[0001] 本申请为2005年10月7日提交的、发明名称为“在种子中具有“不饱和”或降低饱和水平的脂肪酸的某些植物以及来自种子的油”的PCT申请PCT/US2005/036052的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2007年5月25日，申请号为200580040443.2。

[0002] 与相关申请的交叉参考

[0003] 本发明要求提交于2004年10月8日的美国临时申请系列号60/617,532的优先权。
技术背景

[0004] 植物油已经逐渐取代动物油和脂肪作为饮食脂肪摄入的主要来源。然而，在多数工业国家中饱和脂肪摄入保持在总热量消耗的约15％至20％。在推动更健康的生活方式
的努力中，美国农业部(USDA)最近已经推荐饱和脂肪占每日热量摄入的小于10％。为使消
费者易于了解，当前由USDA发布的标签指导现在要求总饱和脂肪酸水平低于1.0g/14g方
可获得“低饱和”标签，低于0.5g/14g方可获得“无饱和”标签。这意味着植物油的饱和脂肪酸含量需要低于7％和3.5％方可分别获得“低饱和”和“无饱和”标签。由于这些指导
的发布，因此对“低饱和”油的消费需求明显增加。迄今为止，满足要求的主要为油菜油以及程度低得多的向日葵油和红花油。

[0005] 无论是植物或动物来源，油的特征主要由碳和氢原子的数目以及脂肪酸链包含的双键的数目和位置决定。来自植物的多数油由不同数量的软脂酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、
油酸(18:1)、亚油酸(18:2)和亚麻酸(18:3)脂肪酸组成。习惯上将软脂酸和硬脂酸称为
“饱和”，因为其碳链被氢原子饱和，因此不具有双键；它们含有最大可能数目的氢原子。然而，油酸、亚油酸和亚麻酸是其中分别具有1、2和3个双键的18碳脂肪酸链。一般认为油
酸是单不饱和脂肪酸，而认为亚油酸和亚麻酸是多不饱和脂肪酸。美国农业部将“无饱和”产品定义为具有少于3.5％(以重量计)的组合饱和脂肪酸(与脂肪酸总量相比)的产品。

[0006] 不饱和脂肪(单不饱和及多不饱和)是有益的(特别是适量消费时)，而饱和脂肪及反式脂肪则不然。饱和脂肪和反式脂肪提高血中LDL胆固醇水平。膳食胆固醇也提高
LDL胆固醇，并且甚至不提高LDL而促进心脏病。因此，建议选择低饱和脂肪、反式脂肪和胆固醇的食品作为健康饮食的一部分。

[0007] 最近的研究已经确定了以高水平单不饱和脂肪酸(特别是油酸)作为主要饮食脂肪组分的健康价值。这些饮食认为可降低由高饱和脂肪酸饮食导致的动脉硬化的发病率。
因此存在对具有高单不饱和脂肪酸含量的食用植物油的需求。种子诱变已经用于产生具有
不高于4％饱和脂肪酸含量的菜籽油(PCT国际专利申请公布号WO 91/15578)。

[0008] 1985年，超过13％的世界食用油供应产生自油料种子作物物种芸苔，通常称为油菜籽或芥菜。芸苔是第三重要的食用油来源，仅次于大豆和棕榈。由于芸苔能在相对低的
温度下萌发和生长，因此它也是可在较冷的农业区种植以及在更温暖的地区作为冬季作物
的少数具有经济重要性的食用油料种子作物之一。此外，正更多地考虑将植物油(特别是
菜籽油)用于工业应用，因为它们具有提供与合成油或矿物/基于环烷的油相当的性能的
潜力，还具有可生物降解这一非常需要的优势。

[0009] 在所有的植物油中，芸苔油具有最低水平的饱和脂肪酸。“芸苔”指油菜籽(芥)，其具有至多为种子脂肪酸总量2％(以重量计)(优选至多0.5％(以重量计)，最优选基本为0％(以重量计))的芥酸(C22:1)，并在压榨后产生每克含有小于30微摩尔脱脂(无
油)粉的风干粉。这些类型的油菜籽通过其与该物种中更常规变种相比较的可食性来区
分。

[0010] 可以以化学方法进行植物油的修饰。已经使用该方法获得含有少于约3％饱和脂肪酸的沙拉/烹调油(美国专利号4,948,811)；油可以通过化学反应形成，或者通过物理
分离饱和脂类而形成。一般参考使用“遗传工程”获得具有所需特征的油(参阅第3栏第
58行及以下等等)。然而，没有详细公开如何这样修饰任一特定油料种子植物以提供具有
所需特征的植物油。

[0011] 作为替代的，一般通过常规育种技术修饰植物油的脂肪酸组成。这些技术使用现存的种质作为影响脂肪酸组成的天然发生的突变的来源。使用适当的筛选与其后的育种结
合来发现和选择这些突变。例如，已经使用这样的方法来降低菜籽油中长链饱和脂肪酸芥
酸的含量(Stefansson，B.R.(1983)《High and Low Erucic Acid Rapeseed Oils》，Kramer J.K.G.等编辑；Academic Press，New York；144-161页)和提高玉米油中单不饱和脂肪酸
油酸的量(美国专利申请系列号07/554,526)。

[0012] 近来，已经尝试通过使用诱变剂增加用以选择所需特征的可用突变。然而，诱变剂一般通过失活或修饰已存在的基因而导致特定功能的丧失或降低来发挥作用。因此通过诱变引入新特征经常依赖于某个现存性状的丧失。此外，通过诱变剂实现所需目的通常是不
确定的。使用该方法仅在植物油中获得了少数类型的修饰脂肪酸组成。这种影响脂肪酸
组成的“创造性”突变的一个实例是降低菜籽油中多不饱和脂肪酸(特别是亚油酸和亚麻
酸)，而同时提高单不饱和脂肪酸油酸(Auld，M.，等，(1992)Crop Sci.出版中)。另一实例是降低菜籽油中的饱和脂肪酸(PCT国际专利申请公布号WO 91/15578)。然而，种子油合成
的生物化学是复杂并且尚未完全了解的，可能存在若干机制造成在菜籽油中观察到的脂肪
酸组成改变(PCT国际专利申请公布号WO 91/15578)。使用诱变影响这些改变基本上是随
机、非特异的。

[0013] 理论上，通过使用遗传工程修饰脂肪酸组成的可能性会允许精确受控地引入特定的所需基因以及失活不需要的特定基因或基因产物。因此，可以向植物中引入完全不依赖
于现存基因的新性状，或者可以失活或修饰预选择的基因。然而，有效使用遗传工程修饰脂肪酸组成的一个先决条件是在植物细胞中调节脂肪酸合成和加工的机理的合理的准确模
型。

[0014] 美国专利号6,495,738(还可参阅WO 99/50430)显示可以通过在植物细胞内表达真菌软脂酰CoAΔ-9去饱和酶来改变玉米油和烟草种子的饱和脂肪酸水平。这些蛋白质最
可能使软脂酰CoA分子酶酶促去饱和，优选通过移去分子CoA部分的第9和第10个碳原子
之间的两个氢原子并添加双键，从而产生棕榈油酰CoA(16:1Δ-9)。棕榈油酰CoA最终掺入
种子油中，从而降低所述油的总饱和水平。玉米油的总饱和脂肪酸水平(平均约为13.9％)
不符合上文所述当前的标签指导。此外，与大豆、芸苔、向日葵等相比，一般不认为玉米是油料作物。事实上，认为产生并提取自玉米的油是淀粉提取中使用的湿磨方法的副产品。因
此，几乎没有兴趣修饰玉米油的饱和水平。

[0015] 公认在油料种子中脂肪酸合成主要发生在质体中，并且新合成的脂肪酸从质体外运至胞质。它们在胞质中用于在内质网中发生甘油三酯的装配。

[0016] 脂肪酸合成的主要产物是软脂酸(16:0)，它似乎可有效延伸成硬脂酸(18:0)。仍然在质体中时，饱和脂肪酸可以接着通过称为Δ-9去饱和酶的酶去饱和，以引入一个或多
个碳-碳双键。特别是硬脂酸可被质体Δ-9去饱和酶迅速去饱和而获得油酸(18:1)。事
实上，软脂酸也可被质体Δ-9去饱和酶去饱和成棕榈油酸(16:1)，但该脂肪酸在多数植物
油中仅以痕量存在(0-0.2％)。

[0017] 因此，质体中脂肪酸合成的主要产物为软脂酸、硬脂酸和油酸。在多数油中，由于饱和脂肪酸以小得多的比例存在，因此油酸是合成的主要脂肪酸。

[0018] 其后在胞质中质体外植物脂肪酸的去饱和似乎仅限于油酸，它可去饱和成亚油酸(18:2)和亚麻酸(18:3)。此外，取决于植物，油酸可以通过延长(至20:1、22:1和/或
24:1)或通过加入官能团而进一步进行修饰。接着这些脂肪酸与饱和脂肪酸软脂酸和硬脂
酸一起可以装配成甘油三酯。

[0019] 植物Δ-9去饱和酶是可溶的。它位于质体间质中，使用酯化成ACP(主要是硬脂酰ACP)的新合成脂肪酸作为底物。这与酵母Δ-9去饱和酶相反，后者位于内质网膜(ER，
或微粒体)中，使用酯化成CoA的脂肪酸作为底物，并且使饱和脂肪酸软脂酸和硬脂酸去饱
和。美国专利号5,723,595和6,706,950涉及植物去饱和酶。

[0020] 酵母Δ-9去饱和酶已经从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中分离、克隆并测序(Stukey，J.E.等，J.Biol.Chem.264：16537-16544(1989)；Stukey，J.E.等，J.Biol.Chem.265：20144-20149(1990))。该基因还已用于在显然过表达的条件下转化同一酵母菌
株，引起转化酵母细胞中贮藏脂类累积的提高，所述提高通过使用尼罗红染色甘油三酯的
荧光显微术测定(美国专利号5,057,419)。没有对脂肪酸组成进行表征。该参考文献包含
对使用来自分离的酵母Δ-9去饱和酶基因的信息首先从酵母或从其他生物分离其他去饱
和酶基因，接着在条件下将这些基因再引入酵母或植物的一般讨论。推测这可以导致高表
达，从而修饰产生的油及其脂肪酸组成。

[0021] 其后，报道了将酵母Δ-9去饱和酶基因引入烟草叶组织(Polashcok，J.等，FASEB J.5：A1157(1991))并在该组织中明显表达。此外，该基因在番茄中表达。参阅
Wang 等，J.Agric Food Chem.44：3399-3402(1996) 和 C.Wang 等，Phytochemistry 58：
227-232(2001)。尽管在烟草和番茄中报道了某些不饱和物的提高和一些饱和物的降低，但是烟草和马铃薯显然不是油料植物。还将该酵母基因引入了欧洲油菜(Brassica napus)
中(参阅美国专利号5,777,201)。尽管报道了软脂酸和硬脂酸(饱和物)的减少以及棕榈
油酸和油酸(不饱和物)的增加(参阅该专利实施例7的表1a和1b)，但在下文详述章节
中将更详细地讨论该参考文献。WO 00/11012和美国专利号6,825,335涉及用于在植物中
表达的合成酵母去饱和酶基因，其中该基因包含去饱和酶结构域和cyt b5结构域。这些参
考文献的背景章节详细讨论了脂肪酸合成。

[0022] 植物油的性能特征(无论是饮食特征或工业特征)基本由其脂肪酸谱决定，即由油中存在的脂肪酸种类以及每个种类的相对和绝对量决定。尽管已知脂肪酸谱和性能特征
之间的若干关系，但有许多仍然未知。尽管如此，植物油中存在的不饱和的类型和数量与其饮食和工业应用都相关。

[0023] 标准芸苔油含有约8-12％的亚麻酸，这使其就氧化而言(因此也就风味和稳定性而言)处于与大豆油相似的类别。可以以许多方式提高芸苔油的氧化稳定性，例如通过氢
化来减少不饱和量、添加抗氧化剂和用具有较好氧化稳定性的油进行调和。例如，用低亚麻酸油(如向日葵)调和芸苔油可降低18:3水平，从而提高油的稳定性。然而，这些处理必
然提高油的费用，并且可能具有其他问题，例如氢化可能同时提高饱和脂肪酸的水平和反
式不饱和的量，这两者都是饮食应用中所不希望的。

[0024] 高油酸油是可以提供的，但是除了这些溢价油可能增加的费用以外，来自为极高油酸水平育种的作物的植物油可证明不适用于工业用途，因为它们保留了很高水平的多不
饱和脂肪酸，主要是亚油酸和/或亚麻酸。这些油对于饮食应用仍然非常有用，包括作为烹调油，但在可见于工业应用的更严格条件下氧化稳定性不足。添加抗氧化剂甚至也不能使
这些油达到工业应用所需的氧化稳定性水平，这可能是因为这些油中对氧化极端敏感的亚
麻酸水平。

[0025] 氧化稳定性对于工业应用是很重要的，可在热和压力条件下以及在化学副产物存在下延长润滑剂的寿命。在这些应用中，亚麻酸(以及亚油酸，其程度较低)仍然是弱氧化
稳定性的最主要原因。

[0026] 因此需要获得欧洲油菜变种，其具有农业成活力并产生具有足以使其可用于饮食应用的氧化稳定性水平，并且还本身足够稳定或者(取决于确切的应用)对抗氧化剂具有
足够的感应性，从而可用于工业应用。

[0027] 欧洲专利申请EP 323753、美国专利号5,840,946和美国专利号5,638,637涉及具有80-90％油酸含量(以脂肪酸总量的重量计)和不高于2％的芥酸的菜籽油。使用诱
变提高油酸含量。’946申请的权利要求书进一步规定该油具有不超过2％的芥酸含量和小
于3.5％的α-亚麻酸含量以及不高于7％的硬脂酸和软脂酸形式的饱和脂肪酸含量。这
些专利涉及在诱变之后进行选择。

[0028] 美国专利号5,387,758、5,434,283和5,545,821涉及具有2-4％(以重量计)的硬脂酸和软脂酸组合以及不高于约2％(以重量计)的芥酸含量的菜籽油。使用诱变降低
硬脂酸和软脂酸含量。

[0029] 国际申请WO 92/03919和美国专利号5,668,299、5,861,187和6,084,157涉及具有改变的脂肪酸谱的油菜籽、植物和油。提到了若干这样的谱，其全部预期最高约2％的芥酸含量与约7％至约12％的软脂酸含量、约14％至约20％的亚油酸含量、约0.8％至约
1.1％的硬脂酸含量、约7％至约9％的α-亚麻酸含量以及某些范围的FDA饱和物的组合。
这些专利将饱和脂肪酸和“FDA饱和物”定义为月桂酸(C12:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、软脂酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)的总和。

[0030] 国际申请WO 93/06714和美国专利号6,270,828、6,562,397、6,680,396和6,689,409涉及具有降低的硫苷(glucosinolate)(从而具有降低的硫)以及约2％至约
7％的α-亚麻酸含量的芸苔油和种子。

[0031] 美国专利号6,169,190涉及来自芸苔种子的油，其具有约71-77％的油脂肪酸含量和少于约3％的亚麻酸含量。还要求了34-55之间的油酸:亚麻酸比。

[0032] 美国专利号6,063,947和5,850,026要求保护得自芸苔种子的油、相关芸苔植物以及产生油的方法，其中油具有高于约80％(约86-89％)的油酸含量、约2％至约6％的
亚油酸含量、少于约2.5％(约1-2％)的α-亚麻酸含量和少于约2％(水解后)的芥酸
含量。这些专利涉及种子特异性抑制微粒体油酸去饱和酶(将油酸转化成亚油酸的Δ-12
去饱和酶)和微粒体亚油酸去饱和酶(将亚油酸转化成α-亚麻酸的Δ-15去饱和酶)的
基因表达。

[0033] 美国专利号5,952,544要求保护催化碳15和16间反应的植物质体或微粒体Δ-15脂肪酸去饱和酶的片段。

[0034] 美国专利号4,627,192和4,743,402涉及向日葵种子和向日葵油，其具有约80-94％(相对于其总脂肪酸含量)的油酸含量，并且亚油酸与油酸的比值小于约0.09。这
些向日葵植物通过常规育种技术得到。

[0035] WO 2003002751涉及激酶基因等用于改变植物油表型的用途。

[0036] 不能预计Δ-9去饱和酶基因显著(并且需要地)影响已经有益的油料种子作物的脂肪酸谱的能力，特别是降低饱和脂肪水平而不对植物和油的其他方面产生不利影响的
能力。

[0037] 发明概述

[0038] 本发明提供“无饱和”芸苔油。本发明还部分涉及减少某些植物种子中饱和脂肪酸的方法。令人惊奇地，通过在芸苔(Brassica)中使用Δ-9去饱和酶基因实现了这些结
果。该技术可应用于本文公开的其他植物。本发明包括能产生这些油和种子的植物，优选
芸苔。本发明还提供来自所述植物的种子和油，其中特别地，油具有此前未曾得到过的优势特征和脂肪酸谱。本发明还提供植物优化的Δ-9去饱和酶基因。在一些优选的实施方案
中，优选的植物包含本发明Δ-9去饱和酶基因的至少两个拷贝。令人惊奇地，这些植物产
生的种子不显示基因沉默的效应，而是还具有总饱和物水平的令人惊奇的降低。

[0039] 附图简述

[0040] 图1显示在拟南芥中实现了饱和脂肪酸大于60％的降低。该图概述了单个拟南芥事件的T2和T3种子数据。

[0041] 图2显示来自18个额外转化体的T2拟南芥种子中“饱和物”高达60-70％的降低。该图中展示的数据为表8中显示的数值数据和较早的数值数据的组合。

[0042] 图3显示在Westar芸苔中饱和脂肪超过43％的降低(包括24:0时为50％的降低)。

[0043] 图4A显示来自多种芸苔植物(包括事件36-11.19)的种子中总饱和物与对照相比的柱形图。图4B和4C显示柱形图中展示的数值数据。

[0044] 图5A显示来自多种芸苔植物(包括事件218-11.30)的种子中总饱和物与对照相比的柱形图。图5B和5C显示柱形图中展示的数值数据。

[0045] 图6A-F显示来自T3大田试验的半种子数据。图6A和6B明确显示了与空白(转基因分离出植物的事件)和野生型对照(未转化株系)相比，转基因事件中C16:0的降低
和C16:1的提高。图6C和6D明确显示了与空白和野生型对照相比，转基因事件中C18:0
的降低和C18:1的提高。图6E和6F分别明确显示了与空白和野生型对照相比，转基因事
件中C20:0和C22:0的降低。

[0046] 图6G和6H明确显示了与空白和野生型对照相比，转基因事件中C16:0的改变和降低以及C16:1的改变和提高。图6I和6J明确显示了与空白和野生型对照相比，转基因
事件中C18:0的改变和降低以及C18:1的改变和提高。图6K和6L显示C18:2和C18:3相
似的柱形图。图6M进一步展示了与现有的优秀株系Nex 710相比总饱和物的降低。图6N
显示了1000个种子的分布。

[0047] 图7A和7B展示使用实施例16的方案得到的数据。

[0048] 图8和9是用来自实施例19讨论的F3植物的DNA进行的两个凝胶电泳的图片。

[0049] 序列简述

[0050] SEQ ID NO：1显示本文使用的植物优化的Δ-9去饱和酶基因可读框的核酸序列。

[0051] SEQ ID NO：2显示前面为Kozak序列和BamHI克隆位点(残基1-10)的SEQ IDNO：1的ORF序列以及ORF末端的翻译终止子(残基1379-1381)。

[0052] SEQ ID NO：3显示用于扩增Δ-9基因的Δ-9正向B引物的核酸序列。

[0053] SEQ ID NO：4显示用于扩增Δ-9基因的Δ-9反向B引物的核酸序列。

[0054] SEQ ID NO：5显示SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列。

[0055] 发明详述

[0056] 本发明提供“无饱和”芸苔油。本发明还部分涉及减少某些植物种子中饱和脂肪酸的方法。令人惊奇地，通过在植物(优选油料植物，更优选芸苔(Brassica))中使用Δ-9
去饱和酶基因产生“无饱和”水平的脂肪酸实现了这些结果。本发明包括这些植物，还提供来自所述植物的种子和油，其中油具有此前未曾获得的特别有利的特征和脂肪酸谱。

[0057] 本文示例了构巢曲霉(Aspergillus nidulans)微粒体Δ-9-CoA去饱和酶基因。这种Δ-9去饱和酶是膜结合酶，催化16:0-CoA和18:0-CoA至16:1-CoA和18:1-CoA的反
应(在Δ-9位置加入双键)。本发明的意义还在于其他饱和物(如C20:0、C22:0和C24:0)
的水平也令人惊奇并有利地降低了，而C16:1和C18:1不饱和物则提高(C18:2和C18:3不
提高或几乎不提高，在一些情况下这些相对不稳定的多不饱和物甚至降低)。迄今为止尚
不清楚这在已经具有需要的(但不是最优的)脂肪酸谱的芸苔和其他“优良”油料种子作
物中是否是良好的酶(包括该基因是否可以足够表达)。(例如，它在玉米中仅得到饱和物
10％的降低。)

[0058] 如背景章节中提到的，由于复杂的脂肪酸谱和不同生物和植物的代谢途径及其不同的物理细胞机器，尽管该基因和酶可能在芸苔中有效力，也不能期待该效力是有益的。如背景章节中所讨论的，一种或多种类型所需脂肪酸的提高经常导致其他所需脂肪酸的降
低、不需要脂肪酸的提高和农学损失(即对修饰植物的其他完全不利的效应)。令人惊奇
地，还可以实践本发明而不对其他有价值的农学特征，如种荚大小、种子产量、种子大小、油产量等产生相应的不利效应。在单个转基因插入片段纯合的植物中没有不利效应。一些双
纯合叠加(通过两个转基因事件的杂交产生)显示种荚数和结实率的降低，原因未知。然
而表27含有具有与非转基因对照相似的种子产量以及“无饱和”组成的叠加(即显然提高
了拷贝数的事件)。

[0059] 去饱和酶之间(甚至是酵母、真菌、植物和动物Δ-9去饱和酶之间)的差异产生了不可预见性的另一原因。去饱和酶的差异可以部分归结为不同去饱和酶的来源生物细胞
结构的差异。上文背景章节中讨论了来自美国专利号5,777,201的酵母去饱和酶。它比
本文示例的曲霉去饱和酶更长(510个氨基酸对455个氨基酸)。此外，它仅在约400个氨
基酸上具有约52％的同一性(通过BLAST和BestFit(Smith-Waterman程序)确定，都用
EMBOSS完成)。该专利实施例7的表1a和1b显示使用酵母去饱和酶实现的饱和物降低远
弱于根据本发明在芸苔中使用示例的曲霉去饱和酶实现的降低。有多种因素可能解释酵母
去饱和酶相对弱的性能。例如，该蛋白可能在植物中内在地不稳定(而本发明去饱和酶很
显然在芸苔中非常稳定)。在其他酶特性上也可能存在差异，如催化效率、底物亲和力、辅因子亲和力等。

[0060] 与美国专利号5,723,595和6,706,950的红花去饱和酶相比，红花去饱和酶(396个氨基酸)比本发明示例的曲霉去饱和酶(455个氨基酸)更短。红花去饱和酶还可见于
质体，而本发明曲霉去饱和酶见于ER/微粒体/胞质隔室。此外，红花去饱和酶使用见于质
体的酰基ACP底物，而曲霉去饱和酶使用见于胞质隔室的酰基CoA底物。因此，就本发明而
言，不了解酰基CoA底物库中的大部分是否可用于曲霉去饱和酶。

[0061] 因此，非常有意义的是，发现本发明的Δ-9去饱和酶能够获得具有优秀特性(特别是就提高油的食用品质而言)的芸苔植物、种子和来自于它们的油。非常令人惊奇地，在拟南芥中获得了饱和脂肪酸的高于60％的降低，在芸苔中获得了饱和脂肪酸的高于43％
的降低。必须注意到，这是在已经产生任何适当植物的最佳脂肪酸谱之一的植物中获得的。
如下文所示并详细讨论的，本发明还用于获得令人惊奇并有利的脂肪酸谱和比例。尽管认
为硬脂酸是饱和脂肪酸，但是已经发现其具有降低胆固醇的作用。因此，相对较高的硬脂酸水平可能是有益的。类似的，相对较高水平的花生四烯酸可能是需要的。如本文数据所示，来自本发明种子的油具有有利的这两种脂肪酸谱以及所需水平的如11-十八碳烯酸。本文
还显示，在本发明的商品品质植物中，有利水平的这些脂肪酸和/或总饱和物与需要的植
物高度、产量和其他有益特征组合存在(与如矮化植物相反)。本文展示了这些本发明植物
的示例数据。

[0062] 还应该注意，本发明不仅限于示例的去饱和酶。GENBANK中提供了多种去饱和酶和Δ-9去饱和酶，可以使用标准方法进行序列比对以观察并比较酶序列的差异。可以根据本发明使用与本文的示例相似的酶。

[0063] 例如，本发明的曲霉去饱和酶具有两个结构域。第一个结构域(大致在分子的氨基端三分之二)为去饱和酶结构域，第二个结构域(大致在分子的C端三分之一)为细胞色
素b5结构域。例如，SEQ ID NO：5的残基62-279可以与如脂肪酸去饱和酶gnl|CDD|25523
pfam00487的残基4-233比对。SEQID NO：5的残基332-407可以与gnl|CDD|22935
pfam00173(细胞色素b5结构域)的残基1-74比对。SEQ ID NO：5的残基17-305可以与
脂肪酸去饱和酶gnl|CDD|11113 COG1398(OLE1)脂类代谢结构域的残基3-288比对。SEQ
ID NO：5的残基301-449可以与gnl|CDD|14396 COG5274的CYB5(与脂类代谢相关的细胞
色素b)的残基11-163比对。缺乏细胞色素b5的SEQ ID NO：5去饱和酶结构域可以是功
能性的，因为这是植物质体去饱和酶的一般结构。也已经公开了假想的微粒体松去饱和酶
(LOCUSAF438199)，其使用可见于胞质隔室的酰基CoA底物，并且缺乏细胞色素b5结构域。
还可以将曲霉细胞色素b5结构域与其他生物(甚至是来自植物胞质去饱和酶)的进行交
换。如下文详细讨论的，这些结构域或编码一种或两种这些结构域的区段可作为探针用于
定义本发明的分子。

[0064] 因此，可根据本发明使用的基因和蛋白质不仅包括具体示例的全长序列，还包括这些序列的部分、区段和/或片段(包括与全长分子相比的内部和/或末端缺失)、其变体、
突变体、嵌合体和融合物。用于本发明的蛋白质可以具有替代的氨基酸，只要它们保留本文具体示例的蛋白质的特征性酶活性。“变体”基因具有编码相同蛋白质或与示例蛋白质功能等价的等价蛋白质的核苷酸序列。术语“变体蛋白质”和“等价蛋白质”指具有与示例蛋白质相同或基本相同的生物/功能活性的蛋白质。在本文中使用的“等价”序列指具有改善
功能性或不对功能性产生不利影响的氨基酸替换、缺失、添加或插入的序列。该定义还包括保留功能性的片段。保留与示例蛋白相应片段相同或相似功能的片段和其他等价物在本发
明的范围内。可以为了多种目的而产生变化如氨基酸替换或添加，例如为了提高(或降低)
蛋白质的蛋白酶稳定性(而不明显/显著降低蛋白质的功能性)。

[0065] 可以使用标准技术(例如产生点突变)便利地构建基因的改变。此外，例如美国专利号5,605,793描述了通过在随机断裂后使用DNA再装配产生额外的分子多样性的方法。
变体基因可用于产生变体蛋白质，重组宿主可用于产生变体蛋白质。使用这些“基因改组”技术可以构建等价基因和蛋白质，其包含任一本文示例序列的(例如)任意5、10、15、20、
25、30、35、40、45、50、55、60个连续残基(氨基酸或核苷酸)。

[0066] 可以使用市售的外切核酸酶或内切核酸酶按照标准方法产生全长基因的片段。例如可以使用酶如Bal31或位点定向诱变来系统地从这些基因的末端切除核苷酸。还可以使
用多种限制性酶获得编码活性片段的基因。可以使用蛋白质直接获得这些蛋白质的活性片
段。

[0067] 可以截短本发明蛋白质而仍然保留功能活性，这在本发明范围内。“截短蛋白质”指可以切割而在切割后仍然显示酶活性的蛋白质的部分。此外，可以使用分子生物学技术产生有效切割的蛋白质，其中通过用限制性内切核酸酶消化或通过本领域技术人员可用的
其他技术去除编码所述蛋白质的DNA碱基。截短后，可以在异源系统如大肠杆菌、杆状病
毒、基于植物的病毒系统、酵母等中表达所述蛋白质，接着在本文公开的昆虫测定中测定活性。本领域熟知，可以成功地产生截短蛋白质，以使它们保留功能活性，而比完整的全长序列更短。本领域熟知，可以以截短(核心毒素)形式使用B.t.毒素。参阅如Adang等，
Gene 36：289-300(1985)，“Characterizedfull-length and truncated plasmid clones of the crystal protein of Bacillusthuringiensis subsp kurstaki HD-73 and their toxicity to Manduca sexta.”。存在其他保留杀虫活性的截短蛋白质的实例，包括昆虫保幼激素酯酶(Regents of the University of California的美国专利号5,674,485)。本
文使用的术语“毒素”还意在包括功能活性截短物。

[0068] 可以通过如使用寡核苷酸探针定义、鉴定和/或获得根据本发明使用的蛋白质和基因。这些探针为可检测的核苷酸序列，所述核苷酸序列由于适当的标记或如国际申请号
WO 93/16094所述使其具有固有的荧光性而可被检测。探针(和本发明的多核苷酸)可以
是DNA、RNA或PNA。除了腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U，
RNA分子中)之外，本发明的合成探针(和多核苷酸)还可以含有次黄苷(能与全部四种
碱基配对的中性碱基，有时用于在合成探针中代替全部四种碱基的混合物)。因此，当本文中提到合成的简并寡核苷酸时一般使用“N”或“n”，“N”或“n”可以是G、A、T、C或次黄苷。
本文使用的多义密码子与提交本申请的标准IUPAC命名约定一致(如R为A或G、Y为C或
T等)。

[0069] 如本领域所熟知，如果探针分子与核酸样品杂交，可以合理的假设探针和样品具有显著同源性/相似性/同一性。优选地，首先进行多核苷酸杂交，之后使用本领域所
熟知的技术在低、中或高严格条件下进行洗涤，如Keller，G.H.，M.M.Manak(1987)《DNA Probes》，Press，New York，NY，169-170页中所述。例如，如文中所述，可以通过首先在室温下用2×SSC(标准柠檬酸盐溶液)/0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)洗涤15分钟来得到低
严格条件。一般进行两次洗涤。可以通过降低盐浓度和/或通过提高温度得到较高的严格
性。例如，在上述洗涤之后可以接着在室温下两次用0.1×SSC/0.1％SDS洗涤15分钟，然
后在55℃用0.1×SSC/0.1％SDS接着洗涤30分钟。如本领域技术人员所知，这些温度可
以与本文公开的其他杂交和洗涤程序一起使用(例如可以用SSPE代替SSC作为盐使用)。
可以通过向445ml水中加入50ml 20×SSC和5ml 10％SDS制备2×SSC/0.1％SDS。可以
通过组合NaCl(175.3g/0.150M)、柠檬酸钠(88.2g/0.015M)和水并接着用10NNaOH调整pH
至7.0，然后调节体积至1升来制备20×SSC。可以通过将10g SDS溶解到50ml高压灭菌
水中，然后稀释到100ml来制备10％SDS。

[0070] 探针检测提供了以已知方式测定杂交是否保持的方法。这种探针分析提供了鉴定本发明毒素编码基因的快速方法。可以使用DNA合成仪和标准程序合成本发明用作探针的
核苷酸片段。这些核苷酸序列还可以用作PCR引物以扩增本发明的基因。

[0071] 与给定的多核苷酸杂交是可用于鉴定、发现和/或定义本发明蛋白质和基因的技术。本文使用的“严格”杂交条件指得到与本文所述条件相同或大致相同程度杂交特异
性的条件。通过标准方法可以进行固定在DNA印迹上的DNA与32p标记的基因特异性探
针的杂交(参阅如Maniatis，T.，E.F.Fritsch，J.Sambrook[1982]Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。一般在允许检测靶序列的条件下进行杂交和其后的洗涤。对于双链DNA基因探针，在6×SSPE、
5×Denhardt溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml变性DNA中在DNA杂交体解链温度(Tm)以下
20-25℃进行过夜杂交。按下式描述解链温度(Beltz，G.A.，K.A.Jacobs，T.H.Eickbush，P.T.Cherbas 和 F.C.Kafatos[1983]Methods of Enzymology，R.Wu，L.Grossman 和
K.Moldave[编辑]Academic Press，New York 100：266-285)：

[0072] Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(G+C％)-0.61(甲酰胺％)-600/双链体长度(碱基对)

[0073] 一般如下述进行洗涤：

[0074] 1)在1×SSPE、0.1％SDS中室温洗涤两次，每次15分钟(低严格洗涤)。

[0075] 2)在0.2×SSPE、0.1％SDS中在Tm-20℃洗涤一次15分钟(中度严格洗涤)。

[0076] 对于寡核苷酸探针，在6×SSPE、5×Denhardt溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml变性DNA中在杂交体解链温度(Tm)以下10-20℃进行过夜杂交。按下式确定寡核苷酸探
针的Tm：Tm(℃)＝2(T/A碱基对数目)+4(G/C碱基对数目)(Suggs，S.V.，T.Miyake，
E.H.Kawashime，M.J.Johnson，K.Itakura和R.B.Wallace[1981]ICN-UCLA Symp.Dev.Biol.Using PurifiedGenes，D.D.Brown[编辑]，Academic Press，New York，23：683-693)。

[0077] 如下述进行洗涤：

[0078] 1)在1×SSPE、0.1％SDS中室温15分钟洗涤两次(低严格洗涤)。

[0079] 2)在1×SSPE、0.1％SDS中在杂交温度下洗涤一次15分钟(中度严格洗涤)。

[0080] 一般可以改变盐和/或温度以改变严格性。对于长度＞70碱基左右的标记DNA片段，可以使用以下条件：

[0081] 低： 1或2×SSPE，室温

[0082] 低： 1或2×SSPE，42℃

[0083] 中： 0.2×或1×SSPE，65℃

[0084] 高： 0.1×SSPE，65℃。

[0085] 双链体的形成和稳定性依赖于杂交体两条链间的显著互补性，且如上文所提到的，某种程度的错配是允许的。因此，本发明的探针序列包括所述序列的突变(单个和多
个)、缺失、插入及其组合，其中所突变、插入和缺失允许与目的靶多核苷酸形成稳定的杂交体。可以以多种方法在给定的多核苷酸序列中产生突变、插入和缺失，这些方法为本领域普通技术人员所公知。其他方法可能在将来被了解。

[0086] 由于遗传密码的简并性/冗余性，多种不同的DNA序列都可以编码本文公开的氨基酸序列。产生编码相同或基本相同的酶的替代DNA序列在受本领域训练的技术人员的能
力范围内。这些变体DNA序列在本发明的范围内。

[0087] 例如，本发明包括：

[0088] 1)得自野生型生物的蛋白质；

[0089] 2)由突变产生的变体；

[0090] 3)通过进行保守性氨基酸替换设计的变体；和

[0091] 4)通过随机断裂并重新组装编码本发明TC蛋白的多种不同序列(DNA改组)产生的变体。参阅如美国专利号5,605,793。

[0092] 编码本发明蛋白质的DNA序列可以是野生型序列、突变体序列或设计用于表达预定蛋白质的合成序列。通过如避免多腺苷酸化信号和使用植物优选的密码子而设计在植物
中高表达的DNA序列是特别有用的。

[0093] 本文示例了某些蛋白质和基因。由于这些蛋白质和基因仅作为示例，因此显然本发明包括具有与示例蛋白质相同或相似功能的变体或等价蛋白质(以及编码其等价物的
核苷酸序列)的用途。等价蛋白质与示例酶(或其活性片段)具有氨基酸相似性(和/或
同源性)。可以以较窄的同一性和/或相似性范围的方式定义本发明优选的多核苷酸和蛋
白质。例如与本文示例或建议的序列相比，酶蛋白的同一性和/或相似性可以是40、41、42、
43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、
68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、
93、94、95、96、97、98或99％。可以使用上文列出的任一数字定义上限和下限。例如，本发明的蛋白质可以定义为例如与示例蛋白具有50-90％的同一性。

[0094] 除非另有说明，使用如Karlin和Altschul(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877中所改良 的Karlin和Altschul(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：
2264-2268的算法确定本文所使用的两个核酸的序列同一性和/或相似性百分比。这样的
算法整合在Altschul等(1990)，J.Mol.Biol.215：402-410的NBLAST和XBLAST程序中。使
用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，评分＝100、字宽＝12。可以如Altschul等(1997)，
Nucl.AcidsRes.25：3389-3402中所述使用Gapped BLAST。使用BLAST和GappedBLAST程
序时，使用程序(NBLAST和XBLAST)各自的默认参数。参阅NCBI/NIH网站。

[0095] 使用默认参数，用Vector NTI Suite 8(InforMax，Inc.，North Bethesda，MD，美国A)中的AlignX函数得到用于比较目的的缺口比对。默认参数一般为缺口打开罚分15、缺口延伸罚分6.66和缺口分离罚分范围8。可以以这种方式或本领域熟知的其他技术比对
和比较两种或更多序列。通过分析这些比对可以鉴定本发明多肽中相对保守和非保守的区
域。这可用于例如评估通过修饰或替换一个或多个氨基酸残基来改变多肽序列是否预期是
可接受的。

[0096] 氨基酸同源性/相似性/同一性一般(但不必然)在蛋白质的决定生物活性的区域中是最高的，或者在与最终决定生物活性的三维构型决定相关的区域中是最高的。考虑
到这一点，某些氨基酸替换是可以接受的并预计是可承受的。例如，这些替换可以在对活性非关键的蛋白质区域中。可以使用蛋白质晶体结构分析和基于软件的蛋白质结构建模来鉴
定可(使用位点定向诱变、改组等)进行修饰以确实改变蛋白质特性和/或提高功能性的
蛋白质区域。

[0097] 还可以改变蛋白质的多种特性和三维特征而不对蛋白质的活性/功能性产生不利影响。保守性氨基酸替换预期是可以接受的/不对分子的三维构型产生不利影响的。氨
基酸可置于如下类别：非极性、极性不带电荷、碱性和酸性。只要替换不损害化合物的生物活性，则保守性替换在本发明的范围内，在所述保守性替代中，一种类别的氨基酸被同一类型的另一氨基酸替换。下表提供了属于每一类的氨基酸实例。

[0098]

[0099] 在一些情况下，还可以进行非保守性替代。关键因素是这些替代不能明显降低蛋白质的功能/生物/酶活性。

[0100] 为了在植物中得到异源基因的高表达，例如，可以优选重新设计所述基因以使其在植物细胞中更有效的表达。可以设计序列用于一般地在植物中优化表达，或者可以设计
用于在特定类型的植物中优化表达。芸苔就是这样的一种植物，其中优选在转化前重新设
计异源基因以提高其在所述植物中的表达水平。因此，在设计编码真菌蛋白质的基因中额
外的步骤是例如重新设计异源基因，以用于在不同类型的生物中优化表达。关于产生优化
用于植物表达的合成基因的指导可见于例如美国专利号5,380,831。本文中以SEQ ID NO：
1(其编码SEQ ID NO：5所示的示例蛋白)示例了优化用于植物表达的序列。

[0101] 本文使用的“分离的”多核苷酸和/或蛋白质以及“纯化的”蛋白质是指这些分子不伴随有与其天然共存的其他分子。因此，提到“分离的”和/或“纯化的”表示与本文所述的“人为”相关。例如，置于植物中进行表达的本发明真菌多核苷酸(或“基因”)是“分离的多核苷酸”。同样，植物所产生的本发明蛋白质是“分离的蛋白质”。

[0102] “重组”分子指经重组的分子。涉及核酸分子时，该术语指由通过分子生物学技术连接的核酸序列组成的分子。涉及蛋白质或多肽时，术语“重组”指使用一种或多种重组核酸分子产生的蛋白质分子。

[0103] 涉及核酸序列时，术语“异源”指与其在自然界中不连接或在自然界中在不同位置连接的核酸序列连接(或经操作而与其连接)的核酸序列。因此，术语“异源”表示使用遗传工程(即通过人工介入)对核酸分子进行了操作。因此，本发明的基因可以与异源启动
子(或“转录调节区”，指转录调节区与目的序列有效连接时能介导或调节目的核苷酸序列转录的核苷酸序列)有效连接。优选的异源启动子可以是植物启动子。当序列功能性连接
从而允许转录调节区介导或调节目的序列的转录时，则启动子和/或转录调节区与目的序
列“有效连接”。在一些实施方案中，为了有效连接，转录调节区可以与目的序列位于同一链上。在一些实施方案中，转录调节区可以位于目的序列的5’。在这些实施方案中，转录调节区可以直接在目的序列的5’，或者在这些区域之间可以存在间插序列。转录调节区与目的序列的有效连接可能需要适当的分子(如转基因激活蛋白)与转录调节区结合，因此本发
明包括(体外或体内)提供这些分子的实施方案。

[0104] 有多种方法可用于获得按本发明方法使用的蛋白质。例如，可以使用针对本文公开蛋白质的抗体从混合物中鉴定和分离其他蛋白质。具体地，可以针对最恒定和与其他蛋
白质区别最大的蛋白质部分产生抗体。然后可以通过免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)或免疫印迹使用这些抗体特异性鉴定具有特征活性的等价蛋白质。可以使用标准程序便利
地制备针对本文公开蛋白质或等价蛋白质或这些蛋白质的片段的抗体。这些抗体是本发明
的一个方面。

[0105] “来自”或“得自”任一本文提到或建议的隔离群的蛋白质指该蛋白质(或相似的蛋白质)可得自示例隔离群或其他来源，如另一真菌菌株或细菌菌株或植物(如经改造用于产生该蛋白质的植物)。“衍生自”也具有此意义，包括如得自给定真菌或细菌类型的多核苷酸(和蛋白质)，例如其中多核苷酸经修饰用于在植物中表达。本领域技术人员容易理
解，在真菌基因和蛋白质公开后就可以改造植物以产生该蛋白质。可以使用本文公开的多
核苷酸和/或氨基酸序列制备抗体制剂、核酸探针(如DNA和RNA)等，并用于从其他(天
然)来源筛选和回收其他蛋白质基因。

[0106] 本发明的油保持了高度的氧化稳定性，但含有较低水平的饱和脂肪酸和高水平的不饱和脂肪酸。本发明优选的油具有少于3.5％的总饱和脂肪酸含量、至少75％(优选并
令人惊奇地少于80％)的油酸含量和少于20％(更优选少于15％，更优选少于10％，并且
甚至更优选少于9％)的多不饱和脂肪酸含量。本发明还可用于获得具有不高于(优选低
于)总脂肪酸含量的2.5％(优选具有上文提到的油酸范围)的总饱和脂肪酸含量(C:14、
C:16、C:18、C:20、C:22和C:24)的芸苔种子。促进油不稳定性的18:2和18:3水平没有提
高或优选地降低(对于食品应用)。用于任一这些特定脂肪酸、其任一组合和具体地两种
C18不饱和物中的一种或两种的范围终点可得自本文提供的任一图和表。

[0107] 本发明可用于提供农业良种芸苔种子，其产生总饱和物少于3.5％的精制油/脱臭油。来自这些植物的油可用于制备多种终产物，或者它们可单独用作“无饱和”(或“低饱和”)产品的煎炸油。

[0108] 除非另有说明，可以通过标准方法测定给定的一组芸苔种子的饱和脂肪酸含量，其中通过压榨种子从种子中移出油，并按照与甲醇和氢氧化钠的反应以脂肪酸甲酯进行提
取。接着使用毛细柱通过气液层析分析得到的酯的脂肪酸含量，所述毛细柱允许基于不饱
和程度和链长度进行分离。该分析方法描述于例如J.K.Daun等，J.Amer.Oil Chem.Soc.60：
1751-1754(1983)。

[0109] 如下文所述以“半种子”分析、“单个/完整种子”分析或“批量种子”分析来测定芸苔种子的脂肪酸组成。对于“半种子”分析，从胚上取下部分子叶组织并进行分析；保留剩余的种子，需要时可进行萌发。尽管半种子技术在选择稳定遗传控制的脂肪酸突变(和其后的育种和杂交)中可能不太可靠，但是本发明证明可以引入优选基因并用于产生稳定
株系。与未表征突变不同，本领域熟知可以将基因引入植物并稳定维持。因此，本文公开的分析证明了本发明基因的用途，以及可以获得具有所指出特征的芸苔油。

[0110] 在来自市售Nexera 710(芸苔)种质的转基因株系的种子中达到了“无饱和”(即No Sat)的脂肪酸水平。No Sat水平定义为低于3.5％的组合饱和物。此外，使用同一转化
构建体在Westar芸苔株系和另一Crucifer(拟南芥)中观察到降低的饱和物。值得注意的
是，在一些种子中单个种子的饱和水平低至2.6至2.7％。本发明还可用于产生具有2.5％
或更低总饱和物的种子。这是很重要的，因为油加工可以使总饱和“分数”增加～0.5-1％，意味着经加工的油产品仍可使用标准测试方法可测量地达到FDA定义的No Sat水平。具有
这种容许量水平不仅允许测试装置(被较高饱和的种子)的某种水平的污染(特别是如果
植物操作者不能良好地使种子批次分开时)，还允许某种水平的大田种植条件变化(如倾
向于产生更多饱和物的高温)和来自临近的大田中未改良芸苔飘来的花粉的异花授粉(可
稀释目的基因)。

[0111] 美国食品与药物管理局将“饱和脂肪”定义为“对于一份中饱和脂肪的克数的表述，定义为所有不含双键的脂肪酸的总数”21 CFR 101.9(c)(2)(i)。除非另有说明，这就是本文中对于“总饱和物”和“总饱和脂肪”的定义。如果一份食品“在一份中含有小于0.5g的总脂肪”，则认为该产品为“无饱和脂肪”21 CFR 101.9(c)(2)(i)。“总脂肪”定义为“对于一份中总脂肪克数的表述，定义为总脂类脂肪酸并表达为甘油三酯”21 CFR 101.9(c)(2)。
21CFR 101.12(b)中定义了多种类型食品的“份大小”，一份油定义为一汤匙或15ml。在本文中理解为指14克。因此，本文中“无饱和”芸苔油(或不含有饱和脂肪的芸苔油)定义
为一份(14克芸苔油，含有14克脂肪)中总饱和脂肪低于0.5克的芸苔油。换言之，“无饱
和”芸苔油包含低于3.57％的总饱和物(0.5克总饱和物除以14克总脂肪)。除非另有说
明，本文的所有脂肪酸百分比均为该脂肪酸作为组分的油的重量百分比。

[0112] 如本文所示，本发明可令人惊奇地用于获得来自芸苔种子的油，其中所述油包含少于3.57％的总饱和物。可以使用本领域熟知的方法从受试种子获得油，如以上段落所述，并且可以使用熟知的技术，包括本文示例的技术测定油的含量。除非另有说明，用于产生半种子油数据和大田油数据的分析使用碱催化的酯交换反应(AOCS Ce 2-66，备选方法)。该
方案与本文描述的皂化/酸酯化方案相似，只是皂化/酸酯化方案测量总脂类，其中大部分
是与通过碱催化的酯交换反应检测到的来自甘油三酯的相同的脂肪酸。

[0113] 在市售的Nexera 710种质中，促进氧化不稳定性的18:3脂肪酸水平相对而言没有变化。因此，本发明不仅提供具有较低饱和脂肪的植物、种子和油，还提供令人惊奇地保持其他有益特征的植物、种子和油。即可以令人惊奇地使用本发明的植物和基因，而不对植物的其他有益特征产生不利影响。

[0114] 在优选的实施方案中，本发明提供包含本发明Δ-9去饱和酶基因的一个以上的表达拷贝的植物。本文展示的结果显示表达该基因的多个拷贝令人惊奇地改善了芸苔植物
的脂肪酸谱(饱和脂肪水平大幅降低)。这是令人惊奇的，部分在于迄今为止本领域仍无法
预计同一基因的多个拷贝的表达。“基因沉默”是一种已知的现象，其教导反对使用异源基因的多个拷贝(例如在基因组不同位置插入)。尝试获得多重转化事件也不是理想的。因
此，没有动机产生包含多于1个(2个、3个、4个等)Δ-9去饱和酶事件的植物。也没有预
计这些植物实际上具有改善的特征。

[0115] 本文示例了十字花科植物的两种实例：欧洲油菜(芸苔)和拟南芥。然而，如本领域所知，其他芸苔物种和其他十字花科可用于例如在芸苔等中育种和开发所需性状。可
以根据本发明这样使用的其他植物包括芜菁(Brassica rapa)、芥菜(Brassica juncea)、
Brassica carinata、Brassica nigra、甘 蓝 (Brassica oleracea)、萝 卜 (Raphanus
sativus)和白芥(Sinapis alba)。也可以根据本发明测试大豆、大豆植物和大豆油的改进。

[0116] 在优选的实施方案中，优化了本发明的Δ-9去饱和酶基因用于植物表达。因此，本发明还提供植物优化的Δ-9去饱和酶基因。本文示例的优化包括引入优选的密码子和
Kozak翻译起始区以及除去不需要的序列。基因由β-菜豆蛋白启动子(强双子叶植物贮
藏蛋白启动子)驱动。

[0117] 可以使用表达与油合成吻合的启动子(如ACP，延伸酶)来进一步减少饱和物，因为表达在贮藏蛋白表达之前发生。(目前的烟草构建体使用nos 3’UTR，目前的玉米构建体使用组成型玉米泛蛋白-1启动子和nos 3’UTR。)可以根据本发明使用其他双子叶种子
启动子，包括豌豆球蛋白、凝集素、cruciferin、大豆球蛋白和大豆聚球蛋白(conglycinin)启动子、US20030005485A1中公开的植物种子启动子、US20030159173A1中的延伸酶启动子
和美国专利号5,767,363中的ACP启动子。还参阅如US6100450A(种子特异性，在胚中表
达，第8栏第8行)、US20030159173A1(第0044节，种子特异性启动子，实例为USP、大麦
醇溶蛋白、ACP、油菜籽蛋白、FatB3和FatB4)、WO9218634A1(引言讨论了来自其他专利的
种子特异性启动子，1-7页)、WO0116340A1(第7页第13行提供了“种子特异性”启动子的
定义，一般在其他组织中的表达低于5％；第10页第19-29行讨论了种子贮藏蛋白如白蛋
白、球蛋白、豌豆球蛋白和豆球蛋白样蛋白、非贮藏油质蛋白、与脂肪酸代谢相关的启动子如ACP、饱和酶、去饱和酶、延伸酶)、WO2003014347A2(启动子定义，23-25页：优选种子特异性高于2x)、US20030233677A1(第0033节提供了“种子启动子”的实例[油菜籽蛋白、
ACCase、2S白蛋白、菜豆蛋白、油质蛋白、玉米醇溶蛋白、谷蛋白、淀粉合酶、淀粉分支酶])、WO2003092361A2(第15页提供了“启动子”的定义，第17页上方提供了启动子实例和专
利参考文献(仅为贮藏蛋白)，包括玉米醇溶蛋白、7S贮藏蛋白、巴西坚果蛋白、phe-free
蛋白、白蛋白、β-大豆聚球蛋白、11S、α-hordothionin、arcelin、凝集素、麦谷蛋白)、US20030148300A1(参阅权利要求8，包括油菜籽蛋白启动子、菜豆蛋白启动子、大豆胰蛋白酶抑制剂启动子、ACP启动子、硬脂酰-ACP去饱和酶启动子、大豆7S启动子、油质蛋白启动子、大豆聚球蛋白启动子、油质蛋白启动子、胚胎发生高丰度蛋白启动子、胚球蛋白启动子、arcelin 5、油菜籽蛋白启动子和酸性几丁质酶启动子)、美国专利号5,777,201(第6栏，
第30-50行，组成型启动子、种子和/或发育调节的启动子，如植物脂肪酸脂质生物合成基
因[ACP、酰基转移酶、去饱和酶、脂转移蛋白l或种子启动子[油菜籽蛋白、cruciferin、大豆聚球蛋白、凝集素]或诱导型启动子[光、热、创伤诱导剂])。

[0118] 高等植物的质体是遗传工程的有意义的靶标。已经实现了叶绿体(质体的一种)转化，并且是有利的。参阅如美国专利号5,932,479、6,004,782和6,642,053。还参阅美国专利号5,693,507和6,680,426。转化叶绿体基因组的优势包括：可能的环境安全性，因为
转化的叶绿体仅为母系遗传，因此不通过花粉杂交传递到其他植物中；获得高拷贝数外源
基因的可能性以及降低植物能耗，因为减少了将蛋白质运输至叶绿体，这是高能耗的。

[0119] 植物质体(叶绿体、造粉体、油质体、黄化质体、色质体等)是主要的生物合成中心，与光合作用一起负责产生许多具有工业重要性的混合物，如氨基酸、复杂碳水化合物、脂肪酸和色素。质体来自称为前质体的共同前体，因此给定植物物种的质体都具有相同的
遗传内容。

[0120] 多数植物的质体为母本遗传。因此，与在核中表达的异源基因不同，在质体中表达的异源基因不分布在花粉中。从而引入植物质体的性状将不会传递到野生型亲缘植物中。这为植物的遗传改造提供了耐受或抵抗天然或化学条件的优势，如除草剂耐性，因为这些
性状不会传递到野生型亲缘植物中。

[0121] 高等植物的质体基因组(原质体系)是120-160kb的环状双链DNA分子，每个叶细胞中可存在1900-50000个拷贝(Palmer，1991)。通常植物细胞含有500-10000个拷贝的
小120-160kb环状基因组，其每个分子具有一个大(约25kb)反向重复。因此，可以改造植
物细胞以含有高达20000个拷贝的特定目的基因，这可能引起极高水平的外源基因表达。

[0122] 本发明的油可用于(并且特别适用于)工业以及多种食品用途。除了烹调油本身以外，本发明还包括“无饱和”产品，如炸土豆片等(参阅美国专利号6,689,409，其要求包含马铃薯和芸苔油的油炸食品组合物，然而，本发明可用于改进”409专利所描述的组合物)。

[0123] 本发明的植物可以与其他植物杂交，以获得特征和性状的多种需要的组合。甚至可以通过使用已知的育种技术和其他有利的种质来源(如具有额外的或其他有益性状和
特征的其他芸苔株系)杂交本发明植物来进行其他改进。另一实例是与具有质体Δ-9去
饱和酶的株系杂交。

[0124] 因此，本发明可用于在可变环境条件下在商品油中获得少于3.5％的总饱和脂肪酸(和原种的种子油中少于3％的总饱和脂肪酸)。这可以实现而不降低贮藏蛋白质质量
和数量、不提高芸苔食品中的不消化纤维并且不对每英亩的种子产量(或其他希望的农学
性状)产生不利影响。

[0125] 下文为本文使用的脂肪酸通用名及其碳原子数和双键数的列表。饱和脂肪双键数为0。

[0126] 表1.

[0127]

[0128] ＊＝Δ-9位置的双键

[0129] ＊＊＝Δ-11位置的双键

[0130] 本文提到或引用的所有的专利、专利申请、临时申请和出版物均引入本文作为参考文献，其程度为它们不与本说明书的明确教导矛盾。

[0131] 除非明确指出或者暗示，术语“一个”表示如本文使用的“至少一个”。

[0132] 下文为展示实践本发明的方法的实施例。这些实施例不应理解为限制性的。除非另有说明，所有的百分比均以重量计，所有的溶剂混合物比例以体积计。

[0133] 实施例1-Δ-9去饱和酶基因的重建

[0134] 通过将构巢曲霉序列变成植物优选的翻译密码子、引入独特限制性酶位点和去除不需要的序列和某些二级结构的组合来重新设计本发明的Δ-9去饱和酶基因，以用于植
物表达。重新设计的基因由Operon，Inc.合成。本文中以SEQ ID NO：1提供该多核苷酸的
可读框序列。SEQ ID NO：2提供了ORF序列，其之前为Kozak序列和BamHI克隆位点(帽)，
并且ORF末端为翻译终止子(帽)。

[0135] 实施例2-Δ-9去饱和酶植物转化载体的构建

[0136] 将BamHI-BstEII基因片段克隆进载体中Pvβ-菜豆蛋白启动子与Pvβ-菜豆蛋白3’UTR(pPhas-UTR)之间。该构建体命名为pOIL。通过用NotI消化从pOIL中切出启
动子-基因-UTR片段、补平并克隆进载体pOEA1的平末端PmeI位点中。最终载体命名为
pPD9-OEA1。

[0137] 实施例3-用pPD9-OEA1进行植物转化

[0138] 将质粒载体pPD9-OEA1转化进根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)[菌株C58GV3101(C58C1RifR)pMP90(GmR)。Koncz和Schell，Mol.Gen.Genet(1986)]。接着通过
根癌农杆菌介导的植物转化获得Δ-9去饱和酶植物。

[0139] 使用本领域熟知的“浸染法”转化拟南芥。自交植物，收集干燥种子用于FAME(脂肪酸甲酯)分析。

[0140] Katavic[Katavic，Campbell，L.，Friesen，L.，Palmer，D.，Keller，W.，and Taylor，D.C.(1996)，“Agrobacterium-mediated genetic transformationof selected thhigh erucic acid B.napus cultivars，”4 Canadian Plant TissueCulture and Genetic Engineering Conference，Saskatoon，SK，June 1-4，1996]描述了用于芸苔转化的方案，对DAS的Nexera株系进行了改良。从欧洲油菜Westar或Nexera 710栽培种的6日龄苗分离
下胚轴切片，在转化前先在愈伤组织起始培养基中培养。转化当天，将下胚轴与含有带有性状基因的质粒pPD9-OEA1的农杆菌培养物共温育，从而包括Δ-9去饱和酶基因的质粒DNA
片段整合进细胞染色体中。共温育期后，将下胚轴转移至含有作为选择剂的草铵膦的愈伤
组织起始培养基。获得健康的抗性愈伤组织并重复转移至新鲜的选择培养基上约12至16
周。再生植物并转移至Convirons培养箱。自交植物以获得种子。如果转基因植物是不育
的，将其与来自未修饰Nexera 710株系的花粉杂交。收获干燥种子用于FAME分析。

[0141] 实施例4-芸苔事件分选处理和芸苔结果概述

[0142] 除非另有说明，使用以下方法获得Nex 710/Δ-9芸苔种子，以下实施例中展示了所述数据。

[0143] 开发、选择或分选事件一般有四个主要步骤：分选最初的转基因事件、分选T1和T2种子、分选T1或T2植物和通过大田性能分选事件。首先将转化的愈伤组织再生成T0植
物。

[0144] 对于最初的分选，通过农学和DNA印迹筛选了107个推定的转基因(简单或复杂，即多于3个拷贝)。每个事件筛选多个种子。测定T1种子的饱和物、测定C16:1/C16:0比
(以推断催化效率)并且测定了生物化学表型的分离。基于这些数据和种子可用性(时间
选择、数量)，有限的部分种子进行后续实验。

[0145] 对于T1和T2种子分选(少数事件前进一个世代)，进行半种子分析，鉴定可能的纯合子。基于该数据，选择来自分离种群的半种子用于温室培养。

[0146] 下一个主要步骤是分选T1或T2植物(少数事件前进一个世代)。进行DNA印迹以测定转基因整合复杂度。还通过INVADER测定(Third WaveTechnologies，Inc.)测定接
合性。使用这些数据选择用于大田试验的种子。

[0147] 对于T1温室研究，将每个事件的30个种子用于半种子分析。使用Nex 710芸苔作为商品检验。对事件内的所有个体进行接合性采样，以测定Δ-9和PAT的等位基因拷贝
数。这之后进行PCR和吲哚乙酰胺水解酶(IAAH，可阴性评分或选择标记)分析。对事件内
的所有个体进行叶面喷洒以测定PAT分离比。对达到“无饱和”谱、阳性IAAH并且PAT和
Δ-9为纯合的个体进行DNA印迹分析。

[0148] 接着将这些用于T2分析(对来自每个以上植物的100个种子进行半种子分析)。使用INVADER证实拷贝数并观察事件对于D9和PAT是否分离。使用叶面喷洒观察株系的
PAT是否分离。基于半种子数据、INVADER结果、LP和IAAH阳性从植物收集10个种子批次
脂肪酸数据。

[0149] 第四个主要步骤是通过大田性能进行分选(种植T2或T3种子、分析T2或T3植物，再分析T3或T4种子)。对转基因事件广泛采样。进行农学、DNA印迹和接合性分析。
还进行了批量种子油分析。基于这些数据，选择事件用于杂交以提高基因剂量。

[0150] 使用以下选择标准选择株系进入大田研究。在3个地点的一式两份苗圃中评估了来自23个事件(6reps/entry)的224个株系(包括空白)。种植了6个T3和17个T2事
件。基于插入数和半种子分析以及其后的对来自每个植物的种子进行的10种子批量脂肪
酸分析来选择株系/事件进入大田。选择的株系的总饱和百分比范围约在3.3-4.5％范围
内。选择以下T3事件用于进一步开发：

[0151] 表2A.

[0152]

[0153]

[0154] 选择以下T2事件用于进一步开发：

[0155] 表2B.

[0156]

[0157] 按下文进行大田测试。如以下实施例的讨论进行农学评估，以确认Δ-9(D9)不与农学损失相关。从最有希望的28个T3株系(加上近亲空白)采集15个INVADER叶组织
用于进一步的拷贝数验证和测定株系的PAT是否分离。基于具有少于3.5％的总饱和物选
择D9株系。

[0158] 从最有希望的3个T2株系采集10个Southern组织样品，基于具有少于3.5％的总饱和物进行选择。所有的组织采样植物进行自花受粉。基于来自自交植物的10种子批
次(455个样品)以及来自OP行的1克批次种子样品(1445)进行脂肪酸分析。

[0159] 以下为“最佳”的T4事件：

[0160] 表3A.

[0161]

[0162] 以下为“最佳的”T3事件：

[0163] 表3B.

[0164]

[0165] 一般未观察到与Δ-9相关的重大农学损失，某些株系在种子重量上表现出约10％的提高。下文在实施例18中更详细地讨论了农学结果。下文实施例11-13中讨论了个
体脂肪酸组分分布的一般观察。表4-7中展示了事件218-11.30、36-11.19和69-11.19的
平均TSAT数据、TSAT变化百分比和某些脂肪酸组分变化百分比的概述。一般观察到TSAT
相对于近亲空白和野生型～30％至～40％的降低。然而，下文更详细地讨论了例如进一步
改进，并可进行进一步杂交。

[0166]

[0167]

[0168]

[0169] 实施例5-植物的分子表征

[0170] 采集叶组织用于DNA分析，以通过PCR和DNA印迹分析验证转基因的存在，并有时通过ELISA确认PAT的表达。

[0171] 5A.用于Δ-9去饱和酶的PCR分析的方案。使用以下两种引物：

[0172] Δ-9正向B：

[0173] 5’TGA GTT CAT CTC GAG TTC ATG 3’(SEQ ID NO：3)

[0174] Δ-9反向B：

[0175] 5’GAT CCA ACA ATG TCT GCT CC 3’(SEQ ID NO：4)

[0176] 该引物对在扩增Δ-9基因后得到～1380bp的片段。

[0177] 在该筛选中用MJ四相热循环仪使用以下循环方案：

[0178] 1.94℃，2分钟

[0179] 2.94℃，1分钟

[0180] 3.50℃，2分钟

[0181] 4.72℃，3分钟，+5秒/循环延伸

[0182] 5.重复步骤2-425次

[0183] 6.4℃至可用于分析，或者至少2分钟

[0184] 5B.提取用于DNA印迹分析的植物基因组DNA的方案。使用来自Qiagen的DNeasyPlant Maxi试剂盒。使用手册中的方案，对洗脱部分进行了以下变化。用DNA级水(Fisher
号BP561-1)以1∶10稀释缓冲液AE。使用0.75ml预热至65℃的稀释的AE缓冲液洗脱
两次。用异丙醇沉淀DNA并用70％乙醇洗涤。将DNA沉淀重悬于100μl 1X TE缓冲液中。
定量DNA浓度。将6μgDNA等分试样并调整至终体积为40μl。将样品存放于-20℃。

[0185] 5C.FAME分析(用甲醇H2SO4从种子直接进行FAME合成)

[0186] 用于FAME分析的方案如下。

[0187] GC Specs

[0188] 气相色谱仪：具有两个注射口和两个火焰电离探测器的Hewlett-Packard 6890。

[0189] 数据系统：HP Chemstation，Leap Technologies，Carrboro，NC27510，PAL系统。

[0190] 柱：J&W毛细柱，DB-23，60Mx0.25mm内径，0.15微膜厚度，最高操作温度250℃。目录号：122-2361。

[0191] 温度分布：平衡时间：1分钟。起始温度：50℃。起始时间：3分钟。提高率：40℃/分钟。终温度：240℃。终时间：7.25分钟。

[0192] 用于拟南芥的FAME方法。将100ul(50μg)15:0标准品加入干净的16x125mm玻璃管中(内标准贮存液：500μg/ml C15:0 TAG，溶于2∶1的氯仿∶异丙醇中)。在氮气
中以55℃蒸汽浴干燥标准品。

[0193] 干燥时，加入含2ml含2％DMP(100ml∶95.22ml甲醇，2.772mlH2SO4，2ml DMP＝2，2-二甲氧基丙烷)的1N甲醇H2SO4。

[0194] 称出～5mg拟南芥种子装入干净的16x125mm玻璃管中并记录准确的重量。

[0195] 为破坏脂肪酶，将热的甲烷H2SO4和标准品加入装有种子的管，在85℃温育15分钟。

[0196] 将管冷却至～50℃，接着在小研磨器中用玻璃杵碾碎种子。

[0197] 将样品转移回管中，在氮气下在85℃温育至少1个小时。将管在冰上冷却。先加入0.5ml 0.9％NaCl，再加入250μl己烷中的17∶0标准品(0.1335mg/ml甲酯贮存液)。
涡旋，以1000g离心5分钟。

[0198] 用Pasteur移液器转移100-200μl至带有圆锥板的1.5ml瓶(0.5ml)。

[0199] 将5μl注射进GC中。

[0200] 用于芸苔的FAME方法。将100μl(50μg)15:0标准品加入干净的16x125mm玻璃管中(内标准贮存液：2∶1的氯仿∶异丙醇中500μg/mlC15:0 TAG)。在氮气中以55℃
蒸汽浴干燥标准品。

[0201] 干燥时，加入含2ml含2％DMP(100ml∶95.22ml甲醇，2.772mlH2SO4，2ml DMP＝2，2-二甲氧基丙烷)的1N甲醇H2SO4。将管加热至85℃。

[0202] 称量一个芸苔种子装入干净的管中并记录准确的重量。

[0203] 为破坏脂肪酶，将种子样品加入含有标准品和热的甲烷H2SO4的管，在85℃温育15分钟。

[0204] 将管冷却至～50℃，接着用玻璃杵碾碎种子。

[0205] 在N2下在85℃温育至少1个小时。

[0206] 将管在冰上冷却。先加入0.5ml 0.9％NaCl，再加入250μl己烷中的17:0标准品(0.1335mg/ml甲酯贮存液)。涡旋，以1000g离心5分钟。

[0207] 用Pasteur移液器转移100-200μl至带有圆锥板的1.5ml瓶(0.5ml)。

[0208] 将5μl注射进GC中。

[0209] 实施例6-拟南芥结果

[0210] 最初的结果示于图1，显示获得了高于60％的饱和脂肪酸降低。还获得了比16:0(4.4％)更多的16:1(如5.9％)。

[0211] 通过Δ9-CoA-去饱和酶方法获得的无饱和油

[0212] FAME分析

[0213] 分析了来自约18个额外转化体的T2种子。该数据(见表8和图2)显示“饱和物”的降低高达60-70％。这是比最初的数据(见图1)所表明的更强的饱和脂肪酸降低。
需要注意到T2世代仍然是分离的，因此，可以预期在其后的世代中性能更好的株系。这一
点对所有的T1、T2、T3和其他本文中别处报道的最初世代(包括芸苔株系)都是真实的，除
非性状已固定，并且株系对于转基因是纯合的。(在以下的实施例中产生并描述了性状固定的稳定株系和植物。)

[0214]

[0215] 实施例7-Westar数据

[0216] 将与实施例5C所述类似的方案应用于来自熟知的“Westar”芸苔的芸苔株系。如图3所示，标出的饱和脂肪降低了超过43％，包括24:0时则获得了50％的降低。

[0217] 实施例8-示例Nexera 710数据

[0218] 将与本文中别处所述相似的方案应用于来自熟知的“Nexera 710”商品良种芸苔的芸苔株系。使用本文讨论的方法计算总饱和物，并在下文中标出。

[0219] 总饱和物来自16:0+18:0+20:0+22:0+24:0脂肪酸的总和。表9中给出了单个种子中一些值得注意的饱和物水平。油谱以摩尔％值给出。摩尔％值在计算中引入了每种特
定脂肪酸的化学式量。它使用给定脂肪酸种类的质量(峰区，或与用于直接计算脂肪酸百
分比相同的值)除以该脂肪酸种类的化学式量。

[0220]

[0221] 分析了具有最低的总饱和物的种子的谱(种子113a 11.19#4、113a11.19#8、511.19#6和511.19#8)。未修饰Nexera 710种质的值来自进行的同一FAME分析。在
Convirons培养箱中培养植物，因此实际的摩尔％可能与大田培养的种子不同。一般而言，转基因植物显示16:0、18:0和20:0的降低和16:1的升高。18:0水平一般从Nexera 710
的平均值1.4％(上至2.08％，下至0.81％)下降至选择的转基因材料中的平均值0.1％
(上至0.6％，下至0％)。同时，16:0水平从平均值4.6％(上至5.12％，下至4％)下降
至3.0％(上至3.41％，下至2.63％)。同样，20:0水平从Nexera 710中的平均值0.5％
下降至选择的转基因植物中的0％。16:1水平从Nexera 710中的不可检测提高至转基因
植物中的平均值2.3％(上至2.71％，下至1.72％)。平均18:3水平在少数转基因种群中
稍有提高，但值的范围与未修饰的Nexera 710样品重叠。这些结果概述如下：

[0222]

[0223] 实施例9-其他芸苔数据

[0224] 将与本文中别处所述相似的方案应用于来自熟知的“Nexera 710”商品良种芸苔的芸苔株系。使用本文讨论的方法计算总饱和物和每种脂肪酸类型的重量百分比，在下文
中标出。

[0225] 图4A-C和5A-C分别显示了来自事件36-11.19和218-11.30的代表性结果，证明可以通过实践本发明获得降低的饱和脂肪酸水平。通过进行本发明的其他操作，甚至可以
进一步降低本文示例的饱和脂肪水平。所有这些数据均得自本文指出的自交转基因芸苔植
物。

[0226] 总之，对于事件36-11.19，来自温室培养的植物的T2半种子分析具有低至2.57％的总饱和物。对于来自温室培养植物的T3完整种子，总饱和物低至3.66％。结果图示于图
4A(数值数据在图4B和4C中)。对于事件218-11.30的温室培养植物，T2半种子分析显
示总饱和物低至2.71％。T3完整种子具有低至3.37％的总饱和物。结果图示于图5A(数
值数据在图5B和5C中)。作为参照，NATREON在大田条件下具有6.5％的总饱和物。

[0227] 通过根据进行本发明的其他改进(如额外轮次的自交、与其他优秀株系杂交、[通过额外的转化、通过进一步育种杂交等]提高去饱和酶基因拷贝数、改变去饱和酶表达的
时间以及诱变)，甚至可以获得更大程度的总饱和脂肪降低。

[0228] 实施例10-其他芸苔数据的分析——总饱和脂肪的降低百分比

[0229] 可以使用实施例9所示的数据进行多种计算，以展示本发明的多个方面。例如，可以通过先用给定植物的总饱和物除以对照株系的总饱和物再从100％中扣除来计算总饱和脂肪降低的百分比。本发明提供的这种降低的实例示于下文。可以通过四舍五入为最接近
的整数(非小数)来对结果进行近似。

[0230] 表11.

[0231]

[0232] 本文中任一图、图表、表或其他各处讨论的任一数字均可作为端点用于定义本发明的边界和界限。同样，使用任一这些数字(如上文所示以及下文详细讨论的)的任一计算
均可用于定义本发明的边界和界限。表12-14显示了事件218-11.30、36-11.19和69-11.19
的株系的其他代表性结果和计算。

[0233]

[0234]

[0235]

[0236] 实施例11-其他芸苔数据的分析——详细的脂肪酸谱

[0237] 图4A-C和5A-C显示了具有事件218-11.30和36-11.19的多种植物的脂肪酸谱的一些代表性结果。一般而言，这些结果显示不仅16:0和18:0水平大幅降低(同时导致相
应不饱和物水平的提高)，而且20:0、22:0和24:0水平也有利地令人惊奇并且意外地降低
了。在一些情况下，18:2和18:3水平也可以降低，这增强了改良油的氧化稳定性。此外，上文建议的任一比例(如16:0-16:1、18:0-18:1和例如18:0-[20:0+22:0+24:0])均可用于
定义实践本发明的有利结果。根据本发明还令人惊奇地实现了C20:0+C22:0+C24:0总的降
低百分比的组合。因此，本发明提供如本文示例的具有有利并改良的脂肪酸谱的植物。通
过进行本发明的其他改良，可以实现甚至饱和物更好的降低、“无饱和”的提高以及更好的比例。

[0238] 例如，使用以下来自图5C和图4B的数据的多种计算可用于展示本发明的成就。来自图5C和图4B的样本数据示于下表。标出了每个事件的每种标出的脂肪酸的量，并在括
号中标出了相关对照植物的脂肪酸的量。

[0239] 表15.

[0240] 事件(&世代) C20:0(对照) C22:0(对照) C24:0(对照)

[0241] 218-11.30(T2) 0.11(0.62) 0.12(0.32) 0.03(0.14)

[0242] 36-11.19(T3) 0.32(0.64) 0.15(0.42) 0.04(0.21)

[0243] 就218-11.30事件而言，在对照中C20:0、C22:0和C24:0对饱和物的总贡献为1.08％，而这些组分在本发明的芸苔株系中有利地降低至0.26％。这显示了这些饱和物超
过4倍的降低。同样，可以单独考虑每种组分。再就218-11.30事件而言，C20:0组分在对
照/野生型中为0.62％，而在本发明的植物株系中降低约5.6倍(低至0.11％)。C22:0
组分降低约22/3倍：从缺乏去饱和酶基因的对照株系中的0.32％降低至d-9去饱和酶植
物株系中的0.12％。C24:0降低约42/3倍，从0.14％降低至0.03％。

[0244] 对于事件36(或36-11.19)，两个株系的C20:0、C22:0和C24:0含量分别为0.32、0.15和0.04以及0.30、0.14和0.07。与分别为0.64、0.42和0.21的对照相比，这些株系
C20:0的降低约为一半，C22:0和C24:0降低至少约为3倍。上文提到的第一个株系实际显
示出超过5×的C24:0降低。

[0245] 将很快显而易见，可以对本发明任一其他株系的这些优选脂肪酸任一组分进行大量类似的计算。这些展示不应理解为限制性，任一这种新的降低和比例均可用于定义本发
明。

[0246] 实施例12-其后世代的其他半种子数据

[0247] 其他半种子FAME分析公开于表16。该图表显示总饱和物在T3世代中低至2.64％，在T4世代中低至2.66％。表17显示了各个株系中存在的D-9去饱和酶基因拷贝
数(见表16的样品ID和表17的ID列)。下文实施例14和19中更详细地讨论了拷贝数
的影响。

[0248]

[0249]

[0250]

[0251]

[0252]

[0253] 实施例13-来自实施例12的半种子数据的其他分析以及显示脂肪酸转换、不饱和物提高和饱和物降低的其他数据

[0254] 绘出了来自T3大田试验的半种子数据以展示脂肪酸含量与“总饱和物”数据的多种比较。图6A和6B明确显示了与空白(非功能性插入片段的事件)和野生型对照(未转
化株系)相比，转基因事件中C16:0的降低和C16:1的提高。图6C和6D明确显示了与空
白和野生型对照相比，转基因事件中C18:0的降低和C18:1的提高。图6E和6F分别明确
显示了与空白和野生型对照相比，转基因事件中C20:0和C22:0的降低。

[0255] 在柱形图中还展示了使用如实施例4的讨论所获得的数据的类似结果。图6G和6H明确显示了与空白和野生型对照相比，转基因事件中C16:0的转换和降低以及C16:1的
转换和提高。图6I和6J明确显示了与空白和野生型对照相比，转基因事件中C18:0的转
换和降低以及C18:1的转换和提高。图6K和6L显示了C18:2和C18:3的相似柱形。

[0256] 上文所示图和图6M还明确展示了与已经非常优秀的Nex 710株系相比，总饱和物非常令人惊奇的降低。图6N显示了1000个种子的分布。

[0257] 实施例14-用多个Δ-9去饱和酶基因降低饱和脂肪水平

[0258] 来自温室和大田试验的结果提示在总饱和物降低与曲霉Δ-9去饱和酶拷贝数之间存在关系。

[0259] 14A：用于事件分选的FAME分析方案和转基因拷贝数的影响样品制备

[0260] 1.获得单个种子的重量并放在塑料母板中。

[0261] 2.在每个孔中加入2个1/8”的球

[0262] 3.将母板移至液体处理机Hamilton：

[0263] 加入400μL有IS(C11:0)和代用品(C15:0FAEE)的庚烷，接着加入100μL甲醇钠(.5N)

[0264] 4.用顶盖(strips caps)盖住板(inserts)，Geno研磨5分钟(1x@500)

[0265] 5.更换顶盖

[0266] 6.用橡皮垫对板加盖(额外密封)。用黑电工胶带包住盖并去除母板的底以暴露瓶。

[0267] 7.将板置于37℃/60rpm的涡旋/加热器上15分钟。(用沙子填充涡旋孔)

[0268] 8.以3500rpm将板离心2分钟。

[0269] 9.将底盖放回，除去盖/顶盖。使用Hamilton将350μl顶层转移至子板。

[0270] 10.接着在提取板中加入400μL含IS和代用品的庚烷。

[0271] 11.再重复步骤5至10两次(总共转移3次)

[0272] 12.在最后一次转移后将提取板保留在Hamilton上。将50μl提取物转移至玻璃片，所述玻璃片封固于含有450μl带C11的庚烷的铝砧中

[0273] 13.注入GC

[0274] GC/FID分析

[0275] GC参数：

[0276] 每个样品注入1ul无分流

[0277] 柱-

[0278] DB23，15米，内径0.25mm，膜厚度0.15μm

[0279] GC参数-

[0280] 烘箱温度程序-

[0281] 保持70℃2.15分钟(无分流)

[0282] 70℃-150℃@25℃-分钟，

[0283] 150℃-180℃@5℃-分钟，

[0284] 180℃-220℃@25℃-分钟，

[0285] 保持220℃2分钟

[0286] 注射器温度-230℃

[0287] 检测器温度-240℃

[0288] 补充气-氮气@25mL/分钟

[0289] FID燃料-空气@400mL/分钟，

[0290] 氢@40mL/分钟

[0291] 前注射器：清洗时间1分钟

[0292] 清洗流速35ml/分钟

[0293] 后注射器：清洗时间2.15分钟

[0294] 清洗气流35ml/分钟

[0295] 前入口压力：1.0mL/分钟-恒流

[0296] 后入口压力：1.0mL/分钟-恒流

[0297] 运行时间-14.95分钟

[0298] 流速-氦恒流@1mL/分钟

[0299] 采集序列

[0300] 在前柱和后柱之间分离96个样品，以使尾管的造型最小化。用对应于注入样品类型的5种注入方法建立样品列表。注入的前5种样品均为：

[0301] 1.基质

[0302] 2.基质

[0303] 3.标准品1

[0304] 4.芸苔阳性对照

[0305] 5.试剂空白

[0306] 6-27.芸苔样品

[0307] 33.标准品2

[0308] 34-54.芸苔样品

[0309] 55.标准品3

[0310] 每个列表包含3个事件的16个样品(48个样品)。

[0311] 标准品含有25ppm FAMES，总分布如下：

[0312]

[0313]

[0314] 14B：估计拷贝数的初步DNA印迹分析

[0315] 用于这些目的的DNA制备方案如下。用HindIII消化约6微克DNA，将消化的DNA在0.75％琼脂糖凝胶上电泳。印迹到带正电的尼龙膜上并按典型方案杂交(Maniatis，Roche Applied Science，Inc.)。探针由用DIG标记的(试剂盒来自Roche Applied Science，
Inc.)的来自曲霉Δ-9去饱和酶基因的PCR产物组成。用室温的2XSSC/0.1％SDS 5分钟
洗涤2次，接着用65℃0.1XSSC/0.1％SDS洗涤2次。用DIG发光检测试剂盒按照生产商
的指导(Roche Applied Science，Inc.)使杂交条带显现。计数杂交条带，如果显示1至3
个条带，则转基因样品最初描述为“简单的”，如果显示多于3个条带，则描述为“复杂的”。

[0316] 14C：转基因事件中转基因拷贝数与饱和脂肪酸降低的比较

[0317] 在表中应用以下定义：

[0318]

[0319]

[0320]

[0321]

[0322]

[0323] “饱和物降低比”用于对事件排序，因为它一般使用来自同一转基因事件的种子。这种直接比较帮助降低了由不同时间的组织培养和植物培养导致的植物间的差异。

[0324] 以上数据显示了表观基因剂量效应，更多拷贝的转基因倾向于引起更有效的饱和脂肪酸降低。例如，以上展示了57个“非对照”植物。这57个植物可以分为三组，每组19
个植物。第一组植物(显示最佳的饱和物降低和最低水平的饱和物)19个中有11个“复
杂”事件(多于3个拷贝的去饱和酶基因)。该组在19个中含有8个表征为“简单”或“可
能简单”的事件。中间组的19个植物在19个中仅有6个“复杂”事件(19个中有13个“简
单”或“可能简单”事件)。另外，第三组的19个植物(显示饱和物相对最低的降低)仅含
有3个复合事件，19个事件中的16个为“简单”或“可能简单”事件。因此，细胞中含有多于3个拷贝的去饱和酶的植物似乎显示了比细胞仅具有1个基因拷贝的植物更好的饱和物
降低。

[0325] 实施例15-油酸和11-十八碳烯酸的分离

[0326] 11-十八碳烯酸是在Δ-11位置具有双键的C18:1。11-十八碳烯酸通过在质体外延长Δ-9 C16:1而形成。以下是非常重要的，因为本文讨论的其他分析方法将油酸和
11-十八碳烯酸峰组合在一起作为标记为“油酸”的单个百分比组成。即，除非另有说明，二者是不分离的。通过扣除11-十八碳烯酸的贡献，目前证明油酸的贡献百分比优选并有利
地(并且令人惊奇地)维持在低于80％，而仍能实现降低总饱和物(至“无饱和”或“低饱
和”水平)。使用两种类型的分析证明这一点，如以下两个实施例所述。

[0327] 实施例16-芸苔Δ-9种子提取和11-十八碳烯酸SOP的分析

[0328] 图7A和7B展示了使用以下方案获得的数据。

[0329] 样品制备(与上文相同)

[0330] 1.获得单个种子的重量并放在塑料母板中。

[0331] 2.在每个孔中加入2个1/8”的球

[0332] 3.将母板移至液体处理机Hamilton：

[0333] 加入400μL有IS(C11:0)和代用品(C15:0 FAEE)的庚烷，接着加入100μL甲醇钠(.5N)

[0334] 4.用顶盖盖住板，Geno研磨5分钟(1x@500)

[0335] 5.更换顶盖

[0336] 6.用橡皮垫对板加盖(额外密封)。用黑电工胶带包住盖并去除母板的底以暴露瓶。

[0337] 7.将板置于37℃/60rpm的涡旋/加热器上15分钟。(用玻璃珠填充涡旋孔)

[0338] 8.以3500rpm将板离心2分钟。

[0339] 9.将底盖放回，除去盖/顶盖。使用Hamilton将350μl顶层转移至子板。

[0340] 10.接着在提取板中加入400μL含IS和代用品的庚烷。

[0341] 11.再重复步骤5至10两次(总共转移3次)

[0342] 12.在最后一次转移后将提取板保留在Hamilton上。将50μl提取物转移至玻璃片，所述玻璃片封固于含有450μl带IS C11的庚烷的铝砧中

[0343] 13.注入GC

[0344] GC/FID分析(与FAME谱不同)

[0345] GC参数：

[0346] 每个样品注入1ul无分流

[0347] 柱-

[0348] 来自SGE的BPX 70，15米，内径0.25mm，膜厚度0.25μm

[0349] GC参数-

[0350] 烘箱温度程序-

[0351] 保持70℃2.15分钟(无分流)

[0352] 70℃-140℃@25℃-分钟

[0353] 140℃保持14分钟

[0354] 140℃-180℃@10℃-分钟，

[0355] 18℃保持3分钟

[0356] 180℃-220℃@25℃-分钟，

[0357] 220℃保持3分钟

[0358] 注射器温度-230°℃

[0359] 检测器温度-240℃

[0360] 补充气-氮气@25mL/分钟

[0361] FID燃料-空气@400mL/分钟，

[0362] 氢@40mL/分钟

[0363] 前注射器：清洗时间1分钟

[0364] 清洗流速35ml/分钟

[0365] 后注射器：清洗时间2.15分钟

[0366] 清洗气流35ml/分钟

[0367] 前入口压力：1.0mL/分钟-恒流

[0368] 后入口压力：1.0mL/分钟-恒流

[0369] 运行时间-30.55分钟

[0370] 流量-氦恒流@1mL/分钟

[0371] 采集序列

[0372] 在前柱和后柱之间分离96个样品，以使尾管的造型最小化。用对应于注入样品类型的5种注入方法建立样品列表。注入的前5种样品均为：

[0373] 1.基质

[0374] 2.基质

[0375] 3.标准品1

[0376] 4.试剂空白

[0377] 5-32.芸苔样品

[0378] 33.标准品2

[0379] 34-54.芸苔样品

[0380] 55.标准品3

[0381] 每个列表包含6个事件的8个样品(1个种子＝一个样品)(48个样品)。

[0382] 标准品含有200ppm FAMES，总分布如下：

[0383]

[0384]

[0385] 实施例17-使用气相色谱/质谱/飞跃时间进行的11-十八碳烯酸贡献分析

[0386] 表21显示了使用以下方案获得的数据。在表21中，对于T4，脂类百分比未降低，在转基因株系中维持在40.8％(与对照株系相同)。

[0387]

[0388] 仪器说明

[0389] 来自Leco的飞行时间质谱仪Pegasus III，连接气相色谱HP 6890

[0390] 来自CTC Analytics technology的Combi Pal自动注射器，安装在具有10μl注射器的HP 6890。

[0391] GC方法

[0392] GC参数：

[0393] 每个样品注入1至3μl无分流

[0394] 柱-

[0395] SolGel Wax，30米，内径0.25mm，膜厚度0.25μm

[0396] GC参数-

[0397] 烘箱温度程序-

[0398] 70℃-175℃@25℃-分钟(无分流)

[0399] 175℃保持25分钟

[0400] 175℃-230℃@50℃-分钟，

[0401] 230℃保持3分钟

[0402] 注射器温度-230°℃

[0403] 转移线-300℃

[0404] 后注射器：清洗时间30秒

[0405] 清洗流速20ml/分钟

[0406] 后入口压力：2mL/分钟-恒流

[0407] 运行时间-33.3分钟

[0408] 流速-氦恒流@2mL/分钟

[0409] 质谱仪

[0410] 质量选择：

[0411] 选择50至600amu的质量

[0412] 灯丝偏压(filament bias)：-70V

[0413] 离子源：225℃

[0414] 检测器：

[0415] 检测电压：1600V

[0416] 采集率：10个光谱/秒

[0417] 溶剂延迟100秒

[0418] 断裂

[0419] ChromaTOF软件用于汇编断裂和去卷积共迁移峰以更好的分离和解释。

[0420] 通过保留时间和基于在相同条件注入的标准品溶液(见下文)的断裂匹配和/或与上述软件内包括的NIST/EPA/NIH数据库的良好匹配进行脂肪酸的鉴定。

[0421] 通过运行由来自Sigma(CAS：506-17-2)的11-十八碳烯酸产生的标准品，从芸苔种子提取物中鉴定11-十八碳烯酸甲酯(也称为顺11-十八碳烯酸甲酯)。保留时间为
1207秒，产生853个与标准品的匹配和814个与上述文库的匹配。

[0422] 注入标准品的组成：

[0423]

[0424] 11-十八碳烯酸甲酯方法：

[0425] 在甲基化100mg酸后获得甲基化产物：

[0426] -100mg溶于30ml玻璃瓶中的5ml MeOHCl 0.5N(Supelco)中

[0427] -在氮气中以70℃加热1小时

[0428] -冷却至室温后，加入5ml含有0.9％NaCl的水。

[0429] -用三次连续的己烷萃取(15ml)，使酯分配到己烷中

[0430] -通过使有机相与15ml含有2.5％HNaCO3的水混合来中和酸残留

[0431] -RT下在N2中蒸发有机层，以获得对应于11-十八碳烯酸甲酯的透明油层

[0432] 实施例18-在保留优良农学性状的同时获得“无饱和”

[0433] 在多个大田位置进行农学测量，比较转基因和对照。结论为总体上转基因植物的行为与Nex 710对照相似，并显示类似的性状(除了更为改善的饱和物水平以外)。因此，
本发明的转基因对植物健康没有持续的负影响。表23中提供了性状和评分系统的概述。在
多个大田位置使用多种标准。

[0434] 表24-27以数字展示了一些代表性结果。在这些图表中使用以下缩写： DTF＝至开花天数 EOF＝至开花结束天数 HT＝高度 SC＝不育数 DTM＝
至成熟天数 LSV＝晚季活力 LOD＝倒伏 SD WT＝种子重量

[0435]

[0436] 表24显示来自事件号218-11.30的株系的农学数据。表25显示来自事件号36-11.19的株系的农学数据。表26显示来自事件号69-11.19的株系的农学数据。以上证
明可以实践本发明，即获得“无饱和”芸苔，而不对其他重要的农学性状产生不利影响。

[0437]

[0438]

[0439]

[0440]

[0441] 实施例19-剂量效应；通过插入多个拷贝的δ-9去饱和酶基因进一步降低饱和物

[0442] 该实施例进一步显示“叠加”多个拷贝的δ-9去饱和酶基因具有令人惊奇的剂量效ccc应，所述剂量效应可用于甚至进一步降低油料种子植物(如芸苔)的饱和物。除非
另有说明，以下为使用FAME方法测量的温室数据。

[0443] 表27报道了来自天然Nex 710、简单事件(218、36、69)的F3 10种子批量脂肪酸数据，以及从每个F3种子包回溯至基于InVader测定选择的F2植物的数据。(表27的后
两列显示了与Nex 710对照相比，各个植物的近似平均总饱和物和总饱和物的近似平均降
低。)在该世代中未使用Southern数据。因此，基于饱和物表达和InVader测定，通过种植
F3植物并使用Southern重新测试对选择的可能的叠加和可能的亲本同胞以及空白进行再
确认。

[0444] 例如，虽然未进行统计学分析，来自41个“叠加”株系的样品具有平均3.5％的总饱和物。21个“单个”株系具有平均3.84％的总饱和物。

[0445] 表28包含再次种植以确认拷贝数和接合性的可能的F3叠加、可能的亲本同胞和空白的概述。名为TDN0400141、TDN0400142、TDN0400145、TDN0400155、TDN0400158
和TDN0400160的株系可能为纯合叠加。株系TDN0400189、TDN0400143、TDN0400197、
TDN0400167和TDN0400184可能为叠加的亲本同胞。株系TDN0400198、TDN0400199为叠加
自交产生的空白。TDN0400202、TDN0400204和TDN0400208为简单事件。该材料目前仍在
大田中或最近收获。因此尚未提供大田数据。

[0446] 图8和9是用来自F3植物的DNA进行的两个凝胶电泳。在这一步骤中遇到了与分离用于Southern分析的DNA相似的问题，所以凝胶中未显示提交的所有9个植物。基于
凝胶，株系TDN0400141、TDN0400142和可能的TDN0400158(仅有2个植物)为纯合叠加。
TDN0400145对事件36仍然分离，TDN0400155对事件69仍然分离。株系TDN0400160似乎
具有奇怪的分离条带，可能说明对3个简单事件都分离。对TDN0400160进行追踪观察。该
杂交的8号植物具有2.6％的低饱和水平，与高接合性的三重叠加一致。额外的分子分析
可以证明这一点。凝胶中没有显示所有可能为亲本同胞的株系(表29中事件栏中突出显
示的株系TDN0400184、TDN0400189和TDN0400197，在下文讨论)。基于单个植物脂肪酸数
据，似乎来自TDN0400184(可能为单个事件218的近交)的9个植物具有与可能的叠加一
样低的饱和水平。即，数据的倾向为与“近交”(sibbed-out)事件(从两个转基因事件的杂交回收的单个转基因事件)相比，叠加始终显示饱和物的降低。

[0447] 表29含有来自Nex 710、简单事件和每个单个F4植物的10种子批量脂肪酸数据。再培养了每种可能叠加、空白、单纯事件等的9个植物，采样组织用于分子分析并保存至结实用于脂肪酸分析。

[0448]

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