对合成磷脂的需要不断增加，部分地是由于它们在脂质体中的应用， 其已经成为活性治疗剂、酶、抗生素、抗原和激素以及其它化合物的有用 载体(Tyrell，等1976)。认为阳离子脂质体是辅助向细胞输送阴离子物质、 例如基因或其它核酸的重要方式(Miller，1998)。认为阳离子脂质体与带负 电荷的核酸序列通过静电相互作用来形成复合物，其促进这些试剂进入细 胞中。因而，在治疗疾病时，阳离子脂质可以在将阴离子试剂输送进患者 的靶细胞和器官中起作用。结果，已经需要开发结构明确的脂质的新的合 成方法(Bhattacharya等1999)。
本发明涉及阳离子心磷脂，其用于通过促进跨膜转运或通过增强向生 物表面的粘附来提高生物活性剂、特别是多核苷酸、蛋白、肽和药物分子 的输送。更具体地，涉及含有铵基的阳离子心磷脂。有些生物活性物质不 需要进入细胞来发挥它们的生物作用，因为它们通过细胞表面受体作用于 细胞表面来起作用。但是，许多能在亚细胞或分子水平影响细胞功能的天 然生物分子和它们的类似物，包括蛋白和多核苷酸或外来物质，例如药物， 优选进入细胞中，以产生它们的作用。对于这些试剂，细胞膜成为了不可 透过的选择性屏障。
在DNA转染领域的一项重要进展是，发现某些脂质体或小泡形式的 合成的阳离子脂质，例如N-[1-(2，3-二油基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵氯 化物(DOTMA)，能自发地与DNA相互作用，形成脂质-DNA复合物，其 能与细胞膜的带负电荷的脂质相融合，导致DNA的摄入和表达(Felgner， 等1987)。熟知的LipofectinTM试剂(Bethesda Research Laboratories， Gaithersburg，MD)是用于将高度阴离子的多核苷酸输送进活组织培养细胞 中的有效试剂，其包含带正电荷的多核苷酸以形成复合物。在某种程度上， 认为阳离子脂质作为细胞转染剂的功效的原因是它们具有增强的细胞亲 合力，所述细胞中的许多在它们的膜表面具有高负电荷的区域。另外，包 含阳离子脂质的脂质聚集体上存在的正电荷使得该聚集体能结合聚阴离 子，特别是核酸。以该方法制备的脂质聚集体可以自发地与细胞表面上的 负电荷相互作用，与质膜融合，并将功能多核苷酸有效地输送进细胞中。
心磷脂(也称作双磷脂酰甘油)构成了一类复合的阴离子的磷脂，其典 型地从与高度代谢活性有关的组织的细胞膜中纯化，包括心脏和骨骼肌的 线粒体(Grunner等1985)。但是，已知的色谱纯化技术不能将心磷脂归为 离散的分子种类。结果，该组分在药物制剂中的应用已经受到限制，因为 得到的制剂不是均匀的。另外，该化合物是阴离子的，这限制了它在阳离 子脂质体中的应用。心磷脂和阴离子试剂之间的电荷排斥会影响其在许多 情况中的应用。
阳离子形式的心磷脂会吸引阴离子试剂，且对药物输送更有用。这样 的复合物还可以用于稳定胶束和脂质体中的疏水化合物。需要可以用于合 成阳离子心磷脂的新的合成方法。用于制备阳离子心磷脂的合成方法可以 用于制备化合物的均匀制剂。
需要新的合成方法，其可以用于制备大量的饱和的和不饱和的具有不 同脂肪酸链长的阳离子心磷脂种类。该方法能提高更多种阳离子心磷脂种 类的可利用性，并且能使可以用于开发新的含有活性剂的脂质体制剂的脂 类多样化，与目前可以获得的那些相比，其具有更多定义的组合物。
本发明提供了这样的方法和组合物。从这里提供的本发明的描述，本 发明的这些和其它优点、以及其它的发明特征将是明显的。
发明概述
本发明提供了阳离子心磷脂化合物和合成和使用它们的方法。更具体 地，本发明提供了含有阳离子心磷脂类似物的脂质体、含有阳离子心磷脂 类似物的药物组合物和使用这样的脂质体和组合物的方法，例如将活性药 物输送给患者。
本发明的阳离子心磷脂可以结合在脂质体或其它脂质制剂中，所述的 脂质体或其它脂质制剂还可以包含活性剂例如疏水的或亲水的药物，核 酸例如反义寡核苷酸或诊断剂。这样的脂质体可以用于治疗疾病，或用于 诊断和/或分析试验中。阳离子心磷脂能促进生物活性剂向细胞中的运输。 可以加工本发明的阳离子心磷脂化合物，以与生物活性剂形成脂质聚集 体，照此，可以用作细胞转染剂。
附图说明
图1显示了含有醚连接的烷基侧链的阳离子心磷脂类似物的合成。
图2、3和4显示了含有醚连接的烷基侧链的隔离物阳离子心磷脂类 似物的合成。
图5显示了含有醚连接的烷基侧链的隔离物阳离子心磷脂类似物的 合成。
图6显示了含有醚连接的烷基侧链的隔离物阳离子心磷脂变体、阳离 子心磷脂类似物的合成。
图7显示了含有醚连接的烷基侧链的阳离子心磷脂变体类似物的合 成。
图8显示了含有酯连接的烷基侧链的隔离物阳离子心磷脂类似物的 合成。
发明详述
本发明提供了包含在光学上纯的和/或非对映异构体的阳离子心磷脂 变体和类似物、以及它们的合成方法和应用。在一个实施方案中，本发明 提供了具有通式I或X的阳离子心磷脂变体和类似物和它们的合成方法：


在式I和X中，Z1和Z2可以相同或不同地为-O-C(O)-、-O-、-S-、 -NH-C(O)-等。另外，在式I和X中，R1，R2，R3和R4可以相同或不同， 且可以独立地为H、饱和的或不饱和的烷基、链烯基、或炔基(典型地， 但不是必须地，C1至C32)，其可以是任选地羟基化的、胺化的(aminenated)、 硫化的、环氧化的、环化的、聚乙二醇化的、卤化的、或用它们的组合取 代的。在式I和X中，R5和R6可以相同或不同，且可以独立地没有或含 有连接物，所述连接物含有烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基(典 型地C1至C32)或烷氧基例如含有1至500个PEG(聚乙二醇)单元的聚乙二 醇化的醚。
在式I和X中，R7可以是氢、烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷 氧基、环烷基、取代的环烷基、链烯基、炔基、烷酰基、烯酰基(alkenoyl)、 炔酰基(alkynoyl)，其可以是任选地羟基化的、胺化的、硫化的、环氧化 的、环化的、聚乙二醇化的、卤化的、或以它们的组合取代的；或烷氧基 或取代的烷氧基例如含有1至500个PEG(聚乙二醇)单元的聚乙二醇化的 醚；氨基酸、肽、肽模拟部分(peptidomimetic moiety)、二肽、多肽、蛋 白质、碳水化合物、糖或多糖、多胺、杂环化合物、核苷、或多核苷酸或 其它类似部分。在式X中，两个R7取代基可以相同或不同，且可以独立 地含有这样的部分。在式I和X中，R8基团可以相同或不同，且可以独 立地包含C1至C25饱和的或不饱和的烷基、烷氧基、取代的烷基、或取代 的烷氧基。式I和X中的″X″是无毒的阴离子，例如氯离子、溴离子、碘 离子等。
术语″烷基″包含饱和的或不饱和的直链和支链烃部分。术语″取代的 烷基″或″取代的烷氧基″等包含还携带一个或多个取代基的烷基或烷氧 基，所述取代基选自羟基，烷氧基(低级烷基的)，巯基(低级烷基的)，环 烷基，取代的环烷基，卤素，氰基，硝基，氨基，酰胺基(amido)，亚氨基， 硫代，-C(O)H，酰基，氧酰基，羧基等。术语″糖″是指任何天然存在的或非 天然的糖，例如葡萄糖、甘露糖、阿洛糖、核糖、岩藻糖、阿拉伯糖、半 乳糖、2-脱氧糖、3-脱氧糖、4-脱氧糖、二糖和多糖。术语″氨基酸″指任 何天然存在的或非天然的氨基酸。该定义意在包含取代的α-氨基酸和非α- 氨基酸。α-氨基酸是定义为这样的氨基酸，其中氨基是连接到临近羧酸基 团的碳原子上。术语″核苷酸序列″指任意一种或多种多核苷酸或多核苷酸 片段或构建体(例如，DNA或RNA寡聚体，mRNA或pDNA)。核苷酸序 列可以是线性的、环状的(例如，质粒)或分支形式以及双链或单链形式。 核苷酸序列可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如，酰胺键，例如 出现在肽核酸(PNA)中)。术语″肽″指含有通过肽键连接的两个或多个氨基 酸的分子。″肽键″或″肽连接″是一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基 之间去除一个水分子形成的共价键，且具有化学结构-C(O)-NR-，其中R 是H、C1至C15烷基。术语″多肽″指通过肽键连接的超过9个氨基酸的聚 合物。术语″蛋白″指高分子量的氨基酸多肽，包括但不限于激素、抗体和 某些抗原(Wheeler，Carl，J.专利号WO 00/73263A1)。
在优选的实施方案中，式I和X中的R1，R2，R3和R4相同或不同地 为H、或C1至C32烷基、链烯基、炔基，它们是任选地羟基化的、胺化 的、硫化的、环氧化的、环化的、聚乙二醇化的或卤化的。另外，在优选 的实施方案中，式I和X中的R5和R6相同或不同地为连接物，其含有 C1至C32烷基或烷氧基例如含有1至500个PEG单元的聚乙二醇化的醚。 另外，在优选的实施方案中，在式I和X中的R7取代基是氢、烷基、取 代的烷基、环烷基、取代的环烷基、肽、二肽、多肽、蛋白质、碳水化合 物、多糖、杂环化合物、核苷、或多核苷酸。
在其它优选的实施方案中，式I和X中的R5，R6，R7和R8中的至少 一个包含任选取代的烷基或任选取代的烷氧基。例如，式I和X中的R5 或R6中的至少一个(或二者)可以含有任选取代的聚烷氧基，其含有1至 500个烷氧基，例如1至100个烷氧基。实际上，在优选的实施方案中， 式I和X中的R7和R8中的至少一个包含任选取代的烷基，且R5和R6包 含任选取代的聚烷氧基。在一个特别优选的实施方案中，在式I和X中， 至少一个R5和/或R6(或全部R5和/或R6取代基)是乙氧基(单PEG)。
在另一个优选的实施方案中，在式I和X中，R7取代基是氨基酸、 叶酸、糖、肽、多糖、多肽、蛋白质、多胺、或肽模拟部分。例如，在式 I和X中，优选的R7取代基是组蛋白、精胺、亚精胺、或其衍生物。在 式I和X中，另一个优选的R7取代基是作为O-糖苷或C-糖苷结合的糖 类，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、核糖、阿拉伯糖、阿洛糖、岩藻糖、 2-脱氧糖等。在其它优选的实施方案中，在式I和X中，R7取代基可以 包括在侧链上具有带正电荷的基团的L-或D-α氨基酸，例如，精氨酸、 组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、或其类似物。另外，在优选的实施方案中，在 式I和X中，R7取代基包含带有一个或多个正电荷的氨基酸、糖类、肽、 多糖、多肽、蛋白质、多胺、或肽模拟部分。关于式X，其具有2个R7 取代基，它们可以相同或不同，且可以独立地含有这样的基团。
在优选的实施方案中，在式I和X中，R8基团是CH3。在其它优选的 实施方案中，在式I和X中，至少一个R5，R6，R7和R8包含取代的烷基 或取代的烷氧基。在最优选的实施方案中，在式I和X中，Z1和Z2是 -O-C(O)-或-O-。R1，R2，R3和R4是相同的，为C1至C32饱和的和/或不 饱和的烷基、优选10至24个碳原子。在式I和X中，″X″最优选地为氯 离子或溴离子。
在优选的根据通式I的化合物中，R5和R6不存在；R7是氢；R8是CH3； X是溴离子；Z1和Z2是氧；它是具有结构II的阳离子心磷脂醚：

其中，R1，R2，R3和R4相同或不同地为H、C1至C32烷基、链烯基、 炔基；
在另一个优选的根据通式I的化合物中，R5和R6不存在；R7是氢； R8是CH3；X是溴离子；Z1和Z2是-O-C(O)-；它是具有结构III的阳离子 心磷脂酯：

其中，R1，R2，R3和R4相同或不同地为H、C1至C31烷基、链烯基、 炔基。
在另一个优选的根据通式I的化合物中，R5不存在；R6是OCH2CH2； R7是氢；R8是CH3，X是溴离子；Z1和Z2是氧；它是具有结构IV的阳离 子心磷脂醚类似物：

其中，R1，R2，R3和R4相同或不同地为H、C1至C32烷基、链烯基、 炔基。
在另一个优选的根据通式I的化合物中，R5不存在；R6是OCH2CH2； R7是氢；R8是CH3，X是溴离子；Z1和Z2是-O-C(O)-；它是具有结构V 的阳离子心磷脂酯类似物：

其中，R1，R2，R3和R4相同或不同地为H、C1至C31烷基、链烯基、 炔基。
在另一个优选的根据通式I的化合物中，R5是OCH2CH2；R6不存在； R7是氢；R8是CH3，X是溴离子；Z1和Z2是氧；它是具有结构VI的阳离 子心磷脂醚类似物：

其中，R1，R2，R3和R4相同或不同地为H、C1至C32烷基、链烯基、 炔基。
在另一个优选的根据通式I的化合物中，R5是OCH2CH2；R6不存在； R7是氢；R8是CH3，X是溴离子；Z1和Z2是-O-C(O)-；它是具有结构VII 的阳离子心磷脂酯类似物：

其中，R1，R2，R3和R4相同或不同地为H、C1至C31烷基、链烯基、 炔基。
在另一个优选的根据通式I的化合物中，R5和R6是OCH2CH2；R7是 氢；R8是CH3，X是溴离子；Z1和Z2是氧；它是具有结构VIII的阳离子 心磷脂醚：

其中，R1，R2，R3和R4相同或不同地为H、C1至C32烷基、链烯基、 炔基。
在另一个优选的根据通式I的化合物中，R5和R6是OCH2CH2；R7是 氢；R8是CH3，X是溴离子；Z1和Z2是-O-C(O)-；它是具有结构IX的阳 离子心磷脂酯：

其中，R1，R2，R3和R4相同或不同地为H、C1至C31烷基、链烯基、 炔基。
在一个优选的根据通式X的化合物中，R5和R6不存在；R7是氢；X 是溴离子；R8是CH3，Z1和Z2是氧；它是具有结构XI的阳离子心磷脂变 体醚：

其中，R1，R2，R3和R4相同或不同地为H、C1至C32烷基、链烯基、 炔基。
在另一个优选的根据通式X的化合物中，R5和R6不存在；R7是氢； X是溴离子；R8是CH3，Z1和Z2是-O-C(O)-；它是具有结构XII的阳离 子心磷脂变体酯：

其中，R1，R2，R3和R4相同或不同地为H、C1至C31烷基、链烯基、 炔基。
在另一个实施方案中，本发明提供了具有通式XIII的阳离子心磷脂：

在式XIII的化合物中，R1，R2，R3，R4，R5和R6，X，Z1和Z2可以 是如上面关于式I和X所述。而且，在式XIII中，R7，R9，R10和R11可 以是如上面关于式I和X中的R7所述。在式XIII中，R8是烷基、取代的 烷基、链烯基、取代的链烯基、烷氧基或取代的烷氧基、优选C2-C32。
在一个优选的根据通式XIII的化合物中，R5和R6不存在，R8是丙基； R7，R9，R10和R11是氢；Z1和Z2是氧；X是氯化物；它是具有结构XIV 的阳离子心磷脂变体醚：

其中，R1，R2，R3和R4相同或不同地为H、C1至C32烷基、链烯基、 炔基。
在另一个优选的根据通式XIII的化合物中，R5和R6不存在，R8是丙 基；R7，R9，R10和R11是氢；Z1和Z2是-O-C(O)-；X是氯化物；它是具 有结构XV的阳离子心磷脂变体酯：

其中，R1，R2，R3和R4相同或不同地为H、C1至C31烷基、链烯基、 炔基。
根据本发明的阳离子心磷脂分子可以包含具有不同长度和饱和/不饱 和的脂肪酸/烷基链(例如，在R1，R2，R3和R4)。通常，脂肪酸烃链的长 度为约2至约32个碳原子；但是，碳链更典型地是约10至约24个碳原 子(例如14至20碳原子)。脂肪酸典型地根据烃链中的双键和/或三键的数 目(即不饱和度)来分类。饱和脂肪酸不含有任何双键或三键，且链中的每 个碳上结合有最大数目的氢原子。脂肪酸的不饱和程度依赖于烃链中的双 键或三键的数目。在这方面，单不饱和脂肪酸含有一个双键，而多不饱和 脂肪酸含有2个或多个双键(参见，例如，Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology，修改版，A.D.Smith(编)，Oxford University Press(2000)和Molecular Biology of the Cell，第3版，B.A.Alberts(编)， Garland Publishing，New York(1994))。
无论短的或还是长的，本发明的阳离子心磷脂的脂肪酸链还可以是饱 和的或不饱和的。优选的脂肪酸的碳链长为约C1至C32，优选约C4至约 C24，且包括丁酸(C4:0)，戊酸(C5:0)，己酸(C6:0)，庚酸(C7:0)，辛酸(Cs:0)，壬酸 (C9:0)，癸酸(C10:0)，十一烷酸(C11:0)，十二烷酸(C12:0)，十三烷酸(C13:0)，十 四烷酸(肉豆蔻酸)(C14:0)，十五烷酸(C15:0)，十六烷酸(棕榈酸)(C16:0)，十 七烷酸(C17:0)，十八烷酸(硬脂酸)(C18:0)，十九烷酸(C19:0)，二十烷酸(花 生酸)(C20:0)，二十一烷酸(C21:0)，二十二烷酸(山萮酸)(C22:0)，二十三烷 酸(C23:0)，二十四烷酸(C24:0)，10-十一碳烯酸(C11:1)，11-十二碳烯酸(C12:1)， 12-十三碳烯酸(C13:1)，肉豆寇脑酸(C14:1)，10-十五碳烯酸(C15:1)，棕榈油酸 (C16:1)，油酸(C18:1)，亚油酸(C18:2)，亚麻酸(C18:3)，二十碳烯酸(C20:1)，二十 碳二烯酸(eicosdienoic acid)(C20:2)，二十碳三烯酸(C20:3)，花生四烯酸(顺 式-5，8，11，14-二十碳四烯酸)和顺式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸，除了别的 以外。关于醚类似物，烷基链的范围是C1至C32，优选约C4至约C24。其 它的脂肪酸链也可以用作R1和/或R2，R3和/或R4取代基。这样的实例包 括饱和脂肪酸，例如乙酸(或乙酸)，丙酸(或propionic acid)，丁酸(或 butyric acid)，二十六酸(或蜡酸)，二十八酸(或褐煤酸)，三十烷酸(或 蜂花酸)，三十二烷酸(或紫胶蜡酸)，三十四酸，三十五酸(或ceroplastic acid)等；单烯的不饱和脂肪酸例如反式-2-丁烯酸(或巴豆酸)，顺式-2- 丁烯酸(或异巴豆酸)，2-己烯酸(或异己烯酸)，4-癸酸(或4-十碳烯酸)， 9-癸酸(或癸烯酸)，4-十二碳烯酸(或linderic acid)，5-十二碳烯酸(或 denticetic acid)，9-十二碳烯酸(或月桂烯酸)，4-十四碳烯酸(或粗租酸)，5- 十四碳烯酸(或抹香鲸酸)，6-十八碳烯酸(或petroselenic acid)，反式-9-十八 碳烯酸(或反油酸)，反式-11-十八碳烯酸(或牛痘酸)，9-二十碳烯酸(或顺9- 二十碳烯酸)，11-二十碳烯酸(或巨头鲸鱼酸)，11-二十二烯酸(或鲸蜡烯酸)， 13-二十二烯酸(或芥酸)，15-二十四碳烯酸(或神经酸)，17-二十六碳烯酸 (或西门木烯酸)，21-三十碳烯酸(或lumequeic acid)，等；二烯的不饱和脂肪 酸例如2，4-戊二烯酸(或β-乙烯基丙烯酸)，2，4-己二烯酸(或山梨酸)，2，4-癸 二烯酸(或乌桕酸)，2，4-十二碳二烯酸，9，12-十六碳二烯酸，顺式-9，顺式 -12-十八碳二烯酸(或α-亚油酸)，反式-9，反式-12-十八碳二烯酸(或 linlolelaidic acid)，反式-10，反式-12-十八碳二烯酸，11，14-二十碳二烯酸， 13，16-二十二碳二烯酸，17，20-二十六碳二烯酸等；三烯的不饱和脂肪酸例 如6，10，14-十六碳三烯酸(或hiragonic acid)，7，10，13-十六碳三烯酸，顺式-6， 顺式-9-顺式-12-十八碳三烯酸(或γ-亚油酸)，反式-8，反式-10-反式-12-十八 碳三烯酸(或β-十八碳三烯酸)，顺式-8，反式-10-顺式-12-十八碳三烯酸，顺 式-9，顺式-12-顺式-15-十八碳三烯酸(或α-亚麻酸)，反式-9，反式-12-反式 -15-十八碳三烯酸(或α-亚麻酸)，顺式-9，反式-11-反式-13-十八碳三烯酸 (或α-桐酸)，反式-9，反式-11-反式-13-十八碳三烯酸(或α-桐酸)，顺式-9，反 式-11-顺式-13-十八碳三烯酸(或石榴油酸)，5，8，11-二十碳三烯酸，8，11，14- 二十碳三烯酸等；四烯的不饱和脂肪酸例如4，8，11，14-十六碳四烯酸， 6，9，12，15-十六碳四烯酸，4，8，12，15-十八碳四烯酸(或moroctic acid)， 6，9，12，15-十八碳四烯酸，9，11，13，15-十八碳四烯酸(或α-或β-十八碳四烯 酸)，9，12，15，18-十八碳四烯酸，4，8，12，16-二十碳四烯酸，6，10，14，18-二十碳 四烯酸，4，7，10，13-二十二碳四烯酸，7，10，13，16-二十二碳四烯酸， 8，12，16，19-二十二碳四烯酸等；五-和六-烯的不饱和脂肪酸例如 4，8，12，15，18-二十碳五烯酸(或二十碳五烯酸)，4，7，10，13，16-二十二碳五烯 酸，4，8，12，15，19-二十二碳五烯酸(或鰶鱼酸)，7，10，13，16，19-二十二碳五烯 酸，4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸，4，8，12，15，18，21-二十四碳六烯酸(或尼 生酸)等；支链的脂肪酸例如3-甲基丁酸(或异戊酸)，8-甲基十二烷酸，10- 甲基十一烷酸(或异月桂酸)，11-甲基十二烷酸(或异十一烷酸)，12-甲基十 三烷酸(或异肉豆蔻酸)，13-甲基十四烷酸(或异十五烷酸)，14-甲基十五烷 酸(或异棕榈酸)，15-甲基十六烷酸，10-甲基十七烷酸，16-甲基十七烷酸(或 异硬脂酸)，18-甲基十九烷酸(或异花生酸)，20-甲基二十一烷酸(或山萮酸)， 22-甲基二十三烷酸(或异二十四烷酸)，24-甲基二十五烷酸(或异蜡酸)，26- 甲基二十七烷酸(或isomonatonic acid)，2，4，6-三甲基二十八烷酸(或 mycoceranic或mycoserosic acid)，2-甲基-顺式-2-丁烯酸(当归酸)，2-甲基- 反式-2-丁烯酸(或顺芷酸)，4-甲基-3-戊烯酸(或pyroterebic acid)等。
本发明的阳离子心磷脂分子可以根据任何合适的方法制备，例如本领 域已知的方法。但是，典型地，它们属于2种一般的合成方法之一。在第 一种途径中，烃链通过醚键连接到甘油主链上。下面的实施例1-8(图1-7) 解释了这种合成途径。根据合成本发明的阳离子心磷脂的第2种途径，烃 链通过酯键连接到甘油主链上。下面的实施例9(图8)解释了这种合成途 径。本领域的技术人员能够明白，当在实施例中描述了具体化合物的合成 时，类似的反应方案也可以用于构建本发明的阳离子心磷脂分子，其例如 在R1，R2，R3，R4或其它取代基的性质上不同。
但是，制备后，本发明的阳离子心磷脂分子可以包含在组合物中，例 如脂质体制剂，复合物，乳剂，混悬液等。这样的制剂可以根据组合物的 类型通过任何合适的技术来制备，这是本领域的普通技术人员已知的。
这样的制剂可以包含除了本发明的阳离子心磷脂之外的成分，例如一 种或多种共脂质或生理上可接受的载体。为了定义的目的，术语″共脂质″ 指可以与阳离子心磷脂组合的任何疏水物质，其包括两亲的脂质，例如磷 脂和中性脂质，例如胆固醇和其它甾醇，以及这样的脂质溶解形式。共脂 质可以是任何天然的或合成的磷脂或单-、二-或三甘油。天然磷脂典型地 是来自动物和植物源的那些，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、 磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇。其它的合适的共脂质包括甾醇(例如胆固醇， 胆固醇的衍生物，粪醇，胆甾烷醇，胆甾烷，胆固醇半琥珀酸酯，胆固醇 硫酸酯和其混合物)和生育酚(例如α生育酚)。用于包含在本发明的组合物 中的其它的合适共脂质包括磷脂酰胆碱，例如二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二 硬脂酰磷脂酰胆碱、二油基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基-磷脂酰胆碱、二花 生四烯酰磷脂酰胆碱、卵磷脂酰胆碱、豆磷脂酰胆碱、氢化的豆磷脂酰胆 碱和其混合物。另外，其它已知的阳离子脂质例如N-[1-(2，3-二油基氧基) 丙基]-N，N，N-三甲基铵氯化物(DOTMA)或1，2-二油酰基氧基-3-(三甲基 氨)-丙烷(DOTAP)，可以包含在本发明的阳离子心磷脂组合物中。当包含 中性脂质时，阳离子脂类(包括本发明的阳离子心磷脂)与中性脂类的摩尔 比典型地为约9/1至约1/9。
除了本发明的阳离子心磷脂外，脂质体组合物、复合物、乳剂等可以 包括稳定剂、吸收促进剂、抗氧剂、磷脂、可生物降解的聚合物和医学活 性剂，除了其它成分外。在一些实施方案中，优选地，本发明的组合物、 特别是脂质体组合物包含靶向剂，例如能结合特异性底物的碳水化合物或 蛋白或其它配体，例如抗体(或其片段)或能识别细胞受体的配体。包含这 样的试剂(例如碳水化合物或一种或多种蛋白质，所述蛋白质选自由抗体、 抗体片段、肽、肽激素、受体配体例如细胞受体的抗体和其混合物组成的 组)，可以促进脂质体靶向预定的组织或细胞类型。
尽管本发明意图在任何合适类型的组合物中包括阳离子心磷脂，优选 的组合物是脂质体组合物或含有脂质囊的其它组合物。这样的组合物可以 包含单层的或多层的囊，或其混合物。可以用任何合适的技术来生产这样 的脂质体制剂。例如，可以将能形成亲脂的脂质体的成分，例如磷脂酰胆 碱、本发明的阳离子心磷脂、胆固醇和α-生育酚，溶解或分散到合适的溶 剂或溶剂的组合中，并干燥。合适的溶剂包括任何非极性的或轻微极性的 溶剂，例如叔丁醇、乙醇、甲醇、氯仿或丙酮，它们可以蒸发掉而不留下 任何药学上不可接受的残余物。可以通过任何合适的方法进行干燥，例如 通过冻干。可以将亲水的成分(例如一些药剂、防腐剂和其它试剂)溶解 到极性溶剂、包括水中，其可以在干燥前或在重构时与脂质相进行混合。 将干燥的亲脂成分与亲水的混合物混合可以形成脂质体。可以通过任何强 烈地均质化混合物的方法将极性溶液与干燥的脂质膜混合。涡流、磁力搅 拌和/或超声处理可以实现均质化。
当脂质体中含有活性剂时，它们可以溶解或分散在合适的溶剂中，并 在混合前添加到脂质体混合物中。典型地，将亲水的活性剂直接添加到极 性溶剂中，将疏水的活性剂添加到用于溶解其它成分的非极性溶剂中，但 这是不需要的。活性剂可以溶解在第3种溶剂或溶剂混合物中，并在均质 化混合物之前添加到极性溶剂与脂质膜的混合物中。
通常，脂质体可以是净中性的，负电荷或正电荷的。例如，可以从含 有磷脂酰胆碱、胆固醇、足够的硬脂胺以克服阳离子心磷脂的净正电荷的 溶液中形成阳离子脂质体。现在，可以从含有磷脂酰胆碱、胆固醇和本发 明的阳离子心磷脂类似物的溶液制备出带正电荷的脂质体。
根据制备它们的具体组合物和方法，本发明的脂质体可以是多层的或 单层的囊。脂质体可以制备成具有实质上均匀的在选定尺寸范围内的大 小，例如约1微米或更小，或约500nm或更小，约200nm或更小，或约 100nm或更小。一种有效的设定尺寸的方法包括：将脂质体的水性悬浮液 从一系列具有选定的均匀孔径大小的聚碳酸酯膜中挤出；膜的孔径大小大 致与穿过该膜挤出生成的脂质体的最大尺寸相对应。
可以给脂质体包裹可生物降解的聚合物例如蔗糖、表氯醇、分支的亲 水的蔗糖聚合物、聚乙二醇、聚乙烯醇、甲氧基聚乙二醇、乙氧基聚乙二 醇、聚环氧乙烷、聚氧乙烯、聚氧丙烯、乙酸纤维素、藻酸钠、N，N-二乙 基氨基乙酸酯、聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、聚 氧乙烯X-月桂醚，其中X是9至20，和聚氧乙烯脱水山梨醇酯。
脂质体(或其它脂质)组合物或制剂可以是任何理想的形式。例如，为 了药物用途，组合物可以是已经准备好施用给患者。当这样的组合物含有 脂质体或其它类型的脂质囊时，这样的制剂典型地是在水性介质中的微囊 形式。或者，制剂可以是干燥的或冻干的形式，在该情况下，组合物优选 地还包含冷冻保护剂。合适的冷冻保护剂包括，例如，糖类例如海藻糖、 麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖和葡聚糖，从性能看，最优选的糖是海藻糖 和蔗糖。还可以使用其它更复杂的糖，例如，氨基糖苷，包括链霉素和二 氢链霉素。
抗氧剂可以包含在包括本发明的阳离子心磷脂的脂质体或其它脂质 制剂中。合适的抗氧剂包括化合物例如抗坏血酸、生育酚和deteroxime mesylate。吸收促进剂可以包含在脂质制剂中。合适的吸收促进剂包括水 杨酸钠-鹅去氧胆酸钠、去氧胆酸钠、聚氧乙烯9-月桂醚、鹅去氧胆酸盐- 去氧胆酸盐和聚氧乙烯9-月桂醚、甘油一油酸酯、牛磺-24，25-二氢夫西地 酸钠(Na taruo-24，25-dihydrofusidate)、牛磺去氧胆酸钠、甘氨鹅去氧胆 酸钠(Na glycochenodeoxycholate)、油酸、亚油酸和亚麻酸。还可以包含 聚合的吸收促进剂，例如聚氧乙烯醚、聚氧乙烯脱水山梨醇酯、聚氧乙烯 10-月桂醚、聚氧乙烯16-月桂醚、氮酮(1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮)。
包含本发明的阳离子心磷脂的根据本发明的组合物可以用于多种用 途，例如将肽、多肽、蛋白质、核苷酸、多核苷酸、小分子、或其它试剂 体内地或体外地输送给人或动物(典型地脊椎动物)患者、植物或培养的细 胞。可以以任何方法使用组合物，例如，包括使用脂质体或脂质囊体内地 或体外地胞内输送物质(Felgner等美国专利号5,264,618)。组合物还可以 以化妆品方式使用，例如，作为皮肤病学制品。因此，可以根据目标最终 用途来配制组合物。
为了应用于人或动物患者，组合物优选地包含一种或多种生理上(或 药学上)可接受的介质或载体。可以使用任何这样的介质，例如通常用于 脂质制剂中的那些。因此，本发明提供了药物制剂，其含有本发明的阳离 子心磷脂(例如如所述配制的)和药学上可接受的载体或介质。
相信根据本发明的化合物会赋予患者有益效果，且可以例如抵抗老 化、癌症、心脏病等的影响。因此，可以有益地使用本发明的药物制剂来 治疗某些个体，无需包含其它的药物。但是，本发明的药物制剂可以包含 药理学上有效量的一种或多种治疗剂。在该意义上，治疗剂的有效量是在 给人或动物应用该组合物后适合提供治疗效果的量。特定治疗剂的有效量 取决于该试剂，但是在本发明的组合物中使用的有效量的确定属于本领域 的常识。
在一个实施方案中，药物制剂可以包括作为活性剂的治疗有效量的核 苷类似物或核苷酸类似物。合适的核苷类似物或核苷酸类似物的实例包括 具有抗病毒作用的核苷或核苷酸类似物，例如二脱氧核苷酸、二脱氢核 苷酸、核苷的卤化的或叠氮基衍生物和无环的核苷。例如，具有卤素-取 代的嘌呤或嘧啶环的核苷或核苷酸类似物，例如5-三氟甲基-2′-脱氧尿苷 或5-氟尿嘧啶；具有卤素-和叠氮基取代的核糖部分的核苷或核苷酸类似 物，例如3′-叠氮基-3′脱氧胸苷(AZT)，具有取代核糖部分上的氧的碳的核 苷类似物(碳环核苷)，或具有无环的戊糖的核苷酸类似物，例如无环鸟苷 或丙氧鸟苷(gancyclovir)(DHPG)可以合适地包含在组合物中。这种类似 物的脂质体输送是本领域已知的(Hosteter等美国专利号5,223,263)，本发 明的组合物可以合适地用于将这样的试剂输送给能够从这样的治疗中获 益的患者。当将它们作为磷脂衍生物呈递给细胞时，发现这些类似物的抗 病毒效力有所提高。这些衍生物可以整合进用于施用给细胞的脂质体结构 中，由此形成更稳定的脂质体复合物，其可以将更大量的药物输送给靶细 胞，且具有更低的毒性。核苷类似物的有效的抗病毒脂质衍生物包括磷脂 酰2′，3′-二脱氧核苷，2′，3′-二脱氢核苷，3′-叠氮基-2′-脱氧核苷，3′-氟脱氧核 苷和3′-氟二脱氧核苷，9-β-D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤(araA)，1-β-D-阿拉伯呋 喃糖胞苷(araC)，核苷例如具有无环的核糖基团的无环鸟苷和丙氧鸟苷， 或与二甘油二磷酸酯衍生物相同的核苷类似物。用于使用阳离子脂质介导 的脂质体输送治疗HIV感染的抗病毒的或抗逆转录病毒的核苷类似物的 脂质衍生物的优选种类是3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧嘧啶的3′-磷脂衍生物、3′- 卤代嘧啶二脱氧核苷、或2′，3′-二脱氢-2′，3′-二脱氧核苷，例如磷脂酰3′- 叠氮基-3′脱氧胸苷(pAZT)或磷脂酰2-氯脱氧腺苷。使用含有无环鸟苷、 丙氧鸟苷、1-(2-脱氧-2′-氟-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘胞嘧啶(FIAC)或 1-(2′-脱氧-2′-氟-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基)5-碘尿嘧啶(FIAU)的核苷类似物， 可以有效地治疗某些病毒感染，包括疱疹、巨细胞病毒和乙肝感染。使用 根据本发明的阳离子脂质脂质体输送系统，可以将这些试剂的磷脂衍生 物、优选磷脂酰和二甘油二磷酸酯衍生物施用于这些疾病。已经报道了抗 病毒核苷的脂质衍生物的结构、合成和脂质体输送的细节(Hostetler等美 国专利号6,448,392)，本发明的组合物可以合适地用于将这样试剂输送给 能从这样的治疗获益的患者。
在另一个实施方案中，药物制剂可以包含作为活性剂的治疗有效量的 皮质类固醇或非甾族的抗炎剂。其它合适的活性剂包括生物活性脂质，例 如，1-O-十八烷基-2-O-甲基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱。其它合适的活性剂包 括药物，例如抗癌药和局部的抗生素例如克林霉素，妥布霉素，新霉素，庆 大霉素，四环素，红霉素；抗真菌药，例如克霉唑，咪康唑，nystain， lactoconazole，益康唑和托萘酯；用于治疗痤疮的视黄酸；和用于治疗单 纯疱疹的试剂，和包括抗病毒的核苷类似物例如无环鸟苷和丙氧鸟苷。这 些核苷类似物制剂优选地含有抗病毒剂的脂质衍生物，特别是如(Felgner 等，美国专利号5,459,127)所述的磷脂酰甘油衍生物，照此可以整合在含 有一种或多种本发明的阳离子心磷脂类似物的脂质体或其它制剂中。其它 合适的活性剂的实例包括抗真菌药、氧化剂、蛋白质、多肽和治疗性多核 苷酸。优选的蛋白质包括，例如，抗体例如单克隆抗体或其片段。
适用于阳离子脂质介导的输送的治疗上重要的多核苷酸是不同工艺 的带负电荷的新寡核苷酸，包括用于消除或减少基因产物生成的反义多核 苷酸序列(Ts′o等1987)。这些寡核苷酸种类中的许多是稀有的、且合成昂 贵，根据普通的现有技术，不能有效地包封到带负电荷的脂质的脂质体中。
治疗性多核苷酸的实例包括核酶、干扰RNA(RNAi)、反义RNA或 DNA序列，其可以定位到细胞中的目标序列，例如与疾病状态有关的基 因(例如，致癌基因或病毒基因)。用于定位到目标基因的优选的治疗性多 核苷酸是10至30-mer的反义多核苷酸，优选15-mer的序列，例如，对 c-raf基因靶向的(参见，例如美国专利6,126,965，其公开了具有序列 5′-GTGCTCCATTGATGC-3′的15-mer抗c-raf-1寡核苷酸)。当组合物中含 有寡核苷酸时，它们优选地含有一个或多个硫代磷酸连接，优选2个硫代 磷酸连接。最优选地，包含在本发明的组合物中的寡核苷酸在每个末端含 有1个硫代磷酸连接，但是它们可以存在于从寡核苷酸的一个末端至另一 个末端的任何位置(例如，在末端之间)。治疗性核酶、干扰RNA(RNAi) 反义RNA或DNA序列定位的其它优选的基因包括病毒基因，特别是HIV 基因，例如rev反式激活蛋白。在其它实施方案中，治疗性多核苷酸可以 是这样的，它在疾病状态中不存在或是突变的，或可以编码在疾病状态是 缺乏的或不存在的基因产物。其它多核苷酸可以编码治疗性多肽，例如， 免疫原性肽(其可以用作疫苗)、天然激素或天然激素的合成类似物。
可以包含在本发明的制剂中的其它合适的活性剂包括能作用于下述 对象的试剂：外周神经、肾上腺素能受体、胆碱能受体、骨骼肌、心血管 系统、平滑肌、血管系统、突触位点、神经效应器接合位点、内分泌和激 素系统、免疫系统、生殖系统、骨骼系统、消化和排泄系统、组胺系统和 中枢神经系统。合适的试剂可以选自，例如蛋白质、酶、激素、核苷酸(包 括有义和反义寡核苷酸)、多核苷酸、核蛋白、多糖、糖蛋白、脂蛋白、 多肽、类固醇。活性剂可以是镇痛药、麻醉剂、抗心律不齐剂、抗生素、 抗过敏剂、抗真菌剂、抗癌剂、抗凝血剂、抗抑郁剂、抗糖尿病剂、抗癫 痫剂、抗炎的皮质类固醇、用于治疗阿尔茨海默氏病或帕金森氏病的药物、 抗溃疡剂、抗原虫药、抗焦虑药、甲状腺制剂、抗甲状腺制剂、抗病毒药、 减食欲药物(anoretics)、二膦酸盐、影响心肌收缩力药(cardiac inotropic agents)、心血管药、皮质类固醇、利尿剂、多巴胺能剂、肠胃病药、止血 药、高胆固醇药、降压药(例如二氢吡啶)、抗抑郁药和cox-2抑制剂、免 疫抑制剂、抗痛风药、抗疟药、类固醇、terpinoids，triterpines，类视色素； 抗溃疡H2-受体拮抗剂、降血糖药、保湿剂、化妆品、抗偏头痛药、抗毒 蕈碱性剂(antimuscarinic agents)、抗炎药、例如用于治疗风湿病、关节 炎、牛皮癣、炎性肠病、局限性回肠炎的药物；或用于治疗脱髓鞘性病、 包括多发性硬化的药物、眼药、疫苗(例如抗肺炎、甲型肝炎、乙型肝炎、 丙型肝炎、霍乱毒素B亚单位、流感病毒、伤寒、恶性疟原虫、diptheria、 破伤风、HSV、结核病、HIV、SARS病毒、pordetela pertussis、麻疹、流 行性腮腺炎和风疹疫苗(MMV)、细菌类毒素、疫苗病毒、腺病毒、canary、 脊髓灰质炎病毒、卡介苗(BCG)、弗里德兰德杆菌肺炎(klebsiella pneumonia)等)、组胺受体拮抗剂、安眠药、保肾剂、调脂剂、肌肉松弛 剂、神经抑制药、亲神经剂、阿片样物质激动剂和拮抗剂、拟胆碱药、蛋 白酶抑制剂、前列腺素(prostglandins)、镇静药、性激素(例如，雌激素、 雄激素)、兴奋剂、拟交感神经药、血管舒张药和花黄素和这些种类的合 成类似物。治疗剂可以是肾毒性的，例如环孢素和两性霉素B，或心脏毒 性的，例如两性霉素B和紫杉醇。示例性的抗癌剂包括美法仑、氮芥、 extramustinephosphate、乌拉莫司汀、异环磷酰胺、甘露莫司汀、trifosfamide、 链唑霉素、二溴甘露醇、米托蒽醌(参见，例如公开的国际专利申请WO 02/32400)、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、阿糖胞苷、替加氟、idoxide、紫杉烷类 (例如，泰素、紫杉醇等，(参见，例如公开的国际专利申请WO 00/01366)、 道诺霉素、柔红霉素、博来霉素、两性霉素、卡铂、顺铂、紫杉醇、BCNU、 长春新碱、喜树碱和其衍生物(例如SN38(参见，例如公开的国际专利申 请WO 02/058622)、伊立替康(参见，例如公开的国际专利申请WO 03/030864))、小红霉素(antracyclines)、抗体、cytoxines、多柔比星、依 托泊甙(etopside)、细胞因子、核酶、干扰素、寡核苷酸和前述物质的功 能衍生物。可以根据本方法输送的药物的其它实例包括乙二磺酸盐丙氯拉 嗪(prochlorperzine edisylate)、硫酸亚铁、氨基己酸、盐酸美卡拉明、盐 酸普鲁卡因胺、硫酸苯丙胺、盐酸去氧麻黄碱、benzamphetamine hydrochloride、硫酸异丙肾上腺素、盐酸芬美曲秦、氯贝胆碱、氯醋甲胆 碱、盐酸毛果芸香碱、硫酸阿托品、东莨菪碱溴化物(scopolamine bromide)、 异丙碘铵、曲地氯铵、盐酸苯乙双胍、盐酸哌甲酯、胆茶碱、盐酸头孢氨 苄、地芬尼多、盐酸美克洛嗪、马来酸丙氯拉嗪、酚苄明、马来酸硫乙拉 嗪(thiethylperzine maleate)、anisindone、二苯茚酮丁四硝酯、地高辛、 异氟磷、乙酰唑胺、醋甲唑胺、苄氟噻嗪、chloropromaide、妥拉磺脲、 醋酸氯地孕酮、非那二醇、别嘌醇、阿司匹林铝、甲氨蝶呤、醋磺胺异噁 唑、红霉素、氢化可的松、hydrocorticosterone acetate、醋酸可的松、地塞 米松和其衍生物例如倍他米松、曲安西龙、甲睾酮、17-(S)-雌二醇、炔雌 醇、炔雌醇3-甲基醚、泼尼松龙、17-α-醋酸羟孕酮、19-去甲孕酮、炔诺 酮孕、去甲脱氢羟孕酮、炔诺酮、norethiederone、孕酮、诺孕酮、异炔诺 酮、阿斯匹林、吲哚美辛、萘普生、非诺洛芬、舒林酸、吲哚洛芬、硝基 甘油、硝酸异山梨酯、普萘洛尔、噻吗洛尔、阿替洛尔、阿普洛尔、西咪 替丁、可乐定、丙咪嗪、左旋多巴、氯丙嗪、甲基多巴、二羟基苯丙氨酸、 茶碱、葡萄糖酸钙、酮洛芬、布洛芬、头孢氨苄、红霉素、氟哌啶醇、佐 美酸、乳酸亚铁、长春胺、长春瑞滨(参见，例如公开的国际专利申请 WO03/018018)、地西泮、酚苄明、地尔硫、米力农、头孢孟多、quanbenz、 氢氯噻嗪、雷尼替丁、氟比洛芬、fenufen、氟洛芬、托美丁、阿氯芬酸、 甲芬那酸、氟芬那酸、difuinal、尼莫地平、尼群地平、尼索地平、尼卡地 平、非洛地平、利多氟嗪、噻帕米、戈洛帕米、氨氯地平、米氟嗪、赖诺 普利、依那普利、依那普利拉、卡托普利、雷米普利、法莫替丁、尼扎替 丁、硫糖铝、依汀替丁、tetratolol、米诺地尔、利眠宁、地西泮、阿米替 林、和丙米嗪。其它的实例是蛋白和肽，其包括但不限于骨形态生成蛋白、 胰岛素、秋水仙碱、胰高血糖素、促甲状腺激素、甲状旁腺和垂体激素、 消化激素、降钙素、肾素、催乳素、促肾上腺皮质激素、促甲状腺激素、 促卵泡激素、绒毛膜促性腺激素、促性腺激素释放激素、牛促生长素、猪 促生长素、催产素、血管升压素、GRF、促生长素抑制素、赖氨加压素、 促胰酶素、黄体生成素、LHRH、LHRH激动剂和拮抗剂、亮丙立德、干 扰素(例如共有干扰素、干扰素α-2a、干扰素α-2b、α-、β-或γ-干扰素)、 白介素、生长激素例如人生长激素和其衍生物例如甲硫胺(methione)-人生 长激素和des-苯丙氨酸人生长激素、牛生长激素和猪生长激素、生育抑制 剂例如前列腺素、生育促进剂、生长因子例如胰岛素样生长因子、凝固因 子、胰激素释放因子(pancreas hormone releasing factors)、这些化合物的 类似物和衍生物和这些化合物的药用盐或它们的类似物或衍生物。治疗剂 可以是试剂(例如，两种或多种试剂)的混合物，它们可以在脂质体制剂中 有益地共同施用。
药物制剂可以用于将治疗剂通过各种途径输送到动物体内的不同位 点，以实现理想的治疗性作用。通过包含将制剂应用或插入到身体空腔或 组织的施用，经口输送，气雾剂的吸入或吹入，局部施用到皮肤或粘膜表 面，或通过肠胃外给药，包括肌肉内的、静脉内的、肿瘤内的、皮内的、 腹膜的、皮下的和局部的施用，可以实现局部地或全身地输送治疗剂。这 些制剂中的阳离子脂质的作用是，通过促进包含于其中的治疗剂的细胞内 输送来提高它的功效和效率(Felgner等，美国专利号5,459,127)。因此， 本发明提供了通过施用本文所述的含有阳离子心磷脂和一种或多种活性 剂的组合物输送一种或多种活性剂的方法。该方法可以治疗性地施用，即 给需要治疗的人或动物患者(或植物)输送一种或多种活性剂，或者该方 法可以用于将一种或多种活性剂输送给培养中的细胞。该方法可以用于施 用实质上所有的活性剂。关于治疗性应用，认为对于在存在表面活性剂时 稳定的活性剂是常规的。亲水的活性剂是合适的，且可以包含在脂质体内 部，这样脂质体双分子层建立起扩散屏障，防止它随机地遍布身体扩散。 认为疏水的活性剂特别适用于本方法的用途，因为它们不但具有能表现出 低毒性的优点，而且它们倾向于在脂质体的脂双分子层中较好地溶解。
化疗剂也较好地适用于该方法。含有化疗剂的脂质体或其它脂质制剂 可以直接注射到肿瘤组织中，以将化疗剂直接输送到癌细胞中。在一些情 况下，特别是在切除肿瘤后，可以将脂质体制剂直接植入产生的空腔中， 或可以应用到残余组织上作为包衣。在术后施用脂质体制剂的情况下，可 以使用具有约1微米的大直径的脂质体，因为它们无需穿过脉管系统。
特别优选的实施方案包括用于治疗或预防单纯疱疹的制剂、和这样的 制剂在治疗或预防疱疹感染中的应用。如本文所指出的，除了本发明的阳 离子心磷脂外，这样的制剂理想地包括药理学上有效浓度的无环鸟苷、丙 氧鸟苷、1-(2-脱氧-2′-氟-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘胞嘧啶(FIAC)或1(2′- 脱氧-2′-氟-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基)5-碘尿嘧啶(FIAU)。例如，通过局部施 用(理想地施用给粘膜组织)可以将组合物施用给感染了单纯疱疹或处于 感染单纯疱疹的风险中的个体。
本发明提供了施用药物制剂的方法，所述药物制剂除了活性剂的脂质 体制剂外，还包含无毒的、惰性的药学上合适的赋形剂。药学上合适的赋 形剂包括固体、半固体或液体稀释剂、填料和各种制剂辅料。本发明还包 括剂量单位形式的药物制剂。这意味着，制剂是单个部分的形式，例如小 瓶、注射器、胶囊、丸剂、栓剂或安剖，其中活性剂在脂质体制剂中的含 量与单次给药剂量的分数或倍数相对应。剂量单位可以含有例如1、2、3 或4个单次给药剂量，或1/2、1/3或1/4单次给药剂量。单次给药剂量优 选地含有一次施用的活性剂量，其通常与每日给药剂量的全部、1/2、1/3 或1/4相对应。
片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂、粒剂、栓剂、溶液、混悬液和乳剂、糊 剂、软膏剂、凝胶、霜剂、洗剂、粉末和喷雾剂可以是合适的药物制剂。 除了脂质体活性剂外，栓剂可以含有合适的水溶性的或水不溶性的赋形 剂。合适的赋形剂是这样的，本发明的脂质体活性剂在其中是足够稳定的， 以用于治疗用途，例如聚乙二醇、某些脂肪和酯或这些物质的混合物。软 膏剂、糊剂、霜剂和凝胶还可以含有合适的赋形剂，脂质体活性剂在其中 是稳定的。
活性剂或其药物制剂可以施用给患者或体内的细胞，例如静脉内地、 皮下地、局部地(例如，给皮肤或真皮组织，或给粘膜组织)、经口地、肠 胃外地、腹膜内地和/或直肠地，或通过已知的或开发的方法，直接注射 进肿瘤或需要治疗的位点中。而且，在一些实施方案中，理想地给患者的 细胞体外地施用药物制剂，其包含本发明的阳离子心磷脂和任选的活性 剂，此后将细胞返回到患者。这样的治疗可以是有效的，例如，在重新导 入的细胞中的基因表达可以有效地抵抗患者的疾病，例如治疗癌症的情况 下。
本发明的阳离子心磷脂和上述的制剂能促进治疗脊椎动物(例如人或 非人的动物)的疾病的方法，其包括给患者施用如本文所述的药物制剂的 步骤，该制剂典型地包含对疾病的治疗具有特异性的治疗剂。根据本发明 的方法，将本文所述的制剂(理想地含有活性剂)施用给需要治疗的脊椎 动物，其量和给药位置足以治疗脊椎动物的疾病。在一些实施方案中，将 治疗剂整合进患者的至少一个细胞中，它在其中发挥治疗疾病的作用(例 如，当治疗剂是DNA或RNA时，它在被摄入细胞中以后进行表达)。在 其它实施方案中，试剂在患者内细胞外地发挥作用，抵抗疾病。药物制剂 是以适合于制剂类型的方式施用给患者(例如，皮肤地施用给皮肤或粘膜 表面，肠胃外的注射或注射进体内腔或组织中，经口施用等)。应当认识 到，根据本发明的方法有效地治疗疾病，在理想地消除疾病或其症状的同 时，无需彻底根除疾病的影响。实际上，通过疾病、感染的严重性的降低 或患者的疾病发展速度的降低，可以检测到根据本发明的方法的成功治 疗。
在一个实施方案中，方法疾病是癌症，在该情况下，药物制剂可以含 有合适的抗癌剂，例如本文所述的化疗剂(例如，抗癌药物)或选自下述的 多核苷酸：核酶、干扰RNA(RNAi)和反义RNA或DNA序列。优选的抗 癌多核苷酸是c-raf反义寡核苷酸。在另一个实施方案中，疾病是病毒感 染，例如单纯疱疹或HIV。为了治疗病毒感染，药物制剂典型地包含抗病 毒药，例如本文所述的。例如，为了治疗HSV，制剂可以包括无环鸟苷，丙 氧鸟苷，1-(2-脱氧-2′-氟-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘胞嘧啶(FIAC)或1(2′- 脱氧-2′-氟-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基)5-碘尿嘧啶(FIAU)。为了治疗HIV，组 合物可以包含抗病毒的核苷，例如3′-叠氮基-3′-脱氧胸苷(AZT)。
本发明还提供了将活性剂导入一个或多个细胞中的方法。根据本发明 的方法，制备了含有本文所述的阳离子心磷脂的组合物，其还包含活性剂。 然后使细胞与试剂接触，使细胞摄入活性剂，或者，可以制备不含有活性 剂的组合物，在存在活性剂的情况下，使细胞与组合物接触，使细胞摄入 活性剂。
一个或多个细胞可以是体外细胞培养物。当一个或多个细胞是体外的 时，通过将其与培养基相混合，可以将含有阳离子心磷脂和/或活性剂的 组合物输送给细胞，或者，一个或多个细胞可以是植物或动物(例如人) 宿主体内的。在该情况下，可以如本文所述配制和输送组合物。
当活性剂是多核苷酸时，本发明的方法可以用于使用该多核苷酸转染 一个或多个细胞。该方法可以用于体外地转染细胞(例如在培养物中)， 或者给细胞体内地输送治疗性的或诊断性的多核苷酸。例如，根据基因治 疗方案，该方法可以用于将基因输送给培养物中的细胞或患者。为了治疗 性应用，本发明因而提供了基因治疗方法，其包括给需要治疗的患者施用 包含一种或多种核酸的药物组合物，其中该组合物包含阳离子心磷脂。在 这方面，多核苷酸可以是能编码基因的表达构建体，该基因在根据本发明 的方法转染后在细胞内表达。为了表达，这样的基因构建体理想地包括合 适的调节元件来促进表达。因此，除了编码序列外，表达构建体典型地包 括可操作地连接到编码序列上的启动子。另外，编码序列可以包括其它调 节元件，例如核糖体进入位点、增强子等。表达构建体的构建是本领域的 普通常识。
预期的应用包括与那些现在已知的和使用两亲脂质的方法、和使用常 规的阳离子脂质技术和方法相对应的转染方法，所述两亲脂质包括商业的 阳离子脂质制剂，例如LipofectinTM。因此，本文所公开的脂质组合物可 以用于促进编码治疗活性的多肽的DNA或mRNA序列的细胞间输送 (Felgner等，美国专利号5,459,127)。它们可以类似地用于表达的基因产 物、多肽或自身蛋白的脂质体输送。因此，阳离子脂质介导的DNA和 mRN多核苷酸或蛋白的输送可以提供遗传疾病的治疗，它通过提供缺乏 的或不存在的基因产物来治疗任何遗传疾病来进行，其中已经鉴别出了缺 陷基因和/或其产物，例如杜兴氏营养不良(Kunkel等1989)。
通过将阳离子脂质和DNA、RNA或蛋白直接体内地注射进动物的细 胞中可以施用上面所述的转染方法和试剂盒。但是，最近已经证实，阳离 子脂质特别有效地促进细胞的体外转染。因此，通过使用阳离子脂质输送 方法，体外地转染动物的一些细胞，并将细胞重新导入动物中，可以替代 性地进行上面的治疗。因而阳离子脂质的高效率地转染细胞的能力提供了 免疫的替代方法。通过阳离子脂质介导的输送可以将抗原的基因导入已经 从动物取出的细胞中。将现在能表达抗原的转染细胞重新注射进动物中， 其中的免疫系统现在可以对内源性的抗原作出反应。通过共注射佐剂或淋 巴因子、或编码这样的淋巴因子的基因，进一步刺激淋巴细胞，可以增强 该过程(Felgner等，美国专利号5,459,127)。
本发明还提供了将多核苷酸转染进细胞的试剂盒。该试剂盒包含本文 所述的阳离子心磷脂，其还可以包含用于转染的理想的多核苷酸。当存在 时，多核苷酸可以是分开地包装或与阳离子心磷脂包装在一起，例如在本 文所述的制剂中。该试剂盒还可以包含关于使用该试剂盒进行转染的说明 书。说明书可以包含，例如，关于将多核苷酸和阳离子心磷脂配制成能用 于转染细胞的制剂的说明。该试剂盒还可以包含有利于转染的试剂，例如 缓冲剂、培养基等。另外，该试剂盒可以包含用于储存阳离子心磷脂的容 器，用于储存试剂的容器，用于储存包含阳离子心磷脂和多核苷酸的制剂 的容器，或用于制备制剂的容器。另外，该试剂盒可以包含有利于转染的 物质，例如吸管或吸管帽、培养皿或瓶或其它合适的物质。
本发明还涉及向细胞输送活性剂的方法。通过制备包含活性剂和通过 如上所述的方法合成的阳离子心磷脂变体/类似物的脂质体，可以实现该 方法。然后将脂质体输送给细胞。这也可以通过将脂质体加入细胞培养基 中来完成。
下面的实施例进一步解释了本发明，但是当然，不应当理解为以任何 方式限制其范围。
实施例
实施例1.阳离子心磷脂类似物(4)的合成[图1]
(R，S)-1，2-二-(十四烷基氧基)-3-二甲基氨基丙烷(2)

向三颈圆底烧瓶中的氢化钠(60％，在油中)(6.7g，167.92mmol)和 DMF(100mL)的悬浮液中，在0℃经1.5小时逐滴地加入1-二甲基氨基-2，3- 丙二醇(1)(5g，41.98mmol)的DMF(25mL)溶液，然后使其达到室温，并搅 拌1小时。向反应混合物中经90分钟逐滴加入四癸基溴化物(46.5g，167.27 mmol)。然后使其达到室温，并搅拌1小时。使反应混合物的温度逐渐升 至82℃，并在该温度搅拌24小时。将反应混合物冷却至0℃，非常缓慢 地加入几滴冷冰水，然后用水(750mL)稀释该混合物。用己烷提取含水层 数次(6×150mL)。有机层经硫酸钠干燥。使用20％乙酸乙酯的己烷溶液， 经硅凝胶(70-230目)柱层析纯化粗化合物，得到无色油状的1，2-二-(十四 烷基氧基)-3-二甲基氨基丙烷(2)(13g，62％)(Wheeler等1987)。TLC(SiO2) 甲醇/氯仿(1∶9)Rf～0.51 1H NMR(CDCl3，500MHz)：δ0.88(t，J＝6.8Hz， 6H)，1.25(s，44H)，1.54-1.56(m，4H)，2.25(s，6H，N-CH3)，2.26-2.41(m，2H， CH2N)，3.43-3.52(m，7H)。
(R，S)-1，3-二-(1，2-二十四烷基氧基丙基-3-N，N，N-二甲基铵溴化物)丙烷-2- 醇(4)

将1，2-二-(十四烷基氧基)-3-二甲基氨基丙烷(2)(4.3g，84.0mmol)和 1，3-二溴甘油(3)(0.73g，3.36mmol)在无水乙醇(100mL)中的溶液 (Bhattacharya等1999)回流5天。将反应混合物冷却，蒸发溶剂，得到粗 蜡状固体。将粗化合物溶解到己烷(200mL)中，并在室温搅拌6小时，保 持在0℃过夜。过滤分离的固体，并用己烷洗涤(8×10mL)，以除去原料 1，2-二-(十四烷基氧基)-3-二甲基氨基丙烷。对粗化合物进行柱层析(硅胶， 70-230目)，用1-6％甲醇的二氯甲烷溶液洗脱，以得到白色固体状的阳离 子心磷脂类似物(4)(3.2g，77％)。TLC(SiO2)甲醇/氯仿(1∶9)Rf～0.11.1H NMR(CDCl3，500MHz)：δ0.88(t，J＝6.8Hz，12H)，1.24-1.31(m，88H)， 1.56-1.60(m，8H)，3.42-3.68(m，25H)，3.79-3.85(m，4H)，4.39(t，J＝6.8Hz，2H)， 4.53-4.60(m，2H)，5.18-5.24(m，1H)，6.50-6.61(m，1H)。13C NMR(CDCl3，125 MHz)：δ14.03，22.60，29.28，29.35，29.37，29.39，29.52，29.55，29.57，29.58， 29.61，29.62，29.98，30.0，31.84，52.74，52.89，53.16，54.85，54.89，55.01， 62.28，62.57，65.02，68.53，68.63，68.88，69.29，69.39，69.80，70.02，72.02， 72.82，72.87.IR(cm-1)：3407(br)，3223(br)，2956(s)H，2920(s)，1633，1467， 1377，1116，971，893，720.ESI-MS 1162.5[M+1-Br]，1080.6[M+1-2Br]， 540.7[M+1-2Br/2]。分子式C69H144Br2N2O5；元素分析；计算值C：66.74，H： 11.69，N：2.26，Br：12.87；实测值C：65.85，H：11.52，N：2.31，Br：13.21。
实施例2.阳离子心磷脂类似物(11)的合成[图2]
1，3二[(2-乙氧基四氢-2H-吡喃)]-2-苄氧基-甘油(7)

在氩气氛下、在0℃，向搅拌的氢化钠(59.3g，1.48mol，60％，在油中) 在无水DMF(300mL)中的悬浮液中，经2小时加入2-苄氧基1，3-丙二醇 (5)(90g，0.49mol)的DMF(700mL)溶液，将温度维持在15℃以下。在室温 搅拌2小时后，在0℃、经3小时加入2-(2-溴乙氧基)四氢-2H-吡喃(6)(310 g，1.48mol)，将温度维持在10℃以下。将反应混合物在室温搅拌12小时。 将反应混合物冷却至0℃，非常缓慢地加入冰水，以淬灭多余的氢化钠。 在减压下浓缩反应混合物，以除去最大量的DMF，用水(1L)稀释粗溶液， 用乙酸乙酯(2×500mL)萃取。用含水的饱和氯化钠(500mL)洗涤有机层， 经硫酸钠干燥。在减压下浓缩溶剂。使用10-30％乙酸乙酯的己烷溶液， 通过硅胶(230-400目)柱层析纯化粗化合物，得到无色油状的1，3-二-[(2- 乙氧基四氢-2H-吡喃)]-2-苄氧基-甘油(7)(154g，71％)。TLC(SiO2)己烷/乙 酸乙酯(3∶2)Rf～0.40。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ1.41-1.82(m，12H)， 3.41-3.98(m，17H)，4.61(brs，2H)，4.78(s，2H，OCH2Ph)，7.24-7.45(m，5H， Ph-H)。
3，7-二氧杂-5-苄氧基-1，9-壬二醇(8)

向1，3-二[(2-乙氧基四氢-2H-吡喃)]-2-苄氧基-甘油(7)(50g，0.11mol) 的甲醇(500mL)溶液中，加入1N HCl的醚(5mL)溶液，并在室温搅拌2 小时。用碳酸氢钠中和反应混合物，直到溶液变成中性。过滤反应混合物， 在减压下浓缩。将粗化合物溶解到乙酸乙酯(1L)中，用水(100mL)洗涤， 并经硫酸钠干燥。在减压下浓缩有机层，经硅凝胶(70-230目)柱层析纯化 粗化合物，用乙酸乙酯洗脱，随后用5％甲醇的乙酸乙酯溶液洗脱，得到 无色油状的3，7-二氧杂-5-苄氧基-1，9-壬二醇(8)(27g，88％)。TLC(SiO2)乙 酸乙酯Rf～0.10.1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ3.01(brs，2H，OH)， 3.50-3.81(m，13H)，4.68(s，2H，OCH2Ph)，7.21-7.42(m，5H，Ph-H)。
1，9-二溴-3，7-二氧杂-5-苄氧基-壬烷(9)

在氩气氛下、在0℃，向3，7-二氧杂-5-苄氧基-1，9-壬二醇(8)(27g，0.1 mol)的无水二氯甲烷(400mL)溶液中，加入三苯膦(65.5g，0.25mol)，然 后加入四溴化碳(79.4g，0.24mol)。将反应混合物在0℃搅拌2小时。用水 (300mL)稀释反应混合物，分离有机层，经硫酸钠干燥。在减压下浓缩有 机层，使用20％乙酸乙酯的己烷溶液经硅凝胶(70-230目)柱层析纯化粗化 合物，得到无色油状的1，9-二溴-3，7-二氧杂-5-苄氧基-壬烷(9)(36g，91％)。 TLC(SiO2)己烷/乙酸乙酯(3∶2)Rf～0.60。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ 3.45(t，J＝5.5Hz，4H，CH2Br)，3.60-3.67(m，4H，OCH2)，3.72-3.82(m，5H)， 4.70(s，2H，OCH2Ph)，7.28-7.38(m，5H，Ph-H)。
1，3-二-(2-溴乙氧基)丙烷-2-醇(10)

将1，9二溴-3，7-二氧杂-5-苄氧基-壬烷(9)(36g，90.90mmol)溶解到乙 醇(110mL)中，在50psi的压强下，用10％碳载钯(3.6g)氢化2小时。滤 出催化剂后，在减压下蒸发溶液。对粗物质进行硅胶柱层析(70-230目)， 用60％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，得到无色油状的1，3-二-(2-溴乙氧基)丙 烷-2-醇(10)(26g，94％)。TLC(SiO2)己烷/乙酸乙酯(1∶1)Rf～0.30。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ2.56(d，J＝4.5Hz，1H，OH)，3.45(t，J＝6.0Hz，4H CH2Br)，3.54-3.64(m，4H，OCH2)，3.82(t，J＝5.7Hz，4H，OCH2)，3.96-4.02(m， 1H)。
(R，S)-1，3-二(1，2-二十四烷基氧基丙基-3-N，N-二甲基-3-乙氧基铵溴化物) 丙烷-2-醇(11)

在78-80℃，将1，2-二-十四烷基氧基-3-二甲基氨基丙烷(2)(50.2g， 98.36mmol)和1，3-二-(2-溴乙氧基)丙烷-2-醇(10)(10g，32.78mmol)的无水 乙醇(600mL)溶液回流5天。将反应混合物冷却，蒸发溶剂，得到粗蜡状 固体。加入己烷(400mL)，并搅拌1小时。滤出固体，用己烷(6×100mL) 洗涤。通过重结晶[化合物/甲醇/丙酮的比例为(1∶3∶50)]纯化化合物，保持 在-20℃过夜。过滤分离的固体，用冷丙酮洗涤。重复重结晶2次，得到 分析纯的样品。真空下干燥化合物24小时，然后经P2O5 36小时，得到 白色固体状的阳离子心磷脂类似物(11)(30g，69％)。TLC(SiO2)甲醇/氯仿(1∶ 9)Rf～0.11。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ0.88(t，J＝6.7Hz，12H)，1.25(s， 88H)，1.52-1.71(m，8H)，3.41-3.68(m，29H)，3.95-4.19(m，14H)，4.66(brs， 1H)。13C NMR(CDCl3，125MHz)：δ13.92，22.50，25.89，26.03，29.12，29.27， 29.32，29.42，29.48，29.50，29.54，29.87，31.74，52.95，53.02，53.50，65.02， 65.07，66.57，68.63，68.84，69.15，71.80，72.65，73.29。IR(cm-1)：3323(br)， 2918(s)，2873(s)，1468(s)，1123(brs)。ESI-MS 1248.6[M+1-Br]，584.3 [M+1-2Br/2]。分子式C73H152Br2N2O7；元素分析；计算值C：65.93，H：11.52， N：2.11，Br：12.02；实测值C：65.93，H：11.40，N：2.11，Br：11.99。
实施例3.阳离子心磷脂类似物(19)的合成[图3]
(R)-4-(苄氧基甲基)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环(13).

在氩气氛下、在0℃，向搅拌的氢化钠(30.3g，0.75mol，60％，在油中) 的无水四氢呋喃(500mL)的悬浮液中，经1小时加入R(-)-2，2-二甲基-1，3- 二氧戊环-4-甲醇(12)(50g，0.37mol)，维持内部温度低于20℃。在室温搅 拌1小时后，在0℃、经1小时加入苄基溴(97.1g，0.56mol)。加入完毕 后，将反应混合物在室温搅拌14小时。将反应混合物冷却至0℃，非常 缓慢地加入冷水，用含水的饱和氯化铵(500mL)稀释该混合物。用乙酸乙 酯(500mL)萃取含水层，用水(300mL)洗涤。在减压下浓缩有机层，得到 浆状的粗产物(121g)(R)-4-苄氧基甲基-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环(13)。 TLC(SiO2)己烷/乙酸乙酯(1∶9)Rf～0.26(不经纯化，对粗产物进行下一步 操作)1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ1.39(s，3H，CH3)，1.40(s，3H，CH3)， 3.41-3.55(m，2H)，3.68-3.74(m，1H)，4.01-4.05(m，1H)，4.20-4.31(m，1H)， 4.55(brs，2H，OCH2Ph)，7.25-7.35(m，5H，Ph-H)。
(S)-(-)-3-苄氧基-1，2-丙二醇(14)

向(R)-4-苄氧基甲基-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环(13)(120g)的甲醇(700 mL)溶液中，加入浓HCl(20mL)，并在室温搅拌10小时。用碳酸氢钠中 和反应混合物，直到溶液变成中性。过滤反应混合物，并在减压下浓缩。 将粗化合物溶解于二氯甲烷(600mL)，分离有机层，并经硫酸钠干燥。减 压下浓缩有机层。使用10-20％乙酸乙酯的己烷溶液作为洗脱剂、随后使 用10％甲醇的乙酸乙酯溶液，经硅凝胶(230-400目)柱层析纯化粗化合物， 得到浆状的(S)-(-)-3-苄氧基-1，2-丙二醇(14)(64g，93％)。TLC(SiO2)乙酸乙 酯Rf～0.44。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ3.42-3.61(m，4H)，3.79-3.83(m， 3H)，4.47(s，2H，OCH2Ph)，7.23-7.32(m，5H，Ph-H)。
(S)-1，2-二-十四烷基氧基-3-O-苄基丙烷(15).

在氩气氛下、在0℃，向搅拌的氢化钠(54.5g，1.36mol，60％，在油中) 的无水DMF(220mL)悬浮液中，经1小时加入(S)-(-)-3-苄氧基-1，2-丙二醇 (14)(62g，0.34mol)的DMF(400mL)溶液，维持内部温度低于20℃。在室 温搅拌2小时后，在0℃经2小时加入十四烷基溴(377.4g，1.36mol)。加 入完毕后，在室温搅拌反应混合物2小时，使温度逐渐升高至70℃，然后 搅拌5小时。将反应混合物冷却至0℃，非常缓慢地加入冷水，并用含水 的饱和氯化铵(500mL)稀释。用乙酸乙酯(1L)萃取含水层，并用水(3×1L) 洗涤。在减压下浓缩有机层，经硅凝胶(70-230目)柱层析纯化粗产物，使 用2-10％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，以得到无色油状的(S)-1，2-二-十四烷 基氧基-3-O-苄基丙烷(15)(146g，75％)。TLC(SiO2)己烷/乙酸乙酯(1∶9)Rf～ 0.53。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ0.88(t，J＝6.7Hz，6H)，1.25(brs，44H)， 1.49-1.58(m，4H)，3.39-3.60(m，9H)，4.54(m，2H，OCH2Ph)，7.23-7.32(m，5H， Ph-H)。
(R)-1，2-二-十四烷基氧基-丙烷-3-醇(16)

将(S)-1，2-二-十四烷基氧基-3-O-苄基丙烷(15)(70g，0.12mmol)溶液溶 解到乙酸乙酯(280mL)中，在50psi的压强下，用10％钯(3g)氢化12小 时。滤出催化剂后，在减压下蒸发溶液。将残余物溶解于热乙醇(500mL) 中，保持在-20℃过夜。过滤分离的固体，并真空干燥，以得到白色固体 状的(R)-1，2-二-十四烷基氧基-丙烷-3-醇(16)(54g，92％).TLC(SiO2)己烷/ 乙酸乙酯(1∶9)Rf～0.17。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ0.88(t，J＝6.7Hz，6H)， 1.25(brs，48H)，1.59-1.57(m，4H)，2.2(t，J＝5.7Hz，1H，OH)，3.37-3.73(m， 9H)。
(S)-1，2-二-十四烷基氧基-3-溴丙烷(17)

在氩气氛下、在0℃，向(R)-1，2-二-十四烷基氧基-丙烷-3-醇(16)(52g， 0.1mol)的无水二氯甲烷(280mL)溶液中，加入三苯膦(35.1g，0.13mol)。 向该反应混合物中经1小时逐滴加入四溴化碳(46.2g，0.13mol)的二氯甲 烷(240mL)溶液，在0℃进一步搅拌3小时。用水(500mL)稀释反应混合 物，分离有机层，经硫酸钠干燥。在减压下浓缩有机层，使用1-5％乙酸 乙酯的己烷溶液，经硅凝胶(230-400目)柱层析纯化粗化合物，以得到无 色油状的(S)-1，2-二-十四烷基氧基-3-溴丙烷(17)(53g，90％)。TLC(SiO2)己 烷/乙酸乙酯(1∶9)Rf～0.72。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ0.88(t，J＝6.7Hz， 6H)，1.25(brs，48H)，1.51-1.61(m，4H)，3.39-3.61(m，9H)。
(R)1，2-二-十四烷基氧基-3-二甲基氨基丙烷(18)

在螺旋盖压力瓶中，将(S)-1，2-二-十四烷基氧基-3-溴丙烷(17)(50g， 0.09mol)溶解到2M二甲胺的甲醇溶液(400mL)中。密封压力瓶，在搅拌 的油浴中，在88-90℃加热60小时。冷却压力瓶，并在减压下浓缩溶液。 将粗残余物溶解到乙酸乙酯(500mL)中，并用水(500mL)洗涤。在减压下 浓缩有机层，使用5-20％乙酸乙酯的己烷溶液作为洗脱剂，经硅凝胶 (230-400目)柱层析纯化，得到浅色油状的(R)-1，2-二-十四烷基氧基-3-二甲 基氨基丙烷(18)(41g，88％)。TLC(SiO2)甲醇/氯仿(1∶9)Rf～0.51。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ0.88(t，J＝6.8Hz，6H)，1.25(s，44H)，1.51-1.58(m， 4H)，2.25(s，6H，N-CH3)，2.37(t，J＝4.6Hz，2H，N-CH2)，3.41-3.62(m，7H)。
(R)1，3-二-(1，2-二十四烷基氧基丙基-3-N，N-二甲基-3-乙氧基铵溴化物)丙 烷-2-醇(19)

将(R)-1，2-二-十四烷基氧基-3-二甲基氨基丙烷(18)(35.6g，69.8mmol) 和1，3-二-(2-溴乙氧基)丙烷-2-醇(10)(7.1g，23.2mmol)的无水乙醇(430mL) 溶液在78-80℃回流5天。将热反应混合物转移到锥形瓶中，并经2小时 逐滴加入丙酮(4.3L)。将混合物保持在-20℃过夜。滤出固体，用冷丙酮(500 mL)洗涤，得到纯白色(colorless white)固体(28g)。通过在温甲醇(140mL)： 丙酮(1.4L)的混合物中重结晶来纯化粗固体，然后储存在-20℃过夜。分离、 过滤固体，用冷丙酮(300mL)洗涤。重复重结晶2次，得到分析纯的样品。 干燥化合物24小时，然后在真空下经P2O536小时，得到白色固体状的(R)- 阳离子心磷脂类似物(19)(24g，78％)。TLC(SiO2)甲醇/氯仿(1∶9)Rf～0.13。 1H NMR(CDCl3，500MHz)：δ0.88(t，J＝6.7Hz，12H)，1.25(s，88H)， 1.52-1.71(m，8H)，3.41-3.68(m，30H)，3.95-4.19(m，13H)，4.63(brs，1H，OH)。 13C NMR(CDCl3，125MHz)：δ13.94，22.52，25.90，26.04，29.20，29.28，29.33， 29.44，29.50，29.52，29.55，29.88，31.76，52.99，53.07，53.49，65.01，65.07， 66.56，68.66，68.84，69.17，71.82，72.62，72.64，73.30，73.28.IR(cm-1)： 3409(br，OH)，2918(s)，2873(s)，1468(s)，1124(br s)。ESI-MS 1248.5[M+1-Br]， 584.2[M+1-2Br/2]分子式C73H152Br2N2O7；元素分析；计算值C：65.93，H： 11.52，N：2.11，Br：12.02；实测值C：65.65，H：11.49，N：2.13，Br：12.17。
实施例4.阳离子心磷脂类似物(27)的合成[图4]
(S)-4-(苄氧基甲基)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环(21)

在氩气氛下、在0℃，向搅拌的氢化钠(22.7g，0.57mol，60％，在油中) 的无水四氢呋喃(350mL)的悬浮液中，经1小时加入S(-)-2，2-二甲基-1，3- 二氧戊环-4-甲醇(20)(50g，0.37mol)，维持内部温度低于20℃。在室温搅 拌1小时后，在0℃经1小时加入苄基溴化物(97.1g，0.56mol)。加入完毕 后，在室温搅拌反应混合物18小时。将反应混合物冷却至0℃，非常缓 慢地加入几滴冰水(20mL)，用含水的饱和氯化铵(500mL)稀释该混合物。 用乙酸乙酯(750mL)萃取含水层。在减压下浓缩有机层，得到浆状的 (S)-4-苄氧基甲基-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环(21)粗产物(83g)。TLC(SiO2)己 烷/乙酸乙酯(1∶9)Rf～0.26。
(R)-(-)-3-苄氧基-1，2-丙二醇(22)

向(S)-4-(苄氧基甲基)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环(21)(83g)的甲醇(800 mL)的溶液中，加入浓HCl(20mL)，并在室温搅拌15小时。用碳酸氢钠 中和反应混合物，直到溶液变成中性。过滤反应混合物，并在减压下浓缩。 将粗化合物溶解于二氯甲烷(200mL)中，分离有机层，经硫酸钠干燥，在 减压下浓缩。使用10-20％乙酸乙酯的己烷溶液作为洗脱剂，随后使用10％ 甲醇的乙酸乙酯溶液，经硅凝胶(230-400目)柱层析纯化粗化合物，得到 浆状的(R)-(-)-3-苄氧基-1，2-丙二醇(22)(65g，94％)。TLC(SiO2)乙酸乙酯 Rf～0.44。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ3.42-3.61(m，4H)，3.75-3.99(m，3H)， 4.47(s，2H，OCH2Ph)，7.22-7.32(m，5H，Ph-H)。
(R)-1，2-二-十四烷基氧基-3-O-苄基丙烷(23)

在氩气氛下、在0℃，向搅拌的氢化钠(38.4g，0.96mol，60％，在油中) 的无水DMF(200mL)的悬浮液中，经1小时加入(R)-(-)-3-苄氧基-1，2-丙二 醇(22)(35g，0.19mol)的DMF(150mL)溶液，维持内部温度低于20℃。在 室温搅拌2小时后，在0℃经2小时加入十四烷基溴化物(266g，0.97mol)。 加入完毕后，将反应混合物在室温搅拌2小时，使温度逐渐升高至60℃，然 后搅拌20小时。将反应混合物冷却至0℃，非常缓慢地加入几滴冰水， 并用含水的饱和氯化铵(500mL)稀释。用己烷(3×500mL)萃取含水层，并 用水(500mL)和盐水(500mL)洗涤。在减压下浓缩有机层，经硅凝胶 (70-230目)柱层析纯化粗产物，使用2-10％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，得 到无色油状的(R)-1，2-二-十四烷基氧基-3-O-苄基丙烷(23)(88g，80％)。 TLC(SiO2)己烷/乙酸乙酯(1∶9)Rf～0.53。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ 0.88(t，J＝6.6Hz，6H)，1.25(brs，44H)，1.49-1.58(m，4H)，3.39-3.60(m，9H)， 4.54(m，2H，OCH2Ph)，7.23-7.32(m，5H，Ph-H)。
(S)，-1，2-二-十四烷基氧基-丙烷-3-醇(24)

将(R)-1，2-二-十四烷基氧基-3-O-苄基丙烷(23)(83.8g，0.14mol)溶解到 乙酸乙酯(450mL)中，在50psi的压强下，用10％碳载钯(3.1g)氢化12 小时。滤出催化剂后，在减压下蒸发溶液。将残余物溶解于热己烷(200mL) 中，保持在-20℃过夜。过滤分离的固体，干燥，得到白色固体状的(S)-1，2- 二-十四烷基氧基-丙烷-3-醇(24)(64.8g，92％)。TLC(SiO2)己烷/乙酸乙酯(1∶ 9)Rf～0.17。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ0.88(t，J＝6.7Hz，6H)，1.25(brs， 44H)，1.51-1.57(m，4H)，2.22(t，J＝5.2Hz，1H，OH)，3.40-3.73(m，9H)。
(R)-1，2-二-十四烷基氧基-3-溴丙烷(25)

在氩气氛下、在0℃，向(S)-1，2-二-十四烷基氧基-丙烷-3-醇(24)(36.8g， 59.0mmol)的无水二氯甲烷(375mL)的溶液中，加入三苯膦(27.9g，106.0 mmol)。在1小时的时间内，向反应混合物逐滴加入四溴化碳(36.2g，109.0 mmol)的二氯甲烷(60mL)溶液。在0℃进一步搅拌反应混合物2小时。然 后用水(3×300mL)稀释。分离有机层，经硫酸钠干燥，在减压下浓缩。 使用1-5％乙酸乙酯的己烷溶液，经硅凝胶(230-400目)柱层析纯化粗化合 物，得到无色油状的(R)-1，2-二-十四烷基氧基-3-溴丙烷(25)(37.8g，87％)。 TLC(SiO2)己烷/乙酸乙酯(1∶9)Rf～0.72。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ0.88(t， J＝6.7Hz，6H)，1.25(brs，44H)，1.50-1.60(m，4H)，3.40-3.68(m，9H)。
(S)-1，2-二-十四烷基氧基-3-二甲基氨基丙烷(26)

在螺旋盖压力瓶中，将(R)-1，2-二-十四烷基氧基-3-溴丙烷(25)(36.7g， 0.07mol)溶解到2M二甲胺的甲醇溶液(450mL)中。密封压力瓶，在92℃， 在搅拌的油浴中加热75小时。冷却压力瓶，并在减压下浓缩溶液。将粗 残余物溶解到乙酸乙酯(500mL)中，并用水洗涤(500mL)。在减压下浓缩 有机层，使用5-20％乙酸乙酯的己烷溶液作为洗脱剂，经硅凝胶(230-400 目)柱层析纯化，得到浅色油状的(S)-1，2-二-十四烷基氧基-3-二甲基氨基丙 烷(26)(28.7g，80％)。TLC(SiO2)甲醇/氯仿(2∶8)Rf～0.66。1H NMR(CDCl3， 300MHz)：δ0.88(t，J＝6.7Hz，6H)，1.25(s，44H)，1.51-1.57(m，4H)，2.15， 2.25(s，6H，N-CH3)，2.34-2.36(m，2H，N-CH2)，3.38-3.61(m，7H)。
(S)-1，3-二-(1，2-二十四烷基氧基丙基-3-N，N-二甲基-3-乙氧基铵溴化物)丙 烷-2-醇(27)

将(S)-1，2-二-十四烷基氧基-3-二甲基氨基丙烷(26)(22.5g，43.9mmol) 和1，3-二-(2-溴乙氧基)丙烷-2-醇(10)(4.48g，14.6mmol)的无水乙醇(220 mL)溶液在78-80℃回流5天。将热溶液转移到锥形瓶中，逐滴加入丙酮(2.5 L)，同时搅拌溶液。将瓶子在冰箱(-25℃)中储存15小时。滤出白色固体， 用冷丙酮(100mL)洗涤。将产物溶解到氯仿(100mL)中，加入丙酮(1L)。 将瓶子在-25℃储存15小时。过滤分离的白色固体，用冷丙酮洗涤(100 mL)。重复重结晶过程3次。将产物与己烷(1L)一起研磨成粉末，过滤， 并在高真空下经P2O5干燥24小时，得到白色固体状的(S)-阳离子心磷脂 类似物(27)(15.5g，80％)。TLC(SiO2)甲醇/氯仿(1∶9)Rf～0.13。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ0.88(t，J＝6.6Hz，12H)，1.25(s，88H)，1.52-1.71(m， 8H)，3.40-3.71(m，36H)，3.92-4.11(m，7H)，4.74(d，J＝5.7Hz，1H，OH)。13C NMR(CDCl3，125MHz)：δ13.91，22.48，25.86，26.0，29.16，29.24，29.30， 29.40，29.46，29.48，29.51，29.84，31.72，52.93，53.01，53.46，64.98，66.51， 86.63，68.8，69.12，71.77，72.61，73.26.IR(cm-1)：3397(br，OH)，2917(s)， 1467(s)，1122(br s)。ESI-MS 1248.5[M+1-Br]，584.4[M+1-2Br/2]。
实施例5.阳离子心磷脂类似物(32)的合成[图5]
2-[2-(2，3-二-十四烷基氧基-丙氧基)-乙氧基]-四氢-吡喃(28)

在氩气氛下、在0℃，向搅拌的氢化钠(3.3g，82.6mmol，60％，在油 中)的无水四氢呋喃(50mL)的悬浮液中，在2小时内加入1，2-二(十四烷基 氧基)丙烷-3-醇(16)(20g，41.3mmol)的THF(150mL)溶液，维持温度低于 15℃。在室温搅拌2小时后，在0℃经3小时加入2-(2-溴乙氧基)四氢-2H- 吡喃(6)(25.9g，123mmol)，维持温度低于10℃。将反应混合物在室温搅 拌48小时。将反应混合物冷却至0℃，非常缓慢地加入冰水，以淬灭多 余的氢化钠，并用含水的饱和氯化铵(300mL)稀释，用乙酸乙酯(2×150 ml)萃取。用水(100mL)洗涤有机层，经硫酸钠干燥，在减压下浓缩。使 用1-8％乙酸乙酯的己烷溶液，经硅凝胶(230-400目)柱层析纯化粗化合物， 得到无色油状的2-[2-(2，3-二-十四烷基氧基丙基)乙氧基]四氢-吡喃 (28)(16.3g，66％)。TLC(SiO2)己烷：乙酸乙酯(1∶4)Rf～0.30。1H NMR(CDCl3， 300MHz)：δ0.88(t，J＝6.7Hz，12H)，1.25(s，44H)，1.53-1.87(m，10H)， 3.40-4.04(m，15H)，4.62-4.67(m，1H)。
2-(2，3-二-十四烷基氧基-丙氧基)-乙醇(29)

向2-[2-(2，3-二-十四烷基氧基丙氧基)乙氧基]四氢吡喃(28)(16g，26.75 mmol)的甲醇(500mL)溶液中，加入1N HCl的醚(5mL)溶液，并在室温搅 拌2小时。用碳酸氢钠中和反应混合物，直到溶液变成中性。过滤反应混 合物，并在减压下浓缩。将残余物溶解到乙酸乙酯(500mL)中，并用水(200 mL)洗涤，经硫酸钠干燥。在减压下浓缩有机层，经硅凝胶(230-400目) 柱层析纯化粗化合物，使用10-15％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，得到无色 油状的2-(2，3-二-十四烷基氧基丙氧基)乙醇(29)(10g，71％)。TLC(SiO2)己 烷/乙酸乙酯(1∶4)Rf～0.18。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ0.88(t，J＝6.7 Hz，12H)，1.25(s，44H)，1.51-161(m，4H)，2.58(t，J＝6Hz，OH)，3.41-3.71 (m，13H)。
1-[1-(2-溴-乙氧基甲基)-2-十四烷基氧基乙氧基]十四烷(30)

在氩气氛下、在0℃，向2-(2，3-二-十四烷基氧基丙氧基)乙醇(29)(20g， 37.8mmol)的无水二氯甲烷(200mL)的溶液中，加入三苯膦(14.8g，56.8 mmol)，随后加入四溴化碳(17.5g，53.0mmol)。将反应混合物在0℃搅拌 2小时。用水(100mL)稀释反应混合物，分离有机层，经硫酸钠干燥。在 减压下浓缩有机层，使用5％的乙酸乙酯的己烷溶液，经硅凝胶(230-400 目)柱层析纯化粗化合物，得到无色油状的1-[1-(2-溴乙氧基甲基)-2-十四 烷基氧基乙氧基]十四烷(30)(17g，76％)。TLC(SiO2)己烷/乙酸乙酯(1∶ 5)Rf～0.65。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ0.88(t，J＝6.7Hz，12H)，1.25(s， 44H)，1.51-157(m，4H)，3.40-3.61(m，11H)，3.79(t，J＝6Hz，2H)。
1，3-二-(1，2-二十四烷基氧基-4-氧杂-己基-6-N，N-二甲基铵溴化物)丙烷-2- 醇(32)

将1-[1-(2-溴乙氧基甲基)-2-十四烷基氧基乙氧基]-十四烷(30)(6g， 10.15mmol)和1，3-二(二甲基氨基)-2-丙醇(31)(0.48g，3.38mmol)的无水乙 醇(65mL)溶液在78-80℃回流5天。将热溶液转移到锥形瓶中，逐滴加入 丙酮(650mL)，同时搅拌溶液。将瓶子在冰箱(-25℃)中储存过夜。滤出 白色固体，用冷丙酮(100mL)洗涤。将固体溶解到二氯甲烷中，加入丙酮 (比例1∶10)。将瓶子在-25℃储存过夜。过滤白色固体，用冷丙酮洗涤(20 mL)。重复重结晶过程2次。真空下干燥产物，得到白色固体状的阳离子 心磷脂类似物(32)(0.82g，18％)。TLC(SiO2)甲醇/氯仿(1∶9)Rf～0.12。1H NMRδ(CDCl3，300MHz)：δ0.88(t，J＝6.8Hz，6H)，1.25(s，88H)，1.49-1.60(m， 8H)，3.39-3.82(m，31H)，3.81-4.01(m，8H)，4.52(d，J＝12.6Hz，2H)， 5.21-5.35(m，1H)。ESI-MS：1248.7[M+1-Br]，584.6[M+1-2Br-/2]。分子式 C73H152Br2N2O7；元素分析；计算值C：65.93，H：11.52，N：2.11，Br：12.02； 实测值C：64.46，H：11.34，N：2.21，Br：11.80。
实施例6.阳离子心磷脂类似物(34)的合成[图6]
[2-(2，3-二-十四烷基氧基丙氧基)乙基]-二甲胺(33)

在螺旋盖压力瓶中，将1-[1-(2-溴乙氧基甲基)-2-十四烷基氧基乙氧基] 十四烷(30)(10g，16.92mmol)加入2M二甲胺的甲醇溶液(100mL)。密封压 力瓶，在搅拌的油浴中在88-90℃加热60小时。冷却压力瓶，并在减压下 浓缩溶液。将粗化合物溶解到乙酸乙酯(300mL)中，并用水(100mL)洗涤。 在减压下浓缩有机层，使用5-20％乙酸乙酯的己烷溶液作为洗脱剂，经硅 凝胶(230-400目)柱层析纯化，得到浅色油状的[2-(2，3-二-十四烷基氧基丙 氧基)乙基]二甲胺(33)(8g，85％)。TLC(SiO2)甲醇/氯仿(1∶9)Rf～0.46。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ0.88(t，J＝6.7Hz，12H)，1.25(s，44H)，1.52-1.56(m， 4H)，2.17(s，6H，N-CH3)，2.78(t，J＝5.8Hz，2H)，3.39-3.46(m，4H)，3.49-3.56(m， 5H)，3.71(t，J＝5.4Hz，2H)。
1，3-二-(1，2-二-十四烷基氧基-4，10-二氧杂-癸基-7-N，N-二甲基铵溴化物)丙 烷-2-醇(34)

将(R)-[2-(2，3-二-十四烷基氧基丙氧基)乙基]二甲胺(33)(5g，8.99 mmol)和1，3-二-(2-溴乙氧基)丙烷-2-醇(10)(0.91g，2.99mmol)的无水 乙醇(60mL)溶液在78-80℃回流5天。将热反应混合物转移到锥形瓶中， 在2小时内逐滴加入丙酮(600mL)，保持在-20℃过夜。滤出固体，用冷 丙酮(100mL)洗涤，得到纯白色固体(5g)。在温甲醇∶丙酮(1∶10的比例) 中重结晶纯化粗固体，然后储存在-20℃过夜。分离、过滤固体，用冷丙 酮洗涤(50mL)。重复重结晶2次，得到纯化合物。在真空下干燥化合物， 得到白色固体状的阳离子心磷脂类似物(34)(1.82g，43％)。TLC(SiO2) 甲醇/氯仿(1∶9)Rf～0.13。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ0.88(t，J＝6.9Hz， 12H)，1.25(s，88H)，1.48-1.59(m，8H)，3.38-3.65(m，35H)，3.89-4.13(m，16H)， 4.77(brs，1H，OH)。ESI-MS：1336.4[M+1-Br]，628.4[M+1-2Br-/2]。分子式 C77H160Br2N2O9；元素分析；计算值C：65.22，H：11.37，N：1.98，Br：11.27； 实测值C：63.94，H：11.28，N：2.03，Br：9.94。
实施例7.阳离子心磷脂变体类似物(36)的合成[图6]
(R，S)-1，3-二-(1，2-二-十四烷基氧基丙基-3-N，N-二甲基铵溴化物)丁烷-2，3- 二醇(36)

将1，2-二-(十四烷基氧基)-3-二甲基氨基丙烷(2)(6g，11.72mmol)和 1，4-二溴-2，3-丁二醇(35)(1.16g，4.68mmol)的无水乙醇(72mL)的溶液回流 7天。将反应混合物冷却，蒸发溶剂，得到粗蜡状固体。将粗化合物溶解 到己烷(200mL)中，并在室温搅拌6小时，维持在0℃过夜。过滤分离的 固体，并用己烷(8×10mL)洗涤，以除去原料1，2-二-(十四烷基氧基)-3-二 甲基氨基丙烷。对粗物质进行柱层析(硅胶，70-230目)，使用1-10％甲醇 的二氯甲烷溶液洗脱，得到白色固体状的阳离子心磷脂变体类似物 (36)(1.9g，32％)。TLC(SiO2)甲醇/氯仿(1∶9)Rf～0.07。1H NMR(CDCl3，500 MHz)：δ0.88(t，J＝6.8Hz，12H)，1.24-1.31(m，88H)，1.51-1.62(m，8H)，2.13(brs， 2H，OH)，3.33-3.65(m，22H)，3.75-3.82(m，6H)，4.05-4.25(m，6H)，4.68(brs， 2H)，4.39(d，J＝13Hz，2H)。13C NMR(CDCl3，125MHz)：δ14.05，22.63，25.98， 26.14，29.30，29.42，29.63，31.87，52.58，53.28，54.83，67.27，68.87，69.40， 72.04，73.17。ESI-MS：1190.3[M+1-Br-]，555.3[M+1-2Br-/2]。分子式 C71H148Br2N2O6；元素分析；计算值C：66.32，H：11.60，N：2.18，Br：12.43； 实测值C：65.20，H：11.46，N：2.19，Br：12.24。
实施例8.阳离子心磷脂变体类似物(38)的合成[图7]
根据美国专利申请(Ahmad等PCT/US03/27806)所述的方法制备的2-苄基 -1，3-二[(1，2-二肉豆蔻酰基-sn-丙三基-3)-磷酰基]甘油二氰基乙基酯化合物 (37)

在氩气氛下，向1，2-肉豆蔻基-sn-甘油(24)(9.2g，19.01mmol)和N，N- 二异丙基乙基胺(5.46g，42.26mmol)的无水醚(150mL)的混合物中，加入 2-氰基乙基二异丙基氯亚磷酰胺(2-cyanoethyl diisopropylchlorophosphoramidite)(5g，21.13mmol)。将混合物在室温搅拌 3小时，过滤二异丙基胺氢氯化物，在减压下浓缩滤液，在真空下干燥 粗物质1小时，得到亚磷酰胺(phosphoramidite)中间体(13g)，照此用于下 一步磷酸化。
向上面的亚磷酰胺和1H-四唑(1.59g，22.77mmol，0.45M溶液，在乙 腈中)的无水CH2Cl2(80mL)的混合物中，加入2-苄氧基1，3-丙二醇(5)(1.55 g，8.54mmol)的CH2Cl2(20mL)溶液。将反应混合物在室温搅拌3小时， 冷却至-40℃，并逐份地加入叔丁基氢过氧化物(6.8g，75.91mmol)。在 -40℃搅拌30分钟后，将反应混合物加热至室温，用CH2Cl2(200mL)稀释， 用5％含水的NaHCO3(50mL)、盐水(50mL)洗涤，经硫酸钠干燥。减压下 浓缩有机层。残余物在硅胶(230-400目)上纯化，使用50-75％乙酸乙酯的 己烷溶液洗脱，得到无色浆状的(37)(7.1g，61％)。TLC(SiO2)乙酸乙酯/己 烷(3∶1)Rf～0.29。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ0.88(t，J＝7.0Hz，12H)， 1.22-1.39(m，88H)，1.51-1.57(m，8H)，2.58-2.79(m，4H)，3.39-3.87(m，13H)， 4.04-4.32(m，10H)，4.59-4.68(m，2H)，7.27-7.36(m，5H)。
1，3-二[(1，2-二-十四烷基氧基-sn-丙三基-3)-磷酰基]甘油二铵氯化物-n-丙 烷酯(38)

在50psi下，将2-苄基-1，3-二-[(1，2-二肉豆蔻基-sn-丙三基-3)-磷酰基] 甘油二氰基乙基酯(37)(0.74g，0.53mmol)的乙醇(25mL)溶液经 Pd(OH)2(210mg)氢化24小时。经硅藻土床过滤催化剂，用乙醇洗涤。在 减压下浓缩乙醇层，真空干燥过夜，得到浆状的阳离子心磷脂变体类似物 (38)0.6g。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ0.88(t，J＝6.8Hz)，1.24(brs，88H)， 1.51-1.61(m，8H)，2.80-2.88(m，1H)，3.01-3.3.18(m，3H)，3.40-4.21(m，28H)。 通过向醚中加入1N HCl溶液，将氨基化合物转变成氢氯化物盐。
实施例9.阳离子心磷脂酯类似物(44)的合成[图8]
甲苯-4-磺酸2，2-二甲基-[1，3]二氧戊环-4-基甲基酯(39).

向R(-)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-甲醇(12)(40g，0.30mol)和吡啶 (250mL)的混合物中，在0℃、经1小时分份地加入甲苯磺酰基氯化物(63.3 g，0.33mol)，然后使其升至室温，并搅拌12小时。在减压下浓缩反应混 合物，用水(1.5L)稀释粗化合物，用乙酸乙酯(500mL)萃取。有机层经硫 酸钠干燥，在减压下浓缩，得到浅色固体状的甲苯-4-磺酸2-[2-(2-甲氧基 乙氧基)乙氧基]乙基酯(39)(87g)。TLC(SiO2)乙酸乙酯/己烷(1∶4)Rf～0.22。 1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ1.29(s，3H)，1.32(s，3H)，2.44(s，3H，Ar-CH3)， 2.73(dd，J＝10.6Hz，1H)，3.97-4.0(m，3H)，4.22-4.30(m，1H)，7.35(dd，J＝8.4 Hz，2H，Ar-H)，7.77(dd，J＝8.4Hz，2H，Ar-H)。
2，2-二甲基-[1，3]二氧戊环-4-基甲基二甲胺(41).

方法1：在氩气氛下，向(R)-(+)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-甲醛 (40)(31g，0.23mol)和2M二甲胺的甲醇溶液(70mL)的无水甲醇(100mL) 混合物中，加入无水硫酸钠(50g)。在室温搅拌混合物2小时。将反应冷 却至0℃，分份加入氢硼化钠(7.1g，0.18mol)，在室温搅拌过夜。在减压 下浓缩反应混合物。将粗化合物溶解到乙酸乙酯(100mL)中，并用水(100 mL)洗涤。在减压下浓缩有机层，使用20-40％乙酸乙酯的己烷溶液作为洗 脱剂，经硅凝胶(230-400目)柱层析纯化，得到浅色油状的2，2-二甲基-[1，3] 二氧戊环-4-基甲基二甲胺(41)(7g，19％)。TLC(SiO2)甲醇/氯仿(1∶9)Rf～ 0.45。1H NMR(CDCl3，500MHz)：δ1.35(s，3H)，1.41(s，3H)，2.28(s，6H， N-CH3)，2.35(dd，J＝12.5Hz，N-CH2)，2.49(dd，J＝12.5Hz，N-CH2)，3.58(dd， J＝8Hz，1H)，4.07(dd，J＝8Hz，1H)，4.20-4.25(m，1H)。
方法2：在螺旋盖压力瓶中，将甲苯-4-磺酸2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙 氧基]乙基酯(39)(50g，0.17mol)溶解到2M二甲胺的甲醇溶液(400mL) 中。将压力瓶在搅拌的油浴中在88-90℃加热48小时。冷却压力瓶，并在 减压下浓缩溶液。将粗化合物溶解到乙酸乙酯(100mL)中，并用水(100mL) 洗涤。减压下浓缩有机层，得到浅色油状的2，2-二甲基[1，3]二氧戊环-4- 基-甲基二甲胺(41)(11g，40％)。
3-二甲基氨基丙烷-1，2-二醇(42)

向2，2-二甲基-[1，3]二氧戊环-4-基-甲基二甲胺(41)(5g，31.44mmol)的 甲醇(100mL)的溶液中，加入1M HCl的醚溶液(10mL)，并在室温搅拌 7小时。用碳酸氢钠中和反应混合物，直到溶液变成中性。过滤反应混合 物，并在减压下浓缩。用温乙酸乙酯(5×100mL)萃取粗化合物。减压下 浓缩有机层，得到浅色浆状的3-二甲基氨基丙烷-1，2-二醇(42)(1.4g，37％)。 TLC(SiO2)甲醇∶氯仿(1∶4)Rf～0.13。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ2.23(dd， J＝5.1Hz，1H，N-CH2)，2.38(s，6H，N-CH3)，2.47-2.56(m，1H，N-CH2)，3.49(dd， J＝11.2Hz，1H)，3.68-3.81(m，4H)。
1，2-二肉豆蔻酰基-3-二甲基氨基丙烷(43)

向冰冷却的(R)-(+)-3-二甲基氨基丙烷-1，2-二醇(42)(3g，25.2mmol)和 吡啶(100mL)的溶液中，经30分钟逐滴加入肉豆蔻酰氯化物(19.8g，75.6 mmol)。将反应混合物在室温搅拌4天，在减压下浓缩。用CH2Cl2(200mL) 稀释粗化合物，用水(100mL)和盐水(100mL)洗涤，经硫酸钠干燥。在减 压下浓缩有机层，使用5％EtOAc的己烷溶液，在硅凝胶(230-400目)上纯 化残余物，得到浅色浆状的(43)(2.9g，21％)。TLC(SiO2)乙酸乙酯Rf～ 0.54。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ0.88(t，J＝6.9Hz，6H)，1.25(brs，40H，-)， 1.60(t，J＝6.9Hz，4H)，2.13(brs，2H，OH)，3.33-3.65(m，22H)，3.75-3.82(m， 6H)，2.25(s，6H，N-CH3)，2.30-2.33(m，1H，N-CH2)，2.44(t，J＝6.3Hz，1H， N-CH2)，4.08(dd，J＝11.8Hz，1H)，4.36(dd，J＝11.8Hz，1H)，5.15-5.23(m，1H)。
(R)-1，3-二(1，2-二肉豆蔻酰基丙基-3-N，N-二甲基-3-乙氧基铵溴化物)丙烷 -2-醇(44)

将1，2-二-(十四烷基氧基)-3-二甲胺(43)(4g，7.42mmol)和1，3-二-(2-溴 乙氧基)丙烷-2-醇(10)(0.75g，2.47mmol)的无水乙醇(45mL)溶液回流5 天。将反应混合物冷却，蒸发溶剂，得到粗蜡状固体。对化合物进行柱层 析(硅凝胶，70-230目)，使用0-10％甲醇的二氯甲烷溶液洗脱，得到阳 离子心磷脂酯类似物(44)(67mg，2％)。TLC(SiO2)甲醇/氯仿(1∶9)Rf～0.10 1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ0.88(t，J＝7.2Hz)，1.25(brs，80H)，1.60(brs，8H)， 2.37(t，J＝7.5Hz，8H)，3.48-3.83(m，24H)，3.99-4.20(m，8H)，4.65-4.75(m，2H)， 5.14-5.25(m，2H)。
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，包括但不 限于下面列出的，结合于此作为参考，其程度如同每篇文献各自地和特别 地结合作为参考，且在这里以其全文的形式阐述。
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