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用反向遗传操作拓展口 蹄疫疫苗株抗原谱及疫苗制备方法

阅读：644发布：2020-05-17

专利汇可以提供用反向遗传操作拓展口蹄疫疫苗株抗原谱及疫苗制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及利用反向遗传操作拓展口蹄疫疫苗株抗原谱及疫苗制备方法。本发明的口蹄疫病毒毒株，其VP3和VP1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4中第304-736位氨基酸残基所示。实验证明，将本发明得到的突变病毒株制成疫苗，可以同时抗中国型O/TL/Taiwan/97谱系猪源流行毒、泛亚型O/China/99谱系猪源流行毒和东南亚型缅甸98谱系O/GS/2010猪源流行毒的侵害，具有抗原普广的特性，免疫猪，能明显提高对抗原性有差异的同型口蹄疫病毒攻击的保护率，达到交叉保护的免疫效果，在预防和控制口蹄疫中将发挥重要作用。，下面是用反向遗传操作拓展口蹄疫疫苗株抗原谱及疫苗制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一株口蹄疫病毒毒株，其VP3和VP1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4中第
304-736位氨基酸残基所示。
2.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒毒株，其特征在于：所述口蹄疫病毒毒株的结构蛋白如SEQ ID NO：4中第1-736位氨基酸残基所示；
所述VP3和VP1结构蛋白的编码基因如SEQ ID NO：2中第2569-3867位核苷酸所示；
所述口蹄疫病毒毒株的结构蛋白的编码基因如SEQ ID NO：2中第1660-3867位核苷酸所示。
3.根据权利要求1或2所述的口蹄疫病毒毒株，其特征在于：所述口蹄疫病毒毒株的基因组RNA对应的cDNA序列如SEQ ID NO：2所示。
4.一种疫苗，其活性成分为灭活的权利要求1-3中任一所述口蹄疫病毒毒株。
5.权利要求1-3中任一所述口蹄疫病毒毒株在制备疫苗中的应用。
6.根据权利要求4所述的疫苗或权利要求5所述的应用，其特征在于：所述疫苗为口蹄疫疫苗；
所述疫苗中使用的佐剂为IS201。
7.根据权利要求4或6所述的疫苗或权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述口蹄疫为O型口蹄疫病毒引起的口蹄疫；
和/或，所述O型口蹄疫病毒为猪源的；和/或所述O型口蹄疫病毒为中国谱系或泛亚谱系或缅甸98谱系；
和/或，所述中国谱系病毒毒株为O/TL/Taiwan/97，所述泛亚谱系病毒毒株为O/China/99，所述缅甸98谱系病毒毒株为O/GS/2010。
8.一种拓展口蹄疫病毒抗原谱的方法，包括如下步骤：1)获得出发口蹄疫病毒基因组RNA互补的cDNA；2)将所述cDNA中的编码出发口蹄疫病毒结构蛋白的编码基因进行突变或将所述cDNA中的编码出发口蹄疫病毒的抗原决定簇的编码基因进行突变，使突变后的编码基因与待抗口蹄疫病毒毒株的等位基因相同，得到抗原谱广于所述出发口蹄疫病毒的目的口蹄疫病毒的基因组cDNA；3)表达得到步骤2)所述目的口蹄疫病毒。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述出发口蹄疫病毒为任一血清型的野生型病毒，或通过任意操作获得的口蹄疫病毒；
所述任意操作为培育或基因操作；
所述出发口蹄疫病毒优先为免疫原性好、复制性能强和病毒滴度高的野生型病所述抗原决定簇为B细胞抗原决定簇或T细胞抗原决定簇。
10.由权利要求8或9所述方法得到的口蹄疫病毒。

说明书全文

用反向遗传操作拓展口 蹄疫疫苗株抗原谱及疫苗制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及利用反向遗传操作拓展口蹄疫疫苗株抗原谱及疫苗制备方法。

背景技术

[0002] 口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的猪、牛、羊等多种偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。因其传染性极强，世界动物卫生组织(FAO/OIE)将其列为必报疫病之首，我国规定为一类动物传染病。该病的爆发和流行使家畜的生产力下降，活畜及畜产品贸易停滞，经济损失巨大；同时，给公共卫生和国家声誉造成严重的负面影响。因此，世界各国十分重视对该病的防控。目前，在世界上许多国家，尤其是非洲、亚洲和南美洲国家，该病发生次数频繁，流行严重。此外，不时出现全球的流行性爆发。

[0003] 预防和控制口蹄疫的一个主要措施是用疫苗免疫易感动物。常用的有效疫苗是灭活疫苗。其制备是用筛选的口蹄疫病毒接种培养的细胞，大量增殖病毒，收获病毒，经灭活后与佐剂乳化而成。筛选的口蹄疫病毒即为疫苗株，也叫种毒。疫苗株必须满足的一个要求是其抗原关系与流行的口蹄疫病毒(流行毒)密切。然而，口蹄疫病毒易发生变异，在不同畜种、不同地区流行的病毒，经反复感染，循环流行，会衍化出多个变异株(遗传关系密切的毒株归为一个谱系)，抗原有差异[B.Borrego，I.S.Novella，E.Giralt，D.Andreu，E.Domingo.1993.Distinct repertoire of antigenic variants of foot-and-mouth disease virus in the presence or absence of immune selection.J.Virol.67，6071-6079，A.Holguin，J.Hernandez，M.A.Martinez，M.G.Mateu，E.Domingo.1997.Differential restrictions on antigenic variation among antigenic sites of foot-and-mouth disease virus in the absence of antibody selection.J Gene Virol.，78：601-609]。其结果使原有疫苗株的有效性减弱甚至丧失，难以达到免疫防疫要求，需要更换新的疫苗株，才能起到有效的免疫防控效果。

[0004] 疫苗株有效性减弱的根本原因是抗原关系和流行毒疏远，不匹配。和其它病毒一样，不同病毒株间的抗原关系与组成病毒蛋白(结构蛋白)的氨基酸序列有关(口蹄疫病毒的结构蛋白有VP4，VP2，VP3，VP1四种，其中VP1暴露于病毒颗粒表面，且有一段氨基酸链形成环状结构(G-H环)外露)。更为精确地说决定抗原关系的分子基础是抗原决定族或抗原位点氨基酸序列组成的异同。当抗原决定族或抗原位点氨基酸序列发生变异，形成抗原性有差异的变异株，当发生多处变异或氨基酸累积变异，这种衍化的变异株与原病毒的抗原关系逐渐疏远，原病毒作为疫苗株难以发挥有效的免疫预防作用，需要筛选新的疫苗株。但筛选新的疫苗株费时费力，甚至筛选不到满足要求的种毒。更为困难的是，在一个地区或国家存在多个抗原差异的流行毒，筛选一个能匹配多个谱系流行毒的疫苗株几乎不可能实现。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的是提供一株口蹄疫病毒毒株。

[0006] 本发明所提供的口蹄疫病毒毒株，其VP3和VP1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4中第304-736位氨基酸残基所示。

[0007] 上述口蹄疫病毒毒株的结构蛋白如SEQ ID NO：4中第1-736位氨基酸残基所示；

[0008] 上述口蹄疫病毒毒株中，所述VP3和VP1结构蛋白的编码基因如SEQ ID NO：2中第2569-3867位核苷酸所示；

[0009] 上述口蹄疫病毒毒株中，结构蛋白的编码基因如SEQ ID NO：2中第1660-3867位核苷酸所示。

[0010] 上述口蹄疫病毒毒株的基因组RNA对应的cDNA序列如SEQ ID NO：2所示。

[0011] 本发明的另一个目的是提供一种疫苗。

[0012] 本发明所提供的疫苗，其活性成分为灭活的上述任一所述口蹄疫病毒毒株。

[0013] 上述疫苗中，所述疫苗为口蹄疫疫苗；

[0014] 上述疫苗中，使用的佐剂为IS201；佐剂IS201的产品名称为Montanide ISA201VG，购自法国SEPPIC公司，产品目录号为L01408。

[0015] 上述疫苗中，所述口蹄疫为O型口蹄疫病毒引起的口蹄疫；

[0016] 上述疫苗中，所述O型口蹄疫病毒为猪源的；

[0017] 上述疫苗中，所述O型口蹄疫病毒为中国谱系或泛亚谱系或缅甸98谱系；

[0018] 上述疫苗中，所述中国谱系病毒毒株为O/TL/Taiwan/97，所述泛亚谱系病毒毒株为O/China/99，所述缅甸98谱系病毒毒株为O/GS/2010。

[0019] 上述任一所述口蹄疫病毒毒株在制备疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。

[0020] 上述应用中，所述疫苗为口蹄疫疫苗；

[0021] 上述应用中，使用的佐剂为IS201；佐剂IS201的产品名称为Montanide ISA201VG，购自法国SEPPIC公司，产品目录号为L01408。

[0022] 上述应用中，所述口蹄疫为O型口蹄疫病毒引起的口蹄疫；

[0023] 上述应用中，所述O型口蹄疫病毒为猪源的；

[0024] 上述应用中，所述O型口蹄疫病毒为中国谱系或泛亚谱系或缅甸98谱系；

[0025] 上述应用中，所述中国谱系病毒毒株为O/TL/Taiwan/97，所述泛亚谱系病毒毒株为O/China/99，所述缅甸98谱系病毒毒株为O/GS/2010。

[0026] 本发明的最后一个目的是提供一种拓展口蹄疫病毒抗原谱的方法。

[0027] 本发明所提供的拓展口蹄疫病毒抗原谱的方法，包括如下步骤：1)获得出发口蹄疫病毒基因组RNA互补的cDNA；2)将所述cDNA中的编码出发口蹄疫病毒结构蛋白的编码基因进行突变或将所述cDNA中的编码出发口蹄疫病毒的抗原决定簇的编码基因进行突变，使突变后的编码基因与待抗口蹄疫病毒毒株的等位基因相同，得到抗原谱广于所述出发口蹄疫病毒的目的口蹄疫病毒的基因组cDNA；3)表达得到步骤2)所述目的口蹄疫病毒。

[0028] 上述方法中，所述出发口蹄疫病毒为任一血清型的野生型病毒，或通过任意操作获得的口蹄疫病毒；

[0029] 上述方法中，所述任意操作为培育或基因操作；

[0030] 上述方法中，所述出发口蹄疫病毒优先为免疫原性好、复制性能强和病毒滴度高的野生型病毒；

[0031] 上述方法中，所述抗原决定簇为B细胞抗原决定簇或T细胞抗原决定簇。

[0032] 由上述任一所述方法得到的口蹄疫病毒也属于本发明的保护范围。

[0033] 本发明所提供的拓展口蹄疫病毒抗原谱的方法如下：

[0034] 1、获得一株口蹄疫病毒全基因组RNA互补的cDNA片段；

[0035] 2、利用基因操作技术突变cDNA的一些碱基或密码子，使之与流行毒株的等位基因相同；

[0036] 3、按口蹄疫病毒基因组顺序，串连突变和未突变的cDNA片段，连接入一质粒载体的T7启动子下游，构建成口蹄疫病毒基因组全长感染性cDNA重组质粒；

[0037] 4、核酸内切酶线化重组质粒DNA，体外转录为RNA，转染培养的细胞；或线化的重组质粒DNA与表达T7RNA聚合酶的重组质粒DNA同时转染培养的细胞；或线化的重组质粒DNA直接转染培养的表达T7RNA聚合酶的细胞系，产生口蹄疫病毒，拯救获得的病毒即为拓展了抗原谱的口蹄疫病毒。

[0038] 所述方法1中，所述口蹄疫病毒为分离的任一血清型的野生型病毒，或通过任意操作获得的口蹄疫病毒，包括培育的和基因操作获得的病毒，优先为免疫原性好，复制性能强，病毒滴度高的野生型病毒。所述互补的cDNA为口蹄疫病毒基因组RNA经反转录的产物或依据口蹄疫病毒基因组RNA序列人工化学合成的cDNA。

[0039] 所述方法2中，所述cDNA为不同的口蹄疫病毒株基因组的同一功能区域的cDNA，优先为各结构蛋白基因cDNA，更优先为抗原位点的编码基因cDNA，包括B细胞和T细胞抗原位点编码基因cDNA。所述突变为基因操作所能实现碱基或密码子替换的任意技术，包括人工化学合成技术。

[0040] 所述方法3中，所述突变的cDNA为方法2所得。所属口蹄疫病毒基因组全长感染性cDNA为突变和未突变的cDNA片段连接产物，包含T7启动子。

[0041] 所述方法4中，所述重组质粒DNA为方法3所得。所述细胞为体外培养的口蹄疫病毒敏感的细胞系，如BHK21、IB-RS-2和PK15等；所述T7 RNA聚合酶细胞为携带T7 RNA聚合酶基因的细胞系，优先为携带T7聚合酶基因的BHK21和IB-RS-2细胞系。

[0042] 本发明的发明人针对目前东南亚地区流行的多谱系O型口蹄疫病毒，利用反向遗传操作技术，对免疫原性强、复制性能好(病毒滴度高)的口蹄疫病毒(OZK/93-08)基因组全长cDNA突变修饰后，拯救获得了基因工程病毒。该病毒的抗原位点中数个氨基酸突变为O/TL/Taiwan/97病毒(属CATHAY，中国型谱系，猪源毒)的，另几个氨基酸突变为O/China/99病毒(属Pan-Asia，泛亚谱系)和O/GS/2010病毒(属SEA-Mya98，东南亚型缅甸98谱系)的。用该病毒作为疫苗株，在培养的BHK-21细胞上增殖后灭活，与ISA201佐剂(法国SEPPIC)乳化制成疫苗，肌肉接种免疫猪，能有效保护中国谱系猪源流行毒、泛亚谱系猪源流行毒和缅甸98谱系猪源流行毒的攻击，提高了对中国谱系猪源流行毒的保护率，免疫效力增加，表明抗原谱变广。因此，利用反向遗传操作技术能拓展口蹄疫病毒的抗原谱。

[0043] 实验证明，将本发明得到的突变病毒株制成疫苗，可以同时抗中国谱系猪源流行毒O/TL/Taiwan/97、泛亚谱系猪源流行毒O/China/99和缅甸98谱系猪源流行毒O/GS/2010的侵害，具有抗原谱广的特性，免疫猪，能明显提高对抗原性有差异的同型口蹄疫病毒攻击的保护率，达到交叉保护的免疫效果，在预防和控制口蹄疫中将发挥重要作用。附图说明

[0044] 图1为FMDV OZK/93-08株全长cDNA分子克隆的构建策略。

[0045] 图2为突变修饰的口蹄疫病毒OZK/93-08株全基因组感染性cDNA克隆的构建过程示意图。

[0046] 图3为突变病毒rV-OSYNa氨基酸突变示意图。

[0047] 图4为含突变氨基酸的1674bp片段和重组质粒pOZK-Z123DKV的酶切鉴定电泳图。

[0048] 图5为A、B和C片段的电泳图。

[0049] 图6为重组质粒酶切鉴定电泳图。

[0050] 图7为病毒rV-OSyNa感染BHK-21细胞后引起的CPE。

[0051] 图8为突变病毒的鉴定结果。A为OZK父本拯救病毒部分VP3、VP1测序峰图；B为修饰病毒rV-OSyNa部分VP3、VP1测序峰图；C为修饰病毒rV-OSyNa和OZK父本拯救病毒部分VP1测序峰图，左：rV-OSyNa VP1测序峰图；右：OZK父本拯救病毒VP1测序峰图。

[0052] 图9为间接免疫荧光检测拯救病毒在BHK上的复制。

[0053] 图10为电镜下rV-OSyNa拯救病毒粒子。

具体实施方式

[0054] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0055] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0056] 公众可从中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室获得以下病毒株：口蹄疫病毒OZK/93-08株、O型中国谱系猪源流行毒O/TL/Taiwan/97、O型泛亚谱系猪源流行毒O/China/99、O型缅甸98谱系猪源流行毒O/GS/2010。上述菌株在农业部兽医局指定国家口蹄疫参考实验室保藏，公众可通过农业部兽医局批示的委托函获得。

[0057] O型中国谱系猪源流行毒O/TL/Taiwan/97在文献[Tsai，C.P.，Pan，C.H.，Liu，M.Y.，Lin，Y.L.，Chen，C.M.，Huang，T.S.，Cheng，I.C.，Jong，M.H.and Yang，P.C.2000.Molecular epidemiological studies on foot-and-mouth disease type O Taiwan viruses from the 1997 epidemic.Vet.Microbiol.74(3)，207-216.]中公开过，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。该毒株的genebank的序列号为：Accession No.AF030259。

[0058] 实施例1、突变毒株的制备及功能验证

[0059] 一、口蹄疫病毒基因组RNA对应的全长cDNA重组质粒构建

[0060] 设计合成下列寡核苷酸引物(上海桑尼有限公司合成)：

[0061] Z1：agactagt ttgaaagggggcgctagggt

[0062] Z1-2：tggttggggggggggggggggtgaa

[0063] Z2：ttcaccccccccccccccccaacca

[0064] Z2-2：agcgtggagtcgagcacagtac

[0065] Z3：ggtctaagcaggtttccacaactg

[0066] Z3-2：aactgcagtgcttcgtgctgccctttctcaatg

[0067] Z4：gctaagcttggaactccacgaaaaggtgtcga

[0068] Z4-2： ttttttttttttttttttttt[注：斜体的核苷酸为另外加的酶切位点和保护碱基，后面的为序列中的核苷酸].

[0069] T1：gaaaacgcctgaggccgccgcacactgcatt

[0070] T1-2：aatgcagtgtgcggcggcctcaggcgttttc

[0071] T2：gtgaagaagatatctgactcgctctccagt

[0072] T2-2：actggagagcgagtcagatatcttcttcac

[0073] 用RNeasy mini Kit(Qiagen)提取口蹄疫病毒OZK/93-08株的总RNA，分别用Z2-2、Z3-2和Z4-2引物，合成第一链cDNA。以第一链CDNA为模板，用4对引物Z1/Z1-2、Z2/Z2-2、Z3/Z3-2和Z4/Z4-2，扩增获得4个相互重叠的cDNA双链片段，分别命名为Z1cDNA、Z2cDNA、Z3cDNA和Z4cDNA。

[0074] Z3cDNA和pBluescriptSKhdv载体分别用XbaI和BglII(TakaRa)消化后连接，得到重组质粒pSK-Z3。pBluescriptSKhdv载体在文献“《华北农学报》2010年第25卷第3期，曹伟军，李平花，白兴文等，口蹄疫病毒O/HN/93疫苗株的拯救及病毒活性鉴定”中公开过，公众可从中国农业科学院兰州兽医研究所获得。

[0075] 利用QuikChange@Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)定点突变试剂盒，以引物对T1/T1-2和T2/T2-2进行定点突变引入分子标签。分别依次突变了重组质粒pSK-Z3中2985位的NotI(TakaRa)位点和4238位的BglII(TakaRa)位点，得到阳性重组质粒pOZK-Z3。

[0076] Z1cDNA和Z2cDNA混合作模板，用一对引物Z1/Z2-2进行融合PCR，得Z12cDNA。Z12cDNA与pMD20-T质粒(TakaRa)连接，得到重组质粒pMD-Z12。

[0077] pMD-Z12和pBluescriptSKhdv质粒载体分别用KpnI/XbaI(TakaRa)双酶切消化后，纯化回收相应的目的片段，连接得到重组质粒pOZK-Z12。用BglII/XbaI(TakaRa)分别双酶切消化重组质粒pOZK-Z12和pOZK-Z3，纯化回收相应的目的片段，连接得到重组质粒pOZK-Z123。最后用BglII/NotI(TakaRa)分别消化重组质粒pOZK-Z123和Z4片段，纯化回收，连接得到含口蹄疫病毒OZK/93-08株全基因组CDNA克隆的重组质粒pOZKF-Z1234。测序验证，结果在pBluescriptSKhdv质粒载体的Kpn I/NotI(TakaRa)位点间插入了SEQ ID NO：1所示核苷酸序列(即病毒OZK/93-08的基因组RNA对应的DNA，Z1234)。

[0078] 核苷酸序列：Z1的核苷酸序列为SEQ ID NO：1中第1-389位核苷酸；Z2的核苷酸序列为SEQ ID NO：1中第365-696位核苷酸；Z3的核苷酸序列为SEQ ID NO：1中第588-5394位核苷酸；Z4的核苷酸序列为SEQ ID NO：1中第5289-8137位核苷酸。

[0079] 结构蛋白VP4-VP2-VP3-VP1的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1中第1660-3867位核苷酸。VP4的编码序列为SEQ ID NO：1中第1660-1914位核苷酸；VP2的编码序列为SEQ ID NO：1中第1915-2568位核苷酸；VP3的编码序列为SEQ ID NO：1中第
2569-3228位核苷酸；VP1的编码序列为SEQ ID NO：1中第3229-3867位核苷酸。

[0080] 上述构建过程如图1所示。最后得到的病毒基因组中，1表示5′UTR，2表示L，3表示VP4，4表示VP2，5表示VP3，6表示VP1，7表示2A，8表示2B，9表示2C，10表示3A，11表示3B，12表示3C，13表示3D，14表示3′UTR。VP4、VP2、VP3、VP1为结构蛋白，L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D为非结构蛋白。

[0081] 二、突变修饰基因

[0082] 载体pUC57购自南京金斯瑞生物科技有限公司，产品目录号为SD1176。

[0083] 合成病毒株OZK/93-08编码区DNA(即SEQ ID NO：3中第1056-8024位核苷酸)，含VP3 58位、VP1 43位和48位氨基酸突变(58E→D、43T→K和48I→V)，将合成DNA片段与载体pUC57连接，测序验证，得到阳性重组质粒，记作pHC。

[0084] 用下列引物，构建突变口蹄疫病毒的基因组全长cDNA重组质粒pOZKF-TmFull，构建过程如图2所示。

[0085] EapaI(+)：CCGGGCCCAATACCTCTGGACTGGAAAC；

[0086] EsacI(-)：GTTGAAGGAGGTGGGCAGAGCTCTCTC；

[0087] F207(+)：TACGGTGACACTAGCACTAACAACGTGCGGGGAGACCTGCAGGTGCTG；

[0088] R1629(-)：CAGCACCTGCAGGTCTCCCCGCACGTTGTTAGTGCTAGTGTCACCGTA；

[0089] EXma1(-)：TGCTTGTGTCTAGCGTCACTCG；

[0090] Exma2(-)：CTGTTTTGCGGGTGCCACGATC；

[0091] Eky2027(+)：GGTGACGTACGGGTATGCAACAGC。

[0092] 以pHC质粒为模板，用Eapal(+)/EsacI(-)引物，PCR扩增含VP3 58位，VP1 43位和48位氨基酸突变的1674bp的目的片段(即SEQ ID NO：3中第2052-3719)，该片段经ApaI和Sac I双酶切，回收后与质粒pOZK-Z123经Apa I和SacI双酶切回收的大片段连接，连接产物经酶切鉴定，将阳性重组质粒记作pOZK-Z123DKV，酶切鉴定结果如图4(1：含VP358位，VP1 43和48位氨基酸突变的PCR片段；2：500-12000bpwide range DNA mark(500、
1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、8000、12000bp)3：重组质粒pOZK-Z123DKV Apa I和SacI酶切鉴定)。

[0093] 以质粒pOZK-Z123DKV为模板，分别用Eky2027(+)/R1629(-)和F207(+)/Exma2(-)引物对，PCR扩增得A片段(A片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：3中第2007-3681位核苷酸)和B片段(B片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：3中第3634-3836位核苷酸)。纯化的A片段和B片段等量混合做为模板，以EapaI(+)/Exma1(-)为引物PCR扩增得C片段(C片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：2中第2052-3836位核苷酸)。该C片段含VP1137(137S→G)、139(139A→T)、140(140R→S)、141(141V→T)和142(142S→N)位氨基酸突变。A片段、B片段、C片段的电泳图如图5所示(1：A片段；2：B片段；3、5：DL，2000(100、250、500、750、
1000、2000bp)；6：融合C片段)。

[0094] 包含SacI位点的核苷酸在设计EXma1(-)引物的上游，所以即使引物中不带该位点，扩增片段中也包含。

[0095] C片段用SacI/ApaI(TakaRa)内切酶消化后插入用ApaI/SacI(TakaRa)酶消化的质粒pOZK-Z123DKV中，用KpnⅠ(TakaRa)进行酶切鉴定，将阳性重组质粒记作pOZKF-Z123m，酶切鉴定结果如图6(1：wide range DNA mark；2：重组质粒pOZKF-TmFull XhoI酶切鉴定；3：重组质粒pOZKF-Z123m质粒Kpn I酶切鉴定)。(C片段替换了载体pOZK-Z123DKV上的含“VP3 58位，VP1 43位和48位氨基酸突变的约1674bp片段，但该片段仍然含有VP3 58位，VP1 43位和48位氨基酸突变，但有点差异的是C片段中同时含有了VP1 137(1378→G)、139(139A→T)、140(140R→S)、141(141V→T)和142(1428→N)位氨基酸突变)

[0096] 用BglII和SpeI(TakaRa)双酶切重组质粒pOZKF-Z123m，回收大片段；用SpeI和BglII双酶切质粒pOZKF-Z1234，回收Z4片段；将两片段连接，用XhoI内切酶进行酶切鉴定，鉴定结果如图6所示，将阳性重组质粒记作pOZKF-TmFull，即为突变修饰的口蹄疫病毒OZK/93-08株全基因组感染性cDNA克隆，该质粒pOZKF-TmFull中含有突变病毒的全部基因组RNA对应的DNA(即SEQ ID NO：2)。

[0097] 突变病毒的核苷酸序列：VP4的核苷酸序列为SEQ ID NO：2中第1660-1914位核苷酸；VP2的核苷酸序列为SEQ ID NO：2中第1915-2568位核苷酸；VP3的核苷酸序列为SEQ ID NO：2中第2569-3228位核苷酸；VP1的核苷酸序列为SEQ ID NO：2中第3229-3867位核苷酸。与OZK/93-08的核苷酸序列相比，将第2740-2742位核苷酸由gaa突变为gat，第3355-3357位核苷酸由aca突变为aag，第3370-3372位核苷酸由atc突变为gtg，第3637-3639位核苷酸由agt突变为ggt，第3643-3654位核苷酸由gcc cgc gtg agc突变为act agc act aac。

[0098] 突变病毒的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示：VP4的氨基酸序列为SEQ ID NO：4中第1-85位氨基酸；VP2的氨基酸序列为SEQ ID NO：4中第86-303位氨基酸；VP3的氨基酸序列为SEQ ID NO：4中第304-523位氨基酸；VP1的氨基酸序列为SEQ ID NO：4中第524-736位氨基酸。突变病毒的结构蛋白与OZK/93-08的结构蛋白相比，氨基酸突变情况如图3所示。

[0099] 三、拯救拓展了抗原谱的基因工程病毒

[0100] BHK-21细胞购自中国兽医监察所，产品目录号为BHK21F5620071213。

[0101] 用QIAGEN Plasmid Midi Kits(QIAGEN 公司) 制备质粒pOZKF-TmFull 和pcDNAT7P。pcDNAT7P质粒在文献“《中国农业科学》2009年第42卷第2期，李平花，白兴文，卢曾军等，“细胞内转录拯救Asial型口蹄疫病毒”中公开过，公众可从中国农业科学院兰州兽医研究所获得。

[0102] 用Not Ⅰ线化pOZKF-TmFull后，加入蛋白酶K(终浓度为0.25μg/mL，Invitrogen公司)，37℃温育30min后，纯化后作为转染cDNA模板。常规培养的单层BHK-21细胞生长至70％～80％时用于转染。转染时各取2μg线化cDNA模板和pcDNAT7P用TMLipofectamine 2000(Invitrogen公司)介导转染BHK-21细胞。转染后6h吸去细胞上清，加入2mL含8％胎牛血清的DMEM培养基(Invitrogen公司)，置37℃5％CO2培养箱，
72h后收获病毒，冻融2-3次后，在BHK-21上连续2-3传代，出现典型细胞病变(CPE)(图7，A：正常BHK-21细胞，B：出现CPE的细胞)，收集病毒液，即为目的病毒，命名为rV-OSyNa。
用该病毒在培养的BHK-21细胞上传代增殖30代，-70℃保存各代病毒备用。

[0103] 四、病毒rV-OSyNa的鉴定

[0104] 1、测序鉴定病毒基因

[0105] 取连续传20代的rV-OSyNa细胞毒，用RNAasy Mini Kit提取细胞毒总RNA，RT-PCR方法扩增含有突变氨基酸的特定片段，结果如图8所示。

[0106] RT-PCR引物为：

[0107] EXma1(-)：TGCTTGTGTCTAGCGTCACTCG

[0108] Eky2599(+)：GCATCTTCCCTGTGGCTTGCTC

[0109] Eky3427(+)：CGCACCGCTACATACTACTT

[0110] 结果显示：OZK/93-08病毒基因组的第2740-2742，3355-3357，3370-3372测序结果分别为GAA，ACA，ATC，编码E，T，I三个氨基酸(图8A)，人工拯救病毒rV-OSyNa的第2740-2742，3355-3357，3370-3372测序结果分别为GAT，AAG，GTG，编码D，K，V三个氨基酸(图8B)，人工拯救病毒rV-OSyNa的第3637-3639和3643-3654测序结果为GGT和ACTAGCACTAAC，分别编码G和T、S、T、N氨基酸(图8C左)，而OZK/93-08病毒基因组的第3637-3639和3643-3654测序结果为AGT和GCCCGCGTGAGC，分别编码S和A、R、V、S氨基酸(图8C右)。表明本发明构建的rV-OSyNa基因组序列正确。

[0111] 2、间接免疫荧光鉴定病毒蛋白

[0112] 接种病毒的BHK-21(单层细胞生长至70％)，24h后进行间接免疫荧光法鉴定。一抗为O型口蹄疫病毒兔阳性血清，二抗为加FITC羊抗兔IgG(Sigma公司)，同时设正常细胞对照。接种病毒的BHK细胞中可见绿色特异性荧光，而正常细胞对照无可见荧光(图9，A：接种rV-OSyNa病毒的BHK-21细胞；B：未接种病毒的BHK-21细胞)。表明，病毒与O型口蹄疫病毒兔阳性血清能够相互结合。

[0113] 3、电镜检查

[0114] 在BHK-21细胞中增殖后收获的细胞毒200mL，冻融2-3次后，加BEI灭活，4℃6000rpm离心40min，收集病毒上清，4℃45000rpm离心3h，沉淀加500μL NET缓冲液重悬，负染后电镜观察。结果检查到直径约为25nm、球形的口蹄疫病毒粒子(图10)。

[0115] 4、拯救病毒的遗传稳定性分析

[0116] 将rV-OSyNa病毒按10％接种量接种BHK-21细胞，连续传代，观察出现典型细胞病变(CPE)的时间，并对9、13、30代病毒进行RT-PCR检测拯救病毒突变氨基酸的变化。

[0117] RT-PCR检测的引物为：

[0118] EXma1(-)：TGCTTGTGTCTAGCGTCACTCG

[0119] Eky2599(+)：GCATCTTCCCTGTGGCTTGCTC

[0120] Eky3427(+)：CGCACCGCTACATACTACTT。

[0121] 实验设3次重复。

[0122] 结果：拯救病毒rV-OSyNa用小方瓶连续传至第8代后，出现的CPE的时间趋于稳定，100％病变时间约9-10h，小方瓶20代病毒转入大转瓶，100％病变时间约为11-12小时，病变时间稳定。拯救病毒9、13、30代VP3、VP1基因的序列测定结果表明突变的氨基酸稳定存在，在传代过程中未发生变化。

[0123] 五、疫苗制备工艺

[0124] 1、拯救病毒的大量增殖培养

[0125] 静止或旋转培养BHK21细胞至单层细胞长满，向其中加入病毒液和培养液，其中病毒液按5-15％体积比例加入，补加培养液至培养容器体积的1/20-1/30；37℃继续培养，待出现细胞病变效应(cytopathogenic effct，CPE)，收获病毒液即为病毒培养物，置-20-40℃保存。

[0126] 培养液的组成为：水解乳蛋白液(93-97％)、氨基酸溶液(2-5％)、抗生素液(1％)、HEPES液(0.5％)，加7.5％的NaHCO3调Ph至7.5-7.7；所述百分含量为体积百分含量水解乳蛋白液、氨基酸溶液、抗生素液和HEPES液均购自Invitrogen公司。

[0127] 2、病毒灭活

[0128] 用BEI(Sigma公司)灭活大量增殖的病毒液。

[0129] 3、疫苗配制

[0130] IS201佐剂产品名称为Montanide ISA 201 VG，购自法国SEPPIC公司，产品目录号为L01408。

[0131] 用灭活病毒液(抗原)和佐剂配制疫苗，如下：(1)“抗原/佐剂/抗原”双相佐剂型。灭活病毒液与IS201佐剂(法国SEPPIC)混合乳化。灭活病毒液与IS201佐剂的体积比为50％∶50％，振荡或乳化机搅拌均匀后即成。置4-8℃。

[0132] 将得到的疫苗记作rV-O/STN疫苗。

[0133] 六、疫苗免疫动物效果比对

[0134] 将步骤五制备得到的疫苗免疫48头猪(要求被免疫的猪的口蹄疫抗体滴度小于1∶6，感染抗体为阴性)测定免疫效力。疫苗剂量2ml/头，免疫途径为肌肉接种。

[0135] 以OZK/93-08制备的疫苗为对照，接种48头猪。疫苗剂量2ml/头，免疫途径为肌肉接种。常规疫苗的制备方法如下：将OZK/93-08株病毒液用BEI灭活后，与佐剂以1∶1比例混合，按《中华人民共和国兽药典》中兽用生物制品的口蹄疫灭活疫苗规程制备。

[0136] 攻毒方法及结果判定方法均按照《Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals》(2009年版，世界动物卫生组织(OIE))中所述。具体如下：

[0137] 所有免疫猪，28d-39d后，按每组16头进行随机分组。

[0138] 中国型猪源流行毒组：用中国型O/TL/Taiwan/97系猪源流行毒进行攻毒试验。

[0139] 泛亚型猪源流行毒组：用泛亚型O/China/99系猪源流行毒进行攻毒实试验。

[0140] 东南亚型缅甸98谱系猪源流行毒组：用东南亚型缅甸98谱系O/GS/2010猪源流行毒毒株进行攻毒试验。

[0141] 以上每种病毒设5头非免疫猪对照。

[0142] 攻击每头猪接种1000ID50的病毒量，观察10d，判定免疫效力结果。以口蹄部不出现任何水泡病症为保护。

[0143] 接种疫苗和免疫效力数据如表1所示。

[0144] 表1、疫苗免疫猪效力测定结果(保护数/免疫数)

[0145]

[0146] 结果表明：用突变修饰的口蹄疫病毒作为疫苗株，在培养的BHK-21细胞上增殖后灭活，与ISA201佐剂(法国SEPPIC)乳化制成疫苗，免疫猪，能有效保护中国谱系猪源流行毒、泛亚谱系猪源流行毒和缅甸98谱系猪源流行毒的攻击。口蹄疫病毒疫苗株经针对抗原表位氨基酸的替换，制备的疫苗免疫猪，提高了对中国谱系猪源流行毒的保护率，免疫效力增加，表明抗原谱变广。因此，利用反向遗传操作技术能拓展口蹄疫病毒的抗原谱。

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用反向遗传操作拓展口蹄疫疫苗株抗原谱及疫苗制备方法

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