EgDHAsyn1*C20延伸酶结构域)、SEQ ID NO：203(EgDHAsyn2 C20延伸酶结构域)、SEQ ID NO：227(EaDHAsyn1 C20延伸酶结构域)、SEQ ID NO：228(EaDHAsyn2 C20延伸酶结构域)、SEQ ID NO：229(EaDHAsyn3 C20延伸酶结构域)或SEQ ID NO：230(EaDHAsyn4 C20 延伸酶结构域)所示出的核苷酸序列进行比较时，所述核苷酸序列具有至少80％的序列同一性；
[0024] (c)编码具有C20延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在严格条件下与如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：201(EgDHAsyn1 C20延伸酶结构域)、SEQ ID NO：206(EgDHAsyn1*C20延伸酶结构域)、SEQ ID NO：203(EgDHAsyn2 C20延伸酶结构域)、SEQ ID NO：227(EaDHAsyn1 C20延伸酶结构域)、SEQ ID NO：228(EaDHAsyn2 C20延伸酶结构域)、SEQ ID NO：229(EaDHAsyn3 C20延伸酶结构域)或SEQ ID NO：230(EaDHAsyn4 C20延伸酶结构域)所示出的核苷酸序列杂交；或
[0025] (d)(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100％互补。
[0026] 在第八实施方案中，本发明涉及编码Δ4去饱和酶的分离多核苷酸，所述多核苷酸包括：
[0027] (a)编码具有Δ4去饱和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法在与如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：221、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：240、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：382、SEQ ID NO：384、SEQ ID NO：386、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：404、SEQ ID NO：406、或SEQ ID NO：408所示出的氨基酸序列进行比较时，所述多肽具有至少80％的氨基酸同一性；
[0028] (b)编码具有Δ4去饱和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTN比对方法在与如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：220、SEQ ID NO：236、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：244、SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：381、SEQ ID NO：383、SEQ ID NO：385、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：403、SEQ ID NO：
405、或SEQ ID NO：407所示出的核苷酸序列进行比较时，所述核苷酸序列具有至少80％的序列同一 性；
[0029] (c)编码具有Δ4去饱和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在严格条件下与如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：220、SEQ ID NO：236、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：244、SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：
381、SEQ ID NO：383、SEQ ID NO：385、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：403、SEQ ID NO：405、或SEQ ID NO：407所示出的核苷酸序列杂交；或
[0030] (d)(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100％互补。
[0031] 在第九实施方案中，本发明涉及编码DHA合酶的分离多核苷酸，所述多核苷酸包括如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、或SEQ ID NO：410中任一种所示出的序列。
[0032] 在第十实施方案中，本发明涉及编码C20延伸酶的分离多核苷酸，所述分离多核苷酸编码C20延伸酶，所述多核苷酸包括如SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：201(EgDHAsyn1 C20延伸酶结构域、SEQ ID NO：206(EgDHAsyn1*C20延伸酶结构域)、SEQ ID NO：203(EgDHAsyn2 C20延伸酶结构域)、SEQ ID NO：227(EaDHAsyn1 C20延伸酶结构域)、SEQ ID NO：228(EaDHAsyn2 C20延伸酶结构域)、SEQ ID NO：229(EaDHAsyn3 C20延伸酶结构域)或SEQ ID NO：230(EaDHAsyn4 C20延伸酶结构域)中任一种所示出的序列。
[0033] 在第十一实施方案中，本发明涉及编码Δ4去饱和酶的分离多核苷酸，所述多核苷酸包括如SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：220、SEQ ID NO：236、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：244、SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：381、SEQ ID NO：383、SEQ ID NO：385、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：403、SEQ ID NO：405、或SEQ ID NO：407所示出的序列。
[0034] 在第十二实施方案中，本发明涉及包括本发明任何可操纵地连接到至少一个调控序列上的分离多核苷酸的重组构建体。
[0035] 在第十三实施方案中，本发明涉及在其基因组中包括本发明重组构 建体的宿主细胞。更具体地讲，宿主细胞是包括本发明复合酶的重组微生物宿主细胞，其中第一酶活性是Δ9延伸酶，第二酶活性是Δ8去饱和酶。在另一方面，第一酶活性是C20延伸酶，第二酶活性是Δ4去饱和酶。
[0036] 在第十四实施方案中，本发明涉及包括本发明重组构建体的转化过的耶氏酵母菌种。
[0037] 在第十五实施方案中，本发明涉及用于转化细胞的方法，所述方法包括用本发明重组构建体转化细胞以及选择那些用所述重组构建体转化过的细胞。
[0038] 在第十六实施方案中，本发明涉及用于生产转化植物的方法，所述方法包括用本发明的任何多核苷酸转化植物细胞以及从转化过的植物细胞再生植物。
[0039] 在第十七实施方案中，本发明涉及用于生产酵母的方法，包括用本发明的任何多核苷酸转化酵母细胞以及从转化过的酵母细胞生长酵母。
[0040] 在第十八实施方案中，本发明涉及在其基因组中包括本发明重组构建体的植物。还关注获自此类植物的种子，获自此类种子的油，掺入此类油的食物或饲料，以及掺入本发明的油的饮料。
[0041] 在第十九实施方案中，本发明涉及编码如SEQ ID NO：183所示出的C20延伸酶的分离核酸分子，其中至少147个密码子是经密码子优化的以用于在耶氏酵母菌种中表达。
[0042] 在第二十实施方案中，本发明涉及编码如SEQ ID NO：188所示出的C20延伸酶的分离核酸分子，其中至少134个密码子是经密码子优化的以用于在耶氏酵母菌种中表达。
[0043] 在第二十一实施方案中，本发明涉及编码如SEQ ID NO：192所示出的Δ4去饱和酶的分离核酸分子，其中至少285个密码子是经密码子优化的以用于在耶氏酵母菌种中表达。
[0044] 在第二十二实施方案中，本发明涉及用于制备复合酶的方法，所述方法包括：
[0045] (a)使第一多肽与至少第二多肽连接，其中每个多肽具有独立的和可分的酶活性；并且
[0046] (b)评估步骤(a)产物的独立的和可分的酶活性。
[0047] 在第二十三实施方案中，本发明涉及用于改变油料种子植物的脂肪 酸分布型的方法，所述方法包括：
[0048] a)用本发明重组构建体来转化油料种子植物细胞；
[0049] b)从步骤(a)的转化油料种子植物细胞来再生植物，其中所述植物具有改变了的脂肪酸分布型。
[0050] 在第二十四实施方案中，本发明涉及编码DGLA合酶的分离多核苷酸，所述多核苷酸包括：
[0051] (a)编码具有DGLA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽在SEQ ID NO：441、SEQ ID NO：454、SEQ ID NO：461、SEQ ID NO：464、SEQ ID NO：471、SEQ ID NO：515、SEQ ID NO：516、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：518、或SEQ ID NO：519中示出；
[0052] (b)编码具有DGLA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在SEQ ID NO：440、SEQ ID NO：446、SEQ ID NO：453、SEQ ID NO：460、SEQ ID NO：463、SEQ ID NO：470、SEQ ID NO：492、SEQ ID NO：493、SEQ ID NO：494、SEQ ID NO：495、或SEQ ID NO：496中示出；
[0053] (c)编码具有DGLA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在严格条件下与如SEQ ID NO：440、SEQ ID NO：446、SEQ ID NO：453、SEQ ID NO：460、SEQ ID NO：463、SEQ ID NO：470、SEQ ID NO：492、SEQ ID NO：493、SEQ ID NO：494、SEQ ID NO：495、或SEQ ID NO：496所示出的核苷酸序列杂交；或
[0054] (d)(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100％互补。
[0055] 在第二十五实施方案中，本发明涉及用于将亚油酸转化成二高γ-亚麻酸的方法，所述方法包括
[0056] a)提供一种重组微生物宿主细胞，所述宿主细胞包括：
[0057] i)DGLA合酶，它包括：
[0058] 1)至少一个编码Δ9延伸酶的多肽；
[0059] 2)至少一个编码Δ8去饱和酶的多肽；并且
[0060] 3)多肽接头；
[0061] 其中所述接头插入Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶之间；以及
[0062] ii)亚油酸源；并且
[0063] b)使(a)的宿主细胞在使得能产生二高γ-亚麻酸的条件下生长。
[0064] 在第二十六实施方案中，本发明涉及用于将α-亚麻酸转化成二十碳 三烯酸的方法，所述方法包括：
[0065] a)提供一种重组微生物宿主细胞，所述宿主细胞包括：
[0066] i)DGLA合酶，它包括：
[0067] 1)至少一个编码Δ9延伸酶的多肽；
[0068] 2)至少一个编码Δ8去饱和酶的多肽；并且
[0069] 3)多肽接头；
[0070] 其中所述接头插入Δ9延伸酶与Δ8去饱和酶之间；以及
[0071] ii)α-亚麻酸源；以及
[0072] b)使(a)的宿主细胞在使得能产生二十碳三烯酸的条件下生长。
[0073] 在第二十七实施方案中，本发明涉及用于将二十碳五烯酸转化成二十二碳六烯酸的方法，所述方法包括：
[0074] a)提供一种重组微生物宿主细胞，所述宿主细胞包括：
[0075] i)DHA合酶，其包括：
[0076] 1)至少一个编码C20延伸酶的多肽；
[0077] 2)至少一个编码Δ4去饱和酶的多肽；并且
[0078] 3)多肽接头；
[0079] 其中所述接头插入C20延伸酶与Δ4去饱和酶之间；并且
[0080] ii)二十碳五烯酸源；并且
[0081] b)使(a)的宿主细胞在使得能产生二十二碳六烯酸的条件下生长。
[0082] 在第二十八实施方案中，本发明涉及用于将花生四烯酸转化成二十二碳五烯酸的方法，所述方法包括：
[0083] a)提供一种重组微生物宿主细胞，所述宿主细胞包括：
[0084] i)DHA合酶，它包括：
[0085] 1)至少一个编码C20延伸酶的多肽；
[0086] 2)至少一个编码Δ4去饱和酶的多肽；以及
[0087] 3)多肽接头；
[0088] 其中所述接头插入C20延伸酶与Δ4去饱和酶之间；并且
[0089] ii)花生四烯酸源；以及
[0090] b)使(a)的宿主细胞在使得能产生二十二碳五烯酸的条件下生长。
[0091] 在第二十九实施方案中，本发明涉及用于鉴定具有改善的Δ4去饱和酶活性的多肽的方法，所述方法包括：
[0092] a)提供一种野生型Δ4去饱和酶多肽，它分离自Euglena anabena， 具有基线Δ4去饱和酶活性；
[0093] b)使(a)的野生型多肽截短约1至约200个氨基酸以形成截短的突变型多肽，它具有比基线Δ4去饱和酶活性更高的Δ4去饱和酶活性。
[0094] 在第三十实施方案中，本发明涉及微生物宿主细胞，所述宿主细胞产生多不饱和脂肪酸并表达编码在以下连续途径中的酶的多肽：
[0095] 1)Δ9去饱和酶，
[0096] 2)Δ12去饱和酶，
[0097] 3)Δ9延伸酶，
[0098] 4)Δ8去饱和酶，
[0099] 5)Δ5去饱和酶，
[0100] 6)Δ17去饱和酶，
[0101] 7)C20/22延伸酶，和
[0102] 8)Δ4去饱和酶；
[0103] 其中所述多肽包括至少一个复合酶、包括融合在至少一对相邻酶之间的融合区域。
[0104] 生物保藏
[0105] 下列生物材料保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209)，并具有下列名称、保藏号和保藏日期(表1)。
[0106] 表1
[0107] ATCC保藏
[0108]描述 保藏号 保藏日期
质粒pKR57(plasmid：PKR57) ATCC PTA-6017 2004年5月28日
质粒pKR63(plasmid：PKR63) ATCC PTA-6018 2004年5月28日
质粒pKR72(plasmid：PKR72) ATCC PTA-6019 2004年5月28日
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y4128 ATCC PTA-8614 2007年8月23日
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y4127 ATCC PTA-8802 2007年11月29日
附图说明
[0109] 根据以下的详细描述和附图以及序列清单，可以更全面地理解本发 明，以下的详细描述和附图以及序列清单形成本申请的一部分。
[0110] 图1是代表性的ω-3和ω-6脂肪酸途径，它们通过不同的中间体将肉豆蔻酸转化成DHA。
[0111] 图2显示在EgDHAsyn2(SEQ ID NO：21)编码序列部分、小眼虫Δ4去饱和酶(SEQ ID NO：23)(NCBI登录号AY278558(GI 33466345)，位点AY278558，Meyer等人，Biochemistry 42(32)：9779-9788(2003))cDNA序列和小眼虫Δ4去饱和酶(SEQ ID NO：24)(Meyer等人，同上)编码序列之间的Clustal W比对。
[0112] EgDHAsyn2_CDS为SEQ ID NO：21的nt 620-921，EgD4_cDNA为SEQ ID NO：23的nt 620-921，并且EgD4_CDS为SEQ ID NO：24的nt 1-164。
[0113] 图3A和3B显示在EgDHAsyn1(SEQ ID NO：12)、EgDHAsyn2(SEQ ID NO：22)和EgC20elo1(SEQ ID NO：6)氨基酸序列之间的Clustal W比对。
[0114] Eg C20elo 1(SEQ ID NO：6)，EgDHAsyn1(SEQ ID NO：12)和Eg DHAsyn2(SEQ ID NO：22)。
[0115] 图4A和4B显示sEgDHAsyn1(SEQ ID NO：12)N末端和EgDHAsyn2(SEQ ID NO：22)N末端与EgC20elo1(SEQ ID NO：6)、巴夫藻CCMP459C20-PUFA Elo(SEQ ID NO：2)、绿藻PUFA延伸酶2(SEQ ID NO：25)(NCBI登录号AAV67798(GI 55852396)，位点AAV67798，CDSAY591336；Meyer等人，J.Lipid Res.45(10)：1899-1909(2004))和假微型海链藻PUFA延伸酶2(SEQ ID NO：26)(NCBI登录号AAV67800(GI 55852441)，位点AAV67800，CDS AY591338；Meyer等人，J.Lipid Res.45(10)：1899-1909(2004))的Clustal W比对。
[0116] Eg DHAsyn1(SEQ ID NO：12) 的 N 末 端 和 Eg HDAsyn2(SEQ ID NO：22) 与EgC20elo1(SEQ ID NO：6)，巴夫藻CCMP459 C20-PUFA Elo(SEQ ID NO：2)，绿藻PUFA延长酶2(SEQ ID NO：25)
[0117] 和假微型海链藻PUFA延长酶2(SEQ ID NO：26)。
[0118] 巴夫藻、绿藻和假微型海链藻蛋白质分别标记为PavC20elo、OtPUFAelo2和TpPUFAelo2。
[0119] 图5A、5B、5C和5D显示EgDHAsyn1(EgDHAsyn1_CT；SEQ ID NO：12的氨基酸253至793；不显示EgDHAsyn1的N末端并用“...”表示)C-末端和EgDHAsyn2(EgDHAsyn2_CT；SEQ ID NO：22的氨基酸253至793，不显示EgDHAsyn2的N末端并用“...”表示)的C-末端与小眼虫Δ4脂肪酸去饱和酶(SEQ ID NO：13)、金黄色破囊壶菌Δ4去饱和酶(SEQ ID NO：27)(NCBI登录号AAN75707(GI 25956288)，位点AAN75707，CDS AF391543)、聚合裂殖壶菌Δ4去饱和酶(SEQ ID NO：28)(PCT公开WO 2002/090493)、假微型海链藻Δ4去饱和酶(SEQ ID NO：29)(NCBI登录号AAX14506(GI 60173017)，位点AAX14506，CDS AY817156；
Tonon等人，FEBS J.272(13)：3401-3412(2005))和绿光等鞭金藻Δ4去饱和酶(SEQ ID NO：30)(NCBI登录号AAV33631(GI 54307110)，位点AAV33631，CDS AY630574；Pereira等人，Biochem.J.，384(2)：357-366(2004)和PCT公开WO 2002/090493)的Clustal W比对。
[0120] 图6显示EgDHAsyn1(EgDHAsyn1_NCT；SEQ ID NO：12的氨基酸253至365)和EgDHAsyn2(EgDHAsyn2_NCT；SEQ ID NO：22的氨基酸253至365)跨C20延伸酶区域和Δ4去饱和酶结构域(基于同源性)的内部片段与C20延伸酶(EgC20elo1_CT，SEQ ID NO：6的氨基酸246至298；PavC20elo_CT，SEQ ID NO：2的氨基酸240至277；OtPUFAelo2_CT，SEQ ID NO：25的氨基酸256至300；TpPUFAelo2_CT，SEQ ID NO：26的氨基酸279至358)C-末端和Δ4去饱和酶(EgD4_NT，SEQ ID NO：13的氨基酸1至116；TaD4_NT，SEQ ID NO：27的氨基酸1至47；SaD4_NT，SEQ ID NO：28的氨基酸1至47；TpD4_NT，SEQ ID NO：29的氨基酸1至82；IgD4_NT，SEQ ID NO：30的氨基酸1至43)N末端的比对。
[0121] 显示了Eg HDAsyn1_NCT(aa 253至365，SEQ ID NO：12)、Eg DHAsyn2_NCT(aa 253至365，SEQ ID NO：22)、Eg C20elo1_CT(aa 246至298，SEQ ID NO：6)、Pab C20elo_CT(aa240至277，SEQ ID NO：2)、OtPUFAelo2_CT(aa 256至300，SEQ ID NO：25)、TpPUFAelo2_CT[0122] (aa 279至358，SEQ ID NO：26)、EgD4_NT(aa 1至116，SEQ ID NO：13)、TaD4_NT(aa 1至47，SEQ ID NO：27)、SaD4_NT
[0123] (aa 1至47，SEQ ID NO：28)、TpD4_NT(aa 1至82，SEQ ID NO：29)、IgD4_NT、(aa1至43，SEQ ID NO：30)。
[0124] 图7提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pY115(还参见SEQ ID NO：33)；(B)解脂耶氏酵母 目的载体pBY1(还参见SEQ ID NO：34)；(C)解脂耶氏酵母目的载体pY159(还参见SEQ ID NO：38)；和(D)pBY-EgC20elo1(还参见SEQ ID NO：39)。
[0125] 图8提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pY132(还参见SEQ ID NO：40)；(B)pY161(还参见SEQ ID NO：4 1)；(C)pY164(还参见SEQ ID NO：42)；和(D)pY141(还参见SEQ ID NO：49)。
[0126] 图9提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pY143(还参见SEQ ID NO：52)；(B)pY149(还参见SEQ ID NO：55)；(C)pY150(还参见SEQ ID NO：62)；和(D)pY156(还参见SEQ ID NO：64)。
[0127] 图10提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pY152(还参见SEQ ID NO：67)；(B)pY157(还参见SEQ ID NO：69)；(C)pY153(还参 见SEQ ID NO：72)；和(D)pY151(还参见SEQ ID NO：76)。
[0128] 图11是pY160(还参见SEQ ID NO：77)的图谱。
[0129] 图12显示如实例中所述的Euglena anabena细胞提取物的脂质特征色谱。
[0130] 图13A、13B和13C显示EaDHAsyn1(SEQ ID NO：95)、EaDHAsyn2(SEQ ID NO：96)、EaDHAsyn3(SEQ ID NO：97)和EaDHAsyn4(SEQ ID NO：98)的氨基酸序列的Clustal W比对。
[0131] EaDHAsyn1是SEQ ID NO：95；
[0132] EaDHAsyn2是SEQ ID NO：96；
[0133] EaDHAsyn3是SEQ ID NO：97；
[0134] EaDHAsyn4是SEQ ID NO：98。
[0135] 图14提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pY165(还参见SEQ ID NO：99)；(B)pY166(还参见SEQ ID NO：100)；(C)pY167(还参见SEQ ID NO：101)；和(D)pY168(还参见SEQ ID NO：102)。
[0136] 图15提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pKR1061(还参见SEQ ID NO：111)；(B)pKR973(还参见SEQ ID NO：128)；(C)pKR1064(还参见SEQ ID NO：132)；和(D)pKR1133(还参见SEQ ID NO：145)。
[0137] 图16提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pKR1105(还参见SEQ ID NO：156)；(B)pKR1134(还参见SEQ ID NO：161)；(C)pKR1095(还参见SEQ ID NO：167)；和(D)pKR1132(还参见SEQ ID NO：170。
[0138] 图17是KS373(还参见SEQ ID NO：179)的图谱。
[0139] 图18显示表24中所示克隆(除pBY-EgC20elo1之外)的脂肪酸分布型、计算出的％延伸率和计算出的％去饱和率。
[0140] 图19显示转入了EPA的对照载体、pY141、pY143、pY149、pY156、pY157和pY160的脂肪酸分布型、计算出的％延伸率和计算出的％去饱和率。
[0141] 图20显示转入了DPA的对照载体、pY141、pY150、pY151、pY152、pY153、pY156、pY157和pY160的脂肪酸分布型、计算出的％延伸率和计算出的％去饱和率。
[0142] 图21显示表25中所述的每个构建体的相关结构域的示意图。
[0143] 图22显示转入了EPA、ARA和DPA的经pY141(EgDHAsyn1；SEQ ID NO：49)转化过的耶氏酵母细胞和对照载体的脂肪酸分布型、计算出 的％延伸率和计算出的％去饱和率。
[0144] 图23显示来自用大豆表达载体pKR973和pKR1064(参见表26)转化过的大豆体细胞胚中代表性事件的单个胚芽的脂肪酸分布型。
[0145] 图24显示来自用大豆表达载体KS373转化过的大豆胚芽中五个最好延伸事件的脂肪酸分布型。
[0146] 图25综述了EgC20elo1(实施例3)、EgDHAsyn1(实施例4)和EgDHAsyn2(实施例5)的BLASTP和百分比同一性值。
[0147] ·“巴夫藻C20Elo”＝来自巴夫藻CCMP459(SEQ ID NO：2)C20-PUFA Elo(NCBI登录号AAV33630(GI 54307108)，位点AAV33630，CDS AY630573；Pereira等人，Biochem.J.384：357-366(2004)
[0148] ·“小眼虫D4”＝Δ4脂肪酸去饱和酶，来自小眼虫(SEQ ID NO：13)(NCBI登录号AAQ19605(GI 33466346)，位点AAQ19605，CDS AY 278558；Meyer等人，Biochemistry42(32)：9779-9788(2003)
[0149] 图26显示来自转入了EPA的大豆胚芽的脂肪酸分布型。大豆胚芽选自在用大豆表达载体pKR1105转化过的具有最好C20/Δ5延伸酶和Δ4去饱和酶活性的大豆胚芽。
[0150] 图27显示如实例中所述的小眼虫细胞提取物的脂质特征色谱。
[0151] 图28是pKR1183(还参见SEQ ID NO：266)的图谱。
[0152] 图29综述了Euglena anabenaDHA合酶结构域序列。
[0153] 图30是pKR1253(还参见SEQ ID NO：270)的图谱。
[0154] 图31是pKR1255(还参见SEQ ID NO：275)的图谱。
[0155] 图32是pKR1189(还参见SEQ ID NO：285)的图谱。
[0156] 图33是pKR1229(还参见SEQ ID NO：296)的图谱。
[0157] 图34是pKR1249(还参见SEQ ID NO：297)的图谱。
[0158] 图35是pKR1322(还参见SEQ ID NO：314)的图谱。
[0159] 图36显示用pKR1189转化过的五个事件的脂肪酸分布型，所述事件具有最低的平均ALA含量(5个经分析的大豆体细胞胚的平均值)，并且一个事件(2148-3-8-1)具有该实验典型野生型胚芽的脂肪酸分布型。脂肪酸经鉴定是16:0(棕榈酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、LA和ALA。脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。
[0160] 图37显示用pKR1183转化过的五个事件的脂肪酸分布型，所述事件具有最高的平均DGLA含量(5个经分析的大豆体细胞胚的平均值)。脂肪酸经鉴定是16:0(棕榈酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、LA、ALA、EDA、ERA、DGLA和ETA。脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。
[0161] 图38显示用具有最高ARA的pKR1249和pKR1253转化过的20个事件的平均脂肪酸分布型(10个大豆体细胞胚的平均值)。脂肪酸经鉴定是16:0(棕榈酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、LA、ALA、EDA、SCI、DGLA、ARA、ERA、JUN、ETA和EPA。脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。作为“其他”列出的脂肪酸包括：18:2(5，9)、18:3(5，9，12)、STA、20:0、20:1(11)、20:2(7，11)或20:2(8，11)和DPA。
[0162] 图39显示来自具有17.0％的平均ARA含量和1.5％的平均EPA含量的一个事件(AFS 5416-8-1-1)的每个大豆体细胞胚的实际脂肪酸分布型。脂肪酸经鉴定是16:0(棕榈酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、LA、ALA、EDA、SCI、DGLA、ARA、ERA、JUN、ETA和EPA。脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。作为“其他”列出的脂肪酸包括：18:2(5，9)、18:3(5，9，12)、STA、20:0、20:1(11)、20:2(7，11)或20:2(8，11)和DPA。
[0163] 图40显示用具有最高ARA的pKR1249和pKR1255转化过的20个事件的平均脂肪酸分布型(9或10个大豆体细胞胚的平均值)。脂肪酸经鉴定是16:0(棕榈酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、LA、ALA、EDA、SCI、DGLA、ARA、ERA、JUN、ETA和EPA；脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。作为“其他”列出的脂肪酸包括：18:2(5，9)、18:3(5，9，12)、STA、20:0、20:1(11)、20:2(7，11)或20:2(8，11)和DPA。
[0164] 图41显示来自转入了EPA的胚芽的脂肪酸分布型。大豆胚芽选自在用大豆表达载体pKR1134转化过的具有最好C20/Δ5延伸酶和Δ4去饱和酶活性的事件。图41中的脂肪酸经鉴定是16:0(棕榈酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、LA、ALA、EPA、22:0(二十二烷酸)、DPA、24:0(二十四烷酸)、DHA和24:1(二十四烯酸)。图41中列出的脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。
[0165] 图42显示来自转入了EPA的大豆胚芽的脂肪酸分布型。大豆胚芽选自来自pKR1105转化大豆的20个经分析新事件的具有最好C20/Δ5延伸酶和Δ4去饱和酶活性的事件。图42中的脂肪酸经鉴定是16:0(棕榈酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、LA、ALA、EPA、22:0(二十二烷酸)、DPA、24:0(二十四烷酸)、DHA和24:1(二十四烯酸)。 图42中列出的脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。
[0166] 图43显示一幅图，描述当向大豆胚芽提供EPA时，用pKR1105(个别表达的C20延伸酶和Δ4去饱和酶)或pKR1134(融合表达的C20延伸酶和Δ4去饱和酶)转化过的事件的相对活性。
[0167] 图44图示了解脂耶氏酵母菌株Y4305U3的发育。
[0168] 图45提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pZKLeuN-29E3和(B)pY116。
[0169] 图46提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pKO2UF8289和(B)pZKSL-555R。
[0170] 图47提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pZP3-Pa777U和(B)pY117。
[0171] 图48提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pZP2-2988和(B)pZKUE3S。
[0172] 图49提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pZKL2-5U89GC和(B)pZKL1-2SP98C。
[0173] 图50提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pZKUM和(B)pZKD2-5U89A2。
[0174] 图51A图示了解脂耶氏酵母菌株Y4184U的发育。图51B提供了pEgC20ES的质粒图谱。
[0175] 图52提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pZUFmEgC20ES和(B)pZKL4-220EA4。图52C是显示在EaDHAsyn1(SEQ ID NO：95)中的EaC20E结构域(SEQ ID NO：231)3’区域和EaD4结构域(SEQ ID NO：246)5’区域的重叠的示意图。
[0176] 图53A显示在EaD4S(SEQ ID NO：193)、EaD4S-1(SEQ ID NO：382)、EaD4S-2(SEQ ID NO：384)和EaD4S-3(SEQ ID NO：386)的N末端之间的比对。
[0177] EaD4S(SEQ ID NO：193)、EaD4S-1(SEQ ID NO：382)、EaD4S-2(SEQ ID NO：384)和EaD4S-3(SEQ ID NO：386)的N末端之间的比对。
[0178] 图53B显示在EgD4S(SEQ ID NO：388)、EgD4S-1(SEQ ID NO：404)、EgD4S-2(SEQ ID NO：406)和EgD4S-3(SEQ ID NO：408)的N末端之间的比对。
[0179] EgD4S(SEQ ID NO：388)，EgD4S-1(SEQ ID NO：404)，EgD4S-2(SEQ ID NO：406)和EgD4W-3(SEQ ID NO：408)的N末端之间的比对。
[0180] 图54提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pZKLY-G204、(B) pEgC20ES-K、(C)pYNTGUS1-CNP和(D)pZKLY。
[0181] 图55提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pZUFmG9G8fu和(B)pZUFmG9A8。
[0182] 图56是pKR1014的图谱。
[0183] 图57是pKR1152的图谱。
[0184] 图58是pKR1151的图谱。
[0185] 图59是pKR1150的图谱。
[0186] 图60是pKR1199的图谱。
[0187] 图61是pKR1200的图谱。
[0188] 图62是pKR1184的图谱。
[0189] 图63是pKR1321的图谱。
[0190] 图64是pKR1326的图谱。
[0191] 就图65至71而言，脂肪酸经鉴定是16:0(棕榈酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、LA、ALA、EDA、ERA、DGLA和ETA，并将脂肪酸组合物表达为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。此外，将延伸活性表达为C18脂肪酸(C18％Δ9延伸率)的％Δ9延伸率，按照以下公式计算：([产物]/[底物+产物])*100。更具体地讲，将LA和ALA的组合延伸百分比如下进行测定：([DGLA+ETA+EDA+ERA]/[LA+ALA+DGLA+ETA+EDA+ERA])*100。EDA和ERA的组合去饱和百分比显示为“C20％Δ8去饱和”，如下进行测定：([DGLA+ETA]/[DGLA+ETA+EDA+ERA])*100，也称为总％去饱和。
[0192] 图65显示用pKR1014转化过的五个事件的脂肪酸分布型，所述事件具有最高的平均DGLA含量(5个经分析的大豆体细胞胚的平均值)。
[0193] 图66显示用pKR1152转化过的五个事件的脂肪酸分布型，所述事件具有最高的平均DGLA含量(5个经分析的大豆体细胞胚的平均值)。
[0194] 图67显示用pKR1151转化过的五个事件的脂肪酸分布型，所述事件具有最高的平均DGLA含量(5个经分析的大豆体细胞胚的平均值)。
[0195] 图68显示用pKR1150转化过的五个事件的脂肪酸分布型，所述事件具有最高的平均DGLA含量(5个经分析的大豆体细胞胚的平均值)。
[0196] 图69显示用pKR1199转化过的五个事件的脂肪酸分布型，所述事件具有最高的平均DGLA含量(5个经分析的大豆体细胞胚的平均值)。
[0197] 图70显示用pKR1200转化过的五个事件的脂肪酸分布型，所述事 件具有最高的平均DGLA含量(5个经分析的大豆体细胞胚的平均值)。
[0198] 图71显示用pKR1184转化过的五个事件的脂肪酸分布型，所述事件具有最高的平均DGLA含量(5个经分析的大豆体细胞胚的平均值)。
[0199] 图72显示个别表达的Δ9延伸酶与Δ8去饱和酶对当量Δ9延伸酶-Δ8去饱和酶融合蛋白的比较。每个数据点代表所有分析事件的5至6个胚芽(％总脂肪酸)的平均％DGLA或％EDA，并且平均％DGLA对平均％EDA绘图。在(A)中，EgTpom代表与TpomD8(pKR1014)共表达的EgD9e，EgTpomfus代表EgD9e/TpomD8融合(pKR1199)。在(B)中，EgEa代表与EaD8(pKR1152)共表达的EgD9e，EgEafus代表EgD9e/EaD8融合(pKR1200)。在(C)中，EaTpom代表与TpomD8(pKR1151)共表达的EaD9e，EaTpomfus代表EaD9e/TpomD8融合(pKR1183)。在图(D)中，EaEa代表与EaD8(pKR1150)共表达的EaD9e，EaEafus代表EaD9e/EaD8融合(pKR1200)。
[0200] 图73显示用具有最高平均ARA和EPA含量(5个经分析胚芽的平均值)的pKR1322(实验MSE2274)转化过的五个事件的脂肪酸分布型。脂肪酸经鉴定是16:0(棕榈酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、18:2(5，9)、LA、ALA、EDA、ERA、SCI、DGLA、JUN(也称为JUP)、ETA、ARA和EPA。脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。将延伸活性表达为C18脂肪酸(％Elo)的％Δ9延伸率，按照以下公式计算：([产物]/[底物+产物])*100。更具体地讲，将LA和ALA的组合延伸百分比如下进行测定：
([DGLA+ETA+EDA+ERA+EPA+ARA]/[LA+ALA+DGLA+ETA+EDA+ERA+EPA+ARA])*100。EDA 和ERA的组合Δ8去饱和百分比显示为“％D8”，如下进行测定：([DGLA+ETA+EPA+ARA]/[DGLA+ETA+EDA+ERA+EPA+ARA])*100。这也称为总％Δ8去饱和。DGLA和ETA的组合Δ5去饱和百分比显示为“％D5”，如下进行测定：([EPA+ARA]/[DGLA+ETA+EPA+ARA])*100。这也称为总％Δ5去饱和。
[0201] 图74显示用pKR1326(实验MSE2275)转化过的五个事件的脂肪酸分布型，所述事件具有最高的平均DGLA和ETA含量(5个经分析胚芽的平均值)。脂肪酸经鉴定是16:0(棕榈酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、LA、ALA、EDA、ERA、DGLA和DGLA以及ETA。脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。将延伸活性表达为C18 脂肪酸(C18％Δ9延伸率)的％Δ9延伸率，按照以下公式计算：([产物]/[底物+产物])*100。
更具体地讲，将LA和ALA的组合延伸百分比如下进行测定：([DGLA+ETA+EDA+ERA]/[LA+ALA+DGLA+ETA+EDA+ERA])*100。EDA和ERA的组合去饱和百分比显示为“C20％Δ8去饱和”，如下进行测定：([DGLA+ETA]/[DGLA+ETA+EDA+ERA])*100。这也称为总％去饱和。
[0202] 序列表说明
[0203] 序列描述综述了在此附上的序列列表。序列列表包含核苷酸序列字符的单字母代码和氨基酸的单字母及三字母代码，这些代码定义于IUPAC-IUB标准，描述于Nucleic Acids Research 13：3021-3030(1985)和Biochemical Journal 219(2)：345-373(1984)。
[0204] SEQ ID NO：1至519是表2中鉴定的引物、ORF编码基因、蛋白质(或它们的部分)、或质粒。
[0205] 表2
[0206] 核酸和蛋白质SEQ ID Number摘要
[0207]
[0208]
[0209]
[0210]
[0211]
[0212]
[0213]
[0214]
[0215]
[0216]
[0217]
[0218]
[0219]
[0220]
[0221]
[0222]
[0223]
[0224]
[0225]

具体实施方式

[0226] 藉此将本文中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文以引用的方式并入本文。
[0227] 本发明涉及复合酶，如DHA合酶。这些可用于特别是生产有益健康的PUFA，更具体地讲生产二十二碳六烯酸(DHA)的生物化学途径的操纵。因此，本发明有多种应用。通过本文所公开的方法学制备的PUFA或其衍生物可用作膳食替代品或补充剂，尤其是婴儿代乳品(formula)，可用于接受静脉内营养法的患者或用来预防或治疗营养不良。
[0228] 作为另外一种选择，可将纯化的PUFA(或其衍生物)掺入到食用油、脂肪或调配的人造黄油中，以便食用者在正常使用中将获得所需量的膳食补充。PUFA还可以掺入到婴儿代乳品、营养补充剂或其他食品中，并且可用作抗炎或降胆固醇剂。任选地，该组合物可以用于药用(人药或兽药)。在此情况下，一般口服PUFA，但也可通过任何可被成功吸收的途径来施用PUFA，例如肠胃外给药(例如皮下注射、肌内注射或静脉内注射)、直肠给药、阴道给药、或局部给药(例如皮肤油膏剂或洗剂)。
[0229] 给人或动物补充以重组手段产生的PUFA可导致加入的PUFA以及它们的代谢物的水平升高。例如，用EPA处理不但可以导致EPA的水平升高，而且还可以导致EPA的下游产物如类二十烷酸(即前列腺素、白三烯和血栓素)的水平升高。复杂的调节机制使得期望组合多种PUFA或者添加不同的PUFA缀合物，以便预防、控制或克服这种机制来在个体中实现所需水平的特定PUFA。
[0230] 定义
[0231] 如本文所用的并在所附的权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地指明其他含义。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株此类植物，“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。
[0232] 如本文所用，术语“发明”或“本发明”不限于任何一个具体的实施方案，而是一般应用于如权利要求书和说明书中所述的本发明的任何和所有实施方案。
[0233] 在此公开的上下文中使用了许多术语和缩写。给出了如下定义。
[0234] “开放阅读框”缩写为ORF。
[0235] “聚合酶链反应”缩写为PCR。
[0236] “美国典型培养物保藏中心”缩写为ATCC。
[0237] “多不饱和脂肪酸”缩写为PUFA。
[0238] “三酰基甘油”缩写为TAG。
[0239] 如本文所用，术语“下调”是指基因或多核苷酸表达水平的减少或下降。
[0240] 术语“复合酶”是指具有至少两种独立的和可分的酶活性的单一多肽。优选地，复合酶包括第一酶活性以及与其相联系的第二酶活性。
[0241] 术语“融合蛋白”与术语“复合酶”可互换使用。因此，“融合蛋白”是指具有至少两种独立的和可分的酶活性的单一多肽。
[0242] 术语“融合基因”是指编码复合酶的多核苷酸或基因。可通过连接至少两个DNA片段来构建融合基因，其中每个DNA片段编码一种独立的和可分的酶活性。在下文的实施例38中描述了融合基因的一个实例，其中Hybrid1-HGLA合酶融合基因通过使用小眼虫DHA合酶1富含脯氨酸的接头连接Euglena anabenaΔ9延伸酶(EaD9Elo1；SEQ ID NO：252)和Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491Δ8去饱和酶(TpomD8；SEQ ID NO：162)来构建。(EgDHAsyn1Link；SEQ ID NO：197)。
[0243] “结构域”或“功能结构域”是与功能(例如酶活性)相关的多肽离散部分、连续部分或亚序列。如本文所用，术语“结构域”包括但不限于脂肪酸生物合成酶和保留酶活性的脂肪酸生物合成酶部分。
[0244] “DHA合酶”是复合酶的一个实例。具体地讲，DHA合酶包括使用本文所述的任何接头连接到Δ4去饱和酶上的C20延伸酶。另一个复合酶的实例是包括如下文所述的连接到Δ8去饱和酶上的Δ9延伸酶的单一多肽。
[0245] 术语“连接”是指连接或键合至少两个具有独立的和可分的酶活性的多肽。
[0246] 术语“接头”是指两个或多个多肽间的键或连接部分，每个多肽具有独立的和可分的酶活性。
[0247] 用于形成复合酶的连接最低限度应由单个多肽键构成。在另一方面，该连接可由一个氨基酸残基(例如脯氨酸)或一个多肽构成。如果 该连接是一个多肽，则期望该连接具有至少一个脯氨酸残基。
[0248] 接头的实例在SEQ ID NO：198(EgDHAsyn1富含脯氨酸接头)中显示。
[0249] 术语“脂肪酸”指不同链长的长链脂族酸(链烷酸)，链长为约C12至C22(尽管更长和更短链长的酸两者都是已知的)。主要的链长介于C16和C22之间。关于“饱和脂肪酸”与“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”与“多不饱和脂肪酸”(或“PUFA”)以及“ω-6脂肪酸”(ω-6或n-6)与“ω-3脂肪酸”(ω-3或n-3)之间的区别的附加详细信息在美国专利公开7,238,482中提供。
[0250] 本文通过简单的记号系统“X：Y”来描述脂肪酸，其中X表示特定脂肪酸中碳(C)原子的总数目，而Y表示双键的数目。按照脂肪酸命名法，数字表示脂肪酸羧基末端的双键位置，“c”词缀表示双键为顺式构型(例如，棕榈酸(16：0)、硬脂酸(18：0)、油酸(18：1，9c)、岩芹酸(18：1，6c)、LA(18：2，9c，12c)、GLA(18：3，6c，9c，12c)和ALA(18：3，9c，12c，
15c))。除非另外指明，18：1、18：2和18：3分别指油酸、LA和ALA脂肪酸。除非另外明确指明，则认为双键为顺式构型。例如，认为18：2(9，12)中的双键为顺式构型。
[0251] 在本公开内容中用于描述PUFA的命名在下面的表3中示出。在标题为“简化符号”一栏中，ω-指代系统用于表明碳数目、双键的数目和最接近ω碳的双键位置，双键位置的计数从ω碳开始(为此ω碳的编号为1)。该表的其余部分汇总了ω-3和ω-6脂肪酸及其前体的俗名、将在整个说明书的其余部分中使用的缩写以及每种化合物的化学名称。
[0252] 表3
[0253] 多不饱和脂肪酸及其前体的命名
[0254]
[0255] 代谢途径或生物合成途径在生物化学意义上可以认为是发生于细胞内由酶催化的一系列化学反应，用以实现待细胞使用的或待细胞贮存的代谢产物的形成，或启动另一代谢途径(因而称作流量产生步骤)。 很多此类途径都很精细，并涉及对起始物质的逐步修饰以使之形成具有期望的精确化学结构的产物。
[0256] 术语“PUFA生物合成途径”指将油酸转化成LA、EDA、GLA、DGLA、ARA、DTA、DPAn-6、ALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA的代谢过程。该过程在文献中已有很好的描述(如参见PCT公开WO 2006/052870)。简而言之，该过程涉及通过添加碳原子来延长碳链和通过加入双键来使分子去饱和，这通过存在于内质网膜内的一系列特异性去饱和酶和延伸酶(即“PUFA生物合成途径酶”)进行。更具体地讲，“PUFA生物合成途径酶”指如下与PUFA生物合成相关的任何酶(以及编码该酶的基因)，包括：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶、C20/22延伸酶、DHA合酶和/或本发明的复合酶。
[0257] 术语“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”指在合适条件下表达时编码催化ω-3和ω-6脂肪酸二者之一或两者产生的酶的一组基因。通常，参与ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的基因编码PUFA生物合成途径酶。图1示出了一条代表性途径，提供了从肉豆蔻酸经过多种中间产物向DHA的转化，演示了ω-3和ω-6脂肪酸两者是如何可以从共同来源产生。该途径自然分成两部分，其中一部分将产生ω-3脂肪酸而另一部分只产生ω-6脂肪酸。
[0258] 如本文中关于ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径所用的，术语“功能性的”指该途径中的一些(或全部)基因表达活性酶，导致体内催化或底物转化。应当理解，“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”或“功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”并不意味着所有PUFA生物合成途径酶基因都是必需的，因为许多脂肪酸产物将仅要表达该途径中的一亚组基因。
[0259] 术语“Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径”是指PUFA生物合成途径，该途径最低限度应包括至少一个Δ6去饱和酶和至少一个C18/20延伸酶，因此能够分别从LA和ALA生物合成DGLA和/或ETA，其中GLA和/或STA是中间体脂肪酸。当表达其他去饱和酶和延伸酶时，也可合成ARA、DTA、DPAn-6、EPA、DPA和DHA。
[0260] 术语“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”是指PUFA生物合成途径，该途径最低限度应包括至少一个Δ9延伸酶和至少一个Δ8去饱和酶， 因此能够分别从LA和ALA生物合成DGLA和/或ETA，其中EDA和/或ETrA是中间体脂肪酸。当表达其他去饱和酶和延伸酶时，也可合成ARA、DTA、DPAn-6、EPA、DPA和DHA。该途径在一些实施方案中可能是有利的，因为GLA和/或STA的生物合成被排除。
[0261] 术语“中间体脂肪酸”是指在脂肪酸代谢途径中产生的任何脂肪酸，在此途径中通过其他代谢途径酶的作用能够进一步将其转化成想要的脂肪酸产物。例如，当使用Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径生产EPA时，可产生EDA、ETrA、DGLA、ETA和ARA并认为它们是“中间体脂肪酸”，因为能经由其他代谢途径酶的作用将这些脂肪酸进一步转化成EPA。
[0262] 术语“脂肪酸副产品”是指在脂肪酸代谢途径中产生的，既不是该途径想要的脂肪酸产物也不是该途径“中间体脂肪酸”的任何脂肪酸。例如，当使用Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径生产EPA时，金松烯酸(sciadonic acid，SCI)和杜松烯酸(juniperonic acid，JUP)也能通过Δ5去饱和酶分别对EDA或ETrA的作用产生。认为它们是“脂肪酸副产品”是因为其他代谢途径酶不能将它们进一步转化成EPA。
[0263] 术语“三酰基甘油”、“油”和“TAG”指由与甘油分子酯化的三个脂肪酰残基组成的中性脂质(并且这些术语在本公开内容中将可以互换使用)。这些油可含有长链PUFA以及较短的饱和的和不饱和的脂肪酸以及较长链的饱和脂肪酸。因此，“油的生物合成”一般指细胞中TAG的合成。
[0264] “总脂质和油组分中的PUFA百分比(％)”指PUFA相对于在那些组分中的总脂肪酸的百分比。术语“总脂质组分”或“脂质组分”两者均指含油生物内所有脂质(即中性和极性脂质)的总和，因此包括位于磷脂酰胆碱(PC)组分、磷脂酰乙醇胺(PE)组分和三酰基甘油(TAG或油)组分中的那些脂质。然而，术语“脂质”和“油”将可在整个说明书中互换使用。
[0265] 术语“转化效率”和“底物转化百分比”指特定酶(如去饱和酶)能够将底物转化成产物的效率。转化效率根据下面的公式测量：([产物]/[底物+产物])×100，其中‘产物’包括源于它的途径中的中间产物和所有产物。
[0266] “去饱和酶”是可以在一种或多种脂肪酸中去饱和(即导入双键) 而产生所关注的脂肪酸或前体的多肽。尽管在整个说明书中使用ω-指代系统来指代特定的脂肪酸，但使用Δ系统从底物的羧基端计数来表示去饱和酶的活性更方便。例如，Δ8去饱和酶将分子羧基末端编号为第八和第九的碳原子之间的脂肪酸去饱和，并能例如催化EDA转化成DGLA和/或催化ETrA转化成ETA。其他可用的脂肪酸去饱和酶包括例如：(1)Δ5去饱和酶，它催化DGLA转化为ARA和/或催化ETA转化为EPA；(2)Δ6去饱和酶，它催化LA转化为GLA和/或催化ALA转化为STA；(3)Δ4去饱和酶，它催化DPA转化为DHA和/或催化DTA转化为DPAn-6；(4)Δ12去饱和酶，它催化油酸转化为LA；(5)Δ15去饱和酶，它催化LA转化为ALA和/或催化GLA转化为STA；(6)Δ17去饱和酶，它催化ARA转化为EPA和/或催化DGLA转化为ETA；以及(7)Δ9去饱和酶，它催化棕榈酸转化成棕榈油酸(16：1)和/或催化硬脂酸转化成油酸(18：1)。在本领域中，基于Δ15和Δ17去饱和酶将ω-6脂肪酸转化成它们的ω-3对应物的能力(如分别将LA转化成ALA以及将ARA转化成EPA)，偶尔也将它们称作“ω-3去饱和酶”、“w-3去饱和酶”和/或“n-3去饱和酶”。在一些实施方案中，最期望通过用脂肪酸去饱和酶基因转化合适的宿主并测定其对宿主脂肪酸分布型的影响来根据经验测定特定脂肪酸去饱和酶的特异性。
[0267] 术语“Δ4去饱和酶”是指将分子羧基末端编号为第四和第五的碳原子之间的脂肪酸去饱和的酶，它能例如催化DPA转化成DHA和/或催化DTA转化成DPAn-6。为本文目的，术语“EgDHAsyn1”指分离自小眼虫的由本文SEQ ID NO：11编码的DHA合酶(SEQ ID NO：12)。术语“EgDHAsyn2”指分离自小眼虫的由本文SEQ ID NO：21编码的DHA合酶(SEQ ID NO：22)。术语“EaDHAsyn1”指分离自Euglena anabena的由本文SEQ ID NO：91编码的DHA合酶(SEQ ID NO：95)。术语“EaDHAsyn2”指分离自Euglena anabena的由本文SEQ ID NO：
92编码的DHA合酶(SEQ ID NO：96)。术语“EaDHAsyn3”指分离自Euglena anabena的由本文SEQ ID NO：93编码的DHA合酶(SEQ ID NO：97)。术语“EaDHAsyn4”指分离自Euglena anabena的由本文SEQ ID NO：94编码的酶(SEQ ID NO：98)。
[0268] 术语“延伸酶体系”指负责延伸脂肪酸碳链以产生比延伸酶体系作用的脂肪酸底物增加两个碳原子的脂肪酸的四种酶的集合。更具体地 讲，延伸过程与脂肪酸合酶协同作用，其中CoA是酰基载体(Lassner等人，Plant Cell，8：281-292(1996))。在第一步中，已经发现该酶是底物特异性的和限速的，丙二酸单酰-CoA与长链酰基-CoA缩合以产生二氧化碳(CO2)和β-酮脂酰-CoA(其中该酰基部分已经延长了两个碳原子)。继发反应包括还原β-羟脂酰-CoA，脱水烯酰-CoA和二次还原以产生延长的酰基-CoA。延伸酶体系催化反应的实例如催化GLA转化为DGLA、催化STA转化为ETA、催化LA转化为EDA、催化ALA转化为ETrA以及催化EPA转化为DPA。
[0269] 为本文目的，催化第一次缩合反应(即将丙二酸单酰-CoA和长链酰基-CoA转化成β-酮脂酰-CoA)的酶一般称为“延伸酶”。一般来讲，延伸酶的底物选择性有点广泛，但是可以通过链长及不饱和程度区分。因此，延伸酶可能具有不同的特异性。例如C14/16延伸酶将会利用C14底物(如肉豆蔻酸)；C16/18延伸酶将会利用C16底物(如棕榈酸)；C18/20延伸酶将会利用C18底物(如GLA、STA)；而C20/22延伸酶将利用C20底物(如ARA、EPA)。同样的，“Δ9延伸酶”能够催化LA转化为EDA和/或ALA转化为ETrA。
[0270] 重要的是注意到一些延伸酶具有广泛的特异性，因此单个酶能够催化几个延伸酶反应。因此，例如，Δ9延伸酶也可作为C16/18延伸酶、C18/20延伸酶和/或C20/22延伸酶使用，并且对Δ5和Δ6脂肪酸如EPA和/或GLA可分别具有供选择的、但是非优选的特异性。
[0271] 如本文所用，术语“C20延伸酶”是指利用C20底物例如EPA或ARA的酶。术语“C20/Δ5延伸酶”是指利用具有一个Δ5双键的C20底物的酶。
[0272] 同样的对于本文而言，术语“EgD9elo”或“EgD9e”是指分离自小眼虫(参见SEQ ID NO：112；也参见美国专利申请11/601,563(提交于2006年11月16日，它在2007年5月24日公布为US-2007-0118929-A1))的Δ9延伸酶。
[0273] 本文所用的“核酸”意指多核苷酸，并包括单链或双链的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基聚合物。核酸也可以包括片段和经修饰的核苷酸。因此，术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用，并且是指作为单链或双链的RNA或DNA聚合物，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸(通常以它们 的5′-单磷酸形式存在)可以用如下它们的单字母名称指代：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，而“N”表示任意核苷酸。
[0274] 术语“功能等同的亚片段”和“功能上等同的亚片段”本文可互换地使用。这些术语是指分离核酸片段的一部分或亚序列，无论该片段或亚片段是否编码活性酶，其中均保留了改变基因表达或产生某种表型的能力。例如，可使用该片段或亚片段设计嵌合基因以在经转化的植物中生产所需表型。可设计嵌合基因用于抑制，这是通过连接其核酸片段或亚片段，无论它是否编码活性酶，在相对于植物启动子序列的正义方向或反义方向上。
[0275] 术语“保守结构域”或“基序”指进化上相关的蛋白质的比对序列中在特定位置保守的一组氨基酸。虽然同源蛋白质之间在其他位置的氨基酸可以发生变化，但在特定位置高度保守的氨基酸表示对蛋白质的结构、稳定性或活性来说是必需的氨基酸。术语“同源性”、“同源的”、“基本上类似的”和“基本上对应的”本文可互换使用。它们指其中一个或多个核苷酸碱基的变化不会影响核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力的核酸片段。这些术语也指本发明的核酸片段的修饰(例如缺失或插入一个或多个核苷酸)，相对于初始的未经修饰的核酸片段，基本上不会改变所得核酸片段的功能特性。因此，正如本领域技术人员应该理解的，本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。
[0276] 此外，技术人员认识到，本发明所涵盖的基本上类似的核苷酸序列也由它们在中等严格条件(如0.5×SSC，0.1％SDS，60℃)下，与本文所示例的序列杂交的能力，或杂交至本文所公开的核苷酸序列的任何部分以及杂交至与本文所公开的任何核苷酸序列功能相当的序列的能力所限定。可以调节严格性条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列)，到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后的洗涤确定严格性条件。
[0277] 术语“选择性杂交”包括指在严格杂交条件下，核酸序列与特定核酸靶序列以比其与非靶核酸序列的杂交更高的可检测程度(例如至少2 倍于背景)杂交，并指基本排除了非靶核酸。选择性杂交的序列通常彼此具有约至少80％的序列同一性，或90％的序列同一性，最多并包括100％的序列同一性(即完全互补)。
[0278] 术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指探针将选择性杂交至其靶序列的条件。严格条件是序列依赖性的，并将因不同的环境而异。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。作为另一种选择，可调节严格条件以允许序列中的一些错配，以便检测到更低程度的相似性(异源探测)。通常，探针的长度少于约1000个核苷酸，任选长度少于500个核苷酸。
[0279] 一般地，严格条件将是如下那些条件：在pH7.0至8.3下盐浓度低于约1.5M钠离子，通常约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃，而对于长的探针(例如多于50个核苷酸)温度为至少约60℃。严格条件也可以通过加入例如甲酰胺之类的去稳定剂来实现。示例性的低严格条件包括在
37℃于含有30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液中杂交，以及在50至55℃用1×至2×SSC(20×SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)洗涤。示例性的中
等严格条件包括在37℃于40％至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，以及在55至60℃下用0.5×至1×SSC洗涤。示例性的高严格条件包括在37℃于50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，以及在60至65℃用0.1×SSC洗涤。
[0280] 特异性通常取决于杂交后洗涤，最后的洗涤溶液的离子强度和温度是关键因素。对于DNA-DNA杂交体，Tm可以用Meinkoth等人，Anal.Biochem.138：267-284(1984)：Tm＝
81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的体积摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，而L是以碱基对表示的杂交体的长度。Tm是(在确定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。每出现1％的错配，Tm降低约1℃；因此，可调节Tm杂交和/或洗涤条件以与具有期望同一性的序列杂交。例如，如果要寻求具有≥90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。通常，在确定的离子强度和pH下，严格条件选择为比特定序列及其互补序列的热解链温度(Tm)低约5℃。然而，极严格条件可采用在比热解链温度(Tm)低1、2、3 或4℃的温度下杂交和/或洗涤；中等严格条件可采用在比热解链温度(Tm)低6、
7、8、9或10℃的温度下杂交和/或洗涤；低严格条件可采用在比热解链温度(Tm)低11、12、
13、14、15或20℃温度下杂交和/或洗涤。利用所述等式、杂交和洗涤组合物以及理想的Tm，本领域技术人员将会理解，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化已经在本质上得以描述。
如果所需的错配程度导致m低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC的浓度以便能使用更高的温度。对于核酸杂交的详尽指导可在以下文献中找到：Tij ssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”，Elsevier，New York(1993)；和Current Protocols in Molecular Biology，第2章，Ausubel等人，Eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。杂交和/或洗涤条件可进行至少10、30、60、90、120或240分钟。
[0281] 在核酸或多肽序列上下文中的“序列同一性”或“同一性”是指两序列中的核酸碱基或氨基酸残基当在指定比较窗口中比对最大匹配时是相同的。
[0282] 因此，“序列同一性百分比”是指通过在比较窗口中比较两个最佳比对序列从而测定的值，其中比较窗口中的多核苷酸或多肽序列部分与参考序列(参考序列不包括添加或删除)相比可包括添加或删除(即间隙)以达到两序列的最佳比对效果。百分比通过以下方法进行计算：测定两序列中具有相同核酸碱基或氨基酸残基以产生匹配位置的位置数目，将该匹配位置的数目除以比较窗口两序列中的位置总数，并且所得结果乘以100来获得序列同一性的百分比。序列同一性百分比的有用实例包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％、或从50％至100％之间的任何整数百分比。可使用任何本文所述程序测定这些同一性。
[0283] 序列比对和百分比同一性或相似度可以用设计用于检测同源序列的多种比较方法来确定，这些方法包括但不限于LASARGENE生物信息计算包(DNASTAR Inc.，Madison，TMWI)的Megalign 程序。在本专利申请案的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，分析结果将基于所参考程序的“默认值”，除非另外指明。在此所用的“默认值” 是指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
[0284] “Clustal V序列比对方法”对应于Clustal V标记的比对方法(在Higgins和 Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G. 等 人，Comput.Appl.Biosci.8：189-191(1992)中有所描述)，并且可见于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR TM
Inc.，Madison，WI)的MegAlign 程序中。对于多重比对，默认值对应于空位罚分(GAP PENALTY)＝10和空位长度罚分(GAP LENGTH PENALTY)＝10。用Clustal V方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1，空位罚分＝3，窗口(WINDOW)＝5和DIAGONALS SAVED＝5。而对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2，空位罚分＝5，窗口＝4和DIAGONALS SAVED＝4。用Clustal V程序比对序列后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。
[0285] “Clustal W序列比对方法”对应于Clustal W标记的比对方法(描述于Higgins和Sharp，同上；Higgins、D.G.等人，同上)，并且可见于LASERGENE生物信息学计算软件TM包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的MegAlign 版本6.1程序中。用于多重比对的默认参数对应于空位罚分＝10，空位长度罚分＝0.2，延迟发散序列(Delay Divergen Seqs)(％)＝30，DNA转换权重(DNA Transition Weight)＝0.5，蛋白质权重矩阵(Protein Weight Matrix)＝Gonnet系列，DNA权重矩阵(DNA WeightMatrix)＝IUB。在使用Clustal W程序对序列进行比对之后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。
[0286] “BLASTN比对方法”是由国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)提供的用以采用默认参数比较核苷酸序列的算法。
[0287] 本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于从其他物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分比的可用的实例包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％、或50％至100％之间的任何整数百分比。实际上，50％至100％之间的任何整数氨基酸同一性可用于描述本发明，例如51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％。此分离核苷酸片段的任何全长或部分互补的序列也是有用的。
[0288] “基因”指表达特定蛋白质的核酸片段，并且可以包括单独的编码区或除位于编码序列之前(5′非编码区)和之后的调节序列(3′非编码区)之外的编码区。“天然基因”是指天然存在的具有其自己的调控序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的调节序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。“内源性基因”指位于生物的基因组内它的天然位置的天然基因。“外来基因”指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移导入宿主生物。外来基因可以包含插入到非天然生物体内的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是通过转化方法导入基因组内的基因。
[0289] 在应用于植物细胞时，术语“基因组”不仅包括在细胞核内发现的染色体DNA，而且还包括在细胞的亚细胞成分(例如线粒体、质体)内发现的细胞器DNA。
[0290] “经密码子优化的基因”是其密码子使用频率经设计用以模仿宿主细胞优选的密码子使用频率的基因。
[0291] “等位基因”是染色体上占据给定位点的基因的几种供选择替代形式的其中一种。当染色体上给定位点处存在的所有等位基因相同时，植物在该位点是纯合子。如果染色体上给定位点处存在的等位基因不同，则植物在该位点是杂合子。
[0292] “编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“调控序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括，但不限于：启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
[0293] “启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。启动子序列由近侧和较远端上游元件组成，后者经常指增强子。因此，“增强子”是能刺激启动子活性的DNA序列，它可以是启动子的天然元件，或被插入以增强启动子水平或组织特异性的异源元件。启动子可 以整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包括合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。还应认识到，由于在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，一些变型的DNA片段可能具有相同的启动子活性。在多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。不断在发现可用于植物细胞中的不同类型的新启动子；在以下文献中可以发现多个实例：Okamuro，J.K.和Goldberg，R.B.编辑的Biochemistry ofPlants15∶1-82(1989).
[0294] “翻译前导序列”指位于基因启动子序列和编码序列之间的多核苷酸序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列的经完全加工后的mRNA上游。翻译前导序列可影响mRNA的初级转录过程、mRNA稳定性或翻译效率。已经描述了翻译前导序列的实例(Turner，R.和Foster，G.D.，Mol.Biotechnol.3：225-236(1995))。
[0295] “3′非编码序列”、“转录终止子”或“终止序列”是指位于编码序列下游，包括能够影响mRNA加工或基因表达的多腺苷酸化识别序列和其他序列编码调节信号的DNA序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3′末端。Ingelbrecht，I.L.等人例示了不同3′非编码序列的用途Plant Cell 1：671-680(1989)。
[0296] “RNA转录物”指由RNA聚合酶催化的DNA序列的转录所产生的产物。当RNA转录物与DNA序列拷贝完全互补时，它指初级转录物。当RNA转录物是来源于转录后加工的初级转录物的RNA序列时，它指成熟的RNA。“信使RNA”或“mRNA”指无内含子并且可以由细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链，或使用DNA聚合酶I的Klenow片段转化成双链。“正义”RNA指包括mRNA和在细胞内或体外能被翻译成蛋白质的RNA在内的RNA转录物。“反义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并阻断或减少靶基因表达的RNA转录物(美国专利号公开5，107,065)。反义RNA可以与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子、或编码序列互补。“功能性RNA”指反义RNA、核酶RNA或其他不能翻 译但是对细胞过程有影响作用的RNA。术语“互补的”和“反向互补的”对mRNA转录来说可互换使用，并且用以定义信使反义RNA。
[0297] 术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。在另一个实例中，可将本发明的互补RNA区域可操纵地连接到(直接地或非直接地)靶mRNA的5’端、或靶mRNA的3’端、或靶mRNA内部、或靶mRNA的5’端的第一互补区域及靶mRNA的3’端的它的互补区域。
[0298] 本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)。转化方法是本领域的技术人员所熟知的，并且如下文所述。
[0299] “PCR”或“聚合酶链反应”是用于合成大量特异性DNA片段的技术，由一系列重复循环构成(Perkin Elmer Cetus Instruments，Norwalk，CT)。通常将双链DNA加热至变性，低温退火处理靶片段的3’端的两个互补引物，然后在中间温度下进行延伸。将一组这三个连续步骤称为一个“循环”。
[0300] 术语“重组体”指例如通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。
[0301] “质粒”或“载体”是通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组进一种独特构建体中，该独特构建体能够将表达盒导入细胞中。“表达盒”指包含外来基因并且除该外来基因以外还具有使得该基因在外来宿主中的表达增强的元件的DNA片段。“转化盒”指含有外来基因并且除了该外来基因外还含有有利于转化特定宿主细胞转化的元件的DNA片段。
[0302] 术语“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建 体”和“重组DNA构建体”本文可互换使用。重组构建体包括人造的核酸片段组合，例如天然条件下不一起存在的调控序列和编码序列。例如重组构造可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可独自使用或与载体组合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于用以转化宿主细胞的方法，该宿主细胞是本领域的技术人员所熟知的。例如可以使用质粒载体。技术人员熟知为了成功地转化、筛选和繁殖包括本发明任何分离的核酸片段的宿主细胞，必须存在于载体上的遗传元件。技术人员也将认识到不同的独立转化事件将导致不同水平和不同模式的表达(Jones等人，EMBO J.4：2411-2418(1985)；De Almeida等人，Mol.Gen.Genetics 218：78-86(1989))，因此，必须筛选多次事件以获得显示期望表达水平和模式的品系。这样的筛选可以通过DNA的Southern印迹分析、mRNA表达的Northern印迹分析、蛋白表达的免疫印迹分析或表型分析等完成。
[0303] 如本文所用，术语“表达”是指产生功能性终产物(例如mRNA或蛋白[前体或成熟体])。
[0304] 术语“导入”是指将核酸(例如表达构建体)或蛋白提供到细胞中。导入包括指将核酸整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸可以整合进细胞的基因组内，以及包括指将核酸或蛋白暂时提供给细胞。导入包括指稳定的或瞬时的转化方法以及有性杂交。因此，将核酸片段(例如重组DNA构建体/表达构建体)插入细胞内的情况下的“导入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可以整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内、转变成自主的复制子或瞬时表达(例如转染的mRNA)。
[0305] “成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽(即已经去除了存在于初始翻译产物中的任何前肽或肽原的多肽)。“前体”蛋白质指mRNA的初级翻译产物，即前肽和肽原仍然存在。前肽和肽原可以是但不限于细胞内定位信号。
[0306] “稳定转化”指将核酸片段转入宿主生物的基因组以产生稳定的遗传特性，该基因组包括核基因组和细胞器基因组。相反“瞬时转化”指将核酸片段转入宿主生物的核中或包含DNA的细胞器中，在无整合或 无稳定的遗传特性的情况下引起基因表达。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”生物体。
[0307] 如本文所用的“转基因”是指其基因组内含有异源多核苷酸的植物或细胞。优选的是，异源多核苷酸被稳定地整合进基因组中，使得该多核苷酸能传递至连续的世代。异源多核苷酸可以单独地或作为表达构建体的部分整合进基因组中。本文所用的转基因包括因异源核酸存在而已经改变了基因型的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括初始进行此类改变的转基因以及从初始的转基因通过有性杂交或无性繁殖产生的那些转基因。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过例如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。
[0308] “反义抑制”指产生能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物。“共抑制”是指产生能够抑制相同或基本上类似的外源或内源基因表达的正义RNA转录物(美国专利公开5,231,020)。以前已经通过集中正向超表达具有与内源mRNA同源性的核酸序列设计出了植物中的共抑制构建体，它导致所有与超表达序列具有同源性的RNA减少(Vaucheret等人，Plant J.16：651-659(1998)；Gura，Nature，404：804-808(2000))。该现象的总体效率较低，并且RNA减少的程度变化较大。更新的工作已经描述了“发夹”结构的用途，该结构以互补方向整合mRNA编码序列的全部或部分，导致已表达的RNA形成潜在的“茎-环”结构(PCT公开WO 99/53050；PCT公开WO 02/00904)。这在获得的转基因植物中提高了共抑制的频率。另一种变型描述了将植物病毒序列用于引导对近端mRNA编码序列的抑制或“沉默”(PCT公开WO 98/36083)。这些共抑制现象均未从机制上得到阐明，但遗传证据已经开始揭示这种复杂的情况(Elmayan等人，Plant Cell，10：1747-1757(1998))。
[0309] 术语“含油的”指那些趋于以脂质形式贮存它们的能源的生物(Weete，Fungal Lipid Biochemistry，第二版，Plenum，1980)。Fungal Lipid Biochemistry，第二版，Plenum，1980)。确定为含油的一类植物通常指“含油种子”植物。含油种子植物的实例包括但不限于：大豆(大豆属野大豆，Glycine and Soja sp.)，亚麻(亚麻属)，油菜籽(芸苔属)、玉米、棉花、红花(红花属)和向日葵(Helianthus sp.)。
[0310] 在含油微生物中细胞油或TAG含量一般符合S形曲线，其中脂质浓度增加直至在晚对数培育生长期或早稳定培育生长期时它达到最高浓度，随后在晚稳定培育生长期和死亡期期间逐渐下降(Yongrmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.57：419-25(1991))。术语“含油酵母”指那些产油的并被归类为酵母的微生物。含油微生物积累油超过它们的干细胞重量的约25％的情形并不鲜见。含油酵母的实例包括但不限于如下属：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。
[0311] 如本文所用，术语“生物质”具体地讲是指耗费的或使用的酵母细胞物质，该物质由以商业显著量生产PUFA的重组生产宿主发酵产生，其中优选的生产宿主是含油酵母的重组菌株，解脂耶氏酵母。生物质可以是以下形式：全细胞、全细胞溶解产物、匀化细胞、部分水解细胞物质和/或部分纯化细胞物质(例如微生物产生的油)。
[0312] 术语“裸藻纲”是指一类单细胞无色或光合鞭毛虫(“类眼虫”)，生存于淡水、海水、土壤和寄生环境中。该类生物特征在于单细胞，其中多数可自由游动，并具有两根由已知是储蓄泡的前鞘发出的鞭毛(其中一根可以不出鞘)。光合作用类眼虫包含一个至多个草绿色叶绿体，叶绿体形状不同，为微盘状至膨胀盘状或带状。无色类眼虫依赖渗透或吞噬进行营养吸收。已经描述了约1000个物种并将其分成约40个属和6个目。裸藻纲实例包括但决不限于以下属：眼虫属、小型绿藻属和Tetruetreptia。
[0313] 术语“植物”是指整个植株、植物器官、植物组织、种子、植物细胞、种子以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
[0314] “子代”包括植物的任何后续世代。
[0315] 综述：脂肪酸和三酰基甘油的微生物生物合成
[0316] 通常，含油微生物的脂质蓄积响应存在于生长培养基中的总的碳氮比率而触发。该过程(导致含油微生物中游离棕榈酸(16：0)的从头合成)在美国专利公开7,238,482中有详细描述。棕榈酸是长链饱和的和 不饱和的脂肪酸衍生物的前体，这些脂肪酸衍生物通过延伸酶和去饱和酶的作用形成(图1)。
[0317] TAG(脂肪酸的主要贮存单位)通过包括如下反应在内的一系列反应形成：(1)一分子的酰基辅酶A和甘油-3-磷酸通过酰基转移酶酯化而生成溶血磷脂酸；2.)第二分子的酰基辅酶A通过酰基转移酶酯化而生成1，2-二酰基甘油磷酸(通常称为磷脂酸)；3.)通过磷脂酸磷酸酶除去磷酸而生成1，2-二酰基甘油(DAG)；和(4)在酰基转移酶作用下加入第三个脂肪酸以形成TAG。广谱的脂肪酸可被整合进TAG中，包括饱和的和不饱和的脂肪酸以及短链和长链的脂肪酸。
[0318] ω-脂肪酸的生物合成
[0319] 其中油酸转化成长链ω-3/ω-6脂肪酸的代谢过程包括通过添加碳原子使碳链延长和通过加入双键使分子去饱和。这需要存在于内质网膜内的一系列特殊去饱和酶和延伸酶。然而，如在图1中看到的和如下所述的，通常存在多个用于产生特定长链ω-3/ω-6脂肪酸的替代途径。
[0320] 具体地讲，所有途径都需要最初通过Δ12去饱和酶将油酸转化成LA(第一个ω-6脂肪酸)。然后，使用“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”并以LA作底物，如下所述来制备长链ω-6脂肪酸：(1)通过Δ9延伸酶将LA转化成EDA；(2)通过Δ8去饱和酶将EDA转化成DGLA；(3)通过Δ5去饱和酶将DGLA转化成ARA；(4)通过C20/22延伸酶将ARA转化成DTA；和，(5)通过Δ4去饱和酶将DTA转化成DPAn-6。作为另外一种选择，“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”可使用ALA作底物，如下制备长链ω-3脂肪酸：(1)通过Δ15去饱和酶将LA转化成ALA(第一个ω-3脂肪酸)；(2)通过Δ9延伸酶将ALA转化成ETrA；(3)通过Δ8去饱和酶将ETrA转化成ETA；(4)通过Δ5去饱和酶将ETA转化成EPA；(5)通过C20/22延伸酶将EPA转化成DPA；和(6)通过Δ4去饱和酶将DPA转化成DHA。任选地，ω-6脂肪酸可转化成ω-3脂肪酸；例如，ETA和EPA通过Δ17去饱和酶活性分别从DGLA和ARA生成。
[0321] 用于生物合成ω-3/ω-6脂肪酸的替代途径利用Δ6去饱和酶和C18/20延伸酶(还称为Δ6延伸酶，这些术语可互换使用)(即，“Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径”)。更具体地讲，LA和ALA可通过Δ6去饱和酶分别转化成GLA和STA；然后，C18/20延伸酶将GLA转化成DGLA 和/或将STA转化成ETA。
[0322] 预期需要在特定宿主生物中导入用以产生ω-3/ω-6脂肪酸的特定功能将取决于宿主细胞(及其天然的PFUA概况和/或去饱和酶/延伸酶概况)、底物的可利用性和所需的终产物。例如Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达在一些实施方案中是优选的，但它会抑制Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径的表达，因为经由前者产生的PUFA缺乏GLA。
[0323] 本领域技术人员将能够鉴定多种编码ω-3/ω-6脂肪酸生物合成所需的每种酶的候选基因。可用的去饱和酶和延伸酶序列可源自任何来源，例如，分离自天然来源(来自细菌、藻类、真菌、植物、动物等)、经由半合成途径产生或从头合成。尽管导入宿主的去饱和酶和延伸酶基因的具体来源不是关键的，但选择具有去饱和酶或延伸酶活性的特定多肽的考虑事项包括：(1)多肽的底物特异性；(2)多肽或其组分是否为限速酶；(3)去饱和酶或延伸酶是否是合成期望的PUFA所必需的；(4)多肽所需的辅因子。和/或，(5)多肽是否在产生后进行修饰(例如通过激酶或异戊烯转移酶)。表达的多肽优选具有与它在宿主细胞中的位置的生化环境相容的参数(其他详细信息参见美国专利公开7,238,482)。
[0324] 在另外的实施方案中，考虑每种特定的去饱和酶和/或延伸酶的转化效率也将是有用的。更具体地讲，由于每种酶极少能以100％的效率将底物转化成产物，宿主细胞所产生的未纯化的油的最终脂质概况将通常是由期望的ω-3/ω-6脂肪酸及多种上游PUFA中间产物组成的多种PUFA的混合物。因此，当最优化所需的脂肪酸的生物合成时，每种酶的转化效率也是一个要考虑的变量。
[0325] 考虑到上述各个考虑事项，具有合适去饱和酶和延伸酶活性(如Δ6去饱和酶、C18/20延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、Δ9延伸酶、Δ8去饱和酶、Δ4去饱和酶、C20/22延伸酶和DHA合酶)的候选基因可根据可公开获得的文献(如GenBank)、专利文献和对具有产生PUFA能力的生物的实验分析来鉴定。这些基因将适用于导入到特定的宿主生物中，以使该生物能合成PUFA或增强生物合成PUFA。
[0326] 复合酶和接头
[0327] 在一个实施方案中，本发明涉及包括具有至少两种独立的和可分的 酶活性的单一多肽的复合酶。
[0328] 合适酶活性的实例包括延伸酶、脂肪酸去饱和酶、转移酶、酰基CoA合酶和硫酯酶。例如，合适的脂肪酸去饱和酶包括但不限于：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶和/或Δ17去饱和酶。合适延伸酶的实例包括但不限于：Δ9延伸酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶和/或C20/22延伸酶。
[0329] 合适转移酶的实例包括但不限于酰基转移酶如甘油3-磷酸O-酰基转移酶(也称为甘油磷酸酰基转移酶或甘油-3-磷酸酰基转移酶；GPAT)、2-酰基甘油O-酰基转移酶、1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶(也称为1-酰基甘油-磷酸酰基转移酶或溶血磷脂酸酰基转移酶；AGPAT或LPAAT或LPAT)、2-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶、1-酰基甘油胆碱磷酸O-酰基转移酶(也称为溶血卵磷脂酰基转移酶或溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶；
AGPCAT或LLAT或LPCAT)、2-酰基甘油胆碱磷酸O-酰基转移酶、二酰基甘油O-酰基转移酶(也称为甘油二酯酰基转移酶；DAGAT或DGAT)和磷脂：二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)。
[0330] 合适酰基CoA合酶的实例包括但不限于长链脂肪酸CoA连接酶(也称为酰基活化酶或酰基CoA合酶)。
[0331] 合适硫酯酶的实例包括但不限于油酰-[酰基-载体-蛋白]水解酶(也称为酰基-[酰基-载体-蛋白]水解酶、酰基-ACP-水解酶或酰基-ACP-硫酯酶)。
[0332] 优选地，本复合酶应具有包括连接到至少一种脂肪酸去饱和酶的至少一种脂肪酸延伸酶的酶活性。
[0333] 用于形成复合酶的连接最低限度应由单个多肽键构成。在另一方面，该连接可由一个氨基酸残基(例如脯氨酸)或一个多肽构成。如果该连接是一个多肽，则期望该连接具有至少一个脯氨酸残基。
[0334] 优选地，本发明的复合酶包括连接到第二酶活性的第一酶活性，并且所述连接选自多肽键、SEQ ID NO：198(EgDHAsynl接头)、SEQ IDNO：200(EgDHAsyn2接头)、SEQ ID NO：235(EaDHAsynl接头)、SEQID NO：472、SEQ ID NO：504和修饰解脂耶氏酵母接头(SEQ ID NO：438和445)。
[0335] 用于制备复合酶的方法也在本发明的范围内，所述方法包括：
[0336] (a)使第一多肽与至少第二多肽连接，其中每个多肽具有独立的和可分的酶活性；并且
[0337] (b)评估步骤(a)产物的独立的和可分的酶活性。
[0338] 如上所述，酶活性选自脂肪酸延伸酶、脂肪酸去饱和酶、酰基转移酶、酰基CoA合酶和硫酯酶。优选地，酶活性包括连接到至少一种脂肪酸去饱和酶的至少一种脂肪酸延伸酶。
[0339] 上文讨论了合适的去饱和酶、延伸酶和接头的实例。
[0340] 虽然上文描述了复合酶的多个实例，但DHA合酶(包括C20延伸酶活性和Δ4去饱和酶活性)和DGLA合酶(包括Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶活性)受到了特别的关注。本文所述数据证实每个合酶中两个结构域的连接导致效率或流量比酶结构域以独立部分存在时(即，在复合酶中未连接在一起时)观察到的效率或流量增加。
[0341] 例如，当包括小眼虫C20延伸酶结构域和聚合裂殖壶菌Δ4去饱和酶的复合酶在解脂耶氏酵母中表达时，融合构建体中的Δ4去饱和酶活性比单独表达时的活性高2至3倍(实施例28)。同样的，当小眼虫C20延伸酶结构域-聚合裂殖壶菌Δ4去饱和酶融合体在大豆中以复合酶表达时，测量到的EPA到DHA的流量比两种酶单独表达时的流量要高(实施例49)。
[0342] 在制备的多种DGLA合酶中也证明了效率(或LA到DGLA的流量)的提高。使用多个Δ9延伸酶的组合制备一系列六个Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶融合构建体，所述延伸酶来源于小眼虫、Euglena anabenaUTEX373和小型绿藻属CCMP389，所述Δ8去饱和酶来源于小眼虫和Euglena anabenaUTEX 373；这些酶在解脂耶氏酵母中各自表达(分别见实施例55和56)。在所有情况下，在耶氏酵母属中表达的融合基因具有比单个基因单独表达时更高的活性。这些数据再次证实在融合蛋白中Δ9延伸酶的产物可直接作为Δ8去饱和酶的底物。本领域的技术人员将能够使用本文教导以创造具有更高效率或流量的多个其他复合酶。因此，本发明涉及使用来源于本发明序列的接头制备的任何复合酶。优选的复合酶是那些结合PUFA生物合成途径中的多种基因的复合酶。
[0343] 新型DHA合酶的序列鉴定
[0344] 在本发明中，已经从小眼虫和Euglena anabena中分离出了编码DHA合酶的核苷酸序列，下文表4综述了这些序列。
[0345] 表4
[0346] 眼虫DHA合酶摘要
[0347]
[0348] 在一些实施方案中，可对本EgDHAsyn1、EgDHAsyn2、EaDHAsyn1、EaDHAsyn2和EaDHAsyn3 DHA合酶序列进行密码子优化用于在特定宿主生物中表达。如本领域所熟知的，这可以是进一步优化该酶在替代宿主中表达的有用手段，因为使用宿主优选的密码子能够大幅增强编码该多肽的外来基因的表达。例如对EgDHAsyn1进行密码子优化用于在解脂耶氏酵母中表达(实施例54)，从而产生EgDHAsyn1S(在美国专利公开7,238,482和美国专利公开7,125,672中提出)。
[0349] 本领域技术人员将能够使用本文教导，基于上文表4中所述的野生型EgDHAsyn1、EgDHAsyn2、EaDHAsyn1、EaDHAsyn2和/或EaDHAsyn3序列，创造多个其他的适于在替代宿主中最佳表达的、经密码子优化的DHA合酶蛋白。因此，本发明涉及任何来源于本发明野生型序列的、经密码子优化的DHA合酶蛋白。在一些优选实施方案中，期望修改一部分编码EgDHAsyn1、EgDHAsyn2、EaDHAsyn1、EaDHAsyn2和/或EaDHAsyn3的密码子以提供宿主生物中的基因表达，所述宿主包括但不 限于植物或植物部分。
[0350] 在另一个实施方案中，本发明涉及编码DHA合酶的分离多核苷酸，所述多核苷酸包括：
[0351] (a)编码具有DHA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法在与如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：95、SEQID NO：96、或SEQ ID NO：97所示出的氨基酸序列进行比较时，所述多肽具有至少80％的氨基酸同一性；
[0352] (b)编码具有DHA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTN比对方法在与如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、或SEQ ID NO：410所示出的核苷酸序列进行比较时，所述核苷酸序列具有至少80％的序列同一性；
[0353] (c)编码具有DHA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在严格条件下与如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：205、或SEQ ID NO：410所示出的核苷酸序列杂交；或
[0354] (d)(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100％互补。
[0355] 在另一方面，本发明涉及一种分离多核苷酸，所述多核苷酸包括：
[0356] (a)编码具有DHA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法在与如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、或SEQ ID NO：411所示出的氨基酸序列进行比较时，所述多肽具有至少80％的氨基酸同一性；
[0357] (b)编码具有DHA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTN比对方法在与如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、或SEQ ID NO：410所示出的核苷酸序列进行比较时，所述核苷酸序列具有至少80％的序列同一性；
[0358] (c)编码具有DHA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在严格条件下与如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、或SEQ ID NO：410所示出的核苷酸序列杂交；或
[0359] (d)(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100％互补。
[0360] 优选地，编码DHA合酶的分离多核苷酸包括在SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、或SEQ ID NO：410中任一种所示出的序列。
[0361] 同源物的鉴定和分离
[0362] 可使用任何本DHA合酶序列(即，EgDHAsyn1、EgDHAsyn2、EaDHAsyn1、EaDHAsyn2和EaDHAsyn3)或其部分在相同或其他细菌、藻类、真菌、类眼虫或植物物种中使用序列分析软件搜索DHA合酶的同源物。通常，这种计算机软件通过将同源的程度分配给多种置换、缺失和其他修饰来匹配相似的序列。
[0363] 备选地，任何本发明的DHA合酶序列或其部分也可以用作杂交试剂用以鉴定DHA合酶同源物。核酸杂交试验的基本组成包括探针、怀疑含有目的基因或基因片段的样品及特定的杂交方法。本发明的探针通常是与待检测核酸序列互补的单链核酸序列。探针与待检测的核酸序列是“可杂交的”。尽管探针的长度可在5个碱基到数万个碱基之间变化，但通常约15个碱基到约30个碱基的探针长度是合适的。只需要探针分子的部分与待检测的核酸序列互补。另外，探针和靶序列之间不需要完全互补。杂交确实可以在并不完全互补的分子之间发生，结果是杂交区内的某些碱基没有与正确的互补碱基配对。
[0364] 杂交方法是有严格规定的。通常探针和样品必须在允许核酸杂交的条件下混合。这涉及在正确浓度和温度条件下在存在无机或有机盐时使探针和样品接触。探针和样品核酸必须接触足够长的时间，使探针和样品核酸之间的任何可能的杂交都可发生。混合物中的探针或标记的浓度将决定杂交发生所需的时间。探针或靶标的浓度越高，所需的杂交孵育时间就越短。任选地，可以加入离液剂(如氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾和三氟乙酸铯)。如果需要，可以将甲酰胺加入到杂交混合物中，通常为30-50％(v/v)。
[0365] 可以采用多种杂交溶液。通常，这些杂交溶液包含约20％至60％体积，优选30％体积的极性有机溶剂。普通的杂交溶液采用约30-50％v/v甲酰胺、约0.15至1M氯化钠、约0.05至0.1M缓冲液(如柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围约6-9))、约0.05至0.2％去 污剂(如十二烷基硫酸钠)或0.5-20mM的EDTA、FICOLL(Pharmacia Inc.)(约300-500千道尔顿(kdal))、聚乙烯吡咯烷酮(约250-500千道尔顿)和血清白蛋白。一般的杂交溶液还将包含约0.1至5mg/mL未经标记的载体核酸、片段化的核酸DNA(如小牛胸腺或鲑精DNA或酵母RNA)，以及任选约0.5％至2％重量/体积的甘氨酸。还可以包含其他添加剂，例如包括多种极性水溶性或可膨胀试剂(如聚乙二醇)、阴离子聚合物(如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯)和阴离子糖类聚合物(如硫酸葡聚糖)在内的体积排阻剂。
[0366] 核酸杂交可适用于多种测定形式。最合适的方法形式之一是夹心测定形式。夹心测定尤其适用于在非变性条件下杂交。夹心型测定的主要成分是固体支持体。固体支持体具有吸附或共价连接至其上的固定核酸探针，该探针未经标记并且与序列的一部分互补。
[0367] 在另外的实施方案中，本文描述的任何DHA合酶核酸片段(或其鉴定的任何同源物)都可用于从相同的或其他细菌、藻类、真菌、类眼虫或植物物种中分离编码同源蛋白质的基因。使用序列依赖性规程分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖性规程的实例包括但不限于：(1)核酸杂交方法；(2)DNA和RNA扩增方法，这可通过核酸扩增技术的多种用法例证[如聚合酶链反应(PCR)，Mullis等人、美国专利4,683,202；连接酶链反应(LCR)，Tabor等人、Proc.Acad.Sci.USA82：1074(1985)；或链置换扩增(SDA)，Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392(1992)]；和3.)文库构建和互补筛选方法。
[0368] 例如，能使用本领域技术人员所熟知的方法，通过使用所有或部分本发明核酸片段作DNA杂交探针以筛选来自例如任何所需酵母或菌类(其中优选那些产生DTA、DPAn-6、DPA和/或DHA的生物)的文库，直接分离编码与本文所述复合酶或其单个结构域(如DHA合酶)相似的蛋白或多肽的基因。基于本发明的核酸序列的特异性寡核苷酸探针可通过本领域已知的方法(Maniatis，同上)设计和合成。而且，整个序列可直接用于通过熟练技术人员已知的方法(如随机引物DNA标记、切口平移或末端标记技术)合成DNA探针，或使用可获得的体外转录体系合成RNA探针。另外，可设计特异性引物并将其用于扩增部分(或全长)的本发明序列。所得的扩增产物可在扩增反应过程中直接标记或在扩增反应后标记，并用作探针来在合适的严格条件下分离全长的DNA 片段。
[0369] 通常，在PCR类型的扩增技术中，引物具有不同的序列而且彼此之间不互补。取决于所需的检测条件，应该设计引物序列以便提供既有效又可靠的靶核酸的复制。PCR引物设计方法是本领域常见且熟知的(Thein和Wallace，“The use of oligonucleotide as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders”、in Human Genetic Diseases：A Practical Approach，K.E.Davis 编 辑，(1986)pp 33-50，IRL：Herndon，VA；以及Rychlik，W.，In Methods in Molecular Biology，White，B.A.Ed.，(1993)Vol.15，pp 31-39，PCR Protocols：Current Methods and Applications.Humania：Totowa，NJ)。
[0370] 通常，可以将本发明序列的两个短片段在PCR规程中用于从DNA或RNA扩增编码同源基因的更长的核酸片段。PCR也可以用克隆的核酸片段的文库进行，其中一个引物的序列源自本发明的核酸片段，而另一个引物的序列利用编码真核基因的mRNA前体的3′端的多腺苷酸片的存在。
[0371] 备选地，第二个引物序列可以基于来源于克隆载体的序列。例如，技术人员可以按照RACE规程(Frohman等人，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.，85：8998(1988))，通过用PCR扩增在转录物内单个位点与3′或5′端之间的区域的拷贝来产生cDNA。以3′和5′方向取向的引物可用本发明的序列设计。使用可商业获得的3′RACE或5′RACE体系(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)，可以分离特异性的3′或5′cDNA片段(Ohara等人，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.，86：5673(1989)；Loh等人，Science，243：217(1989))。
[0372] 在其他实施方案中，可以改变任何所述酶(例如本文所述的复合酶、DHA合酶、或单个结构域)。如本领域的技术人员所熟知的，体外诱变和选择、化学诱变、“基因改组(gene shuffling)”法或其他手段可用于获得天然存在的基因的突变。作为另外一种选择，可通过结构域交换合成复合酶，其中来自任何酶的功能结构域可以与供选择酶中的功能结构域交换或添加到替代酶中以产生新型蛋白。
[0373] 新型C20延伸酶的序列鉴定
[0374] 在本发明中，已经从小眼虫和Euglena anabena中分离出了编码C20延伸酶的核苷酸序列，下文表5综述了这些序列。
[0375] 表5
[0376] 眼虫C20延伸酶摘要
[0377]
[0378] 本发明涉及编码C20延伸酶的分离多核苷酸，所述多核苷酸包括：
[0379] (a)编码具有C20延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法在与如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97；SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：231、SEQ ID NO：232、或SEQ ID NO：233所示出的氨基酸序 列进行比较时，所述多肽具有至少80％的氨基酸同一性；
[0380] (b)编码具有C20延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTN比对方法在与如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：229、或SEQ ID NO：230所示出的核苷酸序列进行比较时，所述核苷酸序列具有至少80％的序列同一性；
[0381] (c)编码具有C20延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在严格条件下与如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：230所示出的核苷酸序列杂交；或[0382] (d)(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100％互补。
[0383] 优选地，编码C20延伸酶的分离多核苷酸，所述多核苷酸包括如SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：229、或SEQ ID NO：230中任一种所示出的序列。
[0384] 新型Δ4去饱和酶的序列鉴定
[0385] 在本发明中，已经从小眼虫和Euglena anabena中分离出了编码Δ4去饱和酶的核苷酸序列，下文表6综述了这些序列。
[0386] 表6
[0387] 眼虫Δ4去饱和酶摘要
[0388]
[0389] *注：Δ4去饱和酶结构域1不包括得自DHA合酶的富含脯氨酸的接头。相反地，Δ4去饱和酶结构域2包括得自DHA合酶的富含脯氨酸的接头。
[0390] 在可供选择的实施方案中，本文Δ4去饱和酶结构域序列可进行密码子优化用于在特定宿主生物中表达。例如，可对Euglena anabenaΔ4去饱和酶结构域EaDHAsyn2进行密码子优化用于在解脂耶氏酵母中表达。例如，小眼虫Δ4去饱和酶结构域EgDHAsyn1也经密码子优化用于在解脂耶氏酵母中表达。本领域的技术人员将能够使用本文教导，基于如上表6中所述的野生型Δ4去饱和酶结构域序列EgDHAsyn1、EgDHAsyn2、EaDHAsyn1、EaDHAsyn2和/或EaDHAsyn3，创造多个其他的适于在替代宿主中最佳表达的、经密码子优化的Δ4去饱和酶蛋白。 因此，本发明涉及任何来源于本发明野生型序列的、经密码子优化的Δ4去饱和酶蛋白。在一些优选实施方案中，期望修改一部分编码Δ4去饱和酶结构域序列EgDHAsyn1、EgDHAsyn2、EaDHAsyn1、EaDHAsyn2和/或EaDHAsyn3的密码子以提供宿主生物中的基因表达，所述宿主包括但不限于植物或植物部分。
[0391] 此外，基于观察结果DHA合酶的C20延伸酶结构域的C-末端部分与Δ4去饱和酶结构域的N末端部分出现重叠，对此进行功能性分析以确定最佳功能性Δ4去饱和酶结构域。如下文实施例51和53所述，使用经密码子优化的蛋白序列EaD4S(SEQ ID NO：193)和EgD4S(SEQ ID NO：388)进行删除诱变研究。制备了以下变体：EaD4S-3(SEQ ID NO：386)、EaD4S-2(SEQ ID NO：384)、EaD4S-1(SEQ ID NO：382)、EgD4S-3(SEQ ID NO：408)、EgD4S-2(SEQ ID NO：406)和EgD4S-1(SEQ ID NO：404)。
[0392] 本领域技术人员将认识到，因为这些来自小眼虫和Euglena anabena的特定Δ4去饱和酶序列的确切范围仍未确定，长度增加或减少的蛋白片段或多肽可具有可比较的Δ4去饱和酶活性。同样的，基于如上表6中所述的野生型Δ4去饱和酶结构域序列EgDHAsyn1、EgDHAsyn2、EaDHAsyn1、EaDHAsyn2和/或EaDHAsyn3，易于进行可比较的截短以制备具有足够量Δ4去饱和酶活性的Δ4去饱和酶，其中优选等同的或增加的Δ4去饱和酶活性。
[0393] 因此，本发明还涉及编码Δ4去饱和酶的分离多核苷酸，所述多核苷酸包括：
[0394] (a)编码具有Δ4去饱和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法在与如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：221、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：240、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：382、SEQ ID NO：384、SEQ ID NO：386、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：404、SEQ ID NO：406、或SEQ ID NO：408所示出的氨基酸序列进行比较时，所述多肽具有至少80％的氨基酸同一性；
[0395] (b)编码具有Δ4去饱和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于 BLASTN比对方法在与如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：220、SEQ ID NO：236、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：244、SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：381、SEQ ID NO：383、SEQ ID NO：385、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：403、SEQ ID NO：405或SEQ ID NO：407所示出的核苷酸序列进行比较时，所述核苷酸序列具有至少80％的序列同一性；
[0396] (c)编码具有Δ4去饱和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在严格条件下与如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：220、SEQ ID NO：236、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：244、SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：
192、SEQ ID NO：381、SEQ ID NO：383、SEQ ID NO：385、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：403、SEQ ID NO：405或SEQ ID NO：407所示出的核苷酸序列杂交；或
[0397] (d)(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100％互补。
[0398] 优选地，编码Δ4去饱和酶的分离多核苷酸包括如SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：220、SEQ ID NO：236、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：244、SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：381、SEQ ID NO：383、SEQ ID NO：385、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：403、SEQ ID NO：405、或SEQ ID NO：407中任一种所示出的序列。
[0399] 截短Euglena anabenaΔ4去饱和酶的效应是酶活性当与野生型序列酶活性相比较时提高。该结果是未预料到的和未被预知的，因为本领域的普通技术人员将预期截短序列的活性不会高于并可能低于野生型序列的活性。因此，本发明还提供一种用于获得比野生型序列活性更高的Δ4去饱和酶的新方法，该方法包括：a)提供一种野生型Δ4去饱和酶多肽，它分离自Euglena anabena，具有基线Δ4去饱和酶活性；和b)使(a)的野生型多肽截短约1至约200个氨基酸以形成截短的突变型多肽，它具有比基线Δ4去饱和酶活性更高的Δ4去饱和酶活性。将在此上下文中所用的“基线”活性定义为按照本文所述标准酶规程在体内 或体外测得的野生型酶的活性。
[0400] 在其他实施方案中，可改造本文鉴定的任何酶(例如复合酶、DHA合酶、C20延伸酶、Δ4去饱和酶和/或任何同源物)以生成新的和/或改善的PUFA生物合成途径酶。如本领域的技术人员所熟知的，体外诱变和选择、化学诱变、“基因改组”法或其他手段可用于获得天然存在的基因的突变。作为另外一种选择，可通过结构域交换合成复合酶，其中来自任何酶的功能结构域可以与供选择酶中的功能结构域交换或添加到替代酶中以产生新型蛋白。
[0401] 用于产生多种ω-3和/或ω-6脂肪酸的方法
[0402] 期望在合适启动子控制下导入编码本文所述DHA合酶的嵌合基因(即EgDHAsyn1、EgDHAsyn2、EaDHAsyn1、EaDHAsyn2和EaDHAsyn3或其他突变酶、经密码子优化的酶或它们的同源物)，这将导致经转化宿主生物中的DTA、DPAn-6、DPA和/或DHA生产分别增加。同样的，本发明包括直接产生PUFA的方法，该方法包括使脂肪酸底物(即EPA或DPA)受到本文所述的DHA合酶的作用(例如EgDHAsyn1、EgDHAsyn2、EaDHAsyn1、EaDHAsyn2和EaDHAsyn3)，使得底物被转化为所需的脂肪酸产物(即DHA)。
[0403] 更具体地讲，本发明涉及一种用于转化宿主细胞使得宿主细胞在其基因组中包含本发明的重组构建体的方法。
[0404] 合适的宿主细胞的实例包括但不限于植物和酵母。优选地，植物细胞获自油料种子植物如大豆等，酵母细胞获自含油酵母如耶氏酵母菌种。
[0405] 用于制备经转化的植物或酵母的方法也在本发明的范围内，该方法包括用本发明的任何多核苷酸转化植物细胞或酵母细胞并从转化过的植物细胞再生植物或生长转化过的酵母细胞。
[0406] 更具体地讲，本发明的目的是提供用于在宿主细胞(例如植物、含油酵母)中产生DPAn-6或DHA的方法，其中宿主细胞包括：
[0407] (i)编码具有DHA合酶活性的多肽的分离核苷酸分子，其中基于Clustal V比对方法在与如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、或SEQ ID NO：97所示出的氨基酸序列进行比较时，所述多肽具有至少80％的氨基酸同一性；和，
[0408] (ii)ARA或EPA源；
[0409] 其中使所述宿主细胞在使得具有DHA合酶活性的多肽被表达并且ARA被转化成DPAn-6和/或EPA被转化成DHA的条件下生长，并且其中任选回收DPAn-6或DHA。
[0410] 在可供选择的实施方案中，本发明涉及用于在宿主细胞(例如植物、含油酵母)中产生DTA或DPA的方法，其中宿主细胞包括：
[0411] (i)编码具有C20延伸酶活性的多肽的分离核苷酸分子，其中基于Clustal V比对方法所在与如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97；SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：231、SEQ ID NO：232、或SEQ ID NO：233所示出的氨基酸序列进行比较时，述多肽具有至少80％的氨基酸同一性；和，
[0412] (ii)ARA或EPA源；
[0413] 其中使所述宿主细胞在使得具有C20延伸酶活性的多肽被表达并且ARA被转化成DTA和/或EPA被转化成DPA的条件下生长，并且其中任选回收DTA或DPA。
[0414] 此外，本发明提供用于产生DPAn-6或DHA的方法，其中所述宿主细胞包括：
[0415] (i)编码具有Δ4去饱和酶活性的多肽的分离核苷酸分子，其中基于Clustal V比对方法在与如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：221、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：240、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：382、SEQ ID NO：
384、SEQ ID NO：386、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：404、SEQ ID NO：406、或SEQ ID NO：408所示出的氨基酸序列进行比较时，所述多肽具有至少80％的氨基酸同一性；和，
[0416] (ii)DTA或DPA源；
[0417] 其中使所述宿主细胞在使得具有Δ4去饱和酶活性的多肽被表达并且DTA被转化成DPAn-6和/或DPA被转化成DHA的条件下生长，并且其中任选回收DPAn-6或DHA。
[0418] 上述任何方法中使用的底物ARA、DTA、EPA或DPA源可通过天然宿主或转基因宿主产生，或由外源提供。
[0419] 连接单个结构域以形成复合酶可能导致中间体脂肪酸的减少。例如，在复合酶如DHA合酶中连接C20延伸酶和Δ4去饱和酶可导致DHA 生产期间的中间体脂肪酸DPA减少。同样的，使用EgDHAsyn1接头连接Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶以形成如本文所述的复合酶可导致产生DGLA和ETA，以及EDA和ERA中间体减少。
[0420] 作为另外一种选择，可间接使用本文所述的包括DHA合酶的每个复合酶基因以及它们对应的酶产物来产生多种ω-6和ω-3 PUFA，包括例如DTA、DPAn-6、DGLA、ETA、ARA、EPA、DPA和/或DHA(图1；参见美国专利公开7,238,482)。发生了间接产生ω-3/ω-6 PUFA，其中脂肪酸底物经由中间步骤或途径中间产物间接转化成期望的脂肪酸产物。因此，预期本文所述的DHA合酶(即，EgDHAsyn1、EgDHAsyn2、EaDHAsyn1、EaDHAsyn2和EaDHAsyn3、或其他突变酶、经密码子优化的酶或它们的同源物)可结合表达编码PUFA生物合成途径的附加酶(例如Δ6去饱和酶、C18/20延伸酶、Δ17去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、Δ9延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶、C20/22延伸酶、DHA合酶)以产生高含量的长链ω-3/ω-6脂肪酸(例如ARA、DTA、DPAn-6、EPA、DPA和/或DHA)。
[0421] 包含于具体表达盒中的特定基因将取决于宿主细胞(和它的PFUA概况和/或去饱和酶/延伸酶概况)、底物的可利用性和期望的终产物。
[0422] 有时期望最小化副产物脂肪酸。相对丰富的副产物脂肪酸可通过用接头连接单个途径酶以形成复合酶来减少。例如，可认为存在的金松烯酸(sciadonic acid，SCI)和/或杜松烯酸(juniperonic acid，JUP)[通常存在于裸子植物的种子脂质中(Wolff等人，Lipids 35(1)：1-22(2000))，如在松科家族(松树)中的那些裸子植物]是Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径或Δ9-延伸酶/Δ8去饱和酶途径的副产物脂肪酸。虽然认为这些脂肪酸本身具有多种健康促进性质(Nakane等人，Biol.Pharm.Bull.23：758-761(2000))，取决于应用可能不期望它们在工程化PUFA途径中作为副产物脂肪酸存在，如在含油种子作物中。例如，使用接头连接Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶以形成复合酶(DGLA和/或ETA合酶)可导致流量增加，通过这些步骤导致Δ5去饱和酶可用的EDA/ERA中间体脂肪酸减少，并因此降低了SCI和JUP的浓度。
[0423] 有时候，Δ6延伸酶可延长除目标脂肪酸之外的脂肪酸。例如，Δ6延伸酶一般将GLA转化成DGLA，但是一些Δ6延伸酶也可将非预期底 物如LA或ALA分别转化成EDA或ETrA。在Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径中，认为EDA和ETrA是“副产物脂肪酸”。将Δ8去饱和酶加入到Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径中可提供一种将“副产物脂肪酸”EDA和ETrA分别反转化成“中间体脂肪酸”DGLA和ETA的方法。
[0424] 在可供选择的实施方案中，基于本文描述的完整序列、那些完整序列的互补序列、那些序列的基本部分、源于那些序列的经密码子优化的去饱和酶以及那些与其基本同源的序列，破坏宿主生物内的天然DHA合酶、C20延伸酶、或Δ4去饱和酶可能是有用的。
[0425] 植物表达系统、表达盒和载体、以及转化
[0426] 在一个实施方案中，本发明涉及包括本发明任何一种分离多核苷酸的重组构建体，将所述多核苷酸可操纵地连接到至少一种适于在宿主细胞如植物中表达的调控序列。启动子是引导植物细胞机制从启动子的邻接编码序列下游(3′)产生RNA的DNA序列。启动子区域影响速率、发育阶段和其中进行基因RNA转录的细胞型。加工RNA转录物以产生mRNA，它作为RNA序列翻译成编码多肽的氨基酸序列的模板。5′非翻译引导序列是蛋白编码区域的mRNA上游区域，它可以在启动和mRNA翻译中起到作用。3′转录终止/聚腺苷酸化信号是蛋白编码区域的非翻译下游区域，它在植物细胞中起到引起RNA转录终止和将多腺苷酸核苷酸添加到RNA3′末端的功能。
[0427] 只要它具有足够的转录活性，通过在正确时间、在所需宿主组织中表达所需核酸片段的可翻译mRNA以完成本发明，经选择用于促进复合酶编码序列表达的启动子的起源是不重要的。可使用异源或非异源(即，内源)启动子实施本发明。例如，植物中合适的启动子包括但不限于：β-伴大豆球蛋白α亚基启动子、Kunitz胰蛋白酶抑制剂3启动子、膜联蛋白启动子、大豆球蛋白Gyl启动子、β-大豆伴球蛋白β-亚基启动子、P34/Gly Bd m30K启动子、白蛋白启动子、Leg A1启动子和Leg A2启动子。
[0428] 在PCT公开WO 2004/071178(公布于2004年8月26日)中描述了膜联蛋白或P34启动子。膜联蛋白启动子的活性水平比得上多种已知强启动子的活性水平，例如：(1)CaMV35S启动子(Atanassova等人，Plant Mol.Biol.37：275-285(1998)；Battraw和Hall，Plant Mol.Biol.15：527-538(1990)；Holtorf等人，Plant Mol.Biol.29：637-646(1995)； Jefferson 等 人，EMBO J.6：3901-3907(1987)；Wilmink 等 人，Plant Mol.Biol.28：
949-955(1995))；(2)鼠耳芥属油质蛋白启动子(Plant等人，Plant Mol.Biol.25：
193-205(1994)；Li，Texas A&M University Ph.D.dissertation，pp.107-128(1997))；(3)鼠耳芥属泛素延伸蛋白启动子(Callis等人，J Biol.Chem.265(21)：12486-93(1990))；
(4)番茄泛素基因启动子(Rollfinke等人，Gene.211(2)：267-76(1998))；(5)大豆热激蛋白启动子(Schoffl等人，Mol Gen Genet.217(2-3)：246-53(1989))；和，(6)玉米H3组蛋白基因启动子(Atanassova等人，Plant Mol Biol.37(2)：275-85(1989))。
[0429] 膜联蛋白启动子的另一个有用特性是其在发育种子中的表达谱。膜联蛋白启动子在种子发育早期阶段(在授粉后10天之前)活性最强，在晚期阶段很大程度上静止。膜联蛋白表达谱不同于多种种子特异性启动子的表达谱，例如，种子贮藏蛋白启动子，它经常在发育晚期阶段提供最高活性(Chen等人，Dev.Genet.10：112-122(1989)；Ellerstrom等 人，Plant Mol.Biol.32：1019-1027(1996)；Keddie 等 人，Plant Mol.Biol.24：327-340(1994)；Plant等人，(同上)；Li，(同上))。膜联蛋白启动子具有较常规的表达谱，但不同于其他种子特异性启动子。因此，当期望在早期发育阶段过表达或抑制胚芽中的基因时，膜联蛋白启动子将是一个非常具有吸引力的候选。例如，可期望过表达调节早期胚芽发育的基因或涉及种子成熟前代谢的基因。
[0430] 在鉴定了适于表达特定DHA合酶编码序列的合适启动子之后，使用本领域的技术人员所熟知的常规方法将启动子可操纵地在正义方向上连接。
[0431] 本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，New York，1989(在下文中“Sambrook等人，1989”)或Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.和Struhl，K.，Eds.；In Current Protocols in Molecular Biology；John Wiley和Sons：New York，1990(在下文中“Ausubel等人，1990”)。例如，可通过框内连接至少两个DNA片段来构建融合基因，以便不导入终止密码子(框内融合)。
所得融合基因将使得每个 DNA片段编码至少一个独立的和可分的酶活性。
[0432] 一旦制备了重组构建体，然后可通过本领域普通技术人员熟知的方法(例如转染、转化和电穿孔)将它导入选定的植物细胞。油料种子植物细胞是优选的植物细胞。然后在允许表达长链PUFA的合适条件下培养和再生转化过的植物细胞，所述长链PUFA随后被回收并纯化。
[0433] 也可将本发明的重组构建体导入一种植物细胞；或者，作为另外一种选择，可将每个构建体导入到分开的植物细胞中。
[0434] 植物细胞中的表达可在如上文所述的瞬时的或稳定的融合体中完成。
[0435] 可在种子中表达所需长链PUFA。获自此类经转化过的植物的种子或植物部分也在本发明的范围内。
[0436] 植物部分包括分化和未分化的组织，包括但不限于下列部分：根、茎、芽、叶、花粉、种子、肿瘤组织和多种形式的细胞和培养物(例如单个细胞、原生质体、胚和愈伤组织)。植物组织可存在于植株或植物器官、组织或细胞培养物中。
[0437] 术语“植物器官”是指构成植株的形态和功能不同部分的植物组织或组织群。术语“基因组”是指：(1)存在于生物体的每一个细胞或者病毒或细胞器中的全套遗传物质(基因和非编码序列)；和/或(2)作为(单倍体)单位从一个亲本遗传的全套染色体。
[0438] 因此，本发明还涉及用于转化细胞的方法，所述方法包括用本发明重组构建体转化细胞以及选择那些用权利要求中所述重组构建体转化过的细胞。
[0439] 还关注用于生产转化植物的方法，所述方法包括用本发明的任何多核苷酸转化植物细胞以及从转化过的植物细胞再生植物。
[0440] 已经公布了转化双子叶植物(主要通过使用根癌土壤杆菌)和获取转基因植物等等的方法，用于：棉花(美国专利公开5,004,863；美国专利公开5,159,135)；大豆(美国专利公开5,569,834；美国专利公开5,416,011)；芸苔属植物(美国专利公开5,463,174)；花生(Cheng等人Plant Cell Rep.15：653-657(1996)；McKently等人Plant Cell Rep.14：699-703(1995))；番木瓜果(Ling，K.等人Bio/technology 9：752-758(1991))；和豌豆(Grant等人Plant Cell Rep.15：254-258(1995))。对其他常用植物转化方法的回顾参见Newell，C.A.(Mol.Biotechnol. 16：53-65(2000))。这些转化方法的其中一个使用发根土壤杆菌(Tepfler，M.和Casse-Delbart，F.Microbiol.Sci.4：24-28(1987))。已经公布了使用DNA直接递送转化大豆的方法，如使用PEG融合(PCT公开WO 92/17598)、电穿孔(Chowrira、G.M.等人，Mol.Biotechnol.3：17-23(1995)；Christou、P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：3962-3966(1987))、显微注射和粒子轰击(McCabe、D.E等人，Bio/Technology 6：923(1988)；Christou等人，Plant Physiol.87：671-674(1988))。
[0441] 存在多种用于从植物组织再生植物的方法。再生的具体方法将取决于起始植物组织以及待再生的具体植物物种。从单植物原生质体转化子或从多种经转化的外植体再生、发育和培育植物是本领域所熟知的(Weissbach和Weissbach(编辑)，载于：Methods for Plant Molecular Biology，(Eds.)，Academic：San Diego，CA(1988))。该再生和生长方法通常包括如下步骤：选择转化的细胞并培养这些单独化的细胞通过胚发育的通常阶段以及通过生根小植株阶段。转基因胚以及种子以类似方式再生。随后将所得的转基因的生根小苗种植在例如土壤之类的合适植物生长培养基中。优选地，将再生的植物进行自授粉以产生纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植株进行杂交。相反，将来自这些重要品系的植物用于给再生植物授粉。利用本领域技术人员所熟知的方法培育含有所需多肽的本发明的转基因植物。
[0442] 除了上文讨论的程序外，从业者还熟悉描述特别条件和程序的标准来源的材料，用于：构建、操纵和分离大分子(例如DNA分子、质粒等)；生成重组DNA片段和重组表达构建体；以及筛选和分离克隆。参见例如：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor：NY(1989)；Maliga 等 人，Methods in Plant Molecular Biology，Cold Spring Harbor：NY(1995)；Birren 等 人，Genome Analysis：Detecting Genes，Vol.1，Cold Spring Harbor：NY(1998)；Birren等人，Genome Analysis：Analyzing DNA，Vol.2，Cold Spring Harbor：NY(1998)；Plant Molecular Biology：A Laboratory Manual，eds.Clark，Springer：NY(1997)。
[0443] 含油种子植物的实例包括但不限于：大豆、芸苔属物种、向日葵、玉米、棉花、亚麻和红花。
[0444] 具有至少二十个碳原子和四个或更多个碳-碳双键的PUFA包括但不限于ω-3脂肪酸如EPA、DPA和DHA。获自此类植物的种子以及获自此类种子的油也在本发明的范围内。
[0445] 因此，本发明还涉及用于改变油料种子植物的脂肪酸分布型的方法，所述方法包括：
[0446] a)用如本发明权利要求所述的重组构建体转化油料种子植物细胞；并且
[0447] b)从步骤(a)的转化油料种子植物细胞再生植物，其中所述植物具有改变了的脂肪酸分布型。
[0448] 微生物表达系统、表达盒和载体
[0449] 还可以在异源微生物宿主细胞尤其是含油酵母细胞(例如解脂耶氏酵母)中制备本文所述的DHA合酶基因和基因产物(即EgDHAsyn1、EgDHAsyn2、EaDHAsyn1、EaDHAsyn2和EaDHAsyn3、或其他突变酶、经密码子优化的酶或它们的同源物)。
[0450] 含有引导外来蛋白质高水平表达的调控序列的微生物表达系统和表达载体是本领域技术人员熟知的。这些表达系统和表达载体的任一种均可用于构建用于产生本发明序列的任何基因产物的嵌合基因。然后可以将这些嵌合基因通过转化导入合适的微生物中以提供所编码的酶的高水平表达。
[0451] 用于转化合适的微生物宿主细胞的载体是本领域众所周知的。存在于构建体中的序列的具体选择取决于期望的表达产物(同上)、宿主细胞的性质以及建议的相对于未转化细胞分离转化细胞的手段。然而，通常该载体包含至少一个表达盒、一个选择性标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的表达盒包括控制转录启动(例如启动子)的基因的5′区域、基因编码序列和控制转录终止(例如终止子)的DNA片段的3′区域。最优选的是，这两个控制区都来源于来自转化的微生物宿主细胞的基因，尽管应当理解这种控制区不必源自选作生产宿主的特定物种的天然基因。
[0452] 在所需微生物宿主细胞中有多个用于促本发明复合酶(如DHA合酶或单个结构域ORF)表达的启动控制区或启动子，本领域的技术人员对它们很熟悉。实际上任何能引导这些基因在所选择的宿主细胞中表达的启动子均适用于本发明。在微生物宿主细胞中的表达可以瞬时的方式 或稳定的方式完成。瞬时表达可通过诱导可操作地连接至目的基因的可调控启动子的活性完成。稳定表达可通过利用可操作地连接至目的基因的组成型启动子实现。举例来说，当宿主细胞为酵母时，提供在酵母细胞中起作用的转录和翻译区，尤其是来自宿主物种的转录和翻译区(例如，对于在解脂耶氏酵母中使用的优选的转录起始调控区，参见美国专利公开7,238,482和PCT公开WO 2006/052870)。可以使用许多调控序列的任意一种，这取决于是期望组成型转录还是诱导型转录、启动子在表达所关注的ORF中的效率、构建容易性等。
[0453] 已经发现围绕翻译起始密码子‘ATG’的核苷酸序列影响酵母细胞的表达。如果所需多肽在酵母中表达差，则可以修饰外源基因的核苷酸序列以包括有效的酵母翻译起始序列来获得最佳的基因表达。对酵母中的表达来说，这可以可通过定点诱变不表达基因来完成，即通过将其融合到外源酵母基因的框架区中，优选高表达的基因。作为另外一种选择，可以测定宿主中的共有翻译起始序列并将其导入异源基因中，用于它们在所关注宿主中的最优化表达。
[0454] 终止区可源于起始区从其获得的基因的3′区或来自不同的基因。大量的终止区是已知的并且(在用于与它们源自的属和物种相同和不同的属和物种两者时)在多种宿主中发挥的功能令人满意。终止区的选择通常更多是为了方便而不是因为任何特殊的性质。终止控制区也可以源于优选宿主天然的多种基因。在可供选择的实施方案中，3’区域也可以是合成的，因为本领域技术人员能利用可用的信息设计并合成用作转录终止子的3’区域序列。任选地，终止位点可以是非必需的；然而，如果包括则是最优选的。
[0455] 如本领域技术人员所意识到的，仅仅将基因插入到克隆载体中不能保证它将被成功地以所需要的水平表达。响应于对高表达率的需要，通过操作许多控制转录、翻译、蛋白质稳定性、氧限制和从微生物宿主细胞分泌方面的不同遗传元件，已经建立了许多专用的表达载体。更具体地讲，已经进行操作来控制基因表达的一些分子特征包括：相关转录启动子和终止子序列的性质；所克隆基因的拷贝数；所述基因是质粒携带的或整合到宿主细胞基因组中去的；所合成的外来蛋白质的最终细胞定位；蛋白质在宿主生物内的翻译和正确折叠的效率；所克隆基因的mRNA和蛋白质在宿主细胞内的固有稳定性；和所克隆基因中的密码子 使用，以使得其频率与宿主细胞的优选密码子使用频率接近。本发明包括各种类型的修饰，作为进一步优化本文所述DHA合酶表达的方法。
[0456] 微生物宿主细胞的转化
[0457] 一旦获得了适于在合适的宿主细胞(例如含油酵母)中表达的表达盒(例如包括启动子、ORF和终止子的嵌合基因)，将其导入能够在酵母细胞中自主复制的质粒载体中，或将其直接整合到宿主细胞基因组中。表达盒的整合可以在宿主基因组中随机地发生或者可以通过使用这样的构建体来靶向，即该构建体含有足以靶向宿主基因座中的重组的与宿主基因组同源的区。如果构建体靶向内源性基因座，则转录和翻译调控区的全部或某些可以由内源性基因座提供。
[0458] 如果两个或更多个基因从独立的复制载体表达，则希望每个载体具有不同的选择手段并且应该缺乏与其他构建体的同源性以便维持稳定表达和防止元件在构建体之间重配(reassortment)。可用实验方法确定调控区、选择手段和导入的构建体的增殖方法的明智选择，以便所有导入的基因都以需要的水平表达从而提供所需产品的合成。
[0459] 包括目的基因的构建体可以通过任何标准技术导入到微生物宿主细胞中。这些技术包括转化(如醋酸锂转化[Methods in Enzymology，194：186-187(1991)])、原生质体融合、基因枪轰击(bolistic impact)、电穿孔、显微注射或任何将目的基因导入宿主细胞中的其他方法。
[0460] 为方便起见，已经通过任何方法操纵来摄取DNA序列(如表达盒)的宿主细胞在本文中将称为“转化的”或“重组的”。转化的宿主将具有至少一个拷贝的表达构建体，而且可以具有两个或更多个拷贝，这取决于该表达盒是整合到基因组内还是存在于具有多拷贝数的染色体外元件上。
[0461] 可通过多种选择技术鉴定转化过的宿主细胞，如美国专利公开7,238,482和7,259,255以及PCT公开WO 2006/052870中所述。
[0462] 转化后，适合于本发明DHA合酶(以及任选在宿主细胞中共表达的其他PUFA酶)的底物可以由宿主自然产生或转基因产生，或者可以从外源提供。
[0463] 用于重组表达的优选微生物宿主
[0464] 用于表达本发明基因和核酸片段的微生物宿主细胞可以包括在多种原料(包括简单或复杂的碳水化合物、脂肪酸、有机酸、油和醇类和 /或碳氢化合物)上于广泛的温度和pH值范围内生长的宿主。基于申请人的受让人的需要，本发明描述的基因将在含油酵母(并且尤其是解脂耶氏酵母)中表达；但是可预期，由于转录、翻译和蛋白质生物合成装置是高度保守的，任何细菌、酵母、藻类、类眼虫和/或真菌都将是用于表达本发明的核酸片段的合适微生物宿主。
[0465] 然而，优选的微生物宿主是含油生物，例如含油酵母。这些生物天然能够合成并积聚油，其中油可占细胞干重的超过约25％，更优选占细胞干重的超过约30％，最优选占细胞干重的超过约40％。通常鉴定为含油酵母的属包括但不限于：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。更具体地讲，例证性的油合成酵母包括：类酵母红冬孢(Rhodosporidium toruloides)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyii)、产油油脂酵母(L lipoferus)、拉可夫氏假丝酵母(Candida revkaufi)、铁红假丝酵母(C.pulcherrima)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、产朊假丝酵母(C.utilis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullans)、皮状丝孢酵母(T.cutaneum)、胶粘红酵母(Rhodotorula glutinus)、禾木科红酵母(R.graminis)和解脂耶氏酵母(以前归类为解脂假丝酵母(Candida lipolytica))。
[0466] 最优选的是含油酵母解脂耶氏酵母；而且，在其他实施方案中，最优选的是命名为ATCC#76982、ATCC#20362、ATCC#8862、ATCC#18944和/或LGAM S(7)1的解脂耶氏酵母菌株(Papanikolaou S.和Aggelis G.，Bioresour.Technol.82(1)：43-9(2002))。
[0467] 从历史上看，多个解脂耶氏酵母菌株已经被用于制作和生产以下产品：异柠檬酸裂合酶；脂肪酶；聚羟基链烷酸酯；柠檬酸；赤藓醇；2-酮戊二酸；γ-癸内酯；γ-十二内酯；和丙酮酸。适用于含油酵母(即，解脂耶氏酵母)转化的具体教导包括美国专利公开4,880,741和美国专利公开5,071,764以及Chen，D.C.等人Appl.Microbiol.Biotechnol，
48(2)：232-235(1997))。适用于在解脂耶氏酵母中工程化ARA、EPA和DHA生产的具体教导分别在美国专利申请11/264784(PCT公开WO 2006/055322、美国专利申请11/265761(PCT公开WO 2006/052870)和美国专利申请11/264737(PCT公开WO 2006/052871)中提供。
[0468] 用于在含油酵母(即解脂耶氏酵母)中合成和转化包括C20延伸酶和Δ4去饱和酶的表达载体的详细方法在PCT公开WO 2006/052871中提供。在解脂耶氏酵母中表达基因的优选方法是通过将线性DNA整合到宿主基因组中。当期望基因高水平表达时，整合到基因组中的多个位置可以是尤其有用的[如在Ura3基因座(GenBank登录号AJ306421)、Leu2基因座(GenBank登录号AF260230)、Lys5基因座(GenBank登录号M34929)、Aco2基因座(GenBank登录号AJ001300)、Pox3基因座(Pox3：GenBank登录号XP_503244或Aco3：GenBank登录号AJ001301)、Δ12去饱和酶基因座(美国专利公开7,214,491)、Lip1基因座(GenBank登录号Z50020)、Lip2基因座(GenBank登录号AJ012632)和/或Pex10基因座(GenBank登录号CAG81606)]。
[0469] 本文公开中用于耶氏酵母属表达载体的终止区域包括例如：解脂耶氏酵母细胞外蛋白酶的100bp的3′区域(XPR；GenBank登录号M17741)；酰基-coA氧化酶(Aco3：GenBank登录号AJ001301和CAA04661；Pox3：GenBank登录号XP_503244)终止子；Pex20(GenBank登录号AF054613)终止子；Pex16(GenBank登录号U75433)终止子；
Lip1(GenBank登录号Z50020)终止子；Lip2(GenBank登录号AJ012632)终止子；以及3-氧酰基-coA硫解酶(OCT；GenBank登录号X69988)终止子。
[0470] 优选的用于解脂耶氏酵母的选择方法是对卡那霉素、潮霉素和氨基糖苷G418的抗性以及在缺乏尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸或组氨酸的培养基上生长的能力。在备选的实施方案中，将5-氟乳清酸(5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物；“5-FOA”)用于选择酵母-Ura 突变体。该化合物对具有编码乳清苷5′-单磷酸脱羧酶(OMP脱羧酶)的功能性URA3-
基因的酵母细胞有毒性；因此，基于这种毒性，5-FOA特别可用于选择和鉴定Ura 突变酵母菌株(Bartel，P.L和Fields，S.，Yeast 2-Hybrid System，Oxford University：New York，v.7，pp 109-147，1997；也参见PCT公开WO 2006/052870，5-FOA在耶氏酵母属中的使用)。
更具体地讲，技术人员可以首先敲除天然Ura3基因以产生具有Ura-显型的菌株，其中基于
5-FOA抗性进行选择。然后，可将多个嵌合基因和新的Ura3基因整合到耶氏酵母属基因组的不同位点以产生具有Ura+显型的新菌株。当敲除导入的Ura3基因时，随后的整合产生新的Ura3-菌株(再 次使用5-FOA选择进行鉴别)。因此，可使用Ura3基因(与5-FOA选择组合)作为多轮转化的选择标记物，因此使得基因修饰以容易的方法被容易地整合到耶氏酵母属基因组中。
[0471] 其他优选的微生物宿主包括含油细菌、藻类、类眼虫和其他真菌；而且，在该广泛的微生物宿主的组中，特别关注的是合成ω-3/ω-6脂肪酸的微生物(或那些能被基因工程化而达到该目的的微生物[如其他酵母例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)])。因此，例如，用处于诱导型或调控型启动子控制下的任何本发明的DHA合酶基因转化高山被孢霉(在商业上用于生产ARA)可以产生能合成增量PUFA的转化子生物。Mackenzie等人(Appl.Environ.Microbiol.，66：4655(2000))描述了转化高山被孢霉的方法。Environ.类似地，美国专利7,001,772公开了转化破囊壶菌目(Thraustochytriales)微生物的方法。
[0472] 可能需要给料底物。
[0473] 不管经选择用于表达复合酶(例如DHA合酶)的宿主如何，为了获取显示所需表达水平和模式的菌株，必须筛选多个转化子。这种筛选可以通过DNA印迹的Southern分析(Southern，J.Mol.Biol.，98：503(1975))、mRNA表达的Northern分析(Kroczek，J.Chromatogr.Biomed.Appl.，618(1-2)：133-145(1993))、蛋白质表达的Western和/或Elisa分析、PUFA产品的表型分析或GC分析完成。
[0474] 当然，因为含油酵母中天然产生的PUFA仅限于18：2脂肪酸(即LA)和通常较少的18：3脂肪酸(即ALA)，除了本文所述的复合酶之外，本文所述的在本发明的更优选的实施方案中将对含油酵母进行遗传工程化以表达多个对长链PUFA生物合成必需的酶(因此产生例如ARA、EPA、DPA和DHA)。
[0475] 在特定的优选实施方案中，所述至少一个附加重组DNA构建体编码DGLA合酶，使得复合酶具有Δ9延伸酶活性和Δ8去饱和酶活性。在一些实施方案中，Δ9延伸酶可分离自或来源于绿光等鞭金藻(GenBank登录号AF390174；IgD9e或IgD9eS)或Δ9延伸酶可分离自或来源于小眼虫或Euglena anabena。例如，参见如SEQ ID NO：441、SEQ ID NO：447、SEQ ID NO：454、SEQ ID NO：461、SEQ ID NO：464和SEQ ID NO：471中示出的DGLA合酶。
[0476] 微生物中的ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成代谢工程学
[0477] 操纵生物化学途径的方法是本领域的技术人员所熟知的；并且，期望可能进行多个操纵以最大化在含油酵母尤其是解脂耶氏酵母中的ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成。这种操纵可能需要直接在PUFA生物合成途径中进行代谢工程改造或需要另外对为PUFA生物合成途径贡献碳的途径进行操纵。可用于上调期望的生化途径和下调不期望的生化途径的方法是本领域技术人员熟知的。
[0478] 例如与ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途径竞争能量或碳的生化途径或干扰特定PUFA终产物产生的天然PUFA生物合成途径中的酶可以通过基因破坏来去除或通过其他手段(如反义mRNA)来下调。
[0479] 在PUFA生物合成途径中作为增加ARA、EPA或DHA的手段的操纵(及其相关技术)的详细讨论分别在PCT公开WO 2006/055322[美国专利公开2006-0094092-A1]、PCT公开WO 2006/052870[美国专利公开2006-0115881-A1]和PCT公开WO 2006/052871[美国专利公开2006-0110806-A1]中给出，在TAG生物合成途径和TAG降解途径中的所需的操纵(及其相关技术)也在其中给出。
[0480] 在本发明的上下文中，通过任何一种上述策略调节脂肪酸生物合成途径的表达都可能是有用的。例如本发明提供将编码PUFA生物合成途径中的关键酶的基因导入含油酵母以产生ω-3和/或ω-6脂肪酸的方法。在含油酵母中表达本发明DHA合酶的基因将是尤其有用的，该含油酵母天然不具有ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途径，它使用用于宿主生物代谢工程学的多种方法协调这些基因的表达以最大化优选的PUFA产物的生产。
[0481] 用于PUFA生产的微生物发酵过程
[0482] 使转化的宿主细胞在优化嵌合基因的表达并且产生最大且最经济产量的期望PUFA的条件下生长。通常，可以被优化的培养基条件包括碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物量生产期的时长、油积聚期的时长以及细胞收获的时间和方法。解脂耶氏酵母通常生长在复合培养基(如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖液体培养基(YPD))或缺乏生长所必需的成分并由此强迫选择所需表达盒的确定成分的极限培养基中(如Yeast Nitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI))。
[0483] 本发明的发酵培养基必须含有合适的碳源。合适的碳源在美国专利 公开7,238,482中提出。尽管预期本发明中利用的碳源可以涵盖许多种含碳源，但优选的碳源是糖类、甘油和/或脂肪酸。最优选的碳源是葡萄糖和/或包含介于10-22个碳之间的脂肪酸。
[0484] 氮可以由无机来源(如(NH4)2SO4)或有机来源(如尿素或谷氨酸)提供。除了合适的碳源和氮源，发酵培养基还必须含有合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素和本领域技术人员已知的适合含油宿主生长并促进PUFA产生所必需的酶促途径的其他组分。要特+2 +2 +2 +2 +2 +2别注意促进脂质和PUFA合成的几种金属离子(如Fe 、Cu 、Mn 、Co 、Zn 、Mg )(Nakahara，T.等人，Ind.Appl.Single Cell Oils，D.J.Kyle和R.Colin(编辑).pp 61-97(1992))。
[0485] 本发明中优选的生长培养基是普通的商业制备的培养基，例如Yeast Nitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)。也可以使用其他确定成分的生长培养基或合成的生长培养基，并且适于转化宿主细胞生长的培养基对微生物学或发酵科学领域的技术人员来说将是已知的。适于发酵的pH范围通常介于约pH4.0至pH8.0之间，其中优选将pH5.5至pH7.5作为初始生长条件的范围。发酵可以在有氧或厌氧条件下进行，其中优选为微好氧条件。
[0486] 通常，在含油酵母细胞中积聚高水平的PUFA需要两个阶段的过程，因为代谢状态必须在生长和脂肪的合成/贮存之间达到“平衡”。因此，最优选地，两阶段发酵过程是在含油酵母(例如解脂耶氏酵母)中生产PUFA所必需的。这种方法在美国专利公开7,238,482/101757中有所描述，其也描述了多种合适的发酵工艺设计(即分批式、补料分批式和连续式)和生长过程中的注意事项。
[0487] PUFA油的纯化和处理
[0488] PUFA可以游离脂肪酸或酯化形式(如甘油酯、磷脂、硫脂或糖脂)存在于宿主微生物和植物中，并且可以通过多种本领域熟知的方法从宿主细胞中提取出来。一个关于酵母脂质的提取技术、质量分析和可接受标准的回顾参见Z.Jacobs(Critical Reviews in Biotechnology，12(5/6)：463-491(1992))。关于下游处理的简要回顾也可参见A.Singh和O.Ward(Adv.Appl.Microbiol.，45：271-312(1997))。
[0489] 一般来讲，用于纯化PUFA的方法可包括用有机溶剂萃取(例如美国专利公开6,797,303和美国专利公开5,648,564)、超声波降解、超临 界流体萃取(例如使用二氧化碳)、皂化及物理方法如压榨、或它们的组合。可参阅美国专利公开7,238,482的教导以获得更多细节。分离种子油的方法是本领域熟知的：(Young等人，Processing ofFats and Oils，In The Lipid Handbook，Gunstone 等 人，eds.，Chapter 5 pp 253-257；
Chapman&Hall：London(1994))。例如，使用一系列涉及从含油种子中萃取和纯化食用油产品的步骤生产大豆油。使用表7所示的通用步骤生产大豆油和大豆副产品。
[0490] 表7
[0491] 大豆油和副产品生产通用步骤
[0492]
[0493] 更具体地讲，将大豆种子清洗、软化、去壳、并切片，从而提高萃取效率。通常通过溶剂(例如己烷)萃取完成油萃取，但也可通过组合使用物理压力和/或溶剂萃取完成油萃取。所得油称为粗制油。粗制油可通过水合磷脂和其他极性与中性脂类复合物进行脱胶，所述复合物有利于它们从非水合的甘油三酯馏分(大豆油)分离。所得卵磷脂胶可进行进一步处理以制备商业上重要的卵磷脂产品，该产品可作为乳化剂和脱模剂(即抗粘剂)用于多种食品和工业产品。可进一步精炼脱胶油以移除杂质(主要是游离脂肪酸、色素和残余树胶)。通过加入苛性剂完成精炼，苛性剂与游离脂肪酸反应形成皂并水合粗制油中的磷脂和蛋白。 用水洗出精炼期间形成的微量皂。皂料副产品可直接用于动物饲料或进行酸化以回收游离脂肪酸。通过漂白土吸收移除色素，漂白土移除大多数叶绿素和类胡萝卜素化合物。可氢化精炼油，从而产生具有多种熔炼特性和质地的脂肪。可使用冻凝(分馏)，通过在仔细控制的冷却条件下结晶从氢化油中移除硬脂精。脱臭(主要经由真空蒸汽蒸馏)是最后的步骤，并经设计以移除赋予油气味或风味的化合物。其他有价值的副产品如生育酚和甾醇可在脱臭过程中移除。可销售包含这些副产品的脱臭馏出液用于生产天然维生素E和其他高价值的药物产品。精炼的、漂白的、(氢化的、分馏的)及脱臭的油和脂肪可被包装并直接销售，或进行进一步处理制成更专门的产品。关于大豆种子加工、大豆油生产和副产品利用的更详细的参考可见于Erickson，Practical Handbook of Soybean Processing and Utilization，The American Oil Chemists’Society and United Soybean Board(1995)。大豆油在室温下是液体，因为与椰子油、棕榈油、棕榈仁油和可可油相比，它的脂肪酸饱和程度相对较低。
[0494] 包含已经精炼过的和/或纯化过的PUFA的植物油和微生物油可被氢化，从而产生具有多种熔炼特性和质地的脂肪。多种经加工的脂肪(包括涂脂、糖脂、硬黄油、人造黄油、烘焙起酥油等)需要室温下不同的硬度，并且仅能通过改变来源油的物理特性来制备。这最普遍地通过催化氢化完成。
[0495] 氢化是一种化学反应，其中使用催化剂如镍将氢加入到不饱和脂肪酸双键中。例如，高油酸大豆油包含不饱和油酸、亚油酸和亚麻酸脂肪酸，它们中的每一个都可被氢化。氢化具有两个主要效应。第一，油的氧化稳定性增加，这是因为不饱和脂肪酸含量减少。第二，油的物理特性发生变化，这是因为脂肪酸修改形式提高了熔点，导致它们在室温下为半液体或固体。
[0496] 有多个影响氢化反应的变量，它们继而改变了最终产品的组成。包括压力、温度、催化剂类型和浓度、搅拌、以及反应器设计的操作条件是最重要的可控参数。可使用选择性氢化条件，优先于不饱和程度较低的脂肪酸来氢化不饱和程度较高的脂肪酸。常使用非常轻度或轻度氢化以提高液态油的稳定性。进一步的氢化将液态油转化成物理上的固体脂肪。氢化程度取决于为特定终产品设计的所需性能和熔融特性。用于制造人造黄油的液态起酥油(用于制造烘焙产品，固体脂肪和起酥油用于 商业油炸和烧烤)和基础油是通过氢化获得的多种可能的油和脂肪产品中的几种。关于氢化和氢化产品的更详细的描述可见于Patterson，H.B.W.，Hydrogenation of Fats and Oils：Theory and Practice.The American Oil Chemists’Society(1994)。
[0497] 由于在氢化过程中产生反式脂肪酸异构体，氢化油已经存在一些争议。摄取大量反式异构体已经与有害的健康效应联系起来，包括血浆中的低密度脂蛋白对高密度脂蛋白比率的提高和冠心病风险的增加。
[0498] 含PUFA油用于食品、健康食物产品、药品和动物饲料
[0499] 市场目前支持许多种掺入了ω-3和/或ω-6脂肪酸(尤其例如ALA、GLA、ARA、EPA、DPA和DHA)的食物和饲料产品。预期本发明的含PUFA植物/种子油、改性种子和微生物生物质和/或油将在食品和饲料产品中发挥功能以赋予本发明制剂的健康有益效果。与其他植物油相比，据信本发明的油从物理观点(例如部分氢化油，如大豆油被广泛用作软涂脂、人造黄油和用于烘焙和油炸的起酥油的成分)来看功能类似于食品应用中的其他油。
[0500] 植物/种子油、改性种子、微生物生物质和/或含ω-3和/或ω-6脂肪酸的油将适用于多种食品和饲料产品，包括但不限于：食品类似物、肉产品、谷类食物产品、烘焙食品、小吃食品和乳品。
[0501] 此外，可在制剂中使用本发明的植物/种子油、改性种子、微生物生物质和/或油以赋予医疗食品健康有益效果，包括医疗营养品、饮食补充剂、婴儿代乳品以及药物产品。食物加工和食物配制领域的技术人员将明白可如何将植物和微生物油的量和组成加入到食物或饲料产品中。该量在本文中将称为“有效”量并将取决于食物或饲料产品、期望补充该产品的膳食或医疗食物或医疗营养品打算纠正或治疗的医学状况。
[0502] 可使用本领域的技术人员熟知的方法来制备食品类似物。提到的有肉类类似物、干酪类似物、乳类似物等。由大豆制成的肉类类似物包含大豆蛋白或豆腐以及其他成分，混合在一起以模拟各种肉类。这些肉类替代物以冷冻、罐头或干燥食品的形式销售。通常使用它们的方法与它们替代的食品相同。由大豆制成的肉类替代物是优异的蛋白质、铁和维生素B来源。肉类类似物的实例包括但不限于：火腿类似物、香肠类似物、熏肉类似物等。
[0503] 取决于食品类似物的功能和组成特性，可将它们分成仿造品或替代 品。例如，仿造干酪仅需类似它设计替代的干酪。然而，仅仅假如一种产品的营养等同于它替代的干酪并符合干酪的最低组成要求时，才能将其称之为替代干酪。因此，替代干酪将通常具有比仿造干酪更高的蛋白含量，并用维生素和矿物质进行强化。
[0504] 乳类似物或非乳品食物产品包括但不限于仿造乳品和非乳品冷冻甜点(例如那些由大豆和/或大豆蛋白产品制成的食品)。
[0505] 肉产品包括多种产品。在美国“肉类”包括产自牛、猪和羊的“红肉”。除了红肉之外还有家禽类肉产品，包括鸡、火鸡、鹅、珍珠鸡、鸭和鱼以及贝类。调味和加工肉制品有多种类别：新鲜的、腌制的和油炸的、以及腌制的和煮熟的。香肠和热狗是加工肉制品的实例。因此，如本文所用，术语“肉类产品”包括但不限于加工肉制品产品。
[0506] 谷类食物产品是来自谷物加工的食物产品。谷物包括来自生产可食用谷物(种子)的草本植物家族的任何植物。最常见的谷物是大麦、玉米、小米、燕麦、奎奴亚藜、大米、裸麦、高粱、黑小麦、小麦和野生稻。谷类食物产品的实例包括但不限于：整谷粒、粉碎谷粒、粗磨粉、面粉、麸皮、胚芽、早餐谷类食物、挤出食物、意大利面食等。
[0507] 烘焙食物产品包括上文提到的任何谷类食物产品并已被烘焙或用类似于烘焙的方法进行加工(即，通过受热进行干燥或硬化)。烘焙食物产品的实例包括但不限于：面包、粉饼、油炸圈饼、巴、意大利面食、面包瓤、烘焙小吃、小点心、小薄脆饼干、小饼干和小脆饼干。如上文所述，本发明的油可用作一种成分。
[0508] 小吃食物产品包括上文或下文所述的任何食物产品。
[0509] 油炸食物产品包括上文或下文所述的任何油炸食物产品。
[0510] 健康食物产品是赋予健康有益效果的任何食物产品。可认为多种含油种子来源的食物产品是健康食品。
[0511] 饮料可以是液体或干粉形式。
[0512] 例如，可涉及非碳酸饮料如新鲜的、冷冻的、罐装的或浓缩的果汁；调味奶或原奶饮料等。成人和婴儿营养代乳品是本领域熟知的和可商购获得的(例如和 来 自 Ross Products Division，
Abbott Laboratories)。
[0513] 婴儿代乳品是喂给婴儿或儿童的液体或再生粉末。本文将“婴儿代乳品”定义为肠营养产品，它能取代人母乳来喂养婴儿并通常由所需百 分比的脂肪与所需百分比的碳水化合物及蛋白质在水溶液中混合组成(例如参见美国专利公开4,670,285)。根据世界范围内的组合物研究，以及专家组指出的含量，平均人类母乳通常包含约0.20％至0.40％的总脂肪酸(约占50％的来自脂肪的卡路里)；并且，一般DHA对ARA的比率在约1∶1至1∶2的范围内(参见例如来自Enfamil LIPILTM(Mead Johnson&Company)和Similac AdvanceTM(Ross Products Division，Abbott Laboratories)的制剂)。婴儿代乳品在婴儿饮食中起到特殊作用，因为它们经常是婴儿唯一的营养来源；并且，虽然母乳仍旧是婴儿最好的食物，但婴儿代乳品足以成为使婴儿不仅存活而且健康成长的第二食品。
[0514] 乳品产品是来源于乳品的产品。乳类似物或非乳品产品来源于除乳品之外的其他来源，例如上文讨论的豆奶。这些产品包括但不限于：全脂乳、脱脂乳、发酵乳产品如酸奶或酸乳、奶油、黄油、炼乳、脱水乳、咖啡伴侣(coffee whitener，coffee creamer)、冰淇淋、干酪等。
[0515] 其中有本发明包含PUFA的油的附加食物产品包括例如口香糖、糖果和糖霜、凝胶物和布丁、硬糖和软糖、果酱和果子冻、白砂糖、糖替代品、甜沙司、浇头和糖浆、以及干混粉末混合物。
[0516] 健康食物产品是赋予健康有益效果的任何食物产品，包括功能性食品、医疗食品、医疗营养品和饮食补充剂。此外，本发明的植物/种子油、改性种子和微生物油可用于标准药物组合物(例如可将包含长链PUFA的油轻易地掺入到上文提到的任何食物产品中以便制备功能性食品或医疗食品)。包括PFUA的更高浓度的制剂包括胶囊、粉末、片剂、软凝胶、胶囊锭、液体浓缩液和乳液，它们能在人类或除人类之外的动物中用作饮食补充剂。
[0517] 动物饲料本文一般定义为旨在用作饲料或混入饲料的产品，用于除人之外的动物。本发明的植物/种子油、改性种子和微生物油可用作多种动物饲料的成分。
[0518] 更具体地讲，尽管不受本文的限制，期望本发明的油用于宠物食物产品、反刍动物和家禽食物产品以及水产业食物产品。宠物食物产品是那些旨在饲喂给宠物(例如狗、猫、鸟类、爬行动物和啮齿动物)的食物产品。这些产品可包括上文的谷类和健康食物产品、以及肉类和肉类副产品、大豆蛋白产品、草和干草产品(例如苜蓿、梯牧草、燕麦或雀麦草、蔬菜)。反刍动物和家禽食物产品是那些旨在饲喂给动物(例如 火鸡、鸡、牛和猪)的食物产品。关于上文的宠物食物，这些产品可包括上文列出的谷类和健康食物产品、大豆蛋白产品、肉类和肉类副产品、以及草和干草产品。水产业食物产品(或“水产品饲料”)是那些旨在用于水产养殖场的食物产品，即，关于在淡水或海水中繁殖、饲养、或养殖水生生物和/或动物的食物产品。实施例
[0519] 本发明将在下面的实施例中进一步限定，其中份数和百分比是以重量计并且度数是摄氏度，除非另外说明。应当理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明的基本特征，并在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明做出多种改变和修饰以使其适用于多种用法和条件。因此，除了本文所示和描述的那些之外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也旨在属于所附权利要求书的范围内。
[0520] 缩写的含意如下：“sec”表示秒，“min”表示分钟，“h”表示小时，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示微摩尔，“mM”表示毫摩尔，“M”表示摩尔，“mmol”表示毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“ng”表示纳克，“U”表示单位，“bp”表示碱基对并且“kB”表示千碱基。
[0521] 一般方法：
[0522] 表达盒命名：
[0523] 表达盒的结构将通过简单的记号系统“X::Y::Z”表示，其中X描述启动子片段，Y描述基因编码区片段，Z描述终止子片段，它们都可操作地彼此连接。
[0524] 解脂耶氏酵母的转化和培养：
[0525] 具有ATCC保藏号#20362、#76982和#90812的解脂耶氏酵母菌株购自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)。根据下文所述方法，解脂耶氏酵母菌株通常在几种培养基中在28℃至30℃下生长。根据标准方法，按要求通过将20g/L琼脂加入到每个液体培养基中来制备琼脂板。
[0526] YPD琼脂培养基(每升)：10g酵母提取物[Difco]，20g Bacto
[0527] 蛋白胨[Difco]；和20g葡萄糖。
[0528] 基础培养基(MM)(每升)：20g葡萄糖；1.7g酵母氮
[0529] 基，无氨基酸；1.0g脯氨酸；以及pH 6.1(无需调节)。
[0530] 基础培养基+尿嘧啶(MM+尿嘧啶或MMU)(每升)：如上制备MM
[0531] 培养基并加入0.1g尿嘧啶和0.1g尿苷。
[0532] 基础培养基+尿嘧啶+磺酰脲类(MMU+SU)(每升)：如上制备
[0533] MMU培养基并加入280mg磺酰脲类。
[0534] 基础培养基+亮氨酸(MM+亮氨酸或MMLeu)(每升)：如上制备MM培养基并加入0.1g亮氨酸。
[0535] 基础培养基+亮氨酸+尿嘧啶(MMLeuUra)(每升)：如上制备MM培养基并加入0.1g亮氨酸，0.1g尿嘧啶和0.1g尿苷。
[0536] 基础培养基+亮氨酸+赖氨酸(MMLeuLys)(每升)：如上制备MM培养基并加入0.1g赖氨酸和0.1g亮氨酸。
[0537] 基础培养基+5-氟乳清酸(MM+5-FOA)(每升)：20g葡萄糖，6.7g酵母氮基，75mg尿嘧啶，75mg尿苷和合适量的FOA(Zymo Research Corp.，Orange，CA)，基于对100mg/L至1000mg/L的浓度范围内进行的FOA活性测试(因为从供应商处收到的每一批活性均发生变化)。
[0538] 高葡萄糖培养基(HGM)(每升)：80葡萄糖，2.58g KH2PO4和5.36g K2HPO4，pH7.5(无需调节)。
[0539] 解脂耶氏酵母的转化根据Chen，D.C.等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.48(2)：232-235(1997))的方法进行，除非另外说明。简而言之，将耶氏酵母划线到YPD平板上，并在30℃下生长大约18小时。从平板上刮掉几大环量的细胞并将其重悬浮于包括下面成分的1mL转化缓冲液中：2.25mL 50％PEG，平均分子量为3350；0.125mL 2M醋酸锂，pH6.0；
0.125mL 2M DTT；和(任选地)50μg剪切鲑精DNA。然后，将大约500ng线性化的质粒DNA在100μl重悬浮的细胞中孵育，并将其在39℃下保持1小时，每间隔15分钟进行涡旋混合。将细胞铺在选择培养基平板上并在30℃下保持2至3天。
[0540] 解脂耶氏酵母脂肪酸分析：
[0541] 为了进行脂肪酸分析，将细胞通过离心收集并如Bligh，E.G.& Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.37：911-917(1959))。脂肪酸甲酯通过脂质提取物和甲醇钠之间的酯交换反应进行制备(Roughan，G.，和Nishida I.，Arch.Biochem Biophys.276(1)：38-46(1990))，然后用配备30-mX0.25mm(内径)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard 6890 GC进行分析。烘箱温度以3.5℃/分钟从170℃(保持25分钟)升至185℃。
[0542] 为了进行直接的碱催化酯交换反应，收获耶氏酵母培养物(3mL)，在蒸馏水中洗涤一次，并在Speed-Vac中在真空下干燥5至10分钟。将甲醇钠(100μl，浓度为1％)加入样本中，然后涡旋振荡20分钟。在加入3滴1M氯化钠和400μl己烷后，涡旋并离心样本。移出上层并如上所述的用GC进行分析。
[0543] 构造解脂耶氏酵母菌株Y4305U3：
[0544] 在下文实施例52、53和54中使用解脂耶氏酵母菌株Y4305U3作宿主。以下描述是构建来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y4305U3的概述。菌株Y4305U3通过表达Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径(图44)能够产生相对于总脂质约53.2％的EPA。
[0545] 菌株Y4305U3的发展需要构建菌株Y2224(抗FOA突变型，来自野生型耶氏酵母属菌株ATCC#20362的Ura3基因的自发突变)、菌株Y4001(产生17％EDA，具有Leu-表型)、菌株Y4001U1(产生17％EDA，具有Leu-和Ura-表型)、菌株Y4036(产生18％DGLA，具有Leu-表型)、菌株Y4036U(产生18％DGLA，具有Leu-和Ura-表型)、菌株Y4070(产生12％ARA，具有Ura-表型)、菌株Y4086(产生14％EPA)、菌株Y4086U1(Ura3-)、菌株Y4128(产生37％EPA)、菌株Y4128U3(Ura-)、菌株Y4217(产生42％EPA)、菌株Y4217U2(Ura-)、菌株Y4259(产生46.5％EPA)和菌株Y4259U2(Ura-)。
[0546] 菌株Y2224的产生：以如下方式分离菌株Y2224：将来自YPD琼脂平板的解脂耶氏酵母ATCC#20362细胞划线至含有250mg/L 5-FOA(Zymo Research)的MM平板(75mg/L的尿嘧啶和75mg/L的尿苷、6.7g/L具有硫酸铵且无氨基酸的YNB，以及20g/L葡萄糖)上。将平板在28℃下孵育并将四个得到的菌落分别贴在含有200mg/mL 5-FOA的MM平板上和无尿嘧啶和尿苷的MM平板上。完成此步骤以确认尿嘧啶Ura3营养缺陷型。
[0547] 产生菌株Y4001以生产占总脂质约17％的EDA通过整合构建体pZKLeuN-29E3(图45A)构建菌株Y4001。将含有四种嵌合基因(即Δ12去饱和酶、C16/18延伸酶和两种Δ9延伸酶)的该构建体整合进菌株Y2224的Leu2基因座，由此使得能产生EDA。
[0548] 构建包含下表8中所示组分的pZKLeuN-29E3。
[0549] 表8
[0550] 质粒pZKLeuN-29E3(SEQ ID NO：315)的描述
[0551]
[0552]
[0553] 将质粒pZKLeuN-29E3用Asc I/Sph I消化，然后根据“一般方法”将其用于转化解脂耶氏酵母菌株Y2224(即ATCC#20362Ura3-)。将转化细胞铺在MMLeu培养基平板上，并在30℃下保持2至3天。挑取菌落并划线到MM和MMLeu选择平板上。将在MMLeu平板上生长但不在MM平板上生长的菌落选作Leu-菌株。将Leu2-菌株的单菌落接种到液体MMLeu培养基中，并在30℃下以250rpm/min摇动2天。离心收集细胞并提取脂质。通过酯交换制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard 6890 GC进行分析。
[0554] GC分析显示，EDA存在于含有pZKLeuN-29E3的4种嵌合基因的转化子中，但不存在于耶氏酵母Y2224对照株中。所选的36个Leu-菌株中大部分产生占总脂质约12％至16.9％的EDA。三个菌株分别命名 为Y4001、Y4002和Y4003，分别产生占总脂质约17.4％、
17％和17.5％的EDA。
[0555] 将Y4001、Y4002和Y4003菌株的单菌落接种到液体MMLeu培养基中，并在30℃下以250rpm/min摇动2天。离心收集细胞，重悬于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。离心收集细胞并提取脂质。通过酯交换制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard 6890 GC进行分析。GC分析显示Y4001、Y4002和Y4003菌株产生占总脂质约24％的EDA。
[0556] 菌株Y4001U(Leu-，Ura-)的生成：通过在菌株Y4001中的质粒pY116(图45B)中暂时表达Cre重组酶以产生Leu-和Ura-表型来产生菌株Y4001U。构建体pY116含有如下组分：
[0557] 表9
[0558] 质粒pY116(SEQ ID NO：323)的描述
[0559]
[0560] 根据在“一般方法”中的描述将质粒pY116用于转化新鲜生长的Y4001细胞。将转化过的细胞接种到MMLeuUra平板上，该平板包含280μg/mL磺酰脲类(氯嘧磺隆，E.I.duPont de Nemours&Co.，Inc.，Wilmington，DE)，并将平板在30℃保持3至4天。采集四个菌落并随后接种到3mL液体YPD中。在30℃下以250rpm/min摇动1天。用液体MMLeuUra培养基将培养物稀释至1∶50,000，并将100mL接种到新的YPD平板上。平板在
30℃下保持2天。挑取菌落并划线至MMLeu和MMLeuUra选择平板上。选择在MMLeuUra平板上生长但不在MMLeu平板上生长的菌落并通过GC分析来确定C20:2(EDA)的存在。几个产生占总脂质约17％的EDA的菌株，每个具有Leu-和Ura-表型，统称为Y4001U。这些菌株的其中一种称为Y4001U1。
[0561] 产生Y4036菌株以生产占总脂质约18％的DGLA：构建pKO2UF8289(图46A；SEQ ID NO：324)以将四种嵌合基因(包含Δ12去饱和酶、一种Δ9延伸酶和两种突变型Δ8去饱和酶)整合进菌株Y4001U1的Δ12基因座，由此使得能产生DGLA。构建体pKO2UF8289含有如下组分：
[0562] 表10
[0563] 质粒pKO2UF8289(SEQ ID NO：324)的描述
[0564]
[0565]
[0566] 将pKO2UF8289质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y4001U1。将转化细胞铺在MMLeu平板上，并在30℃下保持2至3天。挑取菌落并将其在30℃下划线至MMLeu选择平板上2天。然后将这些细胞接种到液体MMLeu培养基中，并在
30℃下以250rpm/min摇动2天。离心收集细胞并提取脂质。通过酯交换制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard 6890 GC进行分析。
[0567] GC分析显示，DGLA存在于含有pKO2UF8289的4种嵌合基因的转化子中，但不存在于亲本Y4001U1菌株中。所选的96个菌株中大部分产生占总脂质7％至13％的DGLA。六个菌株，称为Y4034、Y4035、Y4036、Y4037、Y4038和Y4039，分别产生占总脂质约15％、
13.8％、18.2％、13.1％、15.6％和13.9％的DGLA。
[0568] 菌株Y4036U(Leu-，Ura3-)的生成：利用构建体pY116(图45B；SEQ ID NO：323)以在菌株Y4036中暂时表达Cre重组酶。这从基因组释放出LoxP夹着的Ura3基因。
[0569] 根据“一般方法”将质粒pY116用于转化菌株Y4036。转化后，将细胞铺至MMLeuUra平板上，并在30℃下保持2至3天。采集在MMLeuUra平板上生长的单克隆并划线接种到YPD液体培养基中。液体培养物在30℃下以250rpm/min摇动1天以消除pY116质粒。将来自生长培养物的细胞划线接种到MMLeuUra平板上。在30℃培养两天后，将单菌落再划线接种到MMLeuUra、MMU和MMLeu平板上。选择可以在MMLeuUra平板上生长但不在MMU或MMLeu平板上生长的那些菌落。将一个具有Leu-和Ura-表型的菌株称为Y4036U(Ura-，Leu-)。
[0570] 产生菌株Y4069和Y4070以生产占总脂质约12％的ARA：构建pZKSL-555R(图46B；SEQ ID NO：331)以将三种Δ5去饱和酶基因整合进菌株Y4036U的Lys基因座，由此使得能产生ARA。pZKSL-555R质粒含有如下组分：
[0571] 表11
[0572] 质粒pZKSL-555R(SEQ ID NO：331)的描述
[0573]
[0574]
[0575] 将pZKSL-555R质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y4036U。将转化细胞铺在MMLeuLys平板上，并在30℃下保持2至3天。然后将单菌落再划线接种到MMLeuLys平板上，并用所得菌落接种液体MMLeuLys。随后将液体培养物在30℃下以250rpm/min摇动2天。离心收集细胞并提取脂质。通过酯交换制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard 6890 GC进行分析。
[0576] GC分析显示，ARA存在于含有pZKSL-555R的3种嵌合基因的转化子中，但不存在于亲本Y4036U菌株中。所选的96个菌株中大部分产生占总脂质约10％的ARA。四种菌株，称为Y4068、Y4069、Y4070和Y4071，分别产生占总脂质约11.7％、11.8％、11.9％和11.7％的ARA。进一步的分析显示，pZKSL-555R的三种嵌合基因没有整合进Y4068、 Y4069、Y4070和Y4071菌株中的Lys5位点。所有菌株都具有Lys+表型。
[0577] 相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y4070最终基因型是Ura-、未知1-、未知3-、Leu+、Lys+、GPD：：FmD12：：Pex20、YAT1：：FmD12：：OCT、YAT1：：ME3S：：
Pex16、GPAT：：EgD9e：：Lip2、EXP1：：EgD9eS：：Lip1、FBAINm：：EgD9eS：：Lip2、FBAINm：：
EgD8M：：Pex20、EXP1：：EgD8M：：Pex16、FBAIN：：EgD5：：Aco、EXP1：：EgD5S：：Pex20、YAT1：：RD5S：：OCT。
[0578] 产生Y4086菌株以生产占总脂质约14％的EPA：生成构建体pZP3-Pa777U(图47A；SEQ ID NO：338)以将三个Δ17去饱和酶基因整合到菌株Y4070的Pox3位点(GenBank登录号AJ001301)中，从而产生EPA。pZP3-Pa777UR质粒含有如下组分：
[0579] 表12
[0580] 质粒pZP3-Pa777U(SEQ ID NO：338)的描述
[0581]
[0582]
[0583] 将pZP3-Pa777U质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y4070。将转化细胞铺在MM平板上，并在30℃下保持2至3天。然后将单菌落再划线接种到MMLeu平板上，并用所得菌落接种液体MMLeuLys。将液体培养物在30℃下以250rpm/min摇动2天。离心收集细胞并提取脂质。通过酯交换制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard6890 GC进行分析。
[0584] GC分析显示，EPA存在于含有pZP3-Pa777U的3种嵌合基因的转化子中，但不存在于亲本Y4070菌株中。所选的96个菌株中大部分产生占总脂质约10％至13％的ARA。两个菌株，称为Y4085和Y4086，分别产生占总脂质约14.2％和13.8％的EPA。
[0585] 相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y4086最终基因型是Ura3+、Leu+、Lys+、未知1-、未知2-、YALI0F24167g-、 GPD：：FmD12：：Pex20、YAT1：：FmD12：：OCT、YAT1：：ME3S：：Pex16、GPAT：：EgD9e：：Lip2、EXP1：：EgD9eS：：Lip1、FBAINm：：EgD9eS：：Lip2、FBAINm：：EgD8M：：Pex20、EXP1：：EgD8M：：Pex16、FBAIN：：EgD5：：Aco、EXP1：：
EgD5S：：Pex20、YAT1：：RD5S：：OCT、YAT1：：PaD17S：：Lip1、EXP1：：PaD17：：Pex16、FBAINm：：PaD17：：Aco.
[0586] 菌株Y4086U1(Ura3-)的生成：菌株Y4086U1经由在菌株Y4086中的构建体PY117(图47B；SEQ ID NO：343)中临时表达Cre重组酶以生产Ura-表型被创造出来。这从基因组释放出LoxP夹着的Ura3基因。质粒pY117中的突变型耶氏酵母AHAS酶赋予了R
SU，其可用作阳性筛选标记。
[0587] 质粒pY117通过如下操作而源自质粒pY116(在上文和美国专利申请11/635258中有描述)：将旁侧有PacI-SwaI位点的突变AHAS基因插入用PacI-SwaI消化的pY116中，由此用磺酰脲标记置换了LEU选择标记。因此构建体pY117含有如下组分：
[0588] 表13
[0589] 质粒pY117(SEQ ID NO：343)的描述
[0590]
[0591]
[0592] 根据“一般方法”将质粒pY117用于转化菌株Y4086。在转化之后，将细胞铺在MMU+SU(280μg/mL磺酰脲类；也称为氯嘧磺隆，E.I.duPont de Nemours&Co.，Inc.，RWilmington，DE)平板上，并在30℃下保持2至3天。采集在MMU+SU平板上生长的SU 单菌落并将其划线接种于YPD液体培养基，在30℃下以250rpm/min摇动液体培养物1天以消除pY117质粒。将来自生长培养物的细胞划线接种到MMU平板上。在30℃培养两天后，将单菌落再划线接种到MM和MMU平板上。选择可以在MMU平板上生长但不在MM平板上生长的那些菌落。将这些具有Ura-表型的菌株中的两种称为Y4086U1和Y4086U2(Ura-)。
[0593] 产生Y4128菌株以生产占总脂质约37％的EPA：生成构建体pZP2-2988(图48A；SEQ ID NO：345)以将一个Δ12去饱和酶基因、两个Δ8去饱和酶基因和一个Δ9延伸酶基因整合到菌株Y4086U1的Pox2位点(GenBank登录号AJ001300)中，从而产生更高水平的EPA。pZP2-2988质粒含有如下组分：
[0594] 表14
[0595] 质粒pZP2-2988(SEQ ID NO：345)的描述
[0596]
[0597]
[0598] 将pZP2-2988质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y4086U1。将转化细胞铺在MM平板上，并在30℃下保持2至3天。将单菌落再划线接种到MM平板上，并用所得菌落接种液体MMLeuLys。将液体培养物在30℃下以250rpm/min摇动2天。离心收集细胞，重悬于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。离心收集细胞并提取脂质。通过酯交换制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard6890 GC进行分析。
[0599] GC分析显示大多数所选的96菌株产生占总脂质12％至15.6％的EPA。两个菌株，称为Y4128和Y4129，分别产生占总脂质约37.6％和16.3％的EPA。
[0600] 相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y4128的最终基因型是：YALI0F24167g-、Pex10-、未知1-、未知2-、GPD：：FmD12：：Pex20、YAT1：：FmD12：：OCT、GPM/FBAIN：：FmD12S：：OCT、YAT1：：ME3S：：Pex16、GPAT：：EgD9e：：Lip2、EXP1：：
EgD9eS：：Lip1、FBAINm：：EgD9eS：：Lip2、FBA：：EgD9eS：：Pex20、FBAINm：：EgD8M：：
Pex20、EXP1：：EgD8M：：Pex16、 GPDIN：：EgD8M：：Lip1、YAT1：：EgD8M：：Aco、FBAIN：：
EgD5：：Aco、EXP1：：EgD5S：：Pex20、YAT1：：RD5S：：OCT、YAT1：：PaD17S：：Lip1、EXP1：：
PaD17：：Pex16、FBAINm：：PaD17：：Aco。解脂耶氏酵母菌株Y4128在2007年8月23日保藏于美国典型培养物保藏中心，命名为ATCC PTA-8614。
[0601] Y4128U菌株的产生：为了破坏菌株Y4128中的Ura3基因，创造构建体pZKUE3S(图48B；SEQ ID NO：351)以将EXP1：：ME3S：：Pex20嵌合基因整合到菌株Y4128的Ura3基因中。pZKUE3S质粒含有如下组分：
[0602] 表15
[0603] 质粒pZKUE3S(SEQ ID NO：351)的描述
[0604]
[0605] 将质粒pZKUE3S用SphI/PacI消化，然后根据“一般方法”将其用 于转化菌株Y4128。转化后，将细胞铺至MM+5-FOA选择平板上，并在30℃下保持2至3天。
[0606] 采集在MM+5-FOA选择平板上生长的总共24个转化子，并将它们再划线接种到新MM+5-FOA平板上。从平板上剥离细胞并提取脂质。通过酯交换制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard 6890 GC进行分析。
[0607] GC分析显示在所有来自平板的pZKUE3S转化子中存在10％至15％的EPA。命名为Y4128U1、Y4128U2、Y4128U3、Y4128U4、Y4128U5和Y4128U6的菌株分别产生12.9％、14.4％、15.2％、15.4％、14％和10.9％的EPA(统称为Y4128U)。
[0608] Y4128(37.6％)对Y4128U(平均13.8％)的％EPA数量差异是由于生长条件不同。具体地讲，在液体培养物中生长两天之后分析前者的培养物，在琼脂板上生长后分析后者的培养物。申请人已经观察到当比较琼脂板上的结果与那些在液体培养物中的结果时，％EPA增加了2至3倍。因此，虽然结果不能直接比较，但Y4128和Y4128U菌株都证明能生产高产量的EPA。
[0609] 产生Y4217菌株以生产占总脂质约42％的EPA：生成构建体pZKL2-5U89GC(图49A；SEQ ID NO：348)以将一个Δ9延伸酶基因、一个Δ8去饱和酶基因、一个Δ5去饱和酶基因和一个解脂耶氏酵母甘油二酯胆碱磷酸转移酶基因(CPT1)整合到菌株Y4128U3的Lip2位点(GenBank登录号AJ012632)中，从而产生更高水平的EPA。pZKL2-5U89GC质粒含有如下组分：
[0610] 表16
[0611] 质粒pZKL2-5U89GC(SEQ ID NO：348)的描述
[0612]
[0613]
[0614] 将pZKL2-5U89GC质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y4128U3。将转化细胞铺在MM平板上，并在30℃下保持3至4天。将单菌落再划线接种到MM平板上，然后用所得菌落接种液体MM。将液体培养物在30℃下以250rpm/min摇动2天。离心收集细胞，重悬于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。离心收集细胞并提取脂质。通过酯交换制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard 6890GC进行分析。
[0615] GC分析显示大多数所选的96菌株产生占总脂质32％至39.9％的EPA。六个菌株，称为Y4215、Y4216、Y4217、Y4218、Y4219和Y4220，分别产生占总脂质约41.1％、41.8％、41.7％、41.1％、41％和41.1％的EPA。相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的每个菌株的最终基因型是：YAL10C18711g-、Pex10-、YAL10F24167g-、未知1-、未知3-、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::OCT、GPM/FBAIN::FmD12S::OCT、YAT1::ME3S::Pex16、EXP1::ME3S::Pex20、GPAT::EgD9e::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、FBA::EgD9eS::Pex20、GPD::EgD9eS::Lip2、FBAINm::EgD8M::Pex20、FBAIN::EgD8M::Lip1、EXP1::EgD8M::Pex16、GPDIN::EgD8M::Lip1、YAT1::EgD8M::Aco、FBAIN::EgD5::Aco、EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::EgD5S::Aco、YAT1::RD5S::OCT、YAT1::PaD17S::Lip1、EXP1::PaD17::Pex16、 FBAINm::PaD17::Aco、YAT1::Y1CPT1::ACO。
[0616] 菌株Y4217U2(Ura3-)的生成：为了破坏菌株Y4217中的Ura3基因，使用构建体pZKUE3S(图48B；SEQ ID NO：351)以将EXP1::ME3S::Pex20嵌合基因整合到菌株Y4217的Ura3基因中。转化后，将细胞铺至MM+5-FOA选择平板上，并在30℃下保持3至4天。
[0617] 采集在MM+5-FOA平板上生长的总共6个转化子，并将它们再划线接种到MM平板和MM+5-FOA平板上。所有6个菌株具有Ura-表型(即，细胞能在MM+5-FOA平板上生长，但不能在MM平板上生长)。从MM+5-FOA平板上刮除细胞并提取脂质。通过酯交换制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard 6890 GC进行分析。
[0618] GC分析显示在所有生长于MM+5-FOA平板上的具有pZKUE3S的转化子中存在18.7％至28.6％的EPA。两个菌株，称为菌株Y4217U1和Y4217U2，分别产生22.5％和
28.6％的EPA。
[0619] 产生Y4259菌株以生产占总脂质约46.5％的EPA：生成构建体pZKL1-2SP98C(图49B；SEQ ID NO：352)以将一个Δ9延伸酶基因、一个Δ8去饱和酶基因、一个Δ12去饱和酶基因和一个解脂耶氏酵母甘油二酯胆碱磷酸转移酶基因(CPT1)整合到菌株Y4217U2的Lip1位点(GenBank登录号Z50020)中，从而产生更高水平的EPA。pZKL1-2SP98C质粒含有如下组分：
[0620] 表17
[0621] 质粒pZKL1-2SP98C(SEQ ID NO：352)的描述
[0622]
[0623]
[0624] 将pZKL1-2SP98C质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y4217U2。将转化细胞铺在MM平板上，并在30℃下保持3至4天。将单菌落再划线接种到MM平板上，然后用所得菌落接种液体MM。随后将液体培养物在30℃下以250rpm/min摇动2天。离心收集细胞，重悬于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。离心收集细胞并提取脂质。通过酯交换制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard6890 GC进行分析。
[0625] GC分析显示大多数所选的72菌株产生占总脂质40％至44％的EPA。六个菌株，称为Y4259、Y4260、Y4261、Y4262、Y4263和Y4264，分别产生占总脂质约46.5％、44.5％、44.5％、44.8％、44.5％和44.3％的EPA。
[0626] 相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC #20362的菌株Y4259的最终基因型是：YALI0C18711g-、Pex10-、YALI0F24167g-、未知1-、未知3-、未知8-、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::OCT、GPM/FBAIN::FmD12S::OCT、EXP1::FmD12S::Aco、YAT1::ME3S::Pex16、EXP1::ME3S::Pex20(2 个 拷 贝 )、GPAT::EgD9e::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、FBA::EgD9eS::Pex20、 GPD::EgD9eS::Lip2、
YAT1::EgD9eS::Lip2、FBAINm::EgD8M::Pex20、FBAIN::EgD8M::Lip1(2 个 拷 贝 )、EXP1::EgD8M::Pex16、GPDIN::EgD8M::Lip1、YAT1::EgD8M::Aco、FBAIN::EgD5::Aco、EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::EgD5S::Aco、YAT1::RD5S::OCT、YAT1::PaD17S::Lip1、EXP1::PaD17::Pex16、FBAINm::PaD17::Aco、YAT1::Y1CPT1::ACO、GPD::Y1CPT1::ACO。
[0627] 菌株Y4259U2(Ura3-)的生成：为了破坏菌株Y4259中的Ura3基因，使用构建体pZKUM(图50A；SEQ ID NO：353)以将Ura3突变基因整合到菌株Y4259的Ura3基因中。pZKUM质粒含有如下组分：
[0628] 表18
[0629] 质粒pZKUM(SEQ ID NO：353)的描述
[0630]
[0631] 采集在MM+5-FOA平板上生长的总共3个转化子，并将它们再划线接种到MM平板和MM+5-FOA平板上。所有3个菌株具有Ura-表型(即，细胞能在MM+5-FOA平板上生长，但不能在MM平板上生长)。从MM+5-FOA平板上刮除细胞并提取脂质。通过酯交换制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard 6890 GC进行分析。
[0632] GC分析显示在生长于MM+5-FOA平板上的具有pZKUM的#1、#2和#3转化子中存在31.4％、31％和31.3％的EPA。这三个菌株分别称为菌株Y4259U1、Y4259U2和Y4259U3(统称为Y4259U)。
[0633] 产生Y4305菌株以生产占总脂质约53％的EPA：生成构建体 pZKD2-5U89A2(图50B；SEQ ID NO：355)以将一个Δ9延伸酶基因、一个Δ5去饱和酶基因、一个Δ8去饱和酶基因和一个Δ12去饱和酶基因整合到菌株Y4259U2的甘油二酯酰基转移酶(DGAT2)位点中，从而产生更高水平的EPA。pZKD2-5U89A2质粒含有如下组分：
[0634] 表19
[0635] 质粒pZKD2-5U89A2(SEQ ID NO：355)的描述
[0636]
[0637]
[0638] 将pZKD2-5U89A2质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y4259U2。将转化细胞铺在MM平板上，并在30℃下保持3至4天。将单菌落再划线接种到MM平板上，并用所得菌落接种液体MM。将液体培养物在30℃下以250rpm/min摇动2天。离心收集细胞，重悬于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。离心收集细胞并提取脂质。通过酯交换制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard 6890GC进行分析。
[0639] GC分析显示大多数所选的96菌株产生占总脂质40％至46％的EPA。四个菌株，称为Y4305、Y4306、Y4307和Y4308，分别产生占总脂质约53.2％、46.4％、46.8％和47.8％的EPA。Y4305的完整脂质谱如下：16：0(2.8％)，16：1(0.7％)，18：0(1.3％)，18：1(4.9％)，18：2(17.6％)，ALA(2.3％)，EDA(3.4％)，DGLA(2.0％)，ARA (0.6％)，ETA(1.7％)，和EPA(53.2％)。总脂质％干细胞重(dcw)为27.5。
[0640] 相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y4305的最终基因型为 SCP2-(YALI0E01298g)、YALI0C18711g-、Pex10-、YALI0F24167g-，未 知 1-、未 知
3-、 未 知 8-、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::OCT、GPM/FBAIN::FmD12S::OCT、EXP1::FmD12S::Aco、YAT1::FmD12S::Lip2、YAT1::ME3S::Pex16、EXP1::ME3S::Pex20(3个 拷 贝 )、GPAT::EgD9e::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、FBA::EgD9eS::Pex20、GPD::EgD9eS::Lip2、YAT1::EgD9eS::Lip2、YAT1::E389D9eS::OCT、FBAINm::EgD8M::Pex20、FBAIN::EgD8M::Lip1(2 个 拷 贝 )、EXP1::EgD8M::Pex16、GPDIN::EgD8M::Lip1、YAT1::EgD8M::Aco、FBAIN::EgD5::Aco、EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::EgD5S::Aco、EXP1::EgD5S::ACO、YAT1::RD5S::OCT、YAT1::PaD17S::Lip1、EXP1::PaD17::Pex16、FBAINm::PaD17::Aco、YAT1::Y1CPT1::ACO、GPD::Y1CPT1::ACO.[0641] 菌株Y4305U3(Ura3-)的生成：为了破坏菌株Y4305中的Ura3基因，使用构建体pZKUM(图50A；SEQ ID NO：353)以将Ura3突变基因整合到菌株Y4305的Ura3基因中。
采集在MM+5-FOA平板上生长的总共8个转化子，并将它们分别再划线接种到MM平板和MM+5-FOA平板上。所有8个菌株具有Ura-表型(即，细胞能在MM+5-FOA平板上生长，但不能在MM平板上生长)。从MM+5-FOA平板上刮除细胞并提取脂质。通过酯交换制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard6890 GC进行分析。
[0642] GC分析显示在生长于MM+5-FOA平板上的#1、#6和#7 pZKUM转化子中存在37.6％、37.3％和36.5％的EPA。这三个菌株分别称为菌株Y4305U1、Y4305U2和Y4305U3(统称为Y4305U)。
[0643] 构造解脂耶氏酵母菌株Y4184U
[0644] 在下文实施例32、33、34和51中使用解脂耶氏酵母菌株Y4184U作宿主51。菌株Y4184U来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362，能够经由表达Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径产生相对于总脂质约31％的EPA。
[0645] 菌株Y4184U的发展需要构建菌株Y2224、菌株Y4001、菌株Y4001U、菌株Y4036、菌株Y4036U和菌株Y4069(同上)。菌株Y4184U (图示于图51A中)的进一步发展需要构建菌株Y4084(产生14％的EPA)、菌株Y4084U1(Ura-)、菌株Y4127(产生18％的EPA)、菌株Y4127U2(Ura-)、菌株Y4158(产生25％的EPA)、菌株Y4158U1(Ura-)和菌株4184(产生30.7％的EPA)。虽然本文未详细描述关于转化和选择在菌株Y4069之后发展的EPA生产菌株的细节，用于分离菌株Y4084、菌株Y4084U1、菌株Y4127、菌株Y4127U2、菌株Y4158、菌株Y4158U1、菌株Y4184和菌株Y4184U的方法在构建菌株Y4305的过程中进行了描述，同上。
[0646] 简而言之，利用构建体pZP3-Pa777U(图47A；SEQ ID NO：338)以将三个Δ17去饱和酶基因整合到菌株Y4069的Pox3位点(GenBank登录号AJ001301)中，从而分离菌株Y4084(产生14％的EPA)。菌株Y4084U1通过在菌株Y4084中的构建体pY117(图47B；SEQ ID NO：343)中临时表达Cre重组酶以生产Ura-表型被创造出来。利用构建体pZP2-2988(图48A；SEQ ID NO：345)以将一个Δ12去饱和酶基因、两个Δ8去饱和酶基因和一个Δ9延伸酶基因整合到菌株Y4084U1的Pox2位点(GenBank登录号AJ001300)中，从而分离菌株Y4127(产生18％的EPA)。解脂耶氏酵母菌株Y4127在2007年11月29日保藏于美国典型培养物保藏中心，命名为ATCC PTA-8802。
[0647] 通过破坏菌株Y4127中的Ura3基因，经由构建体pZKUE3S(图48B；SEQ ID NO：351)，包括靶向Ura3基因的嵌合EXP1::ME3S::Pex20基因，创造菌株Y4127U2。利用构建体pZKL1-2SP98C(图49B；SEQ ID NO：352)以将一个Δ9延伸酶基因、一个Δ8去饱和酶基因、一个Δ12去饱和酶基因和一个解脂耶氏酵母甘油二酯胆碱磷酸转移酶基因(CPT1)整合到菌株Y4127U2的Lip1位点(GenBank登录号Z50020)中，从而分离菌株Y4158(产生
25％的EPA)。然后创造出Ura-衍生物(即，菌株Y4158U1)，这经由转化构建体pZKUE3S(图
48B；SEQ ID NO：351)，包括靶向Ura3基因的嵌合EXP1::ME3S::Pex20基因。最后，利用构建体pZKL2-5U89GC(图49A；SEQ ID NO：348)以将一个Δ9延伸酶基因、一个Δ8去饱和酶基因、一个Δ5去饱和酶基因和一个解脂耶氏酵母CPT1整合到菌株Y4158U1的Lip2位点(GenBank登录号AJ012632)中，从而分离菌株Y4184。
[0648] Y4184的完整脂质特征如下：16：0(3.1％)，16：1(1.5％)，18：0 (1.8％)，18：1(8.7％)，18：2(31.5％)，ALA(4.9％)，EDA(5.6％)，DGLA(2.9％)，ARA(0.6％)，ETA(2.4％)，和EPA(28.9％).总脂质％干细胞重(dcw)为23.9。
[0649] 相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y4184的最终基因型为未知1-、未知2-、未知4-、未知5-、未知6-、未知7-、YAT1::ME3S::Pex16、EXP1::ME3S::Pex20(2个 拷 贝 )、GPAT::EgD9e::Lip2、FBAINm::EgD9eS::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、FBA::EgD9eS::Pex20、YAT1::EgD9eS::Lip2、GPD::EgD9eS::Lip2、GPDIN::EgD8M::Lip1、YAT1::EgD8M::Aco、EXP1::EgD8M::Pex16、FBAINm::EgD8M::Pex20、FBAIN::EgD8M::Lip1(2个 拷 贝 )、GPM/FBAIN::FmD12S::Oct、EXP1::FmD12S::Aco、YAT1::FmD12::Oct、GPD::FmD12::Pex20、EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::EgD5S::Aco、YAT1::Rd5S::Oct、FBAIN::EgD5::Aco、FBAINm::PaD17::Aco、EXP1::PaD17::Pex16、YAT1::PaD17S::Lip1、YAT1::Y1CPT1::Aco、GPD::Y1CPT1::Aco。
[0650] 为了破坏菌株Y4184中的Ura3基因，使用构建体pZKUM(图50A；SEQ ID NO：353)以将Ura3突变基因整合到菌株Y4184的Ura3基因中。
[0651] 采集在MM+5-FOA平板上生长的总共11个转化子，并将它们分别再划线接种到MM平板和MM+5-FOA平板上。所有11个菌株具有Ura-表型(即，细胞能在MM+5-FOA平板上生长，但不能在MM平板上生长)。从MM+5-FOA平板上刮除细胞；提取脂质；并通过酯交换制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard 6890 GC进行分析。
[0652] GC分析显示在生长于MM+5-FOA平板上的具有pZKUM的#7、#8和#10转化子中存在11.2％、10.6％和15.5％的EPA。这三个菌株分别称为菌株Y4184U1、Y4184U2和Y4184U4(统称为Y4184U)。
[0653] 实施例1
[0654] 小眼虫生长条件、脂质特征和mRNA分离
[0655] 小眼虫获自Dr.Richard Triemer的实验室，Michigan State University(East Lansing，MI)。在500ml玻璃瓶中将10mL活性生长培养基，1mL等分试样转入250mL的小眼虫(Eg)培养基中。Eg培养基通过组合1g乙酸钠，1g牛肉膏(Cat.No.U126-01，Difco Laboratories，Detroit，MI)，2g 蛋白胨(0123-17-3，Difco Laboratories)，和2g 酵母 提取物(Cat.No.0127-17-9，Difco Laboratories)在970mL水中进行
制备。过滤除菌后，在无菌条件下加入30mL土壤-水上清液(Cat.No.15-3790，Carolina Biological Supply Company，Burlington，NC)以制备最终Eg培养基。小眼虫培养物在
23℃，16小时光照，8小时黑暗的循环条件下静置生长2个星期。
[0656] 2个星期后，移除10ml培养物用于液体分析，在1,800x g下离心5分钟。用水洗涤沉淀一次并再次离心。所得沉淀真空干燥5分钟，重悬浮于100μL三甲基氢氧化硫(TMSH)中，室温下震荡培养15分钟。此后加入0.5mL己烷并将小瓶室温下震荡培养15分钟。分离脂肪酸甲酯(从己烷层注入5μL)并进行定量，定量方法使用配有Omegawax 320熔融石英毛细柱的Hewlett-Packard 6890气相色谱仪(Supelco Inc.，Cat.No.24152)。设定烘箱温度程序如下：220℃保持2.7分钟，然后以20℃/分钟的速度升温至240℃并再保持2.3分钟。载气通过Whatman氢气发生器供应。保留时间与那些可商购获得的标准甲酯比较(Nu-Chek Prep，Inc.Cat.No.U-99-A)，所得色谱在图27中显示。
[0657] 保持2星期的培养物(240mL)通过在1,800x g离心10分钟、水洗一次并再离心制成粒状。使用RNA STAT-60试剂(TEL-TEST，Inc.，Friendswood，TX)，按照制造商提供的规TM程(使用 5mL试剂，将RNA溶解于0.5mL水中)从所得颗粒状沉淀中提取总RNA。这样从颗粒状沉淀中获得了1mg总RNA(2mg/mL)。使用mRNA纯化试剂盒(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，按照制造商提供的规程从1mg总RNA中分离mRNA。这样就获得了85μg的mRNA。
[0658] 实施例2
[0659] 小眼虫cDNA合成、文库建立和测序
[0660] 使 用 CloneminerTM cDNA Library Construction Kit(Cat.No.18249-029，Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)，按照制造商提供的规程(Version B，25-0608)建立cDNA文库。使用非放射标记方法，从3.2μgmRNA(上文所述的mRNA)中使用Biotin-attB2-Oligo(dT)引物合成cDNA。在合成第一和第二链后，加入attB1衔接子；
进行连接；使用柱层析分离大小cDNA。浓缩来自片段7和8的DNA(大小介于～800
TM TM TM
至1500bp之间)，将其重组进入pDONR 222并转化到大肠杆菌ElectroMAX DH10B T1 Phage-Resistant细胞中(Invitrogen Corporation)。将小眼虫文库命名为eeg1c。
[0661] 为了测序，首先从在384-孔冷冻培养基平板中生长/冻存的归档甘油培养物中回收克隆。使用自动QPix菌落采集器(Genetix)采集细胞，然后将细胞接种于包含LB+50μg/mL卡那霉素的96-孔深孔平板。在37℃生长20小时后，离心收集细胞并在-20℃下贮存。然后质粒在Eppendorf 5Prime机械手上使用改进96-孔板式碱性裂解小量制备法(Eppendorf PerfectPrep)进行分离。简而言之，使用过滤器和真空歧管以利于在乙酸沉淀后移除细胞碎片。然后使质粒DNA直接从滤液中结合到第二个过滤板上，并进行洗涤、干燥和稀释。
[0662] 使用载体M13F通用引物(SEQ ID NO：1)和ABI BigDye version 3Prism测序试剂盒在384-孔板中进行质粒的末端测序。100至200ng模板和6.4pmol引物被用于测序反应，重复以下反应条件25次：96℃10秒，50℃5秒，60℃4分钟。用乙醇清洁后，将循环序列反应产物溶解并用Perkin-Elmer ABI 3700自动测序仪进行检查。
[0663] 实施例3
[0664] 鉴定来自小眼虫cDNA文库eeg1c的C20-PUFA延伸酶同源物
[0665] 编 码C20-PUFA 延 伸 酶 同 源 物 (即，“C20-PUFA Elo”)的 cDNA克 隆 通过 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul 等 人，J.Biol.215：403-410(1993))搜索BLAST“nr”数据库中包含的相似序列进行鉴别(包括所有非冗余GenBank CDS翻译物、来源于3-维结构Brookhaven Protein Data Bank的序列、SWISS-PROT蛋白质序列数据库、EMBL和DDBJ数据库的最终主要释放物)。采用国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTN算法，分析如实施例2中获得的cDNA序列与包含在“nr”数据库中的所有可公开获得的DNA序列的相似性。在所有的阅读框中翻译DNA并使用NCBI提供的BLASTX算法比较“nr”数据库中包含的所有公开可用的蛋白质序列的相似性(Gish and States，Nat.Genet.3：266-272(1993))。为方便起见，通过BLAST计算仅仅偶然观察到cDNA序列与所搜索的数据库中所包含序列的匹配的P-值(概率)在本文报导为“pLog”值，它代表所报导的P-值的负对数。因此，pLog值越大，cDNA序列和BLAST的“匹配”代表同源蛋白的可能性就越大。
[0666] 使用来自克隆eeg1c.pk005.p14.f的核苷酸序列进行的BLASTX搜索 揭示了由cDNA编码的蛋白与来自巴夫藻CCMP459(SEQ ID NO：2)(NCBI登录号AAV33630(GI54307108)，locus AAV33630，CDSAY630573；Pereira 等 人，Biochem.J.384：
357-366(2004))的C20-PUFAElo的相似度。来自克隆eeg1c.pk005.p14.f的cDNA插入的部分序列显示于SEQ ID NO：3(cDNA插入的5′末端)中。随后，获取全长插入序列(即，eeg1c.pk005.p14.f：fis)并在SEQ ID NO：4中显示。编码序列(CDS)的序列在SEQ ID NO：
5中显示。对应的推导氨基酸序列的序列在SEQ ID NO：6中显示。
[0667] 使用改进转座规程完成全长插入序列(FIS)。从归档的甘油原种作为单一菌落回收确定了FIS的克隆，并通过碱性裂解分离质粒DNA。质粒模板经由Template Generation System(TGS II)转座试剂盒(Finnzymes Oy，Espoo，Finland)按照制造商的规程进行转座。通过电穿孔将转座DNA转化到EH10B电穿孔感受态细胞(Edge BioSystems，Gaithersburg，MD)中。从每次转座反应随机地选择多个转化子，制备质粒DNA，并用独特引物SeqE(SEQ ID NO：7)和SeqW(SEQ ID NO：8)从转座事件位点向外进行测序，如上所述(ABI BigDye v3.1)。
[0668] 收集(ABI Prism Collections软件)序列数据并使用Phrap序列拼接程序(P.Green，University of Washington，Seattle)进行拼接。通过用于最终编辑的Consed序列编辑工具(D.Gordon，University of Washington，Seattle)观察拼接。
[0669] 在SEQ ID NO：6中示出的氨基酸序列通过BLASTP进行评估，产生对巴夫藻CCMP459 C20-PUFA Elo(SEQ ID NO：2)的pLog值为61.22(6e-62的E值)。使用Jotun Hein方法计算出在SEQ ID NO：6中示出的氨基酸序列与巴夫藻CCMP459 C20-PUFA Elo序列(SEQ ID NO：2)有45.1％相同。使用Jotun Hein方法进行的序列百分比同一性计算(Hein，J.J.，Meth.Enz.183：626-645(1990))通过LASERGENE计算生物信息学程序包TM(DNASTA Inc.，Madison，WI)的MegAlign v6.1程序完成，该程序使用双序列比对的预设参数(KTUPLE＝2)。使用Clustal V计算出在SEQ ID NO：6中示出的氨基酸序列与巴夫藻CCMP459C20-PUFA Elo序列(SEQ ID NO：2)有40.4％相同。通过Clustal V方法进行的序列百分比同一性计算(Higgins，D.G.和Sharp，P.M.，Comput.Appl.Biosci.5：
151-153(1989)；Higgins等人，Comput.Appl.Biosci. 8：189-191(1992))通过LASERGENTM
计算生物信息学程序包(同上)的MegAlign v6.1程序完成，该程序使用双序列比对的预设参数(KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5，DIAGONALS SAVED＝5，GAP LENGTH PENALTY＝10)。BLAST得分和概率指示本发明的核酸片段(SEQ ID NO：5)编码整个小眼虫C20-PUFA Elo基因，在此命名为EgC20elo1。
[0670] 图25综述了EgC20elo1(实施例3)、EgDHAsyn1(下文实施例4)和EgDHAsyn2(下文实施例5)的BLASTP和百分比同一性值。
[0671] 实施例4
[0672] 鉴定来自小眼虫cDNA文库eeg1c的DHA合酶1(EgDHAsyn1)
[0673] 如实施例3中所述，通过BLAST搜索在BLAST“nr”数据库中包含的序列相似性，鉴定编码附加C20-PUFA Elo同源物的cDNA克隆。
[0674] 使用来自克隆eeg1c.pk016.e6.f(也称为pKR1049)的核苷酸序列进行的BLASTX搜索揭示了由cDNA编码的蛋白与来自巴夫藻CCMP459(SEQ ID NO：2)(NCBI登录号AAV33630(GI 54307108)，locusAAV33630，CDS AY630573；Pereira等人，Biochem.J.384：
357-366(2004))。来自克隆eeg1c.pk016.e6.f的cDNA插入的部分序列显示于SEQ ID NO：
9(cDNA插入的5′末端)中。随后，获取如实施例3中所述的全长插入序列(eeg1c.pk016.e6.f：fis)并在SEQ ID NO：10中显示。编码序在SEQ ID NO：11中显示；对应的推导氨基酸序列在SEQ ID NO：12中显示。
[0675] 在SEQ ID NO：12中示出的氨基酸序列通过实施例3中所述的BLASTP进行评估。有趣的是，发现SEQ ID NO：12与C20-PUFA Elo和Δ4脂肪酸去饱和酶相似。SEQ ID NO：
12(大约来自氨基酸16-268)的N末端对巴夫藻CCMP459 C20-PUFA Elo(SEQ ID NO：2)产生的pLog值为60.30(5e-61的E值；124/258相同氨基酸；48％的同一性)。SEQ ID NO：
12(大约来自氨基酸253-793)的C末端的产生E值为0.0(535/541相同氨基酸；98％的同一性)，该值为对来自小眼虫(SEQ ID NO：13)(NCBI登录号AAQ19605(GI 33466346)，位点AAQ19605，CDS AY278558；Meyer等人，Biochemistry 42(32)：9779-9788(2003))的Δ4脂肪酸去饱和酶的值。BLAST得分和概率指示本发明的核酸片段(SEQ ID NO：11)编码整个小眼虫C20-PUFA Elo/Δ4脂肪酸去饱和酶 融合基因，在此命名为小眼虫DHA合酶
1(EgDHAsyn1)。
[0676] EgDHAsyn1(SEQ ID NO：12)的氨基酸序列与来自巴夫藻CCMP459(SEQ ID NO：2)的C20-PUFA Elo有47.8％相同，与来自小眼虫(SEQ ID NO：13)的Δ4脂肪酸去饱和酶有98.9％相同，使用如实施例3中所述的Jotun Hein方法。EgDHAsyn1(SEQ ID NO：12)的氨基酸序列与来自巴夫藻CCMP459(SEQ ID NO：2)的C20-PUFA Elo有41.2％相同，与来自小眼虫(SEQ ID NO：13)的Δ4脂肪酸去饱和酶有98.9％相同，使用如实施例3中所述的Clustal V方法。
[0677] 图27综述了EgDHAsyn1(实施例4)、EgC20elo1(实施例3，同上)和EgDHAsyn2(下文实施例5)的BLASTP和百分比同一性值。
[0678] 实施例5
[0679] 鉴定来自小眼虫cDNA文库eeg1c的DHA合酶2(EgDHAsyn2)
[0680] 将小眼虫cDNA文库eeg1c的大约17,000个克隆铺在三个较大的方形(24cm×24cm)培养平板上(Corning，Corning，NY)，每个平板包含LB+50μg/mL卡那霉素琼脂培养基。细胞在37℃培养过夜，然后将平板冷却至室温。
[0681] 菌落转移：
[0682] 将 Biodyne B 0.45μm 膜 (Cat.No.60207，Pall Corporation，Pensacola，FL)裁成大约22cm×22cm大小，并将膜仔细置于琼脂顶部以避免气泡。在室温下孵育2分钟后之后，标记膜的方向，用镊子取下膜，并将菌落侧置于滤纸上，滤纸在0.5M氢氧化钠和1.5M氯化钠中浸泡过。变性4分钟后，将膜置于滤纸上中和氢氧化钠，滤纸在
0.5MTris-HCL(pH7.5)和1.5M氯化钠中浸泡4分钟。重复该步骤，并在2X SSC缓冲液(20X SSC是3M氯化钠，0.3M柠檬酸钠；pH 7.0)中简单漂洗膜，风干滤纸。
[0683] 杂交：
[0684] 膜在65℃下在200mL杂交液中预杂交2小时。杂交液包含6X SSPE(20X SSPE是3M氯化钠，0.2M磷酸钠，20mM EDTA；pH7.4)，5X Denhardt′s试剂(100X Denhardt试剂是
2％(w/v)Ficoll，2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮，2％(w/v)乙酰牛血清白蛋白)，0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)，100μg/mL剪切鲑精DNA，和5％硫酸葡聚糖。
[0685] 使用琼脂糖凝胶纯化的NcoI/NotI DNA片段制备DNA探针，该片 段包含来自32
pY141(描述于本文实施例10)的EgDHAsyn1*并用p dCTP进行了标记，该标记方法使用RadPrime DNA Labeling System(Cat.No.18428-011，Invitrogen，Carlsbad，CA)，按
32
照制造商的说明书进行。未掺入的P dCTP使用NICK柱(Cat.No.17-0855-02，Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)按照制造商的说明书进行分离。在100℃变性探针5分钟并置于冰上3分钟；然后，将一半加入到杂交液中。
[0686] 膜和探针在65℃轻摇杂交过夜，然后在第二天用包含0.5％SDS(每次5分钟)的2X SSC洗涤两次，并用包含0.1％SDS(每次15分钟)的0.2X SSC洗涤两次。洗涤后，胶片(Cat.No.RPN30K，Amersham Biosciences)和所述膜在-80℃下曝光过夜。
[0687] 基于平板与曝光胶片的比对结果，使用Pasteur吸移管的钝端将阳性克隆采集到1mL水中并涡旋混合。进行几次稀释并铺在包含LB培养基加50μg/mL卡那霉素的小圆培养皿(82mm)上以获取在单个平板上的约100孔的分离菌落。除使用NytranN圆形膜(Cat，No.10416116，Schleicher&Schuell，Keene，NH)之外，如上所述完成转移，使用剩余100mL放射标记探针完成杂交。这样就鉴定了一个阳性克隆(命名为eeg1c-1)。来自eeg1c-1的质粒也可称为pLF116。
[0688] 单个阳性克隆在37℃下在LB+50μg/mL卡那霉素液体培养基中生长，并且使用Spin Miniprep Kit(Qiagen Inc.，Valencia，CA)按照制造商的规程纯化质粒。质粒插入序列如实施例2所述，使用ABI BigDye version 3 Prism测序试剂盒，利用载体M13F通用引物(SEQ ID NO：1)、载体M13rev引物(SEQ ID NO：14)和poly(A)尾WobbleT寡核苷酸进行测序。简而言之，WobbleT引物是21mer poly(T)A、poly(T)C和poly(T)G的克分子数相等的混合物，用于对cDNA克隆的3′末端测序。基于原始序列数据，使用寡核苷酸oEUGel4-1(SEQ ID NO：15)、EgEloD4Mut-5(SEQ ID NO：16)、oEUGel4-2(SEQ ID NO：
17)、EgDHAsyn5′(SEQ ID NO：18)和EgDHAsyn3’(SEQ ID NO：19)，以类似方法获取附加的内部片段序列。这样就获取了eeg1c-1的全长插入序列并在SEQ ID NO：20中显示。编码序列在SEQ ID NO：21中显示；对应的推导氨基酸序列在SEQ ID NO：22中显示。
[0689] 在SEQ ID NO：22中示出的氨基酸序列通过实施例3中所述的BLASTP进行评估。在EgDHAsyn1的情况下，发现SEQ ID NO：22与 C20-PUFA Elo和Δ4脂肪酸去饱和酶相似。
SEQ ID NO：22(大约来自氨基酸41至268)的N末端对巴夫藻CCMP459 C20-PUFA Elo(SEQ ID NO：2)产生的pLog值为61.0(1e-61的E值；118/231相同氨基酸；51％的同一性)。
CCMP459 C20-PUFA Elo(SEQ ID NO：2)的pLog值为61.22(6e-62的E值)。SEQ ID NO：
22(大约来自氨基酸253至793)的C末端的产生E值为0.0(541/541相同氨基酸；100％的同一性)，该值为对来自小眼虫(SEQ ID NO：13)Δ4脂肪酸去饱和酶氨基酸序列的值。
BLAST得分和概率指示本发明的核酸片段(SEQ ID NO：21)编码整个小眼虫C20-PUFA Elo/Δ4脂肪酸去饱和酶融合基因，在此命名为小眼虫DHA合酶2(EgDHAsyn2)。
[0690] EgDHAsyn2(SEQ ID NO：22)的氨基酸序列与来自巴夫藻CCMP459(SEQ ID NO：2)的C20-PUFA Elo有48.2％相同，与来自小眼虫(SEQ ID NO：13)的Δ4脂肪酸去饱和酶有100％相同，使用如实施例3中所述的Jotun Hein方法。EgDHAsyn2(SEQ ID NO：22)的氨基酸序列与来自巴夫藻CCMP459(SEQ ID NO：2)的C20-PUFA Elo有41.2％相同，与来自小眼虫(SEQ ID NO：13)的Δ4脂肪酸去饱和酶有100％相同，使用如实施例3中所述的Clustal V方法。
[0691] 图25综述了EgDHAsyn2(实施例5)、EgC20elo1(实施例3，同上)和EgDHAsyn1(实施例4，同上)的BLASTP和百分比同一性值。
[0692] 实施例6
[0693] EgC20elo1、EgDHAsyn1和EgDHAsyn2的一级结构分析
[0694] 假设在EgDHAsyn2(SEQ ID NO：22)的C末端和小眼虫Δ4去饱和酶(SEQ ID NO：13)之间的氨基酸同一性为100％，在EgDHAsyn2(SEQ ID NO：21)的编码序列、小眼虫Δ4去饱和酶(SEQ ID NO：23)(NCBI登录号AY278558(GI 33466345)，位点AY278558，Meyer等人，Biochemistry 42(32)：9779-9788(2003))的cDNA序列和小眼虫Δ4去饱和酶(SEQ ID NO：24)(Meyer等人，同上)的编码序列之间进行核苷酸序列比对。通过Clustal W方TM
法(使用LASARGENE生物信息计算包(DNASTAR Inc.)的MegAlign v6.1程序，多序列比对的预设参数(空位罚分＝10，间隙长度罚分＝0.2，Delay Divergen Seqs(％)＝30，DNA Transition Weight＝0.5，Protein Weight Matrix＝Gonnet Series，DNA Weight Matrix＝IUB)进行序列比对。比对结果显示于图2中。将小眼 虫Δ4去饱和酶编码序列命名为EgD4_CDS(SEQ ID NO：24)；将小眼虫Δ4去饱和酶cDNA序列命名为EgD4_cDNA(SEQ ID NO：
23)；并将小眼虫DHA合酶2编码序列命名为EgDHAsyn2_CDS(SEQ ID NO：21)。
[0695] 截短比对序列的5’末端(在该处序列不同)和3’末端(在该处序列相同)以便在一页上进行比对。图2示出了序列从小眼虫Δ4去饱和酶cDNA的起始处至编码序列(CDS)起始位点的83bp上游处高度不同。从比对结果可以清楚的看到EgD4_cDNA和EgDHAsyn2_CDS的核苷酸序列从小眼虫Δ4去饱和酶cDNA序列(SEQ ID NO：23)CDS起始位点的83bp上游处是相同的，这等同于从EgDHAsyn2_CDS(SEQ ID NO：21)的核苷酸674序列末端。在开始不同的确切位点，NotI位点可见于小眼虫cDNA序列(SEQ ID NO：23的核苷酸656-663)，并且因为NotI接头被用于小眼虫Δ4去饱和酶cDNA(参见Meyer等人，同上)的原始克隆，可能所克隆的序列是EgDHAsyn2不完全的、非全长的转录物。
[0696] 使用如上所述的Clustal W方法将氨基酸序列EgDHAsyn1(SEQ ID NO：12)与EgDHAsyn2(SEQ ID NO：22)和EgC20elo1(SEQ ID NO：6)进行比较，比对结果显示于图3A和3B中。与EgDHAsyn1和EgDHAsyn2相比，EgC20elo1在N末端具有7个氨基酸(即，A L D L A[V/I]L)的删除和2个其他氨基酸的取代(即，W47R，T48I；基于EgDHAsyn1编号)。在EgC20elo1的氨基酸289之后，当与DHA合酶比较时序列差异很大。EgDHAsyn1和EgDHAsyn2在C末端具有与Δ4脂肪酸去饱和酶同源的498个附加氨基酸，然而EgC20elo1末端之后仅有9个附加氨基酸。EgDHAsyn1(SEQ ID NO：12)和EgDHAsyn2(SEQ ID NO：22)的氨基酸序列在2序列之间具有8个氨基酸差异(即，V25I，G54V，A305T，L310P，V380I，S491N，I744T，R747P；基于EgDHAsyn1编号)。最后的四个差异发生在Δ4去饱和酶结构域。
[0697] 图4A和4B显示EgDHAsyn1(SEQ ID NO：12)N末端和EgDHAsyn2(SEQ ID NO：22)N末端与EgC20elo1(SEQ ID NO：6)，巴夫藻CCMP459C20-PUFA Elo(SEQ ID NO：2)、绿藻PUFA延伸酶2(SEQ ID NO：25)(NCBI登录号AAV67798(GI 55852396)，位点AAV67798，CDS AY591336；Meyer等人，J.Lipid Res.45(10)：1899-1909(2004))和 假微型海链藻PUFA延伸酶2(SEQ ID NO：26)(NCBI登录号AAV67800(GI 55852441)，位点AAV67800，CDS AY591338；Meyer等人，J.Lipid Res.，同上)的Clustal W比对结果。在图4A和4B中，巴夫藻、绿藻、和假微型海链藻蛋白质分别标记为PavC20elo、OtPUFAelo2和TpPUFAelo2。
[0698] 图5A、5B、5C和5D显示EgDHAsyn1(EgDHAsyn1_CT；SEQ ID NO：12的氨基酸253至793；不显示EgDHAsyn1的N末端并用“...”表示)C-末端和EgDHAsyn2(EgDHAsyn2_CT；SEQ ID NO：22的氨基酸253至793，不显示EgDHAsyn2的N末端并用“...”表示)的C-末端与小眼虫Δ4脂肪酸去饱和酶(SEQ ID NO：13)、金黄色破囊壶菌Δ4去饱和酶(SEQ ID NO：27)(NCBI登录号AAN75707(GI 25956288)，位点AAN75707，CDS AF391543)、聚合裂殖壶菌Δ4去饱和酶(SEQ ID NO：28)(PCT公开WO 2002/090493)、假微型海链藻Δ4去饱和酶(SEQ ID NO：29)(NCBI登录号AAX14506(GI 60173017)，位点AAX14506，CDS AY817156；
Tonon等人，FEBS J.272(13)：3401-3412(2005))和绿光等鞭金藻Δ4去饱和酶(SEQ ID NO：30)(NCBI登录号AAV33631(GI 54307110)，位点AAV33631，CDS AY630574；Pereira等人，Biochem.J.384(2)，：357-366(2004)和PCT公开WO2002/090493)。在图5A、5B、5C和5D中，眼虫、金黄色破囊壶菌、假微型海链藻、和绿光等鞭金藻蛋白质分别标记为EgD4、TaD4、TpD4和IgD4。
[0699] 图6显示EgDHAsyn1(标记为“EgDHAsyn1_NCT.pro”；SEQ ID NO：12的氨基酸253至365)和EgDHAsyn2(标记为“EgDHAsyn2_NCT.pro”；SEQ ID NO：22的氨基酸253至365)的跨越C20延伸酶区域和Δ4去饱和酶结构域(基于同源性)的内部片段与C20延伸酶(EgC20elo1_CT.pro，SEQ ID NO：6的氨基酸246至298；PavC20elo_CT.pro，SEQ ID NO：2的氨基酸240至277；OtPUFAelo2_CT.pro，SEQ ID NO：25的氨基酸256至300；TpPUFAelo2_CT.pro，SEQ ID NO：26的氨基酸279至358)C末端和Δ4去饱和酶(EgD4_NT.pro，SEQ ID NO：13的氨基酸1至116；TaD4_NT.pro，SEQ ID NO：27的氨基酸1至47；SaD4_NT.pro，SEQ ID NO：28的氨基酸1至47；TpD4_NT.pro，SEQ ID NO：29的氨基酸1至 82；IgD4_NT.pro，SEQ ID NO：30的氨基酸1至43)N末端的比对结果。所有C20延伸酶结构域(即，VLFXXFYXXXY(SEQ ID NO：180))的C末端保守基序出现在EgD4的N末端并进一步支持EgD4成为不完整的DHA合酶。
[0700] 在EgDHAsyn1、EgDHAsyn2和EgC20elo1中的每一个的C20延伸酶结构域的C末端，存在包含NG基序(即，KNGK(SEQ ID NO：186)、PENGA(SEQ ID NO：187)、PENGA(SEQ ID NO：187)和PCENGTV(SEQ ID NO：191)的重复序列；称为NG重复，在图6中用序列下的划线指示)。虽然该模式发生的概率很高，但使用Prosite扫描NG重复区域证明在此区域中最后的NG基序(即，NGTV)是潜在的N-糖基化位点。在NG重复区域之后，EgDHAsyn1和EgDHAsyn2都包含富含脯氨酸区域(图6中标记为“富含脯氨酸的接头”)，该区域可作为C20延伸酶和Δ4去饱和酶结构域之间的接头。该接头可在合适的结构取向中起到保留C20延伸酶和Δ4去饱和酶结构域的作用，从而允许EPA有效的转化成DHA。虽然富含脯氨酸的接头在图6中显示为从P304延伸至V321(基于EgDHAsyn1编号)，但NG重复区域也有些富含脯氨酸并且也可起到接头功能。
[0701] 如图6中定义的EgDHAsyn1，其富含脯氨酸的接头的核苷酸序列及对应的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：197和SEQ ID NO：198中示出。如图6中定义的EgDHAsyn2，其富含脯氨酸的接头的核苷酸序列及对应的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：199和SEQ ID NO：200中示出。
[0702] 来自EgDHAsyn1的EgDHAsyn1 C20延伸酶结构域的核苷酸序列及对应的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：201和SEQ ID NO：202中示出。EgDHAsyn2 C20延伸酶结构域的核苷酸序列及对应的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：203和SEQ ID NO：204中示出。
[0703] 实施例7
[0704] 构建pDMW263
[0705] 质粒pY5-30(它以前描述于美国专利公开7,259,255(其内容以引用方式并入本文))，是能够在大肠杆菌和解脂耶氏酵母中复制的穿梭质粒。质粒pY5-30包含以下组分：耶氏酵母属自主复制序列(ARS18)；ColE1质粒复制起点；用于在大肠杆菌中选择的氨苄青R
霉素抗性基因(Amp)；耶氏酵母属LEU2基因，用于选择耶氏酵母属；和嵌合 TEF：：GUS：：
XPR基因。质粒pDMW263(SEQ ID NO：31)通过使用本领域技术人员熟知的技术，用解脂耶氏酵母FBAINm启动子(美国专利公开7,202,356)取代TEF启动子，从pY5-30中创造出来。简而言之，FBAIN启动子位于在果糖双磷酸醛缩酶(E.C.4.1.2.13)的‘ATG’翻译起始密码子之前的5’上游非翻译区域，由fba1基因编码。该启动子是表达必须的，并包括一部分具有内含子的5’编码区。经修饰的启动子，FBAINm，在ATG翻译起始密码子和FBAIN启动子(此处仅包括N末端的22个氨基酸)的内含子之间具有52bp的删除，并在内含子之后具有一个新的翻译共有基序。表20综述了pDMW263(SEQ ID NO：31；也描述于PCT公开WO 2007/061845)的组分。
[0706] 表20
[0707] 质粒pDMW263的组分
[0708]
[0709] 实施例8
[0710] 构建解脂耶氏酵母表达载体pY115和 目的载体pBY1和pY159
[0711] 来自pDMW263(SEQ ID NO：31)(参见实施例7中的构建体)的NcoI/SalI DNA片段包含解脂耶氏酵母FBAINm启动子，将其克隆到pDMW237(SEQ ID NO：32)的NcoI/SalI DNA片段中，该质粒以前描述于PCT公开WO 2006/012325(其内容以引用方式并入本文)中。 pDMW237包含来源于绿光等鞭金藻的合成Δ9延伸酶基因并经密码子优化用于在解脂耶氏酵母(IgD9e)中表达。这样就制备了质粒pY115(SEQ ID NO：33；图7A)。在图7A中，将经修饰的FBAINm启动子称为FBA1+内含子。经修饰的FBAINm启动子在其他图中称为FBA1+内含子或YAR FBA1 PRO+内含子；这些术语可交换地用于FBAINm。
[0712] 质粒pY115(SEQ ID NO：33)用NcoI/NotI进行消化，所得DNA末端使用Klenow补齐。在补齐形成钝末端后，DNA片段用牛小肠碱性磷酸酶进行处理并通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。包含解脂耶氏酵母FBAINm启动子的6989bp片段从琼脂糖凝胶中切离，并用Gel Extraction Kit(Qiagen Inc.，Valencia，CA)按照制造商的规程进行纯化。经纯化的6989bp片段与盒式rfA使用Gateway Vector Conversion System(Cat.No.11823-029，Invitrogen Corporation)按照制造商的规程进行连接以形成解脂耶氏酵母 目的载体pBY1(SEQ ID NO：34；图7B)。
[0713] 在构建体pBY1中，经补齐的NcoI位点提供ATG起始位点用于启动翻译。因此，转移到此表达载体的基因被表达为融合蛋白并必须位于在 克隆之后的正确框中。5’非翻译序列也导致附加的氨基酸被加到所得蛋白的N末端。因为这个原因，制备第二 目的载体，该载体移除了来自载体的ATG起始密码子，因此允许从插入基因
起始翻译。
[0714] 通过PCR，使用寡核苷酸引物oYFBA1(SEQ ID NO：35)和oYFBA1-6(SEQ ID NO：36)从质粒pY115(SEQ ID NO：33)扩增FBAINm启动子。设计引物oYFBA1(SEQ ID NO：35)以在启动子5’末端导入BglII位点，设计引物oYFBA1-6(SEQ ID NO：36)以在启动子3’末端导入NotI位点，同时移除NcoI位点并因此移除ATG起始密码子。所得PCR片段用BglII和NotI进行消化，并克隆进入包含载体主链的pY115的BglII/NotI片段以形成pY158(SEQ ID NO：37)。
[0715] 质粒pY158(SEQ ID NO：37)用NotI进行消化，所得DNA末端进行补齐。在补齐形成钝末端后，DNA片段用牛小肠碱性磷酸酶进行处理并通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。包含解脂耶氏酵母FBAINm启动子的6992bp片段从琼脂糖凝胶中切离，并用
Gel Extraction Kit(Qiagen Inc.，Valencia，CA)按照制造商的规程进行纯化。经纯化的 6992bp片段与盒式rfA使用Gateway Vector Conversion System(Cat.No.11823-029，Invitrogen Corporation)按照制造商的规程进行连接以形成解脂耶氏酵母
目的载体pY159(SEQ ID NO：38；图7C)。
[0716] 实施例9
[0717] 构建解脂耶氏酵母表达载体pBY-EgC20elo1(EgC20e1o1)、pY132(EgDHAsyn1)、pY161(EgDHAsyn1)和pY164(EgDHAsyn2)
[0718] 质粒纯化自克隆eeg1c.pk005.p14.f(实施例3)、eeg1c.pk016.e6.f(实施例4)和eeg1c-1(实施例5)，纯化使用 Spin Miniprep Kit(Qiagen Inc.，TM
Valencia，CA)，按照制造商的规程进行。使用 LR Clonase II酶混合物(Cat.
No.11791-020，Invitrogen Corporation)并按照制造商的规程，将来自eeg1c.pk001.p14.f(包括EgC20elo1)和eeg1c.pk016.e6.f(包括EgDHAsyn1)的cDNA插入序列转移到pBY1(SEQ ID NO：34；图7B)中以分别形成pBY-EgC20elo1(SEQ ID NO：39，图7D)和pY132(SEQ ID NO：40；图8A)。不将来自eeg1c-1(包括EgDHAsyn2)的cDNA插入序列转移到pBY1中，因为它将导致表达错误的翻译框。
[0719] 使用 LR ClonaseTMII酶混合物(Cat.No.11791-020，InvitrogenCorporation)并按照制造商的规程，将来自eeg1c.pk016.e6.f和eeg1c-1的cDNA插入序列转移到pY159(SEQ ID NO：38；实施例8)中以分别形成pY161(SEQ ID NO：41，图8B)和pY164(SEQ ID NO：42；图8C)。
[0720] 实施例10
[0721] 构建解脂耶氏酵母表达载体pY141(EgDHAsyn1*)、PY143(EgDHAsyn1*C20EloDoml)和pY149(EgDHAsyn1*C20EloDom2Linker)
[0722] 使用以下方法从克隆eeg1c.pk001.e6.f中扩增EgDHAsyn1：利用寡核苷酸引物TMEgEPAEloDom-5(SEQ ID NO：43)和oEUG e14-3(SEQ ID NO：44)，使用Phusion 高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)，按照制造商的规程进行扩增。将所得DNA片段克隆到 克隆载体中，该方法使用Zero PCR Cloning
Kit(Invitrogen Corporation)，按照制造商的规程进行以制备pKR1062(SEQ ID NO：45)。
[0723] 在核苷酸619至624处的内部NcoI位点被从pKR1062中的EgDHAsyn1中移除，该移除使用 Site Directed Mutagenesis kit(Cat.No.200518，Stratagene，La Jolla，CA)，利用寡核苷酸EgEloD4Mut-5(SEQ ID NO：46)和EgEloD4Mut-3(SEQ ID NO：
47)，按照制造商的规程进行。在广泛测序后，选择具有移除了NcoI位点(即，从ccatgg至ccttgg的突变)并且无其他核苷酸发生改变的克隆进行进一步研究。将此克隆命名为pLF115-7(SEQ ID NO：48)。具有NcoI移除位点(EgDHAsyn1*)的EgDHAsyn1核苷酸序列在SEQ ID NO：205中示出。对应的氨基酸序列与SEQ ID NO：12相同。
[0724] 构建质粒pY141，表达EgDHAsyn1*：来自pLF115-7(SEQ ID NO：48)的NcoI/NotI DNA片段包含EgDHAsyn1(SEQ ID NO：205；无内部NcoI位点；在EgDHAsyn1 CDS的nt 621；ccatgg至ccttgg)，将其克隆到来自pY115的NcoI/NotI DNA片段中以制备pY141(SEQ ID NO：49；图8D)，所述pY115包含解脂耶氏酵母FBAINm启动子。因此，质粒pY141包含全长EgDHAsyn1*基因(图中标记为“EgDHAsyn1(-NcoI)”)，该基因在解脂耶氏酵母FBAINm启动子(PCT公开WO 2005/049805；美国专利公开7,202,356；图中标记为“Fba1+内含子”)的控制下，和Pex20终止子序列，该序列来自耶氏酵母属Pex20基因(GenBank登录号AF054613)。
[0725] 构建质粒pY143，表达EgDHAsyn1-C20EloDoml：在pY141中的EgDHAsyn1*C20延伸酶结构域(EgDHAsyn1C20EloDoml)的核苷酸序列在SEQ ID NO：206(与SEQ ID NO：201相同，但移除了NcoI位点)中示出。对应的氨基酸序列与SEQ ID NO：202相同。
[0726] 使用以下方法从pLF115-7中扩增EgDHAsyn1C20EloDoml(SEQ ID NO：206)：利用寡核苷酸引物EgEPAEloDom-5(SEQ ID NO：43)和EgDPAEloDom-3(SEQ ID NO：50)，使用PhusionTM高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)，按照制造商的规程进行扩增。将所得DNA片段克隆到 克隆载体中，该方法使用ZeroPCR Cloning Kit(Invitrogen Corporation)，按照制造商的规程进行以制备pHD16(SEQ ID NO：51)。
[0727] 来自pHD16(SEQ ID NO：51)的NcoI/NotI DNA片段包含EgDHAsyn1C20EloDoml(无内部NcoI位点)，将其克隆到来自pY115 的NcoI/NotI DNA片段中以制备pY143(SEQ ID NO：52；图9A)，pY115包含 解脂耶氏酵 母FBAINm启动子。质粒 pY143包含EgDHAsyn1*(EgDHAsyn1C20EloDoml)的N末端结构域并且不包括富含脯氨酸的接头或Δ4去饱和酶结构域。
[0728] 构建 质粒pY149，表达EgDHAsvn1-C20EloDom2Linker：使用 以下 方法 从pLF115-7(SEQ ID NO：48)中扩增EgDHAsyn1*C20延伸酶结构域(SEQ ID NO：206)和富含脯氨酸的接头(SEQ ID NO：197)：利用寡核苷酸引物EgEPAEloDom-5(SEQ ID NO：43)和TMoEUGsyn6-2(SEQ ID NO：53)，使用Phusion 高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)，按照制造商的规程进行扩增。将所得DNA片段克隆到 克隆载
体中，该方法使用Zero PCR Cloning Kit(Invitrogen Corporation)，按照制造商的规程进行以制备pKR1071(SEQ ID NO：54)。
[0729] 将来自pKR1071(SEQ ID NO：54)的NcoI/Ecl132II DNA片段克隆到来自pY115(其中已经补齐了NotI位点)的NcoI/NotI DNA片段中以制备pY149(SEQ ID NO：55；图9B)，pY115包含解脂耶氏酵母FBAINm启动子。质粒pY149包含EgDHAsyn1C20EloDoml/富含脯氨酸的接头融合基因(即，EgDHAsyn1 C20EloDom2Linker；SEQ ID NO：207)，但是不包含Δ4去饱和酶结构域。EgDHAsyn1C20EloDom2Linker的氨基酸序列在SEQ ID NO：208中示出。除了来自EgDHAsyn1*C20延伸酶结构域和富含脯氨酸的接头的氨基酸之外，作为片段合成和克隆的结果还将4个附加氨基酸(即，SCRT)加到接头区域之后。
[0730] 实施例11
[0731] 构建解脂耶氏酵母表达载体用于生成新型C20延伸酶/Δ4去饱和酶融合蛋白[0732] 为了合成新型C20延伸酶/Δ4去饱和酶融合蛋白，将独特SbfI位点加到在富含脯氨酸连接区域(EgDHAsyn1C20EloDom3Linker)之后的EgDHAsyn1*的C20延伸酶结构域3’末端。使用以下方法从pLF115-7(SEQ ID NO：48)中扩增EgDHAsyn1C20EloDom3：利用寡TM
核苷酸引物EgEPAEloDom-5(SEQ ID NO：43)和oEUGsyn6-3(SEQ ID NO：56)，使用Phusion高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)，按照制造商的规程进行扩增。将所得DNA片段克隆到 克隆载体中，该方法使用Zero PCR
Cloning Kit(Invitrogen Corporation)，按照制造商的规程进行以制备pKR1091(SEQ ID NO：57)。
[0733] 将 来 自 pKR1091(SEQ ID NO：57) 的 NcoI/Ecl136II DNA 片 段 包 含EgDHAsyn1C20EloDom3Linker，将其克隆到来自pY115(其中补齐了NotI位点使之形成钝末端)的NcoI/NotI DNA片段中以制备pY155(SEQ ID NO：58)，pY115包含解脂耶氏酵母FBAINm启动子。
[0734] 为了合成新型C20延伸酶/Δ4去饱和酶融合蛋白，将独特SbfI位点加到多种Δ4去饱和酶的5’末端。在各种情况下，SbfI位点位于每个编码序列的ATG起始位点之后并导致在基因编码的Δ4去饱和酶的N末端加入和/或置换一些氨基酸。
[0735] 构建质粒pY156，表达EgDHAsyn1-C20EloDom3-IgD4*：使用以下方法从pRIG6(以前描述于PCT公开WO 2002/090493)中扩增绿光等鞭金藻Δ4去饱和酶(SEQ ID NO：209；IgD4)：利用寡核苷酸oRIG6-1(SEQ ID NO：59)和oRIG6-2(SEQ ID NO：60)，使用PhusionTM高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S)，按照制造商的规程进行扩增。所得DNA片段包含IgD4 CDS并与SEQ ID NO：209相同，不同的是在起始密码子(IgD4*；SEQ ID NO：210)之后的5’末端加入了SbfI位点，将该片段克隆到 克隆载体中以制备pKR1067(SEQ ID
NO：61)，克隆使用Zero PCR Cloning Kit(Invitrogen Corporation)，按照制造商的规程进行。来自pKR1067的IgD4*的氨基酸序列在SEQ ID NO：211中示出并与IgD4(SEQ ID NO：30)的氨基酸序列相同，不同的是前4个氨基酸(即，MCNA)已经变成了MALQ，这是因为在核苷酸序列中加入了SbfI位点。
[0736] 将来自包含IgD4*的pKR1067(SEQ ID NO：61)的NcoI/NotI DNA片段克隆到来自pY115的NcoI/NotI DNA片段中以制备pY150(SEQ ID NO：62；图9C)，pY115包含解脂耶氏酵母FBAINm启动子。在图9C中，将IgD4*标记为“Ig d4 DS”。这样，IgD4*可在耶氏酵母属中单独表达。
[0737] 来 自 pKR1091(SEQ ID NO：57；同 上 ) 的 XbaI/SbfI DNA 片 段 包 含EgDHAsyn1C20EloDom3Linker，将其克隆到来自包含IgD4*的pKR1067(SEQ ID NO：61)的XbaI/SbfI DNA片段中以制备pKR1097(SEQ ID NO：63)。因此，制备了在
EgDHAsyn1C20EloDom3Linker和IgD4*之间的框内融合，它们由富含脯氨酸连接区域(称为EgDHAsyn1C20EloDom3-IgD4；SEQ ID NO：212)分开。EgDHAsyn1C20EloDom3-IgD4的氨基酸序列在SEQ ID NO：213中示出。
[0738] 将来自包含EgDHAsyn1C20EloDom3-IgD4的pKR1097(SEQ ID NO：63)的NcoI/NotI DNA片段克隆到来自pY115的NcoI/NotI DNA片段中以制备pY156(SEQ ID NO：64；图9D)，pY115包含解脂耶氏酵母FBAINm启动子。在图9D中，将EgDHAsyn1C20EloDom3-IgD4标记为“EGe1-IGd4”。
[0739] 构建质粒pY152，表达EgDHAsyn1-D4Doml*：按照以下方法从pLF115-7(如实施例10所述)中扩增包含起始于富含脯氨酸连接区域末端之后的Δ4去饱和酶结构域(EgDHAsyn1D4Doml；SEQ ID NO：214；EgDHAsyn1D4Doml对应的氨基酸序列在SEQ ID NO：215中示出)的EgDHAsyn1*(SEQ ID NO：205)C末端区域：利用寡核苷酸oEGslne6-1(SEQ ID TM
NO：65)和oEUGe14-3(SEQ ID NO：44)，使用Phusion 高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S)，按照制造商的规程进行扩增。寡核苷酸oEGslne6-1(SEQ ID NO：65)在PCR产物的5’末端导入一个ATG起始密码子，后跟一个SbfI位点。将所得DNA片段克隆到 克隆
载体中，该方法使用Zero PCR Cloning Kit(Invitrogen Corporation)，按照制造商的规程进行以制备pKR1069(SEQ ID NO：66)。包含来自pKR1069(即，EgDHAsyn1D4Doml*)的EgDHAsyn1D4Doml的新CDS和氨基酸序列分别在SEQ ID NO：216和SEQ ID NO：217中示出。EgDHAsyn1D4Doml*(SEQ ID NO：217)的氨基酸序列与EgDHAsyn1D4Doml(SEQ ID NO：
215)的氨基酸序列相同，不同的是前2个氨基酸(即，SG)已经变成了MAL，这是因为在核苷酸序列中加入了SbfI位点。
[0740] 将来自包含EgDHAsyn1D4Doml*的pKR1069(SEQ ID NO：66)的NcoI/NotI DNA片段克隆到来自pY115的NcoI/NotI DNA片段中以制备pY152(SEQ ID NO：67；图10A)，pY115包含解脂耶氏酵母FBAINm启动子。在图10A中，将EgDHAsyn1D4Doml*标记为“EUG d4(fus测试)”。这样，EgDHAsyn1D4Doml*可在耶氏酵母属中单独表达。
[0741] 构建质粒pY157，表达EgDHAsyn1-C20EloDom3-EgD4Doml：来自 pKR1091(SEQ ID NO：57)的XbaI/SbfI DNA片段包含EgDHAsyn1C20EloDom3-Linker，将其克隆到来自包含EgDHAsyn1D4Doml*的pKR1069的XbaI/SbfI DNA片段中以制备pKR1099(SEQ ID NO：68)。这样，制备了在EgDHAsyn1C20EloDom和EgDHAsyn1D4Doml*之间的框内融合，它们由富含脯氨酸连接区域(称为EgDHAsyn1C20EloDom3-EgD4Doml；SEQ ID NO：218)分开。EgDHAsyn1C20EloDom3-EgD4Doml(SEQ ID NO：219)的氨基酸序列几乎与EgDHAsyn1相同，除了一个氨基酸(即，基于EgDHAsyn1编号的G323L)发生变化，这是因为SbfI克隆位点和融合连接。
[0742] 将来自 包含EgDHAsyn1C20EloDom3-EgD4Doml的pKR1099(SEQ ID NO：68) 的NcoI/NotI DNA片段克隆到来自pY115的NcoI/NotI DNA片段中以制备pY157(SEQID NO：69；图10B)，pY115包含解 脂耶氏酵母FBAINm启 动子。在图10B中，将
EgDHAsyn1C20EloDom3-EgD4Doml标记为“EGel-EGd4 fus”。
[0743] 构建质粒pY153，表达EgDHAsyn1*D4Dom2：按照以下方法从pLF115-7(如实施例10所述)中扩增包含Δ4去饱和酶结构域和一些C20延伸酶结构域(EgDHAsyn1D4Dom2；SEQ ID NO：220；EgDHAsyn1D4Dom2对应的氨基酸序列在SEQ ID NO：221中示出)的EgDHAsyn1的C末端区域，C20延伸酶结构域对应于如EgD4(SEQ ID NO：13；Meyer等人，Biochemistry
42(32)：9779-9788(2003))鉴定的氨基酸序列：利用寡核苷酸oEUGe14-4(SEQ ID NO：70)TM
和oEUGe14-3(SEQ ID NO：44)，使用Phusion 高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S)，按照制造商的规程进行扩增。将所得DNA片段克隆到 克隆载体中，该方法使用
Zero PCR Cloning Kit(Invitrogen Corporation)，按照制造商的规程进行以制
备pKR1073(SEQ ID NO：71)。
[0744] 将来自包含EgDHAsyn1D4Dom2的pKR1073(SEQ ID NO：71)的NcoI/NotI DNA片段克隆到来自pY115的NcoI/NotI DNA片段中以制备pY153(SEQ ID NO：72；图10C)，pY115包含解脂耶氏酵母FBAINm启动子。在图10C中，将EgDHAsyn1D4Dom2标记为EUG d4(HZ)。这样，EgDHAsynD4Dom2可在耶氏酵母属中单独表达。
[0745] 构建质粒pY160，表达EgDHAsyn1-C20EloDom3-SaD4*：从pRSA-1(以前描述于PCT公开WO 2002/090493)中扩增聚合裂殖壶菌Δ4去 饱和酶(SEQ ID NO：222；SaD4)，该扩TM增利用寡核苷酸oRSA1-1(SEQ ID NO：73)和oRSA1-2(SEQ ID NO：74)，使用Phusion 高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S)，按照制造商的规程进行扩增。所得DNA片段包含SaD4 CDS并与SEQ ID NO：222相同，不同的是在起始密码子(SaD4*；SEQ ID NO：223)之后的5’末端加入了SbfI位点，将该片段克隆到 克隆载体中以制备pKR1068(SEQ ID NO：
75)，克隆使用Zero PCR Cloning Kit(Invitrogen Corporation)，按照制造商的规程进行。来自pKR1068的SaD4*的氨基酸序列在SEQ ID NO：224中示出并与SaD4(SEQ ID NO：28)的氨基酸序列相同，不同的是前3个氨基酸(即，MTV)已经变成了MALQ，这是因为在核苷酸序列中加入了SbfI位点。
[0746] 来自pKR1068(SEQ ID NO：75)(部分消化以避免内部NcoI位点)的NcoI/NotI DNA片段包含SaD4*，将其克隆到来自pY115的NcoI/NotIDNA片段中以制备pY151(SEQ ID NO：76；图10D)，pY115包含解脂耶氏酵母FBAINm启动子。在图10D中，将SaD4*标记为“RSA d4 DS”。这样，SaD4*可在耶氏酵母属中单独表达。
[0747] 将来自包含SaD4*的pKR1068(SEQ ID NO：75)的SbfI/NotI DNA片段克隆到来自pY157(SEQ ID NO：69)的SbfI/NotI DNA片段中以制备pY160(SEQ ID NO：77；图11)，pY157包含EgDHAsyn1C20EloDom3Linker。这样就制备了在EgDHAsyn1C20EloDom3和SaD4*之间的框内融合，它们由富含脯氨酸连接区域(即，EgDHAsyn1C20EloDom3-SaD4；SEQ ID NO：225)分开。EgDHAsyn1C20EloDom3-SaD4的氨基酸序列在SEQ ID NO：226中示出。
[0748] 实施例12
[0749] Euglena anabena生长条件、脂质特征和mRNA分离
[0750] Euglena anabena 获 自 Dr.Richard Triemer 的 实 验 室，Michigan State University(East Lansing，MI)。移除大约2mL培养物用于液体分析，在1,800xg下离心5分钟。用水洗涤沉淀一次并再次离心。所得沉淀真空干燥5分钟，重悬浮于100μL三甲基氢氧化硫(TMSH)中，室温下震荡培养15分钟。此后加入0.5mL己烷并将小瓶室温下震荡培养15分钟。分离脂肪酸甲酯(从己烷层注入5μL)并进行定量，定量方法使用配有Omegawax 320熔融石英毛细柱的Hewlett-Packard 6890 Gas Chromatograph(Supelco Inc.，Cat.No.24152)。设定烘箱温度程序如下：170℃保持1.0分钟，然后以5℃/分钟的速度升温至240℃并再保持1.0分钟。载气通过Whatman氢气发生器供应。保留时间与那些可商购获得的标准甲酯比较(Nu-Chek Prep，Inc.Cat.No.U-99-A)，所得色谱在图12中显示。在脂肪酸谱中存在EPA和DHA说明Euglena anabena将是长链PUFA生物合成基因的良好来源，所述基因例如，但不限于，C20延伸酶、Δ4去饱和酶和/或DHA合酶。
[0751] 将剩余5mL活性生长培养物转入在125mL玻璃烧瓶中的25mLAF-6培养基(Watanabe&Hiroki，NIES-Collection List of Strains，第5版，National Institute for Environmental Studies，Tsukuba，127pp(2004))中。Euglena anabena培养物在22℃，16小时光照，8小时黑暗的循环条件下轻摇生长2个星期。
[0752] 2周后，将培养物(25mL)转入在500mL玻璃瓶中的100mL AF-6培养基中，培养物如上所述生长1个月。在这段时间后，将两个50mL等分试样转入两个包含250mL的AF-6培养基的500mL玻璃瓶中，然后培养物如上所述生长两个月(提高总共～600mL的培养物)。在此之后，培养物通过在1,800xg离心10分钟、水洗一次并再离心制成粒状。使用TMRNA STAT-60 试剂(TEL-TEST，Inc.，Friendswood，TX)，按照制造商的规程(使用5mL试剂，将RNA溶解于0.5mL水中)从所得其中一种颗粒状沉淀中提取总RNA。这样从颗粒状沉淀中获得了340μg总RNA(680μg/mL)。剩余颗粒状沉淀在液氮中冻存并贮存于-80℃。
使用mRNA纯化试剂盒(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，按照制造商提供的规程从所有340μg总RNA中分离mRNA。这样就获得了9.0μg的mRNA。
[0753] 实施例13
[0754] Euglena anabenacDNA合成、文库建立和从cDNA文库euglc鉴定DHA合酶
[0755] 使 用 CloneminerTM cDNA Library Construction Kit(Cat.No.18249-029，Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)，按照制造商的规程(Version B，25-0608)建立cDNA文 库。使用 非放射标记 方法，从5.12μgmRNA(实 施例12)中使 用Biotin-attB2-Oligo(dT)引物合成cDNA。在合成第一和第二链后，加入attB1衔接子；进TM
行连接；使 用柱层析分离大小cDNA。浓缩片段DNA，将其重组进入pDONR 222并转化到大TM TM
肠杆菌ElectroMAX DH10B T1 Phage-Resistant细胞中(Invitrogen Corporation)。将Euglena anabena文库命名为eug1c。
[0756] 将cDNA文库eug1c的大约17,000个克隆铺在3个较大的方形(24cm x 24cm)培养平板上(Corning，Corning，NY)，每个平板包含LB+50μg/mL卡那霉素琼脂培养基。如实施例5所述，细胞生长、转移到Biodyne B膜、与包含来自pY141的EgDHAsyn1*的标记NcoI/NotIDNA片段杂交。这样就鉴定了11个阳性克隆(命名为eug1c-1至eug1c-11)。
[0757] 阳性克隆生长并将DNA纯化、测序，如实施例2所述，使用载体M13F通用引物(SEQ ID NO：1)、载体M13-28Rev引物(SEQ ID NO：14)和poly(A)尾WobbleT寡核苷酸。基于原始序列数据，使用寡核苷酸EaDHAsyn5’(SEQ ID NO：78)、EaDHAsyn5’2(SEQ ID NO：79)、EaDHAsyn5’3(SEQ ID NO：80)、EaDHAsyn5′4(SEQ ID NO：81)、EaDHAsyn3’(SEQ ID NO：82)、EaDHAsyn3’2(SEQ ID NO：83)、EaDHAsyn3’3(SEQ ID NO：84)、EaDHAsyn3′4(SEQ ID NO：85)和EaDHAsyn3’5(SEQ ID NO：86)以相似方法获取附加的内部片段序列。这样就获取了eug1c克隆的全长插入序列。
[0758] 使用SequencherTM(Version 4.2，Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)比对并比较序列，这样能基于插入序列(鉴定为EaDHAsyn1至EaDHAsyn4)将克隆分成四个不同类别的其中一类。选择包含每类序列的cDNA的代表性克隆用于进一步研究，每个代表性质粒(即，pLF117-1、pLF117-2、pLF117-3和pLF117-4)的序列分别显示为SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90。一串NNNN显示的pLF117-1序列代表polyA尾区域，该区域不进行测序。EaDHAsyn1、EaDHAsyn2、EaDHAsyn3和EaDHAsyn4的编码序列分别显示为SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93和SEQ ID NO：94。EaDHAsyn1、EaDHAsyn2、EaDHAsyn3和EaDHAsyn4对应的氨基酸序列分别显示为SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：98。
[0759] 如实施例3所述，与EgDHAsyn1(SEQ ID NO：12)和EgDHAsyn2(SEQ ID NO：22)的情况一样，通过BLASTP评估EaDHAsyn1(SEQ ID NO：95)、EaDHAsyn2(SEQ ID NO：96)、EaDHAsyn3(SEQ ID NO：97) 和EaDHAsyn4(SEQ ID NO：98)的氨基酸序列，还发现所有四个EaDHAsyn序列类似于C20-PUFA Elo和Δ4脂肪酸去饱和酶。EaDHAsyn1(SEQ ID NO：95)、EaDHAsyn2(SEQ ID NO：96)、EaDHAsyn3(SEQ ID NO：97)和EaDHAsyn4(SEQ ID NO：98)的N末端均对巴夫藻CCMP459 C20-PUFA Elo(SEQ ID NO：2)产生的pLog值为58.5(3e-59的E值；114/247相同氨基酸；46％的同一性)。EaDHAsyn1(SEQ ID NO：95)、EaDHAsyn2(SEQ ID NO：96)、EaDHAsyn3(SEQ ID NO：97)和EaDHAsyn4(SEQ ID NO：98)的C末端对来自小眼虫(SEQ ID NO：13)的Δ4脂肪酸去饱和酶氨基酸序列产生的E值分别为0.0(378/538相同氨基酸；70％的同一性)，0.0(378/538相同氨基酸；70％的同一性)，0.0(379/538相同氨基酸；70％的同一性)，和0.0(368/522相同氨基酸；70％的同一性)。BLAST得分和概率指示本发明的核酸片段编码整个Euglena anabenaC20-PUFA Elo/Δ4脂肪酸去饱和酶基因。
[0760] 如实施例6所述，使用Clustal W方法比较TEaDHAsyn1(SEQ ID NO：95)、EaDHAsyn2(SEQ ID NO：96)、EaDHAsyn3(SEQ ID NO：97)和EaDHAsyn4(SEQ ID NO：98)的氨基酸序列，比对结果显示于图13A、13B和13C中。有趣的是，由于在核苷酸序列中的单bp删除，所得EaDHAsyn4(大约最后35个氨基酸)氨基酸序列的C末端高度不同于并且小于其他三个EaDHAsyn蛋白。
[0761] 当使用BLASTP氨基酸序列EgDHAsyn1(SEQ ID NO：12)比较时，EaDHAsyn1(SEQ ID NO：95)、EaDHAsyn2(SEQ ID NO：96)、EaDHAsyn3(SEQ ID NO：97)和EaDHAsyn4(SEQ ID NO：98)的氨基酸序列分别有70％(558/791)、70％(558/791)、70％(559/791)和70％(548/775)相同。
[0762] 与EgDHAsyn1(SEQ ID NO：12)和EgDHAsyn2(SEQ ID NO：22)的情况相同，所有四个EaDHAsyn序列都具有富含脯氨酸连接区域(基于EaDHAsyn1编号方式大约从P300至T332)。所述接头显示略长于EgDHAsyn1(SEQ ID NO：12)或EgDHAsyn2(SEQ ID NO：22)。所有四个EaDHAsyn序列也都缺乏存在于EgDHAsyn1和EgDHAsyn2的富含脯氨酸基序上游的NG重复基序；但是，与EgDHAsyn1和EgDHAsyn2的情况相同，在所有四个EaDHAsyn序列中此区域也轻微富含脯氨酸并可在连接功能中起到作用。
[0763] EaDHAsyn1、EaDHAsyn2、EaDHAsyn3和EaDHAsyn4的C20延伸酶结构域的核苷酸序列分别在SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：229和SEQ ID NO：230中示出。EaDHAsyn1、EaDHAsyn2和EaDHAsyn3的C20延伸酶结构域的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：
231、SEQ ID NO：232和SEQ ID NO：233中示出。EaDHAsyn4的C20延伸酶结构域的氨基酸序列与EaDHAsyn1相同。
[0764] EaDHAsyn1的富含脯氨酸的接头的核苷酸序列和氨基酸序列分别在SEQ ID NO：234和SEQ ID NO：235中示出。EaDHAsyn2、EaDHAsyn3和EaDHAsyn4的富含脯氨酸的接头的核苷酸和氨基酸序列与EaDHAsyn1相同。
[0765] 每个EaDHAsyn1、EaDHAsyn2和EaDHAsyn4的Δ4去饱和酶结构域1的核苷酸序列分别在SEQ ID NO：236、SEQ ID NO：237和SEQ ID NO：238中示出。EaDHAsyn1、EaDHAsyn2和EaDHAsyn4的Δ4去饱和酶结构域的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：240和SEQ ID NO：241中示出。EaDHAsyn3的Δ4去饱和酶结构域1的核苷酸序列和氨基酸序列与EaDHAsyn1相同。
[0766] EaDHAsyn 1、EaDHAsyn2、EaDHAsyn3和EaDHAsyn4的Δ4去饱和酶结构域2的核苷酸序列，包括富含脯氨酸的接头和C20延伸酶结构域3’末端的一部分分别在SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：244和SEQ ID NO：245中示出。EaDHAsyn1、EaDHAsyn2、EaDHAsyn3和EaDHAsyn4的Δ4去饱和酶结构域的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：248和SEQ ID NO：249中示出。
[0767] 图29综述了Euglena anabenaDHA合酶结构域序列。
[0768] 实施例14
[0769] 构建解脂耶氏酵母表达载体pY165、pY166、pY167和pY168
[0770] 使用 LR ClonaseTMII酶混合物(Cat.No.11791-020，InvitrogenCorporation)，按照制造商的规程，将来自pLF117-1(SEQ ID NO：87)、pLF117-2(SEQ ID NO：88)、pLF117-3(SEQ ID NO：89)和pLF117-4(SEQ ID NO：90)的cDNA插入序列转入pY159(SEQ ID NO：38；实施例8)以分别形成pY165(SEQ ID NO：99，图14A)、pY166(SEQ ID NO：100；图14B)，pY167(SEQ ID NO：101；图14C)和pY168(SEQ ID NO：102；图14D)。因此，每个质粒包含全长EaDHAsyn基因，该 基因在解脂耶氏酵母FBAINm启动子(PCT公开WO
2005/049805；美国专利公开7,202,356；图中标记为“Yar Fba1 Pro+内含子”)的控制下，和Pex20终止子序列，该序列来自耶氏酵母属Pex20基因(GenBank登录号AF054613)。
[0771] 实施例15
[0772] 构建大豆表达载体pKR1061用于共表达小眼虫DHA合酶1(EgDHAsyn1)和异丝水霉Δ17去饱和酶(SdD17)
[0773] 本实施例描述构建大豆载体用于共表达EgDHAsyn1(SEQ ID NO：12)与SdD17和潮霉素磷酸转移酶选择性标记(hpt)。
[0774] 使用以下方法从pKR1049(克隆eeg1c.pk016.e6.f)中扩增EgDHAsyn1：利用寡TM核苷酸引物oEGel2-1(SEQ ID NO：103)和oEUGel4-3(SEQ ID NO：44)，使用Phusion 高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)，按照制造商的规程进行扩增。
将所得DNA片段克隆到 克隆载体中，该方法使用Zero PCR Cloning
Kit(Invitrogen Corporation)，按照制造商的规程进行以制备pKR1055(SEQ ID NO：104)。
[0775] 起始质粒 pKR72(ATCC保藏号PTA-6019；SEQ ID NO：105，7085bp序列 )是pKS123的衍生物，pKS123以前描述于PCT公开WO2002/008269(其内容以引用方式并入本文)，pKR72包含潮霉素B磷酸转移酶基因(HPT)(Gritz，L.和Davies，J.，Gene 25：179-188(1983))，侧面连接有T7启动子和转录终止子(T7prom/HPT/T7term盒)，以及用于选择和在细菌(例如，大肠杆菌)中复制的细菌复制(ori)起点。此外，pKR72也包含HPT，侧面连接有35S启动子(Odell等人，Nature313：810-812(1985))和NOS 3’转录终止子(Depicker等人，J.Mol.Appl.Genet.1：561-570(1982))(35S/HPT/NOS3’盒)，用于在植物如大豆中进行选择。pKR72也包含NotI限制性位点，侧面连接有用于β-大豆伴球蛋白(Beachy等人，EMBO J.4：3047-3053(1985))的α’亚基的启动子和菜豆蛋白基因(Doyle等人，J.Biol.261：9228-9238(1986))的3’转录终止区域，因此允许克隆到NotI位点中的基因在大豆种子中发生强组织特异性表达。
[0776] 在质粒pKR72(SEQ ID NO：105，具有ATCC保藏号PTA-6019)中的βcon/NotI/Phas3’盒利用寡核苷酸引物oCon-1(SEQ ID NO：106)和 oCon-2(SEQ ID NO：107)，使用DNA聚合酶(Catalog No.M0254S，New England Biolabs Inc.，Beverly，MA)，按照制造商的规程进行扩增。所得DNA片段用XbaI进行消化并克隆到pUC19的XbaI位点以制备pKR179(SEQ ID NO：108)。
[0777] EgDHAsyn1通过NotI消化从pKR1055(SEQ ID NO：104)中释放出来，并将其克隆到质粒pKR179(SEQ ID NO：108)的NotI位点以制备pKR1057(SEQ ID NO：109)。
[0778] pKR1057(SEQ ID NO：109)的SbfI片段包含βcon/EgDHAsyn1/Phas3’盒，将其克隆到包含SdD17的pKR328中(SEQ ID NO：110的SbfI位点；描述于PCT公开WO2004/071467中，其内容以引用方式并入本文)，以制备载体pKR1061(SEQ ID NO：111)。
pKR1061描绘示意图在图15A中显示。
[0779] 实施例16
[0780] 构建大豆表达载体pKR973用于共表达鲁兹巴夫藻Δ8去饱和酶(PavD8)与小眼虫Δ9延伸酶(EgD9elo)以及高山被孢霉Δ5去饱和酶(MaD5)
[0781] 小眼虫Δ9延伸酶(EgD9elo)：
[0782] 来自眼虫cDNA文库(eeg1c)的克隆称为eeg1c.pk001.n5f，包含小眼虫Δ9延伸酶(EgD9elo；SEQ ID NO：112；它描述于美国申请11/601,563(提交于2006年11月16日，2007年5月24日公布为US-2007-0118929-A1；Attorney Docket No.BB-1562)，其内容以引用方式并入本文)，将其用作模板以扩增EgD9elo，扩增利用寡核苷酸引物oEugEL1-1(SEQ ID NO：113)和oEugEL1-2(SEQ ID NO：114)，使用 DNA聚合酶(Cat.No.M0254S，New England Biolabs Inc.，Beverly，MA)，按照制造商的规程进行。将所得DNA片段克隆到 克隆载体中，该方法使用Zero PCR Cloning Kit(Invitrogen
Corporation)，按照制造商的规程进行以制备pKR906(SEQ ID NO：115)。
[0783] 质粒pKR906用NotI进行消化，将包含小眼虫Δ9延伸酶的片段克隆到质粒pKR132(SEQ ID NO：116；它描述于PCT公开WO2004/071467)中以制备pKR953(SEQ ID NO：117)。
[0784] 高山被孢霉Δ5去饱和酶(MaD5)：
[0785] 载体pKR287(SEQ ID NO：118；描述于PCT公开WO 2004/071467，公布于2004年8月26日；其内容以引用方式并入本文)包含高山被孢霉Δ5去饱和酶(MaD5；SEQ ID NO：119，描述于美国专利公开6,075,183和PCT公开WO 2004/071467和WO 2005/047479，其内容以引用方式并入本文)，侧面连接有大豆球蛋白Gy1启动子和豌豆leguminA23’终止区域(Gy1/MaD5/legA2盒)。载体pKR287用SbfI/BsiWI进行消化，将包含Gy1/MaD5/legA2盒的片段克隆到pKR277(SEQ ID NO：120；描述于PCT公开WO 2004/071467，其内容以引用方式并入本文)的SbfI/BsiWI片段中以制备pK952(SEQ ID NO：121)。
[0786] 以前描述于PCT公开WO 2005/047479(其内容以引用方式并入本文)的载体pKR457(SEQ ID NO：122)包含NotI位点，该位点侧面连接有Kunitz大豆胰蛋白酶抑制剂(KTi)启动子(Jofuku等人，Plant Cell1：1079-1093(1989))和KTi 3’终止区域(其分离方法描述于美国专利公开6,372,965)，其后是大豆白蛋白转录终止子，该终止子以前描述于PCT公开WO 2004/071467(Kti/NotI/Kti3’Salb3’盒)。通过多个亚克隆步骤，将包含Asp718限制性位点的序列加到Kti/NotI/Kti3’Salb3’盒的5’和3’末端以制备SEQ ID NO：123。
[0787] 鲁兹巴夫藻(Pavlova lutheri)Δ8去饱和酶(PavD8)：
[0788] 鲁兹巴夫藻(CCMP459)获自海洋浮游生物的培养物(CCMP，West Boothbay Harbor，ME)并在26℃，以150rpm摇动生长于包含50mLF/2-Si培养基(使用来自CCMP的F/2 Family Medium Kit-KIT20F2和Filtered Seqwater-SEA2制备)的250mL烧瓶中。每周以1∶4(旧培养物∶新培养基)的稀释度将培养物转到新培养基中。
[0789] 合并来自28个烧瓶(1400mL)中的培养物，并将细胞通过在1,800x g离心10分TM钟、水洗一次并再离心制成粒状。使用RNA STAT-60 试剂(TEL-TEST，Inc.，Friendswood，TX)，按照制造商的规程从所得颗粒状沉淀中提取总RNA。这样就从颗粒状沉淀中获得了
2.6mg总RNA(2.6mg/mL)。使用mRNA纯化试剂盒(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，按照制造商的规程从1.25mg总RNA中分离mRNA。这样就获得了112μg的mRNA。
[0790] 使用SuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR Kit(用于TMRT-PCR第一链合成体系的试剂盒)(Invitrogen Life Technologies， Carlsbad，CA)，利用提供的oligo(dT)引物，按照制造商的规程从224ng mRNA合成cDNA。在按照规程用RNase H处理后，鲁兹巴夫藻Δ8去饱和酶(PavD8；SEQ ID NO：124；描述于美国专利公开申请11/737772(提交于2007年4月20日；Attorney Docket No.BB-1566)，其内容以引用方式并入本文)从所得cDNA，利用寡核苷酸引物PvDES5’Not-1(SEQ ID NO：125)和PvDES3’Not-1(SEQ ID NO：126)，使用下述条件进行扩增。
[0791] 来自上述反应的cDNA(2μL)与下列物质组合使用：50pmol PvDES5’Not-1(SEQ ID NO：125)，50pmol PvDES3’Not-1(SEQ ID NO：126)1μL PCR核苷酸混合物(10mM，Promega，Madison，WI)，5μL 10X PCR缓 冲 液(Invitrogen Corporation)，1.5μL MgCl2(50mM，Invitrogen Corporation)，0.5μL Taq聚合酶(Invitrogen Corporation)，加水至50μL。反应条件为94℃3分钟，随后按照94℃45秒，55℃45秒，72℃1分钟的周期循环35次。在
72℃保持7分钟完成PCR，然后4℃保存。通过琼脂糖凝胶电泳分析5μL PCR反应，观察到TM
一条分子量约1.3kb的DNA条带。通过琼脂糖凝胶电泳分离剩余产物，使用Zymoclean Gel DNA Recovery Kit(Zymo Research，Orange，CA)按照制造商的规程纯化DNA。
[0792] 将侧面连接有NotI位点的PavD8克隆到经修饰的Kti/NotI/Kti3’Salb3’盒(SEQ ID NO：123)的NotI位点中，然后用Asp718消化DNA片段并将其克隆到pKR952(SEQ ID NO：121)的SbfI位点中以制备pKR970(SEQ ID NO：127)。
[0793] 质粒pKR953(SEQ ID NO：117)用PstI进行消化，并且将包含小眼虫Δ9延伸酶的片段克隆到pKR970(SEQ ID NO：127)的SbfI位点中以制备pKR973(SEQ ID NO：128，图15B)。
[0794] 这样，鲁兹巴夫藻Δ8去饱和酶能与高山被孢霉Δ5去饱和酶和小眼虫Δ9延伸酶在强种子特异性启动子后共表达。
[0795] 实施例17
[0796] 构建大豆表达载体pKR1064用于共表达小眼虫DHA合酶1(EgDHAsyn1)和异丝水霉Δ17去饱和酶(SdD17)
[0797] 本实施例描述构建大豆载体用于共表达EgDHAsyn1与SdD17和乙酰乳酸合酶(ALS)选择性标记。
[0798] 将包含来自pKR271(SEQ ID NO：129；描述于PCT公开WO2004/071467，其内容以引用方式并入本文)的Ann/Sdd17/BD30盒的PstI片段克隆到pKR226(SEQ ID NO：130；它也描述于PCT公开WO2004/071467)的SbfI位点以制备载体pKR886r(SEQ ID NO：131)。这样，将异丝水霉Δ17去饱和酶(SdD17)克隆到膜联蛋白启动子之后，该启动子是强启动子和种子特异性启动子。
[0799] 将包含βcon/EgDHAsyn1/Phas3’盒的pKR1057(SEQ ID NO：109)的SbfI片段克隆到包含SdD17的pKR886r(SEQ ID NO：131)的SbfI位点以制备载体pKR1064(SEQ ID NO：132)。pKR1064描绘示意图在图15C中显示。
[0800] 实施例18
[0801] 构建大豆表达载体pKR1133用于共表达小眼虫DHA合酶1(EgDHAsyn1)与小眼虫Δ9延伸酶(EgD9elo)和高山被孢霉Δ5去饱和酶(MaD5)
[0802] 大豆球蛋白Gy1启动子使用oSGly-2(SEQ ID NO：134)和oSGly-3(SEQ ID NO：135)引物，从pZBL119(SEQ ID NO：133；描述于PCT公开WO 2004/071467，其内容以引用方式并入本文)进行PCR扩增。按照制造商的规程将所得PCR片段亚克隆到中间克隆载体pCR-Script AMP SK(+)(Stratagene)以制备质粒pPSgly32(SEQ ID NO：136)。
[0803] 质粒pSGly32(SEQ ID NO：136)的PstI/NotI片段包含Gy1启动子，将其克隆到来自质粒pKR142(SEQ ID NO：137；描述于PCT公开WO2004/071467，其内容以引用方式并入本文)的PstI/NotI片段中以制备pKR264(SEQ ID NO：138)，质粒pKR142包含leguminA2 3’转录终止区域、抗氨苄青霉素基因和细菌ori。因此，载体pKR264包含NotI位点，该位点侧面连接有大豆球蛋白Gy1基因的启动子和leguminA2 3’转录终止区域(Gy1/NotI/legA2盒)。
[0804] EgDHAsyn1通过NotI消化从pKR1055(SEQ ID NO：104；实施例15)中释放出来，并将其克隆到质粒pKR264(SEQ ID NO：138)的NotI位点以制备pKR1128(SEQ ID NO：139)。
[0805] 将包含MaD5的pKS129(SEQ ID NO：140；描述于PCT公开WO2004/071467，其内容以引用方式并入本文)的NotI片段克隆到pKR457(SEQ ID NO：122；实施例16)的NotI位点中以制备pKR606(SEQ ID NO：141)。
[0806] 载体pKR606(SEQ ID NO：141)用BsiWI进行消化，并且在补齐以钝化末端后，将包含Gy1/MaD5/legA2盒的片段克隆到pKR277(SEQ ID NO：120)的补齐NgoMI位点以制备pKR804(SEQ ID NO：142)。
[0807] 将来自包含Gy1/EgDHAsyn1/legA2盒的pKR1128(SEQ ID NO：139)的BsiWI片段克隆到pKR804(SEQ ID NO：142)的BsiWI位点以制备pKR1130(SEQ ID NO：143)。
[0808] 质粒pKR953(SEQ ID NO：117)用BsiWI进行消化；通过补齐钝化末端；然后用BamHI消化pKR953。将包含Salb/EgD9Elo/Phas3’盒的pKR953的补齐BsiWI/BamHI片段克隆到pNEB193(New England Biolabs，Ipswich，MA)的PmeI/BamHI位点以制备pKR1131(SEQ ID NO：144)。
[0809] 质粒pKR1131(SEQ ID NO：144)用PstI进行消化，并且将包含小眼虫Δ9延伸酶的片段克隆到pKR1130(SEQ ID NO：143)的SbfI位点中以制备pKR1133(SEQ ID NO：145，图15D)。
[0810] 这样，小眼虫DHA合酶1能与高山被孢霉Δ5去饱和酶和小眼虫Δ9延伸酶在强种子特异性启动子后共表达。
[0811] 实施例19
[0812] 构建大豆表达载体pKR1105用于共表达小眼虫DHA合酶1 C20延伸酶结构域(EgDHAsyn1C20EloDom1)与聚合裂殖壶菌Δ4去饱和酶(SaD4)
[0813] βcon/NotI/Phas盒使用oKti5(SEQ ID NO：147)和oKti6(SEQ ID NO：148)引物，从pKS 123(SEQ ID NO：146；描述于PCT公开WO2004/071467，其内容以引用方式并入本文)进行PCR扩增。所得PCR片段用BsiWI进行消化，将其克隆到包含细菌复制起点和选择标记的pKR124(SEQ ID NO：149；描述于PCT公开WO 2004/071467，其内容以引用方式并入本文)的BsiWI位点中以制备质粒pKR193(SEQ ID NO：150)。
[0814] EgDHAsyn1 C20Elodom1通过NotI消化从pHD16(SEQ ID NO：51；实施例10)中释放出来，并将其克隆到质粒pKR193(SEQ ID NO：150)的NotI位点以制备pKR1103(SEQ ID NO：151)。
[0815] 将包含EgDHAsyn1C20Elodom1的BsiWI片段从pKR1103(SEQ ID NO：151)中释放出来，并将其克隆到pKR226(SEQ ID NO：130；实施例17)的BsiWI位点以制备载体pKR1104(SEQ ID NO：152)。
[0816] 载体pKR300(SEQ ID NO：153；描述于PCT公开WO 2004/071467，公布于2004年8月26日；其内容以引用方式并入本文)包含聚合裂殖壶菌Δ4去饱和酶(SaD4)，该酶描述于美国专利公开7,045,683和PCT公开WO 02/090493，其内容以引用方式并入本文)，该酶侧面连接有NotI限制性位点。移除在SaD4中存在的AscI位点不影响对应的氨基酸序列产生新序列(SEQ ID NO：154)，它侧面保持连接有NotI位点。将NotI片段(SEQ ID NO：
154)克隆到质粒pKR457(SEQ ID NO：122；实施例16)的NotI位点以制备pKR1102(SEQ ID NO：155)。
[0817] 质粒pKR1102(SEQ ID NO：155)用PstI进行消化，并且将包含SaD4的片段克隆到pKR1104(SEQ ID NO：152)的SbfI位点中以制备pKR1105(SEQ ID NO：156；图16A)。这样，小眼虫DHA合酶1 C20延伸酶结构域能与聚合裂殖壶菌Δ4去饱和酶在强种子特异性启动子后共表达。
[0818] 实施例20
[0819] 构建大豆表达载体pKR1134用于表达小眼虫DHA合酶1 C20延伸酶结构域/聚合裂殖壶菌Δ4去饱和酶融合蛋白(EgDHAsyn1 C20EloDom3-SaD4)
[0820] 使用以下方法从pKR1091中扩增EgDHAsyn1 C20EloDom3：利用寡核苷酸引物TMEgEPAEloDom-5(SEQ ID NO：43)和oEUGsyn6-4(SEQ ID NO：157)，使用Phusion 高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)，按照制造商的规程进行扩增。将所得DNA片段克隆到 克隆载体中，该方法使用Zero PCR ClOning
Kit(Invitrogen Corporation)，按照制造商的规程进行以制备pKR1107(SEQ ID NO：158)。
[0821] 质粒pKR1107(SEQ ID NO：158)用NotI进行消化，并且再连接包含EgDHAsyn1 C20EloDom3的片段以形成pKR1112(SEQ ID NO：159)。
[0822] 将来自包含EgDHAsyn1C20EloDom3的pKR1112(SEQ ID NO：159)的XbaI/PstI DNA片段克隆到来自包含SaD4的pKR1068(SEQ ID NO：75；实施例11)的XbaI/SbfI DNA片段中以制备pKR1115(SEQ ID NO：160)。这样就再创造出了无内部SbfI位点但编码如实施例11所述的相同氨基酸序列的EgDHAsyn1 C20Elodom3-SaD4。
[0823] 通 过 NotI 消 化 从 pKR1115(SEQ ID NO：160) 中 释 放 出 了EgDHAsyn1C20Elodom3-SaD4，将其克隆到包含ALS选择性标记的质粒pKR1104(SEQ ID NO：
152)的NotI位点中以制备pKR1134(SEQ ID NO：161；图16B)。
[0824] 实施例21
[0825] 构建 大豆表 达载 体pKR1095用于 共表达 Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491Δ8去饱和酶(TpomD8)与异丝水霉Δ17去饱和酶(SdD17)
[0826] 本实施例描述构建大豆载体用于共表达TpomD8与SdD17和潮霉素磷酸转移酶选择性标记(hpt)。
[0827] Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491细 胞( 来 自 1升 培 养 物) 购 自Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplakton(CCMP)(Bigelow Laboratory for Ocean Sciences，West Boothbay Harbor，Maine)。使用trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)，按照制造商的规程分离总RNA。将细胞沉淀物再悬浮于0.75mL Trizol试剂中，与0.5mL 0.5mm的玻璃珠混合，并在最高设置下的Biospec微型珠粒打浆机(mini beadbeater)(Bartlesville，OK)中均化3分钟。将混合物在Eppendorf离心机中以14,000rpm离心30秒以移除碎屑和玻璃珠。用150μL 24∶1的氯仿∶异丙醇提取上清液。上层含水相用于RNA分离。
[0828] 对于RNA分离，将水相与0.375mL异丙醇混合并让其在室温下孵育5分钟。通过在8,000rpm和4℃下离心5分钟收集沉淀的RNA。将沉淀物用0.7mL 80％的乙醇洗涤一次并风干。因此，从Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491中获取了95μg总RNA。
[0829] 使用总RNA(1μL中有0.95μg总RNA)作模板合成双链cDNA。使用来自BDBioscience Clontech(Palo Alto，CA)的CreatorTM SMARTTMcDNA Library Construction Kit。总RNA(1μL)与1μL SMART IV寡核苷酸(SEQ ID NO：181)，1μL来自Invitrogen
3’-RACE kit(SEQ ID NO：182)的接头引物，和2μL水混合。将混合物加热至75℃并在此温度加热5分钟，然后在冰上冷却5分钟。混合物中加入：2μL 5X第一链缓冲液，1μL 20mM DTT，1μL dNTP混合物(各10mM的dATP，dCTP，dGTP和dTTP)，和1μL PowerScript逆转录酶。将样品在42℃下孵育1小时。然后将所得第一链cDNA作引物用于扩增。
[0830] Tetruetreptia pomquetensisCCMP1491Δ8去 饱 和 酶(TpomD8；SEQ ID NO：162；描述于美国专利公开申请11/876,115(提交于2007年10月22日；Attorney
Docket No.BB-1574)，其内容以引用方式并入本文)从所得cDNA，利用寡核苷酸引物TpomNot-5(SEQ ID NO：163)和TpomNot-3(SEQ ID NO：164)，使用Taq聚合酶(Invitrogen Corporation)按照供应商的规程进行扩增。
[0831] Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491 cDNA与下列物质组合使用：50pmol TpomNot-5(SEQ ID NO：163)，50pmol TpomNot-3(SEQ ID NO：164)，1μL PCR核苷酸混合物(10mM，Promega，Madison，WI)，5μL 10X PCR缓冲液(Invitrogen Corporation)，1.5μL MgCl2(50mM，Invitrogen Corporation)，0.5μL Taq聚合酶(Invitrogen Corporation)，加水至50μL。反应条件为94℃3分钟，随后按照94℃45秒，55℃45秒，72℃1分钟的周期循环35次。在72℃保持7分钟完成PCR，然后4℃保存。通过琼脂糖凝胶电泳分析5μL PCR反应，观察到一条分子量约1.3kb的DNA条带。
[0832] 通过琼脂糖凝胶电泳分离剩余产物，使用ZymocleanTMGel DNA Recovery Kit(Zymo Research，Orange，CA)按照制造商的规程纯化DNA。按照供应商的规程将所得DNA克隆到 Easy Vector(Promega)中以制备pLF114-10(SEQ ID NO：165)。
[0833] TpomD8通过NotI消化从pLF114-10(SEQ ID NO：165)中释放出来，并将其克隆到质粒pKR179(SEQ ID NO：108；实施例15)的NotI位点以制备pKR1002(SEQ ID NO：166)。
[0834] 将包含βcon/TpomD8/Phas3’盒的pKR1002(SEQ ID NO：166)的PstI片段克隆到包含SdD17的pKR328(SEQ ID NO：110；实施例15)的SbfI位点以制备载体pKR1095(SEQ ID NO：167)。pKR1095描绘示意图在图16C中显示。
[0835] 实施例22
[0836] 构 建 大 豆 表 达 载 体 pKR1132 用 于 共 表 达 TetruetreptiapomquetensisCCMP1491Δ8去饱和酶(TpomD8)与小眼虫Δ9延伸酶(EgD9elo)和高山被孢霉Δ5去饱和酶(MaD5)
[0837] TpomD8通过NotI消化从pLF114-10(SEQ ID NO：165；实施例21)中释放出来，并将其克隆到质粒pKR264(SEQ ID NO：138；实施例18)的NotI位点以制备pKR1127(SEQ ID NO：168)。
[0838] 将来自包含Gy1/TPomD8/legA2盒的pKR1127(SEQ ID NO：168)的BsiWI片段克隆到pKR804(SEQ ID NO：142；实施例18)的BsiWI位点以制备pKR1129(SEQ ID NO：169)。
[0839] 质粒pKR1131(SEQ ID NO：144；实施例18)用PstI进行消化，并且将包含小眼虫Δ9延伸酶的片段克隆到pKR1129(SEQ ID NO：169)的SbfI位点中以制备pKR1132(SEQ ID NO：170，图16D)。这样，Tetruetreptia pomquetensisΔ8去饱和酶能与高山被孢霉Δ5去饱和酶和小眼虫Δ9延伸酶在强种子特异性启动子后共表达。
[0840] 实施例23
[0841] 构建大豆表达载体KS373用于表达小眼虫Δ9延伸酶/小眼虫DHA合酶1接头/鲁兹巴夫藻Δ8去饱和酶融合蛋白(EgD9elo-EgDHAsyn1Link-PavD8)
[0842] 在小眼虫Δ9延伸酶(EgD9elo；实施例16；SEQ ID NO：112)、小眼虫DHA合酶1富含脯氨酸的接头(EgDHAsyn1Link；SEQ ID NO：171；如实施例6所述并在图6中显示)和鲁兹巴夫藻Δ8去饱和酶(PavD8；实施例16；SEQ ID NO：124)之间的框内融合使用下述条件进行构建。
[0843] 通过PCR扩增制备在EgD9elo和EgDHAsyn1Link(EgD9elo-EgDHAsyn1Link)之间的最初框内融合，其侧面连接有5’末端的NcoI位点和3’末端的NotI位点。使用以下方法扩增EgD9elo(SEQ ID NO：112)：利用寡核苷酸MWG507(SEQ ID NO：172)和MWG509(SEQ TMID NO：173)，使用Phusion 高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)，按照制造商的规程进行扩增。用寡核苷酸MWG510(SEQ ID NO：174)和MWG511(SEQ ID NO：
175)以相似方法扩增EgDHAsyn1Link(SEQ ID NO：171)。使用MWG507(SEQ ID NO：172)和MWG511(SEQ ID NO：175)组合并再扩增两个所得PCR产物以形成EgD9elo-EgDHAsyn1Link。
EgD9elo-EgDHAsyn1Link序列在SEQ ID NO：176中显示。EgD9elo-EgDHAsyn1Link在3’末端的NotI位点上游不包含框内终止密码子，因此克隆到NotI位点中的DNA片段能引起与EgD9elo-EgDHAsyn1Link的框内融合。
[0844] 质粒KS366(SEQ ID NO：177)包含独特NcoI和NotI限制性位点，其侧面连接有β-大豆伴球蛋白(Beachy等人，EMBO J.4：3047-3053(1985))的α亚基的启动子和菜豆蛋白基因的3’转录终止区域(Doyle 等人，J.Biol.261：9228-9238(1986))。除了用独特NcoI/NotI多克隆位点替换pKR72(SEQ ID NO：105)中的独特NotI位点外，KS366中的Bcon/NcoINotI/Phas3’盒与存在于pKR72(SEQ ID NO：105)中的盒相同，不同的是侧面相接的HindIII位点被BamHI位点替换。将KS366的Bcon/NcoINotI/Phas3’盒克隆到pBluescript II SK(+)载体(Stratagene)的BamHI位点中。
[0845] 将包含EgD9elo-EgDHAsyn1Link(SEQ ID NO：176)的NcoI/NotIDNA片段克隆到来自包含β-大豆伴球蛋白α亚基启动子的KS366(SEQ ID NO：177)的NcoI/NotI DNA片段以制备KS366-EgD9elo-EgDHAsyn1Link(SEQ ID NO：178)。
[0846] 将 包 含 PavD8(如 实 施 例 16 所 述 生 成 ) 的 NotI 片 段 克 隆 到KS366-EgD9elo-EgDHAsyn1Link(SEQ ID NO：178)的NotI片段中以制备KS373(SEQ ID NO：179；图17)。
[0847] 实施例24
[0848] 构建可供选择的大豆表达载体用于表达DHA合酶、C20延伸酶结构域、Δ4去饱和酶结构域、合成C20延伸酶/Δ4去饱和酶融合蛋白和其他合成延伸酶/去饱和酶融合蛋白[0849] 除了本文所述基因、启动子、终止子和基因盒之外，本领域的技术人员还可认识到其他启动子/基因/终止子盒组合可以相似方法合成，但不限于本文所述用于表达EgDHAsyn1的方法。同样的，可期望表达其他PUFA基因(如那些在表23中描述的基因)，用于与本发明的任何DHA合酶或DHA合酶结构域(即，分别表达的C20延伸酶结构域或Δ4去饱和酶结构域)共表达。此外，可制备和表达在延伸酶结构域和去饱和酶结构域之间的、由合适连接区域分开的合成融合蛋白。例如，可制备和表达在C20延伸酶(或来自DHA合酶C20延伸酶结构域)和合适Δ4去饱和酶(或来自DHA合酶的Δ4去饱和酶结构域)之间的合成融合蛋白。作为另外一种选择，可使用其他延伸酶或去饱和酶例如，但不限于，在Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶之间的、由来自DHA合酶(即，实施例23)的接头分离的本文所述合成融合蛋白。
[0850] 例如，PCT公开WO 2004/071467和WO 2004/071178描述分离多个用于大豆胚芽特异表达的启动子和转录终止子序列。此外，PCT公开WO 2004/071467、WO 2005/047479和WO 2006/012325描述通过以独特 组合将单个启动子、基因和转录终止子连接在一起来合成多个启动子/基因/终止子盒组合。一般使用侧面连接有合适启动子(例如但不限于那些在表21中列出的启动子)和转录终止子(例如但不限于那些在表22中列出的终止子)的NotI位点克隆所需基因。使用PCR扩增，利用设计用于在基因5’和3’末端导入NotI位点的寡核苷酸可将NotI位点加到受关注的基因上，例如但不限于表23中列出的那些基因。然后用NotI消化所得PCR产物，并将其克隆到合适的启动子/NotI/终止子盒中。
[0851] 此外，PCT公开WO 2004/071467、WO 2005/047479和WO2006/012325描述为了获得所需表型表达，进一步将单个基因盒与合适的选择性标记盒以独特组合连接到一起。虽然这主要使用不同限制性酶切位点完成，本领域技术人员可认识到多种技术可用于获得所需启动子/基因/转录终止子组合。这样做可获得胚芽特异性启动子/基因/转录终止子盒的任何组合。本领域的技术人员还可认识到这些盒可位于单个DNA片段上或在多个片段上，该处基因共表达是多个DNA片段共转化的结果。
[0852] 表21
[0853] 种子特异性启动子
[0854]
[0855] 表22
[0856] 转录终止子
[0857]转录终止子 生物 参照序列
菜豆蛋白3’ 菜豆 WO 2004/071467
kunitz胰蛋白酶抑制剂3’ 大豆 WO 2004/071467
BD30(也称为P34)3’ 大豆 WO 2004/071467
豆球蛋白A2 3’ 豌豆 WO 2004/071467
白蛋白2S 3’ 大豆 WO 2004/071467
[0858] 表23
[0859] PUFA生物合成途径基因
[0860]
[0861]
[0862] 实施例25
[0863] 具有大豆表达载体的体细胞胚培养物的生产和模型体系转化
[0864] 培养条件：
[0865] 将大豆胚芽发生悬浮培养物(cv.Jack)保存在35mL液体培养基SB196(下文)中，以150rpm置于旋转振荡器上，温度为26℃，冷白荧光灯的光周期为16∶8小时昼/夜，光照强度为60至85μE/m2/s。每7天至两周通过接种大约35mg组织到35mL新鲜液体SB196中对培养物进行传代培养(优选的传代培养间隔为每隔7天)。
[0866] 大豆胚芽发生悬浮培养物用大豆表达质粒转化，所有转化均使用DuPont Biolistic PDS1000/HE仪(氦气改型)，通过粒子枪轰击(Klein 等人，Nature 327：70(1987))方法进行。
[0867] 大豆胚芽发生悬浮培养物启动：
[0868] 大豆培养物每月启动两次，在每次启动之间间隔5至7天。在种植后45至55天内采集可用大豆植物的带未成熟种子的豆荚。从豆荚中移除种子并置于无菌magenta盒中。大豆种子通过在5％次氯酸钠溶液与1滴象牙皂(即，95mL高压釜蒸馏水加5mL次氯酸钠和1滴皂，充分混合)中摇动15分钟进行无菌处理。种子使用2个1升瓶的无菌蒸馏水漂洗，将那些小于4mm的种子置于单个显微镜载片上。切下种子的小末端，并将子叶挤出种子壳。当制备培养物用于产生转化子时，将子叶转到包含SB1培养基(每个平板25至30个子叶)的平板上。用纤维带将平板打包并在温度26℃，冷白荧光灯光周期16∶8小时昼/夜，光照强度60至80μE/m2/s下培养八周，4周后更换培养基。当制备培养物用于模型体系实验时，将子叶转入包含SB199培养基(每个平板25至30个子叶)的平板中2周，然后转入SB1中2至4周。光照和温度条件与上文所述相同。在SB1培养基上接种后，切下第二个胚芽并将其放入SB196液体培养基7天。
[0869] 制备DNA用于轰击：
[0870] 完整质粒或包含受关注基因和选择性标记基因的DNA质粒片段被用于轰击。通过凝胶分离消化过的质粒获取来自大豆表达质粒的片段，本文描述了所述质粒的构建。在各种情况下，100μg质粒DNA被用于下文所述的0.5mL特定酶混合物。质粒用AscI(100单位)在NEBuffer4(20mM Tris乙酸，10mM乙酸镁，50mM乙酸钾，1mM二硫苏糖醇，pH7.9)，100μg/mL BSA，和5mMβ-巯基乙醇中，在37℃下消化1.5小时。所得DNA片段通过凝胶电泳在1％的SeaPlaque GTG琼脂糖上(BioWhitaker Molecular Applications)分离，并从琼脂糖凝胶上切下包含基因盒的DNA片段。使用GELase消化酶，按照制造商的规程从琼脂糖中纯化DNA。
[0871] 将包含3mg金粉(3mg金)的无菌蒸馏水的50μL等分试样加入30μL 10ng/μL DNA溶液(完整质粒或如本文所述制备的DNA片段)，25μL 5M CaCl2，和20μL 0.1M亚精胺中。将混合物在涡旋振荡器3 档摇动3分钟并在台式离心机中旋转10秒。移除上清液，然后用400μL 100％乙醇洗涤并进行另一次简单离心。移除400ul乙醇，并将颗粒状沉淀重悬在40μL 100％乙醇中。将五μL DNA悬浮液分配到Biolistic PDS1000/HE仪盘的每个浮动盘中。每5μL等分试样每次轰击(例如每盘)包含大约0.375mg金。
[0872] 就模型体系转化而言，规程基本相同，除了一些较小的改变(即，将1mg金粉加到5μL的1μg/μL DNA溶液中；使用50μL的2.5MCaCl2；以及将沉淀颗粒最后重悬在85μL
100％乙醇中，因此每次轰击提供0.058mg的金粉)。
[0873] 组织制备和DNA轰击：
[0874] 将大约150至200mg的七天龄胚芽发生悬浮培养物置于一个空的无菌60x15mm培养皿中，并用塑料网覆盖该培养皿。将室排空至真空度为27至28英寸汞柱，每个平板的组织轰击一或两发，将膜破裂压力设为1100 PSI。将组织放置在距离保留/停止筛网大约3.5英寸处。模型体系转化的条件基本相同，除了使用100至150mg的胚性组织；破裂压力设为650PSI；并将组织放置在距离保留筛网大约2.5英寸处。
[0875] 转化过的胚芽的选择：
[0876] 使用潮霉素(当使用潮霉素B磷酸转移酶(HPT)基因作为选择性标记时)或氯磺隆(当使用乙酰乳酸合酶(ALS)基因作为选择性标记时)选择转化过的胚芽。
[0877] 在轰击后，将组织置于新制SB196培养基中并如上所述进行培养。轰击后六至八天，取决于使用的选择性标记，用包含30mg/L潮霉素或100ng/mL氯磺隆的新制SB196更换旧的SB196。选择培养基每周更新。选择后四至六周，观察到从未转化的坏死胚芽发生簇中生长出绿色转化组织。
[0878] 胚芽成熟：
[0879] 为了产生转化子，取出分离的绿色组织，并且接种到含多孔板中以产生新的、克隆繁殖的、转化过的胚芽发生悬浮液培养物。转化过的胚芽发生簇在多孔板中，在SB196中培养四至六周，培养条件为温度26℃，冷白荧光(Phillips冷白Econowatt F40/CW/RS/EW)和Agro(Phillips F40 Agro)灯泡(40瓦特)，光周期16∶8小时，光照强度为90至120μE/2
ms。一段时间后，将胚芽簇移到固体琼脂培养基、SB166中培养一 至两周，然后传代培养到SB103培养基中3至4周，得到成熟胚芽。在平板上的SB103中成熟后，从簇中取出单个胚芽，干燥并如上文所述筛选脂肪酸组成发生改变的胚芽。
[0880] 就模型体系转化而言，使用改进程序使胚芽在大豆组织分化和成熟液体培养基(SHaM液体培养基；Schmidt等人，Cell Biology and Morphogenesis 24：393(2005))中成熟。简而言之，如上所述在SB196中选择4周后，将胚芽簇转移到在250mL锥形瓶中的35mL SB228(SHaM液体培养基)中。组织保存在SHaM液体培养基中，以130rpm置于旋转振荡器上，温度为26℃，冷白荧光灯的光周期为16∶8小时昼/夜，光照强度为60至85μE/m2/s，保持2周使得胚芽成熟。胚芽在SHaM液体培养基中生长2周的大小和脂肪酸含量等同于胚芽在SB166/SB103中生长5至8周的效果。
[0881] 在SHaM液体培养基中成熟后，从簇中取出单个胚芽，干燥并如上文所述筛选脂肪酸组成发生改变的胚芽。
[0882] 培养基配方：
[0883] SB 196-FN低盐液体增殖培养基(每升)
[0884]
[0885] FN低盐储备液
[0886] 储备液编号 1000mL 500mL
[0887] 1 MS Fe EDTA 100x储备液
[0888] Na2 EDTA* 3.724g 1.862g
[0889] FeSO4-7H2O 2.784g 1.392g
[0890] *首先加入，在搅拌下溶解于不透光瓶中
[0891]
[0892]
[0893]
[0894] SB1固体培养基(每升)
[0895] 1包MS盐(Gibco/BRL-Cat.No.11117-066)
[0896] 1mL B5维生素1000X储备液
[0897] 31.5g葡萄糖
[0898] 2mL 2，4-D(终浓度20mg/L)
[0899] pH5.7
[0900] 8g TC琼脂
[0901] SB199固体培养基(每升)
[0902] 1包MS盐(Gibco/BRL-Cat.No.11117-066)
[0903] 1mL B5维生素1000X储备液
[0904] 30g蔗糖
[0905] 4mL 2，4-D(终浓度40mg/L)
[0906] pH7.0
[0907] 2gm Gelrite
[0908] SB 166固体培养基(每升)
[0909] 1包MS盐(Gibco/BRL-Cat.No.11117-066)
[0910] 1mL B5维生素1000X储备液
[0911] 60g麦芽糖
[0912] 750mg MgCl2六水合物
[0913] 5g活性炭
[0914] pH5.7
[0915] 2g gelrite
[0916] SB 103固体培养基(每升)
[0917] 1包MS盐(Gibco/BRL-Cat.No.11117-066)
[0918] 1mL B5维生素1000X储备液
[0919] 60g麦芽糖
[0920] 750mg MgCl2六水合物
[0921] pH5.7
[0922] 2g gelrite
[0923] SB 71-4固体培养基(每升)
[0924] 1瓶Gamborg’s B5盐w/蔗糖(Gibco/BRL-Cat.No.21153-036)
[0925] pH5.7
[0926] 5g TC琼脂
[0927] 2，4-D储备液
[0928] 从Phytotech Cat.No.D 295-浓度1mg/mL获取的预定
[0929] B5维生素储备液(每100mL)
[0930] 在-20℃贮存等分试样
[0931] 10g肌肌醇
[0932] 100mg烟酸
[0933] 100mg盐酸吡哆醇
[0934] 1g硫胺素
[0935] 如果溶液溶解不够迅速，则经由电路进行适度加热。
[0936] SB 228-大豆组织分化和成熟(SHaM)(每升)
[0937]
[0938] 定容至900mL
[0939] pH5.8
[0940] 高压釜
[0941] 加入到冷却培养基中(≤30℃)：
[0942] *谷氨酰胺(终浓度30mM)4％110mL
[0943] *注：加入谷氨酰胺后的终体积将是1010mL。
[0944] 由于谷氨酰胺降解相当迅速，它优选在使用培养基前现加。谷氨酰胺在加入2周后到期；无谷氨酰胺的基本培养基能保存更长时间。FN-liteMacro，用于SHAM 10X-储备液#1(每升)
[0945]
[0946] 定容
[0947] 高压釜
[0948] MS Micro 1000X-储备液#2(每1升)
[0949]
[0950]
[0951] 定容
[0952] 高压釜
[0953] FeEDTA 100X-储备液#3(每升)
[0954] Na2EDTA*(EDTA钠) 3.73g
[0955] FeSO4*7H2O(硫酸铁七水合物) 2.78g
[0956] *在加入铁前EDTA必须完全溶解。
[0957] 定容
[0958] 溶液是光敏感的。应用金属箔包裹瓶子以避光。
[0959] 高压釜
[0960] Ca 100X-储备液#4(每升)
[0961] CaCl2*2H2O(氯化钙二水合物) 44g
[0962] 定容
[0963] 高压釜
[0964] B5维生素1000X-储备液#5(每升)
[0965]
[0966] 定容
[0967] 冻存
[0968] 4％谷氨酰胺-储备液#6(每升)
[0969] 将DDI水加热到30℃ 900mL
[0970] L-谷氨酰胺 40g
[0971] 缓慢加入，搅拌并适度加热。
[0972] 不超过35℃。
[0973] 定容
[0974] 过滤除菌
[0975] 冻存
[0976] *注：储备液在31℃热解冻，水浴以完全溶解晶体。
[0977] 实施例26
[0978] 氯磺隆选择(ALS)和植物再生
[0979] 氯磺隆(ALS)选择：
[0980] 在轰击后，将组织分装在2个烧瓶中，瓶中装有新制SB196培养基，如实施例25所述进行培养。轰击后六至七天，用包含100ng/mL氯磺隆(氯磺隆储备液为1mg/mL，在0.01N氢氧化铵中)的选择试剂的新制SB196更换SB196。选择培养基每周更新。选择后四至六周，可观察到从未转化的坏死胚芽发生簇中生长出绿色转化组织。将分离的绿色组织移除并接种到包含SB 196的多孔板中，胚芽如实施例25所述成熟。
[0981] 大豆体细胞胚再生成植物：
[0982] 为了从胚芽发生悬浮培养物获得整个植株，必须再生组织。如实施例25所述获得成熟胚芽。在培养基SB 103上传代培养3周后，可从簇中取出单个胚芽，干燥并如本文所述筛选脂肪酸组成发生改变的胚芽。应当指出的是，在此阶段可筛选出由所关注基因的表达产生的任何可发觉的表型。这将包括但不限于脂肪酸分布型的改变、蛋白特征和含量的改变、碳水化合物含量的改变、生长速率的改变、存活率的改变、或正常发育成大豆植株的能力的改变。
[0983] 成熟的单个胚芽通过置于空的小培养皿(35x10mm)中大约4至7天进行脱水。平皿用纤维带(创造出一个低湿度室)密封。将脱水胚芽植入SB71-4培养基，使其在与上述培养条件相同的条件下发芽生长。从发芽培养基中取出发芽的苗并用水彻底冲洗，然后将其植入24孔托 盘中的Redi-Earth中，用透明塑料罩覆盖。2周后移除塑料罩，再硬化植株一周。如果幼苗看上去坚硬，则将它们移植到Redi-Earth的10″盆中，每盆最多3株幼苗。在10至16周后，收获成熟种子，使其破碎并分析脂肪酸。
[0984] 实施例27
[0985] 解脂耶氏酵母中的小眼虫和Euglena anabenaDHA合酶的功能性分析
[0986] 按照上文所述的通用方法，将下文表24中所述的每个表达载体转化到解脂耶氏酵母菌株Y2224(解脂耶氏酵母的尿嘧啶ura3营养缺陷型菌株)中。
[0987] 转化子解脂耶氏酵母的单菌落包含合适的耶氏酵母属表达载体(参见表24)，它们在3mL补充0.2％tergitol的尿嘧啶缺失MM中，在30℃下生长1天。此后转移0.05mL到3mL未补充脂肪酸或补充EPA至0.175mM的相同培养基中。它们在30℃下，以250rpm培养16小时，然后通过离心获取颗粒状沉淀。用水洗涤细胞一次，离心获取颗粒状沉淀并风干。颗粒状沉淀进行转酯化(Roughan，G.和Nishida，I.，Arch.Biochem.Biophys.276(1)：38-46(1990))，用500μL 1％甲醇钠在50℃处理30分钟，之后加入500μL 1M氯化钠和
100μL庚烷。在充分混合并离心后，如上文所述GC分析脂肪酸甲酯(FAME)(参见通用方法)。
[0988] 表24
[0989] 转化到解脂耶氏酵母中的载体综述
[0990]
[0991] 表达pBY-EgC20elo1的耶氏酵母属脂肪酸分布型不显示从EPA至DPA的延伸。剩余克隆的脂肪酸分布型、计算出的％延伸率和计算出的％去饱和在图18中显示。C20延伸率百分比(％C20 Elong)通过用DPA和DHA的重量百分比之和(wt.％)除以EPA、DPA和DHA的wt.％之和并乘以100进行计算，结果表示为％。同样的，Δ4去饱和百分比(％D4 Desat)通过用DHA的wt.％除以DPA和DHA的wt.％之和并乘以100进行计算，结果表示为％。平均值用Ave表示。后跟合适的标题.
[0992] 综合图18的情况，除EaDHAsyn4之外的所有DHA合酶在耶氏酵母属中行使C20延伸酶(使EPA延伸成DPA)和Δ4去饱和酶(使DPA去饱和成DHA)的功能。EaDHAsyn4由于核苷酸序列移码在C末端包含显著不同的氨基酸序列，它具有相当低的延伸功能并且无去饱和酶活性。与其他EgDHAsyn1构建体相比，在pY132中表达EgDHAsyn1一向导致在耶氏酵母属中的更高活性，这可能是由于EgDHAsyn1在一些载体序列、EgDHAsyn1的5’UTR和EgDHAsyn1编码序列之间表达为框内融合。创造出的所得融合可导致活性增加，这是因为在耶氏酵母属中的表达增加，或者因为酶本身固有活性的增加。当仅仅表达EgDHAsyn1*的编码序列时(即，无5’UTR；参见pY141)，活性高于当5’UTR存在但不翻译成融合蛋白时(即，参见pY161)。此观察结果可能是由于5’UTR的存在导致EgDHAsyn1表达的减少。
[0993] 实施例28
[0994] EgDHAsyn1独立C20延伸酶和Δ4去饱和酶结构域的功能性分析以及与异源融合的比较
[0995] 如实施例27所述，将下表25中所述的每个表达载体(和一个仅作对照的载体)转化到解脂耶氏酵母菌株Y2224中。将EPA和/或DPA提供给转化过的耶氏酵母属细胞。显示表25中每个构建体的相关结构域的示意图在图21中显示。
[0996] 表25
[0997] 解脂耶氏酵母中表达的载体综述
[0998]
[0999]
[1000] 转化细胞的脂肪酸分布型随后如实施例27所述进行分析。
[1001] 向EPA提供仅作对照的载体、pY141、pY143、pY149、pY156、pY157和pY160的结果在图19中显示。表达pY150、pY151、pY152和pY153的耶氏酵母属脂肪酸分布型显示EPA不延伸成DPA，并不在图19中显示。
[1002] 向DPA提供仅作对照的载体、pY141、pY150、pY151、pY152、pY153、pY156、pY157和pY160的结果在图20中显示。表达pY143和pY149的耶氏酵母属脂肪酸分布型显示DPA不去饱和成DHA，并不在图20中显示。
[1003] C20延伸率百分比(％C20 Elong)、Δ4去饱和百分比(％D4 Desat)和平均值如实施例27所述进行计算。
[1004] 在图19和图20的综述中，当EgDHAsyn1C20Elo结构域单独表达时(具有或不具有接头；即，pY143和pY149)，与天然EgDHAsyn1*(pY141；SEQ ID NO：49)相比平均C20延伸率百分比增加约40％。当EgDHAsyn1 Δ4去饱和酶结构域单独表达时发生相反的情况，其中EgDHAsyn1D4Dom1(pY152；SEQ ID NO：67；参见图20)无活性，EgDHAsyn1D4Dom2(pY153；SEQ ID NO：72；参见图20)活性比提供DPA的n1*(pY141；SEQ ID NO：49；参见图20)低约
50％。当IgD4当单独表达(pY150；SEQ ID NO：62；参见图20)或作为融合体表达时(pY156；
SEQ ID NO：64；参见图19和20)不具有Δ4去饱和酶活性，并且当与EgDHAsyn1C20延伸酶结构域(pY156；SEQ ID NO：64；参见图19)融合时甚至引起延伸活性大约降低50％，这可能是由于发生不正确的折叠。相反，单独表达的SaD4(pY151；SEQ ID NO：76；参见图20)具有与天然EgDHAsyn1*(pY141；SEQ ID NO：49；参见图20)大约相同的Δ4去饱和酶活性。
有趣的是，SaD4当融合到EgDHAsyn1 C20延伸酶结构域(pY160；SEQ ID NO：77；参见图20)时它的Δ4去饱和酶活性增加大约2倍。当融合到EgDHAsyn1 C20延伸酶结构域并提供EPA(pY160；SEQ ID NO：77；参见图19)时，Δ4去饱和酶活性比当提供DPA时(pY160；SEQ ID NO：77；参见图20)高大约3倍，这说明两个结构域的连接导致效率或流量增加，这可能是由于底物引导。
[1005] 实施例29
[1006] EgDHAsyn1*的底物特异性
[1007] 将GLA、STA、EDA、ERA、DGLA、ETA、ARA、EPA和DPA提供给用pY141(EgDHAsyn1*；SEQ ID NO：49)和仅作对照的载体转化过的耶氏酵母属细胞，如实施例27所述分析脂肪酸分布型。
[1008] 提供EPA、ARA和DPA的结果在图22中显示。提供GLA、STA、EDA、ERA、DGLA和ETA的耶氏酵母属脂肪酸分布型显示不发生延伸，并且不在图22中显示。当提供EPA或DPA时，C20延伸率百分比(％C20 Elong)和Δ4去饱和百分比(％D4 Desat)和平均值如实施例27所述进行计算。当提供ARA时，C20延伸百分比(％C20 Elong)通过用二十二碳四烯酸[DTA；22：4(7，10，13，16)]和ω-6二十二碳五烯酸[DPAn-6；22：5(4，7，10，13，16)]的wt.％之和除以ARA、DTA和DPAn-6的wt.％之和并乘以100进行计算，结果表示为％。同样的，当提供ARA 时Δ4去饱和百分比(％D4 Desat)通过用DPAn-6的wt.％除以DTA和DPAn-6的wt.％之和并乘以100进行计算，结果表达为％。
[1009] 在图22的综述中，EgDHAsyn1*延长ARA和EPA，虽然它略微优选(活性高大约40％)EPA。EgDHAsyn1也使得ARA延伸产物(即，DTA)在Δ4位点发生去饱和以制备
DPAn-6，对DTA的活性比对DPA的活性高大约40％。
[1010] 实施例30
[1011] 小眼虫DHA合酶1和鲁兹巴夫藻Δ8去饱和酶、高山被孢霉Δ5去饱和酶、异丝水霉Δ17去饱和酶及小眼虫Δ9延伸酶在用大豆表达载体pKR973和pKR1064转化过的大豆胚芽中共表达
[1012] 成熟大豆体细胞胚是用于合子胚的良好模型。当在液体培养物中以球状胚芽状态存在时，大豆体细胞胚包含非常少量的三酯酰甘油或贮藏蛋白，它们一般存在于成熟大豆合子胚中。在此发育阶段，总三酯酰甘油对总极性脂质(磷脂和糖脂)的比率为约1∶4，这是典型的处于发育阶段的大豆合子胚，由此启动体细胞胚培养。同样在球状阶段，基本上不存在重要种子蛋白、β-大豆伴球蛋白α’-亚基、kunitz胰蛋白酶抑制剂3和种子凝集素的mRNA。依赖对无激素培养基的转移使得成熟体细胞胚状态分化，三酯酰甘油变成最丰富的一类脂质。同样，β-大豆伴球蛋白α’-亚基、kunitz胰蛋白酶抑制剂3和种子凝集素的mRNA变成在总mRNA中非常丰富的信息。因此，大豆体细胞胚体系与体内的成熟大豆合子胚的表现非常相似，因此是用于分析改变脂肪酸生物合成途径中的基因表达的表型效应的良好和迅速的模型体系(参见PCT公开WO 2002/00904，实施例3)。最重要的是，该模型体系也可预测来自来源于转基因胚芽的植物的种子的脂肪酸组成。
[1013] 表达pKR973和pKR1064的转基因大豆体细胞胚的脂肪酸分析：
[1014] 将大豆胚芽发生悬浮培养物(cv.Jack)用pKR973和pKR1064(包含表达盒的片段)的AscI片段如实施例25所述的生产进行转化，综述于表26中。
[1015] 表26
[1016] 大豆中表达载体的综述
[1017]
[1018] 收获从每个事件(每个事件十个胚芽)生成的大豆胚芽的子集，并将其放入玻璃GC小瓶中，通过酯交换制备脂肪酸甲酯。就酯交换而言，将50μL三甲基氢氧化硫(TMSH)和0.5mL己烷加入到玻璃小瓶中的胚芽中，并在室温下摇动培养30分钟。分离脂肪酸甲酯(从己烷层注入5μL)并进行定量，定量方法使用配有Omegawax 320熔融石英毛细柱的Hewlett-Packard 6890 Gas Chromatograph(Cat.No.24152，Supelco Inc.)。设定烘箱温度程序如下：220℃保持2.6分钟，然后以20℃/分钟的速度升温至240℃并再保持2.4分钟。载气通过Whatman氢气发生器供应。保留时间与那些可商购获得的标准甲酯比较(Nu-Chek Prep，Inc.)。具有良好表型的事件通过GC进行再分析，分析条件相同，除了烘箱温度在150℃保持1分钟，然后间隔5℃升温至240℃。
[1019] 来自代表性事件的每个胚芽的脂肪酸分布型在图23中显示。脂肪酸经鉴定是16：0(棕榈酸)、18：0(硬脂酸)、18：1(油酸)、18：2(LA)、GLA、18：3(ALA)、EDA、DGLA、ARA、ERA、JUN、EPA、22：3(10，13，16)(二十二碳三烯酸)、DTA、DPA和DHA；以及，图23中列出的脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。
[1020] 将EgDHAsyn1的活力表达为C20延伸率百分比(％C20 Elong)和/或Δ4去饱和百分比(％D4 Desat)，根据以下公式进行计算：([产物]/[底物+产物])*100。
[1021] 更具体地讲，EPA的延伸率百分比表示为％C20 Elong，如下进行测定：([DPA+DHA]/[EPA+DPA+DHA])*100。DPA的Δ4去饱和百分比表示为％D4 Desat，计算公式为([DHA]/[DPA+DHA])*100。 该计算不包括其他可被延伸或去饱和的脂肪酸。
[1022] 除了延伸和去饱和EPA和ARA的产物之外，在大豆中还显示DGLA也被EgDHAsyn1延伸，因为制备了显著量的脂肪酸22：3(10，13，16)。将脂肪酸鉴定为22：3(10，13，16)，因为通过GC-MS发现它具有22：3的质量，并具有符合22：3(10，13，16)的MS特征。
[1023] 实施例31
[1024] 在用大豆表达载体KS373转化过的大豆胚芽中表达小眼虫Δ9延伸酶/鲁兹巴夫藻Δ8去饱和酶融合(EgD9elo-EgDHAsyn1Link-PavD8)
[1025] 大豆胚芽发生悬浮培养物(cv.Jack)用KS373(SEQ ID NO：179；图17)和KS120(它描述于PCT公开WO 2004/071467，其内容以引用方式并入本文)进行转化，如实施例25中所述的用于模型体系的转化方法。KS 120包含潮霉素选择基因。在实施例23中制备的KS373能够表达包括小眼虫Δ9延伸酶和鲁兹巴夫藻Δ8去饱和酶的融合蛋白，其中的两个结构域与小眼虫DHA合酶1接头(即，EgDHAsyn1 Link)相连。
[1026] 来自31个事件的五个单一胚芽的脂肪酸分布型如实施例30所述进行获取。五个最好的延伸事件的结果在图24中显示。脂肪酸经鉴定是16：0(棕榈酸)、18：0(硬脂酸)、18：1(油酸)、18：2(LA)、GLA、18：3(ALA)、EDA、DGLA、ERA和ETA；以及，图24中列出的脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。
[1027] 将EgD9elo-EgDHAsyn1Link-PavD8的活力表达为Δ9延伸率百分比(％D9 Elong)和/或Δ8去饱和百分比(％D8 Desat)，根据以下公式进行计算：([产物]/[底物+产物])*100。
[1028] 更具体地讲，Δ9延伸率百分比表示为％D9 Elong，如下进行测定：([EDA+ERA+DGLA+ETA]/[LA+ALA+EDA+ERA+DGLA+ETA])*100.Δ8去饱和百分比表示为％D8 Desat，测定公式为([DGLA+ETA]/[EDA+ERA+DGLA+ETA])*100。
[1029] 最好的％D9 Elong事件具有22.1％的平均延伸率和92.7％的平均％D8 Desat。延伸率略低于当Δ9延伸酶单独在大豆胚芽中表达时观察到的结果，但这可能是由于所观察的事件较少。相反，当PavD8与EgD9elo和EgDHAsyn1Link融合时，去饱和率比PavD8在大豆胚芽中单独表达时高的多，在一些事件中接近几乎100％转化。该通过Δ8去饱 和酶提高的转化可能是由于提高了效率或流量，或许由于底物引导。
[1030] 实施例32
[1031] 合成及功能分析来自解脂耶氏酵母中的小眼虫的密码子优化的C20延伸酶基因(EgC20ES)
[1032] 对小眼虫EgDHAsyn1(EgDHAsyn1C20EloDom1)的C20延伸酶结构域(即，对应于SEQ ID NO：12的氨基酸1至303)所用密码子进行优化，用于在解脂耶氏酵母中表达，优化方法类似于PCT公开WO2004/101753和美国专利公开7,125,672中所述的方法。具体地讲，设计一种经密码子优化的C20延伸酶基因(命名为“EgC20ES”，具有如SEQ ID NO：183示出的核苷酸序列和如SEQ ID NO：184示出的氨基酸序列)，该设计基于EgDHAsyn1(SEQ ID NO：201)的C20延伸酶结构域的编码序列、按照耶氏酵母属密码子使用模式(PCT公开WO 2004/101753)、在‘ATG’翻译起始密码子周围的共有序列和RNA稳定性的一般原则(Guhaniyogi，G.和J.Brewer，Gene，265(1-2)：11-23(2001))。除了修饰翻译起始位点，还对909bp编码区中的163bp进行了修饰(17.9％)并优化了147个密码子(48.5％)。经密码子优化的基因中的修饰未改变编码蛋白的氨基酸序列(即，SEQ ID NO：184与SEQ ID NO：12的氨基酸1至303序列100％相同)。设计的EgC20ES(SEQ ID NO：183)由GenScript Corporation(Piscataway，NJ)合成并将其克隆到pUC57(GenBank登录号Y14837)中而产生pEgC20ES(图51B；SEQ ID NO：185)。
[1033] 为了分析密码子优化的EgC20ES基因的功能，构建了质粒pZuFmEgC20ES(图52A；SEQ ID NO：360)，它包括嵌合FBAINm：：EgC20ES：：Pex20基因。pZuFmEgC20ES质粒含有如下组分：
[1034] 表27
[1035] 质粒pZuFmEgC20ES(SEQ ID NO：360)的组分
[1036]
[1037] 如“一般方法”所述，将质粒pZuFmEgC20ES转化到解脂耶氏酵母菌株Y4184U4中。在MM平板上进行转化子的筛选。在30℃生长2天后，采集在MM平板上生长的10个转化子并再划线接种到新制MM平板上。一旦开始生长，将10个菌株分别接种到3mL液体MM中，在30℃下，以250rpm/min振荡2天。离心收集细胞；提取脂质；并通过酯交换制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard 6890 GC进行分析。
[1038] GC分析显示在所有十个转化子中产生占总脂质约6.2％的EPA和2.8％的DPA，其中在这些10个菌株中EPA到DPA的转化效率经测定为约31％(如实施例27中所述进行计算)。因此，该试验数据证明经密码子优化用于在解脂耶氏酵母中表达的合成小眼虫C20延伸酶(即，EgC20ES，在SEQ ID NO：183中示出)积极地将EPA转化成DPA。
[1039] 实施例33
[1040] 合成及功能分析来自解脂耶氏酵母中的Euglena anabena的密码子优化的C20延伸酶基因(EaC20ES)
[1041] 对Euglena anabenaEaDHAsyn2(SEQ ID NO：228)的C20延伸酶结构域(即，对应于SEQ ID NO：96的氨基酸1至299)所用密码子进行优化，用于在解脂耶氏酵母中表达，优化方法类似于在PCT公开WO2004/101753、美国专利公开7,125,672和上文实施例32中所述的方法。具体地讲，设计一种经密码子优化的C20延伸酶基因(命名为“EaC20ES”，具有如SEQ ID NO：188示出的核苷酸序列和如SEQ ID NO：189示出的氨基酸序列)，该设计基于EaDHAsyn2(SEQ ID NO：92)的C20延伸酶结构域的编码序列、按照耶氏酵母属密码子使用模式(PCT公开WO 2004/101753)、在‘ATG’翻译起始密码子周围的共有序列和RNA稳定性的一般原则(Guhaniyogi，G.和J.Brewer，Gene，265(1-2)：11-23(2001))。除了修饰翻译起始位点，还对897bp编码区中的143bp进行了修饰(15.9％)并优化了134个密码子(44.8％)。经密码子优化的基因中的修饰未改变编码蛋白的氨基酸序列(即，SEQ ID NO：189与SEQ ID NO：96的氨基酸1至299序列100％相同)。设计的EaC20ES基因(SEQ ID NO：188)由GenScript Corporation(Piscataway，NJ)合成并将其克隆到pUC57(GenBank登录号Y14837)中而产生pEaC20ES(SEQ ID NO：190)。
[1042] 为了分析密码子优化的EaC20ES基因的功能，构建包括嵌合FBAINm：：EaC20ES：：Pex20基因的质粒pZuFmEaC20ES(SEQ ID NO：361)。质粒pZuFmEaC20ES(SEQ ID NO：361)构建体与质粒pZuFmEgC20ES(SEQ ID NO：360；图52A)构建体相同，除了将EaC20ES(SEQ ID NO：188)用于EgC20ES(SEQ ID NO：183)位点。
[1043] 如通用方法所述，将质粒pZuFmEaC20ES(SEQ ID NO：361)转化到解脂耶氏酵母菌株Y4184U4中。在MM平板上进行转化子的筛选。在30℃生长2天后，采集在MM平板上生长的20个转化子并再划线接种到新制MM平板上。一旦开始生长，将20个菌株分别接种到3mL液体MM中，在30℃下，以250rpm/min振荡2天。离心收集细胞；提取脂质；并通过酯交换制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard 6890 GC进行分析。
[1044] GC分析显示在所有20个转化子中产生占总脂质约7.4％的EPA和1％的DPA，其中在这些20个菌株中EPA到DPA的转化效率经测定为 约11％(如实施例27中所述进行计算)。因此，该试验数据证明经密码子优化用于在解脂耶氏酵母中表达的合成Euglena anabenaC20延伸酶(即，EaC20ES，在SEQ ID NO：188中示出)积极地将EPA转化成DPA。
[1045] 实施例34
[1046] 合成及功能分析来自解脂耶氏酵母中的Euglena anabena的密码子优化的Δ4去饱和酶基因(EaD4S)
[1047] 对Euglena anabenaEaDHAsyn2(SEQ ID NO：243)的Δ4去饱和酶结构域(即，对应于SEQ ID NO：96的氨基酸259至841)所用密码子进行优化，用于在解脂耶氏酵母中表达，优化方法类似于在PCT公开WO2004/101753、美国专利公开7,125,672和上文实施例32与33中所述的方法。具体地讲，设计一种经密码子优化的Δ4去饱和酶基因(命名为“EaD4S”，具有如SEQ ID NO：192示出的核苷酸序列和如SEQ ID NO：193示出的氨基酸序列)，该设计基于EaDHAsyn2(SEQ ID NO：92)的Δ4去饱和酶结构域的编码序列，它也以SEQ ID NO：194(核苷酸)和SEQ ID NO：195(氨基酸)的形式提供。除了修饰翻译起始位点，还对1752(包括TAA终止密码子)bp编码区中的307bp进行了修饰(17.5％)，并优化了285个密码子(48.8％)。此外，在翻译起始密码子附近导入一个NcoI位点，该导入通过改变合成EaD4S基因中野生型Δ4去饱和酶结构域(即，SEQ ID NO：96的氨基酸残基260或SEQ ID NO：195的氨基酸残基2)的第二个氨基酸，将其从亮氨酸变成缬氨酸残基；因此，EaD4S的氨基酸序列在SEQ ID NO：193中示出。设计的EaD4S基因(SEQ ID NO：192)由GenScript Corporation(Piscataway，NJ)合成并将其克隆到pUC57(GenBank登录号Y14837)中而产生pEaD4S(SEQ ID NO：196)。
[1048] 为了分析密码子优化的EaD4S基因的功能，构建质粒pZKL4-220EA4(图52B；SEQ ID NO：362)以整合两个嵌合C20延伸酶基因和嵌合EaD4S基因到解脂耶氏酵母菌株Y4184U4的脂肪酶4样位点(GenBank登录号XM_503825)。质粒pZKL4-220EA4包含以下组分：
[1049] 表28
[1050] 质粒pZKL4-220EA4(SEQ ID NO：362)的组分
[1051]
[1052] 如通用方法所述，用AscI/SphI消化质粒pZKL4-220EA4，然后将其转化到解脂耶氏酵母菌株Y4184U4中。在MM平板上进行转化子的筛选。在30℃生长5天后，采集在MM平板上生长的8个转化子并再划线接种到新制MM平板上。一旦开始生长，将这些个菌株分别接种到3mL液体MM中，在30℃下，以250rpm/min振荡2天。离心收集细胞，重悬于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应制备脂肪酸甲酯，并随后用Hewlett-Packard 6890 GC分析。
[1053] GC分析显示在所有8个转化子中产生占总脂质平均0.4％的DHA和10.2％的DPA，其中在这些8个菌株中DPA到DHA的转化效率经测定为约4.2％(如实施例27中所述进行计算)。因此，该实验数据证明经密码子优化用于在解脂耶氏酵母中表达的合成Euglena anabena 去饱和酶(即，EaD4S，在SEQ ID NO：192中示出)是有活性的，但是具有相对较低的转化效率。
[1054] 实施例35
[1055] 小眼虫DHA合酶1 C20延伸酶结果域(EgDHAsyn1C20EloDom1)与聚合裂殖壶菌Δ4去饱和酶(SaD4)在经大豆表达载体pKR1105转化过的大豆胚芽中的共表达
[1056] 以下实施例描述了表达EgDHAsyn1C20EloDom1和SaD4的转基因大豆事件的生成，当将所述基因存在于植物中时，能与产生EPA的大豆事件杂交以生成DHA生产植物。
[1057] 大豆胚芽发生悬浮培养物(cv.Jack)用pKR1105(SEQ ID NO：156；图16A；包含表达盒的片段)的AscI片段转化，用如实施例25所述的生产方法获取成熟胚芽，但存在以下改变。在SB 103中促成熟10至12天后，将每个事件的单个胚芽簇取出置于六孔微滴定板的4mL SB 148液体培养基(配方如下)中，该培养基包含0.02％的TERGITOL和0.33mM EPA。
[1058] SB 103固体培养基(每升)
[1059] 1包MS盐(Gibco/BRL-Cat.No.11117-066)
[1060] 1mL B5维生素1000X储备液
[1061] 60g麦芽糖
[1062] pH5.7
[1063] 将簇仔细破坏掉以释放出单个胚芽，以150rpm在旋转振荡器上摇动微滴定板，温度为26℃，冷白荧光的昼/夜光周期为16：8小时，光强度为60至85μE/m2/s，保持48小时。在48小时后，用水漂洗胚芽并干燥，每个事件采集五个胚芽放入玻璃GC小瓶中。通过用TMSH进行酯交换制备脂肪酸甲酯，定量方法使用配有Omegawax 320熔融石英毛细柱的Hewlett-Packard 6890 Gas Chromatograph(Cat.No.24152，Supelco Inc.)，如实施例30所述。设定烘箱温度程序如下：150℃保持1分钟，然后间隔5℃升温至240℃。保留时间与那些可商购获得的标准甲酯比较(Nu-Chek Prep，Inc.)。
[1064] 这样就分析了用PKR1105转化的122个事件。在分析的122个事件中，49个经鉴定能延伸EPA(C20/Δ5延伸酶活性)，41个经鉴定能去饱和DPA(Δ4去饱和酶活性)以制备DHA。提出了具有最好C20/Δ5延伸酶和Δ4去饱和酶活性的事件，并且来自提供EPA的胚芽的脂肪酸分布型在图26中显示。
[1065] 图26中的脂肪酸经鉴定是16：0(棕榈酸)、18：0(硬脂酸)、18：1(油酸)、LA、ALA、EPA、22：0(二十二烷酸)、DPA、24：0(二十四烷酸)、DHA和24：1(二十四烯酸)；以及，图26中列出的脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。将EgDHAsyn1C20EloDom1的活性表达为C20/Δ5延伸率百分比(％C20/Δ5 elong)，根据以下公式进行计算：([产物]/[底物+产物])*100。更具体地讲，将EPA的组合延伸率百分比EPA表示为“％C20/Δ5 elong”，测定公式如下：([DPA+DHA]/[EPA+DPA+DHA])*100。
[1066] 将SaD4的活力表达为Δ4去饱和百分比(％Δ4 Desat)，根据以下公式进行计算：([产物]/[底物+产物])*100。更具体地讲，将DPA的组合去饱和百分比EPA表示为“％Δ4 desat”，测定公式如下：(DHA/[DPA+DHA])*100。
[1067] 实施例36
[1068] 鉴定来自Euglena anabenaUTEX 373的Δ9延伸酶
[1069] 本实施例描述鉴定来自Euglena anabenaUTEX 373 cDNA文库的Δ9延伸酶。美国临时申请60/911,925(提交于2007年4月16日；Attorney Docket No.BB-1613；其内容以引用方式并入本文)也描述了此工作。
[1070] Euglena anabenaUTEX 373的生长和RNA制备
[1071] 如实施例13所述将扩增的cDNA文库eug1c铺在平板上并转移菌落。使用琼脂糖凝胶纯化包含小眼虫Δ9延伸酶基因的NcoI/NotI DNA片段制备DNA探针，该基因来自pKR906(SEQ ID NO：115；实施例16和WO 2007/061845，公布于2007年5月31日；律师32
档案号BB-1562；其内容以引用方式并入本文)，用P dCTP进行标记，使用RadPrime DNA Labeling System(Cat.No.18428-011，Invitrogen，Carlsbad，CA)，按照制造商的说明书进行。
[1072] 如实施例13所述对菌落转移进行探针杂交和阳性鉴定及确认。如实施例2所述分TM离质粒DNA并测序，所得序列使用Sequencher (Version 4.2，Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)进行比对和比较。这样，基于插入序列(命名为EaD9Elo1和EaD9Elo2)能将颗粒分成两类。选择包含每类序列的cDNA的代表性克隆用于进一步研究，每个代表性质粒(pLF121-1和pLF121-2)的序列分别显示为SEQ ID NO：250和SEQ ID NO：251。一串NNNN显示的序列代表polyA尾区域，该区域不进行测序。编码序列EaD9Elo1和EaD9Elo2分别在SEQ ID NO：252和SEQ ID NO：253中显示。EaD9Elo1和EaD9Elo2对应的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：254和SEQ ID NO：255中显示。
[1073] 实施例37
[1074] 鉴定来自Euglena anabenaUTEX 373的Δ5去饱和酶
[1075] 本实施例描述鉴定来自Euglena anabenaUTEX 373的Δ5去饱和酶。美国临时申请60/915733(提交于2007年5月3日；Attorney Docket No.BB-1614；其内容以引用方式并入本文)也描述了此工作。
[1076] 如实施例13所述将扩增的cDNA文库eug1c铺在平板上并转移菌落。使用琼脂糖凝胶纯化包含小眼虫Δ5去饱和酶基因(EgD5；SEQ ID NO：267)的NcoI/NotI DNA片段制备DNA探针，该基因来自pDMW367，以前描述于PCT公开WO 2007/136877(公布于2007年32
11月29日；律师档案号BB 1629；其内容以引用方式并入本文)，用P 进行标记。
[1077] 如实施例13所述对菌落转移进行探针杂交和阳性鉴定及确认。如实施例2所述TM分离质粒DNA并测序，所得序列使用Sequencher (Version4.2，Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)进行比对和比较。
[1078] 包含cDNA(pLF119)的代表克隆在SEQ ID NO：256中显示，cDNA中包含的基因称为EaD5Des1。EaD5Des1编码序列在SEQ ID NO：257中 显示。EaD5Des1对应的氨基酸序列在SEQ ID NO：258中显示。
[1079] 实施例38
[1080] 构 建 大 豆 表 达 载 体 pKR1183 用 于 表 达 Euglena anabenaΔ9 延 伸酶-Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491Δ8去饱和酶融合基因(杂交体1-HGLA合酶)[1081] 构建在Euglena anabenaΔ9延伸酶(EaD9Elo1；SEQ ID NO：252；实施例36)、小眼虫DHA合酶1富含脯氨酸的接头(EgDHAsyn1Link；SEQ ID NO：197；实施例6)和Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491Δ8去饱和酶(TpomD8；SEQ ID NO：162；实施例21；也参见申请人的受让人的共同未决的申请美国专利公开申请11/876115(提交于2007年10月22日；律师档案号BB-1574))之间的框内融合，使用下述条件。
[1082] 通过PCR扩增制备在EaD9Elo1和EgDHAsyn1Link(EaD9elo-EgDHAsyn1Link)之间的最初框内融合，其侧面连接有5’末端的NcoI位点和3’末端的NotI位点。使用以下方法从pLF121-1(SEQ ID NO：250)中扩增EaD9Elo1(SEQ ID NO：252)：利用寡核苷TM酸EaD9-5Bbs(SEQ ID NO：259)和EaD9-3fusion(SEQ ID NO：260)，使 用Phusion 高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)，按照制造商的规程进行扩增。以相似方法从pKR1049(实施例4)中扩增EgDHAsyn1Link(SEQ ID NO：197)，使用寡核苷酸EgDHAsyn1Link-5fusion(SEQ ID NO：261)和MWG511(SEQ ID NO：175)。使用EaD9-5Bbs(SEQ ID NO：259)和MWG511(SEQ ID NO：175)组合两个所得PCR产物以形成EaD9Elo1-EgDHAsyn1Link。EaD9Elo1-EgDHAsyn1Link序列在SEQ ID NO：262中显示。
EaD9Elo1-EgDHAsyn1Link在3’末端的NotI位点上游不包含框内终止密码子，因此如果选择了正确的框，则克隆到NotI位点中的DNA片段能引起与EgD9elo1-EgDHAsyn1Link的框内融合。将EaD9Elo1-EgDHAsyn1Link克隆到 克隆载体中，该方法使用
Zero PCR Cloning Kit(Invitrogen Corporation)，按照制造商的规程进行以制
备pLF124(SEQ ID NO：263)。
[1083] 将包含EaD9Elo1-EgDHAsyn1Link的pLF124(SEQ ID NO：263)的BbsI/NotI DNA片段克隆到来自包含β-大豆伴球蛋白α’亚基启动子的KS366(SEQ ID NO：177；实施例23)的NcoI/NotI DNA片段以制备 pKR1177(SEQ ID NO：264)。
[1084] 将包含EaD9Elo1-EgDHAsyn1Link的pKR1177(SEQ ID NO：264)的BamHI DNA片段克隆到pKR325的BamHI DNA片段中以制备pKR1179(SEQ ID NO：265)，pKR325以前描述于PCT公开WO2006/012325(其内容以引用方式并入本文)。
[1085] 将来自包含TpomD8的pLF114-10(实施例21；SEQ ID NO：165)的NotI片段克隆到pKR1179(SEQ ID NO：265)的NotI片段中以制备pKR1183(SEQ ID NO：266；图28)。在图28中，将融合基因(杂交体1-HGLA合酶)称为EAd9ELONG-TPOMd8DS。
[1086] 实施例39
[1087] 构 建 大 豆 表 达 载 体 pKR1253 用 于 表 达 Euglena anabenaΔ9 延 伸酶-Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491Δ8去饱和酶融合基因(杂交体1-HGLA合酶)与小眼虫Δ5去饱和酶
[1088] 通过多个亚克隆步骤，将NotI位点加到来自pDMW367的小眼虫Δ5去饱和酶(EgD5；SEQ ID NO：267)的5’末端，并且将此包含EgD5的NotI片段克隆到pKR457(SEQ ID NO：122；实施例16)的NotI位点以制备pKR1237(SEQ ID NO：268)。
[1089] 将包含杂交体1-HGLA合酶的pKR1183(SEQ ID NO：266；实施例38)的AscI片段克隆到pKR277(SEQ ID NO：120，它以前描述于PCT公开WO 2004/071467并公布于2004年8月26日；律师档案号BB-1538(其内容以引用方式并入本文)的AscI片段中以制备pKR1252(SEQ ID NO：269)。
[1090] 将包含EgD5基因的pKR1237(SEQ ID NO：268)的BsiWI片段克隆到pKR1252(SEQ ID NO：269)的BsiWI位点以制备pKR1253(SEQ ID NO：270；图30)。
[1091] 实施例40
[1092] 构建大豆载体pKR1139用于表达Euglena anabenaΔ5去饱和酶
[1093] 本实施例描述将来自Euglena anabenaUTEX 373的Δ5去饱和酶克隆到大豆表达载体中。美国临时申请60/915733(提交于2007年5月3日；Attorney DocketNo.BB-1614(其内容以引用方式并入本文))也描述了此工作。
[1094] 使用以下方法从pLF119(SEQ ID NO：256，实施例37)中扩增 EaD5Des1(SEQ ID TMNO：257)：利用oEAd5-1-1(SEQ ID NO：271)和oEAd5-1-2(SEQ ID NO：272)，使用Phusion高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)，按照制造商的规程进行扩增。将所得PCR产物克隆到 克隆载体中，该方法使用Zero PCR
Cloning Kit(Invitrogen Corporation)，按照制造商的规程进行以制备pKR1136(SEQ ID NO：273)。
[1095] 将包含EaD5Des1的pKR1136(SEQ ID NO：273)的NotI片段克隆到pKR974的NotI片段以制备pKR1139(SEQ ID NO：274)，pKR974以前描述于PCT公开WO 2007/136877，公布于2007年11月29日(律师档案号BB-1629(其内容以引用方式并入本文))。
[1096] 实施例41
[1097] 构 建 大 豆 表 达 载 体 pKR1255 用 于 表 达 Euglena anabenaΔ9 延 伸酶-Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491Δ8去饱和酶融合基因(杂交体1-HGLA合酶)与小眼虫Δ5去饱和酶以及Euglena anabenaΔ5去饱和酶
[1098] 质粒pKR1139(SEQ ID NO：274；实施例40)用SbfI进行消化，并且将包含EaD5Des1的片段克隆到pKR1253(SEQ ID NO：270；实施例39)的SbfI位点中以制备pKR1255(SEQ ID NO：275；图31)。
[1099] 实施例42
[1100] 构建大豆表达载体pKR1189用于下调大豆Fad3的表达
[1101] 本实施例描述设计用于减少大豆中fad3表达的大豆表达载体。
[1102] 通过将包含膜联蛋白启动子的pKR268(以前描述于PCT公开WO04/071467)的BsiWI片段插入pKR145(描述于PCT公开WO 04/071467)的BsiWI位点，装配起始载体pKR561(SEQ ID NO：276)。
[1103] 在PCT公开WO 93/11245(它公布于1993年6月10日；还有美国专利公开5,952,544；其内容以引用方式并入本文)中描述的质粒XF1包含大豆Δ15去饱和酶(fad3)基因(SEQ ID NO：277；GenBank登录号L22964；也称为GmFAD3B)。
[1104] 使用以下方法从XF1扩增fad3基因的5’末端部分：使用PhusionTM高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)，按照制造商的规程，使用HPfad3-1(SEQ ID NO：278)和HPfad3-2(SEQ ID NO：279)制备称为HPfad3AB(SEQ ID NO：280)的DNA片段。
[1105] 使用以下方法从XF1扩增fad3基因的3’末端部分：使用PhusionTM高保真DNA聚合酶，利用HPfad3-3(SEQ ID NO：281)和HPfad3-1(SEQ ID NO：278)制备称为HPfad3A’-2(SEQ ID NO：282)的DNA片段。
[1106] 组 合HPfad3AB和 HPfad3A’-2，并 使 用 PhusionTM高 保 真 DNA聚 合 酶 利用Pfad3-1(SEQ ID NO：278) 扩 增 它 们 以 制 备 HPfad3ABA’-2(SEQ ID NO：283)。HPfad3ABA’-2(SEQ ID NO：283)在DNA片段的5’和3’末端具有NotI位点。将所得PCR产物克隆到 克隆载体中，该方法使用Zero PCR Cloning
Kit(Invitrogen Corporation)，按照制造商的规程进行以制备pLF129(SEQ ID NO：284)。
[1107] 将包含fad3发夹的pLF129(SEQ ID NO：284)的NotI片段克隆到pKR561(SEQ ID NO：276)的NotI片段中以制备pKR1189(SEQ ID NO：285；图32)。在图32中，fad3的A和A’结构域通过命名为TR1进行指示，将B结构域命名为TR2。
[1108] 实施例43
[1109] 构建大豆表达载体pKR1249用于下调大豆Fad3和大豆Fad3c
[1110] 如图32所示，将包含fad3的TR1和TR2结构域的pLF129(SEQ ID NO：284)的NotI/HindIII片段克隆到pLF129(SEQ ID NO：284)的NotI/HindIII主链片段以制备pKR1209(SEQ ID NO：286)。
[1111] GmFad3C(GenBank 登 录 号 AY204712)(Bilyeu 等 人，Crop Sci.43：1833-1838(2003)；Anai等人，Plant Sci.168：1615-1623(2005))的编码序列在SEQ ID NO：287中示出，对应的氨基酸序列在SEQ ID NO：288中示出。使用以下方法从在PCT公开WO 93/11245(它公布于1993年6月10日，还有美国专利公开5,952,544)(其内容以引用TM
方式并入本文)中所述的大豆cDNA文库中扩增一部分fad3c基因：使用Phusion 高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)，按照制造商的规程，利用fad3c-5(SEQ ID NO：289)和fad3c-3(SEQ ID NO：290)进行。将所得DNA片段克隆到 克
隆载体中，该方法使用Zero PCR Cloning Kit(Invitrogen Corporation)，按照制造商的规程进行以制备pKR1213(SEQ ID NO：291)。
[1112] 将包含fad3c片段的pKR1213(SEQ ID NO：291)的EcoRV/XhoI片段克隆到pKR1209(SEQ ID NO：286)的NotI(补齐的)/XhoI位点以制备pKR1218(SEQ ID NO：292)。
[1113] 如图32所示，将包含仅来自fad3的TR1结构域的pLF129(SEQ ID NO：284)的NotI/HindIII片段克隆到pLF129(SEQ ID NO：284)的NotI/HindIII主链片段以制备pKR1210(SEQ ID NO：293)。
[1114] 将包含fad3c片段的pKR1213(SEQ ID NO：291)的EcoRV/XhoI片段克隆到pKR1210(SEQ ID NO：293)的NotI(补齐的)/XhoI位点以制备pKR1219(SEQ ID NO：294)。
[1115] 将包含fad3c片段及fad3 TR1和TR2结构域的pKR1218(SEQ ID NO：292)的XhoI(补齐的)/HindIII片段克隆到包含fad3c片段及fad3 TR1结构域的pKR1219(SEQ ID NO：294)的MluI(补齐的)/HindIII位点中以制备pKR1225(SEQ ID NO：295)。这样就形成一个新的发夹结构，它包括fad3和fad3c并且侧面接有NotI位点。
[1116] 将包含包括fad3和fad3c的新发夹结构的pKR1225(SEQ ID NO：295)的NotI片段克隆到pKR561(SEQ ID NO：276；实施例42)的NotI片段中以制备pKR1229(SEQ ID NO：296；图33)。这样，fad3/fad3c发夹能从具有潮霉素选择位点的植物中的一个强种子特异性启动子开始表达。
[1117] 将包含包括fad3和fad3c的新发夹结构的pKR1225(SEQ ID NO：295)的BsiWI片段克隆到pKR226(SEQ ID NO：130；实施例17)的BsiWI片段中以制备pKR1249(SEQ ID NO：297；图34)。在图34中，将pKR1249标记为pKR1249_PHP33240。这样，fad3/fad3c发夹能从具有氯磺隆(ALS)选择位点的植物中的一个强种子特异性启动子开始表达。
[1118] 实施例44
[1119] 构 建 大 豆 表 达 载 体 pKR1322 用 于 表 达 Euglena anabenaΔ9 延 伸酶-Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491Δ8去饱和酶-Euglena anabenaΔ5去饱和酶融合基因(EaD9Elo1-TpomD8-EaD5Des1融合)
[1120] 本实施例描述了构建在Euglena anabenaΔ9延伸酶(EaD9Elo1；SEQ ID NO：252，实施例36)、Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491Δ8去饱和酶(TpomD8；SEQ ID NO：162；实施例21)和Euglena anabenaΔ5去饱和酶(EaD5Des1；SEQ ID NO：257；实施例37)之间的框内融合基因。每个结构域用EgDHAsyn1接头(EgDHAsyn1Link；SEQ ID NO：197；实施例6)分开。
[1121] 使用以下方法从pLF124(SEQ ID NO：263)中扩增EaD9Elo1-EgDHAsyn1Link(SEQ ID NO：262；实施例38)：利用寡核苷酸oEAd9el1-1(SEQ ID NO：298)和oLINK-1(SEQ ID TMNO：299)，使用Phusion 高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)，按照制造商的规程进行扩增。EaD9Elo1-EgDHAsyn1Link侧面接有在5’末端的NotI和在5’及3’末端的EagI，并且在3’末端的EagI位点不包含框内终止密码子上游。因此，如果选择了正确的框，则克隆到EagI位点的DNA片段能引起与EgD9elo-EgDHAsyn1Link的框内融合。将所得包含EaD9Elo 1-EgDHAsyn1Link的DNA片段克隆到 克隆载体中，
该方法使用Zero PCR Cloning Kit(Invitrogen Corporation)，按照制造商的规
程进行以制备pKR1298(SEQ ID NO：300)。
[1122] 通过PCR扩增制备在TpomD8 和EgDHAsyn1Link(TpomD8-EgDHAsyn1Link)之间的框内融合，它包含在5’末端的NotI位点和在5’和3’末端的EagI位点。使用以下方法从pLF114-10(SEQ ID NO：165)中扩增TpomD8(SEQ ID NO：162)：利用寡核苷酸TMoTPd8-1(SEQ ID NO：301)和oTPd8fus-1(SEQ ID NO：302)，使用Phusion 高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)，按照制造商的规程进行扩增。以相似方法从pKR1049(实施例4)中扩增EgDHAsyn1Link(SEQ ID NO：197)，使用寡核苷酸oLINK-2(SEQ ID NO：303)和oLINK-1(SEQ ID NO：304)。使用oTPd8-1(SEQ ID NO：301)和oLINK-1(SEQ ID NO：304)组合并再扩增两个所得PCR产物以形成TpomD8-EgDHAsyn1Link(SEQ ID NO：305)。将TpomD8-EgDHAsyn1Link克隆到 克隆载体中，该方法使用
Zero PCR Cloning Kit(Invitrogen CorporationE)，按照制造商的规程进行以制备pKR1291(SEQ ID NO：306)。
[1123] 将包含TpomD8-EgDHAsyn1Link的pKR1291的EagI片段克隆到pBluescript II SK(+)载体(Stratagene)的NotI位点以形成同向pKR1301(SEQ ID NO：307)或反向pKR1301R(SEQ ID NO：308)。
[1124] 质粒pKR1301(SEQ ID NO：307)用MfeI/BamHI进行消化，得到的DNA片段包含完全补齐的TpomD8-EgDHAsyn1Link，并再连接所得DNA片段以形成pKR1311(SEQ ID NO：309)。
[1125] 质粒 pKR1301R(SEQ ID NO：308)用 EcoRI进 行消 化，得 到的 片 段 包 含TpomD8-EgDHAsyn1Link(称为TPOMD8TR2)的5’末端并再连接载体主链以形成pKR1304(SEQ ID NO：310)。
[1126] 将包含EaD9Elo1-EgDHAsyn1Link的pKR1298(SEQ ID NO：300)的EagI位点克隆到pKR1304(SEQ ID NO：310)的EagI位点以制备pKR1309(SEQ ID NO：311)。
[1127] 将包含EaD9Elo1-EgDHAsyn1Link的pKR1298(SEQ ID NO：300)的NotI位点克隆到pKR1304(SEQ ID NO：310)的EagI位点以制备pKR1309(SEQ ID NO：311)。
[1128] 将包含EaD5Des1的pKR1136(SEQ ID NO：273；实施例40)的NotI片段克隆到pKR1311(SEQ ID NO：309)的EagI位点以制备pKR1313(SEQ ID NO：312)。
[1129] 将pKR1313(SEQ ID NO：312)的MfeI/Ecl136II片段克隆到pKR1309(SEQ ID NO：311)的EcoRV/MfeI位点以制备pKR1315(SEQ ID NO：313)。
[1130] 将pKR1315(SEQ ID NO：313)的NotI片段克隆到pKR72(SEQ ID NO：105；实施例15)的NotI位点以制备pKR1322(SEQ ID NO：314；图35)。
[1131] 在图35中，将EaD9Elo1-TpomD8-EaD5Des1融合标记为EAd9el+TPd8ds+EAd5ds融合。
[1132] 实施例45
[1133] 通过pKR1189或pKR1229转化下调大豆体细胞胚中的fad3和fad3c基因
[1134] 本实施例描述在大豆体细胞胚中转化和表达包含fad3发夹构建体的pKR1189(SEQ ID NO：285，实施例42)或包含fad3和fad3c发夹构建体的pKR1229(SEQ ID NO：296；实施例43)。两个构建体还具有潮霉素磷酸转移酶基因用于潮霉素选择。
[1135] 大豆胚芽发生悬浮培养物(cv.Jack)用pKR1189(SEQ ID NO：285)或pKR1229(SEQ ID NO：296)进行转化，成熟胚芽在大豆组织分化和成熟液体培养基中获取(SHaM液体培养基；Schmidt等人，Cell Biology and Morphogenesis，24：393(2005))，如实施例25所述并且以前描述于PCT公开WO 2007/136877，公布于2007年11月29日(其内容以引 用方式并入本文)。
[1136] 在SHaM液体培养基中成熟后，从簇中取出单个胚芽，干燥并如实施例1所述筛选脂肪酸组成发生改变的胚芽。在各种情况下，收获并分析用pKR1189(SEQ ID NO：285)或pKR1229(SEQ ID NO：296)转化的大豆胚芽(即，每个事件五个胚芽)的子集。
[1137] 这样就分析了用pKR1189(SEQ ID NO：285；实验2148)或pKR1229(SEQ ID NO：296；实验2165)转化的41个事件。图36显示五个事件的脂肪酸分布型，所述事件具有最低的平均ALA含量(5个经分析的大豆体细胞胚的平均值)，并且一个事件(2148-3-8-1)具有该实验典型野生型胚芽的脂肪酸分布型。在图36中脂肪酸经鉴定是16：0(棕榈酸)、18：
0(硬脂酸)、18：1(油酸)、LA和ALA。脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。
[1138] 当与野生型胚芽(图36)相比较时，在表达fad3发夹构建体(事件编号2148，图36)或fad3c发夹构建体(事件编号2165，图36)的体细胞胚中的ALA含量显示减少了至少50％。这强烈证明了发夹构建体能减少大豆胚芽中的ALA含量。
[1139] 实施例46
[1140] 用pKR1183转化过的大豆体细胞胚用于表达Euglena anabenaΔ9延伸酶-Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491Δ8去饱和酶融合基因(杂交体1-HGLA合酶)[1141] 本实施例描述在大豆体细胞胚中转化和表达包含Euglena anabenaΔ9延伸酶-Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491Δ8去饱和酶融合基因(杂交体1-HGLA合酶)和用于潮霉素选择的潮霉素磷酸转移酶基因的pKR1183(SEQ ID NO：266；实施例38)。
[1142] 大豆胚芽发生悬浮培养物(cv.Jack)用pKR1183(SEQ ID NO：266)进行转化，成熟胚芽获自大豆组织分化和成熟液体培养基(SHaM液体培养基；Schmidt等人，Cell Biology and Morphogenesis，24：393(2005))，如实施例25所述并且以前描述于PCT公开WO 2007/136877，公布于2007年11月29日(其内容以引用方式并入本文)。
[1143] 在成熟后，如本文所述在SHaM液体培养基中收获并分析用pKR1183(SEQ ID NO：266)转化的大豆胚芽(即，每个事件四个胚芽)的子集。
[1144] 这样就分析了用pKR1183(SEQ ID NO：266；实验2145)转化过的20个事件。图37显示五个事件的脂肪酸分布型，所述事件具有最高的平均DGLA含量(5个经分析的大豆体细胞胚的平均值)。在图37中，脂肪酸经鉴定是16：0(棕榈酸)、18：0(硬脂酸)、18：1(油酸)、LA、ALA、EDA、ERA、DGLA和ETA。脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。
[1145] 实施例47
[1146] 大豆胚芽用大豆表达载体pKR1253转化，用于表达Euglena anabenaΔ9延伸酶-Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491Δ8去饱和酶融合基因(杂交体1-HGLA合酶)与小眼虫Δ5去饱和酶，和用pKR1249转化，用于下调大豆Fad3和大豆Fad3c
[1147] 大豆胚芽发生悬浮培养物(cv.Jack)如实施例25所述用pKR1249(SEQ ID NO：297；实施例43)和pKR1253(SEQ ID NO：270；实施例39)的AscI片段转化。收获每个事件(每个事件十个胚芽)生成的大豆胚芽的子集并将其放入玻璃GC小瓶，通过酯交换制备脂肪酸甲酯(FAME)并如实施例1所述通过GC进行分析。保留时间与那些可商购获得的标准甲酯比较(Nu-Chek Prep，Inc.)。
[1148] 这样就分析了用pKR1249(SEQ ID NO：297)和pKR1253(SEQ ID NO：270)(实验称为Heal 25)转化的142个事件。在分析的142个事件中，90个事件经鉴定在十个分析的胚芽中至少有一个能产生相对丰度大于1.0％的总脂肪酸。这些事件中，64个事件经鉴定在十个分析的胚芽中至少有一个能产生相对丰度大于10.0％的总脂肪酸。这些事件中，44个事件经鉴定在十个分析的胚芽中至少有一个能产生相对丰度大于20.0％的总脂肪酸。
[1149] 图38显示了具有最高ARA的20个事件的平均脂肪酸分布型(平均10个胚芽)。脂肪酸经鉴定是16：0(棕榈酸)、18：0(硬脂酸)、18：1(油酸)、LA、ALA、EDA、SCI、DGLA、ARA、ERA、JLIN、ETA和EPA；以及，图38中列出的脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。就图38而言，列为“其他”的脂肪酸包括：18：2(5，9)、18：3(5，9，12)、STA、20：0、
20：1(11)、20：2(7，11)或20：2(8，11)和DPA。这些脂肪酸中的每一种存在的相对丰度为小于总脂肪酸的2.0％。平均总ω-3脂肪酸(总计n-3)是所有ω-3脂肪酸的平均值之和)。
[1150] 图39显示了来自具有平均ARA含量17.0％和平均EPA含量1.5％的一个事件(AFS5416-8-1-1)中每个胚芽的实际脂肪酸分布型。脂肪酸经鉴定是16：0(棕榈酸)、18：0(硬脂酸)、18：1(油酸)、LA、ALA、EDA、SCI、DGLA、ARA、ERA、JLIN、ETA和EPA；以及，图39中列出的脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。就图39而言，列为“其他”的脂肪酸包括：18：2(5，9)、18：3(5，9，12)、STA、20：0、20：1(11)、20：2(7，11)或20：2(8，11)和DPA。这些脂肪酸中的每一种存在的相对丰度为小于总脂肪酸的2.0％。总ω-3脂肪酸(总计n-3)是所有ω-3脂肪酸之和)。
[1151] 因为在体细胞胚中的大豆ALA含量一般高于种子中的ALA含量1.5至3倍(即，取决于成熟条件和时间，胚芽中的15％至30％(参见，例如，图36中的典型野生型胚芽)对种子中的7％至10％(Bilyeu等人，2005，Crop Sci.45：1830-1836)，期望种子中通常的ω-3含量和特定的EPA含量将显著低于它们在体细胞胚中的含量。
[1152] 实施例48
[1153] 大豆胚芽用大豆表达载体pKR1255转化，用于表达Euglena anabenaΔ9延伸酶-Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491Δ8去饱和酶融合基因(杂交体1-HGLA合酶)与小眼虫Δ5去饱和酶及Euglena anabenaΔ5去饱和酶，和用pKR1249转化，用于下调大豆Fad3和大豆Fad3c
[1154] 大豆胚芽发生悬浮培养物(cv.Jack)如实施例25所述用pKR1249(SEQ ID NO：297；实施例43)和pKR1255(SEQ ID NO：275；实施例41)的AscI片段转化。收获每个事件(每个事件十个胚芽)生成的大豆胚芽的子集并将其放入玻璃GC小瓶，通过酯交换制备脂肪酸甲酯(FAME)并如实施例1所述通过GC进行分析。保留时间与那些可商购获得的标准甲酯比较(Nu-Chek Prep，Inc.)。
[1155] 这样就分析了用pKR1249(SEQ ID NO：297)和pKR1255(SEQ ID NO：275)(实验称为Heal 26)转化的197个事件。在分析的197个事件中，128个事件经鉴定在十个分析的胚芽中至少有一个能产生相对丰度大于1.0％的总脂肪酸。这些事件中，105个事件经鉴定在十个分析的胚芽中至少有一个能产生相对丰度大于10.0％的总脂肪酸。并且这些事件中，83个事件经鉴定在十个分析的胚芽中至少有一个能产生相对丰度大于20.0％的总脂肪酸。
[1156] 图40显示了具有最高ARA的20个事件的平均脂肪酸分布型(平均9或10个胚芽)。脂肪酸经鉴定是16：0(棕榈酸)、18：0(硬脂酸)、18：1(油酸)、LA、ALA、EDA、SCI、DGLA、ARA、ERA、JUN、ETA和EPA；以及，图40中列出的脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。就图40而言，列为“其他”的脂肪酸包括：18：2(5，9)、18：3(5，9，12)、STA、20：0、20：1(11)、20：2(7，11)或20：2(8，11)和DPA。这些脂肪酸中的每一种存在的相对丰度为小于总脂肪酸的2.0％。平均总ω-3脂肪酸(总计n-3)是所有ω-3脂肪酸的平均值之和)。
[1157] 实施例49
[1158] 表达用大豆表达载体pKR1134转化过的小眼虫DHA合酶1C20延伸酶结构域/聚合裂殖壶菌Δ4去饱和酶融合蛋白(EgDHAsyn1C20EloDom3-SaD4)
[1159] 大豆胚芽发生悬浮培养物(cv.Jack)用pKR1134(SEQ ID NO：161；实施例20；片段包含表达盒)的AscI片段进行转化，并如实施例25所述的生产方法获取成熟胚芽。如实施例35所述提供EPA给底物并进行分析。
[1160] 这样就分析了用pKR1134(称为Hea124的实验)转化过的198个事件。在分析的198个事件中，193个经鉴定能延伸EPA(C20/Δ5延伸酶活性)，所有这些事件能在某种程度上去饱和DPA(Δ4去饱和酶活性)以制备DHA。提出了具有最好C20/Δ5延伸酶和Δ4去饱和酶活性的事件，并且来自提供EPA的胚芽的脂肪酸分布型在图41中显示。
[1161] 图41中的脂肪酸经鉴定是16：0(棕榈酸)、18：0(硬脂酸)、18：1(油酸)、LA、ALA、EPA、22：0(二十二烷酸)、DPA、24：0(二十四烷酸)、DHA和24：1(二十四烯酸)；以及，图41中列出的脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。将EgDHAsyn1C20EloDom1的活性表达为C20/Δ5延伸率百分比(％C20/Δ5elong)，根据以下公式进行计算：([产物]/[底物+产物])*100。更具体地讲，将EPA的组合延伸率百分比EPA表示为“％C20/Δ5elong”，测定公式如下：([DPA+DHA]/[EPA+DPA+DHA])*100。
[1162] 将SaD4的活力表达为Δ4去饱和百分比(％Δ4Desat)，根据以下公式进行计算：([产物]/[底物+产物])*100。更具体地讲，将DPA的组合去饱和百分比EPA表示为“％Δ4desat”，测定公式如下： (DHA/[DPA+DHA])*100。
[1163] 除了如实施例35所述进行分析的用pKR1105(实验称为Hea123)转化过的大豆的122个事件之外，还分析了另外20个事件，因为实施例35共分析了142个事件。在分析的
20个新事件中，18个经鉴定能延伸EPA(C20/Δ5延伸酶活性)，17个这些事件也能在某种程度上去饱和DPA(Δ4去饱和酶活性)以制备DHA。提出了来自用pKR1105转化过的大豆分析的20个新事件的、具有最佳C20/Δ5延伸酶和Δ4去饱和酶活性的事件，在图42中显示了来自提供EPA的胚芽的脂肪酸分布型。
[1164] 通过图示所有向胚芽提供EPA的事件的％DHA(wt.％)对％DPA(wt.％)，比较用pKR1105(个别表达的C20延伸酶和Δ4去饱和酶)或pKR1134(融合表达的C20延伸酶和Δ4去饱和酶)转化过的事件的相对活性。结果在图43中绘图表示。在图43中，Hea123是其中转化pKR1105的实验名称，Hea124是其中转化pKR1134的实验名称。从图43中可以清楚的看出，当C2O延伸酶融合到Δ4去饱和酶上时，总体上DHA浓度提高，而DPA浓度降低(低至无法察觉)。因此，将2个独立酶融合成一个由连接区域分开的融合蛋白提高了由EPA至DHA的流量。
[1165] 实施例50
[1166] 表达Euglena anabenaΔ9延伸酶-Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491Δ8去饱和酶-Euglena anabenaΔ5去饱和酶融合基因(EaD9Elo1-TpomD8-EaD5Des1融合)[1167] 大豆胚芽发生悬浮培养物(cv.Jack)如本文所述用pKR1322(SEQ ID NO：314)转化、获取成熟胚芽并分析其脂肪酸分布型。
[1168] 用pKR1322(SEQ ID NO：314)转化过的大豆体细胞胚将延伸LA成EDA，EDA将被去饱和成DGLA，而DGLA将被进一步去饱和成ARA。因为野生型大豆也包含ALA，一些ALA将被延伸成ERA，ERA将被去饱和成ETA，而ETA将被进一步去饱和成EPA。
[1169] 表达来自pKR1322的融合基因的大豆植株可如实施例26所述再生自胚芽，并且可获取种子。
[1170] 在包含高ALA，或其中共表达Δ15去饱和酶和或Δ17去饱和酶的发明背景中，EPA将较为丰富。相反，如本文所述可通过使用低背景ALA(例如通过杂交到低ALA或低lin植物)或通过敲除内源fad3基因 增加ARA。当使用融合时中间脂肪酸(即，EDA和DGLA或ERA和ETA)将低于当单独转化单个活性(即，非融合)。
[1171] 可将其他基因组合(包括接头组合)用与实施例24所述相似的方法融合在一起。同样的，可制备其他启动子/融合基因/终止子组合。
[1172] 实施例51
[1173] 测定在来源于Euglena anabena并经密码子优化用于在解脂耶氏酵母中表达的合成Δ4去饱和酶(EaD4S)中的功能结构域
[1174] 如在图52C所示，EaDHAsyn1(图中标记为“EaC20E”)的C20延伸酶结构域的C-末端部分与EaDHAsyn1(图中标记为“EaD4”)的Δ4去饱和酶结构域的N末端部分出现重叠。这通过序列比较证明。
[1175] 为了确定EaD4S(SEQ ID NO：192；实施例34)中的Δ4去饱和酶功能结构域，生成了三个具有不同N末端截短的EaD4S*突变型。具体地讲，pZuFmEaD4S(SEQ ID NO：364)通过用pEaD4S(SEQ ID NO：196；实施例34)的NcoI/NotI EaD4S片段替代pZuFmIgD9ES(SEQ ID NO：365)的NcoI/NotI片段进行构建。通过定点诱变，使用引物对YL921和YL922(分别是SEQ ID NO：366和367)、YL923和YL924(分别是SEQ ID NO：368和369)和YL925和YL926(分别是SEQ ID NO：370和371)，在NcoI位点导入pZuFmEaD4S(SEQ ID NO：364)以分别生成pZuFmEaD4S-M1(SEQ ID NO：372)、pZuFmEaD4S-M2(SEQ ID NO：
373) 和 pZuFmEaD4S-M3(SEQ ID NO：374)。The pZuFmEaD4S-M1、pZuFmEaD4S-M2 和pZuFmEaD4S-M3质粒用NcoI消化，然后自连接以生成pZuFmEaD4S-1(SEQ ID NO：375)、pZuFmEaD4S-2(SEQ ID NO：376)和pZuFmEaD4S-3(SEQ ID NO：377)构建 体。使用 包含来自pZuFmEaD4S-1、pZuFmEaD4S-2、pZuFmEaD4S-3的EaD4S不同截短的NcoI/NotI片段以制 备pZKL4-220EA4-1(SEQ ID NO：378)、pZKL4-220EA4-2(SEQ ID NO：379)和pZKL4-220EA4-3(SEQ ID NO：380)构建体。这三个构建体与pZKL4-220EA4(SEQ ID NO：
362和图52B，如实施例34的表28所述)基本相同，不同的是EaD4S的编码区在N末端区域被截短。具体地讲，截短EaD4S*多肽的pZKL4-220EA4-1(即，SEQ ID NO：382)长度为547个氨基酸，截短pZKL4-220EA4-2(即，SEQ ID NO：384)长度为527个氨基酸，截短pZKL4-220EA4-3(即，SEQ ID NO：386)的长度为512个氨基酸，而EaD4S(SEQ ID NO：193)的编码区长度为583个氨基酸。这些多肽(对应于SEQ ID NO：193的氨基酸1至90)的N末端区域在图53A中进行比对。
[1176] 如通用方法所述，质粒pZKL4-220EA4(SEQ ID NO：362)、pZKL4-220EA4-1(SEQ ID NO：378)、pZKL4-220EA4-2(SEQ ID NO：379)和pZKL4-220EA4-3(SEQ ID NO：380)用AscI/SphI消化，然后转入解脂耶氏酵母菌株Y4184U4。在MM平板上进行转化子的筛选。在30℃生长5天后，采集在MM平板上生长的来自每个构建体的5个转化子并再划线接种到新制MM平板上。一旦开始生长，将这些个菌株分别接种到3mL液体MM中，在30℃下，以250rpm/min振荡2天。离心收集细胞，重悬于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应制备脂肪酸甲酯，并随后用Hewlett-Packard6890 GC分析。
[1177] GC结果在表29中显示。DPA和DHA的组分用占总脂肪酸的百分比表示。转化效率(“Conv.Effic.”)根据如下公式测量：([DHA]/[DPA+DHA])*100。每个截短EaD4S*(即，分别在耶氏酵母属转化子pZKL4-220EA4-1，pZKL4-220EA4-2和pZKL4-220EA4-3中的547个氨基酸、527个氨基酸或512个氨基酸的多肽)的Δ4去饱和酶活性与EaD4S(即，pZKL4-220EA4的耶氏酵母属转化子)的该酶活性进行比较，在柱图中比较为“％Δ4活性”。
[1178] 表29
[1179] 在解脂耶氏酵母菌株Y4184U4中的EaD4S和截短变型的功能性分析
[1180]
[1181] 这些数据证明EaD4S(即，SEQ ID NO：193的氨基酸1至37)的N末端37个氨基酸对Δ4去饱和酶活性具有负效应。相对于EaD4S进行测量，在每个EaD4S*截短蛋白中Δ4去饱和酶活性升高，虽然547个氨基酸(SEQ ID NO：382)的EaD4S*多肽活性高于N端缺乏附加氨基酸的EaD4S*多肽(即，SEQ ID NO：384和386)。
[1182] 实施例52
[1183] 合成及功能分析来自解脂耶氏酵母中的小眼虫的密码子优化的Δ4去饱和酶基因(EgD4S)
[1184] 小眼虫EgDHAsyn1(SEQ ID NO：221)的Δ4去饱和酶结构域使用的密码子(对应于SEQ ID NO：12的氨基酸253-793)进行最优化用于在解脂耶氏酵母中表达，表达方法类似于PCT公开WO 2004/101753、美国专利公开7,125,672和本文实施例32、33和34所述的方法。具体地讲，基于EgDHAsyn1Δ4去饱和酶结构域的编码序列，根据耶氏酵母密码子使用模式(PCT公开WO 2004/101753)、‘ATG’翻译起始密码子周围的共有序列以及RNA稳定性的一般规则(Guhaniyogi，G.和J.Brewer，Gene，265(1-2)：11-23(2001))，设计经密码子优化的Δ4去饱和酶基因(称作“EgD4S”；SEQ ID NO：387)。除了修饰翻译起始位点，还对1623bp编码区中的282bp进行了修饰(17.4％)并优化了270个密码子(49.9％)。EgD4S的经密码子优化的编码区长度为1623bp，从而编码540个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：388)。
因此，EgD4S长度比野生型EgDHAsyn1Δ4去饱和酶结构域短一个氨基酸(即，SEQ ID NO：
221；具体地讲，在EgD4S(SEQ ID NO：388)中移除对应于SEQ ID NO：13的氨基酸位点2的亮氨酸残基。设计的EgD4S基因(SEQ ID NO：387)由GenScript Corporation(Piscataway，NJ)合成并将其克隆到pUC57(GenBank登录号Y14837)中而产生pEgD4S(SEQ ID NO：389)。
[1185] 为了分析密码子优化EgD4S基因的功能，构建质粒pZKL4-220Eg4(SEQ ID NO：390)以将两个嵌合C20延伸酶基因和嵌合EgD4S基因整合到解脂耶氏酵母菌株Y4305U3的脂肪酶4样位点(GenBank登录号XM_503825)。在质粒pZKL4-220Eg4(SEQ ID NO：390)的构建体与质粒pZKL4-220Ea4(SEQ ID NO：362；图52B；实施例34的表28)的构建体相同，除了EgD4S(SEQ ID NO：387)被用在EaD4S(SEQ ID NO：192)的位置。
[1186] 如通用方法所述，用AscI/SphI消化质粒pZKL4-220Eg4，然后将其转化到解脂耶氏酵母菌株Y4305U3中。在MM平板上进行转化子的筛选。在30℃生长5天后，采集在MM平板上生长的14个转化子并再划线接种到新制MM平板上。一旦开始生长，将这些个菌株分别接种到3mL液体MM中，在30℃下，以250rpm/min振荡2天。离心收集细胞，重悬于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应制备脂肪酸甲酯，并随后用Hewlett-Packard 6890 GC分析。
[1187] GC分析显示在所有14个转化子中产生占总脂质平均4.9％的DHA和17.8％的DPA，其中DPA到DHA的转化效率经测定为约21.5％(如实施例27中所述进行计算)。因此，该实验数据证明经密码子优化用于在解脂耶氏酵母中表达的合成小眼虫Δ4去饱和酶(即，EgD4S，在SEQ ID NO：387中示出)具将DPA转化成DHA的活性。
[1188] 实施例53
[1189] 测定在来源于小眼虫并经密码子优化用于在解脂耶氏酵母中表达的合成Δ4去饱和酶(EgD4S)中的功能结构域
[1190] 使用类似于在EaDHAsyn1(图52C)观察到的方法，EgDHAsyn1的C20延伸酶结构域的C-末端部分与EgDHAsyn1的Δ4去饱和酶结构域的N末端部分基于序列比较出现重叠。
[1191] 为了确定EgD4S(SEQ ID NO：387)中的Δ4去饱和酶功能结构域，生成了三个具有不同N末端截短的EgD4S突变型。通过定点诱变，使用引物对YL935和YL936(分别是SEQ ID NO：391和392)、YL937和YL938(分别是SEQ ID NO：393和394)和YL939和YL940(分别是SEQ ID NO：395和396)，在NcoI位点导入pEgD4S(SEQ ID NO：389；实施例52)以分别生成pEgD4S-M1(SEQ ID NO：397)、pEgD4S-M2(SEQ ID NO：398)和pEgD4S-M3(SEQ ID NO：399)。使用包含来自pEgD4S-M1、pEgD4S-M2和pEgD4S-M3的EgD4S不同截短的NcoI/NotI片段以制备pZKL4-220Eg4-1(SEQ ID NO：400)、pZKL4-220Eg4-2(SEQ ID NO：401)和pZKL4-EgD4-3(SEQ ID NO：402)构建体。这三个构建体与pZKL4-220Eg4(SEQ ID NO：390；实施例52)基本相同，不同的是EgD4S的编码区在N末端区域被截短。具体地讲，截短EgD4S*多肽的pZKL4-220Eg4-1(即，SEQ ID NO：404)长度为513个氨基酸，截短 pZKL4-220Eg4-2(即，SEQ ID NO：406)长度为490个氨基酸，截短pZKL4-220Eg4-3(即，SEQ ID NO：408)的长度为474个氨基酸，而EgD4S(SEQ ID NO：388)的编码区长度为540个氨基酸。这些多肽(对应于SEQ ID NO：388的氨基酸1至80)的N末端区域在图53B中进行比对。
[1192] 如通用方法所述，质粒pZKL4-220Eg4(SEQ ID NO：390)、pZKL4-220Eg4-1(SEQ ID NO：400)、pZKL4-220Eg4-2(SEQ ID NO：401)和pZKL4-220EgD4-3(SEQ ID NO：402)用AscI/SphI消化，然后分别转入解脂耶氏酵母菌株Y4305U3。在MM平板上进行转化子的筛选。在30℃生长5天后，采集在MM平板上生长的来自每个构建体的4个转化子并再划线接种到新制MM平板上。一旦开始生长，将这些个菌株分别接种到3mL液体MM中，在30℃下，以
250rpm/min振荡2天。离心收集细胞，重悬于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应制备脂肪酸甲酯，并随后用Hewlett-Packard6890GC分析。
[1193] GC结果在表30中显示。DPA和DHA的组分用占总脂肪酸的百分比表示。转化效率(“Conv.Effic.”)根据如下公式测量：([DHA]/[DPA+DHA])*100。每个截短EgD4S*(即，分别在耶氏酵母属转化子pZKL4-220Eg4-1，pZKL4-220Eg4-2和pZKL4-220Eg4-3中的513个氨基酸、490个氨基酸或474个氨基酸的多肽)的Δ4去饱和酶活性与EgD4S(即，pZKL4-220Eg4的耶氏酵母属转化子)的该酶活性进行比较，在柱图中比较为“％Δ4活性”。
[1194] 表30
[1195] 在解脂耶氏酵母菌株Y4305U3中的EgD4S和截短突变型的功能分析
[1196]
[1197] 这些数 据证 明EgD4S*N末端的 28个氨基 酸不是 必要 的(即，参 见pZKL4-220Eg4-1，其中截去了EgD4S的最初28个氨基酸，并且如SEQ ID NO：404示出的截短蛋白保留了完全的Δ4去饱和酶活性)。当从EgD4S蛋白5’部分截去附加氨基酸时，在具有pZKL4-220EgD4-2和pZKL4-220EgD4-3的转化子中测量到降低的Δ4去饱和酶活性，从而产生SEQ ID NO：406和SEQ ID NO：408。
[1198] 实施例54
[1199] 合成及功能分析来自解脂耶氏酵母中的小眼虫的密码子优化的EgDHAsyn1基因(EgDHAsyn1S)
[1200] 设计质粒pZKLY-G204(图54A；SEQ ID NO：409)以将包含密码子优化的EgDHAsyn1编码区(即，如SEQ ID NO：410和411示出的EgDHAsyn1S)的嵌合基因整合到解脂耶氏酵母菌株Y4305U3的脂肪酶7位点(GenBank登录号AJ549519)。除了修饰翻译起始位点，还对2382bp编码区中的417bp进行了修饰(17.5％)，并优化了总共794个密码子中的391个(49.2％)。密码子优化的EgDHAsyn1S(SEQ ID NO：411)的氨基酸序列与EgDHAsyn1(SEQ ID NO：12)的氨基酸序列100％相同。
[1201] 为了生成pZKLY-G204，通过定点诱变，使用寡核苷酸YL973和YL974(分别是SEQ ID NO：413和414)作引物，pEgC20ES作模板，将 KpnI位点导入pEgC20ES(SEQ ID NO：185；参见图51B，实施例32)中以生成pEgC20ES-K(SEQ ID NO：412；图54B)。分离包含pYNTGUS1-CNP(图54C；SEQ ID NO：415)的YAT1启动子(专利公布US 2006/0094102-A1)的732bp PmeI/NcoI片段、包含EgDHAsyn1S经密码子优化的N末端部分的pEgC20ES-K的
873bp NcoI/KpnI片段和包含EgDHAsyn1S经密码子优化的C末端部分的pEgD4S(SEQ ID NO：389；实施例52)的1512bp KpnI/NcoI片段，然后将它们用于置换pZKLY(图54D；SEQ ID NO：416)的PmeI/NotI片段以生成pZKLY-G204(图54A)。因此pZKLY-G204包含以下组分：
[1202] 表31
[1203] 质粒pZKLY-G204(SEQ ID NO：409)的组分
[1204]
[1205] 如通用方法所述，用AscI/SphI消化质粒pZKLY-G204，然后将其转化到解脂耶氏酵母菌株Y4305U3中。在MM平板上进行转化子的筛选。 在30℃生长5天后，采集在MM平板上生长的8个转化子并再划线接种到新制MM平板上。一旦开始生长，将这些个菌株分别接种到3mL液体MM中，在30℃下，以250rpm/min振荡2天。离心收集细胞，重悬于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应制备脂肪酸甲酯，并随后用Hewlett-Packard 6890 GC分析。
[1206] GC分析显示在所有8个转化子中有约5.0％DHA、13.5％DPA和26.5％EPA的总脂质产生。在这八个菌株中EPA到DPA和DHA的转化效率经测定为约41％；并且，DPA到DHA的转化效率经测定为约27％(如实施例27所述进行计算)。因此，该实验数据证明经密码子优化用于在解脂耶氏酵母中表达的合成小眼虫DHA合酶(即，在SEQ ID NO：410中示出的EgDHAsyn1S)包含C20延伸酶活性和Δ4去饱和酶活性。EgDHAsyn1S可使用EPA作底物制备DHA。
[1207] 实施例55
[1208] 创造Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶融合基因以在解脂耶氏酵母中表达
[1209] 为了改善解脂耶氏酵母中的Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶的酶活性，使用来源 于EgDHAsyn1富含 脯氨酸 的接 头(SEQ ID NO：198；PARPAGLPPATYYDSLAV)的两 个 突 变 接 头 序 列(即，SEQ ID NO：438[GPARPAGLPPATYYDSLAV]和 SEQ ID NO：
445[GAGPARPAGLPPATYYDSLAVMGS])，本实施例创造出一系列六个Δ9延伸酶/Δ8融合基因(复合酶)。
[1210] 需要以下工作：鉴定用于在解脂耶氏酵母中表达的合适Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶；和，构建质粒pZUFmG9G8fu(包括EgD9ES/EgD8M融合基因)、质粒pZuFmG9G8fu-B(包括EgD9ES/EgD8M融合基因)，质粒pZUFmG9A8(包括EgD9ES/EaD8S融合基因)、质粒pZUFmA9G8(包括EaD9ES/EgD8M融合基因)、质粒pZUFmA9A8(包括EaD9ES/EaD8S融合基因)和质粒pZUFmR9G8(包括E389D9eS/EgD8M融合基因)。所有质粒共用一个通用载体主链，因此仅能通过每个包括的融合基因进行区分。
[1211] 实施例56中下文测试的每个融合基因的活性功能分析。
[1212] 描述经密码子优化的用于在解脂耶氏酵母中表达的合成Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶基因
[1213] 申请人已经对多个Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶进行了大量分析，以测定当在解脂耶氏酵母中表达时，具有最佳底物特异性和/或底物选择性的那些酶。基于这些分析，将在下表32中描述的基因和来源于它们的经密码子优化的基因(根据美国专利公开7,125,672的方法)鉴定为优选用于在解脂耶氏酵母中表达。那些用粗体字突出显示的基因随后被用于创造Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶融合基因。
[1214] 表32
[1215] 用于在解脂耶氏酵母中创造Δ9/Δ8融合基因的优选去饱和酶和延伸酶
[1216]
[1217] *注：
[1218] ●EgD9e在本文实施例16中描述为“EgD9elo”。
[1219] ●在美国临时专利申请60/911925和本文实施例36中，将EaD9e鉴定为“EaD9Elo1”。
[1220] ●在美国专利公开7,256,033中将EgD8鉴定为“Eg5”。
[1221] ●在美国专利公开7,256,033中将EgD8S鉴定为“D8SF”。
[1222] ●在美国专利公开申请11/635258中将EgD8M鉴定为“EgD8S-23”。
[1223] 在上文引用的每个专利申请中都报道了EgD9eS、E389D9eS和EaD9eS的LA到EDA的转化效率。简而言之，然而，当将每个Δ9延伸酶表达成在解脂耶氏酵母菌株Y2224(图44)中的嵌合基因时，在耶氏酵母属FBAINm启动子(PCT公开WO 2005/049805；
美国专利公开7,202,356)和来自耶氏酵母属Pex20基因(GenBank登录号AF054613)的Pex20终止子序列的控制下，独立测量以下底物转化：EgD9eS(20.1％)；EaD9eS(13％)；和E389D9eS(12％)。所有合成的密码子优化的基因具有比对应野生型基因更高的底物转化效率。
[1224] 美国专利公开7,256,033公开了小眼虫的Δ8去饱和酶(“EgD8”)，它能够分别将EDA和EtrA去饱和成DGLA和ETA，以及来源于EgD8的并经密码子优化用于在解脂耶氏酵母中表达的合成Δ8去饱和酶(“EgD8S”)。无论EgD8和EgD8S是否可用，在更优选的实施方案中使用一种本文鉴定为EgD8M(SEQ ID NO：327和328)的合成的工程化突变型Δ8去饱和酶用于在解脂耶氏酵母中表达。如美国专利公开申请11/635258所述，通过制备在EgD8S的多轮靶突变来创造“EgD8M”(该处鉴定为“EgD8S-23”)。筛选每个突变型对所得突变型的Δ8去饱和酶活性的效应以确保功能等同于EgD8S(SEQ ID NO：426)的Δ8去饱和酶活性。作为该工作的结果，突变型EgD8M(SEQ ID NO：328)包括对在SEQ ID NO：426中列出的合成的经密码子优化的EgD8S序列的以下24个氨基酸突变：4S突变成A、5K突变成S、12T突变成V、16T突变成K、17T突变成V、66P突变成Q、67S突变成A、108S突变成L、117G突变成A、118Y突变成F、120L突变成M、121M突变成L、125Q突变成H、126M突变成L、132V突变成L、133 L突变成V、162L突变成V、163V突变成L、293L突变成M、407A突变成S、408V突变成Q、418A突变成G、419G突变成A和422L突变成Q。使用Vector AlignX程序(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)的预设参数成对比对EgD8M和EgD8S蛋白序列，结果揭示在两个蛋白长度为422个氨基酸的序列之间有94.3％的序列同一性和97.9％的共有序列。当EgD8M在解脂耶氏酵母菌株Y4001(图44)中表达时，在耶氏酵母属FBAINm启动子(PCT公开WO 2005/049805；美国专利公开7,202,356)和来自耶氏酵母属Pex20基因(GenBank登录号AF054613)的Pex20终止子序列的控制下，该突变型Δ8去饱和酶从EDA到DGLA的平均底物转化效率经测定为37％。
[1225] 当EaD8S在解脂耶氏酵母菌株Y4001U(图44)中表达时，在耶氏酵母属FBAINm启动子(PCT公开WO /049805；美国专利公开7,202,356)和来自耶氏酵母属Pex20基因(GenBank登录号AF054613)的Pex20终止子序列的控制下，作底物的内源EDA到DGLA的转化效率为41％。
[1226] 生成包括EgD9ES的构建体pZUFmEgD9ES-Na
[1227] 以前描述于专利公布US 2007-0117190 A1的质粒pZuFmEgD9ES(SEQ ID NO：431)包括嵌合FBAINm：：EgD9ES：：Pex20基因、ColE1质粒复制起点、用于在大肠杆菌中选择的R氨苄青霉素抗性基因(Amp)、耶氏酵母属自主复制序列(ARS18；GenBank登录号A17608)和耶氏酵母属Ura 3基因(GenBank登录号AJ306421)。
[1228] 使用寡核苷酸YL989和YL990(分 别是SEQ ID NO：433和434)作引 物，pZuFmEgD9ES作模板，将Nar I位点导入pZuFmEgD9ES以生成pZuFmEgD9ES-Na(SEQ ID NO：
432)。导入的Nar I位点(即，GGCGCC)正好位于翻译终止密码子EgD9ES之前；因此，EgD9ES的编码区延长了两个附加氨基酸(即，一个甘氨酸和一个丙氨酸)。
[1229] 生成包括EgD9ES/EgD8M融合基因的pZuFmG9G8fu构建体
[1230] 使用寡核苷酸YL991和YL992(分 别是SEQ ID NO：435和436)作引 物，pKO2UFm8A(SEQ ID NO：437)作模板，通过PCR扩增EgD8M(SEQ ID NO：327)的N末端部分。寡核苷酸YL991在其5’末端包含NarI位点和编码EgDHAsyn1富含脯氨酸的接头(即，在SEQ ID NO：438中示出的GPARPAGLPPATYYDSLAV对在SEQ ID NO：198中示出的PARPAGLPPATYYDSLAV)的修饰突变型的DNA序列。该接头在5’末端相对于EgDHAsyn1富含脯氨酸的接头(SEQ ID NO：198)具有一个 附加的甘氨酸。
[1231] 使用包括EgD8M 5’部分的Nar I/Bgl II消化PCR产物和包括EgD8M的3’部分的pKO2UFm8A的Bgl II/Not I消化片段置换pZUFmEgD9ES-Na的Nar I/Not I片段以生成pZUFmG9G8fu(图55A)，它因此包含以下组分：
[1232] 表33
[1233] 质粒pZUFmG9G8fu(SEQ ID NO：439)的组分
[1234]
[1235] 生成pZuFmG9G8fu-B构建体，包括EgD9ES/EgD8M融合基因
[1236] 使 用 寡 核 苷 酸 YL1043和YL1044( 分 别 是SEQ ID NO：443和444)作 引物，pZuFmG9G8fu作模板，将BamH I位点(即，GGATCC) 导入 pZUFmG9G8fu以生 成pZUFmG9G8fu-B(SEQ ID NO：442)。BamH I位点正好位于翻译起始密码子ATG之后并在阅读框EgD8M内，这导致两个氨基酸插入(即，甘氨酸和丝氨酸)甲硫氨酸氨基酸残基和EgD8M多肽剩余部分之间。该修饰引起EgD9ES和EgD8M之间的连接区域变成具有如SEQ ID NO：445所示出的序列的多肽(即，GAGPARPAGLPPATYYDSLAVMGS)；全长EgD9ES/EgD8M融合基因的核苷酸和翻译氨基酸序列分别在SEQ ID NO：446和447中示出。
[1237] 生成包括EgD9ES/EaD8S融合基因的pZUFmG9A8构建体
[1238] 当EaD8S基因(SEQ ID NO：429)被克隆到pUC57(GenBank登录号Y14837)中时质粒pEaD8S(SEQ ID NO：448)被创造出来。然后，使用寡核苷酸YL1059和YL1060(分别是SEQ ID NO：449和450)作引物，pEaD8S作模板，将BamH I位点导入pEaD8S以生成pEaD8S-B(SEQ ID NO：451)。导入的BamH I位点(即，GGATCC)正好位于pEaD8S-B中的翻译起始密码子EaD8S之前，并位于与EaD8S相同的阅读框内。
[1239] 使用包括EaD8S的pEaD8S-B的BamH I/Not I片段置换pZUFmG9G8fu-B(SEQ ID NO：442)的BamH I/Not I片段以生成pZUFmG9A8(SEQ ID NO：452；图55B)(从而将EaD8S导入EgD8M的位置)。EgD9ES和EaD8S之间的连接区域是具有如SEQ ID NO：445所示出的序列的多肽(即，GAGPARPAGLPPATYYDSLAVMGS)。因此，质粒pZUFmG9A8包含EgD9ES/EaD8S融合基因，侧面连接有解脂耶氏酵母FBAINm启动子和Pex20终止子(GenBank登录号AF054613)。全长EgD9ES/EaD8S融合基因的核苷酸和翻译氨基酸序列分别在SEQ ID NO：453和454中示出。
[1240] 生成包括EaD9ES/EgD8M融合基因的pZUFmA9G8构建体
[1241] 质粒pZUFmEaD9ES(SEQ ID NO：455)包含EaD9ES基因，侧面连接有解脂耶氏酵母FBAINm启动子和Pex20终止子(GenBank登录号AF054613)。使用寡核苷酸YL1049和YL1050(分别是SEQ ID NO：457和458)作引物，pZUFmEaD9ES作模板，将NarI位点导入质粒以生成pZUFmEaD9ES-Na(SEQ ID NO：456)。导入的Nar I位点(即，GGCGCC)正好位于EaD9ES的翻译终止密码子之前，并位于与EaD9ES相同的阅读框内。
[1242] 使用包括EaD9ES的pZUFmEaD9ES-Na(SEQ ID NO：456)的Nco I/Nar I片段置换pZUFmG9G8fu-B(SEQ ID NO：442)的Nco I/Nar I片段以生成pZUFmA9G8(SEQ ID NO：459)(从而将EaD9ES导入EgD9ES的位置)。EaD9ES和EgD8M之间的连接区域是具有如SEQ ID NO：445所示出的序列的多肽(即，GAGPARPAGLPPATYYDSLAVMGS)。因此，质粒pZUFmA9G8包含EaD9ES/EgD8M融合基因，侧面连接有解脂耶氏酵母FBAINm启动子和Pex20终止子(GenBank登录号AF054613)。全长EaD9ES/EgD8M融合基因的核苷酸和翻译氨基酸序列分别在SEQ ID NO：460和461中示出。
[1243] 生成pZUFmA9A8构建体，包括EaD9ES/EaD8S融合基因
[1244] 使用包括EaD8S的pEaD8S-B(SEQ ID NO：451)的BamH I I/Not I片段置换pZUFmA9G8(SEQ ID NO：459)的BamH I/Not I片段以生成pZUFmA9A8(SEQ ID NO：462)(从而将EaD8S导入EgD8M的位置)。EaD9ES和EaD8S之间的连接区域是具有如SEQ ID NO：445所示出的序列的多肽(即，GAGPARPAGLPPATYYDSLAVMGS)。因此，质粒pZUFmA9A8包含EaD9ES/EaD8S融合基因，侧面连接有解脂耶氏酵母FBAINm启动子和Pex20终止子(GenBank登录号AF054613)。全长EaD9ES/EaD8S融合基因的核苷酸和翻译氨基酸序列分别在SEQ ID NO：463和464中示出。
[1245] 生成pZUFmR9G8构建体，包括E389D9eS/EgD8M融合基因
[1246] 质粒pE389S(SEQ ID NO：465)当E389D9eS基因(SEQ ID NO：358)被克隆到pUC57(GenBank登录号Y14837)中时被创造出来。然后，使用寡核苷酸YL1051和YL1052(分别是SEQ ID NO：467和468)作引物，pE389S作模板，将NarI位点导入pE389S以生成pE389S-Na(SEQ ID NO：466)。导入的NarI位点(即，GGCGCC)正好位于翻译终止密码子之前，并位于与E389D9eS相同的阅读框内。
[1247] 使用包括E389D9eS的pE389S-Na的Nco I/Nar I片段置换包括EgD9ES的pZUFmG9G8fu-B的Nco I/Nar I片段以生成pZUFmR9G8(SEQ ID NO：469)(从而将E389D9eS导入EgD9ES的位置)。E389D9eS和EgD8M之间的连接区域是具有如SEQ ID NO：445所示出的序列的多肽(即，GAGPARPAGLPPATYYDSLAVMGS)。因此，质粒pZUFmR9G8包含E389D9eS/EgD8M融合基因，侧面连接有解脂耶氏酵母FBAINm启动子和Pex20终止子(GenBank登录号AF054613)。全长 E389D9eS/EgD8M融合基因的核苷酸和翻译氨基酸序列分别在SEQ ID NO：470和471中示出。
[1248] 实施例56
[1249] 在解脂耶氏酵母菌株Y2224中功能分析Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶融合基因
[1250] 如通用方法所述，将来自实施例55[即，pZUFmEgD9ES(SEQ ID NO：431)、pZUFMEgD9ES-Na(SEQ ID NO：432)、pZUFMG9G8fu(SEQ ID NO：439)、pZUFmG9G8fu-B(SEQ ID NO：442)、pZUFmG9A8(SEQ ID NO：452)、pZUFmA9G8(SEQ ID NO：459)、pZuFmA9A8(SEQ ID NO：462)和pZUFmR9G8(SEQ ID NO：469)]的质粒分别转化到解脂耶氏酵母菌株Y2224中。在MM平板上进行转化子的筛选。在30℃生长2天后，将来自每个转化反应的八个转化子划线接种于新制MM平板上，并在30℃另外培养2天。一旦开始生长，将这些个菌株分别接种到3mL液体MM中，在30℃下，以250rpm/min振荡2天。离心收集细胞，移除上清液并加入3mL HGM。这些菌株在30℃培养箱中以250rpm摇动，再另外生长5天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应制备脂肪酸甲酯，并随后用Hewlett-Packard 6890 GC分析。
[1251] GC分析显示在所有具有Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶融合基因的菌株中有Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶活性。下表34综述了该结果。Δ9延伸酶活性如下进行计算：EDA和DGLA的重量百分比(wt％)之和除以LA、EDA和DGLA的wt％之和，并乘以100以表达百分比；同样的，Δ8去饱和酶活性如下进行计算：DGLA的wt％除以EDA和DGLA的wt％之和，并乘以100以表达百分比。
[1252] 表34
[1253]
[1254] 在用多个融合基因转化过的耶氏酵母属中的Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶活性[1255] 在表34的综述中，所述数据显示所有六个融合基因都具有Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶活性；因此，来自融合基因的融合蛋白有效地允许表达两个独立的和可分的酶活性。更重要的是，将两个独立酶融合成一个由连接区域分开的融合蛋白提高了由LA至DGLA的流量。在所有情况下，在耶氏酵母属中表达的融合基因具有比至少其中一个基因单独表达时更高的活性。这些数据证实在融合蛋白中Δ9延伸酶的产物可直接作为Δ8去饱和酶的底物。
[1256] 更具体地讲，在EgD9ES/EgD8M融合基因(即，pZuFmG9G8fu-B)和EgD9ES/EaD8S融合基因(即，pZuFmG9A8)的情况下，EgD9ESΔ9延伸酶的活性(21％的转化效率)比得上当EgD9ES单独表达时的活性(20％的转化效率[pZuFmEgD9ES数据和实施例55])。然而相反的是，耶氏酵母属中表达pZuFmG9G8-B的EgD8MΔ8去饱和酶活性比当EgD8M单独表达时效率高约97％(73％对37％的转化效率[实施例55])。同样的，耶氏酵母属中表达pZuFmG9A8的EaD8SΔ8去饱和酶活性比当EaD8S单独表达时效率高约63％(67％对41％的转化效率[实施例55])。
[1257] 在EaD9ES/EgD8M融合基因(即，pZuFmA9G8)和EaD9ES/EaD8S融合基因(即，pZuFmA9A8)的情况下，EaD9ESΔ9延伸酶的活性为约15％，并分别比EaD9ES单独表达时效率高38％(分别是15％和18％的转化效率对13％的转化效率[实施例55])。同样的，耶氏酵母属中表达pZuFmA9G8的EgD8MΔ8去饱和酶活性比当EgD8M单独表达时效率高约46％(54％对37％的转化效率[实施例55])。同样的，耶氏酵母属中表达pZuFmA9A8的EaD8SΔ8去饱和酶活性比当EaD8S单独表达时效率高约32％(58％对41％的转化效率[实施例55])。
[1258] 最后，在E389D9eS/EgD8M融合基因(即，pZuFmR9G8)的情况下，E389D9eSΔ9延伸酶活性比当E389D9eS单独表达时效率高约50％(18％对12％的转化效率[实施例55])。同样的，耶氏酵母属中表达pZuFmR9G8的EgD8MΔ8去饱和酶活性比当EgD8M单独表达时效率高约89％(70％对37％的转化效率[实施例55])。
[1259] 表34也证明当Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶基因融合在一起时，优选 对解脂耶氏酵母中如SEQ ID NO：438示出的接头进行修饰的接头GAGPARPAGLPPATYYDSLAVMGS(SEQ ID NO：445)。
[1260] 对本领域的技术人员来说显而易见的是，可以用与上述方法类似的方法将优选在解脂耶氏酵母中表达的其他PUFA去饱和酶和延伸酶基因(包括，例如，在表8至19中描述的那些基因中的任何一种)融合在一起并在解脂耶氏酵母中表达。适于构建表达盒(其中表达的ORF编码复合酶)的优选启动子和终止子可选自那些在表8至19中描述的启动子和终止子。假说认为在融合基因中将观察到效率或流量比当两个单个基因单独表达时增加。
[1261] 实施例57
[1262] 创造Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶融合基因以在大豆中表达
[1263] 为了研究大豆中在Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶之间的融合复合酶，创造出一系列Δ9延伸酶/Δ8复合酶。Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶结构域被EgDHAsynl富含脯氨酸的接头(SEQ ID NO：198)分开。也创造共表达单个Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶基因的构建体用于比较。使用的Δ9延伸酶包括EgD9elo(实施例16；SEQ ID NO：112；本文也称为EgD9e和EgD9E，但它们是相同的)和EaD9elo1(SEQ ID NO：252；实施例36；本文也称为EaD9E和EaD9e，但它们是相同的)。使用的Δ8去饱和酶包括TpomD8(SEQ ID NO：162；实施例21)和Euglena anabenaΔ8去饱和酶(EaD8Des3；SEQ ID NO：427；也称为EaD8，但它们是相同的；描述于美国临时申请60/910831(提交于2007年4月10日；律师档案号BB-1615)。
[1264] 在本实施例和描述合成EgD9elo-EgDHAsyn1Link-PavD8融合的实施例23中，将附加核苷酸加到EgDHAsyn1富含脯氨酸的接头序列3′末端上，使得当制备用于所有构建体的融合时能够克隆。因此，在EgDHAsyn1富含脯氨酸的接头(SEQ ID NO：198；PARPAGLPPATYYDSLAV)的 末端和使 用的Δ8去饱 和酶(即，SEQ ID NO：472；
PARPAGLPPATYYDSLAVSGRT)的起始氨基酸之间包括4个附加氨基酸。
[1265] 包括Euglena anabenaΔ9延伸酶-Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491Δ8去饱和酶融合(杂交体1-HGLA合酶；也称为EaD9e/TpomD8)的质粒pKR1183(SEQ ID NO：266)在实施例38中描 述。
[1266] 本实施例中描述的其他质粒包括：pKR1014(描述于美国专利公开申请11/876,115(提交于2007年10月22日；律师档案号BB-1574；包括单个表达的EgD9e和TpomD8)、pKR1152(包括单个表达的EgD9e和EaD8)、pKR1151(包括单个表达的EaD9e和TpomD8)、pKR1150(包括单个表达的EaD9e和EaD8)、pKR1184(包括EaD9e/EaD8融合基因)、pKR1199(包括EgD9e/TpomD8融合基因)、和pKR1200(包括EgD9e/EaD8融合基因)。在表
35中显示了对制备的构建体和受试的各个基因以及产生的核苷酸和氨基酸序列的SEQ ID NO的综述。
[1267] 实施例60中下文测试的每个融合基因的活性功能分析。
[1268] 表35
[1269] 优选的去饱和酶和延伸酶用于在大豆中创造Δ9/Δ8融合基因
[1270]
[1271] 构建pKR1014
[1272] 以前描述于PCT公开WO 2004/071467(公布于2004年8月26日)，包含侧面连接有Kunitz大豆胰蛋白酶抑制剂(KTi3)启动子和KTi3’ 终止区域的NotI位点(Jofuku等人，Plant Cell 1：1079-1093(1989))的载体pKR123r，其分离方法描述于美国专利公开6,372,965(KTi3/NotI/KTi3’盒)。TpomD8(SEQ ID NO：162；实施例21)通过NotI消化从pLF114-10(SEQ ID NO：165；实施例21)中释放出来，并将其克隆到pKR123r的NotI位点以制备pKR1007(SEQ ID NO：473)。
[1273] 载体pKR912以前描述于US-2007-0118929-A1并公布于2007年5月24日，它包含侧面连接有35S启动子(Odell等人，Nature 313：810-812(1985))和NOS 3’转录终止子(Depicker等人，J.Mol.Appl.Genet.1：561-570(1982))(35S/HPT/NOS3’盒)的潮霉素B磷酸转移酶基因，用于在植物如大豆中进行选择。载体pKR912也包含EgD9e(SEQ ID NO：112)，侧面连接有用于β-大豆伴球蛋白(Beachy等人，EMBO J.4：3047-3053(1985))的α’亚基的启动子和菜豆蛋白基因(Doyle等人，J.Biol.Chem.261：9228-9238(1986))的3’转录终止区域，因此允许克隆到NotI位点中的基因在大豆种子中强组织特异性表达EgD9e。
[1274] 质 粒 pKR1007(SEQ ID NO：473)用 PstI 消 化，并 将 包 含 Tetruetreptia pomquetensisΔ8去饱和酶的片段克隆到pKR912的Sbfl位点以形成pKR1014(SEQ ID NO：474)。这样，Tetruetreptia pomquetensisΔ8去饱和酶能与小眼虫Δ9延伸酶一起在强种子特异性启动子后共表达。pKR1014描绘示意图在图56中显示。在图56中，将TpomD8称为Tetruetreptia pomquetensis 1491Δ8去饱和酶，将EgD9e称为eug el1。
[1275] 构建pKR1151
[1276] 为了在编码序列5’末端导入NotI和NcoI限制性位点，并在编码序列3’末端导入NotI位点，将EaD8(SEQ ID NO：427)利用寡核苷酸引物EaD8-5(SEQ ID NO：475)和TMEaD8-3(SEQ ID NO：476)，使用Phusion 高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)，按照制造商的规程进行扩增。将所得DNA片段克隆到 克隆载体中，
该方法使用Zero PCR Cloning Kit(Invitrogen Corporation)，按照制造商的规程进行以制备pLF120-3(SEQ ID NO：477)。
[1277] 载体pLF120-3(SEQ ID NO：477)用NotI消化，并将包含EaD8的片段克隆到pKR457(SEQ ID NO：122；实施例16)的NotI位点以制备pKR1138(SEQ ID NO：478)。
[1278] 载体pKR1138(SEQ ID NO：478)用BsiWI消化，并将包含EaD8的片段克隆到pKR912的BsiWI位点以形成pKR1152(SEQ ID NO：479)。pKR1152描绘示意图在图57中显示。在图57中，将EaD8称为EaD8Des3，将EgD9e称为eug el1。
[1279] 构建pKR1152
[1280] 为了在编码序列5’末端导入NotI和NcoI限制性位点，并在编码序列3’末端导入NotI位点，将EaD9e从pLF121-1(SEQ ID NO：250；实施例36)，利用寡核苷酸引物TMoEAd9el1-1(SEQ ID NO：298；实施例44)和oEAd9el1-2(SEQ ID NO：480)，使用Phusion高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)，按照制造商的规程进行扩增。
将所得DNA片段克隆到 克隆载体中，该方法使用Zero PCR Cloning
Kit(Invitrogen Corporation)，按照制造商的规程进行以制备pKR1137(SEQ ID NO：481)。
[1281] EaD9e通过用NotI消化pKR1137(SEQ ID NO：481)释放出来，并将其克隆到pKR72(SEQ ID NO：105；实施例15)的NotI位点以制备pKR1140(SEQ ID NO：482)。
[1282] TpomD8通过NotI消化从pLF114-10(SEQ ID NO：165；实施例21)中释放出来，并将其克隆到质粒pKR457(SEQ ID NO：122；实施例16)的NotI位点以制备pKR1145(SEQ ID NO：483)。
[1283] 载体pKR1145(SEQ ID NO：483)用BsiWI消化，并将包含TpomD8的片段克隆到pKR1140(SEQ ID NO：482)的BsiWI位点以形成pKR1151(SEQ ID NO：484)。pKR1151描绘示意图在图58中显示。在图58中，将TpomD8称为Tetruetreptia pomquetensis 1491 Δ8去饱和酶，将EaD9e称为EAd9elong。
[1284] 构建pKR1150
[1285] 载体pKR1138(SEQ ID NO：478)用BsiWI消化，并将包含EaD8的片段克隆到pKR1140(SEQ ID NO：482)的BsiWI位点以形成pKR1150(SEQ ID NO：485)。pKR1150描绘示意图在图59中显示。在图59中，将EaD8称为EaD8Des3，将EaD9e称为EAd9elong。
[1286] 构建pKR1199
[1287] 将包含EgD9elo-EgDHAsyn1Link的KS373(SEQ ID NO：179；实施例23)的BbsI/NotI DNA片段克隆到来自包含β-大豆伴球蛋白α’亚基 启动子的pKR1177(SEQ ID NO：264；实施例38)的NcoI/NotI DNA片段以制备pKR1190(SEQ ID NO：486)。
[1288] 将来自包含TpomD8的pLF114-10(SEQ ID NO：165；实施例21)的NotI片段克隆到pKR1190(SEQ ID NO：486)的NotI片段中以制备pKR1195(SEQ ID NO：487)。
[1289] 将包含EgD9e/TpomD8融合基因的pKR1195(SEQ ID NO：487)的BamHI DNA片段克隆到pKR325的BamHI DNA片段中以制备pKR1199(SEQ ID NO：488)，pKR325以前描述于PCT公开WO 2006/012325。pKR1199描绘示意图在图60中显示。在图60中，将EgD9e/TpomD8称为EGd9elong-TPOMd8DS。
[1290] 构建pKR1200
[1291] 将来自包含EaD8的pLF120-3(SEQ ID NO：477)的NotI片段克隆到pKR1190(SEQ ID NO：486)的NotI片段中以制备pKR1196(SEQ ID NO：489)。
[1292] 将包含EgD9e/EaD8融合基因的pKR1196(SEQ ID NO：489)的BamHI DNA片段克隆到pKR325的BamHI DNA片段中以制备pKR1200(SEQ ID NO：490)，pKR325以前描述于PCT公开WO 2006/012325。pKR1200描绘示意图在图61中显示。在图61中，EgD9e/EaD8称为EGd9ELONG-EAd8DS。
[1293] 构建pKR1184
[1294] 将来自包含EaD8的pLF120-3(SEQ ID NO：477)的NotI片段克隆到pKR1179(SEQ ID NO：265)的NotI片段中以制备pKR1184(SEQ ID NO：491)。pKR1184描绘示意图在图62中显示。在图62中，EaD9e/EaD8称为EAd9ELONG-EAd8DS。
[1295] 实施例58
[1296] 构 建 大 豆 表 达 载 体pKR1321 用 于 表 达 Tetruetreptia.pomquetensis CCMP1491Δ8去饱和酶-Euglena anabenaΔ9延伸酶-融合基因(TpomD8-EaD9Elo1融合)[1297] 本实施例描述构建在Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491Δ8去饱和酶(TpomD8；SEQ ID NO：162；实施例21)和Euglena anabenaΔ9延伸酶(EaD9e；SEQ ID NO：252，实施例36)之间的框内融合基因。每个结构域用EgDHAsyn1接头分开，在EgDHAsyn1富含脯氨酸的接头 的末端和EaD9e起始氨基酸之间包括4个附加氨基酸，如实施例57所述(即SEQ ID NO：472；PARPAGLPPATYYDSLAVSGRT)。
[1298] 质粒pKR1301(SEQ ID NO：307；实施例44)用EcoRI进行消化，得到的DNA片段包含TpomD8-EgDHAsyn1Link(称为TpomD8+L1TR1)的3’末端，片段再连接以形成pKR1303(SEQ ID NO：497)。
[1299] 将包含EaD9e的pKR1137(SEQ ID NO：481；实施例57)的NotI片段克隆到pKR1303(SEQ ID NO：497)的EagI位点以制备pKR1308(SEQ ID NO：498)。这样就将EaD9e融合到TpomD8的3′末端。
[1300] 通过PstI/BamHI消化从质粒pKR336(描述于PCT公开WO04/071467；其内容以引用方式并入本文)中释放出Gy1/Pavelo/legA2盒并将其克隆到pKR268(描述于PCT公开WO 04/071467)中以制备pKR393(SEQ ID NO：499)。使用NotI从pKR393(SEQ ID NO：499)中释放出Pavelo基因，并再连接载体以形成pKR407(SEQ ID NO：500)。
[1301] TpomD8通过NotI消化从pLF114-10(SEQ ID NO：165；实施例21)中释放出来，并将其克隆到质粒pKR407(SEQ ID NO：500)的NotI位点以制备pKR1018(SEQ ID NO：501)。
[1302] 质粒pKR1018(SEQ ID NO：501)用HindIII/EcoRI消化，并将包含Tpomd8 5′末端的片段克隆到pKR 1308(SEQ ID NO：498)的HindIII/EcoRI位点以制备pKR1312(SEQ ID NO：502)。这样就恢复了TpomD8序列并形成了TpomD8/EaD9e融合。
[1303] 将包含TpomD8/EaD9e融合的pKR1312(SEQ ID NO：502)的NotI片段克隆到pKR72(SEQ ID NO：105；实施例23)的NotI位点以制备pKR1321(SEQ ID NO：503)。pKR1321描绘示意图在图63中显示。在图63中，TpomD8/EaD9e称为TPd8ds-EAd9el融合。
[1304] 实施例59
[1305] 使用Euglena anabenaDHAsynl富含脯氨酸的接头构建大豆表达载体pKR1326用于表达Euglena anabenaΔ9延伸酶-Tetruetreptiapomquetensis CCMP1491Δ8去饱和酶融合基因
[1306] 本实施例描述构建在Euglena anabenaΔ9延伸酶(EaD9e；SEQ ID NO：252，实施例36)和Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491Δ8去饱和酶(TpomD8；SEQ ID NO：162；实施例21)之间的框内融合基因。每个结构域用EaDHAsyn1富含脯氨酸的接头(SEQ ID NO：
235)分开， 但在EaDHAsyn1富含脯氨酸的接头(EaDHAsyn1Link)和EaD9e(即SEQ ID NO：
504；PGGPGKPSEIASLPPPIRPVGNPPAAYYDALATGRT)起始氨基酸之间包括3个附加氨基酸。如实施例57中所述进行克隆。
[1307] 通过PCR扩增制备在EaD9e和EaDHAsyn1Link(EaD9elo-EgDHAsyn1Link)之间的最初框内融合，其侧面连接有在5’末端的NotI和NcoI位点和在3’末端的NotI位点。使用以下方法从pLF121-1(SEQ ID NO：250)中扩增EaD9e(SEQ ID NO：252)：利用寡核苷酸TMoEAd9el1-1(SEQ ID NO：298)和EaLink1(SEQ ID NO：505)，使用Phusion 高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)，按照制造商的规程进行扩增。以相似方法从pLF117-1(SEQ ID NO：87；实施例13)中扩增EaDHAsynlLink(SEQ ID NO：234)，使用寡核苷酸EaLink2(SEQ ID NO：506)和EaLink3(SEQ ID NO：507)。使用oEAd9el1-1(SEQ ID NO：
298)和EaLink3(SEQ ID NO：507)组合两个所得PCR产物以形成EaD9e-EaDHAsynlLink。
EaD9e-EaDHAsynlLink序列在SEQ ID NO：508中显示。将EaD9e-EaDHAsynlLink克隆到克隆载体中，该方法使用Zero PCR Cloning Kit(Invitrogen
Corporation)，按照制造商的规程进行以制备pKR1305(SEQ ID NO：509)。
[1308] 将包含EaD9e-EaDHAsynlLink的pKR1305(SEQ ID NO：509)的EagI DNA片段克隆到pKR1304(SEQ ID NO：310；实施例44)的NotI位点以制备pKR1317(SEQ ID NO：510)。这样就将TpomD8的5′末端融合到EaD9e-EaDHAsyn 1 Link上。
[1309] 将包含TpomD8的3′末端的pKR1 127(SEQ ID NO：168；实施例22)的EcoRI/Asp718片段克隆到包含EaD9e-EaDHAsynlLink的pKR1317(SEQ ID NO：510)的EcoRI/Asp718片段中以制备pKR1320(SEQ ID NO：511)。
[1310] 将来自包含融合的pKR1320(SEQ ID NO：511)的NotI片段克隆到pKR72(SEQ ID NO：105；实施例15)的NotI片段中以制备pKR1326(SEQ ID NO：512)。pKR1326描绘示意图在图64中显示。在图64中，具有EaDHAsynl富含脯氨酸的接头的EaD9e/TpomD8称为EAd9el-TPOMd8ds L2融合。
[1311] 实施例60
[1312] 大豆中Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶基因融合的功能性分析
[1313] 本实施例描述在大豆体细胞胚中转化和表达pKR1014(SEQ ID NO：474)、pKR1152(SEQ ID NO：479)、pKR1151(SEQ ID NO：484)、pKR1150(SEQ ID NO：485)、pKR1199(SEQ ID NO：488)、pKR1200(SEQ ID NO：490)和pKR1184(SEQ ID NO：491)，其合酶以前描述于实施例57中。pKR1183(SEQ ID NO：266)和KS373(SEQ ID NO：179)的功能分析以前分别描述于实施例46和31中。
[1314] 大豆胚芽发生悬浮培养物(cv.Jack)用上述载体转化，在大豆组织分化和成熟液体培养基中获取成熟胚芽(SHaM液体培养基；Schmidt等人，Cell Biology and Morphogenesis，24：393(2005))，如实施例25所述并且以前描述于PCT公开WO2007/136877，公布于2007年11月29日(其内容以引用方式并入本文)。
[1315] 在成熟后，如本文所述在SHaM液体培养基中收获并分析转化的大豆胚芽(即，每个事件5至6个胚芽)的子集。
[1316] 这样就分析了大约30个用pKR1014(SEQ ID NO：474)、pKR1152(SEQ ID NO：479)、pKR1151(SEQ ID NO：484)、pKR1150(SEQ ID NO：485)、pKR1199(SEQ ID NO：488)、pKR1200(SEQ ID NO：490)、或pKR1184(SEQ ID NO：491)转化过的事件。在图65、66、67、68、
69、70、或71中分别显示五个具有最高的平均DGLA含量的事件(5个经分析的大豆体细胞胚的平均值)。在图65至71中，脂肪酸经鉴定是16：0(棕榈酸)、18：0(硬脂酸)、18：1(油酸)、LA、ALA、EDA、ERA、DGLA和ETA。脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。
表36综述了载体、所用基因、实验数目(MSE#)和对应的图。
[1317] 在图65至71中，将延伸活性表达为C18脂肪酸(C18％Δ-9延伸率)的％Δ9延伸率，按照以下公式计算：([产物]/[底物+产物])*100。更具体地讲，将LA和ALA的组合延伸百分比如下进行测定：([DGLA+ETA+EDA+ERA]/[LA+ALA+DGLA+ETA+EDA+ERA])*100。
[1318] 在图在图65至71中，EDA和ERA的组合去饱和百分比显示为“C20％Δ8去饱和”，如下进行测定：([DGLA+ETA]/[DGLA+ETA+EDA+ERA])*100。这也称为总％去饱和。
[1319] 表36
[1320] 大豆中Δ9/Δ8基因融合的功能性分析
[1321]
[1322] *在图37中，将MSE2145列为MSE2144
[1323] 图72显示个别表达的Δ9延伸酶与Δ8去饱和酶对当量Δ9延伸酶-Δ8去饱和酶融合蛋白的比较。在图72中，每个数据点代表所有分析事件的5至6个胚芽(％总脂肪酸)的平均％DGLA或％EDA，并且平均％DGLA对平均％EDA绘图。在图72(A)中，EgTpom代表与TpomD8(pKR1014)共表达的EgD9e，EgTpomfus代表EgD9e/TpomD8融合(pKR1199)。在图72B中，EgEa代表与EaD8(pKR1152)共表达的EgD9e，EgEafus代表EgD9e/EaD8融合(pKR1200)。在图72C中，EaTpom代表与TpomD8(pKR1151)共表达的EaD9e，EaTpomfus代表EaD9e/TpomD8融合(pKR1183)。在图72D中，EaEa代表与EaD8(pKR1150)共表达的EaD9e，EaEafus代表EaD9e/EaD8融合(pKR1200)。
[1324] 实施例61
[1325] Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶/Δ5去饱和酶基因融合的功能性分析
[1326] 本实施例描述了在大豆体细胞胚中转化和表达包括EaD9Elo1-TpomD8-EaD5Des1三联融合的pKR1322(SEQ ID NO：314；实施例50)(也称为EaD9e/TpomD8/EaD5)。每个结构域都用EgDHAsyn1接头分开，接头具有4个附加氨基酸(即SEQ ID NO：472；PARPAGLPPATYYDSLAVSGRT)。
[1327] 大豆胚芽发生悬浮培养物(cv.Jack)用pKR1322转化，在大豆组织分化和成熟液体培养基中获取成熟胚芽(SHaM液体培养基；Schmidt等人，Cell Biology and Morphogenesis，24：393(2005))，如实施例25所述并且以前描述于PCT公开WO
2007/136877，公布于2007年11月29日(其内容以引用方式并入本文)。
[1328] 在成熟后，如本文所述在SHaM液体培养基中收获并分析转化的大豆胚芽(即，每个事件5个胚芽)的子集。
[1329] 这样就分析了大约30个用pKR1322(实验MSE2274)转化过的事件，并且在图73中表示了五个具有最高平均ARA和EPA含量的事件(分析了平均5个胚芽)。在图73中，脂肪酸经鉴定是16∶0(棕榈酸)、18∶0(硬脂酸)、18∶1(油酸)、18∶2(5，9)、LA、ALA、EDA、ERA、SCI、DGLA、JUN(也称为JUP)、ETA、ARA和EPA。脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。
[1330] 在图73中，将延伸活性表达为C18脂肪酸(％Elo)的％Δ9延伸率，按照以下公式计算：([产物]/[底物+产物])*100。更具体地讲，将LA和ALA的组合延伸百分比如下进行测定：([DGLA+ETA+EDA+ERA+EPA+ARA]/[LA+ALA+DGLA+ETA+EDA+ERA+EPA+ARA])*100。
[1331] 在图73中，EDA和ERA的组合Δ8去饱和百分比显示为“％D8”，如下进行测定：([DGLA+ETA+EPA+ARA]/[DGLA+ETA+EDA+ERA+EPA+ARA])*100。这也称为总％Δ8去饱和。
[1332] 在图73中，DGLA和ETA的组合Δ5去饱和百分比显示为“％D5”，如下进行测定：([EPA+ARA]/[DGLA+ETA+EPA+ARA])*100。这也称为总％Δ5去饱和。
[1333] 在图73的综述中，所有三个结构域是功能性的。可将该融合称为EPA合酶或ARA合酶。
[1334] 实施例62
[1335] Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶和Δ8去饱和酶/Δ9延伸酶融合基因的功能分析
[1336] 本实施例描述在大豆体细胞胚中转化和表达包括EaD9Elo1-TpomD8融合(也称为EaD9e/TpomD8)的pKR1326(SEQ ID NO：512)，该融合被具有3个附加氨基酸的EaDHAsyn1接头分开(即SEQ ID NO：504；PGGPGKPSEIASLPPPIRPVGNPPAAYYDALATGRT)，或包括TpomD8/EaD9e融合的pKR1321(SEQ ID NO：503；实施例58)，该融合被EgDHAsyn1接头分开。
[1337] 大豆胚芽发生悬浮培养物(cv.Jack)用pKR1326或pKR1321转化，在大豆组织分化和成熟液体培养基中获取成熟胚芽(SHaM液体培养基；Schmidt等人，Cell Biology and Morphogenesis，24：393(2005))，如实施例25所述并且以前描述于PCT公开WO2007/136877，公布于2007年11月29日(其内容以引用方式并入本文)。
[1338] 在成熟后，如本文所述在SHaM液体培养基中收获并分析转化的大豆胚芽(即，每个事件5个胚芽)的子集。
[1339] 这样就分析了大约30个用pKR1326(实验MSE2275)转化过的事件，并且在图74中表示了五个具有最高平均DGLA和ETA含量的事件(分析了平均5个胚芽)。在图74中，脂肪酸经鉴定是16∶0(棕榈酸)、18∶0(硬脂酸)、18∶1(油酸)、LA、ALA、EDA、ERA、DGLA和DGLA、以及ETA。脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。
[1340] 在图74中，将延伸活性表达为C18脂肪酸(C18％Δ-9延伸率)的％Δ9延伸率，按照以下公式计算：([产物]/[底物+产物])*100。更具体地讲，将LA和ALA的组合延伸百分比如下进行测定：([DGLA+ETA+EDA+ERA]/[LA+ALA+DGLA+ETA+EDA+ERA])*100。
[1341] 在图74中，EDA和ERA的组合去饱和百分比显示为“C20％Δ8去饱和”，如下进行测定：([DGLA+ETA]/[DGLA+ETA+EDA+ERA])*100。这也称为总％去饱和。
[1342] 在图74的综述中，EaDHAsyn1接头功能类似于EgDHAsyn1接头。任何用pKR1321转化过的事件，其中TpomD8用EgDHAsyn1连接到EaD9e上，均未发现有活性。
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