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用于 植物 纤维表征和鉴定的方法

阅读：158发布：2021-09-22

专利汇可以提供用于植物纤维表征和鉴定的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了用于分离生物大分子的方法，这些生物大分子包括来自成熟的植物纤维 (如棉纤维)以及来自纺织品的肽、蛋白质、以及核酸。该生物大分子可用于表征该植物纤维(生产植物的来源、起源、基因组构成等等)。，下面是用于植物纤维表征和鉴定的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.用于表征碾轧的、打包的或经加工的成熟的棉纤维的方法，该方法包括以下步骤：
a.通过在来自Qiagen的AP1裂解缓冲液中孵育从所述棉纤维分离天然存在于所述棉纤维中的DNA；以及
b.表征编码在所述DNA的单体的序列中的信息。
2.用于鉴定碾轧的、打包的或经加工的成熟的棉纤维的方法，该方法包括以下步骤：
a.通过在来自Qiagen的AP1裂解缓冲液中孵育从所述棉纤维分离天然存在于所述棉纤维中的DNA；以及
b.对所述DNA进行对于所述棉纤维而言特异性的检测测定，所述测定选自基于聚合酶链反应的检测测定、基于抗体的检测测定和基于核酸杂交的检测测定。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述检测测定检测存在于产生纤维的棉花植物的基因组中的嵌合基因的存在或缺乏。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述嵌合基因包含选自N-乙酰葡糖胺转移酶、膦丝菌素乙酰转移酶、EPSPS、羟基苯丙酮酸双加氧酶、苏云金杆菌晶体蛋白的杀虫部分、聚(ADP核糖)聚合酶、聚(ADP核糖)葡萄糖水解酶、蔗糖合酶、蔗糖磷酸合酶、葡聚糖酶、纤维素合酶、几丁质酶、扩展蛋白、胼胝质合酶、激酶、烟酰胺酶、烟酸盐磷酸核糖基转移酶、烟酸单核苷酸腺苷酸转移酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶或烟碱酰胺磷酸核糖基转移酶的编码区或其部分或反义部分。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述检测测定是事件特异性检测测定。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述检测测定检测存在于产生纤维的植物的基因组中的特定等位基因的存在或缺乏。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述纤维存在于纱线、织物、薄纱或成品服装中。
8.用于分析产生棉纤维的棉花植物的基因组的方法，该方法包括以下步骤：
a.通过在来自Qiagen的AP1裂解缓冲液中孵育从所述棉花植物的碾轧的、打包的或经加工的成熟的棉纤维分离DNA，所述DNA天然存在于所述棉纤维中；以及
b.对所述DNA进行基因组分析方案。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在对所述DNA进行基因组分析方案之前对所述分离的DNA进行全基因组扩增步骤。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法应用于旧的成熟的纤维或旧的纱线、织物或成品服装上。
11.用于从碾轧的、打包的或经加工的成熟的棉纤维分离DNA的方法，该方法包括以下步骤：
a.从收获的成熟的棉纤维去除叶和茎废料；并且
b.在来自Qiagen的AP1裂解缓冲液中以4到100小时的一段时期孵育所述棉纤维；
以及
c.根据标准DNA分离方法加工所述裂解缓冲液并且分离所述DNA。
12.用于从编织的或针织的织物分离DNA的方法，所述织物包含棉纤维，所述方法包括以下步骤：
a.解开所述织物的线；
b.在来自Qiagen的AP1裂解缓冲液中以4到100小时的一段时期孵育所述线；以及c.根据标准DNA分离方法加工所述裂解缓冲液并且分离所述DNA。
13.根据权利要求1至12中任一项的方法在证明交易的植物纤维的身份的过程中的用途。
14.用于确定在碾轧的、打包的或经加工的成熟棉纤维的混合物中不同棉纤维的相对量的方法，该方法包括以下步骤：
a.根据权利要求1至12中任一项的方法从所述棉纤维的混合物分离天然存在于所述棉纤维中的DNA；
b.对所述DNA进行对于每种所述棉纤维而言特异性的检测测定，所述测定选自基于聚合酶链反应的检测测定、基于抗体的检测测定和基于核酸杂交的检测测定；以及c.确定这些纤维各自的相对含量。
15.证明交易的棉纤维的身份的方法，所述方法包括：
a.记录由经注册的栽培者对经证明的棉花种子的购买，所述棉花种子包含特别的基因组组成并且产生特定牌子的棉纤维；
b.将由所述注册的栽培者从所述经证明的棉花种子生产的粗棉纤维包注册为所述特定牌子的棉纤维；
c.通过与所述种子购买记录交叉校验来证实所述棉纤维包；
d.向纺织厂提供所述经注册的棉纤维包以便从所述牌子的棉纤维生产纱线、织物或服装；
e.使用根据权利要求1至12的任一项所述的方法在一个或多个步骤中审核所述牌子的棉纤维的身份。
16.权利要求15的方法，其中所述提供所述经注册的棉纤维包主要来自所述牌子的棉纤维。
17.权利要求15的方法，其中所述提供所述经注册的棉纤维包专有地来自所述牌子的棉纤维。

说明书全文

用于植物 纤维表征和鉴定的方法

发明领域

[0001] 本发明涉及用于分离生物大分子的方法，这些生物大分子包括来自成熟植物纤维(如棉纤维)的肽、蛋白质、以及核酸。在该生物大分子的分离之前，这些植物纤维可能已经加工成纱线，这些纱线随后可以被编织或针织成织物或成品服装。由于这些分离的大分子含有编码在它们的构造单元的序列中的信息，根据当前描述的方法从植物纤维分离出的这些大分子可以方便地用于表征该植物纤维或鉴定该植物纤维的起源或来源。使用植物纤维的历史来源，所生成的信息可以用在例如用于特殊植物纤维的身份(identity)保护(identity preservation)程序、植物纤维起源的证明中或者甚至用在育种系谱的重建中。

发明背景

[0002] 植物纤维形成对于在经济上重要的产品如纸、绳索(绳和索)以及纺织品的来源。纤维被植物学地定义为长的窄的尖端细的细胞，其在成熟时是无生命的和中空的、具有大部份由纤维素并且通常是木质素组成的硬的厚的细胞壁。在双子叶植物(亚麻、黄麻、大麻、苎麻)茎的韧皮部(内部树皮)中发现软纤维或韧皮纤维。在单子叶植物的(剑麻、马尼拉麻、菠萝)叶脉管束中发现硬纤维或叶纤维。表面纤维由种子类(棉花)、叶类或果实类(椰子纤维)的表面长成。

[0003] 棉花提供了许多用于纺织工业的高质量纤维并且在通过经典方法或通过遗传上改变棉株的基因组获得具有适于工业要求的特征的棉纤维方面已经投入了较多的努力。

[0004] 棉纤维起源于种子毛状体，更确切地说来自在开花期或正好在开花期之前的胚珠的外珠被的表皮的单个细胞。棉纤维的形态学发育已经很好地被文件证明(Basra和Malik，1984，Int Rev of Cytology89：65-113；Graves and Stewart，1988，前述；Ramsey和Berlin，1976，American Journal of Botany 63(6)：868-876；Ruan和Chourey，1998，Plant Physiology118：399-406；Ruan等人.2000，Aust.J.Plant Physiol.27：795-800；Stewart，1975，Am.J.Bot.62，723-730)。棉纤维，特别是来自陆地棉的棉纤维，经历了四个重叠的发育阶段：纤维细胞开始、延长、次生胞壁生物合成、以及成熟。纤维细胞开始是快速的过程。在开花期之后白色毛绒纤维立即开始发育并且持续至多约开花后3天(DPA)，此后纤维细胞延长(直到约10至约17 DPA)。取决于生长条件，次生胞壁生物合成开始并且持续至约25至约40 DPA，随后是直到约45至约60 DPA的成熟过程。该次生胞壁合成以及成熟期通常被视为“纤维强度建立期”。仅仅约25％至30％的表皮细胞分化成商业上重要的棉绒纤维(Kim和Triplett，2001)。大多数细胞不分化成纤维或发育成短纤维或绒毛。在纤维延长以及次生壁代谢期间，纤维细胞快速延长、合成次生壁成分、并且显示出急剧的细胞、分子以及生理学变化。纤维延长是与快速的细胞生长和膨胀(Seagull，
1991.In Biosynthesis and biodegradation of cellulose(Haigler，C.H.&Weimer，P.J.，eds)pp.1432163，MarcelDekker，New York)以及大量的细胞代谢物以及细胞壁成分如纤维素的恒定合成相偶联的。在成熟的棉纤维中约95％的干重是纤维素(Pfluger和Zambryski，2001，Curr Biol11：R436-R439；Ruan等认，2001，Plant Cell 13：47-63)。非赛璐珞成分(non-celluloid component)对于纤维细胞发育也是重要的(Hayashi和Delmer，
1988，Carbohydr.Res.181：273-277；Huwyler等人，1979，Planta146：635-642；Meinert和Delmer，1977，Plant Physiol59：1088-1097；Peng et al.，2002，Science295：147-150)。
与其他的植物细胞比较，棉纤维在次生壁中不含有木质素但是具有推测地与快速的细胞生长和膨胀相关的大液泡(Basra和Malik，1984，supra；Kim and Triplett，2001，Plant Physiology127：1361-1366；Mauney，1984，supra； Ruan and Chourey，1998，前述；Ruan等人，2000，前述；Van‘t Hof，1999，American Journal of Botany86：776-779)。

[0005] 发育中的棉纤维是活的细胞并且因此含有生物大分子如肽、蛋白质以及核酸(如DNA和RNA)。相比之下，成熟的纤维是无生命的中空的细胞，主要由纤维素组成。通常公认的是纤维细胞特别是棉纤维细胞不再含有可提取的核酸或蛋白质。基于这样的惰性，棉拭子被用作一种医学物质的涂抹器以及在法律学调查中用于(最通常地)从内颊取得DNA样品。

[0006] 此外，植物纤维在它们的在工业中的使用(尤其是在它们的在纺织工业中的使用)之前经受了广泛的加工。关于棉花，从在大田中的粗纤维加工成出售的成品服装包括很多步骤，这些步骤取决于所希望的终产品而变化很大。通常可以将在这些过程中的多种可能步骤分成机械和化学步骤。

[0007] 收获以及轧棉的过程可以使纤维经受热损伤和机械损伤。在轧棉期间没有施用化学药品。如果它含有大于8％的水分，在该轧棉期间通常利用热量来干燥棉花。通常周密地调节加热以避免纤维损伤。在采摘和轧棉操作期间可以发生机械损伤。这种机械损伤将会影响非常低％的总纤维。

[0008] 在纺纱期间，这些过程步骤主要是机械性的。在该纺纱过程中去除了短纤维(未成熟的和/或机械损伤的纤维)以及杂质。当用润滑剂处理用于针织的纱线并且用胶料处理约一半用于编织的纱线时，在接近纺纱过程结束时进行了加工中的第一化学处理。最通常地用蜡作为润滑剂处理用于针织的棉纱以便促进纱线通过针织设备移动。合成润滑剂也是可供使用的但是蜡仍然被认为是最常见的处理。对在完成的织物(经纱)中将用作纵向股的用于编织的纱线进行上浆(还被称为浆纱)。横向(纬)纱线未经上浆处理。用于上浆的普通材料是淀粉。还将聚乙烯醇用于上浆并且淀粉与聚乙烯醇的混合物是常见的。还可以将添加剂如粘合剂、保湿剂、软化剂、湿润剂、消泡剂以及其他辅助剂添加至该上浆处理。

[0009] 针织和编织两者都是不涉及化学或热应用的机械过程。在针织和编织结束时，制备用于整理的获得的织物的步骤涉及化学物质的应用，并且在一些情况下涉及高温的应用。该整理步骤的制备过程目标在于去除杂质，这些杂质将干扰贯穿染色、印制或其他的整理步骤的加工。主要地，必须从针织的织物去除蜡(擦洗)并且必须从编织的织物去除浆料(脱浆)。可以在这个步骤中去除其他的杂质包括籽壳、果胶以及其他的化学物质。用于脱浆的化学物质包括用于去除淀粉的酶类以及用于去除聚乙烯醇的苏打、灰或洗涤剂。擦洗是用将溶解蜡或使用的其他的润滑剂的有机溶剂进行的。在擦洗或脱浆之后，通常使用氯漂白剂或过氧化物漂白剂对织物进行漂白。漂白的目标在于去除任何剩余的非纤维材料、残留浆料的水解、氧化、以及去除以及改善染料的吸收度。用过氧化物进行漂白可以涉及在接近沸水温度的蒸汽或水浴，并且该漂白浴可以含有添加剂如稳定剂和掩蔽剂。用氯的漂白是在较低的温度(40至50摄氏度)下进行的并且相比于用过氧化物纤维素降解是较少的。如果是用氯进行漂白的，还需要脱氯剂处理。在一些织物上用受控制的火焰进行烧毛以便清理织物表面并且去除或减少起球。可以将光增亮剂添加至作为白色的未染色产品待售的织物或服装。通常将阴离子有机光增亮剂用于棉花上。若干化合物是可供使用的并且一些可以在漂白期间加入。

[0010] 丝光处理是可以施用于棉纱或织物的过程，用于改善染料的吸收或对其的反应以及其他的化学整理处理、改善断裂强度、改善尺寸稳定性、改善纤维平滑性和光泽以及掩盖不成熟的棉纤维。它是涉及用NaOH处理、洗涤、酸洗、漂洗以及干燥的过程。

[0011] 最常见的整理处理是染色。它可以在纱线、织物或服装阶段进行。用于棉花的染料是很多的并且有许多不同的类型。最常见的用于棉花的染料产品是靛蓝，但是它仅仅代表4％的染色的织物。染色可以作为连续过程或分批过程完成。虽然用于染色的化学物质是很多的，该过程通常涉及在染缸中使用接近沸腾的高温，可以将织物、纱线或服装长时间浸没于所述染缸中。印制是用于对纺织品添加颜色或图样的另外的主要工艺。印制主要涉及用于对织物或服装的表面施用着色墨的机械过程。染色和印制两者都涉及在过程结束时应用化学固定剂。

[0012] 另一个常见的整理处理(特别是在染色之后)是侵蚀性洗烫(aggressive laundering)。这将会包括使用洗涤剂以及其他的清洁剂以便从完成的织物或服装去除残留的整理物质。

[0013] 可以对织物、纱线或服装施用许多其他的机械和化学整理步骤，涉及化学物质和处理过程的很多选项。单独的软化剂可以是三个不同类型并且每一类型可以涉及若干不同的化学物质。

[0014] 尽管以上将粗棉纤维转化成目标使用的纺织产品的综述是高度广义的，将清楚的是本领域的人员不会期望能够在许多通常涉及的化学和热处理步骤之后从纱线、纺织品或成品服装产品提取肽、蛋白质或核酸。

[0015] 在工业中存在着能够追踪植物纤维尤其是成熟的和/或经加工的植物纤维的来源和/或起源的需要。这样的植物纤维的来源和/或起源的鉴定可能对于保证从特别种质生产的具有规定的质量的纤维的生产和加工的证明过程是重要的，如证明程序( Certification Program)(www.certifiedfibermax.com)。在成熟的和/或经加工的纤维中追踪来源和/或起源的能力还允许鉴定具有特殊特征的植物纤维(例如在WO2006/136351中描述的具有提高的化学反应性或可染性的纤维)。

[0016] 现有的证明程序是基于特别种质的纤维作物(如棉花)的种子购买的种子零售商或栽培者的记载以及注册的栽培者的生产的纤维的鉴定(在经过永久USDA棉包识别码的棉花的情况下)。

[0017] 如果从含有与纤维的来源植物相关的生物信息的成熟的和/或经加工的植物纤维提取生物大分子(如肽类、蛋白质类、核酸类、DNA或RNA)将是可能的话，则追踪植物纤维尤其是成熟的和/或经加工的纤维的来源和/或起源的能力将会大大提高。这样，将会使现有的证明程序的审核变成可能。此外，在供应链中的后期(超过纤维的栽培者或供应商，像例如在纺织者、编织者或零售消费者水平)鉴定纤维将会变成可能。

[0018] 农业研究机构，USDA和Applied DNA Sciences一起工作以研发基于DNA植入技术的标签系统用于追踪US来源的棉花和纺织品成分。

[0019] (htpp://seedquest.com/News/releases/2004/February/7829.htm)。

[0020] 因此能够从植物纤维如棉纤维尤其是从成熟的和/或经加工的纤维、纺织品、纱线或服装中提取天然存在的生物大分子，以及进一步能够从此类植物纤维导出植物来源相关信息将会是有利的。

[0021] 通过允许从植物纤维如棉纤维尤其是从成熟的和/或经加工的纤维、纺织品、纱线或服装中提取天然生物大分子，以及进一步能够从此类植物纤维导出植物来源相关信息，在以下不同的实施方案、实例、图形以及权利要求书中描述的方法提供了对于上述问题的方案。

[0022] 发明概述

[0023] 在一个实施方案中，本发明提供了用于表征成熟的植物纤维或经加工的植物纤维例如种子纤维或棉纤维的方法，该方法包括以下步骤：从所述植物纤维分离天然存在于所述植物纤维中的除多糖或木质素以外的生物大分子；并且表征所述生物大分子的单体的序列中编码的信息。

[0024] 在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了用于鉴定成熟的植物纤维或经加工的植物纤维例如种子纤维或棉纤维的方法，该方法包括以下步骤：从所述植物纤维分离天然存在于所述植物纤维中的除多糖或木质素以外的生物大分子；并且对所述生物大分子进行对所述植物纤维特异的检测测定。

[0025] 在一个实施方案中，生物大分子可以是多肽、蛋白质、核酸、DNA、RNA、单链RNA或双链RNA。

[0026] 在另一个实施方案中，该检测测定可以是基于聚合酶链式反应的检测测定、基于抗体的检测测定、或基于核酸杂交的检测测定。

[0027] 还在另一个实施方案中，检测测定可以检测存在于产生纤维的植物的基因组中的嵌合基因的存在或缺乏。该嵌合基因可以包含选自N-乙酰葡糖胺转移酶、膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinotricinacetyltransferase)、EPSPS、羟基苯丙酮酸双加氧酶(hydroxyphenylpyruvatedioxygenase)、苏云金杆菌晶体蛋白的杀虫部分、聚(ADP核糖)聚合酶、聚(ADP核糖)葡萄糖水解酶、蔗糖合酶、蔗糖磷酸合酶、葡聚糖酶、纤维素合酶、几丁质酶、扩展蛋白(expansin)、胼胝质合酶、激酶、烟酰胺酶、烟酸盐磷酸核糖基转移酶、烟酸单核苷酸腺苷酸转移酶(nicotinic acid mononucleotide adenyl transferase)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(nicotinamide adenine dinucleotide synthetase)或烟碱酰胺磷酸核糖基转移酶(nicotine amide phosphorybosyltransferase)的编码区或部分或其反义部分。该检测测定还可以是事件特异性检测测定。

[0028] 还在本发明的另一个实施方案中，该检测测定可以检测存在于该产生纤维的植物的基因组中的特异等位基因的存在或缺乏。

[0029] 还在本发明的另一个实施方案中，从其中分离生物大分子的纤维是存在于纱线、织物、薄纱或成品服装中的。

[0030] 本发明进一步提供了用于分析产生纤维的植物的基因组的方法，该方法包括以下步骤：从所述植物的成熟的或经加工的纤维分离核酸，所述核酸是在所述植物纤维中天然存在的；并且对所述核酸进行基因组分析方案。该方法可以应用于旧的成熟的纤维或旧的纱线、织物或成品服装。

[0031] 本发明的又一个实施方案是从成熟的植物纤维或经加工的植物纤维分离核酸如DNA的方法，该方法包括以下步骤：将所述植物纤维在含有洗涤剂、蛋白酶、以及盐的缓冲液中长时间孵育，优选为时4至100小时的时期；以及根据标准核酸分离方法处理所述裂解缓冲液并且分离所述DNA。

[0032] 在本发明的另一个实施方案中，提供了从编织的或针织的织物分离核酸如DNA的方法，该方法包括以下步骤：解开所述织物的线；将所述线在含有洗涤剂、蛋白酶、以及盐的缓冲液中长时间孵育，优选为时4至100小时的时期；以及根据标准核酸分离方法处理所述裂解缓冲液并且分离所述核酸。

[0033] 在本发明的又一个实施方案中，提供了从收获的成熟的植物纤维分离核酸如DNA的方法，该方法包括以下步骤：从该收获的成熟的植物纤维去除叶和茎废料；将所述植物纤维在含有洗涤剂、蛋白酶、以及盐的缓冲液中长时间孵育，优选为时4至100小时的时期；以及根据标准核酸分离方法处理所述裂解缓冲液并且分离所述核酸。

[0034] 本发明还提供了根据本发明的方法在证明交易的植物纤维的身份的过程中的用途。

[0035] 本发明进一步提供了确定在成熟的植物纤维或经加工的植物纤维的混合物中的不同植物纤维的相对量的方法，该方法包括以下步骤：从所述植物纤维的混合物分离天然存在于所述植物纤维中的除多糖或木质素以外的生物大分子；对所述生物大分子进行对每一种所述植物纤维特异的检测测定；并且确定每一种纤维的相对量。

[0036] 在本发明的另一个实施方案中，提供了证明交易的棉纤维的身份(identity)的方法，所述方法包括：记录由经注册的栽培者对经证明的棉花种子的购买，所述棉花种子包含特别的基因组组成并且产生特定牌子的棉纤维；将由所述注册的栽培者从所述经证明的棉花种子生产的粗棉纤维包注册为所述特定牌子的棉纤维；通过与所述种子购买记录交叉校验证实所述棉纤维包；向纺织厂(mill)提供所述经注册的棉纤维包以便从所述牌子的棉纤维，优选主要地，特别地专有地，从所述牌子的棉纤维生产纱线、织物或服装；并且使用如在此描述的方案以一个或多个步骤审核所述牌子的棉纤维的身份(identity)。

[0037] 附图简要说明

[0038] 图1：在从成熟的棉纤维材料(陆地棉FM966)分离的核酸模板上的GhGluc1的PCR扩增。泳道1：分子量标记；泳道2：来自纯化的纤维的模板DNA(1μl)；泳道3：来自未纯化的含有叶废料的纤维的模板DNA(1μl)；泳道4：仅仅来自叶废料的模板DNA(1μl)；泳道5：来自纯化的纤维的模板DNA(5μl)；泳道6：来自未纯化的含有叶废料的纤维的模板DNA(5μl)；泳道7：仅仅来自叶废料的模板DNA(5μl)；泳道8：无模板对照；泳道9：阳性对照-从FiberMax966(FM966)植物材料分离的基因组DNA。

[0039] 图2：在从成熟的陆地棉FM966棉纤维材料以及从4年龄的海岛棉(Gossypium barbadense)Pima Y5棉纤维材料分离的核酸模板上的GhGluc1的PCR扩增。泳道1：分子量标记；泳道2-3：来自FM966纯化的不含有叶废料的纤维的模板DNA(5μl)；泳道4-5：来自FM966未纯化的含有叶废料的纤维的模板DNA(5μl)；泳道6：来自不合有纤维材料的FM966叶废料的模板DNA(5μl)；泳道7-8：来自不合有叶废料的Pima Y5纯化的纤维的模板DNA(5μl)；泳道9：无模板对照；泳道10：阳性对照-从FiberMax966植物材料分离的基因组DNA。

[0040] 图3：在通过多种方案分离的核酸模板上的GhGluc1的PCR扩增。泳道1：分子量标记；泳道2：通过 Plant Mini Kit分离的模板DNA(5μl)；泳道3：通过 Plant Mini Kit分离的模板DNA(1μl)；泳道4：通过
Plant Mini Kit分离的模板DNA(1μl)；泳道5：通过 Plant Mini Kit分
离的模板DNA(5μl)；泳道6：通过 Genomic DNA Purification Kit分离
的模板DNA(1μl)；泳道7：通过 Genomic DNA Purification Kit分离的
模板DNA(5μl)；泳道8：通过 Genomic DNAPurification Kit分离的模
板DNA(1μl)；泳道9：通过 Genomic DNA Purification Kit分离的模板
DNA(5μl)；泳道10：通过CTAB程序分离的模板DNA(1μl)；泳道11：通过CTAB程序分离的模板DNA(5μl)；泳道12：无模板对照；泳道13：阳性对照-从FiberMax966植物材料分离的基因组DNA。

[0041] 图4：在棉布分离的核酸模板上的GhGluc1的PCR扩增。泳道1和8：分子量标记；泳道2：来自棉布(在孵育)的模板DNA(1μl)；泳道3：来自棉布(30’孵育)的模板DNA(1μl)；泳道4：来自棉布(在孵育)的模板DNA(5μl)；泳道5：来自棉布(30’孵育)的模板DNA(5μl)；泳道6：无模板对照；泳道7：阳性对照-从FiberMax966植物材料分离的基因组材料。

[0042] 图5：在从具有不同的织法(针织或编织)的棉衬衫分离的核酸模板上的GhGluc1的PCR扩增。泳道1：分子量标记；泳道2：来自编织棉衬衫的模板DNA，在孵育，(1μl)；泳道3：来自编织棉衬衫的模板DNA，在孵育，(5μl)；泳道4：来自编织棉衬衫的模板DNA，在孵育，(1μl)；泳道5：来自编织棉衬衫的模板DNA，在孵育，(5μl)；泳道6：来自针织棉衬衫的模板DNA，在孵育，(1μl)；泳道7：来自针织棉衬衫的模板DNA，在孵育，(5μl)；泳道8：来自针织棉衬衫的模板DNA，在孵育，(1μl)；泳道9：来自针织棉衬衫的模板DNA，在孵育，(5μl)；泳道10：来自编织棉衬衫的模板DNA，6天孵育，(1μl)；泳道11：来自编织棉衬衫的模板DNA，6天孵育，(5μl)；泳道12：来自编织棉衬衫的模板DNA，6天孵育，(1μl)；泳道13：来自编织棉衬衫的模板DNA，6天孵育，(5μl)；泳道14：来自针织棉衬衫的模板DNA，
6天孵育，(1μl)；泳道15：来自针织棉衬衫的模板DNA，6天孵育，(5μl)；泳道16：来自针织棉衬衫的模板DNA，6天孵育，(1μl)；泳道17：来自针织棉衬衫的模板DNA，6天孵育，(5μl)；泳道18：无模板对照；泳道19：阳性对照-从FiberMax966植物材料分离的基因组DNA。

[0043] 图6：在从成熟的转基因棉纤维材料(含有嵌合N-乙酰葡糖胺转移酶编码基因)分离的核酸模板上的NodC的PCR扩增。泳道1：来自转基因纤维材料的模板DNA，复本1(1μl)；泳道2：来自转基因纤维材料的模板DNA，复本1(5μl)；泳道3：来自转基因纤维材料的模板DNA，复本2(1μl)；泳道4：来自转基因纤维材料的模板DNA，复本2(5μl)；泳道5：无模板对照；泳道6：阳性对照-从转基因棉珠材料分离的基因组DNA；泳道7：分子量标记。

[0044] 图7：辨别来自陆地棉以及来自海岛棉的GhGluc1A亚基因组等位基因的端点Taqman测定的图示。对从Pima(海岛棉)或FM966(陆地棉)植株(叶)材料制备的基因组DNA样品(或者处于纯的形式或处于多种比率(75/25、50/50以及25/75)的混合物)进行TaqMan检测测定。X轴表明陆地棉Gluc1等位基因的存在，而Y轴表明海岛棉Gluc1等位基因的存在。在该混合的DNA样品中，该Taqman分析允许检测多种比率的两个等位基因。

[0045] 图8：辨别纤维材料和保罗衫纺织品上的来自陆地棉以及来自海岛的GhGluc1A亚基因组等位基因的端点Taqman测定的图示。从Pima(海岛棉)或FM966(陆地棉)植株(叶)材料制备的基因组DNA样品(或者处于纯的形式或者处于50/50比率的混合物)作为对照样品。对从纤维材料(FM966包)或从纺织品材料(保罗衬衫)制备的核酸进行TaqMan检测测定。X轴表明Gluc1陆地棉等位基因的存在，而Y轴表明Gluc1海岛棉等位基因的存在。在该分析中，仅仅检测到陆地棉等位基因，表明所有的纤维材料以及所有的纺织品材料仅仅含有陆地棉型纤维。

[0046] 本发明的实施方案的详细说明

[0047] 当前描述的方法是基于这样的意外的发现，即，从成熟的和/或经加工的植物纤维尤其是从种子纤维如棉纤维提取生物大分子(除多糖以外)如肽、蛋白质以及核酸、DNA或RNA是可能的。而且，该分离的DNA被证明具有足够的品质用于进一步的加工，该加工允许使用例如检测测定如基于聚合酶链式反应的扩增对这些纤维进行表征。

[0048] 因此，在第一实施方案中，本发明提供了用于成熟的植物纤维或经加工的植物纤维的方法，该方法包括以下步骤：从所述植物纤维分离天然存在于所述植物纤维中的除多糖或木质素以外的生物大分子；并且表征编码在所述生物大分子的单体的序列中的信息。

[0049] 如在此所使用，“成熟的植物纤维”是已经完成它的发育周期的纤维并且被认为是无生命的细胞的残余物。具体而言，成熟的植物纤维是将其从产生该植物纤维的纤维作物收获之后的植物纤维。例如，对于棉花，成熟的纤维将会被认为是当它们在收获时采摘的棉球中存在的纤维。将会清楚的是成熟的植物纤维包括所有的经纤维工业加工的植物纤维。

[0050] 如在此使用的“加工的植物纤维”是当从植物作物收获时的成熟的植物纤维，其已经经历了另外的机械、热和/或化学处理，包括上蜡、染色(dying)、梳理、纺纱、编织、上浆、丝光处理等(参见背景部分)。

[0051] 如在此使用的“植物纤维“是植物源的长窄的尖端细的细胞，其在成熟时是无生命的和中空的、具有大部份由纤维素和木质素组成的硬的厚的细胞壁。

[0052] 如在此所使用的“种子纤维”是由种子表面生长的纤维，如棉花。如在此使用的“棉花”包括陆地棉或海岛棉，包括“棉花祖先植物”如亚洲棉(Gossypium arboretum)、草棉(Gossypium herbaceum)以及雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)以及长萼棉(Gossypium longicalyx)。

[0053] “天然存在于植物纤维细胞中的生物大分子“是非外源性地添加至所述植物纤维的生物大分子(例如将分子如外来的DNA分子、肽、或蛋白质通过孵育或注射以便标记该植物纤维)，并且包括所有的大分子，即具有信息内容的聚合性质的分子。该信息内容将通常被编码在构造单元或单体的序列中。生物大分子的实例是多肽、蛋白质、核酸(如DNA或RNA)，它们是单链的或双链的。

[0054] 如在此使用的“表征生物大分子”表示解码该生物大分子的信息内容。这可以通过对该生物大分子进行一系列的分析来方便地进行，包括确定组成该大分子的单体的序列，以及对该生物大分子进行一种或多种特异的检测测定。

[0055] 如在此使用的“检测测定”是靶向于发现在生物大分子中的单体的特异序列的方法或方案。这可以包括基于聚合酶链反应的扩增、抗体检测或核酸杂交的检测测定。

[0056] 已经证明了特别的提取方法(虽然对提取的生物大分子的质量具有影响)对于能够从植物纤维提取这样的生物大分子的能力不是关键的。

[0057] 尽管如此，已经出乎意料地发现从成熟的和/或经加工的植物纤维分离的该生物大分子(尤其是它的核酸部分)的质量和/或数量可以是很好地通过若干措施来实现。

[0058] 例如可以有利的是使该有待分析的植物纤维长时间留在含有洗涤剂以及可能其他的组分的裂解缓冲液中。具体而言，已经发现在裂解缓冲液中孵育成熟的和/或经加工的植物纤维至少30分钟(但是更优选至少4小时多至120小时)的时期将提高回收的生物大分子尤其是其核酸部分的产量。

[0059] 还已经确定的是，在生物大分子的分离之前从植物纤维如收获的和/或碾轧的棉纤维仔细地去除杂质(包括叶残余物、树脂以及其他的废料)大大地改善了该分离的核酸的质量，尤其是改善了关于该分离的核酸的进一步分析和可加工性。

[0060] 可以有利地使用本发明的方法以便鉴定从含有转化事件或转化事件的组合的植物得到的棉纤维，在美国，所述转化时间可能是对美国农业部(USDA)的动植物卫生监督局(APHIS)的非规管状态(non-regulated status)的请求的主题，无论这样的请求是否批准或者仍然待决定，包括以下事件：

[0061]

[0062]

[0063] 为此，可以对该生物大分子尤其是该核酸如DNA进行检测测定，所述检测测定经特异地设计用以检测这些转化事件。这样的检测测定包括公开在http://gmo-crl.jrc.it/statusofdoss.htm的至少用于事件MON1445、MON531、MON15985、LLCotton25、3006-210-23以及281-24-236的测定。另外的信息如在这些转化事件中与插入的DNA的植物侧翼序列相邻的核苷酸序列(在此基础上可以设计信息特异性DNA检测测定)可以被发现于以下专利申请中：：

[0064]

[0065]

[0066] 可以有利地使用本发明的方法以便鉴定从含有遗传材料的棉珠得到的棉纤维，所述遗传材料赋予这些植物特别有利的、有用的性状。这样的性状的实例是更好的植物生长、增加的对非生物性胁迫(如高或低温、干旱、在土壤中的极端的水或盐或矿物含量)的耐受、增加的开花性能、较易收割、加速的成熟、商业相关植物部分(例如种子)的更高的收获产量、该收获的产品的更高的质量和/或更高的营养价值、以及该收获的产品的更好的储藏稳定性和/或可加工性。进一步并且特别强调的这样的性状的实例是对生物性胁迫的抗性，即，该植物的更好的对动物和微生物病害的防御，如对抗昆虫、螨、植物病原真菌、细菌和/或病毒，以及还有该植物的对某些除草活性化合物的增加的耐受性。

[0067] 可以有利地使用本发明的方法以便鉴定从含有遗传材料的棉珠得到的棉纤维，该遗传材料赋予除草剂耐受性例如草甘膦耐受植株，即，使这些植物对除草剂草甘膦或其盐耐受。可以通过不同的手段使植物对草甘膦耐受。例如，可以通过用编码酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶 (EPSPS)的基因转化该植株而获得草甘膦耐受植物。这样的EPSPS基因的实例是细菌鼠伤寒沙门菌的AroA基因(突变体CT7)(Comai等人，1983，Science221，370-371)、细菌土壤杆菌属的CP4基因(Barry等人，1992，Curr.Topics Plant Physiol.7，139-145)、编码碧冬茄属EPSPS(Shah等人，1986，Science233，478-481)、番茄EPSPS(Gasser等人.，1988，J.Biol.Chem.263，4280-4289)、或蟋蟀草属EPSPS(WO01/66704)的基因。它还可以是突变的EPSPS，例如在EP0837944、WO 00/66746、WO
00/66747或WO 02/26995中的描述。还可以通过表达编码草甘膦氧化还原酶的基因获得草甘膦耐受植物，如在美国专利号5,776,760和5,463,175中的描述。还可以通过表达编码草甘膦乙酰转移酶的基因获得草甘膦耐受植物，例如描述于WO 02/36782、Wo 03/092360、WO 05/012515以及WO 07/024782中。还可以通过选择含有上述基因的天然存在的突变的植株获得草甘膦耐受植物，例如描述于WO 01/024615或WO 03/013226中。其他的除草剂抗性植物是例如对抑制酶谷氨酰胺合酶的除草剂(如双丙氨磷、膦丝菌素或草铵膦)耐受的植物。可以通过表达对该除草剂解毒的酶或抵抗抑制的突变的谷氨酰胺合酶获得这样的植物。一个这样的有效的解毒酶是编码膦丝菌素乙酰转移酶的酶(如来自链霉菌的bar或pat蛋白)。表达外源性膦丝菌素乙酰转移酶的植物例如描述于美国专利号5,561,236、
5,648,477、5,646,024、5,273,894、5,637,489、5,276,268、5,739,082、5,908,810 以及
7,112,665中。此外的除草剂耐受植物还是对抑制酶羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)的除草剂耐受的植物。羟基苯丙酮酸双加氧酶是催化其中对羟基苯丙酮酸(HPP)被转化成尿黑酸盐的酶。可以用编码天然存在的抗HPPD酶的基因或编码突变的HPPD酶的基因转化对HPPD抑制剂耐受的植物，如描述于WO 96/38567、WO 99/24585以及WO 99/24586中。还可以通过用编码某些使得能够形成尿黑酸盐的酶的基因转化植物获得对HPPD抑制剂的耐受性，尽管被HPPD抑制剂抑制了该天然的HPPD酶。这样的植物和基因描述于WO 99/34008和WO
02/36787中。还可以通过用除了编码HPPD耐受酶的基因之外的编码预苯酸脱氢酶的基因转化植物来提高植物对HPPD抑制剂的耐受性，如描述于WO 2004/024928中。更进一步的除草剂抗性植物是那些对乙酰乳酸合酶(ALS)抑制剂耐受的植物。已知的ALS抑制剂包括例如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶类、嘧啶氧(硫)苯甲酸酯类、和/或磺酰基氨基羰基三唑啉酮除草剂。已经知道在ALS酶(还称为乙酰羟酸合酶，AHAS)中的不同突变赋予了对不同除草剂以及除草剂的组的耐受性，例如描述于Tranel和Wright(2002，Weed Science50：
700-712)中，以及在美国专利号5,605,011、5,378,824、5,141,870、以及5,013,659中。
磺酰脲耐受植物以及咪唑啉酮耐受植物的生产描述于美国专利号5,605,011、5,013,659、
5,141,870、5,767,361、5,731,180、5,304,732、4,761,373、5,331,107、5,928,937、以及
5,378,824、以及国际公开WO 96/33270中。其他的咪唑啉酮耐受植物还描述于例如WO
2004/040012、WO 2004/106529、WO 2005/020673、WO 2005/093093、WO 2006/007373、WO
2006/015376、WO 2006/024351、以及WO 2006/060634中。进一步的磺酰脲以及咪唑啉酮耐受植物还描述于例如WO 07/024782中。

[0068] 可以有利地使用本发明的方法以便鉴定从含有遗传材料的棉珠得到的棉纤维，所述遗传材料赋予对被某些目标昆虫攻击的抗性。这样的植物可以通过遗传转化或通过选择含有赋予这样的昆虫抗性的突变的植物而获得并且可以含有至少一个包含编码序列的转基因，该编码序列编码以下蛋白：

[0069] 1)来自苏云金杆菌的杀虫晶体蛋白或它的杀虫部分，如由Crickmore等人列举的杀虫晶体蛋白(1998，Microbiology and Molecular Biology Reviews，62：807-813)，由Crickmore等人(2005)在苏云金杆菌毒素命名法中更新，联机在： http://www.lifesci.sussex.ac.uk/Home/Neil Crickmore/Bt/)，或它的杀虫部分，例如Cry蛋白类Cry1Ab、CrylAc、Cry1F、Cry2Ab、Cry3Aa、或Cry3Bb的蛋白质或其杀虫部分；或

[0070] 2)来自苏云金杆菌的晶体蛋白或它的部分，其在来自苏云金杆菌的第二个其他的晶体蛋白或它的部分的存在下是杀虫的，如由Cry34和Cry35晶体蛋白构成的二元毒素(Moellenbeck等人，2001，Nat.Biotechnol.19：668-72；Schnepf等人2006，Applied Environm.Microbiol.71，1765-1774)；或

[0071] 3)包含来自苏云金杆菌的不同的杀虫晶体蛋白的部分的杂合杀虫蛋白，如以上1)的蛋白质的杂合体或以上2)的蛋白质的杂合体，例如由玉米事件MON98034(WO2007/027777)生产的Cry1A.105蛋白；或

[0072] 4)以上A1)至A3)的任意一种蛋白质，其中一些，尤其是1至10个氨基酸已经被另外的氨基酸取代以便获得对靶昆虫种系的更高的杀虫活性、和/或用以扩大所影响的靶昆虫种系的范围、和/或由于在克隆或转化期间引入编码DNA的变化的缘故，如在玉米事件MON863或MON88017中的Cry3Bb1蛋白、或在玉米事件MIR604中的Cry3A蛋白；

[0073] 5)来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的杀虫分泌蛋白或它的杀虫部分，如列举在：http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html的营养期杀虫蛋白(VIP)，例如来自VIP3Aa蛋白类别的蛋白质；或

[0074] 6)来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的分泌蛋白，该分泌蛋白在来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的第二种分泌蛋白的存在下是杀虫的，如由VIP1A和VIP2A蛋白构成的二元毒素(WO 94/21795)；或

[0075] 7)包含来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的不同的分泌蛋白的部分的杂合杀虫蛋白，如以上1)中的蛋白质的杂合体或以上2)中的蛋白质的杂合体；或

[0076] 8)以上1)至3)的任意一种蛋白质，其中一些，尤其是1至10个氨基酸已经被另外的氨基酸取代以便获得对靶昆虫种系的更高的杀虫活性、和/或用以扩大所影响的靶昆虫种系的范围、和/或由于在克隆或转化期间引入编码DNA的变化的缘故(尽管仍然编码杀虫蛋白)，如在棉花事件COT102中的VIP3Aa蛋白。

[0077] 可以有利地使用本发明的方法以便鉴定从含有遗传材料的棉珠得到的棉纤维，所述遗传材料赋予对非生物性胁迫的耐受性。这样的植物可以通过遗传转化获得并且可以含有以下转基因的一种或多种

[0078] a.能够减少植物细胞或植物中聚(ADP核糖)聚合酶(PARP)基因的表达和/或活性的转基因，如描述于WO 00/04173或EP 04077984.5或EP06009836.5中。

[0079] b.能够减少植物或植物细胞的PARG编码基因的表达和/或活性的胁迫耐受增强转基因，例如描述于WO 2004/090140中。

[0080] c.用于编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径的植物功能性酶的胁迫耐受增强转基因，这些酶包括烟酰胺酶、烟酸盐磷酸核糖基转移酶、烟酸单核苷酸腺苷酸转移酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶或烟碱酰胺磷酸核糖基转移酶，例如描述于EP 04077624.7或WO 2006/133827或PCT/EP07/002433中。

[0081] 可以有利地使用本发明的方法以便鉴定从含有遗传材料的棉珠得到的棉纤维，该遗传材料可以改变该纤维的特征如强度、长度、纤维细度等，包括描述于WO05/017157(葡聚糖酶沉默基因)、WO04/0655571(几丁质酶编码基因)、WO02/45485和WO08/012058(蔗糖合酶基因)、WO01/17333(蔗糖磷酸合成酶基因)、WO98/00549(纤维素合酶基因)、WO06/133827(N-乙酰葡糖胺转移酶基因如几丁质合酶或NODC编码基因)中的嵌合基因。

[0082] 本发明的方法的进一步的应用是鉴定植物纤维，如来自包含特定基因的特异等位基因变异的植物的棉纤维。用于鉴定这样的等位基因变异的方法在本领域是熟知的。具体而言，这样的等位基因变异可以用于区分来自特别植物种系的纤维，像例如区分来自海岛棉和陆地棉的纤维。作为实例，在来自海岛棉和来自陆地棉的葡聚糖酶A亚基因组等位基因之间的多态性(通过在海岛棉中的Gluc1A亚基因组等位基因的编码区中存在的终止密码子来区分，如描述于未公开的欧洲申请08075514.3中，通过引用并入本文)可以用于区分起源于海岛棉和陆地棉的纤维。

[0083] 在此描述的方法还可以用于分离核酸模板，这些模板可以用于任何基因组表征方案，包括AFLP、READS等等。在应用基因组表征方案之前，可以使用本领域已知的方法(如全基因组扩增)扩增这些从成熟的或经加工的纤维分离的核酸模板。

[0084] 在此描述的方法还可以用于协助证明程序，保证具有特殊规定的特征的商业贸易植物纤维(如棉纤维)的供应。通常，这样的证明程序包括记录注册的栽培者所购买的经证明的种子，由此该棉花种子包含特异的基因组构成并且产生特定牌子的植物纤维。对由注册的栽培者从所述经证明的种子生产的收获的植物纤维包进行注册，并通过用所述种子购买记录的交叉校验来证实所述收获的植物纤维包，并且将其提供给纺织厂(mill)以便优选主要地，特别地专有地，从所述牌子的纤维生产纱线、织物或服装。在此描述的方法允许在该供应链中的不同点进行审核。

[0085] 在此描述的方法还可以应用于从在植物种子上的毛发样(毛状体样)结构(如番茄种子上的毛发或在小麦种子基部上的粗毛(bear hairs))分离生物大分子。

[0086] 在此描述的方法还可以应用于表征旧的纤维和旧的纺织品材料(例如超过100年龄的纤维和纺织品)的核酸材料。没有将本发明限制于特殊的机理和理论，生物材料被保存在旧的纤维中的一个可能性被认为是因为我们已经观察到成熟的纤维被扭曲使得生物材料被“截留”(并且由此“保存”)在成熟的纤维中。

[0087] 在此描述的方法还可以应用在法医应用中，因为在犯罪现场鉴定的纤维或纺织品材料可以例如通过上述的全基因组扩增步骤进行表征，如本申请的实施例6中所示。

[0088] 如在此使用的“包含“将被解释为指定存在如提及的陈述的特征、整体、步骤或组分，但是并不预先排除存在或添加一个或多个特征、整体、步骤或组分、或它们的组。因此，例如包含核苷酸或氨基酸的序列的核酸或蛋白质可以包含比实际引用的更多的核苷酸或氨基酸，即被包含在更大的核酸或蛋白质中。包含功能上或结构上定义的DNA区域的嵌合基因可以包含另外的DNA区域等。

[0089] 以下非限制性实例描述了用于从成熟的植物纤维以及从经加工的纤维分离生物大分子的方法以及它们用于表征或鉴定植物纤维的用途。除非在实施例中另行说明，所有的重组DNA技术是根据如描述于Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY和Ausubel等人(1994)Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA的第1卷和第2卷中的标准方案来进行的。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于由R.D.D.Croy撰写的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中，由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK联合出版。

[0090] 贯穿本说明书和实施例对呈现在序列表中的以下序列进行了引用：

[0091] SEQ ID NO1：用于Ghgluc1的PCR扩增的寡核苷酸1

[0092] SEQ ID NO2：用于Ghgluc1的PCR扩增的寡核苷酸2

[0093] SEQ ID NO3：用于NodC的PCR扩增的寡核苷酸1

[0094] SEQ ID NO4：用于NodC的PCR扩增的寡核苷酸2

[0095] SEQ ID NO5：用于扩展蛋白的PCR扩增的寡核苷酸1

[0096] SEQ ID NO6：用于扩展蛋白的PCR扩增的寡核苷酸2

[0097] SEQ ID NO7：用于Ghgluc1的Taqman检测测定的寡核苷酸1(正向引物)[0098] SEQ ID NO8：用于Ghgluc1的Taqman检测测定的寡核苷酸2(反向引物)[0099] SEQ ID NO9：用于亚基因组A Ghgluc1等位基因的Taqman检测测定的寡核苷酸3(检测陆地棉Gluc1等位基因的VIC标记的寡核苷酸)

[0100] SEQ ID NO10：用于亚基因组A Ghgluc1等位基因的Taqman检测测定的寡核苷酸4(检测海岛棉Gluc1等位基因的FAM标记的寡核苷酸)

[0101] SEQ ID NO11：用于rpl16的PCR扩增的寡核苷酸1

[0102] SEQ ID NO12：用于rpl16的PCR扩增的寡核苷酸2

[0103] SEQ ID NO13：用于matK的PCR扩增的寡核苷酸1

[0104] SEQ ID NO14：用于matK的PCR扩增的寡核苷酸2

[0105] SEQ ID NO15：用于trnT-trnL的PCR扩增的寡核苷酸1

[0106] SEQ ID NO16：用于trnT-trnL的PCR扩增的寡核苷酸2

[0107] SEQ ID NO17：用于ndhF的PCR扩增的寡核苷酸1

[0108] SEQ ID NO18：用于ndhF的PCR扩增的寡核苷酸2实施例

[0109] 实施例1：从粗棉纤维材料分离核酸。

[0110] A.从陆地棉FM966纤维材料分离核酸。

[0111] 使用常规的用于从植物材料分离基因组DNA的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)程序(Doyle和Doyle，1987，Phytochem.Bull.19，11)对从FM966收获的已经被碾轧并打包的棉纤维材料进行DNA提取。尽管获得了核酸的沉淀物，这个材料不能用于任何进一步的应用，包括PCR扩增或限制性内切酶消化酶切。

[0112] 该收获的打包的粗棉纤维仍然含有一些杂质如叶残余物以及其他的废料。通过手工清理仔细地去除这些污染材料以便获得纯化的纤维部分(以及废料部分)。根据制造商的推荐使用由QIAGEN商业化的 Plant Mini Kit对该粗纤维材料、该纯化的纤维材料以及该废料部分进行DNA提取(参见 Plant Handbook，在www1.qiagen.com/HB/DNeasy PlantMiniMaxi是可获得的)并且使用紫外分光光度法确定该分离的核酸的浓度(表1)。

[0113] 表1.

[0114]样品 ng/ul A260 A280 260/280 260/230
纯纤维 3.49 0.07 0.05 1.41 0.52
纯纤维 4.19 0.084 0.065 1.29 0.51
粗纤维 14.91 0.298 0.194 1.54 0.43
粗纤维 17.4 0.348 0.239 1.46 0.43
仅废料 76.55 1.531 1.09 1.4 0.45

[0115] 在标准PCR反应中这些分离的核酸被用作模板，使用以下引物以检测内源性棉花葡聚糖酶基因(GhGluc1；参见EP 08075514.3，对GhGluc1的不同的等位基因的核苷酸序列通过引用并入本文)：

[0116] SE002：ggccgaagccgatcttatctagg(SEQ ID NO：1)

[0117] SE003：cggcaacaatcttccatctccag(SEQ ID NO：2)

[0118] 使用了1μl和5μl的模板核酸。PCR扩增的结果在图1中进行了可视化。使用纯纤维(5μl模板)清楚地检测到656bp的扩增子(如所期望的)(泳道4)，而使用从纯的和粗的纤维材料两者分离的少量(1μl)的核酸可以观察到微弱的信号。在较高浓度下使用时，仅从废料所分离的核酸无法检测出扩增信号，并且从未纯化的材料所获得的核酸也无法检测出扩增信号，表明从污染材料所获得的提取物似乎抑制了从粗纤维材料所获得的核酸的进一步加工。

[0119] 有趣的是，这项实验证明那些可以被进一步分析的核酸可以从成熟的棉纤维材料提取。该实验还表明可以通过从粗的收获的并且碾轧的棉纤维去除叶废料及其他杂质而进一步提高分离的核酸-DNA的质量。

[0120] B.从海岛棉Pima-Y5纤维材料分离核酸。

[0121] 如上在1.A.中的描述将来自海岛棉Pima 5Y的4年龄的旧的粗棉纤维材料连同陆地棉FM966棉纤维材料一起处理。如在1.A中的描述将所获得的核酸用作PCR反应中的模板。结果在图2中进行了可视化。

[0122] 虽然海岛棉纤维是更结实的并且具有不同于陆地棉纤维的结构，结果证明还可以从这些纤维分离包括可加工的DNA的核酸。有趣的是，这些纤维也已经在非最佳条件下储存了若干年，表明可以从旧的纤维材料获得可加工的DNA或其他的核酸。

[0123] C.其他棉内源性基因的扩增。

[0124] 将所分离的核酸也用作在标准PCR反应中的模板，该标准PCR反应使用对其他的内源性基因特异的引物，如以下从扩展蛋白编码基因扩增299bp片段的引物：

[0125] Kl51：gggagcttgtggttatggaaacc(SEQ ID NO：5)

[0126] Kl52：cagggacgatcccagctcgatattc(SEQ ID NO：6)

[0127] 使用对于其他内源性基因的这些其他引物还可以检出所预期的多个扩增子。

[0128] D.使用其他裂解缓冲液和方案从棉纤维材料分离核酸。

[0129] 如在部分1.A中的描述通过去除污染叶废料及其他杂质而纯化粗棉纤维材料。使用由QIAGEN商业化的 Plant Mini Kit或由PROMEGA CORPORATION商业化的基因组DNA纯化试剂盒或常规的CTAB程序(Doyle和Doyle，1987，Phytochem.Bull.19，11)从该纯化的纤维材料提取核酸。使用紫外分光光度法确定所获得的核酸的浓度(表2)。

[0130] 表2.

[0131]

[0132] ＊注释：高浓度读数可能是由于缺乏RNA酶处理。

[0133] 将所分离的核酸用作在标准PCR反应中的模板，该标准PCR反应使用以下引物以检测内源性的棉葡聚糖酶基因(GhGluc1；参见EP 08075514.3，对于GhGluc1的不同等位基因的核苷酸序列参见通过引用并入本文)：

[0134] SE002：ggccgaagccgatcttatctagg(SEQ ID NO：1)

[0135] SE003：cggcaacaatcttccatctccag(SEQ ID NO：2)

[0136] 使用1μl和5μl的模板核酸。PCR扩增的结果在图3中进行了可视化。虽然通过和CTAB程序所分离的这些核酸的明显较高的浓度(5μl反应物)对该PCR反应具有负面效应，使用通过任何方法分离的模板核酸观察到了所期望的DNA扩增子。

[0137] 虽然效率较低，我们观察到还可以通过将这种纤维材料与水(H2O)孵育一定量的时间(例如在一定体积的水存在下孵育经清理的纤维材料至少4小时)而从该经清理的纤维材料提取核酸。

[0138] 实例2：从纺织品分离核酸。

[0139] A.从棉布分离核酸。

[0140] 从成熟的棉纤维成功分离可被进一步加工的核酸(如DNA)促使了尝试分离生物大分子如核酸，特别是从在纺纱和编织之后的纤维分离可加工的DNA。为此，通过解开一块棉布分离纱线，将其剪切成小的碎片并且在5ml的裂解缓冲液( AP1缓冲液)中在65℃下孵育至少30分钟或在室温下过夜。将缓冲液挤出该材料并且将500μl裂解液转移到微量离心管并且根据制造商的推荐进一步处理，即：

[0141] ■加入130μl AP2缓冲液、混合并且在冰上孵育5分钟

[0142] ■在13000rpm下离心5分钟

[0143] ■将该液相转移到lilac QIAshredder微型旋转柱上

[0144] ■在13000rpm下离心2分钟

[0145] ■将流通液转移到新的微量离心管(未干扰沉淀物)；

[0146] ■加入800μl AP3/E缓冲液并且混合■转移650μl到微型旋转柱上并且在8000 rpm下离心1分钟、丢弃流通液

[0147] ■用所剩余的样品重复这个步骤；丢弃该收集管并且将该柱放置在新的2ml收集管中

[0148] ■用500μl AW缓冲液洗涤该柱并且在8000rpm下离心1分钟、丢弃流通液[0149] ■用500μl AW缓冲液洗涤该柱并且在13000rpm下离心2分钟、丢弃流通液[0150] ■将该柱放置在没有遗留乙醇的1.5ml微量离心管中

[0151] ■加入50μl水到该柱并且在室温下孵育至少5分钟

[0152] ■在8000rpm下离心1分钟。在4℃下储存该DNA。

[0153] 在使用实例1.A的引物的PCR反应中将1μl和5μl样品用作模板DNA。结果在图4中进行了可视化。当使用在孵育过夜之后的核酸样品时，可以检出所期望的669bp的扩增子，这表明该方案可用于从在纺纱和编织之后的棉纤维分离核酸。在孵育过夜之后比孵育30分钟PCR信号显著更强，表明前者方案产生了更高浓度的可加工的DNA。

[0154] B.从具有不同织法的纺织品分离核酸。

[0155] 该核酸分离方案还应用于具有不同织法的成品服装(即，已经经历不同的加工)。为此，从棉长袖衬衫(编织)以及棉保罗衫(针织)上剪下碎片，并且如在实施例2A中处理(除在裂解缓冲液中进行孵育过夜、或甚至延长到6天的孵育以外)。对所分离的核酸进行如在实施例2.A中所描述的PCR反应并且将结果如在图5中进行了可视化。

[0156] 在使用从两种织物所分离的核酸样品进行PCR扩增之后检出了所期望的扩增子。再次，其中在裂解缓冲液中的孵育已经被延长的样品中的信号是更强的。

[0157] 实例3：从特种纤维分离核酸。

[0158] 从包含N-乙酰葡糖胺转移酶嵌合基因(“NodC”基因)的转基因棉株分离并且纯化成熟的纤维，如在WO2006/136351实施例1中的描述。根据制造商的推荐使用由QIAGEN商业化的 Plant Mini Kit从纯化的纤维提取物分离核酸(参见在www1.qiagen.com/HB/DNeasyPlantMiniMaxi下可获得的植物手册)并且使用紫外分光光度法确定所分离的核酸的浓度(表3)。

[0159] 表3.

[0160]样品 ng/ul A260 A280 260/280 260/230
NodC1 7.95 0.159 0.105 1.51 0.56
NodC2 7.62 0.152 0.101 1.51 0.56

[0161] 分离的核酸也用作在标准PCR反应中的模板，该标准PCR反应使用对其他内源性基因特异性的引物，如以下从NodC编码基因扩增1224bp片段的引物：

[0162] Idb093：cgtttttcactcatcgtcgttttcaagtgtcgtagatgtgatcggtttgcttgcg(SEQ ID NO：3)

[0163] Idb126：ggcgcgccttaggaactctcgcgtgatagccac(SEQ ID NO：4)

[0164] 使用了1μl和5μl的模板核酸。PCR扩增的结果在图6中进行了可视化。可以在各样品中观察到所期望的指示该转基因的存在的DNA扩增子。

[0165] 实例4：自动化和区分不同的纤维类型。

[0166] 如在未公开的欧洲申请08075514.3中的描述(通过引用并入本文)，来自海岛棉的葡聚糖酶1A亚基因组等位基因与来自陆地棉的葡聚糖酶1A亚基因组等位基因不同，在前者中Gluc1A亚基因组等位基因的编码区中存在终止密码子。这种多态性可用于区分来自具有该海岛棉Gluc1等位基因或该陆地棉Gluc1等位基因的植物的棉纤维。为此，设计了测定，由此所使用的扩增携带该多态性的DNA片段的寡聚核苷酸引物是：

[0167] 正向引物：GCTTTTGGAAGCGATATAACATCGA(SEQ ID NO：7)

[0168] 反向引物：GGCATAGGCAAAATAAGGGTACACA(SEQ ID NO：8)

[0169] 通过监测以下检测多态性的荧光标记引物的降解而检测多态性：

[0170] VIC-AATCCTGTCGAACCAG(陆地棉等位基因)(SEQ ID NO：9)

[0171] FAM-ATCCTGTCAAACCAG(海岛棉等位基因)(SEQ ID NO：10)

[0172] 将这些引物用于qPCR装置中，将循环次数增加至高达60并且仅确定在终点的荧光。作为核酸模板，从海岛棉纤维(PIMA)或陆地棉纤维(FM966)分离的DNA混合物按以下比率使用：100％PIMA、75％PIMA/25％FM966、50％PIMA/50％FM966、25％PIMA/75％FM966、100％FM966。结果示意地表示在图7中。

[0173] X轴表明陆地棉Gluc1等位基因的存在，而Y轴表明海岛棉Gluc1等位基因的存在。在从PIMA纤维分离的DNA中，仅检测到海岛棉 Gluc1等位基因。在从FM966纤维分离的DNA中，仅检测到陆地棉Gluc1等位基因。在混合的DNA样品中，该Taqman分析允许检测两个等位基因的多种比率。

[0174] 在进一步的步骤中，同样的RT-PCR类型分析用于分析来自棉纺织品以及来自FM966包的纤维材料的核酸样品。结果表示在图8中。在从该FM966包以及从保罗衫提取的核酸中，仅检测到陆地棉Gluc1等位基因，这表明所使用的棉材料唯一地起源于陆地棉类型材料。

[0175] 虽然该分析可能需要进一步优化，这种优化清楚地是在技术人员的领域之内的。

[0176] 实例5：从棉纤维分离的质体基因组的表征。

[0177] 由于出乎意料发现可以从成熟的棉纤维分离并且表征基因组DNA，我们研究了在从这些纤维提取的DNA池中鉴定质体DNA的可能性。

[0178] 虽然已经显示白色体质体存在于发育棉纤维之中(Ryser U.(1985)Europeanjournal of cell biology39，第236-256页)，没有预期它们存在于成熟的棉纤维中。白色体与叶绿体由于具有同样的基因组而相似-因为它们分化自相同的祖细胞类型-但是白色体因为淀粉含量的高积聚而特异化。

[0179] Cronn等(2002)American Journal of Botany89(4)：707-725公开了扩增质体基因组的4个基因(rpl16、matK、trnT-trnL、以及ndhF)的引物组合。在第一步骤中，通过对从棉叶分离的DNA进行PCR分析我们优化了用于扩增这四个基因的公开的引物组合。在下一步骤中，将每个基因的优化的引物组合用于扩增从从微型棉包(被证明的FiberMax棉)获得的纤维DNA样品。出人意料地，我们显示了来自这种纤维DNA样品的4个PCR片段的扩增。在TOPO平端载体中亚克隆，随后通过这些片段的序列分析证实这四个片段起源于该质体基因组。对于rpl16、matK以及trnT-trnL，测序导致独特的共有序列，对于ndhF获得了若干共有序列。

[0180] 由于陆地棉以及海岛棉的完全叶绿体序列是在EMBL数据库(条目DQ 345959是柯克棉(coker)310FR(陆地棉)的叶绿体DNA序列，并且条目AP 009123是海岛棉的叶绿体DNA序列)中是可获得的，将获得的序列与该公开的序列进行比对是可能的。发现获得的序列与该公开的陆地棉序列是100％相同的(除简并引物位点外)。这证实在该棉包中的纤维源自于陆地棉。现在这些特异性质体序列的成功的分子表征为纤维DNA的基因分型提供了新的时机。同样可以对更旧的纤维样品进行质体序列探查并且它们的关系可以在进化以及育种过程中得以解释。

[0181] PCR条件：

[0182] 2μl模板

[0183] 1.5μl正向引物(10μM)

[0184] 1.5μl反向引物(10μM)

[0185] 21μl MQ

[0186] 1μl dNTP

[0187] 10μl 10X HF缓冲液

[0188] 0.5μl Phusion

[0189] 12.5μl MQ

[0190] PCR程序

[0191] 98℃下30秒

[0192] 98℃下10秒

[0193] 60℃下30秒

[0194] 72℃下60秒

[0195] 35次循环

[0196] 72℃下10分钟

[0197] 保持于4℃

[0198] 引物组合：

[0199] rpl16 F71：gctatgcttagtgtgtgactcgtt(SEQ ID No11)

[0200] R1516：cccttcattcttcctctatgttg(SEQ ID No12)

[0201] matK matKF3：ctaatggatcaacagaawcgtttg(SEQ ID No13)trnKR：aactagtcggatggagtag(SEQ ID No14)

[0202] trnT-trnL trnL2：aatattactgactccmttttkattttckag(SEQ ID No15)trnB：tctaccgatttcgccatatc(SEQ ID No16)

[0203] ndhF 5’Fnew ：gaatatgcatggatcatacc(SEQ ID No17)1318R：cgaaacatataaaatgcrgttaatcc(SEQ ID No18)

[0204] 实例6：从棉纤维分离的核酸的基因组的表征。

[0205] 前面的实例已经有力地显示了可以从成熟的棉纤维以及从它们的下游产品分离并且表征DNA。在下一步骤中，我们怀疑是否所分离的纤维DNA是全棉基因组的真实表示或者它是否仅仅表示该棉基因组的部分。因为部分基因组等效物将产生不可靠的以及不完全的测定结果，它对于性状或基因型测试将不会是有用的。第一挑战是克服从棉纤维获得的DNA(作为用于测定测试的起始材料)的有限量。选择了全基因组扩增(WGA)的方法来克服这种限制。以前未曾使用过WGA来扩增多倍体基因组(如棉)用于基因分型以及性状测试。DNA扩增步骤对于提高起始纤维DNA材料的量是重要的，但关键的是不要引入基因组偏差(genome bias)，所述偏差有时对于WGA步骤是固有的，如由Giardina等(2009)BMC Genomics Apr14，10：159的报告。我们着手研究了在功能性Taqman测定中分离的纤维DNA的WGA步骤的可靠性。在基本上相同的Taqman测定中，将WGA扩增的纤维DNA的质量与相同商业棉纤维来源的WGA扩增的子叶DNA进行了比较。

[0206] 由K.Merritt提供了来自CropMark Direct农场的大约500克的FM9063B2F纤维(每一样品500克，在3个小的棕色包中；3个重复取自样品种类不同的包，包号721134350138、721134350154、721134350156)。该纤维来自于在该2008至2009年之间的棉花季节生长的棉花并且被列出用于FiberMax证明程序。

[0207] 由于我们已经确定在纤维中的污染物对用于下游测试的纤维DNA的使用可以具有显著的影响，我们手工清理了这些纤维。这是通过伸展少量纤维(例如1.5克)由此用镊子将大部分碎片去除直到没有可以用裸眼看到的碎片为止来完成的。

[0208] 用Qiagen DNeasy Plant Mini kit经以下步骤进行DNA提取：

[0209] ·取1克经清理的(没有叶废料)成熟的棉纤维并且将它放在50ml Falcon管中。用清洁的剪刀将这些纤维切割几次。

[0210] ·加入5ml AP1裂解缓冲液(Qiagen货号1014630)和100μl核糖核酸酶A(10mg/ml)。使用研杵以使在样品与缓冲液之间的接触均匀。

[0211] ·在65℃下孵育20分钟，在孵育期间使用15ml的管以混合该材料2到3次。

[0212] ·使用15ml的管以挤压该材料以便将500μl裂解液转移进入2ml的微量离心管中。取3份等分试样并且用作复本。

[0213] ·对各等分试样加入130μl AP2缓冲液，混合并且在冰上孵育5分钟。

[0214] ·在13000rpm下离心5分钟。

[0215] ·将该液相转移到lilac QIAshredder微型旋转柱上。

[0216] ·在13000rpm下离心2分钟。

[0217] ·将流通液转移到新的微量离心管(未干扰该沉淀物)。

[0218] ·加入800μl AP3/E缓冲液并且混合。

[0219] ·转移650μl 到微型旋转柱上并且在8000rpm下离心1分钟，丢弃流通液。

[0220] ·用剩余的样品重复这个步骤。丢弃该收集管并且将该柱放置在新的2ml收集管中。

[0221] ·用500μlAW缓冲液洗涤该柱并且在8000rpm下离心1分钟，丢弃流通液。

[0222] ·用500μl AW缓冲液洗涤该柱并且在13000rpm下离心1分钟，丢弃该液体以及收集管。

[0223] ·将该柱放置在没有遗留乙醇的1.5ml微量离心管中。

[0224] ·加入50μlMQ水到该柱并且在室温下孵育至少5分钟。

[0225] ·在8000rpm下离心1分钟。在4℃(短期)或-20℃(长期)下储存DNA。

[0226] 如下进行FM 9063B2F的子叶DNA提取。用发芽纸和水使FM9063B2F的50个种子在28℃的种子发芽器中进行发芽。收集子叶并且用硅干燥。提取子叶DNA。将提取的子叶DNA合并到五个1.5ml管中。

[0227] 用Sigma’s Genome 全基因组扩增(WGA)试剂盒(WGA2)经以下步骤进行全基因组扩增：

[0228] 在PCR管中向10μl的提取的DNA添加1μl的10x片段化缓冲液。

[0229] ·在热循环仪中在95℃下孵育2分钟并且在冰上冷却。

[0230] ·加入2μl的1x文库制备缓冲液。

[0231] ·加入1μl的文库稳定化溶液并且混合。

[0232] ·在热循环仪中在95℃下孵育2分钟并且在冰上冷却。

[0233] ·加入1μl的文库制备酶并且混合。

[0234] ·使用程序WGA1在热循环仪中孵育

[0235] 在16℃下20分钟

[0236] 在24℃下20分钟

[0237] 在37℃下20分钟

[0238] 在75℃下5分钟

[0239] 4℃直至结束

[0240] ·加入以下预混合液：

[0241] 7.5μl10x扩增主混合液

[0242] 47.5μl无核酸酶水

[0243] 5μl WGA聚合酶

[0244] ·使用程序WGA2在热循环仪中孵育

[0245] 在95℃下3分钟

[0246] 14个循环：在94℃下15秒

[0247] 在65℃下5分钟

[0248] 4℃直至结束

[0249] 将5μl放在1％琼脂糖凝胶上以检查该WGA DNA的质量。在100与1000bp之间应当存在拖尾(smear)。

[0250] 所有的WGA反应(纤维与子叶)被证明是成功的。

[0251] 可任选地是将FM9063B2F的子叶与纤维的WGA扩增的DNA以下列方式进一步纯化。将来自5个样品的WGA DNA合并进入2ml管(大约240ul DNA)，加入24ul3M乙酸钠(pH5.2)并且混合，加入800ul 100％的冰冷的乙醇并且彻底混合、并且在-20℃下过夜，在-20℃在12000rpm下离心10分钟，小心地去除上清液，用800ul 70％的冰冷的乙醇洗涤DNA沉淀物，在-20℃在12000 rpm下离心2分钟，小心地去除上清液，将管放在65℃培养箱中干燥15分钟，在65ul1x TE中重悬DNA。

[0252] 对这些扩增的DNA样品进行两个不同的Taqman测定。一个Taqman测定的目的在于鉴定40个不同的SNP并且另一个Taqman测定的目的在于鉴定3个不同的性状：Bollgard II(Mon531)、Bollgard(MON15985)以及Flex(MON88913)。每个Taqman测定在4个不同的DNA样品上进行：1)WGA扩增的从FM9063 B2F纤维提取的DNA，2)WGA扩增的从子叶FM9063 B2F提取的DNA，3)纯化的WGA扩增的FM9063 B2F纤维的DNA，和4)纯化的WGA-扩增的FM9063 B2F子叶的DNA。由于众所周知的是，在物理尺寸方面，棉A亚基因组(At)比棉D亚基因组(Dt)大50％，从该A基因组中选出了23个SNP而从该D基因组中选出了17个SNP。

[0253] 在纯化的FM9063 B2F WGA扩增的纤维DNA中的Taqman测定中，观察到可以成功地检出所有的40个SNP。另外，用纯化的FM9063B2F子叶WGA DNA以及用粗的(即未纯化的)FM9063B2F子叶DNA获得了检测同样的40个SNP的相同的结果。用于检测Bollgard II(Mon531)、Bollgard(MON15985)、以及Flex(MON 88913)的Taqman测定也证明在纤维与子叶的WGA扩增的DNA样品之间给出相同的结果。根据Yang等人(2005)J.Agric.Food Chem.53，6222-6229测定了Mon531。根据Lee等人(2007)J.Agric.Food Chem.55，3351-3357测定了Mon15985与Mon88913。

[0254] 因此，可以使用WGA扩增的棉纤维DNA作为可靠的来源用于成功的分子标记确定，因为其提供了与对WGA扩增的叶DNA进行的Taqman测定相同的结果。另外，可以使用WGA扩增的棉纤维DNA作为可靠的来源用于成功的性状确定，因为其提供了与对WGA扩增的叶DNA进行的Taqman测定相同的结果。

[0255] 虽然通常应当将更高数目的SNP(大约300)用于特异的棉品种的表征和鉴定，本实例显示通过使用WGA扩增的棉纤维DNA这种方法是可行的。

[0256] 实例7：从棉纤维材料分离的其他的生物大分子。

[0257] 使用不同分离方案的提取物的紫外分光光度法表明这些提取物不单纯由DNA组成的，并且可能含有其他的生物大分子。使用Bradford分析，发现了低浓度(大约10ng/μl)的蛋白质。另外，纤维提取物含有多种浓度的对核糖核酸酶I抵抗的小RNA，我们将其鉴定为微RNA。

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