转基因生物
阅读：347发布：2020-05-13
专利汇可以提供转基因生物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且产生转基因细胞的方法，该方法包括往细胞中导入含有目的核苷酸序列(NOI)的非灵长类慢病毒表达载体。还描述了产生转基因细胞的方法，该方法包括往细胞中导入含有NOI的慢病毒表达载体，该NOI能够产生反义寡核苷酸、核酶、siRNA、短发卡RNA、微RNA或者1型内含子。同样还描述了含有第一核苷酸序列的一种病毒载体，其中所述的第一核苷酸序列包括：(a)含有适应酶的第二核苷酸序列；和(b)能够产生多聚核苷酸的第三核苷酸序列；此处(a)和(b)可 操纵性 地相连接，其中的适应酶活化，切割第一核苷酸序列的转录本，从而产生多聚核苷酸。，下面是转基因生物专利的具体信息内容。
1.一种产生转基因细胞的方法，该方法包括将含有目的核苷酸 (NOI)的非灵长类慢病毒表达载体导入细胞。
2.根据权利要求1的方法，其中NOI编码且能够表达治疗性蛋白 质或适应酶，或能够产生反义寡核苷酸、核酶、siRNA、短发卡RNA、 微RNA或1型内含子。
3.根据权利要求1或2的方法，其中非灵长类慢病毒表达载体来 源于EIAV、FIV、BIV、CAEV或MVV。
4.产生转基因细胞的方法，该方法包括向细胞中导入包含NOI或 适应酶的慢病毒表达载体，该载体能够产生反义寡核苷酸、核酶、 siRNA、短发卡RNA、微RNA或1型内含子。
5.根据权利要求4的方法，其中慢病毒表达载体来自于EIAV、 FIV、BIV、CAEV、MVV或HIV。
6.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中表达载体经体内 或离体导入。
7.根据权利要求6的方法，其中细胞位于子宫内。
8.根据权利要求7的方法，其中细胞是围产期细胞。
9.根据权利要求8的方法，其中细胞是胚胎细胞。
10.根据权利要求9的方法，其中细胞是胎儿细胞。
11.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中细胞能够引起胚 系改变。
12.根据权利要求11的方法，其中细胞是生殖细胞。
13.根据权利要求11的方法，其中细胞参与配子形成。
14.根据权利要求11至13任何一项的方法，其中细胞是卵母细 胞、输卵管细胞、卵巢细胞、卵子、卵原细胞、受精卵、ES细胞、 胚细胞、精母细胞、精细胞、精子或者精原细胞。
15.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中慢病毒表达载体 经由囊胚层、脐带、胎盘、或羊水、子宫、性腺或通过腹膜内、肌肉 的、脊柱内的、颅骨内的、静脉内、呼吸道内、胃肠道内或肝内途径 导入细胞。
16.根据权利要求15的方法，其中慢病毒表达载体经由囊胚层、 脐带、胎盘或羊水、或通过腹膜内、肌内、脊髓内、颅内、静脉内、 呼吸道内、胃肠道内或肝内途径导入子宫细胞。
17.一种产生转基因细胞的方法，该方法包括将含有NOI的慢病 毒表达载体导入非分裂细胞。
18.根据权利要求17的方法，其中慢病毒表达载体来自EIAV、 FIV、BIV、CAEV、MVV或HIV。
19.根据权利要求17或者18的方法，其中NOI编码并能够表达蛋 白质或适应酶，或者能够产生反义寡核苷酸、核酶、siRNA、短发卡 RNA、微RNA或者1型内含子。
20.根据权利要求17至19中任何一项的方法，其中细胞能够引起 胚系改变。
21.根据权利要求20的方法，其中细胞是生殖细胞。
22.根据权利要求20的方法，其中细胞参与配子形成。
23.根据权利要求22的，其中细胞是卵母细胞。
24.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中细胞来自动物或 者酵母。
25.根据权利要求24的方法，其中细胞来源于非人类生物。
26.根据权利要求24的方法，其中细胞是哺乳动物细胞。
27.根据权利要求24的方法，其中细胞是鼠类、人类、猪、牛、 猴、绵羊、马、鸟类、昆虫或者爬行动物或者鱼类细胞。
28.根据权利要求24的方法，其中细胞来源于线虫或果蝇。
29.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中慢病毒表达载体 是假型病毒。
30.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中慢病毒表达载体 不包含任何功能性附属基因。
31.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中NOI可操纵性地 和组成性、组织特异性或者诱导性启动子相连接。
32.根据前面权利要求中任何一项方法产生的转基因细胞。
33.从根据权利要求32产生的转基因细胞产生或获得、或者通过 权利要求1至31中任何一项所限定的方法产生或获得的转基因生物。
34.根据权利要求33的转基因生物，其中NOI在输卵管细胞、生 殖道细胞、造血细胞(包括单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、粒细胞 或者这些细胞的祖细胞)、分泌细胞、乳腺细胞、内皮细胞、肿瘤细 胞、间质细胞、星形胶质细胞、或者神经胶质细胞、肌细胞、上皮细 胞、神经元、成纤维细胞、肝细胞、肾脏、肝脏、心脏或者肺细胞中 表达。
35.根据权利要求33或者34的转基因生物，其中的生物是鸟类。
36.根据权利要求35的转基因生物，其中的生物是家禽，例如鸡、 鸭或者鹅
37.来源于权利要求33至36中任何一项的转基因生物的转基因 卵。
38.前面权利要求中任何一项的转基因生物或卵，包括编码且能 够表达蛋白质的至少一种NOI。
39.根据权利要求38的转基因生物或卵，进一步包括能够产生适 应酶、反义寡核苷酸、核酶、siRNA、短发卡RNA、微RNA或者1型 内含子的至少一种NOI。
40.包括第一核苷酸序列的载体，其中所述的第一核苷酸序列包 括：
(a)编码适应酶的第二核苷酸序列；和
(b)能够产生多寡核苷酸的第三核苷酸序列；
其中(a)和(b)可操纵性地相连接，其中的适应酶能活化，以 切割第一核苷酸序列的转录本，从而产生多聚核苷酸。
41.根据权利要求40的载体，其中所述的多聚核苷酸是能调节靶 基因表达的RNA分子。
42.根据权利要求41的载体，其中RNA分子选自适应酶、siRNA、 短发卡RNA、微RNA、反义RNA和核酶。
43.包含第一核苷酸序列的载体，其中所述的第一核苷酸序列包 括：
(a)编码适应酶的第二核苷酸序列；和
(b)包含NOI的第三核苷酸序列；
其中(a)和(b)可操纵性地相连接，其中适应酶能活化，以切 割第一核苷酸序列的转录本，从而抑制所述NOI的表达。
44.根据权利要求43的载体，其中适应酶能活化，以在第三核苷 酸序列转录本中某个位置的切割第一核苷酸序列的转录本。
45.根据权利要求43或44的载体，其中的NOI编码治疗性蛋白。
46.根据权利要求40到45中任何一项的载体，其中适应酶被配体 活化。
47.根据权利要求40到45中任何一项的载体，其中适应酶被配体 灭活。
48.根据权利要求46或47的载体，其中载体包括编码权利要求46 或47中配体的第四核苷酸序列。
49.根据权利要求48的载体，其中编码配体的核苷酸序列可操纵 性地和启动子相连接。
50.根据权利要求46至49中任何一项的载体，其中配体选自多肽 和其片段、线性肽、环肽、其编码核酸、包括低分子量有机或者无机 化合物的合成和天然化合物以及抗体。
51.根据权利要求46至49中任何一项的载体，其中配体选自 FMN、强力霉素和VEGF、四环素和葡萄糖。
52.根据权利要求40至51中任何一项的载体，其中(a)和(b) 可操纵性地和启动子相连。
53.根据权利要求52的载体，其中启动子选自RNA聚合酶III启动 子和RNA聚合酶II启动子。
54.根据权利要求52的载体，其中启动子可操纵性地和至少一个 拷贝的四环素应答元件(TRE)相连接，从而使第一核苷酸序列的转 录受四环素调节因子、四环素或及其衍生物的调节。
55.根据权利要求54的载体，其中的载体包括编码四环素调节因 子的第五核苷酸序列。
56.根据权利要求52到55中任何一项的载体，其中启动子的3’端 包括一段能够和适应酶的一部分进行碱基配对的序列，从而形成发 卡，阻止病毒RNA基因组中活性适应酶的形成。
57.根据权利要求40至56中任何一项的载体，它为病毒载体形 式。
58.根据权利要求57的载体，其中载体以分裂内含子载体形式存 在，从而能够阻止病毒RNA基因组中活化适应酶的形成。
59.根据权利要求57或58的载体，其中载体系统来源于逆转录病 毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、 细小病毒载体和杆状病毒载体。
60.使用权利要求40至59任何一项中的载体产生转基因细胞的方 法。
61.通过产生权利要求60所限定的转基因细胞而产生或获得的转 基因生物。
62.使用权利要求46至59任何一项的载体的权利要求1至31任何 一项的方法。
63.通过权利要求62的方法产生的转基因细胞。
64.通过产生权利要求63的转基因细胞而产生或获得的转基因生 物。
65.根据权利要求64的转基因生物，其中NOI在输卵管细胞、生 殖道细胞、白蛋白、造血细胞(包括单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、 粒细胞、或者这些细胞的祖辈细胞)、分泌细胞、乳腺细胞、内皮细 胞、肿瘤细胞、间质细胞、或者神经胶质细胞、肌细胞、上皮细胞、 神经元、成纤维细胞、肝细胞、星形胶质细胞、肾脏、肝脏、心脏和 肺细胞表达。
发明领域
本发明涉及产生转基因细胞和转基因生物(transgenic organism)的 方法。
发明背景
将基因或者其它DNA序列导入到生物体比如哺乳动物的胚系 (germline)或者体细胞是近期生物学技术的最大进展之一。这样的动 物称作是转基因动物。当涉及到胚系改变时，基因操作的结果将被哺 乳动物的后代所继承，这些动物后代的所有细胞都遗传有导入的基 因，在某些情况以缺失DNA作为其遗传组成部分。对于研究胚胎发 育、分化过程中的基因调节，研究原癌基因的功能和免疫系统中复杂 的细胞间相互接触来说，转基因哺乳动物提供了一种手段。整体哺乳 动物是操作指导复杂生物学过程的基因的最终分析系统。此外，转基 因动物为表达有用的重组蛋白和建立人类遗传性疾病的精确动物模型 提供了令人振奋的可能性。
通常，通过两种方法中的一种产生转基因动物：通过在胚胎干细 胞中以同源重组的方式靶向插入DNA序列，这是劳动密集型且耗时 的过程；或者通过受精卵前核注射，其中DNA的整合是随机的，并 且可能会导致一连串DNA的插入，这些DNA不稳定，在随后的细 胞分化过程中重新分布或被删除。WO99/51755讨论了使用包含编码 至少一个核酶之核酸的逆转录病毒表达载体产生转基因动物。没有公 开在具体的实施例中使用逆转录病毒的内容。虽然也提到提到了使用 腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、疱疹单纯病毒或者痘苗病毒的可能性。 然而，没有使用这些病毒的具体实施例。
因此，近些年人们建议使用逆转录病毒进行基因治疗。重要的是， 逆转录病毒是生活周期不同于裂解性病毒的RNA病毒。从这方面说， 当逆转录病毒感染细胞时，其基因组转化为DNA的形式。换句话说， 逆转录病毒是经过DNA中间体进行复制的感染实体。稍后将介绍逆 转录病毒感染等的更多细节。
有许多逆转录病毒，举例来说包括：鼠白血病病毒(MLV)、鼠 乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病 毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病 毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血 病病毒(A-MLV)、鸟髓细胞瘤病病毒-29(MC29)和鸟骨髓成红 血细胞增多症病毒(AEV)。
还有一种慢病毒家族，包括：人免疫缺陷病毒(HIV)和马感染 性贫血病毒(EIAV)。下文将阐述进一步的细节。
逆转录病毒和慢病毒的详细列表可见于Coffin等的著作(“逆转 录病毒”，1997年，冷泉港实验室出版社：J M Coffin，S M Hughes， HE Varmus 758-763页)。
我们可以从本技术领域中发现一些逆转录病毒基因组结构的细 节。举例来说，HIV病毒的细节可以从NCBI基因库中检索得到(基 因组注册号AF033819)。
上面已经指出，人们对建立基于小的逆转录病毒亚群慢病毒的逆 转录病毒载体系统有相当大的兴趣。这一兴趣首先起源于使用基于 HIV的载体将抗HIV治疗性基因定位到HIV易感细胞的想法，其次来 自于一预言：因为慢病毒能够感染非分裂细胞(Lewis和Emerman， 1993，病毒杂志，68，510)，所以基于这些病毒的载体系统将可以转 导非分裂细胞(如Vile和Russel，1995欧洲医学公告，51，12)。已 经构建了基于HIV的载体系统(Buchschacher和Panganiban，1992年， 病毒杂志，66卷，2731页)，且已经用于转导CD4+细胞，还如期转 导了非分裂细胞(Naldini等，1996年科学272，263)。此外，慢 病毒载体可以使目的基因非常稳定的长时间表达。转导鼠神经细胞后 可以出现至少3个月时间的高表达。基于MLV的载体仅使目的基因表 达6周。
迄今为止，构建的基于HIV的载体在转导的细胞中形成了一种整 合的前病毒，前病毒末端含有HIV的LTRs序列。这限制了这些载体的 使用，因为如果不使用了内部启动子，LTRs必须用作为插入基因的 表达信号。使用内部启动子有显著的缺点。在逆转录病毒的LTR序列 中插入附加的启动子会引起不可预知的结果，这一点已经有文献详细 阐述(Bowtell等，1988，病毒杂志，62，2464；Correll等，1994，血 液杂志84，1812；Emerman和Temin，1984，细胞，39，459；Ghattas 等，1991年，分子细胞生物学杂志，11，5848；Hantzopoulos等，1989； PNAS 86，3519；Hatzoglous等，1991，生化杂志，266，8416；Hatzogous 等，1988，生化杂志，263，17798；Li等，1992，人类基因治疗，3， 381；McLachlin等，1993病毒学195，1；Overell等，1988，分子细 胞生物学，8，1803；Scharfman等，1991，PNAS 88，4626；Vile等， 1994基因治疗，1,307；Xu等，1989，病毒学，171，331；Yee等， 1987，PNAS 84，5197)。涉及的因素包括两种启动子的相对位置和 定位、启动子的特性、表达基因和任何可能被采纳的选择操作。内部 启动子可以影响包装细胞株转导的效价和整合载体的稳定性。
HIV和其他慢病毒的LTRs对基因表达具有病毒特异性要求。例 如，在病毒Tat蛋白缺失情况下，HIV的LTR并不活化(Cullen 1995 AIDS 9，S19)。因此，需要通过改表基因表达要求的途径来修饰LTRs。 特殊情况下，对于一些基因治疗的应用可能还需要组织特异性基因表 达信号。
HIV载体有一系列的明显的缺点，这可能会限制其在一些疾病中 的治疗应用。HIV-1具有成为人病原体的缺点，带有潜在的原癌蛋白 和序列。包装细胞过程中产生的载体颗粒导入细胞表达HIV gag-pol 蛋白，导入患者体内将引起血清转化，这是一危险因素。因为这些原 因，有必要发展不会将HIV蛋白导入患者体内的基于慢病毒的载体。
已经提出了使用MLV来产生转基因动物。然而，使用这一技术产 生的表达水平令人失望。
仍然很有必要建立一种可以有效地产生且其中转基因受到调节的 疾病模型。
本方面的各方面克服了这些困难。
根据本发明的第一个方面，提供了产生转基因细胞的一种方法， 该方法包括向细胞中导入含有目的核苷酸(NOI)的非灵长类慢病毒 表达载体。
本发明提供了产生转基因动物的有效方法，该方法克服了和使用 灵长类慢病毒相关的潜在困难。
优选的是非灵长类慢病毒表达载体来自于EIAV、FIV、BIV、CAEV 或者MVV，而其中EIAV是最为优选的。
本发明的一个优点是表达载体可以在体内或者离体(ex vivo)导 入。在该方法的一个实施方案中，进行体外导入。在另一个实施方案 中，细胞存在于子宫中(in utero)。
已经建立了外源DNA导入哺乳动物胚系的几种方法。该技术使不 同胚系的细胞混合生成嵌合体，使多能细胞如ES细胞成为发育胚胎， 微注射DNA，并通过逆转录病毒感染细胞。大多数这些技术都基本 需要分离受精卵或者早期胚胎；将之体外培养；然后重新放回母体使 胚胎进一步发育。在ES细胞中通过同源重组的方法靶向性插入基因 和来产生转基因动物是劳动密集型且耗时的过程，从细胞核注射开始 算起周期为8至9周。
本发明该实施方案的一个主要优点是不需要进行分离操作，体外 培养，然后再植入。本发明还避免了劳动密集型且耗时的操作。
事实上，大规模的基因测序程序之后，可以获得许多功能未知的 基因。为了从新的基因组靶点开发治疗产品，有必要将生物学和基因 序列信息相对应。本发明提供了一种有效率且有效地验证靶点的体内 方法。
我们也发现了使用本发明可以得到产物的良好表达水平，尤其是 使用EIAV载体的表达水平高于使用MLV载体的表达水平。这一嗲令 人惊奇。
本发明的另一优点是其效率。通过使用一种载体转导，如果需要 数代培养以有效率地产生受调节的敲除疾病模型。因此，本发明满足 了这一长远需要，虽然在当时该问题的解决还不明显。
本发明这一方面的另一个优点是其灵活性；慢病毒载体可以在生 物发育的整个过程中导入。因此，在一个实施方案中，该细胞是一围 产期细胞，该围产期细胞可能是胚胎细胞。在该实施方案的一个特定 方面中，胚胎细胞位于子宫中。然而，该方法可以应用于任何细胞， 如体细胞，也可应用于能够导致胚系改变的任何细胞。这些细胞包括 生殖细胞(germ cell)，但是本发明还能应用于直接或者间接参与配 子形成或受精的细胞。我们还包括不经过直接受精而获得的等效细 胞，如通过细胞核移植技术获得的等效细胞。
优选的是，该细胞是卵母细胞、输卵管细胞、卵巢细胞、卵子细 胞、ES细胞、卵子(blastocyte)、精母细胞、精子细胞、精子或者精原 细胞。
当试图获得胚系改变时，应该了解到越早转导越好，因为这样转 导生殖细胞成功的机会较大。
使用慢反应病毒载体的一个独特优势是：可以转导非分裂细胞或 者慢分裂细胞，比如卵母细胞和精子形成细胞。
接下来，根据本发明的另一方面，本发明提供了一种产生转基因 细胞的方法。该方法包括向非分裂细胞中导入包含NOI的慢病毒表达 载体。慢病毒表达载体可以来自于非灵长类慢病毒，还可以来自于灵 长类慢病毒，如HIV。
本发明该方面的另一优点是细胞不需要进行受精后转导。
我们所指的非分裂细胞包括具备分裂能力但是在某一特定时期不 分裂的细胞。
该方法并不局限于特定的细胞种类，但是细胞优选是真核细胞， 例如动物细胞，优选哺乳动物；或者酵母细胞。本发明可应用的细胞 种类包括鼠细胞；人类细胞；猪细胞；牛细胞；猿细胞；绵羊细胞； 马细胞；鸟细胞，诸如家禽、尤其是鸡的细胞；昆虫细胞或者爬行动 物或者鱼类的细胞。细胞可以来自于线虫或者果蝇。
在一个实施方案中，细胞来自于人类以外的生物。
优选的是，慢病毒表达载体是假型载体(pseudotyped)。
优选的是，慢病毒表达载体不包括任何附属性的功能基因。
NOI可以可操纵地和组成性启动子、组织特异性启动子或诱导性 启动子相连接。
优选的是，NOI编码并能够表达治疗性的蛋白质，或者编码反义 寡聚核酸或者编码核酶。
在一个优选的实施方案中，NOI能够产生一种使靶基因转录后沉 默的RNA分子。本发明的这一方面中，我们提供了一种产生转基因 细胞的方法，该方法包括向细胞中导入慢病毒表达载体，该载体包括 能够产生使靶基因转录后沉默之RNA分子的NOI。
优选的是，NOI能产生短RNA、siRNA、短发卡RNA和微RNA或 者I型内含子。
在一个实施方案中，短RNA、siRNA、短发卡RNA和微型RNA的 表达受一种RNA聚合酶启动子的四环素应答衍生物调节。
在一个实施方案中，该方法中包括转导能够表达一种蛋白质，优 选优选治疗性蛋白质的至少一个NOI，以及编码能够导致靶基因转录 后沉默之RNA分子的至少一个NOI。能够表达一种蛋白质，优选优选 治疗性蛋白质的至少一个NOI，以及编码能够导致靶基因转录后沉默 之RNA分子的至少一个NOI可以存在于同一慢病毒表达载体中，也可 以存在于不同的慢病毒表达载体中。
慢病毒表达载体可以通过各种方便的途径转导进入靶细胞，例如 脐带细胞、胎盘、羊水；或者直接进入器官，比如子宫、性腺、大脑、 肾脏、肝脏、心脏、骨髓、血液、中枢神经系统或者肺。
一只基因敲除小鼠基因表达降低是致死性的，因此这引出了用作 疾病模型的转基因动物产量的问题。在本发明的方法中，NOI能通过 操作和组织特异性或诱导性启动子连接。在一个特定的发育阶段或者 一种特异的组织需要消除基因表达的时候，此点具有独特的优势。
NOI以结构组织特异性或者可调节的方式在转基因生物中表达。 可以表达NOI的细胞种类包括任何器官和组织的细胞，比如所述生物 大脑、肾脏、肝脏、心脏、骨髓、血液、中枢神经系统或者肺的细胞。 NOI还可以在生物的特定发育阶段表达。
如上讨论，在本发明的优选实施方案中，所述NOI编码能够使靶 基因转录后沉默的RNA，如短RNA、siRNA、短发卡RNA或者微RNA。
本发明还涉及到来源于这些细胞的转基因动物。这些转基因动物 可以用作蛋白质生产，如治疗蛋白(例如胰岛素)的生产，这和转基 因动物在动物模型中的使用一样有前景。
在本发明中的一个特定方面中，提供了一种转基因鸟类的卵。因 此根据本发明中的这一方面，提供了一种产生转基因鸟类和/或者转 基因鸟类卵的方法，该方法中包括在鸟类细胞中导入含有NOI的慢病 毒表达载体。在这一情况，NOI编码一种蛋白，该蛋白可以洁净而有 效地从表达蛋白的转基因卵中获得。
然而我们已经认识到由于卵的大小所限，在卵中所产生蛋白质的 体积有限。我们已经发现使一个或多个卵固有编码蛋白的基因沉默， 可能会增加NOI介导的蛋白质表达。这些固有蛋白表达可以通过本发 明的方法下调，例如使用编码能够使天然卵基因沉默之RNA分子的 慢病毒表达载体。一种能表达蛋白质的NOI和一种能产生使卵靶基因 沉默之RNA分子的NOI可以存在于相同的慢病毒载体中，也可以存在 于不同的慢病毒表达载体中。在本发明这一方面的优选实施方案中， 能表达蛋白质的NOI置于受启动子控制的区域中，而这一启动子是卵 所固有的，比如溶菌酶启动子。
因此本发明提供一种转基因生物或者转基因生物卵，其包括能表 达蛋白质，优选治疗性蛋白质的至少一种NOI，以及编码能够使卵固 有靶基因沉默之RNA分子的NOI。如上讨论，第二种NOI可以编码能 够使靶基因转录后沉默的RNA，如短RNA、siRNA、短发卡RNA或微 RNA。
转录后基因沉默作用(PTGS)由双链dsRNA介导，是细胞固有 的、用以控制外源基因在细胞内表达的防御机制。举例来说，转座子 或病毒等一些DNA元件可以随机整合引起dsRNA表达，dsRNA进而 激活序列特异性的同源单链mRNA或者病毒基因RNA降解。沉默作用 称作RNA干扰(RNAi)。RNAi的机制包括将长dsRNAs加工成21～25 个核苷酸(nt)RNAs的两倍体。这些产物称作小干扰RNA或者小沉 默RNAs(siRNAs)，它们是mRNA降解的序列特异性介质。除了 siRNAs，短RNAs的表达也可以改变剪切(“外显子跳跃(exon- skipping)”)或者多聚腺苷酸化，或者抑制翻译。
虽然病毒载体是体内基因转导的有效工具，但由于参与转录后基 因沉默作用的RNA分子较短，使用常规的表达序列盒难以进行这些 RNA分子的转录。另一个问题是，应用病毒载体，例如慢病毒载体 转导上述针对某一基因、编码一种重要生理功能的产物的RNA，由 此生成的转基因生物可能会在发育过程中死亡。本发明的一个方面通 过提供一种载体，该载体中多核苷酸(如siRNA)的转录能被适应酶 所调节，因此克服了这一问题。事实上，本发明的这一方面并不局限 于涉及慢病毒载体的方法，这构成了本发明独立的一个方面。
本发明的第二方面中，提供了包含第一核苷酸序列的载体，其中 所述的第一核苷酸序列包括：
(a)编码适应酶(aptazyme)的第二核苷酸序列；和
(b)可以产生多聚核苷酸的第三核苷酸序列；
此处(a)和(b)可操纵性地相连接，其中适应酶能够活化，切 割第一核苷酸序列的转录本，从而形成多聚核苷酸序列。
换句话说，构建了一种包括核酸序列的载体，其中所述的核酸序 列包括：
(c)编码适应酶的第一核苷酸序列；和
(d)可以产生多聚核苷酸的第二核苷酸序列；
此处(a)和(b)可操纵性地相连接，其中适应酶能够活化，切 割核酸序列的转录本，从而形成多聚核苷酸序列。
优选的是，所述载体是病毒载体。
在本发明这一方面的优选实施方案中，多聚核苷酸是能够调节靶 基因表达的RNA分子，优选选自siRNA、短发卡RNA、微RNA、反义 RNA和核酶。
适应酶是具有别构效应的核酶。该酶是核酸分子，可以形成能结 合许多配体的结构，所述的配体包括蛋白质和药物分子。将核酶例如 锤头状核酶的一个螺旋替换为适应酶，配体存在或不存在条件下导致 该酶构象改变，从而有可能形成能够切割底物(可以是其自身)的催 化性RNA。已经有人报道了(Soukup和Breaker 1999)受黄素单核苷 酸(FMN)诱导或抑制的适应酶，还有人报道了(Piganaeu等2000 年)受强力霉素抑制的适应酶。
本发明的另一个独立方面是：适应酶诱导的切割可以被用来直接 调节NOI的表达。
因此，根据本发明的第三个方面，提供了一种包括第一条核苷酸 序列的载体，其中所述的第一条核苷酸序列包括：
(a)编码适应酶的第二核苷酸序列；和
(b)含有一个NOI的第三核苷酸序列；
其中(a)和(b)可操纵性地相连接，其中适应酶能够活化，切 割第一核苷酸序列的转录本，从而使NOI的表达受到抑制。
换句话说，本发明提供了一个包含核酸序列的载体，此处的核酸 序列包括：
(c)编码适应酶的第一核苷酸序列；和
(d)包括NOI的第二核苷酸序列；
此处(a)和(b)可以通过操作连接，其中适应酶能够活化，切 割核酸序列的转录本，从而NOI的表达受到抑制。
优选的是，所述载体是病毒载体。
在一个实施方案中，由上述载体编码的适应酶活化，从而切割第 一核苷酸的转录本，切割位点位于第三核苷酸序列转录本内。
在一个优选实施方案中，根据本发明的第三方面，该载体编码的 NOI编码一种治疗性蛋白质。
本发明第二和第三方面的一个实施方案中，适应酶结合配体后活 化。
本发明第二和第三方面的另一个实施方案中，适应酶结合配体后 失活。
本发明第二和第三方面的一个优选实施方案中，载体还包括第四 核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种能和适应酶结合的配体。编码配 体的核苷酸序列可操纵性地和启动子连接。
该配体选自多肽和其片段、线性肽、环肽和其编码核苷酸、包括 低分子量有机或者无机化合物的合成和天然化合物以及抗体。
在优选的实施方案中，本发明这些方面中使用的配体选自FMN、 强力霉素和VEGF、四环素或者葡萄糖。
本发明的第二和第三方面的另一个实施方案中，(a)和(b)可 操纵性地和启动子连接。优选的启动子选自RNA聚合酶III(U6)启 动子，例如U6启动子和常规的RNA聚合酶II启动子。
启动子可操纵性地和至少一个拷贝的四环素应答元件(TRE)如 Tet操纵子的相连接，从而使第一核苷酸序列的转录受四环素调节因 子、四环素或者其衍生物调节。
在一个实施方案中，根据本发明的第二和第三方面，该载体包括 编码四环素调节因子的第五核苷酸序列。
虽然我们优选在尽量降低适应酶活性以及自身切割所致载体基因 组不必要的破坏条件下构建载体，在一个优选的实施方案中，载体以 分裂内含子载体(split intron vector)的构型存在。这样可以确保适 应酶的完整序列仅存在于原病毒编码的转录本中，而不出现在载体颗 粒的RNA基因组中。抑制病毒RNA基因组中具有潜在活性之适应酶 形成的另一个手段是使用一种启动子，所述启动子的3’末端序列可以 和适应酶的一部分进行碱基配对，从而形成发卡以阻止病毒RNA基 因组中活化适应酶的形成。分裂内含子载体的细节在WO99/15683中 有描述。
根据本发明第二和第三方面，载体可以来自于任何合适的病毒， 例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒载体、疱疹载体、痘 病毒载体、细小病毒载体或者杆状病毒(baculoviral)载体。
本发明的第四方面中，提供了产生转基因细胞的方法，该方法使 用本发明第二和第三方面中的载体。
根据本方面的第五方面，提供了按照本发明的一些方法产生的转 基因细胞。
根据本发明的第六方面，提供了转基因生物，所述转基因生物通 过本发明中产生的转基因细胞产生或获得。
根据本发明的的第七方面，提供了转基因生物，其中NOI在造血 细胞(包括单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、粒细胞或者这些细胞的 祖细胞)、内皮细胞、肿瘤细胞、间质细胞、星形胶质细胞、肌细胞、 上皮细胞、神经元、成纤维细胞、肝细胞、星形胶质细胞、肾脏、肝 脏、心脏或肺脏细胞中表达。
本发明的另一方面中，提供了根据本发明的转基因生物，此处NOI 在输卵管细胞、生殖道细胞、白蛋白、造血细胞(包括单核细胞、巨 噬细胞、淋巴细胞、粒细胞或者这些细胞的祖细胞)内皮细胞、肿瘤 细胞、间质细胞、星形胶质细胞、神经胶质细胞、肌细胞、上皮细胞、 神经元、成纤维细胞、肝细胞、星形胶质细胞、肾脏、肝脏、心脏或 肺脏细胞中表达。
现在将通过非限制性的实施例方式，参考附图来描述本发明的各 种优选特征和实施方案：
附图简述
图1所示为子宫注射EIAV慢病毒后的肝脏和组织组织学，以及胎 儿静脉内注射后3、7、14、28、79天和6个月后对β半乳糖苷酶标记 基因进行染色的鼠肝脏切片。
图2所示为子宫注射EIAV慢病毒后的组织和组织学，以及胎儿静 脉内注射后3、7、14、28、79天和6个月后对β半乳糖苷酶标记基因 进行染色的鼠肝脏、心脏、骨骼肌、肺、脑和肾脏切片。
图3所示为胎儿脊内注射表达核定位LacZ的EIAV病毒载体7天后 对β半乳糖苷酶标记基因进行染色的鼠背根神经节。
图4所示为胎儿脊内注射表达核定位LacZ的EIAV病毒载体数天后 对β半乳糖苷酶标记基因进行染色的鼠背根神经节切片。
图5所示为胎儿静脉内注射表达核定位LacZ的EIAV病毒载体7天 后对β半乳糖苷酶标记基因进行染色的鼠肝脏切片。
图6所示为胎儿静脉内注射表达核定位LacZ的EIAV病毒载体7天 对β半乳糖苷酶标记基因进行染色的鼠肾血管小球及其切片。
图7所示为胎儿静脉内注射表达核定位LacZ的EIAV病毒载体7天 后对β半乳糖苷酶标记基因进行染色的鼠胰腺及其切片。
图8所示为胎儿肌肉注射表达核定位LacZ的EIAV病毒载体7天后 对β半乳糖苷酶标记基因进行染色的鼠骨骼肌切片。
图9所示为胎儿腹腔注射表达LacZ的EIAV病毒载体两周后对β半 乳糖苷酶标记基因进行染色的鼠膈膜及其横切片。
图10所示为胎儿肌肉注射表达LacZ的EIAV病毒载体两周后对β 半乳糖苷酶标记基因进行染色的鼠小腿及其切片。
图11所示为在胸内和腹膜内注射EIAV病毒载体96小时后，β半 乳糖苷酶催化的X-Gal显色。图11A所示为去除内脏的矢状面。图11B 所示为切除膈膜的正面。
图12所示为EIAV基因组大小的示意图。这可以应用于本发明中 的转染。发生转染时，3’LTR末端将拷贝到5’LTR。
图13所示为pONY8.1G的核酸序列。
图14所示为pONY8.4CG的核苷酸序列。
图15所示为pONY8.1GCZ的核苷酸序列。
图16所示为应用于本发明中的一个载体的杂合U3区示意图。
图1 7所示为这一杂合LTR的核苷酸序列。
图18所示为pONY8.1ZHyb的核苷酸序列。
图19所示为pONY8.1ZHyb的一个示意图。
图20(a)-(c)所示为用作RNAi应用的表达盒。
图21(a)所示为一种用于在介导适应酶调节siRNA基因沉默化过 程的表达盒。
图21(b)所示为图24a表达盒的转录本的结构。
图22所示为一种用于通过siRNAs缺氧诱导VEGF沉默的表达 盒。
图23(a)所示为含有一个RNA聚合酶II启动子和表达适应酶调 节短发卡的表达盒。
图23(b)所示为含有一个RNA聚合酶II启动子的表达盒和表达 适应酶调节反义siRNA的表达盒。
图24(a)所示为用于介导适应酶调节胰岛素表达的表达盒。
图24(b)所示为用于介导适应酶调节因子IX表达的表达盒。
图25(a)所示为一种避免RNA基因组自身剪切的分裂内含子策 略的示意图。
图25(b)所示为一种用于分裂内含子的表达盒。
图26所示为一种避免RNA基因组自身剪切的双发卡策略的示意 图。
发明详述
此处提及的技术通常都是本领域所熟知的，具体可以参考 Sambrook等编撰的《分子克隆：实验指南)》(1989)和Ausubel等撰 写的John Wiley & Sons出版的《(分子生物学简明手册》(1999)。
本发明的一个方面涉及利用非灵长类慢病毒表达载体产生转基因 细胞和从转基因细胞获得转基因生物或转基因生物一部分的方法。更 具体地说，本发明的这一方面涉及慢病毒载体在基因治疗和建立疾病 模型中的有效应用。疾病模型，如基因敲除小鼠的建立大大有益于基 因功能的研究，建立遗传性疾病的哺乳动物模型方面尤其具有相关 性。
基因治疗包括任意一种或多种：一个或多个靶位点，如对靶细胞 中的一个或多个核苷酸序列的进行添加、替换、缺失、补充和操作。 如果靶位点是靶细胞，那么细胞可以是组织或者器官的一部分。有关 基因治疗的一般技术参见《分子生物学》(Ed Robert Meyers，Pub VCH，如556-558)。
进一步举例来说，基因治疗还提供了一种方法，通过这种方法， 可以应用任何一个或多个核苷酸序列，如基因来置换或补充有缺陷的 基因；去除致病基因及其产物；按次序增加新基因，例如用以产生一 种更为有利的表型；可以在分子水平操作细胞以治疗癌症(Schmidt -Wolf和Schmidt-Wolf，1994，血液学年报69：273-279)或者其 他病情，例如免疫、心血管、神经系统、炎性或者感染性疾病；可以 操作抗原和/或导入体内引起免疫应答-例如基因疫苗。
转基因生物是其细胞的至少一种细胞中含有目的核苷酸序列 (NOI)。在一个实施方案中，细胞是胚系细胞。在另一个实施方案 中，细胞是体细胞。更具体的是，NOI已通过实验法，例如使用cDNA 技术转导。
NOI通常指的是“转基因”，即以能够确保其功能的方式插入细 胞的一个基因。当基因插入胚系细胞时，必须象正常基因一样发挥功 能、复制并转移。
本发明包括嵌合体(chimeras)和镶嵌体(mosaics)。
“嵌合体”是一种由遗传上不同的细胞的混合体组成的生物。
“镶嵌体”是第一次细胞分裂后将转基因整合入基因组的生物。 因为不同细胞具有不同的整合位点，该生物是镶嵌体。
本发明的转基因生物优选是一种多细胞的真核生物，如动物或者 植物或真菌或诸如酵母之类的单细胞真核生物。
然后生物优选是一种动物，更优选的是哺乳动物。
本发明的第一方面使用非灵长类慢病毒表达载体。
如本领域所熟知的，载体是一种可以促使基因从一种环境转移进 入另一种环境的工具。根据本发明，举例来说，应用于重组DNA技 术中的一些载体能够使DNA片段之类的实体(例如异源DNA片段， 例如异源cDNA片段)转移进入宿主细胞，使含有DNA片段的载体得 以复制。举例来说，在重组DNA技术中使用的载体包括但不仅限于 质粒、染色体、人工染色体或者病毒。
“表达载体”表示一种能够在体内或体外/离体表达的一种构建 体。
本发明的一些方面中使用的慢病毒载体能够转导非分裂的靶细 胞。该特征的优点是：由于新鲜分离的卵母细胞是沉默的，使用慢病 毒可以增强转导效率，而逆转录病毒则不能。
在本发明的方法中使用的一个典型载体中，至少可以从病毒中去 除一个或者多个对于复制来说关键的蛋白质编码区部分。这使地病毒 病毒载体具有复制缺陷。病毒基因组部分还替换为编码候选调节性部 分的文库，该候选调节性部分可操纵性地和载体基因组中调控性的控 制区以及报道部分相连，以产生包含候选调节性部分的载体，其中所 述的候选调节性部分能够转导非分裂的靶细胞和/或将其基因组整合 到宿主细胞中。
优选的是，能转导非分裂或者慢分裂细胞的病毒载体是慢病毒载 体。
慢病毒载体是逆转录病毒大家族中的一部分。慢病毒的详细列单 参考Coffin等(《逆转录病毒》1997冷泉港实验室出版社：J M Coffin， S M Hughes，H E Varmus 758-763页)。简单的说，慢病毒可以分为 灵长类和非灵长类。举例来说，灵长类慢病毒包括但不仅限于：人自 身免疫缺陷综合征(AIDS)的致病因子——人免疫缺陷病毒(HIV) 和猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒包括原型“慢病毒”梅 迪病毒(VMV)、相关羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、马感染性贫血 病毒(EIAV)和近期描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病 毒(BIV)。
慢病毒家族和其他逆转录病毒的区别在于慢病毒既能感染分裂细 胞也能感染非分裂细胞(Lewis等，1992，EMBO.J 11：3053-3058； Lewis和Emerman，1994，病毒学杂志.68：510-516)。相比之下， 其他慢病毒如MLV不能感染非分裂细胞或者慢分裂细胞，这些细胞 如肌、脑、肺、肝等组织的细胞。
本发明一些方面中使用的“非灵长类载体”指载体来源于最初不 感染灵长类动物，尤其是人类的病毒。因此，非灵长类病毒载体包括 感染非灵长类哺乳动物的载体，这些非灵长类动物如狗、羊、马、爬 行动物、鸟和昆虫。
此处使用的慢病毒或者慢病毒载体至少包含一种衍生自慢病毒的 组成部分。优选的是，所述的组成部分参与载体感染细胞、表达基因 或复制的生物学机制。所使用的“衍生”(derivable)表述的意义不 是一般的意义，是该序列没有必要从慢病毒中获取，而是能够从其衍 生而来。举例来说，该序列可以合成得到或者通过使用重组DNA技 术获取。
非灵长类慢病毒可以是慢病毒家族的任何成员，其本质上并不感 染灵长类，包括有猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)， 羊关节脑炎病毒(CAEV)、Maedi绵羊脱髓鞘性脑白质炎病毒(MVV) 或者马感染性的贫血病毒(EIAV)。优选的非灵长类慢病毒是一种 EIAV。马感染性贫血病毒感染所有的马，导致血浆病毒血症和血小 板减少(Clabough等，1991，病毒杂志，65：6242-6251)。病毒复 制受单核细胞转化为巨噬细胞这一过程控制。
在一个实施方案中，病毒载体源自于EIAV。在本发明中特别优 选使用的EIAV具有最简单的慢病毒基因结构。除了gag、pol和env基 因，EIAV编码三种其他基因：tat、rev和S2。Tat作为病毒LTR的转录 活化因子(Derse和Newbold，1993，病毒学，194：530-536；Maury 等，1994，病毒学，200：632-642)；Rev通过rev-应答元件(RRE) 控制和调节病毒基因的表达(Martarano等，1994，病毒学杂志，68： 3102-3111)。这两种蛋白作用的机制被公认为和灵长类病毒的机制相 似(Martano等，引文同上)。S2的功能不详。此外，还分离得到一 个EIAV蛋白Ttm，它是由tat基因的第一个外显子与env基因编码跨膜 蛋白的启始序列拼接所编码的。
除了蛋白酶、逆转录酶和整合酶，非灵长类慢病毒还包括第四个 由pol基因编码的dUTPase，这可能在慢病毒感染某些非分裂型细胞时 起作用。
本发明该方面的病毒RNA由一个启动子转录，启动子可以是病毒 或者非病毒来源的，但必须能控制在真核细胞如哺乳动物细胞的表 达。在启动子上游或者下游可以随意地选用增强子。RNA转录在多 聚腺苷酸化位点中止，该位点可以由慢病毒3’LTR或一种不同的多聚 腺嘌呤信号提供。
因此，本发明使用的DNA转录元件包括启动子和随意地选用的增 强子，该元件能够调节控制非灵长类慢病毒载体基因组的表达。
此处描述的转录件包括含有能够得以转录之序列的核酸区域。因 此，根据该定义，这些序列包括编码mRNA、tRNA和rRNA的序列。 该序列可以在启动子的正义方向或者反义方向上。可以根据人们所熟 知的技术，使用反义构建体来抑制细胞内的一个基因表达。例如，核 酸可以是核糖核酸(RNA)或者脱氧核糖核酸(DNA)或者其类似 物。编码mRNA的序列可选性地包括一些或者所有5’和/或者3’端被转 录但不被翻译的旁侧序列；或者相反，和翻译编码序列相关的序列。 该序列甚至可选性地包括和转录序列相关的转录控制序列；例如转录 中止信号、多聚腺苷酸化位点和下游增强子元件。核酸可以包括cDNA 或者基因组DNA(可包括内含子)。
逆转录病毒基因组的基本结构是一个5’LTR和3’LTR，在两者之 间或其内部存在能使病毒基因组被包装的包装信号、引物结合位点、 使病毒基因组整合入宿主细胞基因组的整合位点和编码包装成分的 gag、pol和env基因——这些多肽是病毒颗粒装配所必需的。更复杂 的逆转录病毒具有其它的特征，例如HIV中的rev和RRE序列，两者可 以使整合的原病毒RNA转录本从核到被感染靶细胞的细胞质被有效 地转运。
在原病毒中，这些基因位于长末端重复区(LTRs)的旁侧。LTRs 控制原病毒整合和转录。LTRs也作为增强子-启动子序列能控制病 毒基因的表达。由于一种psi序列定位于5’基因组末端的存在，逆转录 病毒RNAs可发生包装。
LTRs本身是与U3、R和U5三个元件序列完全相同的。U3源自于 RNA 3’末端的单一序列。R来自于RNA两端的重复序列。U5来自于 RNA 5’末端的单一序列。这三个元件的大小在不同的逆转录病毒间 有变化。
在一个缺陷型逆转录病毒载体基因组中，gag、pol和env可以缺失 或者没有功能。RNA两端的R区域是重复序列。U5和U3分别表示RNA 基因组5’和3’末端的单一序列。
根据本发明的一个方面，优选使用的载体是重组非灵长类慢病毒 载体。
“重组慢反应病毒载体”(RLV)表示一种含有足够的逆转录病 毒遗传信息的载体，在包装成分存在时RNA基因组能包装感染靶细 胞的病毒颗粒。靶细胞的感染包括逆转录和靶细胞基因组的整合。RLV 含有通过载体进入靶细胞的非病毒编码序列。RLV在靶细胞中不能独 立复制产生感染性逆转录病毒颗粒。RLV通常缺乏功能性的gag-pol 和/或者env基因和/或者其他复制必需的基因。本发明的载体可以构建 为分裂内含子载体。分裂内含子载体在PCT专利申请WO99/15683中 有描述。
优选的是，本发明中慢病毒载体有一个最小病毒基因组。
如此处所使用的“最小病毒基因”意味着病毒载体经过操作以致 于去除非必需元件而保留必需元件，以提供感染、转导的必需的功能 和递送目的核苷酸序列进入靶宿主细胞。这个策略的更多细节可参见 我们的WO98/17815。
本发明使用的最小慢病毒基因组包括(5’)R-U5-一个或多个第 一核苷酸序列-U3-R(3’)。然而，在宿主/包装细胞用于产生慢病毒基 因组的质粒载体还包括转录调节控制序列，这些转录调节控制序列可 操纵性地和慢病毒基因组相连并控制基因组在宿主/包装细胞内转 录。这些调节序列可以是和转录的逆转录病毒序列相关的自身序列， 如5’U3区域；或者它们可以是象另一病毒启动子那样的异源启动子， 例如CMV启动子。一些慢病毒基因组为了高效地产生病毒需要另外 的的序列。例如，对于HIV来说优选包括rev和RRE序列。然而，对rev 和RRE的必要条件可以通过密码子优化减少或者消除。这个策略的更 多细节可参见我们的W001/79518。
在本发明的一个实施方案中，慢病毒载体是自身不能激活的载 体。
举例来说，通过去除转录增强子或者同时去除3’LTR U3区域的 增强子和启动子已构建了自身不能激活的逆转录病毒载体。经过一轮 的载体逆转录和整合之后，这些改变可以拷贝到5’和3’LTRs并产生一 种转录的非活化原病毒。(Yu等，1986，Proc Natl Acad Sci，83：3194- 3198；Dougherty和Temin，1987，Proc Natl Acad Sci，84：1197-1201； Hawley等，1987，Proc Natl Acad Sci，84：2406-2410；Yee等，1987，Proc Natl Acad Sci，91：9564-9568)。然而，这些载体内部的启动子到LTRs 仍将被转录活化。这种策略已被用于消除在病毒LTRs中的增强子和 启动子对内置基因转录作用的影响。这些影响包括增强的转录(Jolley 等，1983，Nucleic Acids Res，11：1855-1872)或者转录抑制(Emerman和 Temin，1984，Cell，39：449-467)。这种策略也可以用来消除从3’LTR 进入基因组DNA的下游转录。(Herman和Coffin，1987，Science，236： 845-848)。这在人类基因治疗方面引起了特别的关注，它对阻止内 源性癌基因偶然的活化极其重要。
在我们的WO99/32646中，我们给出了可以方便应用于本发明的 特征细节。具体地说，非灵长类慢病毒基因组(1)优选包括缺失的gag 基因，其中gag基因中的缺失去除了gag编码序列中约350或354个核苷 酸下游的一个或者多个核苷酸；(2)优选具有非灵长类慢病毒基因 组中不存在的一个或多个附属基因；(3)优选缺乏tat基因，但包括 5’LTR末端和gag ATG之间的前导序列；和(4)(1)、(2)和(3) 的组合。在一个特别优选的实施方案中，慢病毒载体包括(1)、(2) 和(3)的所有特征。
非灵长类慢病毒载体可以是靶向载体。“靶向载体”指的是一种 载体，该载体感染/转染/转导细胞或者在宿主和/或靶细胞中表达的能 力仅限于宿主生物体内特定的细胞类型，通常是共同或者相似表型的 细胞。
使用逆转录病毒载体进行基因治疗的靶细胞包括但不仅限于造血 细胞(包括单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、粒细胞或者任意这些细 胞的祖细胞)；内皮细胞、肿瘤细胞、间质细胞、星形胶质细胞或者 神经胶质细胞、肌细胞、上皮细胞、神经元、成纤维细胞、肝细胞、 星形胶质细胞、肾脏、肝脏、心脏和肺细胞。
载体可以是含有任何分子的假型载体，这些分子包括但不局限于 VSV-G、rabies、Mokola、MuLV、LCMV、Sendai和Ebola的包膜糖 蛋白(野生型或者人工改造的变体或者嵌合体)。
虽然本发明的第一方面为使用慢病毒载体的一种方法，本发明的 其他方面可以使用其他的病毒表达载体。根据这些方面的病毒载体包 括但不局限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相 关载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、细小病毒载体或者杆状病毒载 体。
本发明这些方面中使用的逆转录病毒载体来自于或可来自于任何 合适的逆转录病毒。已鉴定到了大量不同的逆转录病毒。这些例子包 括：鼠白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、人T细胞淋 巴病毒(HTLV)、鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、 Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR 鼠骨肉瘤病毒(FBR-MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson 鼠白血病病毒(A-MLV)、鸟髓细胞瘤病病毒-29(MC29)和鸟骨 髓成红血细胞增多症病毒(AEV)。逆转录病毒的详细列表可参见 Coffin等，1997年的《逆转录病毒》，冷泉港实验室出版社：J M Coffin， S M Hughes，H E Varmus，758-763页。
逆转录病毒可以广泛地分为两大类型，即“简单型”和“复杂型”。 逆转录病毒可以进一步分作7类。其中5类是带有原癌基因的逆转录病 毒。其余的两类是慢病毒和泡沫病毒。这些逆转录病毒的综述文献参 见Coffin等1997年的著作(同上)。
腺病毒是双链线性DNA病毒，不需要经过RNA中间体。有50余种 不同的人类血清型腺病毒，根据遗传序列同源性分为6个亚家族。腺 病毒的靶点是呼吸系统和胃肠道的上皮细胞，通常引起较轻的症状。 血清型2和5(95％序列同源性)通常是腺病毒载体系统中最常用到的， 通常和年轻人上呼吸道感染相关。
病毒基因表达可以分为早期(E)和晚期(L)阶段。晚期阶段定 义为病毒DNA复制的开始。腺病毒结构蛋白通常在晚期阶段合成。 腺病毒感染后，受多数血清型病毒感染的宿主细胞mRNA和蛋白的合 成受到抑制。腺病毒2和5的裂解周期非常有效率，导致每个感染细胞 中大约10000个病毒颗粒形成，同时和合成过量的、并不装配入病毒 颗粒的病毒蛋白和DNA。早期腺病毒转录是一系列复杂的相关生化 事件，但是其在DNA复制之前实现了必要的病毒RNA的合成。
在所有腺病毒亚家族中，腺病毒基因组结构相似；对于研究的每 一种血清型来说，特定的功能通常发生在同样的位置上。早期胞浆信 使RNA和四种明确的、不相邻近的病毒DNA区相互补。这些区域命 名为E1-E4。早期转录本分类为立即早期(E1a)、晚早期(E1b、E2a、 E2b、E3和E4)和立即区域。
早期基因在感染后约6～8小时表达，并从基因元件E1-4中的7个启 动子开始转录。
腺病毒可以通过去除E1基因从而用于基因转导的载体，E1基因对 于E2、E3和E4启动子的诱导非常重要。E1复制缺陷病毒可以在含有E1 多肽的、诸如人胚肾细胞系293之类的细胞系中复制。一种或多种治 疗基因能够通过重组而取代E1基因。E1启动子或者一种异种启动子 启动子启动基因表达。
通过缺失某些或者所有的E4开放阅读框(ORFs)已构建了毒性 较弱的腺病毒载体。然而，即使DNA仍保持，某些第二代载体似乎 不会引起基因长时间表达。因此，一个或者几个E4 ORFs的功能似乎 是增强从病毒携带的至少某些病毒启动子的表达。
构建严重缺陷的病毒的另一种侯选方法是彻底去除病毒的核心组 分而仅保留对于病毒复制所必需的末端重复序列。“去除的”“取出 (gutted)”或者“非完全去除的”“未取出(gutless)”病毒和存在于293 细胞中的第一代辅助病毒能够形成高滴度的病毒，但很难从辅助病毒 中分离“去除的”病毒载体。
在鉴定候选基因调节因子(moieties)方面，腺病毒载体具有优 于其他基因治疗载体系统的，其原因如下：
腺病毒是双链DNA无包膜的病毒，能够在体内外转导很多类型的 人源或者非人源的细胞。这些细胞包括呼吸道上皮细胞、肝细胞、肌 细胞、心肌细胞、滑膜细胞、乳腺上皮细胞和有丝分裂后终端分化细 胞，比如神经元。
腺病毒载体也能转导非分裂细胞。这对于诸如囊性纤维化之类的 疾病非常重要，在这些囊性纤维化疾病中，肺上皮中受感染细胞具有 低周转速度。事实上，正进行利用腺病毒介导囊性纤维化转运(CFTR) 方法导入囊性纤维化成年患者肺部的试验。
病毒或者腺病毒基因组中的外源基因表达不需要一种复制型的细 胞。腺病毒载体通过受体介导的胞饮作用进入细胞。一旦进入细胞内， 腺病毒载体就很少整合入宿主染色体。腺病毒载体以线性基因组游离 于(不依赖于宿主基因组)宿主细胞核中行使功能。因此，重组腺病 毒的使用可以减少基因随机整合进入宿主基因组的问题。
根据本发明的许多方面可以使用痘病毒载体，由于大的DNA片段 易于被克隆到痘病毒基因中，并且已有重组减毒的牛痘突变体的文献 报道(Meyer等，1991，J.Gen Virol.72：1031-1038，Smith和Moss 1983 Gene，25：21-28)。
痘病毒载体例如但不局限于兔痘病毒Upton等，J.Virology 60：920 (1986)(shope纤维瘤病毒)；羊痘病毒属Gershon等J.Gen Virol.70： 525(1989)(肯亚绵羊-1)；正痘病毒属：Weir等J.Virology 46： 530(1983)(牛痘)；Esposito等，Virology 135：561(1984)(猴 痘和天花病毒)；Hruby等，PNAS，80：3411(1983)(牛痘)；Kilpatrick 等Virology 143：399(1985)(Yaba猴肿瘤病毒)；禽痘病毒：Binns 等，J.Gen Virol.69：1275(1988)(禽痘)；Boyle等，Virology 156： 355(1987)(禽痘)；Schnitzlein等J.Virological Method，20：341 (1988)(禽痘，鹌鹑痘)；昆虫痘(Lytvyn等，J.Gen Virol.73：3235-3240 (1992)。
痘病毒在真核细胞中被广泛地用作目的基因的表达载体。具体地 说，它们在多种宿主细胞中易于克隆和繁殖的特征导致痘病毒载体广 泛应用于表达外源蛋白的载体和传送疫苗抗原的工具(Moss，B.1991， Science，252：1662-7)。
根据本发明一些方面所使用的痘病毒包括但不仅限于重组痘病毒 载体，例如禽痘病毒(FPV)、昆虫痘病毒；牛痘病毒，例如NYVAC、 金丝雀痘病毒，MVA或者其他非复制病毒载体系统，如WO 95/30018 中所描述的例子。还描述了至少一种免疫逃避基因缺失了的痘病毒载 体(参见WO 00/29428)。
如上所示，本发明的方法中使用的核苷酸序列插入载体中并通过 操作与控制序列相连结，而控制序列通过宿主细胞可表达编码序列， 也就是说载体是一表达载体。重组宿主细胞产生的NOI可以被分泌或 者保存在细胞内，这取决于所使用的序列和/或载体。
异源基因NOI可以是一个野生型基因的任意一种等位变体，或者 可以是一种变突基因。“基因”意思是包括至少能被转录的核苷酸序 列。因此，编码mRNA、tRNA、和rRNA的序列包括在这个定义之中。 相对于启动子这些序列可以位于正义或者反义链中。根据人们熟知的 技术反义结构来抑制细胞中的某一基因的表达。例如，核苷酸可以是 核糖核酸(RNA)或者脱氧核糖核酸(DNA)或者它们的任意类似 物。编码mRNA的序列可以选择性地包括一部分或者所有的5’和/或者 3’转录但不被翻译的旁侧序列，或相反，和能翻译的编码序列相连接。 它可以进一步选择性地包括与转录序列相关的转录控制序列，例如转 录中止信号、多聚腺苷酸化位点和下游增强子元件。核酸可以包括 cDNA或者基因组DNA(可以包含内含子)。然而，通常指的是使用 cDNA，因为它不需要去除内含子并可以高效表达。
合适的NOI编码序列包括那些治疗性的和/或者诊断性的应用，例 如但不局限于编码细胞因子、趋化因子、激素、抗体、工程化的免疫 球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、酶、免疫共刺激分子、免疫调 节分子、反义RNA、靶蛋白的阴性突变体、毒素、引起条件反应的 毒素(conditional toxin)、抗原、肿瘤抑制因子蛋白和生长因子、膜 蛋白、血管活化(vasoactive)蛋白和多肽、抗病毒蛋白和核酶及其 衍生物(例如设有一个相关的报道基团)。这些编码序列可以通过操 作与合适的启动子相连。该启动子可以是使核酶表达的启动子，或者 是另一个或多个不同的启动子。
本发明中使用的用于治疗和预防癌症的NOIs包括NOIs编码蛋 白。这些蛋白质破坏靶细胞(例如一种核糖体毒素)，作为肿瘤抑制 因子(例如野生型p53)、抗肿瘤免疫机制的活化因子(例如细胞因 子、协同刺激分子和免疫球蛋白)、血管生成抑制剂；或者这些蛋白 质提高药物的敏感性(例如前药活化酶)，通过体内效应细胞间接刺 激靶细胞的破坏(例如，强抗原刺激免疫系统或者转变一种前体细胞 成分成为毒性物质从而破坏靶细胞(例如一种前药激活酶))。编码 蛋白也能破坏静止肿瘤细胞(例如利用分泌的抗肿瘤抗体-核糖体毒 素融合蛋白)，编码蛋白间接刺激静止肿瘤细胞的破坏(例如细胞因 子刺激免疫系统或者促凝血蛋白引起局部血管阻塞)或者转变一种前 体细胞成分成为毒性物质从而破坏静止肿瘤细胞(例如活化前药成为 可扩散药物的酶)。
NOIs可以用于编码反义转录本或者干扰肿瘤生存所必需的基因表 达的核酶(例如干扰伯基特淋巴瘤myc的异常转录或者干扰慢性髓样 淋巴瘤bcr-abl的转录)。也观察了这些NOIs的联合使用。
关于治疗性基因性质的更详细资料参见WO95/21927和 WO98/15294。
用于治疗或者预防缺血性心脏病的NOIs包括编码血纤维蛋白溶酶 原活化因子的NOIs。用于治疗和预防风湿性关节炎和脑型疟的NOIs 包括编码抗炎蛋白、作用于肿瘤坏死因子(TNF)α的抗体和抗粘附 分子(例如抗体分子或者粘附分子的特异性受体)的基因。
用于治疗缺氧的NOIs的例子可参见WO95/21927。
NOI编码序列可以编码融合蛋白或者一编码序列中的一个片段。
作为在靶组织中选择性表达的可替换方案，或者与之同时进行的 方案，NOI或者NOIs可以编码前药激活酶或者酶，如果不用一种或多 种作用于一种酶或多种酶的前药对个体进行处理，这些酶就没有重要 作用或有害效应。在存在活化NOI的情况下，对患者进行适当的前药 治疗可以降低肿瘤生长或者存活。
前药激活酶可以在肿瘤位点释放进行癌症治疗。在每个病例中， 一种合适的前药与合适的前药活化酶联合用于患者治疗。合适的前药 通过和载体连接进行给药。举例来说，前药包括依托泊甙磷酸盐(和 碱性磷酸酶联合)、5-氟胞嘧啶(和胞嘧啶脱氨酶联合)、阿霉素-N- 对羟基酚乙酰胺(和青霉素-V-酰胺酶联合)、对-N-二(2-氯乙烯基) 氨基苯甲酰谷氨酰胺(和羧肽酶G2联合)、头孢菌素氮芥氨基甲酸 盐(和β-内酰胺酶联合)、SR4233(和P450还原酶联合)、更昔洛韦 (ganciclovir，和HSV胸腺嘧啶激酶联合)；芥子气(mastard)前药 和硝基还原酶联合；以及环磷酰胺(和P450联合)。
举例来说，本发明使用的合适前药活化酶包括激活5-氟尿嘧啶 前药capcetabine和furtulon的胸腺嘧啶磷酸化酶；来自单纯疱疹病毒的 激活更昔洛韦的胸腺嘧啶激酶；激活前药环磷酰胺成为DNA破坏物 的细胞色素P450；和激活5-氟胞嘧啶的胞嘧啶脱氨酶。优选使用人 源性的酶。
用于治疗或预防缺血性心脏病的合适NOIs包括编码血纤维蛋白溶 酶原活化因子的NOIs。用于治疗或预防风湿性关节炎或者脑型疟疾 的合适NOIs包括编码抗炎蛋白、作用于肿瘤坏死因子(TNF)α的 抗体和抗粘附分子(例如抗体分子或者粘附分子的特异性受体)的基 因。
NOIs编码的表达产物可以是细胞分泌的蛋白质。作为可替代方 案，NOI表达产物不分泌而在细胞内活化。在任一种情况下，优选NOI 表达产物显示一种旁观效应或者一种远端旁观效应；即细胞中形成的 表达产物导致邻近的或者远端的(如转移的)的细胞死亡，这些细胞 都具有一种共有的表型。
诸如编码细胞因子的NOIs可以应用于巨噬细胞或者其他造血细 胞。这些细胞因子引起含有治疗性NOI的造血干细胞后续分化 (HSCs)。合适的细胞因子和生长因子包括但不仅限于：ApoE、 Apo-SAA、BDNF、Cardiotrophin-1、EGF、ENA-78、Eotaxin、Eotaxin-2、 Exodus-2、FGF-酸性、FGF-碱性、纤维原细胞生长因子-10、FLT3配 体、Fractalkine(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、胰岛 素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8(72a.a.)、IL-8(77a.a.)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、 IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素α、抑制素β、IP-10、 角化细胞生长因子-2(KGF-2)、KGF、Leptin、LIF、淋巴毒素、Mullerian 抑制物、单核集落抑制因子、单核细胞趋化蛋白、M-CSF、MDC(67 a.a.)、MDC(69a.a.)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC (67a.a.)、MDC(69a.a.)、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3 β、MIP-4、骨髓原祖抑制因子-1(MPIF-1)、NAP-2、Neurturin、神 经生长因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制瘤素M、PDGF-AA、PDGF- AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、 干细胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、 肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNIL-1、TPO、VEGF、GCP-2、 GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ和HCC1。
对于一些应用，优选一些细胞因子联合作用。具体地说，包括 IL-3、IL-6和CSF联合应用以维持和扩充干细胞数。对于体外分化， 可以增加诸如如GM-CSF和G-CSF细胞因子诱导巨噬细胞分化，或 者增加GM-CSF和G-CSF来获得中性粒细胞。当来自患者的工程化 细胞再次导入患者体内，然后患者的自身机制允许这些细胞或者分化 的细胞后代迁移进入到诸如肿瘤侵袭的区域，。
作为可替代方案，另一种NOI可以是自杀基因，在外源物质存在 情况下该基因表达导致转染或者转导的细胞破坏。自杀基因的一个例 子包括单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSVtk)，能够杀死更昔洛韦治 疗后的被感染的细胞和静止细胞。
作为可替代方案，另一种NOI可以是一种靶蛋白(例如干细胞因 子受体的抗体(WO-A-92、17505；WO-A-9221766))。举例来 说，重组体(ecotropic)逆转录病毒显示一种存在于HSCs(例如CD34 或者干细胞因子)表面的受体抗体(或者生长因子或者多肽)，这种 抗体可以通过体外病毒和骨髓共孵育或者通过静脉注射病毒运输进入 这些细胞。
NOIs也可以包括标记基因(例如编码β-半乳糖苷酶或者绿色荧 光蛋白的基因)、或者调节其他基因表达的基因。此外，NOIs可以 包括编码融合蛋白伴侣(partners)的序列并与编码目的蛋白的序列 形成一个通读框。融合蛋白配体的例子包括GAL4、6xHis和β-半乳 糖苷酶的DNA结合或者转录激活域。增加NOIs编码的靶蛋白的靶序 列可以使表达的融合蛋白定位于特定的细胞结构或者进入分泌途径。 这样的靶序列已经在该领域被广泛地被描述。
在一个实施方案中，根据本发明至少一种NOI通过操作与细菌 HRE元件相连接并编码诸如FNR的氧感应细菌转录调节蛋白。这样的 构建体在缺氧时可以提供一个自身调节系统，由HRE构建体表达的细 菌转录调节蛋白将增加和进一步增加HRE构建体的转录和其他HRE构 建体的转录。
在一优选的实施方案中，NOI编码核酶。核酶是RNA分子，可以 在细胞内催化特定的化学反应且不需要特别的蛋白质参与。举例来 说，I型核酶以内含子的形式存在，能够调节自身剪切前体RNA的剪 切。其他核酶衍生于自身剪接RNA结构，它们是病毒RNA分子的复 制必需的。象蛋白质酶一样，核酶可以折叠成二级和三级结构并形成 底物和诸如金属离子辅因子的特异结合位点。这些结构的例子包括锤 头结构、发卡或者茎环、假结体(pseudoknot)和已描述过肝炎δ抗基 因组核酶。
每种核酶含有一个识别和结合靶RNA识别位点的基元(motif)。该 基元形成以一种或者多种“结合臂”但通常形成两种“结合臂”。锤 头状核酶中结合臂是螺旋I和螺旋III的旁侧序列，螺旋I和螺旋III与 螺旋II相邻。结合臂长度可以变化，通常在6-10个核苷酸之间，但 也可以更短或者更长。
旁侧序列的长度能够影响剪切的速度。举例来说，已发现旁侧序 列核苷酸总数从20个降低到12个能增加核酶剪切HIV序列的的周转速 度(turnover rate)达10倍(Goodchild JVK，1991 Arch Biochem Biophys 284：386-391)。锤头状核酶的螺旋II中催化基元在一个称作剪切位 点的区域剪切靶RNA。对一个含有合适剪切位点的核酶来说，核酶 是否会剪切任意的给定RNA取决于核酶的识别位点存在与否。
每个类型核酶识别自身的剪切位点。锤头状核酶的剪切位点含有 位于其上游的核苷酸碱基三联体GUX，其中G是鸟嘌呤，U是尿嘧啶， X是任意的核苷酸碱基。发卡状核酶含有BCUGNYR的剪切位点，其 中B是除腺嘌呤外任意的的核苷酸碱基，N是任意核苷酸，Y是胞嘧 啶或者胸腺嘧啶，R是鸟嘌呤或者腺嘌呤。发卡核酶的剪切发生于剪 切位点中的G和N之间。
关于核酶更详细的描述参见“分子生物学和生物技术”(Ed.RA Meyers，1995，VCH出版社，831-8320页和“逆转录病毒”(Ed.JM Coffin等，1997，冷泉港实验室出版，683页)。
核酶可以在所有细胞中诱导表达，但仅在靶基因转录本存在的细 胞中起作用。
作为替代直接抑制组分结合的选择方案，该组分可以抑制一个发 明多肽的生物可利用量。举例来说，这可以通过在转录水平、转录本 稳定性、翻译或者翻译后稳定性抑制该组分的表达。举例来说这种物 质的可以是抑制mRNA生物合成的反义RNA或者双链干扰RNA序列。
在另一优选的实施方案中，NOI包括一种siRNA。双链RNA (dsRNA)介导的转录后基因沉默(PTGS)是一种保守的细胞内保 护机制，可以控制外源基因的表达。转座子元件或者病毒的随机整合 引起dsRNA表达，dsRNA激活序列特异性的同源单链mRNA的降解或 者病毒基因组RNA的降解。沉默作用是大家知道的RNA干扰 (RNAi)。RNAi的机制涉及长dsRNAs加工成为21～25个核苷酸(nt) RNAs复合体的过程。这些产物称为小干扰或者沉默RNAs (siRNAs)，siRNAs是序列特异性的mRNA降解调节子。在不同的 哺乳动物细胞中，已发现大于30bp dsRNA激活干扰素应答反应，这 导致蛋白合成中止和非特异性mRNA降解(Stark等1998)。然而， 能用21nt的siRNA复合体激活该应答反应(Elbashir等2001年， Hutvagner等2001年)，可在培养的哺乳动物细胞中用于基因的功能 分析。
在一实施方案中，一种诸如U6的RNA聚合酶III启动子的活性受 四环素调节，可用于调节siRNA的表达(Ohkawa等，2000)。
在另一实施方案中，NOI包括一种微型RNA。微型RNAs是生物 体自身的一个大家族的小RNAs，至少某些微型RNA调节靶基因的表 达。微型RNA家族的组成成员是let-7和lin-4。Let-7基因编码小的、高 度保守的RNA种类，在蠕虫发育过程中调节内源性蛋白编码基因的 表达。活化的RNA种类开始被转录成～70nt的前体，在转录后加工形 成成熟的～21nt的形式。Let-7和lin-4被转录成为发卡RNA前体，RNA 前体在Dicer酶的作用下形成成熟的形式(Lagos-Quintana等，2001 年)。
在一个进一步的实施方案中，NOI包括一个以发卡形式存在的双 链干扰RNA。短发卡可以由诸如U6的简单启动子启始表达。在另一 备选实施方案中，有效的RNAi可以通过合并的两个U6启动子介导调 节，其中一种表达正义链区，另一种表达该靶序列的同一序列的反向 互补序列。这在实例9中有描述。在一个进一步的实施方案中，可以 通过使用两个反向的的启动子从表达盒的正向链和互补链转录靶序列 的正义和反义区来介导有效的或者双链干扰RNA。这些实施方案将 在实例9中进一步描述。
在另一实施方案中，NOI可以编码短RNA，可以改变剪接方向(外 显子跳跃)或者多腺苷酸化或者抑制翻译。在肌肉萎缩症的病例中， 与没有破坏翻译阅读框(Becker肌肉萎缩症)相比，肌营养不良蛋白 (dystrophin)基因的移码突变导致严重的Duchenne肌肉萎缩症 (DMD)。已发现诱导外显子46跳跃的反义序列能有效地修复DMD 患者肌细胞中的内源性肌营养不良蛋白基因的表达(van Deutekom等 2001)。通过反义寡核苷酸靶向结合到E-选择素的3’腺苷酸化位点改 变其隐含的上游位点的多聚腺苷酸化作用，由此产生含有少数不稳定 序列的转录本，从而增加mRNA稳定性和改变蛋白质表达(Vickers等 2001年)。用这样的方法，反义序列可用于增加mRNA的丰度。也能 够通过反义寡核苷酸靶向结合到至关紧要的翻译启始位点，在此情况 下mRNA丰度增加但蛋白质水平下降。
NOI通常可受一种启动子或一种启动子和增强子表达调节元件的 表达控制。增强子和/或者启动子在缺氧或者缺血或者低糖环境可以 优选活化；于是NOI在诸如肿瘤、风湿性关节或者其他缺血部位的特 定靶组织中优选表达。因此，可以减少或者去除NOI对接受治疗的患 者的重要生物作用或者有害作用。赋与调节作用的的增强子元件或者 其它元件可以存在多个拷贝。同样或除此之外，增强子和/或者启动 子可以优选激活一种或多种特异的细胞种类——例如巨噬细胞、内皮 细胞或者这两种细胞中的一种或多种细胞。更多的例子包括呼吸道上 皮细胞、肝细胞、肌细胞、心肌细胞、滑膜细胞、乳腺上皮细胞和诸 如巨噬细胞和神经元的有丝分裂后末期分化的非复制细胞。
“可操纵性连接”意思是所描述的成分以其预期的方式在一定的 相互关系中行使功能。一个文库中所包含的一种调节序列通过“可操 纵性连接”与一种报道序列连接，在与对照序列相同的条件下核酸报 道序列得以表达。
“启动子”使用了该领域的标准含义。举例来说，即是Jacob- Monod基因表达理论中的RNA聚合酶结合位点。
“增强子”是指除转录起始复合物之外的其它蛋白组分所结合的 一个DNA序列，可促进其相关的启动子控制的起始转录。
在原代靶细胞中，在生成二级运输系统的条件下，编码二级传输 系统之翻译单位的启动子和增强子组成的转录单元优选具有强活性， 或者能够强诱导。启动子和/或者增强子活性可以组成性生效，或者 受组织特异性限制或者时间限制。举例来说，时间限制性的启动子/ 增强子是那些缺血和/或者缺氧反应的应答元件，诸如缺氧应答元件 或者grp78或grp94基因的启动子或者增强子。一种优选使用的启动子- 增强子组合是人巨细胞病毒(hCMV)主要立即早期(MIE)启动子/增 强子组合。
在一优选的实施方案中，诸如CMV的强组成启动子或者诸如PGK 的管家基因启动子和Tet-调节系统的组合使用可用于控制基因表达。 除了Tet系统以外，其它的可诱导系统包括金属硫蛋白、hsp68、lacZ、 SV40 T抗原系统。
可通过两个转基因系使用反式活化因子，一个是在启动子“a” 控制下表达NOI的转基因系，另一个是表达启动子“a”的反式作用 因子“b”的转基因系。
在另一个实施方案中，所使用的是FLP重组酶系统。在组合的情 况下，无活性的转基因通过酵母FLP重组酶介导转变为活性形式。在 本方案中也可以使用噬菌体Pl Cre重组酶系统，该系统能使基因在特 定的细胞或者组织和在生物发育的特定阶段沉默。
应用诸如β-肌动蛋白、鼠金属硫蛋白、HMGCR和组蛋白H4管 家基因的启动子可以获得通用的表达系统。
本发明的优选启动子是组织特异性启动子。即它们能控制NOI在 一种组织中转录而在其它组织中很大程度上保持“沉默”。
“组织特异性”指的是一种启动子，其活性并不仅限于单一的组 织类型，而是表现出选择性，即在一些组织中活化、其他一些组织中 活化较低或沉默的。
由特定的启动子控制的NOI表达水平可以通过操纵启动子区域来 调节。举例来说，启动子区域内的不同结构具有不同的基因调节活性。 这些不同区域的活性可用含有不同突变体的载体构建体有代表性地评 估，而这些突变体则含有缺失特定区域的启动子(即缺失分析)。举 例来说，该方法可用于鉴定组成启动子组织特异性的最小区域。
在本发明的实际应用中，以上所述的许多组织特异性启动子非常 有用。在多数实例中，这些启动子可易于酶解为适于克隆到侯选载体 中的限制性内切酶消化片段。可替代的方法是利用聚合酶链反应扩增 得到启动子片段。通过在引物5’端引入限制酶切位点是扩增片段易于 克隆。
适于心脏特异性表达的启动子包括衍生于鼠心脏α-肌球蛋白重 链(MHC)基因的启动子。适于血管内皮细胞特异性启动子包括Et-1启 动子和von Willebrand因子启动子。
适于前列腺特异性表达的启动子包括腺血管舒缓素-1(hklk2) 基因和前列腺特异性抗原(hklk3)的5’旁侧序列。
细胞特异性的启动子/增强子的例子包括诸如CSF-1启动子-增强子 的巨噬细胞特异性启动子或者增强子或者衍生于甘露糖受体基因启动 子-增强子的元件(Rouleux等1994 Exp Cell Res 214：113-119)。在 可替代的方法中，可使用优选在中性粒细胞中活化的启动子或者增强 子元件，或者一种诸如IL-2基因增强子的淋巴特异性增强子。
此外，NOI可利用一个或多个具有发育调节表达作用的序列控 制。NOIs可在转基因生物体或其后代的发育过程中的一个特定阶段 激活。
适应酶可以调节NOI转录。NOI和适应酶的连接可以激活转录本 的剪切，从剪切的转录本中释放NOI使其得以表达。在一个优选的实 施方案中，从包含siRNA、短发卡RNA、微RNA和反义RNA的群体中 选择NOI。举例来说，在短发卡编码的siRNA 5’引入适应酶能够控制 转录本自身剪切的诱导(或抑制)，短发卡能与适应酶结构分离，由 此而激活沉默。适应体(aptamer)的特异性配体可以体外提供、体内表 达或者从同一个载体表达获得。举例来说，一种表达受缺氧反应元件 (HRE)控制表达的蛋白质配体仅在缺氧条件下才合成，如果这能激 活适应酶的剪切反应，释放一个靶向结合血管内皮细胞生长因子 (VEGF)的短发卡结构，那么VEGF的表达在缺氧条件将被特异性 地下调。这将有助于治疗包括增殖性糖尿病性视网膜炎在内的一系列 疾病。在可替代的方法中，适应体的配体可以是VEGF本身。
在本发明的另一个方面中，适应酶诱导的剪切可以直接调节一种 NOI的表达。根据本发明，适应酶的使用包含了NOI的转录后调节。 通过增加或者消除能诱导转录本剪切的合适配体，适应酶可以被激活 (或者抑制)，因此NOI的表达受抑制。举例来说，适应酶可以在转 录本中编码甲硫氨酸的密码子处剪切，或者剪切转录本的UTR，这导 致转录本缺乏cap和/或者多聚腺嘌呤尾，随后转录本在翻译前将被降 解。
如果诸如因子IX之类的治疗基因水平太高，这提供了一种阻断 NOI合成的方法。转基因的表达可用这样的方式进行工程化的自身调 节。举例来说，可以设计成适应酶的活性是受葡萄糖结合的调节，因 此仅当高血糖水平时才可能高水平表达胰岛素。如果血糖水平下降 到临界值，随后适应酶被活化，胰岛素转基因转录本降解。一种受强 力霉素调节的适应酶可通过给予强力霉素调节NOIs体内和体外的表 达。
Tet调节系统可以用于控制适应酶的表达，提供更水平的控制。 当强力霉素消除时，在Tet抑制蛋白存在的条件下Tet操纵子序列插入 到启动子的下游可抑制转录，从而抑制重新转录。因为在强力霉素消 除时适应酶是活化的，任何存在的转录本将被剪切和破坏。
转基因敲除小鼠技术的发展极其有助于基因功能的研究，这和基 因疾病的哺乳动物模型有着特殊的相关性。然而，当前的技术限制于 某些病例。举例来说，具有重要医学的许多基因是生存所必需的。在 这样的病例中，小生命在胚胎发育过程中或者出生后死亡。本发明提 供了敲除调节性基因的有效的转基因方法，目的蛋白的产生可以是生 命体停止在特定的发育阶段，促进了成年哺乳动物疾病模型的建立。 然后转基因生物能够利用一种或者多种表型进行筛选。常用的表型筛 选方法包括眼底照相术、血压、行为分析、X射线荧光镜透视检查、 双能量X射线吸收比色法(DEXA)、CAT扫描、全血计数(CBC)、 尿液分析、血压化学、胰岛素水平、葡萄糖耐受量、荧光活化细胞分 选(FACS)、组织病理学、表达数据和发育生物学。本发明的方法 在时序基因调节有益的许多领域以及验证基因组计划中的假定药物靶 点方面将有着广泛的应用。
本发明可以用于调节和人类疾病相关的基因表达。一个并非穷举 的基因列表如下所示(包括基因的同源物)：
和癌症相关的基因包括但不仅限于Cdh3、Ncam、Akp2、Asgr2、 Bax、Bmp4、Ccnd1、Cd38、Cdc37、Cdkn1a、Cdkn1b、Cdkn1c、Csk、 Epas1、Fgf2、Grpr、HBV、Igf1、Inhbb、Inpp5d、IRS1、Itga5、Kcna1、 lacZ、Map2k4、Mdm2、Njkbia、Ngfb、Oxt、Pemt、Plp、Shh、Src、 Stat5a、Tcfap2a、Trp53、Blmh、Cd152、Cmkar2、Cmkbr5、Csf1、 Csf3、Egfr、Gzmb、Ifng、Ifngr、IGFBP3、Il1r1、Il1rap、Il2、Il2ra、 Il2rb、Il2rg、Il4、Il4ra、Il5、Il6、Il7r、Il10、Il12a、Il12b、Il12rb1、 Il12rb2、IRS1、Kdr、Lifr、Lta、Ncam、Ntf3、Ntf5、Ntrk1、Ntrk2、 Ntrk3、Ph、Prlr、Scya3、Smst、Tgfa、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Tnf、 Tnfrsf1a、Tnfrsf1b、Tnfrsf5、Apc、Prkdc、TAg、Amh、Kit、Kit1、 Ter、Fech、hr、Atm、E2f1、Hoxl1、Apc、Cdh3、Erbb2、Hras、Met、 Notch4、PIP、PyVT、Tag、Wnt1、Madh3、Nf1、Ptch、Rb1、Odc、 Bcl3、Fos、Fyn、Jun、Kras2、luc、Mos、Myc、Rab3a、Rela、Yes、 Cd44、Mgmt、Plg、Ahr、Pgy2、Rag1、Btk、Igh-6、Jak3、Tcra、Tcrb、 Tcrd、Ttp53、Ttpa、Vhlh和Wt1。
和糖尿病、肥胖症相关的基因包括但不仅限于Ins2、Ins1、H2-Ea、 H2-Ab1、Ifng、Prkdc、B2m、Rag1、Lep、Lepr、Cpe、Gck、Irs1、Irs2、 Irs3、Irs4、Slc2a1、Cre、Dgat、tub、Pcsk2、Insr、Nos1、Nos3、Tnf、 B2m、Thy1、Pomc、Ppara和Csf2。
和心血管系统疾病相关的基因包括但不仅限于Acact、Alox15、 Apoa2、Apob、Apoe、Ath1r、Cdkn1a、Cyp7a1、Epas1、Lcat、Ld1r、 Pemt、Soat1、fld、hr、Ace、Adra1b、Adrb2、Adrbk1、Anx6、Atp7a、 Cdh2、Evi1、Fn1、Gja1、Itga4、Jup、Kif3a，Nf1，Nos3，Nppa，Thra，Vcam1， Wt1，Agt，Bdkrb2，Bmp4，Drd3，Kcna1，Npr3，Ren，Apoc1，Apoc2，Apoc3， Apoa1，Cetp，Hp1，Lipc，Srb1，Adra2a，Agtr1a，Fgf2，Tnf，Asgr2，Lrpap1， Vld1r，Col3a1和Plg。
和内分泌系统疾病相关的基因包括但不仅限于Cpe、fld、Insr、 Lep、Lepr、tub、Acact、acd、Cacnb4、Crh、Foxn1、gl、Bmp4、Csf1、 dwg、fsn、Hcph、Kit、Kit1、Mitf、oc、Phex、Prlr、Sparc、Grpr、 Amh、Ar、Cga、Fshb、jsd、Ghrhr、Hmgic、Myo5a、Nr5a1、Oxt、 p、Pit1、Prop1、Smst、Agt、Igf1、Gck、Pcsk2、Egfr、Foxn1、Mc1r、 Tgfa、Thrb、Tshr和Ttr。
和凋亡相关的基因包括但不仅限于Fas、Ngfr、Tnfrsf1a、Tnfrsf1b、 Bax、Bcl2、E2f1、Mdm2、Pcc、Rb1、Trp53、Bdnf、Fas1、Gzmb、 Ntf3、Nt5、Pfp、Tag和Tnf。
和免疫、炎症相关的基因包括但不仅限于Cd1、Cd3e、Cd3z、Cd4、 Cd44、Cd5、Cd8a、Cd8b、Cd14、Cd152、Cd28、Cd38、Fcer1g、Fcgr2a、 Fcgr2b、Fcgr3、Gpi1、H2-Aa、H2-DMa、H2-Eb1、H2-Eb2、H2、Hc、 Icam1、Igh-1、Igh-5、Igh、Igk-C、Igl-1、Igl-5、Itga4、Itga5、Itgb2、 Itgp、Lyst、Mar1、Ncam、PCC、Pep3、Ptprc、Ptprcap、PVR、Sele、 Sell、Selp、Spn、Tapbh、Tcra、Tcrb、Tcrd、Thy1、Tlx1、Tnfrsf5、 Tnfrsf6、Tnfsf5、Bmp4、Cmkar2、Cmkbr5、Csf1、Csf3、Egfr、Gzmb、 Ifng、Ifngr、Il1r1、Il1rap、Il2、Il2ra、Il2rb、Il2rg、Il4、Il4ra、Il5、 Il6、Il7r、Il10、Il12a、Il12b、Il12rb1、Il12rb2、Il15ra、Irs1、Itgb7、 Kdr、Kitl、Lifr、Lta、Map2k4、Ntf3、Ntf5、Ntrk1、Ntrk3、Ph、Scya3、 Smst、Tgfa、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Tnf、Tnfrsf1a、Tnfrsf1b、A、 Atm、C3、C4、Cacnb4、Cd80、Cd86、Dh、Dsg3、Eef1a2、gl、hr、 Lama2、Lbp、Lep、Lepr、Mitf、Pit1、Prop1、Scn8a、Abcb2、Ada、 B2m、Bcl2、Bcl3、Btk、C2ta、Foxn1、H2-Ab1、Hcph、Igh-6、Igh- J、Ii、Jak3、Kit、Lck、Ltb、Lyn、Njkb1、Nfkbia、Pfp、Pnlliprp2、 Prkdc、Ptprcap、Rag1、Relb、Stat4、Stat6、Tlr4、Alox5、Alox5ap、 Alox15、Bdkrb2、Blmh、Bmp6、Cmo、Crh、Nos2、Ptgs2、Vr1、Bax、 E2f1、Inpp5d、Rb1、Stat5a、Trp53、Fyn和Irf1。
和神经生物学相关的基因包括但不仅限于Apoe、Atm、Bdnf、 Cdk5、Chrna7、Cmkar4、Cstb、Gad2、Gfap、Gria2、Grik2、HD、 Hdh、Nos1、Ntf3、Penk-rs、Prkcc、Psen1、Snca、Tnf和Vr1。
除了已描述的治疗基因或者基因和表达调节元件之外，传输系统 可以包括其它的有效遗传元件或者基因的表达调节或者含有启动子/ 增强子、翻译起始信号、内部核糖体进入位点(IRES)、剪切和多 聚腺苷酸化作用信号的基因。可通过结合诸如WPRE的元件来提高表 达水平。
根据本发明，通过运输系统运输的一个或者多个或者更多的治疗 基因可以单独使用，也可以结合其他治疗或者其他治疗成分共同使 用。在进一步优选的实施方案中，本发明第一个方面是一个或者多个 靶核苷酸序列(NOI)导入到载体的克隆位点。这样的治疗基因可以 由逆转录病毒LTR中的启动子启始表达，或者由导入克隆位点靶基因 内在的启动子启始表达。
举例来说，本发明的运输系统可以用于传输一个或者多个NOI (s)，有助于治疗在WO98/05635中列出的疾病。为了便于参考，现 在提供部分列表：癌症、炎症或炎症疾病、皮肤疾病、发烧、心血管 效应、出血、凝固和急性阶段反应、恶病质、厌食症、急性感染、HIV 感染、休克、移植排斥反应、自身免疫疾病、再灌注损伤、脑膜炎、 偏头痛、阿司匹林依赖性抗血栓，肿瘤生长、侵袭和扩散、血管再生、 转移、恶化、腹水和恶性胸膜渗出；大脑缺血、缺血性心脏病、骨关 节炎、风湿性关节炎、骨质疏松、哮喘、多发性硬化症、神经退变 (neurodegenration)、老年痴呆、动脉粥样硬化、中风、脉管炎、克罗 恩氏病和溃疡性结肠炎；牙周炎、牙龈炎；牛皮癣、过敏性皮炎、慢 性溃疡、大疱性表皮松解症；角膜溃疡、视网膜病和外科伤口愈合； 鼻炎、过敏性结膜炎、湿疹、过敏反应；再狭窄、充血性心力衰竭、 子宫内膜异位、动脉粥样硬化或内膜硬化。
除此之外还有，或者作为一个替代方案，本发明的运输系统可以 用于传输一个或者多个NOI(s)，有助于治疗在WO98/07859中列出 的疾病。为了便于参考，现在提供部分列表：细胞因子和细胞增值/ 分化活性；免疫抑制剂或者免疫活化(举例来说，治疗免疫缺陷包括 HIV病毒的感染；淋巴细胞生长的调节；治疗癌症和许多自身免疫疾 病，以及抑制移植排斥或者诱导肿瘤免疫)；造血作用调节，举例来 说，骨髓疾病的治疗或者淋巴疾病的治疗；促进骨、软骨、跟腱、韧 带和神经组织的生长，举例来说，用于治愈创伤、治疗烧伤、溃疡和 牙周疾病和神经退变；卵泡刺激激素的抑制或者活化(受精能力调 节)；趋化性/趋化动力学(chemotactic/chemokinetic)(举例来说，动 员特异性细胞迁移到受损伤或者感染部位)；止血和溶解血栓的活性 (举例来说，用于治疗血友病和中风)；抗炎活性(举例来说，用于 治疗败血病休克或者克罗恩氏病)；用作抗菌剂；诸如新陈代谢或者 行为的调节子；用作止痛剂；治疗特异性缺陷疾病；用于牛皮癣治疗， 用作人类或者兽医的药。
除此之外还有，或者作为一个替代方案，本发明的运输系统可以 用于传输一个或者多个NOI(s)，有助于治疗在WO98/09985中列出 的疾病。为了便于参考，现在提供部分列表：巨噬细胞抑制的和/或 者T细胞抑制的活性和抗炎活性；抗免疫活性，举例来说，对细胞和/ 或者体液免疫应答的抑制效应，包括和炎症无关的应答；抑制巨噬细 胞活性和T细胞黏附于细胞外基质成分和连接蛋白，以及上调T细胞 的fas受体表达；抑制有害的免疫反应和包括风湿性关节炎在内的关 节炎炎症、与超敏性相关的炎症、过敏反应、哮喘、系统性红斑狼疮、 胶原疾病和其他自身免疫疾病、与动脉粥样硬化相关的炎症、动脉 粥样硬化、动脉粥样硬化性的心脏病、再灌注损伤、心搏停止、心肌 梗塞、血管炎症疾病、呼吸道窘迫综合症或者其它与心肺有关的疾病、 和消化性溃疡相关的炎症、溃疡性结肠炎和其他胃肠道疾病、肝纤维 化、肝硬化或者其他肝脏疾病、甲状腺炎或者其他腺体疾病、肾小球 肾炎或者其他肾和泌尿疾病、耳炎或者其他耳鼻咽喉疾病、皮炎或者 其他皮肤病、牙周疾病或者其他牙病、睾丸炎或者其他附睾炎、不育、 orchidal trauma或者其他免疫相关testicular疾病、胎盘功能障碍、胎 盘功能不全、习惯性流产、惊厥、预惊厥和其他免疫和/或炎症相关 妇科疾病、后眼色素层炎、中眼色素层炎、前眼色素层炎、结膜炎、 脉络膜视网膜炎、眼色素层巩膜炎、视神经炎、诸如视网膜炎或者囊 样斑疹水肿的眼球内炎症、交感神经性眼炎、巩膜炎、色素性视网膜 炎，变质样干酪疾病(degenerative fondus)的炎症成分、眼部创伤的炎 症成分、感染引起的眼部炎症、增值性玻璃体-视网膜病变、急性缺 血视神经障碍、诸如青光眼过滤手术后的过度结疤、眼部移植的免疫 和/或者炎症反应和其它免疫和炎症相关眼部疾病、自身免疫相关的 炎症或者病症或者中枢神经系统(CNS)或者其他器官的紊乱、免疫 和/或者有益的炎症抑制、帕金森症、并发症和/或者治疗帕金森病的 不良反应、AIDS-相关痴呆复合症、HIV-相关的脑病、Devic病、 sydenham舞蹈病、Alzheimer病和其他退行性疾病、中枢神经系统的 病症或紊乱、stokes的炎症成分、小儿麻痹后(post-polio)综合症、精 神紊乱的免疫和炎症成分、脊髓炎、脑炎、亚急性致硬化脑炎、脑脊 髓炎、急性神经病、亚急性神经病、慢性神经病、Guillaim-Barre综 合症、sydenham舞蹈病、重症肌无力、大脑假性肿瘤、唐氏综合征、 huntington病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、中枢神经系统压迫或中枢神 经系统创伤或中枢神经系统感染产生的炎症成分、肌萎缩和营养不良 产生的炎症成分以及相关疾病的炎症和免疫、中枢和周围神经系统的 病症或紊乱、创伤后炎症、败血病休克、感染性疾病、外科炎症并发 症或者副作用、骨髓移植或者其他移植并发症和/或副作用、诸如病 毒载体引起基因治疗的炎症和/或免疫并发症和副作用，或者AIDS相 关的炎症，限制或抑制体液和/或者细胞免疫应答，通过降低单核细 胞和淋巴细胞数治疗或改善单核细胞或诸如白血病的白细胞增值病， 预防和/或者治疗在自身或者人造的细胞、组织和器官移植病例中的 移植排斥，这些细胞、组织和器官包括角膜、骨髓、器官、晶体、心 脏起搏器、自身的或者人造的皮肤组织。
本发明的方法所治疗的对象可以是动物受试者。优选的受试者是 哺乳动物，更优选是人。
本发明也提供了一种利用基因疗法治疗患者的药物组合物。本发 明中的这些组合物包括一种有治疗效应的的运输系统，同时可选择性 地包括一种或者多种可以运输的治疗性的和/或者诊断性的NOI(s)。 因为运输系统是一种病毒运送系统，可用一种替代的方法，包括一种 由产生的或同种方式获得的病毒颗粒。药物组合物可用于人或动物。 通常，内科医生将要特地确定适合于每个病人的有效剂量，有效剂量 将随年龄、重量、和特殊个体而改变。
这些组合物可选择性地包括制药上允许的的载体、稀释剂、赋形 剂或者佐剂。可根据给药的具体途径和标准的制药准则选择制药载 体、赋形剂或者稀释剂。药物组合物可以包括载体，或除了载体之外 还可以包括赋形剂或者稀释剂、任何合适的粘合剂、滑润剂、悬浮剂、 包衣成分、增溶剂和其他可帮助或者促进病毒进入靶位点的载体成 分，以上成分可帮助或者促进病毒进入靶位点(如脂质体转染系统)。
根据给药部位，利用一种或多种给药方式施用药物组合物：吸入、 以栓剂或者子宫托的形式、局部性地用药以洗液、溶液、乳剂、软膏 或者扑粉的形式、依靠皮肤贴片(skin patch)、口腔给药以含有诸如淀 粉或者乳糖的赋形剂的片剂形式、或者仅以胶囊或胚珠的形式或者胶 囊或胚珠和赋形剂混合、或者以酏剂(elixirs)、溶液或者含有香味或 色素成分的悬浮液的形式给药，或者可通过诸如腔内 (intracavernosally)、静脉、肌内或者皮下注射给药。对于胃肠道以外 给药，这些成分最好使用包括其它成分的无菌水溶液形式，举例来说， 足够的盐或者单糖能保持溶液和血液等渗。对于口腔或者舌下给药， 这些成分可以片剂或者锭剂(lozenges)的方式给药，锭剂可用常规方 式配制。
根据本发明，通过运输系统运送一个或者多个治疗基因可单独使 用或者与其它治疗或者其它治疗成分组合使用。
本发明中的非灵长类慢病毒载体颗粒是在合适的生产细胞中产生 的。生产细胞通常是哺乳动物细胞，但也可以是昆虫细胞。一种生产 细胞可以是含有病毒结构基因并整合进入其基因组的包装细胞。然 后，编码载体基因组的核苷酸转染包装细胞，从而产生感染性的、复 制缺陷载体的病毒颗粒。作为可替代方案，编码载体基因组和结构成 分的核苷酸序列可共转染生产细胞，和/或者利用一个或多个存在于 诸如质粒、腺病毒载体、疱疹病毒载体上的核苷酸序列可以共转染生 产细胞，或者用已知的方法运送功能DNA进入靶细胞。
本发明的载体，举例来说，本发明中第一方面的慢病毒载体可以 用来运输NOI进入任意的产前细胞(prenatal)。“产前”是指发生或者 出现在出生之前。在一个实施方案中，这个方法用于胚胎期的细胞。 胚胎包括在出生(或者孵化)前早期发育阶段的动物。此处所使用的 术语包括“前胚胎”，也就是卵子受精后、胚胎组织分化前形成的结 构，这包括受精卵和原始胚期。“胚胎”也包括胎儿细胞，也就是位 于发育后期的胚胎细胞。本发明也包含基因转导进入到一种围产期细 胞。“围产期”指的是产前3个月产后大约1个月这一段时间，同时也 包括新生儿阶段。“新生儿”指的是出生后的最初几周。
本发明的一般性载体，举例来说，本发明中第一方面的慢病毒载 体可用于运输NOI进入任意的生殖细胞，这些生殖细胞包括原始生殖 细胞或者能引起生殖细胞系改变的细胞。“生殖细胞”是多细胞生物 体的生殖器官中细胞的总称，多细胞生物体可通过减数分裂产生配 子。“配子”指的是单倍体生殖细胞-卵子和精子。然而，如上所示， 本发明也适用于配子发育细胞和诸如卵巢的配子发生部位的细胞。
现在通过实例，结合哺乳动物将讨论配子发生。慢病毒载体可用 于运输NOI进入到下文所讨论结构中的任何细胞。可预见到非哺乳动 物生物体的相同处理也包括在本发明之中。简而言之，配子发生是二 倍体生殖细胞形成配子(定义为单倍体，n)的过程。精子发生是通 过减数分裂(动物体内，植物体内是有丝分裂)在专门的性腺器官中 (雄性为受试者)形成精细胞的过程，分裂后的细胞经过分化成为精 细胞。卵子发生是通过减数分裂(动物体内，植物配偶体内是有丝分 裂)在专门的卵巢性腺中形成卵子的过程。
在精子发生过程中，精子由雄性生殖细胞精原细胞形成，精原细 胞位于睾丸的生精小管内膜。一个精原细胞通过有丝分裂形成原始精 母细胞，原始精母细胞经过减数分裂的初级分裂形成两个次级精母细 胞。每个次级精母细胞经过第二次有丝分裂形成两个精细胞，精细胞 成熟成为精子。睾丸由很多的生精小管构成，精子发生在生精小管壁 中进行。原始生殖细胞在位于生精小管外部的生殖上皮中生成，当细 胞分化产生子细胞后移行进入小管管腔。所有的这些细胞由邻近的滋 养细胞提供营养和支持。
在卵子发生过程中，卵原细胞分化形成初级卵母细胞，然后经过 第一次减数分裂形成极体和次级卵母细胞。次级卵母细胞成熟后，次 级卵母细胞经过第二次减数分裂形成成熟卵子和二级极体。卵巢含有 许多滤泡，外层的卵泡细胞围绕正在发育的卵细胞形成滤泡。排卵后 卵子移行沿输卵管进入子宫。
可预见到载体可在一个位置施用，但是NOI可能在生物体的其它 细胞中表达或者发挥作用，也就是说给药的位点可以不同于靶细胞。 非灵长类慢病毒载体可以转导的细胞包括上文所列的靶细胞例子。
更优选的是，细胞处于胚胎期，举例来说，位于子宫的细胞，慢 病毒载体可通过脐带、胎盘或者羊水，或者通过腹膜内、肝内途径施 用。慢病毒载体可借助超声波导入。
在本领域中人们熟知的转基因动物是利用ES细胞和其它细胞产生 的，举例来说，以下文献描述了产生转基因动物的方法：鼠胚胎操作， 第二版B.Hogan，R.Beddington，F.Costantini和E.Lacy冷泉港实验 室出版社1994年；转基因动物技术C.Pinkert学术出版社1994； 基因靶向：一种实用的方法A.L.Joyner.牛津大学出版社1995；转 基因动物科学的策略G.M.Monastersky和J.M.Robl.ASM出版社 1995；和小鼠遗传学：理论和应用Lee M.Silver牛津大学出版社 1995。关于这个主题的一本有用的常用参考书是Houdebine转基因动 物-生产和使用(哈佛，1997)——全面地篇综述了从鱼到小鼠和牛 产生转基因动物所应用的技术。
因此，举例来说，本发明准许利用慢病毒侵染使异种DNA导入哺 乳动物的受精卵。在一个实施方案中，从捐赠母亲体内收集处于单细 胞期的受精卵，被转导的细胞转移到代孕母亲体内。在单细胞期发生 整合才产生真正的转基因生物，也就是说，包括生殖细胞都发生了转 基因。如果在后期发生整合，则产生嵌合体。在一高度优选的方法中， 用含目的DNA的慢病毒载体转染发育的胚胎，被转染的胚胎产生了 转基因动物。传统的转基因方法需要在体外转染胚胎细胞，然后再植 入子宫。本发明的一个重要的优点是NOI能导入子宫(utero)。另一 个方法是用慢病毒感染导入一种核酸进入前核阶段的卵子用来产生转 基因动物。然后，被转导的卵子在植入假孕受体的输卵管之前进行培 养。
作为一个明确的实施例，一个建立诸如牛的转基因哺乳动物，包 含编码治疗蛋白序列的核酸构建体通过本发明的方法导入到卵母细 胞，卵母细胞是从新鲜的哺乳动物卵巢中分离获得。卵母细胞从滤泡 吸入，在与解冻的冻存精子受精之前停留在滤泡中，而解冻的精子必 须和肝素(heparin)结合而活化，可通过Percoll剃度分离具有活力的精 子部分。
举例来说，受精的卵母细胞在15,000g离心8分钟，观察生殖核并 用于注射，然后用输卵管组织-条件培养基培养使受精卵进入到桑椹 胚或胚泡。这种培养基是由输卵管刮掉的管腔(luminal)组织制备 的，在培养受精卵时需要进一步稀释。在微注射后，受精卵必须在培 养基中放置2小时。
然后，诸如牛待孕受试哺乳动物通过施用甾醇使其同时处于发情 期(Oestrous)。哺乳动物在2天内进入发情期，而胚胎在受试动物 动情期5～7天后转移。成功的转移可通过Southern杂交对转基因动物 后代评估。
作为可替代方案，预想的构建体能导入胚胎干细胞(ES细胞)， 培养胚胎干细胞并确保证被转基因变异。变异的细胞注射到囊胚，囊 胚再植入假孕宿主。由此生成的后代是包括ES细胞和宿主细胞的嵌 合体(chimetic)，而仅包含ES后代的非嵌合体细胞株可以通过常规 的交叉杂交方法获得。举例来说，这种技术已在WO91/10741中被描 述。
包含转基因序列的动物可依据标准的PCR或者Southern杂交方法 进行分析检测。如果有必要，生物体可以繁殖而获得纯合体。
本发明可用于产生转基因生物，在上文中已涉及到在基因治疗和 疾病模型建立方面的应用。在具体实施例中，疾病模型便于进行基因 功能的实验研究。通常情况下，表达新基因或带有异源启动子基因的 转基因生物表现为“功能获得”突变。基因缺失突变可通过基因打 靶获得，即所谓的“基因敲除”生物。转基因生物体也用于研究基因 控制区域和基因表达形式。转基因生物也可利用插入突变、基因俘获 (gene traps)和启动子俘获(promoter traps)等方法鉴定新基因。转基因 动物在农业中也有应用，举例来说，通过遗传改造提高牛奶产量、增 加体重、增加牛奶营养成分，提高疾病免疫能力等。转基因动物也用 作所谓的“制药农场”(pharmaceutical farming)，即是指转基因家畜 用来生产治疗性蛋白质。
作为一个实施例，SMN的调节性缺失(纯合子缺失导致出生前死 亡)可提供一个用于基因治疗研究的脊柱肌肉萎缩模型。一个CFTR 缺陷模型也是一种有用的模型。其它假定的候选基因包括：早老因子 -1、RARα、脑源性神经营养因子(BDNF)、血管内皮生长因子(VEGF) 和表皮生长因子受体(EGFR)。
可利用诸如组织分析和微矩阵基因表达谱(profiling)的标准技术进 行转基因结果的表型分析。
根据本发明优选的特征，一个优选的EIAV慢病毒载体用于产生 转基因小鸡，在其卵中产生治疗或诊断性蛋白。
利用慢病毒载体能产生转基因鸟类，经多代繁殖的众多转基因鸟 类个体都能使目的基因正常表达，利用某些逆转录病毒载体进行观察 没有发现外源基因沉默。举例来说，Mizuarai等(2001)(Biochemical and Biophysics Research Communications 286：456-463)观察到在转基因鹌 鹑中，基于MLV载体的LTR不能启始基因表达，同时鸟类自身的劳 氏肉瘤病毒(RSV)启动子能启始靶基因在G0、G1、G2期表达。
慢病毒载体编码治疗性蛋白或者诊断性蛋白，举例来说，含有一 种抗体或者一种抗体的片段的慢病毒载体可用于产生转基因小鸡。通 过工程改造后，抗体可以含有来自多个种类动物的结构域，或者含有 结合不同靶分子的结构域。编码靶基因的核苷酸序列可改变并增加 RNA的稳定性或者RNA转录水平，而不改变目的蛋白的氨基酸序列。
治疗/诊断基因可由一个组成性启动子或者一个具有组织特异性 启动子启动表达。举例来说，靶蛋白的表达可以限定在生殖结构(包 括输卵管或者生殖道)，通过这种方式，导致在卵中含有表达的靶蛋 白。在蛋清中存在卵清蛋白、溶菌酶、伴清蛋白和卵类粘蛋白等蛋白， 编码这些蛋白的基因的启动子或者启动子的元件可以使用。这些基因 的表达受甾体激素的调节，但是有证据表明其它细胞特异性转录因子 参与卵清蛋白和伴清蛋白启动子的表达调节(Dierich等，EMBOJ，1987 6(8)：2305-12)。已经证明卵白蛋白基因启动子在转录位点上游- 3200和-2800bp之间存在组织特异性沉默元件(Muramatsu等Mol Cell Biochem 1998 185：(1-2)：27-32)，而一种沉默元件位于从溶菌酶转 录位点上游的-2400bp处(Bonifer等J Biol Chem 1997 272(42)：26075- 8综述)。然而，Dierich等(1987)在-1348和-1的截短卵白蛋白中获 得了一定程度的细胞特异性。在原代培养的小鸡输卵管管腺细胞中对 于从-425延伸到-1的截短卵白蛋白来说，观察到了某种程度上的类固 醇调节作用(Dierich等1987)。
编码治疗/诊断性蛋白质的慢病毒载体通过注射的方法用来转导 新生卵的处于囊胚期胚胎的细胞。作为替换方案，使用诸如 WO90/13626中所述或者类似的已发表技术之类的技术，使用慢病毒 载体转导较早期胚胎。
简而言之，可以通过手工操作的方法或者通过诱导早产的方法来 获得子宫胚胎。胚胎用慢病毒载体转染，然后培养至成熟。这使胚胎 细胞在存在的细胞数量相对较低的时候得以转导，增加产生的转基因 鸡的数量，其中转基因存在于胚系中并可遗传。
本发明还涉及到RNAi的使用以增加来自于转基因鸟类的蛋白质 产量。
为了最大限度的增加目的蛋白的表达，如实施例8所描述，RNAi 可以被用作降低蛋中正常情况下存在的富含蛋白的比例，如卵白蛋 白、溶菌酶、伴清蛋白和类卵粘蛋白的比例。下调这些蛋白的产量可 以导致相伴的目的蛋白比例增加，产量提高。
这可以通过表达siRNAs或者短发卡前体，靶向所需的EIAV载体 mRNA来实现这一点。该载体可以包括siRNAs，siRNAs靶向mRNA中 一个或多个位点上的一个或多个mRNAs。
诸如卵白蛋白的蛋白质的有效靶向导致产生不具有繁殖能力的卵 子。因此可以鉴定转基因公鸡，并且将之和具有包含目的转基因的载 体的转基因母鸡交配，以获得具有两种性状的雌性后代，用作蛋白质 生产的生物反应器。siRNAs的调节(如实施例10中所述)也可以是 另外的方式：当卵子是用作蛋白质生产而非繁殖时，在产卵母鸡中诱 导基因沉默。这也可以克服整个生物体中靶基因表达下调所致的任何 可能有害作用。
现在，参照下面的非限制性实施例通过举例的方式来描述本发 明。
实施例1-围产期动物的EIAV转导
载体的制备
如前所述通过瞬时共转染293T人胚肾细胞来制备载体 (Mitrophanous等1999)。该EIAV载体基因组SMART2Z从一个内部 CMV启动子处表达β-半乳糖苷酶受体。它包含EIAV中心多嘌呤序列 (cPPT)(Stetor等1999)和土拨鼠肝炎转录后调节元件(WPRE) (Donelle等，1998)。
载体的施用
通过胎儿血管内注射施用载体，具体如下：异氟烷麻醉下，在腹 部中线切开以暴露怀孕16天的妊娠小鼠的子宫。对于每个鼠胎，使用 34号针头(Hamilton)注射载体进入外周卵黄囊血管，载体总体积20 μL，2×107T.U.(转导单位)。每个dam最多注射五个鼠胎。一层一层 缝合封闭打开的腹部，在温暖的笼子中使小鼠恢复。
转基因检测
妊娠18～19天后小鼠出生。异氟烷麻醉后处死各个发育阶段(3， 7，14，28，79天)的小鼠，制作样本用作组织学研究。器官置于100 ％乙醇溶液中2小时后，用X-gel溶液(1mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D- 半乳糖吡喃糖苷溶解于二甲基亚砜，5mM铁氰化钾，5mM亚铁氰化 钾，2mM氯化镁)对载体表达的β-半乳糖苷酶标记基因进行染色。 染色组织用10％甲醛固定2小时、石蜡包被、切片、中性红染色。染 色显示诸如肝脏、肺、心脏、肌肉、肾脏、骨骼肌和脑的一些器官的 转导情况。该结果见图1到11。
观察到：在研究期间表达水平不降低，且转导细胞和无性繁殖期 间。
除了注射进入卵黄囊血管或者脐静脉，也可以直接注射进入循环 系统、CSF其他组织或者羊水。后者对于肺或者皮肤组织的转导非常 适合。
实施例2：血友病
本实施例通过实施例1中的方法进行。血友病是血液疾病，该病 中一种重要的凝血因子部分或者完全缺失，是和X关联的隐形疾病。 有两种血友病，最常见的是血友病A，其中凝血因子VIII缺乏。在血友 病B中，凝血因子IX缺乏。EIAV用作转导VIII和IX进入血友病胎儿的脐 静脉或者肝脏门静脉。
载体的制备
一种载体，例如在我们共同未决的GB0202403.1.1中描述的载体。
具体细节：
pONY 8.4系列载体含有许多修饰，这些修饰使之作为瞬时或者稳 定载体系统发挥作用，这些系统完全独立于附属蛋白，并且对于滴度 没有有害作用。传统的慢病毒载体基因组需要生产细胞(瞬时或者稳 定转染)中存在病毒蛋白rev以获得足够的滴度。这包括目前的HIV 载体系统和更早期的EIAV载体。
和pONY8.1系列载体基因组相比有三种修饰，它们是：
a)所有来自于gag、形成包装信号一部分的ATG基序都被修饰 成为阅读ATTG。这可以插入一个受LTR中启动子驱动的开放阅读 框架。
b)基因组的长度，即R区域间的距离比wt病毒中所观察到的更 近(7.9kb)。
c)3’U3区域得以修饰含有来自于莫洛尼白血病病毒(MLV)U3 区域的序列，因此在转导时除了内部序列盒之外它还能驱动第二个开 放阅读框，在本实施例中，我们使用了MLV，但是可以是任何启动 子。
修饰LTRs的其他细节可以参考我们的WO96/37623和 WO98/17816。
图12是EIAV基因组示意图。可以根据本发明的方法使用这些 进行转染。转染时，3’LTR将被拷贝到5’LTR。图13提供了pONy8.1G 的全部质粒序列。图14提供了pONY8.4ZCG的全部质粒序列。图15 提供了pONY8.4GCZ的全部质粒序列。图16是杂合U3区域的示意 图。图17提供了是杂合LTR的序列。
EIAV/MLV杂合LTR的构建
PCR按照如下所述进行：
产物A＝引物KM001+KM003，pONY8.1Z作为靶分子。
产物B＝引物KM004+KM005，pHIT111作为靶分子。
产物C＝引物KM006+KM002，pONY8.1Z作为靶分子。
PCR产物(A，B和C)通过凝胶纯化。使用产物A和B(使用引 物KM001和KM005)进行PCR反应产生产物D。使用产物B和C (使用引物KM004和KM002)进行PCR反应产生产物E。产物D 和E用凝胶纯化，并用于PCR反应中的靶分子，使用引物KM001 和KM002生成产物F。PCR产物F用凝胶分离纯化(大约1kb)。 然后用Sap I切割并亚克隆进入用Sap I切割的pONY8.1Z，形成图18 和19所示的载体pONY8.1Zhyb。这时EIAV的3’LTR置换成了 EIAV/MLV杂合LTR。该EIAV U3几乎被MLV U3区域所取代。EIAV 的3’LTR的5’U3序列保留，因为该序列包括att位点，该位点是整 合所必需的序列。
引物序列如下：
1EIAV/MLV杂交U3
KM001
CAAAGCATGCCTGCAGGAATTCG
KM002
GAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAG
KM003
GCCAAACCTACAGGTGGGGTC
TTTCATTATAAAACCCCTCATAAAAACCCCACAG
KM004
CTGTGGGGTTTTTATGAGGGGTTTTATAATGAAAGACCCCAC CTGTAGGTTTGGC
KM005
GAAGGGACTCAGACCGCAGAATCTGAGTGCCCCCCGAGTGA GGGGTTGTGGGCTCT
KM006
AGAGCCCACAACCCCTCACTCGGGGG
GCACTCAGATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTC
最终PCR产物序列。
EIAV PPT/U3
CAAAGCATGCCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATA
CCGTCGAATTGGAAGAGCTTTAAATCCTGGCACATCTCATGTAT
CAATGCCTCAGTATGTTTAGAAAAACAAGGGGGGAACTGTGGG
GTTTTTATGAGGGGTTTTATAA
MLV U3
TGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTA
ACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACATAACTGAGAATAG
AGAAGTTCAGATCAAGGTCAGGAACAGATGGAACAGCTGAATA
TGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCT
CAGGGCCAAGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAG
GATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAA
CAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGAG
AACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACC
CTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTG
TTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAAC
CCCTCACTCGGG
MLV U3/EIAV R/U5
GGGCACTCAGATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTCTCTGCTGGGC
TGAAAAGGCCTTTGTAATAAATATAATTCTCTACTCAGTCCCTGT
CTCTAGTTTGTCTGTTCGAGATCCTACAGAGCTCATGCCTTGGCG
TAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTC
ACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAG
CCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTG
CGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCT
GCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGT
ATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTC
血友病A
一种表达因子VIII(野生型全长开放阅读框(ORF)或者截短形式B 结构域缺失的野生ORF或者密码子优化的ORF或者截短形式B结构域 缺失的优化ORF)的EIAV病毒载体(例如以上所描述的载体)按照 实施例1中的方法施用，施用方法包括静脉内或者肝内或者肌肉运送。 使用诸如CMV的适当启动子或者诸如PGK的人启动子/增强子来表达 基因。此外，还可以使用诸如Tet系统的可诱导启动子来调节表达。 作为替换方案，使用组织特异性启动子/增强子使表达局限于细胞型。
血友病B
一种表达因子IX(野生型ORF或者密码子优化的ORF)的EIAV病 毒载体(例如上述载体)按照实施例1中的方法学施用，施用方法包 括静脉内或者肝内或者肌肉途径。使用诸如CMV的适当启动子或者 诸如PGK的人启动子/增强子来表达基因。此外，还可以使用诸如Tet 系统的可诱导启动子来调节表达。作为可替换方案，使用组织特异性 启动子/增强子使表达局限于细胞型。
实施例3：囊性纤维化
本实施例根据实施例1中的方法学进行。囊性纤维化是一种遗传 性隐性疾病，由囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)突变引起。 CFTR是一种蛋白质，在离子转运、粘液流变学、炎症、细菌粘附中 具有作用。EIAV经由羊水转运CFTR从而对肺脏进行转导。
一种表达CFTR(野生型OFF或者一种密码子优化的ORF)的EIAV 病毒载体(例如上述所描写的载体)按照实施例1中的方法学施用， 施用方法包括胃肠道内、肺内或者羊膜内途径。一种合适的启动子诸 如CMV或者人启动子/增强子诸如PGK用来表达基因。此外，还可以 使用诸如Tet系统的可诱导启动子来调节表达。作为可替换方案，使 用组织特异性启动子/增强子使表达局限于细胞型。
实施例4：肌营养不良
本实施例根据实施例1中的方法学进行。Duchenne型肌营养不良 (DMD)是一种致命的和X染色体有关的隐性疾病。DMD是由位于 纹肌肉组织的肌营养不良蛋白水平和/或者活性的遗传缺陷引起。 EIAV用来携带最小的肌营养不良蛋白cDNA(对应于一种轻度的贝克 尔氏肌营养不良(BMD)表型)到perinates的脐静脉和/或者直接进 入胎儿骨骼肌。
一种表达肌营养不良蛋白(野生全长开放阅读框(ORF)或者截 短的的野生ORF或者密码子优化的ORF或者截短的密码子优化的 ORF)的EIAV病毒载体(例如上述所描写的载体)根据实施例1中的 方法施用，施用方法包括进入所有的肌群途径。一种合适的启动子诸 如CMV活或人启动子/增强子诸如PGK用来表达基因。此外，还可以 使用诸如Tet系统的可诱导启动子来调节表达。作为可替换方案，使 用组织特异性启动子/增强子使表达局限于细胞型。
实施例5：核酶
本实施例根据实施例1中的方法学进行。利用EIAV运输一个靶向 黑色素生物合成途径中一个基因的核酶。这个方法便于进行转基因鉴 定。
实施例6：用于帕金森症转基因模型的EIAV的使用
帕金森症(PD)是常见的神经退变性疾病之一，几乎2％的65岁 以上群体受此疾病侵袭。该病具有包括运动僵硬、休息性震颤和 bradykinesia(运动起始和运动迟钝)的运动紊乱-帕金森病-综合症特 征。这是由于黑质神经元丢失引起，黑质神经元产生神经递质多巴胺。 引起PD的病因很大程度上不清楚，尽管极少数家庭的疾病能遗传。 在带有常染色体显性PD的家族中，两种不同的错义突变定位于α- synuclein(Ploymeropoulos等1997，Kruger等1998)，其编码一个 小的磷蛋白，被认为与突触囊泡运输有关。一个在青春期发病的常染 色体隐性幼年期帕金森症(AR-JP)病例中，Kitade等(1998)发现基因 与帕金森症有关，最近提出E3泛素连接酶能催化α-synuclein的泛素 化(Shimura等2001)。因此已经推测α-synuclein降解功能的缺失 导致AR-JP和偶尔发生的PD(Haass和Kahle 2001)。
EIAV载体系统用来运输一个或多个下述核酸序列进入小鼠 spermatogonial干细胞(Nagano等2001)：
1.帕金森症的核酶
2.突变α-synuclein等位基因
3.酪氨酸羟化酶的核酶(多巴胺合成所需酶)
实施例7：血管生成
缺氧诱导因子(HIF)是一种转录复合物，保持氧动态平衡的作 用。在含氧量正常的条件下，由von Hippel-Lindau复合物识别HIF中 羟基化脯氨酸残基，HIFα亚单位降解被降解。因此，蛋白质的稳定 状态水平很低和转录复合物不能形成。一个脯氨酰-4-羟化酶家族已 被描述(Epstein等2001)，其酶活性受缺氧、铁离子螯合和二价钴 离子调节，该酶是实现调节HIF的氧传感器的必要条件。在培养的果 蝇属黑素细胞中，通过RNA干扰抑制脯氨酰-4-羟化酶导致在含氧量 正常的条件下缺氧诱导的基因表达增高。(Bruick和McKnight 2001)。
EIAV载体系统用于运输：
1.脯氨酰-4-羟化酶(或者VHL)的一种核酶。这可以使HIF-1α 亚单位组成性上调、HIF复合物的活化和HIF靶基因的过度表达。
2.组成性活化HIF-1(HIF在含氧量正常的条件下上调)或者PHD3 (HIF在组织缺氧条件下调)。
对于小鼠卵母细胞注射于卵周间隙(Chan等1998：2001)。
在健康相关研究中，转基因鼠模型的建立和应用已被详细描述。 计划研究能够发展更广泛的人类疾病模型，现有的“基因敲除”方法 不能满足产生人类疾病模型的需要。
优于现存技术的优点包括如下：
1)与注射DNA的非同源性重组相比，通过慢病毒转导提高转基 因效率。原核注射导致大的串连DNA插入，插入的DNA不稳定且易 于重排和丢失。慢病毒转导通常导致有限数量的载体拷贝稳定整合， 在染色体DNA上以不连续的转录盒分布。
2)和当前的“基因敲除”相比时间周期缩短。产生纯合基因缺 失的小鼠是一个相对工作强度大、耗时的过程，需要嵌合体杂合子交 叉繁殖，胚系细胞已丢失工程化缺失基因。相比之下，受精之前转导 卵母细胞，每个细胞将包含部分缺失的基因盒。不需要交叉繁殖，这 使得周期更短并且需要的动物数量显著下降。
3)下调基因表达产物的灵活性。如讨论所述，该技术在建立致 命靶基因的疾病模型中特别有用。有利于研究在特定的发育阶段或者 在特定的组织中基因表达的消除。
4)HIV载体有许多缺点，这限制它们在某些疾病中的治疗应用。 HIV-1具有人类致病源的缺点，携带潜在的原癌基因蛋白质和序列。 在包装细胞中形成的载体颗粒表达HIV gag-pol，HIV载体导入带来的 危险因素是使这些蛋白质进入个体而导致血清转化。在本发明具体实 施方案中使用的非灵长类慢病毒载体不会在个体内引入HIV蛋白质。
实施例8：产生转基因鸟类作为生物反应器用于合成蛋白
一种编码细菌β半乳糖苷酶的EIAV载体，10μL的pONY8Z 5’cppt，直接到注射新生卵囊胚层期的胚胎下，具体操作技术可以参 见专利号为US 5258307，或者注射更早期的胚胎，具体操作参见 WO90/13626所描述的技术。一种惰性的染料用于囊胚期注射以确定 载体的准确运输。通过收集在孵育和孵化后的不同发育阶段的胚胎分 析转导效率。然后，对胚胎进行切片并用β半乳糖苷酶染色以鉴定哪 些器官被转导和胚胎性腺的生殖细胞是否被转导。采集胚胎中诸如血 液和CAM的组织样品，使用定量PCR的方法评估被转导细胞的百分 率。一些雄性胚胎成长到性成熟，精液将被采集。遗传该转基因到其 后代的可能性也通过定量PCR方法进行评估。然后精液被用来使雌鸟 受孕，收集胚胎并用定量PCR方法评估以确定转基因后代的百分率。 此外，处于G1群中的该载体上β-半乳糖苷酶表达水平通过X-Gal染 色评估。
实施例9：用于RNA干扰(RNAi)的载体
图20图解了适于慢病毒的许多RNAi表达盒，距离来说，EIAV在 转基因细胞和动物中表达siRNA。在每个实施例中，都利用了一个RNA 聚合酶III启动子(U6)。RNA聚合酶III产生许多包括小的5S核糖体RNA 和转运RNAs在内小的、稳定RNAs。有效的RNAi由单一U6启动子启 动短发卡表达介导合成(图20A)，或者也可通过合并的两个U6启动 子介导调节，其中一种表达正义链区，另一种表达该靶序列的同一序 列的反向互补序列(图20B)。图20C给出了一个具体实施方案，两 个反向的启动子从表达盒的正链和互补链用来转录靶基因的正义和反 义序列。
实施例10：用于调节短RNAs生成的适应体/核酶(适应酶)
病毒载体诸如慢病毒载体用来产生转基因并运输siRNAs，能靶向 具有重要或必需功能基因的一个基因，导致转基因动物在发育过程中 死亡。因此，调节siRNAs转录使基因的沉默作用受到调节是值得做 的研究。在这个实施例中，我们描述了一种适应体/核酶杂交体用于 调节功能性siRNAs的合成。
适应体是核苷酸分子，形成一定结构，可结合许多包括蛋白质和 药物分子的配体。通过用一个适应体取代锤头状核酶的一个螺旋能形 成催化性RNA，通过在配体存在或者不存在的情况下构象被诱导改 变并没、能够剪切底物(底物可以是其自身)。图21A图解了一个表 达盒的设计，该表达盒可以在本发明的载体中和本发明的方法中使 用。在这个实施例中，适应酶短发卡编码的siRNA的5’端增加了一个 适应酶。这导致转录本自身剪切可以受调节性诱导(或抑制)，发卡 从适应酶结构中分离，并激活基因沉默。象图21B中图解的一样，配 体的增加或者去除可以触发催化活性、剪切转录本和使短发卡释放以 诱导靶基因沉默。
实施例11：低氧情况siRNAs诱导的VEGF沉默
在这个实施例中，我们描述了一种用于调节功能性siRNAs生成的 适应酶的应用，其中适应酶的特异性蛋白质配体是由同一个载体表达 的。一个载体根据图22的图解进行构建，RNA聚合酶III U6 snRNA基 因启动子用来启动一个与适应酶相连的作用于VEGF的短发卡表达。 在缺氧条件下，缺氧反应元件(HRE)被诱导转录基因X，基因X编 码的蛋白质X是适应体的一个配体。配体结合后引发催化、短发卡释 放和随后导致VEGF基因沉默。
因此，VEGF在缺氧条件下被特异性地下调，这可能有助于治疗 包括增生性糖尿病视网膜病在内的许多疾病。
在另一可替代的实施方案中，适应体的配体可以是VEGF本身。
实施例12：用于转录siRNA前体的RNA聚合酶II启动子的应用
在这个实施例中，我们描述在RNA聚合酶II启动子控制下siRNA 前体的转录。这可通过对短发卡引入旁侧区获得(图23A)，或者通 过siRNA序列引入编码有RNA催化活性的适应酶或其作用的靶序列 (图23B)而实现。旁侧序列的剪切使前体释放siRNA或者短发卡。
在图23A中的表达盒，短发卡的表达是受一种RNA聚合酶II启动 子CMV的控制。Tet操纵子下游的两个拷贝给出了其它水平的调节。 在Tet抑制蛋白的存在下转录被抑制(缺少强力霉素)，Tet抑制蛋白 可以独立表达或者由同一个载体表达。适应酶位于转录本的旁侧区， 能被活化并剪切设计的位点，释放短发卡，从而能启始靶基因的沉默 化。在这个具体实施方案中，有必要使用适应酶而不是核酶，因为后 者将导致慢病毒基因组的自身剪切。
在图23B中的表达盒，只有反义siRNA的表达是受适应酶的调节 控制。同样，适应酶位于靶序列旁侧区，剪切释放合适的RNA序列， 与正义RNA形成二聚体，正义RNA是用U6启动子组成性表达的。因 此，靶基因沉默的开启或者关闭依赖于适应酶配体的存在与否。
实施例13：用于转基因表达调节的含有适应酶序列的载体的应用
适应酶可以用于包括基因的任何核苷酸序列的转录后调节。适应 酶通过增加/去除合适的配体而被活化(或抑制)，从而诱导转录本的剪 切，适应酶可以去除转录本的部分片段，举例来说，去除编码起始甲 硫氨酸的密码子或者一段阻止RNA加帽和/或者转录本多聚腺苷酸化 的UTR区。这提供了一种关闭某种基因产物表达合成的方法，举例来 说，一种诸如因子IX的治疗性基因，如果其表达过高可通过此方法调 节。转基因的表达能通过工程设计用这种方式进行自身调节。
图24A图解了一个用于胰岛素表达调节的构建体。适应酶的活性 通过葡萄糖的结合来调节，因此，在血糖水平增高时胰岛素才会高水 平表达。如果血糖降低到能激活适应酶活性的正常临界值以下，胰岛 素转基因的转录本被破坏。
图24B图解了一个用于因子IX表达调节的构建体。在这个构建体 中，一种受强力霉素调节的适应酶在体内和体外都可以通过施用强力 霉素来调节转基因/短RNAs的表达。在这个构建体中，Tet操纵子序 列插入到启动子的下游。在Tet抑制蛋白(可以由同一个载体表达) 存在下，去除强力霉素转录受到抑制，因此阻断重新转录。由于在没 有强力霉素时适应酶被活化，因此任何现存的转录本将被剪切和降 解。
T-RexTM系统能选择性地结合并用这种策略来增加其它的的调节 水平。
实施例14：用于转基因表达调节的含有适应酶序列的载体的应用 —阻止载体基因组RNA自身剪切的方法
本发明的病毒载体应该在适应酶酶活性最小和载体基因组不被自 身剪切破坏的条件下进行合成，但是一种优选的措施是通过构建一个 分裂内含子载体而在物理结构上隔开(或者核酶)(Ismail等2000)。 这可确保全长的核酶仅存在于原病毒编码的转录本中，而不存在于载 体颗粒的RNA基因组中。
图25A图解了分裂内含子策略，图28B图解了本发明这一方面 的合适载体。在剪切供体逆转录过程中，核酶5’某些序列拷贝到病 毒5’LTR，因此仅当转录的前病毒剪切后才形成核酶。应用图25A 中的具体实施例，编码适应酶的序列在病毒产生细胞包装的基因组中 将被分割，这使得蓝色标注区域(AGAUCAU)将不会出现在黑色标 注区域(GAUGCU)的序列上游。相反，它将与包含一个剪切供体 (划线的)的其它序列同时出现在3’LTR中。一旦逆转录开始，将 拷贝到5’LTR。因此它位于剪切受体的上游与适应酶的其余序列相 邻。一旦开始转录，内含子序列
( GUAAAUAAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTG CGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCC TTTCTCTCCACAG)将被剪接从而形成一个完全的适应酶。因此， 适应酶仅存在于转导的细胞，阻止任何载体基因组的剪切，否则将导 致滴度下降。
图25B图解了分裂内含子载体在本发明这一方面的应用。载体含 有一个EIAV/MLV杂合LTR。在转录的起始下游和EIAV重复序列的 上游插入了剪切供体，其中包含了适应酶的5’部分序列。在逆转录过 程中，修饰的3’LTR拷贝到5’LTR。经转录和剪接后形成功能性适应 酶。适应酶活化剪切转录本导致自身降解。
另外一个防止病毒基因组中潜在的活化适应酶形成的方法是在启 动子的3’末端增加一段序列，该序列能和适应酶部分序列碱基互补， 从而降低适应酶形成正确构象的可能性。这在图26中有描述。如图所 示，U6启动子的3’末端进行修饰增加一段序列，该序列和形成发卡 的螺旋I的5’区域互补，阻止适应酶形成催化活性所必需的构象。这 仅出现于RNA基因组而不会出现于转录本，因为转录的起始将在启 动子修饰序列的下游。这不会影响被转录的原病毒的三级结构，因为 启动子序列并不存在。
不同的修改和本发明中所描述的方法和系统的改进为本领域的熟 练技术人员所熟知，它们不偏离本发明的范围和本质。虽然本发明结 合优选的实施方案加以描述，但必须注意本发明并不局限于这些具体 的实施方案。事实上，对本发明的已被描述的方法加以修饰，这些方 法对于那些化学、生物或者其他相关领域的研究人员是熟知的，本发 明也试图包括这些方法。以上说明中所有提及的出版物在此并入作为 参考。
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通常，通过两种方法中的一种产生转基因动物：通过在胚胎干细 胞中以同源重组的方式靶向插入DNA序列，这是劳动密集型且耗时 的过程；或者通过受精卵前核注射，其中DNA的整合是随机的，并 且可能会导致一连串DNA的插入，这些DNA不稳定，在随后的细 胞分化过程中重新分布或被删除。WO99/51755讨论了使用包含编码 至少一个核酶之核酸的逆转录病毒表达载体产生转基因动物。没有公 开在具体的实施例中使用逆转录病毒的内容。虽然也提到提到了使用 腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、疱疹单纯病毒或者痘苗病毒的可能性。 然而，没有使用这些病毒的具体实施例。
因此，近些年人们建议使用逆转录病毒进行基因治疗。重要的是， 逆转录病毒是生活周期不同于裂解性病毒的RNA病毒。从这方面说， 当逆转录病毒感染细胞时，其基因组转化为DNA的形式。换句话说， 逆转录病毒是经过DNA中间体进行复制的感染实体。稍后将介绍逆 转录病毒感染等的更多细节。
有许多逆转录病毒，举例来说包括：鼠白血病病毒(MLV)、鼠 乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病 毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病 毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血 病病毒(A-MLV)、鸟髓细胞瘤病病毒-29(MC29)和鸟骨髓成红 血细胞增多症病毒(AEV)。
还有一种慢病毒家族，包括：人免疫缺陷病毒(HIV)和马感染 性贫血病毒(EIAV)。下文将阐述进一步的细节。
逆转录病毒和慢病毒的详细列表可见于Coffin等的著作(“逆转 录病毒”，1997年，冷泉港实验室出版社：J M Coffin，S M Hughes， HE Varmus 758-763页)。
我们可以从本技术领域中发现一些逆转录病毒基因组结构的细 节。举例来说，HIV病毒的细节可以从NCBI基因库中检索得到(基 因组注册号AF033819)。
上面已经指出，人们对建立基于小的逆转录病毒亚群慢病毒的逆 转录病毒载体系统有相当大的兴趣。这一兴趣首先起源于使用基于 HIV的载体将抗HIV治疗性基因定位到HIV易感细胞的想法，其次来 自于一预言：因为慢病毒能够感染非分裂细胞(Lewis和Emerman， 1993，病毒杂志，68，510)，所以基于这些病毒的载体系统将可以转 导非分裂细胞(如Vile和Russel，1995欧洲医学公告，51，12)。已 经构建了基于HIV的载体系统(Buchschacher和Panganiban，1992年， 病毒杂志，66卷，2731页)，且已经用于转导CD4+细胞，还如期转 导了非分裂细胞(Naldini等，1996年科学272，263)。此外，慢 病毒载体可以使目的基因非常稳定的长时间表达。转导鼠神经细胞后 可以出现至少3个月时间的高表达。基于MLV的载体仅使目的基因表 达6周。
迄今为止，构建的基于HIV的载体在转导的细胞中形成了一种整 合的前病毒，前病毒末端含有HIV的LTRs序列。这限制了这些载体的 使用，因为如果不使用了内部启动子，LTRs必须用作为插入基因的 表达信号。使用内部启动子有显著的缺点。在逆转录病毒的LTR序列 中插入附加的启动子会引起不可预知的结果，这一点已经有文献详细 阐述(Bowtell等，1988，病毒杂志，62，2464；Correll等，1994，血 液杂志84，1812；Emerman和Temin，1984，细胞，39，459；Ghattas 等，1991年，分子细胞生物学杂志，11，5848；Hantzopoulos等，1989； PNAS 86，3519；Hatzoglous等，1991，生化杂志，266，8416；Hatzogous 等，1988，生化杂志，263，17798；Li等，1992，人类基因治疗，3， 381；McLachlin等，1993病毒学195，1；Overell等，1988，分子细 胞生物学，8，1803；Scharfman等，1991，PNAS 88，4626；Vile等， 1994基因治疗，1,307；Xu等，1989，病毒学，171，331；Yee等， 1987，PNAS 84，5197)。涉及的因素包括两种启动子的相对位置和 定位、启动子的特性、表达基因和任何可能被采纳的选择操作。内部 启动子可以影响包装细胞株转导的效价和整合载体的稳定性。
HIV和其他慢病毒的LTRs对基因表达具有病毒特异性要求。例 如，在病毒Tat蛋白缺失情况下，HIV的LTR并不活化(Cullen 1995 AIDS 9，S19)。因此，需要通过改表基因表达要求的途径来修饰LTRs。 特殊情况下，对于一些基因治疗的应用可能还需要组织特异性基因表 达信号。
HIV载体有一系列的明显的缺点，这可能会限制其在一些疾病中 的治疗应用。HIV-1具有成为人病原体的缺点，带有潜在的原癌蛋白 和序列。包装细胞过程中产生的载体颗粒导入细胞表达HIV gag-pol 蛋白，导入患者体内将引起血清转化，这是一危险因素。因为这些原 因，有必要发展不会将HIV蛋白导入患者体内的基于慢病毒的载体。
已经提出了使用MLV来产生转基因动物。然而，使用这一技术产 生的表达水平令人失望。
仍然很有必要建立一种可以有效地产生且其中转基因受到调节的 疾病模型。
本方面的各方面克服了这些困难。
根据本发明的第一个方面，提供了产生转基因细胞的一种方法， 该方法包括向细胞中导入含有目的核苷酸(NOI)的非灵长类慢病毒 表达载体。
本发明提供了产生转基因动物的有效方法，该方法克服了和使用 灵长类慢病毒相关的潜在困难。
优选的是非灵长类慢病毒表达载体来自于EIAV、FIV、BIV、CAEV 或者MVV，而其中EIAV是最为优选的。
本发明的一个优点是表达载体可以在体内或者离体(ex vivo)导 入。在该方法的一个实施方案中，进行体外导入。在另一个实施方案 中，细胞存在于子宫中(in utero)。
已经建立了外源DNA导入哺乳动物胚系的几种方法。该技术使不 同胚系的细胞混合生成嵌合体，使多能细胞如ES细胞成为发育胚胎， 微注射DNA，并通过逆转录病毒感染细胞。大多数这些技术都基本 需要分离受精卵或者早期胚胎；将之体外培养；然后重新放回母体使 胚胎进一步发育。在ES细胞中通过同源重组的方法靶向性插入基因 和来产生转基因动物是劳动密集型且耗时的过程，从细胞核注射开始 算起周期为8至9周。
本发明该实施方案的一个主要优点是不需要进行分离操作，体外 培养，然后再植入。本发明还避免了劳动密集型且耗时的操作。
事实上，大规模的基因测序程序之后，可以获得许多功能未知的 基因。为了从新的基因组靶点开发治疗产品，有必要将生物学和基因 序列信息相对应。本发明提供了一种有效率且有效地验证靶点的体内 方法。
我们也发现了使用本发明可以得到产物的良好表达水平，尤其是 使用EIAV载体的表达水平高于使用MLV载体的表达水平。这一嗲令 人惊奇。
本发明的另一优点是其效率。通过使用一种载体转导，如果需要 数代培养以有效率地产生受调节的敲除疾病模型。因此，本发明满足 了这一长远需要，虽然在当时该问题的解决还不明显。
本发明这一方面的另一个优点是其灵活性；慢病毒载体可以在生 物发育的整个过程中导入。因此，在一个实施方案中，该细胞是一围 产期细胞，该围产期细胞可能是胚胎细胞。在该实施方案的一个特定 方面中，胚胎细胞位于子宫中。然而，该方法可以应用于任何细胞， 如体细胞，也可应用于能够导致胚系改变的任何细胞。这些细胞包括 生殖细胞(germ cell)，但是本发明还能应用于直接或者间接参与配 子形成或受精的细胞。我们还包括不经过直接受精而获得的等效细 胞，如通过细胞核移植技术获得的等效细胞。
优选的是，该细胞是卵母细胞、输卵管细胞、卵巢细胞、卵子细 胞、ES细胞、卵子(blastocyte)、精母细胞、精子细胞、精子或者精原 细胞。
当试图获得胚系改变时，应该了解到越早转导越好，因为这样转 导生殖细胞成功的机会较大。
使用慢反应病毒载体的一个独特优势是：可以转导非分裂细胞或 者慢分裂细胞，比如卵母细胞和精子形成细胞。
接下来，根据本发明的另一方面，本发明提供了一种产生转基因 细胞的方法。该方法包括向非分裂细胞中导入包含NOI的慢病毒表达 载体。慢病毒表达载体可以来自于非灵长类慢病毒，还可以来自于灵 长类慢病毒，如HIV。
本发明该方面的另一优点是细胞不需要进行受精后转导。
我们所指的非分裂细胞包括具备分裂能力但是在某一特定时期不 分裂的细胞。
该方法并不局限于特定的细胞种类，但是细胞优选是真核细胞， 例如动物细胞，优选哺乳动物；或者酵母细胞。本发明可应用的细胞 种类包括鼠细胞；人类细胞；猪细胞；牛细胞；猿细胞；绵羊细胞； 马细胞；鸟细胞，诸如家禽、尤其是鸡的细胞；昆虫细胞或者爬行动 物或者鱼类的细胞。细胞可以来自于线虫或者果蝇。
在一个实施方案中，细胞来自于人类以外的生物。
优选的是，慢病毒表达载体是假型载体(pseudotyped)。
优选的是，慢病毒表达载体不包括任何附属性的功能基因。
NOI可以可操纵地和组成性启动子、组织特异性启动子或诱导性 启动子相连接。
优选的是，NOI编码并能够表达治疗性的蛋白质，或者编码反义 寡聚核酸或者编码核酶。
在一个优选的实施方案中，NOI能够产生一种使靶基因转录后沉 默的RNA分子。本发明的这一方面中，我们提供了一种产生转基因 细胞的方法，该方法包括向细胞中导入慢病毒表达载体，该载体包括 能够产生使靶基因转录后沉默之RNA分子的NOI。
优选的是，NOI能产生短RNA、siRNA、短发卡RNA和微RNA或 者I型内含子。
在一个实施方案中，短RNA、siRNA、短发卡RNA和微型RNA的 表达受一种RNA聚合酶启动子的四环素应答衍生物调节。
在一个实施方案中，该方法中包括转导能够表达一种蛋白质，优 选优选治疗性蛋白质的至少一个NOI，以及编码能够导致靶基因转录 后沉默之RNA分子的至少一个NOI。能够表达一种蛋白质，优选优选 治疗性蛋白质的至少一个NOI，以及编码能够导致靶基因转录后沉默 之RNA分子的至少一个NOI可以存在于同一慢病毒表达载体中，也可 以存在于不同的慢病毒表达载体中。
慢病毒表达载体可以通过各种方便的途径转导进入靶细胞，例如 脐带细胞、胎盘、羊水；或者直接进入器官，比如子宫、性腺、大脑、 肾脏、肝脏、心脏、骨髓、血液、中枢神经系统或者肺。
一只基因敲除小鼠基因表达降低是致死性的，因此这引出了用作 疾病模型的转基因动物产量的问题。在本发明的方法中，NOI能通过 操作和组织特异性或诱导性启动子连接。在一个特定的发育阶段或者 一种特异的组织需要消除基因表达的时候，此点具有独特的优势。
NOI以结构组织特异性或者可调节的方式在转基因生物中表达。 可以表达NOI的细胞种类包括任何器官和组织的细胞，比如所述生物 大脑、肾脏、肝脏、心脏、骨髓、血液、中枢神经系统或者肺的细胞。 NOI还可以在生物的特定发育阶段表达。
如上讨论，在本发明的优选实施方案中，所述NOI编码能够使靶 基因转录后沉默的RNA，如短RNA、siRNA、短发卡RNA或者微RNA。
本发明还涉及到来源于这些细胞的转基因动物。这些转基因动物 可以用作蛋白质生产，如治疗蛋白(例如胰岛素)的生产，这和转基 因动物在动物模型中的使用一样有前景。
在本发明中的一个特定方面中，提供了一种转基因鸟类的卵。因 此根据本发明中的这一方面，提供了一种产生转基因鸟类和/或者转 基因鸟类卵的方法，该方法中包括在鸟类细胞中导入含有NOI的慢病 毒表达载体。在这一情况，NOI编码一种蛋白，该蛋白可以洁净而有 效地从表达蛋白的转基因卵中获得。
然而我们已经认识到由于卵的大小所限，在卵中所产生蛋白质的 体积有限。我们已经发现使一个或多个卵固有编码蛋白的基因沉默， 可能会增加NOI介导的蛋白质表达。这些固有蛋白表达可以通过本发 明的方法下调，例如使用编码能够使天然卵基因沉默之RNA分子的 慢病毒表达载体。一种能表达蛋白质的NOI和一种能产生使卵靶基因 沉默之RNA分子的NOI可以存在于相同的慢病毒载体中，也可以存在 于不同的慢病毒表达载体中。在本发明这一方面的优选实施方案中， 能表达蛋白质的NOI置于受启动子控制的区域中，而这一启动子是卵 所固有的，比如溶菌酶启动子。
因此本发明提供一种转基因生物或者转基因生物卵，其包括能表 达蛋白质，优选治疗性蛋白质的至少一种NOI，以及编码能够使卵固 有靶基因沉默之RNA分子的NOI。如上讨论，第二种NOI可以编码能 够使靶基因转录后沉默的RNA，如短RNA、siRNA、短发卡RNA或微 RNA。
转录后基因沉默作用(PTGS)由双链dsRNA介导，是细胞固有 的、用以控制外源基因在细胞内表达的防御机制。举例来说，转座子 或病毒等一些DNA元件可以随机整合引起dsRNA表达，dsRNA进而 激活序列特异性的同源单链mRNA或者病毒基因RNA降解。沉默作用 称作RNA干扰(RNAi)。RNAi的机制包括将长dsRNAs加工成21～25 个核苷酸(nt)RNAs的两倍体。这些产物称作小干扰RNA或者小沉 默RNAs(siRNAs)，它们是mRNA降解的序列特异性介质。除了 siRNAs，短RNAs的表达也可以改变剪切(“外显子跳跃(exon- skipping)”)或者多聚腺苷酸化，或者抑制翻译。
虽然病毒载体是体内基因转导的有效工具，但由于参与转录后基 因沉默作用的RNA分子较短，使用常规的表达序列盒难以进行这些 RNA分子的转录。另一个问题是，应用病毒载体，例如慢病毒载体 转导上述针对某一基因、编码一种重要生理功能的产物的RNA，由 此生成的转基因生物可能会在发育过程中死亡。本发明的一个方面通 过提供一种载体，该载体中多核苷酸(如siRNA)的转录能被适应酶 所调节，因此克服了这一问题。事实上，本发明的这一方面并不局限 于涉及慢病毒载体的方法，这构成了本发明独立的一个方面。
本发明的第二方面中，提供了包含第一核苷酸序列的载体，其中 所述的第一核苷酸序列包括：
(a)编码适应酶(aptazyme)的第二核苷酸序列；和
(b)可以产生多聚核苷酸的第三核苷酸序列；
此处(a)和(b)可操纵性地相连接，其中适应酶能够活化，切 割第一核苷酸序列的转录本，从而形成多聚核苷酸序列。
换句话说，构建了一种包括核酸序列的载体，其中所述的核酸序 列包括：
(c)编码适应酶的第一核苷酸序列；和
(d)可以产生多聚核苷酸的第二核苷酸序列；
此处(a)和(b)可操纵性地相连接，其中适应酶能够活化，切 割核酸序列的转录本，从而形成多聚核苷酸序列。
优选的是，所述载体是病毒载体。
在本发明这一方面的优选实施方案中，多聚核苷酸是能够调节靶 基因表达的RNA分子，优选选自siRNA、短发卡RNA、微RNA、反义 RNA和核酶。
适应酶是具有别构效应的核酶。该酶是核酸分子，可以形成能结 合许多配体的结构，所述的配体包括蛋白质和药物分子。将核酶例如 锤头状核酶的一个螺旋替换为适应酶，配体存在或不存在条件下导致 该酶构象改变，从而有可能形成能够切割底物(可以是其自身)的催 化性RNA。已经有人报道了(Soukup和Breaker 1999)受黄素单核苷 酸(FMN)诱导或抑制的适应酶，还有人报道了(Piganaeu等2000 年)受强力霉素抑制的适应酶。
本发明的另一个独立方面是：适应酶诱导的切割可以被用来直接 调节NOI的表达。
因此，根据本发明的第三个方面，提供了一种包括第一条核苷酸 序列的载体，其中所述的第一条核苷酸序列包括：
(a)编码适应酶的第二核苷酸序列；和
(b)含有一个NOI的第三核苷酸序列；
其中(a)和(b)可操纵性地相连接，其中适应酶能够活化，切 割第一核苷酸序列的转录本，从而使NOI的表达受到抑制。
换句话说，本发明提供了一个包含核酸序列的载体，此处的核酸 序列包括：
(c)编码适应酶的第一核苷酸序列；和
(d)包括NOI的第二核苷酸序列；
此处(a)和(b)可以通过操作连接，其中适应酶能够活化，切 割核酸序列的转录本，从而NOI的表达受到抑制。
优选的是，所述载体是病毒载体。
在一个实施方案中，由上述载体编码的适应酶活化，从而切割第 一核苷酸的转录本，切割位点位于第三核苷酸序列转录本内。
在一个优选实施方案中，根据本发明的第三方面，该载体编码的 NOI编码一种治疗性蛋白质。
本发明第二和第三方面的一个实施方案中，适应酶结合配体后活 化。
本发明第二和第三方面的另一个实施方案中，适应酶结合配体后 失活。
本发明第二和第三方面的一个优选实施方案中，载体还包括第四 核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种能和适应酶结合的配体。编码配 体的核苷酸序列可操纵性地和启动子连接。
该配体选自多肽和其片段、线性肽、环肽和其编码核苷酸、包括 低分子量有机或者无机化合物的合成和天然化合物以及抗体。
在优选的实施方案中，本发明这些方面中使用的配体选自FMN、 强力霉素和VEGF、四环素或者葡萄糖。
本发明的第二和第三方面的另一个实施方案中，(a)和(b)可 操纵性地和启动子连接。优选的启动子选自RNA聚合酶III(U6)启 动子，例如U6启动子和常规的RNA聚合酶II启动子。
启动子可操纵性地和至少一个拷贝的四环素应答元件(TRE)如 Tet操纵子的相连接，从而使第一核苷酸序列的转录受四环素调节因 子、四环素或者其衍生物调节。
在一个实施方案中，根据本发明的第二和第三方面，该载体包括 编码四环素调节因子的第五核苷酸序列。
虽然我们优选在尽量降低适应酶活性以及自身切割所致载体基因 组不必要的破坏条件下构建载体，在一个优选的实施方案中，载体以 分裂内含子载体(split intron vector)的构型存在。这样可以确保适 应酶的完整序列仅存在于原病毒编码的转录本中，而不出现在载体颗 粒的RNA基因组中。抑制病毒RNA基因组中具有潜在活性之适应酶 形成的另一个手段是使用一种启动子，所述启动子的3’末端序列可以 和适应酶的一部分进行碱基配对，从而形成发卡以阻止病毒RNA基 因组中活化适应酶的形成。分裂内含子载体的细节在WO99/15683中 有描述。
根据本发明第二和第三方面，载体可以来自于任何合适的病毒， 例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒载体、疱疹载体、痘 病毒载体、细小病毒载体或者杆状病毒(baculoviral)载体。
本发明的第四方面中，提供了产生转基因细胞的方法，该方法使 用本发明第二和第三方面中的载体。
根据本方面的第五方面，提供了按照本发明的一些方法产生的转 基因细胞。
根据本发明的第六方面，提供了转基因生物，所述转基因生物通 过本发明中产生的转基因细胞产生或获得。
根据本发明的的第七方面，提供了转基因生物，其中NOI在造血 细胞(包括单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、粒细胞或者这些细胞的 祖细胞)、内皮细胞、肿瘤细胞、间质细胞、星形胶质细胞、肌细胞、 上皮细胞、神经元、成纤维细胞、肝细胞、星形胶质细胞、肾脏、肝 脏、心脏或肺脏细胞中表达。
本发明的另一方面中，提供了根据本发明的转基因生物，此处NOI 在输卵管细胞、生殖道细胞、白蛋白、造血细胞(包括单核细胞、巨 噬细胞、淋巴细胞、粒细胞或者这些细胞的祖细胞)内皮细胞、肿瘤 细胞、间质细胞、星形胶质细胞、神经胶质细胞、肌细胞、上皮细胞、 神经元、成纤维细胞、肝细胞、星形胶质细胞、肾脏、肝脏、心脏或 肺脏细胞中表达。
现在将通过非限制性的实施例方式，参考附图来描述本发明的各 种优选特征和实施方案：
附图简述
图1所示为子宫注射EIAV慢病毒后的肝脏和组织组织学，以及胎 儿静脉内注射后3、7、14、28、79天和6个月后对β半乳糖苷酶标记 基因进行染色的鼠肝脏切片。
图2所示为子宫注射EIAV慢病毒后的组织和组织学，以及胎儿静 脉内注射后3、7、14、28、79天和6个月后对β半乳糖苷酶标记基因 进行染色的鼠肝脏、心脏、骨骼肌、肺、脑和肾脏切片。
图3所示为胎儿脊内注射表达核定位LacZ的EIAV病毒载体7天后 对β半乳糖苷酶标记基因进行染色的鼠背根神经节。
图4所示为胎儿脊内注射表达核定位LacZ的EIAV病毒载体数天后 对β半乳糖苷酶标记基因进行染色的鼠背根神经节切片。
图5所示为胎儿静脉内注射表达核定位LacZ的EIAV病毒载体7天 后对β半乳糖苷酶标记基因进行染色的鼠肝脏切片。
图6所示为胎儿静脉内注射表达核定位LacZ的EIAV病毒载体7天 对β半乳糖苷酶标记基因进行染色的鼠肾血管小球及其切片。
图7所示为胎儿静脉内注射表达核定位LacZ的EIAV病毒载体7天 后对β半乳糖苷酶标记基因进行染色的鼠胰腺及其切片。
图8所示为胎儿肌肉注射表达核定位LacZ的EIAV病毒载体7天后 对β半乳糖苷酶标记基因进行染色的鼠骨骼肌切片。
图9所示为胎儿腹腔注射表达LacZ的EIAV病毒载体两周后对β半 乳糖苷酶标记基因进行染色的鼠膈膜及其横切片。
图10所示为胎儿肌肉注射表达LacZ的EIAV病毒载体两周后对β 半乳糖苷酶标记基因进行染色的鼠小腿及其切片。
图11所示为在胸内和腹膜内注射EIAV病毒载体96小时后，β半 乳糖苷酶催化的X-Gal显色。图11A所示为去除内脏的矢状面。图11B 所示为切除膈膜的正面。
图12所示为EIAV基因组大小的示意图。这可以应用于本发明中 的转染。发生转染时，3’LTR末端将拷贝到5’LTR。
图13所示为pONY8.1G的核酸序列。
图14所示为pONY8.4CG的核苷酸序列。
图15所示为pONY8.1GCZ的核苷酸序列。
图16所示为应用于本发明中的一个载体的杂合U3区示意图。
图1 7所示为这一杂合LTR的核苷酸序列。
图18所示为pONY8.1ZHyb的核苷酸序列。
图19所示为pONY8.1ZHyb的一个示意图。
图20(a)-(c)所示为用作RNAi应用的表达盒。
图21(a)所示为一种用于在介导适应酶调节siRNA基因沉默化过 程的表达盒。
图21(b)所示为图24a表达盒的转录本的结构。
图22所示为一种用于通过siRNAs缺氧诱导VEGF沉默的表达 盒。
图23(a)所示为含有一个RNA聚合酶II启动子和表达适应酶调 节短发卡的表达盒。
图23(b)所示为含有一个RNA聚合酶II启动子的表达盒和表达 适应酶调节反义siRNA的表达盒。
图24(a)所示为用于介导适应酶调节胰岛素表达的表达盒。
图24(b)所示为用于介导适应酶调节因子IX表达的表达盒。
图25(a)所示为一种避免RNA基因组自身剪切的分裂内含子策 略的示意图。
图25(b)所示为一种用于分裂内含子的表达盒。
图26所示为一种避免RNA基因组自身剪切的双发卡策略的示意 图。
发明详述
此处提及的技术通常都是本领域所熟知的，具体可以参考 Sambrook等编撰的《分子克隆：实验指南)》(1989)和Ausubel等撰 写的John Wiley & Sons出版的《(分子生物学简明手册》(1999)。
本发明的一个方面涉及利用非灵长类慢病毒表达载体产生转基因 细胞和从转基因细胞获得转基因生物或转基因生物一部分的方法。更 具体地说，本发明的这一方面涉及慢病毒载体在基因治疗和建立疾病 模型中的有效应用。疾病模型，如基因敲除小鼠的建立大大有益于基 因功能的研究，建立遗传性疾病的哺乳动物模型方面尤其具有相关 性。
基因治疗包括任意一种或多种：一个或多个靶位点，如对靶细胞 中的一个或多个核苷酸序列的进行添加、替换、缺失、补充和操作。 如果靶位点是靶细胞，那么细胞可以是组织或者器官的一部分。有关 基因治疗的一般技术参见《分子生物学》(Ed Robert Meyers，Pub VCH，如556-558)。
进一步举例来说，基因治疗还提供了一种方法，通过这种方法， 可以应用任何一个或多个核苷酸序列，如基因来置换或补充有缺陷的 基因；去除致病基因及其产物；按次序增加新基因，例如用以产生一 种更为有利的表型；可以在分子水平操作细胞以治疗癌症(Schmidt -Wolf和Schmidt-Wolf，1994，血液学年报69：273-279)或者其 他病情，例如免疫、心血管、神经系统、炎性或者感染性疾病；可以 操作抗原和/或导入体内引起免疫应答-例如基因疫苗。
转基因生物是其细胞的至少一种细胞中含有目的核苷酸序列 (NOI)。在一个实施方案中，细胞是胚系细胞。在另一个实施方案 中，细胞是体细胞。更具体的是，NOI已通过实验法，例如使用cDNA 技术转导。
NOI通常指的是“转基因”，即以能够确保其功能的方式插入细 胞的一个基因。当基因插入胚系细胞时，必须象正常基因一样发挥功 能、复制并转移。
本发明包括嵌合体(chimeras)和镶嵌体(mosaics)。
“嵌合体”是一种由遗传上不同的细胞的混合体组成的生物。
“镶嵌体”是第一次细胞分裂后将转基因整合入基因组的生物。 因为不同细胞具有不同的整合位点，该生物是镶嵌体。
本发明的转基因生物优选是一种多细胞的真核生物，如动物或者 植物或真菌或诸如酵母之类的单细胞真核生物。
然后生物优选是一种动物，更优选的是哺乳动物。
本发明的第一方面使用非灵长类慢病毒表达载体。
如本领域所熟知的，载体是一种可以促使基因从一种环境转移进 入另一种环境的工具。根据本发明，举例来说，应用于重组DNA技 术中的一些载体能够使DNA片段之类的实体(例如异源DNA片段， 例如异源cDNA片段)转移进入宿主细胞，使含有DNA片段的载体得 以复制。举例来说，在重组DNA技术中使用的载体包括但不仅限于 质粒、染色体、人工染色体或者病毒。
“表达载体”表示一种能够在体内或体外/离体表达的一种构建 体。
本发明的一些方面中使用的慢病毒载体能够转导非分裂的靶细 胞。该特征的优点是：由于新鲜分离的卵母细胞是沉默的，使用慢病 毒可以增强转导效率，而逆转录病毒则不能。
在本发明的方法中使用的一个典型载体中，至少可以从病毒中去 除一个或者多个对于复制来说关键的蛋白质编码区部分。这使地病毒 病毒载体具有复制缺陷。病毒基因组部分还替换为编码候选调节性部 分的文库，该候选调节性部分可操纵性地和载体基因组中调控性的控 制区以及报道部分相连，以产生包含候选调节性部分的载体，其中所 述的候选调节性部分能够转导非分裂的靶细胞和/或将其基因组整合 到宿主细胞中。
优选的是，能转导非分裂或者慢分裂细胞的病毒载体是慢病毒载 体。
慢病毒载体是逆转录病毒大家族中的一部分。慢病毒的详细列单 参考Coffin等(《逆转录病毒》1997冷泉港实验室出版社：J M Coffin， S M Hughes，H E Varmus 758-763页)。简单的说，慢病毒可以分为 灵长类和非灵长类。举例来说，灵长类慢病毒包括但不仅限于：人自 身免疫缺陷综合征(AIDS)的致病因子——人免疫缺陷病毒(HIV) 和猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒包括原型“慢病毒”梅 迪病毒(VMV)、相关羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、马感染性贫血 病毒(EIAV)和近期描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病 毒(BIV)。
慢病毒家族和其他逆转录病毒的区别在于慢病毒既能感染分裂细 胞也能感染非分裂细胞(Lewis等，1992，EMBO.J 11：3053-3058； Lewis和Emerman，1994，病毒学杂志.68：510-516)。相比之下， 其他慢病毒如MLV不能感染非分裂细胞或者慢分裂细胞，这些细胞 如肌、脑、肺、肝等组织的细胞。
本发明一些方面中使用的“非灵长类载体”指载体来源于最初不 感染灵长类动物，尤其是人类的病毒。因此，非灵长类病毒载体包括 感染非灵长类哺乳动物的载体，这些非灵长类动物如狗、羊、马、爬 行动物、鸟和昆虫。
此处使用的慢病毒或者慢病毒载体至少包含一种衍生自慢病毒的 组成部分。优选的是，所述的组成部分参与载体感染细胞、表达基因 或复制的生物学机制。所使用的“衍生”(derivable)表述的意义不 是一般的意义，是该序列没有必要从慢病毒中获取，而是能够从其衍 生而来。举例来说，该序列可以合成得到或者通过使用重组DNA技 术获取。
非灵长类慢病毒可以是慢病毒家族的任何成员，其本质上并不感 染灵长类，包括有猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)， 羊关节脑炎病毒(CAEV)、Maedi绵羊脱髓鞘性脑白质炎病毒(MVV) 或者马感染性的贫血病毒(EIAV)。优选的非灵长类慢病毒是一种 EIAV。马感染性贫血病毒感染所有的马，导致血浆病毒血症和血小 板减少(Clabough等，1991，病毒杂志，65：6242-6251)。病毒复 制受单核细胞转化为巨噬细胞这一过程控制。
在一个实施方案中，病毒载体源自于EIAV。在本发明中特别优 选使用的EIAV具有最简单的慢病毒基因结构。除了gag、pol和env基 因，EIAV编码三种其他基因：tat、rev和S2。Tat作为病毒LTR的转录 活化因子(Derse和Newbold，1993，病毒学，194：530-536；Maury 等，1994，病毒学，200：632-642)；Rev通过rev-应答元件(RRE) 控制和调节病毒基因的表达(Martarano等，1994，病毒学杂志，68： 3102-3111)。这两种蛋白作用的机制被公认为和灵长类病毒的机制相 似(Martano等，引文同上)。S2的功能不详。此外，还分离得到一 个EIAV蛋白Ttm，它是由tat基因的第一个外显子与env基因编码跨膜 蛋白的启始序列拼接所编码的。
除了蛋白酶、逆转录酶和整合酶，非灵长类慢病毒还包括第四个 由pol基因编码的dUTPase，这可能在慢病毒感染某些非分裂型细胞时 起作用。
本发明该方面的病毒RNA由一个启动子转录，启动子可以是病毒 或者非病毒来源的，但必须能控制在真核细胞如哺乳动物细胞的表 达。在启动子上游或者下游可以随意地选用增强子。RNA转录在多 聚腺苷酸化位点中止，该位点可以由慢病毒3’LTR或一种不同的多聚 腺嘌呤信号提供。
因此，本发明使用的DNA转录元件包括启动子和随意地选用的增 强子，该元件能够调节控制非灵长类慢病毒载体基因组的表达。
此处描述的转录件包括含有能够得以转录之序列的核酸区域。因 此，根据该定义，这些序列包括编码mRNA、tRNA和rRNA的序列。 该序列可以在启动子的正义方向或者反义方向上。可以根据人们所熟 知的技术，使用反义构建体来抑制细胞内的一个基因表达。例如，核 酸可以是核糖核酸(RNA)或者脱氧核糖核酸(DNA)或者其类似 物。编码mRNA的序列可选性地包括一些或者所有5’和/或者3’端被转 录但不被翻译的旁侧序列；或者相反，和翻译编码序列相关的序列。 该序列甚至可选性地包括和转录序列相关的转录控制序列；例如转录 中止信号、多聚腺苷酸化位点和下游增强子元件。核酸可以包括cDNA 或者基因组DNA(可包括内含子)。
逆转录病毒基因组的基本结构是一个5’LTR和3’LTR，在两者之 间或其内部存在能使病毒基因组被包装的包装信号、引物结合位点、 使病毒基因组整合入宿主细胞基因组的整合位点和编码包装成分的 gag、pol和env基因——这些多肽是病毒颗粒装配所必需的。更复杂 的逆转录病毒具有其它的特征，例如HIV中的rev和RRE序列，两者可 以使整合的原病毒RNA转录本从核到被感染靶细胞的细胞质被有效 地转运。
在原病毒中，这些基因位于长末端重复区(LTRs)的旁侧。LTRs 控制原病毒整合和转录。LTRs也作为增强子-启动子序列能控制病 毒基因的表达。由于一种psi序列定位于5’基因组末端的存在，逆转录 病毒RNAs可发生包装。
LTRs本身是与U3、R和U5三个元件序列完全相同的。U3源自于 RNA 3’末端的单一序列。R来自于RNA两端的重复序列。U5来自于 RNA 5’末端的单一序列。这三个元件的大小在不同的逆转录病毒间 有变化。
在一个缺陷型逆转录病毒载体基因组中，gag、pol和env可以缺失 或者没有功能。RNA两端的R区域是重复序列。U5和U3分别表示RNA 基因组5’和3’末端的单一序列。
根据本发明的一个方面，优选使用的载体是重组非灵长类慢病毒 载体。
“重组慢反应病毒载体”(RLV)表示一种含有足够的逆转录病 毒遗传信息的载体，在包装成分存在时RNA基因组能包装感染靶细 胞的病毒颗粒。靶细胞的感染包括逆转录和靶细胞基因组的整合。RLV 含有通过载体进入靶细胞的非病毒编码序列。RLV在靶细胞中不能独 立复制产生感染性逆转录病毒颗粒。RLV通常缺乏功能性的gag-pol 和/或者env基因和/或者其他复制必需的基因。本发明的载体可以构建 为分裂内含子载体。分裂内含子载体在PCT专利申请WO99/15683中 有描述。
优选的是，本发明中慢病毒载体有一个最小病毒基因组。
如此处所使用的“最小病毒基因”意味着病毒载体经过操作以致 于去除非必需元件而保留必需元件，以提供感染、转导的必需的功能 和递送目的核苷酸序列进入靶宿主细胞。这个策略的更多细节可参见 我们的WO98/17815。
本发明使用的最小慢病毒基因组包括(5’)R-U5-一个或多个第 一核苷酸序列-U3-R(3’)。然而，在宿主/包装细胞用于产生慢病毒基 因组的质粒载体还包括转录调节控制序列，这些转录调节控制序列可 操纵性地和慢病毒基因组相连并控制基因组在宿主/包装细胞内转 录。这些调节序列可以是和转录的逆转录病毒序列相关的自身序列， 如5’U3区域；或者它们可以是象另一病毒启动子那样的异源启动子， 例如CMV启动子。一些慢病毒基因组为了高效地产生病毒需要另外 的的序列。例如，对于HIV来说优选包括rev和RRE序列。然而，对rev 和RRE的必要条件可以通过密码子优化减少或者消除。这个策略的更 多细节可参见我们的W001/79518。
在本发明的一个实施方案中，慢病毒载体是自身不能激活的载 体。
举例来说，通过去除转录增强子或者同时去除3’LTR U3区域的 增强子和启动子已构建了自身不能激活的逆转录病毒载体。经过一轮 的载体逆转录和整合之后，这些改变可以拷贝到5’和3’LTRs并产生一 种转录的非活化原病毒。(Yu等，1986，Proc Natl Acad Sci，83：3194- 3198；Dougherty和Temin，1987，Proc Natl Acad Sci，84：1197-1201； Hawley等，1987，Proc Natl Acad Sci，84：2406-2410；Yee等，1987，Proc Natl Acad Sci，91：9564-9568)。然而，这些载体内部的启动子到LTRs 仍将被转录活化。这种策略已被用于消除在病毒LTRs中的增强子和 启动子对内置基因转录作用的影响。这些影响包括增强的转录(Jolley 等，1983，Nucleic Acids Res，11：1855-1872)或者转录抑制(Emerman和 Temin，1984，Cell，39：449-467)。这种策略也可以用来消除从3’LTR 进入基因组DNA的下游转录。(Herman和Coffin，1987，Science，236： 845-848)。这在人类基因治疗方面引起了特别的关注，它对阻止内 源性癌基因偶然的活化极其重要。
在我们的WO99/32646中，我们给出了可以方便应用于本发明的 特征细节。具体地说，非灵长类慢病毒基因组(1)优选包括缺失的gag 基因，其中gag基因中的缺失去除了gag编码序列中约350或354个核苷 酸下游的一个或者多个核苷酸；(2)优选具有非灵长类慢病毒基因 组中不存在的一个或多个附属基因；(3)优选缺乏tat基因，但包括 5’LTR末端和gag ATG之间的前导序列；和(4)(1)、(2)和(3) 的组合。在一个特别优选的实施方案中，慢病毒载体包括(1)、(2) 和(3)的所有特征。
非灵长类慢病毒载体可以是靶向载体。“靶向载体”指的是一种 载体，该载体感染/转染/转导细胞或者在宿主和/或靶细胞中表达的能 力仅限于宿主生物体内特定的细胞类型，通常是共同或者相似表型的 细胞。
使用逆转录病毒载体进行基因治疗的靶细胞包括但不仅限于造血 细胞(包括单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、粒细胞或者任意这些细 胞的祖细胞)；内皮细胞、肿瘤细胞、间质细胞、星形胶质细胞或者 神经胶质细胞、肌细胞、上皮细胞、神经元、成纤维细胞、肝细胞、 星形胶质细胞、肾脏、肝脏、心脏和肺细胞。
载体可以是含有任何分子的假型载体，这些分子包括但不局限于 VSV-G、rabies、Mokola、MuLV、LCMV、Sendai和Ebola的包膜糖 蛋白(野生型或者人工改造的变体或者嵌合体)。
虽然本发明的第一方面为使用慢病毒载体的一种方法，本发明的 其他方面可以使用其他的病毒表达载体。根据这些方面的病毒载体包 括但不局限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相 关载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、细小病毒载体或者杆状病毒载 体。
本发明这些方面中使用的逆转录病毒载体来自于或可来自于任何 合适的逆转录病毒。已鉴定到了大量不同的逆转录病毒。这些例子包 括：鼠白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、人T细胞淋 巴病毒(HTLV)、鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、 Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR 鼠骨肉瘤病毒(FBR-MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson 鼠白血病病毒(A-MLV)、鸟髓细胞瘤病病毒-29(MC29)和鸟骨 髓成红血细胞增多症病毒(AEV)。逆转录病毒的详细列表可参见 Coffin等，1997年的《逆转录病毒》，冷泉港实验室出版社：J M Coffin， S M Hughes，H E Varmus，758-763页。
逆转录病毒可以广泛地分为两大类型，即“简单型”和“复杂型”。 逆转录病毒可以进一步分作7类。其中5类是带有原癌基因的逆转录病 毒。其余的两类是慢病毒和泡沫病毒。这些逆转录病毒的综述文献参 见Coffin等1997年的著作(同上)。
腺病毒是双链线性DNA病毒，不需要经过RNA中间体。有50余种 不同的人类血清型腺病毒，根据遗传序列同源性分为6个亚家族。腺 病毒的靶点是呼吸系统和胃肠道的上皮细胞，通常引起较轻的症状。 血清型2和5(95％序列同源性)通常是腺病毒载体系统中最常用到的， 通常和年轻人上呼吸道感染相关。
病毒基因表达可以分为早期(E)和晚期(L)阶段。晚期阶段定 义为病毒DNA复制的开始。腺病毒结构蛋白通常在晚期阶段合成。 腺病毒感染后，受多数血清型病毒感染的宿主细胞mRNA和蛋白的合 成受到抑制。腺病毒2和5的裂解周期非常有效率，导致每个感染细胞 中大约10000个病毒颗粒形成，同时和合成过量的、并不装配入病毒 颗粒的病毒蛋白和DNA。早期腺病毒转录是一系列复杂的相关生化 事件，但是其在DNA复制之前实现了必要的病毒RNA的合成。
在所有腺病毒亚家族中，腺病毒基因组结构相似；对于研究的每 一种血清型来说，特定的功能通常发生在同样的位置上。早期胞浆信 使RNA和四种明确的、不相邻近的病毒DNA区相互补。这些区域命 名为E1-E4。早期转录本分类为立即早期(E1a)、晚早期(E1b、E2a、 E2b、E3和E4)和立即区域。
早期基因在感染后约6～8小时表达，并从基因元件E1-4中的7个启 动子开始转录。
腺病毒可以通过去除E1基因从而用于基因转导的载体，E1基因对 于E2、E3和E4启动子的诱导非常重要。E1复制缺陷病毒可以在含有E1 多肽的、诸如人胚肾细胞系293之类的细胞系中复制。一种或多种治 疗基因能够通过重组而取代E1基因。E1启动子或者一种异种启动子 启动子启动基因表达。
通过缺失某些或者所有的E4开放阅读框(ORFs)已构建了毒性 较弱的腺病毒载体。然而，即使DNA仍保持，某些第二代载体似乎 不会引起基因长时间表达。因此，一个或者几个E4 ORFs的功能似乎 是增强从病毒携带的至少某些病毒启动子的表达。
构建严重缺陷的病毒的另一种侯选方法是彻底去除病毒的核心组 分而仅保留对于病毒复制所必需的末端重复序列。“去除的”“取出 (gutted)”或者“非完全去除的”“未取出(gutless)”病毒和存在于293 细胞中的第一代辅助病毒能够形成高滴度的病毒，但很难从辅助病毒 中分离“去除的”病毒载体。
在鉴定候选基因调节因子(moieties)方面，腺病毒载体具有优 于其他基因治疗载体系统的，其原因如下：
腺病毒是双链DNA无包膜的病毒，能够在体内外转导很多类型的 人源或者非人源的细胞。这些细胞包括呼吸道上皮细胞、肝细胞、肌 细胞、心肌细胞、滑膜细胞、乳腺上皮细胞和有丝分裂后终端分化细 胞，比如神经元。
腺病毒载体也能转导非分裂细胞。这对于诸如囊性纤维化之类的 疾病非常重要，在这些囊性纤维化疾病中，肺上皮中受感染细胞具有 低周转速度。事实上，正进行利用腺病毒介导囊性纤维化转运(CFTR) 方法导入囊性纤维化成年患者肺部的试验。
病毒或者腺病毒基因组中的外源基因表达不需要一种复制型的细 胞。腺病毒载体通过受体介导的胞饮作用进入细胞。一旦进入细胞内， 腺病毒载体就很少整合入宿主染色体。腺病毒载体以线性基因组游离 于(不依赖于宿主基因组)宿主细胞核中行使功能。因此，重组腺病 毒的使用可以减少基因随机整合进入宿主基因组的问题。
根据本发明的许多方面可以使用痘病毒载体，由于大的DNA片段 易于被克隆到痘病毒基因中，并且已有重组减毒的牛痘突变体的文献 报道(Meyer等，1991，J.Gen Virol.72：1031-1038，Smith和Moss 1983 Gene，25：21-28)。
痘病毒载体例如但不局限于兔痘病毒Upton等，J.Virology 60：920 (1986)(shope纤维瘤病毒)；羊痘病毒属Gershon等J.Gen Virol.70： 525(1989)(肯亚绵羊-1)；正痘病毒属：Weir等J.Virology 46： 530(1983)(牛痘)；Esposito等，Virology 135：561(1984)(猴 痘和天花病毒)；Hruby等，PNAS，80：3411(1983)(牛痘)；Kilpatrick 等Virology 143：399(1985)(Yaba猴肿瘤病毒)；禽痘病毒：Binns 等，J.Gen Virol.69：1275(1988)(禽痘)；Boyle等，Virology 156： 355(1987)(禽痘)；Schnitzlein等J.Virological Method，20：341 (1988)(禽痘，鹌鹑痘)；昆虫痘(Lytvyn等，J.Gen Virol.73：3235-3240 (1992)。
痘病毒在真核细胞中被广泛地用作目的基因的表达载体。具体地 说，它们在多种宿主细胞中易于克隆和繁殖的特征导致痘病毒载体广 泛应用于表达外源蛋白的载体和传送疫苗抗原的工具(Moss，B.1991， Science，252：1662-7)。
根据本发明一些方面所使用的痘病毒包括但不仅限于重组痘病毒 载体，例如禽痘病毒(FPV)、昆虫痘病毒；牛痘病毒，例如NYVAC、 金丝雀痘病毒，MVA或者其他非复制病毒载体系统，如WO 95/30018 中所描述的例子。还描述了至少一种免疫逃避基因缺失了的痘病毒载 体(参见WO 00/29428)。
如上所示，本发明的方法中使用的核苷酸序列插入载体中并通过 操作与控制序列相连结，而控制序列通过宿主细胞可表达编码序列， 也就是说载体是一表达载体。重组宿主细胞产生的NOI可以被分泌或 者保存在细胞内，这取决于所使用的序列和/或载体。
异源基因NOI可以是一个野生型基因的任意一种等位变体，或者 可以是一种变突基因。“基因”意思是包括至少能被转录的核苷酸序 列。因此，编码mRNA、tRNA、和rRNA的序列包括在这个定义之中。 相对于启动子这些序列可以位于正义或者反义链中。根据人们熟知的 技术反义结构来抑制细胞中的某一基因的表达。例如，核苷酸可以是 核糖核酸(RNA)或者脱氧核糖核酸(DNA)或者它们的任意类似 物。编码mRNA的序列可以选择性地包括一部分或者所有的5’和/或者 3’转录但不被翻译的旁侧序列，或相反，和能翻译的编码序列相连接。 它可以进一步选择性地包括与转录序列相关的转录控制序列，例如转 录中止信号、多聚腺苷酸化位点和下游增强子元件。核酸可以包括 cDNA或者基因组DNA(可以包含内含子)。然而，通常指的是使用 cDNA，因为它不需要去除内含子并可以高效表达。
合适的NOI编码序列包括那些治疗性的和/或者诊断性的应用，例 如但不局限于编码细胞因子、趋化因子、激素、抗体、工程化的免疫 球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、酶、免疫共刺激分子、免疫调 节分子、反义RNA、靶蛋白的阴性突变体、毒素、引起条件反应的 毒素(conditional toxin)、抗原、肿瘤抑制因子蛋白和生长因子、膜 蛋白、血管活化(vasoactive)蛋白和多肽、抗病毒蛋白和核酶及其 衍生物(例如设有一个相关的报道基团)。这些编码序列可以通过操 作与合适的启动子相连。该启动子可以是使核酶表达的启动子，或者 是另一个或多个不同的启动子。
本发明中使用的用于治疗和预防癌症的NOIs包括NOIs编码蛋 白。这些蛋白质破坏靶细胞(例如一种核糖体毒素)，作为肿瘤抑制 因子(例如野生型p53)、抗肿瘤免疫机制的活化因子(例如细胞因 子、协同刺激分子和免疫球蛋白)、血管生成抑制剂；或者这些蛋白 质提高药物的敏感性(例如前药活化酶)，通过体内效应细胞间接刺 激靶细胞的破坏(例如，强抗原刺激免疫系统或者转变一种前体细胞 成分成为毒性物质从而破坏靶细胞(例如一种前药激活酶))。编码 蛋白也能破坏静止肿瘤细胞(例如利用分泌的抗肿瘤抗体-核糖体毒 素融合蛋白)，编码蛋白间接刺激静止肿瘤细胞的破坏(例如细胞因 子刺激免疫系统或者促凝血蛋白引起局部血管阻塞)或者转变一种前 体细胞成分成为毒性物质从而破坏静止肿瘤细胞(例如活化前药成为 可扩散药物的酶)。
NOIs可以用于编码反义转录本或者干扰肿瘤生存所必需的基因表 达的核酶(例如干扰伯基特淋巴瘤myc的异常转录或者干扰慢性髓样 淋巴瘤bcr-abl的转录)。也观察了这些NOIs的联合使用。
关于治疗性基因性质的更详细资料参见WO95/21927和 WO98/15294。
用于治疗或者预防缺血性心脏病的NOIs包括编码血纤维蛋白溶酶 原活化因子的NOIs。用于治疗和预防风湿性关节炎和脑型疟的NOIs 包括编码抗炎蛋白、作用于肿瘤坏死因子(TNF)α的抗体和抗粘附 分子(例如抗体分子或者粘附分子的特异性受体)的基因。
用于治疗缺氧的NOIs的例子可参见WO95/21927。
NOI编码序列可以编码融合蛋白或者一编码序列中的一个片段。
作为在靶组织中选择性表达的可替换方案，或者与之同时进行的 方案，NOI或者NOIs可以编码前药激活酶或者酶，如果不用一种或多 种作用于一种酶或多种酶的前药对个体进行处理，这些酶就没有重要 作用或有害效应。在存在活化NOI的情况下，对患者进行适当的前药 治疗可以降低肿瘤生长或者存活。
前药激活酶可以在肿瘤位点释放进行癌症治疗。在每个病例中， 一种合适的前药与合适的前药活化酶联合用于患者治疗。合适的前药 通过和载体连接进行给药。举例来说，前药包括依托泊甙磷酸盐(和 碱性磷酸酶联合)、5-氟胞嘧啶(和胞嘧啶脱氨酶联合)、阿霉素-N- 对羟基酚乙酰胺(和青霉素-V-酰胺酶联合)、对-N-二(2-氯乙烯基) 氨基苯甲酰谷氨酰胺(和羧肽酶G2联合)、头孢菌素氮芥氨基甲酸 盐(和β-内酰胺酶联合)、SR4233(和P450还原酶联合)、更昔洛韦 (ganciclovir，和HSV胸腺嘧啶激酶联合)；芥子气(mastard)前药 和硝基还原酶联合；以及环磷酰胺(和P450联合)。
举例来说，本发明使用的合适前药活化酶包括激活5-氟尿嘧啶 前药capcetabine和furtulon的胸腺嘧啶磷酸化酶；来自单纯疱疹病毒的 激活更昔洛韦的胸腺嘧啶激酶；激活前药环磷酰胺成为DNA破坏物 的细胞色素P450；和激活5-氟胞嘧啶的胞嘧啶脱氨酶。优选使用人 源性的酶。
用于治疗或预防缺血性心脏病的合适NOIs包括编码血纤维蛋白溶 酶原活化因子的NOIs。用于治疗或预防风湿性关节炎或者脑型疟疾 的合适NOIs包括编码抗炎蛋白、作用于肿瘤坏死因子(TNF)α的 抗体和抗粘附分子(例如抗体分子或者粘附分子的特异性受体)的基 因。
NOIs编码的表达产物可以是细胞分泌的蛋白质。作为可替代方 案，NOI表达产物不分泌而在细胞内活化。在任一种情况下，优选NOI 表达产物显示一种旁观效应或者一种远端旁观效应；即细胞中形成的 表达产物导致邻近的或者远端的(如转移的)的细胞死亡，这些细胞 都具有一种共有的表型。
诸如编码细胞因子的NOIs可以应用于巨噬细胞或者其他造血细 胞。这些细胞因子引起含有治疗性NOI的造血干细胞后续分化 (HSCs)。合适的细胞因子和生长因子包括但不仅限于：ApoE、 Apo-SAA、BDNF、Cardiotrophin-1、EGF、ENA-78、Eotaxin、Eotaxin-2、 Exodus-2、FGF-酸性、FGF-碱性、纤维原细胞生长因子-10、FLT3配 体、Fractalkine(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、胰岛 素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8(72a.a.)、IL-8(77a.a.)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、 IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素α、抑制素β、IP-10、 角化细胞生长因子-2(KGF-2)、KGF、Leptin、LIF、淋巴毒素、Mullerian 抑制物、单核集落抑制因子、单核细胞趋化蛋白、M-CSF、MDC(67 a.a.)、MDC(69a.a.)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC (67a.a.)、MDC(69a.a.)、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3 β、MIP-4、骨髓原祖抑制因子-1(MPIF-1)、NAP-2、Neurturin、神 经生长因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制瘤素M、PDGF-AA、PDGF- AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、 干细胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、 肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNIL-1、TPO、VEGF、GCP-2、 GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ和HCC1。
对于一些应用，优选一些细胞因子联合作用。具体地说，包括 IL-3、IL-6和CSF联合应用以维持和扩充干细胞数。对于体外分化， 可以增加诸如如GM-CSF和G-CSF细胞因子诱导巨噬细胞分化，或 者增加GM-CSF和G-CSF来获得中性粒细胞。当来自患者的工程化 细胞再次导入患者体内，然后患者的自身机制允许这些细胞或者分化 的细胞后代迁移进入到诸如肿瘤侵袭的区域，。
作为可替代方案，另一种NOI可以是自杀基因，在外源物质存在 情况下该基因表达导致转染或者转导的细胞破坏。自杀基因的一个例 子包括单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSVtk)，能够杀死更昔洛韦治 疗后的被感染的细胞和静止细胞。
作为可替代方案，另一种NOI可以是一种靶蛋白(例如干细胞因 子受体的抗体(WO-A-92、17505；WO-A-9221766))。举例来 说，重组体(ecotropic)逆转录病毒显示一种存在于HSCs(例如CD34 或者干细胞因子)表面的受体抗体(或者生长因子或者多肽)，这种 抗体可以通过体外病毒和骨髓共孵育或者通过静脉注射病毒运输进入 这些细胞。
NOIs也可以包括标记基因(例如编码β-半乳糖苷酶或者绿色荧 光蛋白的基因)、或者调节其他基因表达的基因。此外，NOIs可以 包括编码融合蛋白伴侣(partners)的序列并与编码目的蛋白的序列 形成一个通读框。融合蛋白配体的例子包括GAL4、6xHis和β-半乳 糖苷酶的DNA结合或者转录激活域。增加NOIs编码的靶蛋白的靶序 列可以使表达的融合蛋白定位于特定的细胞结构或者进入分泌途径。 这样的靶序列已经在该领域被广泛地被描述。
在一个实施方案中，根据本发明至少一种NOI通过操作与细菌 HRE元件相连接并编码诸如FNR的氧感应细菌转录调节蛋白。这样的 构建体在缺氧时可以提供一个自身调节系统，由HRE构建体表达的细 菌转录调节蛋白将增加和进一步增加HRE构建体的转录和其他HRE构 建体的转录。
在一优选的实施方案中，NOI编码核酶。核酶是RNA分子，可以 在细胞内催化特定的化学反应且不需要特别的蛋白质参与。举例来 说，I型核酶以内含子的形式存在，能够调节自身剪切前体RNA的剪 切。其他核酶衍生于自身剪接RNA结构，它们是病毒RNA分子的复 制必需的。象蛋白质酶一样，核酶可以折叠成二级和三级结构并形成 底物和诸如金属离子辅因子的特异结合位点。这些结构的例子包括锤 头结构、发卡或者茎环、假结体(pseudoknot)和已描述过肝炎δ抗基 因组核酶。
每种核酶含有一个识别和结合靶RNA识别位点的基元(motif)。该 基元形成以一种或者多种“结合臂”但通常形成两种“结合臂”。锤 头状核酶中结合臂是螺旋I和螺旋III的旁侧序列，螺旋I和螺旋III与 螺旋II相邻。结合臂长度可以变化，通常在6-10个核苷酸之间，但 也可以更短或者更长。
旁侧序列的长度能够影响剪切的速度。举例来说，已发现旁侧序 列核苷酸总数从20个降低到12个能增加核酶剪切HIV序列的的周转速 度(turnover rate)达10倍(Goodchild JVK，1991 Arch Biochem Biophys 284：386-391)。锤头状核酶的螺旋II中催化基元在一个称作剪切位 点的区域剪切靶RNA。对一个含有合适剪切位点的核酶来说，核酶 是否会剪切任意的给定RNA取决于核酶的识别位点存在与否。
每个类型核酶识别自身的剪切位点。锤头状核酶的剪切位点含有 位于其上游的核苷酸碱基三联体GUX，其中G是鸟嘌呤，U是尿嘧啶， X是任意的核苷酸碱基。发卡状核酶含有BCUGNYR的剪切位点，其 中B是除腺嘌呤外任意的的核苷酸碱基，N是任意核苷酸，Y是胞嘧 啶或者胸腺嘧啶，R是鸟嘌呤或者腺嘌呤。发卡核酶的剪切发生于剪 切位点中的G和N之间。
关于核酶更详细的描述参见“分子生物学和生物技术”(Ed.RA Meyers，1995，VCH出版社，831-8320页和“逆转录病毒”(Ed.JM Coffin等，1997，冷泉港实验室出版，683页)。
核酶可以在所有细胞中诱导表达，但仅在靶基因转录本存在的细 胞中起作用。
作为替代直接抑制组分结合的选择方案，该组分可以抑制一个发 明多肽的生物可利用量。举例来说，这可以通过在转录水平、转录本 稳定性、翻译或者翻译后稳定性抑制该组分的表达。举例来说这种物 质的可以是抑制mRNA生物合成的反义RNA或者双链干扰RNA序列。
在另一优选的实施方案中，NOI包括一种siRNA。双链RNA (dsRNA)介导的转录后基因沉默(PTGS)是一种保守的细胞内保 护机制，可以控制外源基因的表达。转座子元件或者病毒的随机整合 引起dsRNA表达，dsRNA激活序列特异性的同源单链mRNA的降解或 者病毒基因组RNA的降解。沉默作用是大家知道的RNA干扰 (RNAi)。RNAi的机制涉及长dsRNAs加工成为21～25个核苷酸(nt) RNAs复合体的过程。这些产物称为小干扰或者沉默RNAs (siRNAs)，siRNAs是序列特异性的mRNA降解调节子。在不同的 哺乳动物细胞中，已发现大于30bp dsRNA激活干扰素应答反应，这 导致蛋白合成中止和非特异性mRNA降解(Stark等1998)。然而， 能用21nt的siRNA复合体激活该应答反应(Elbashir等2001年， Hutvagner等2001年)，可在培养的哺乳动物细胞中用于基因的功能 分析。
在一实施方案中，一种诸如U6的RNA聚合酶III启动子的活性受 四环素调节，可用于调节siRNA的表达(Ohkawa等，2000)。
在另一实施方案中，NOI包括一种微型RNA。微型RNAs是生物 体自身的一个大家族的小RNAs，至少某些微型RNA调节靶基因的表 达。微型RNA家族的组成成员是let-7和lin-4。Let-7基因编码小的、高 度保守的RNA种类，在蠕虫发育过程中调节内源性蛋白编码基因的 表达。活化的RNA种类开始被转录成～70nt的前体，在转录后加工形 成成熟的～21nt的形式。Let-7和lin-4被转录成为发卡RNA前体，RNA 前体在Dicer酶的作用下形成成熟的形式(Lagos-Quintana等，2001 年)。
在一个进一步的实施方案中，NOI包括一个以发卡形式存在的双 链干扰RNA。短发卡可以由诸如U6的简单启动子启始表达。在另一 备选实施方案中，有效的RNAi可以通过合并的两个U6启动子介导调 节，其中一种表达正义链区，另一种表达该靶序列的同一序列的反向 互补序列。这在实例9中有描述。在一个进一步的实施方案中，可以 通过使用两个反向的的启动子从表达盒的正向链和互补链转录靶序列 的正义和反义区来介导有效的或者双链干扰RNA。这些实施方案将 在实例9中进一步描述。
在另一实施方案中，NOI可以编码短RNA，可以改变剪接方向(外 显子跳跃)或者多腺苷酸化或者抑制翻译。在肌肉萎缩症的病例中， 与没有破坏翻译阅读框(Becker肌肉萎缩症)相比，肌营养不良蛋白 (dystrophin)基因的移码突变导致严重的Duchenne肌肉萎缩症 (DMD)。已发现诱导外显子46跳跃的反义序列能有效地修复DMD 患者肌细胞中的内源性肌营养不良蛋白基因的表达(van Deutekom等 2001)。通过反义寡核苷酸靶向结合到E-选择素的3’腺苷酸化位点改 变其隐含的上游位点的多聚腺苷酸化作用，由此产生含有少数不稳定 序列的转录本，从而增加mRNA稳定性和改变蛋白质表达(Vickers等 2001年)。用这样的方法，反义序列可用于增加mRNA的丰度。也能 够通过反义寡核苷酸靶向结合到至关紧要的翻译启始位点，在此情况 下mRNA丰度增加但蛋白质水平下降。
NOI通常可受一种启动子或一种启动子和增强子表达调节元件的 表达控制。增强子和/或者启动子在缺氧或者缺血或者低糖环境可以 优选活化；于是NOI在诸如肿瘤、风湿性关节或者其他缺血部位的特 定靶组织中优选表达。因此，可以减少或者去除NOI对接受治疗的患 者的重要生物作用或者有害作用。赋与调节作用的的增强子元件或者 其它元件可以存在多个拷贝。同样或除此之外，增强子和/或者启动 子可以优选激活一种或多种特异的细胞种类——例如巨噬细胞、内皮 细胞或者这两种细胞中的一种或多种细胞。更多的例子包括呼吸道上 皮细胞、肝细胞、肌细胞、心肌细胞、滑膜细胞、乳腺上皮细胞和诸 如巨噬细胞和神经元的有丝分裂后末期分化的非复制细胞。
“可操纵性连接”意思是所描述的成分以其预期的方式在一定的 相互关系中行使功能。一个文库中所包含的一种调节序列通过“可操 纵性连接”与一种报道序列连接，在与对照序列相同的条件下核酸报 道序列得以表达。
“启动子”使用了该领域的标准含义。举例来说，即是Jacob- Monod基因表达理论中的RNA聚合酶结合位点。
“增强子”是指除转录起始复合物之外的其它蛋白组分所结合的 一个DNA序列，可促进其相关的启动子控制的起始转录。
在原代靶细胞中，在生成二级运输系统的条件下，编码二级传输 系统之翻译单位的启动子和增强子组成的转录单元优选具有强活性， 或者能够强诱导。启动子和/或者增强子活性可以组成性生效，或者 受组织特异性限制或者时间限制。举例来说，时间限制性的启动子/ 增强子是那些缺血和/或者缺氧反应的应答元件，诸如缺氧应答元件 或者grp78或grp94基因的启动子或者增强子。一种优选使用的启动子- 增强子组合是人巨细胞病毒(hCMV)主要立即早期(MIE)启动子/增 强子组合。
在一优选的实施方案中，诸如CMV的强组成启动子或者诸如PGK 的管家基因启动子和Tet-调节系统的组合使用可用于控制基因表达。 除了Tet系统以外，其它的可诱导系统包括金属硫蛋白、hsp68、lacZ、 SV40 T抗原系统。
可通过两个转基因系使用反式活化因子，一个是在启动子“a” 控制下表达NOI的转基因系，另一个是表达启动子“a”的反式作用 因子“b”的转基因系。
在另一个实施方案中，所使用的是FLP重组酶系统。在组合的情 况下，无活性的转基因通过酵母FLP重组酶介导转变为活性形式。在 本方案中也可以使用噬菌体Pl Cre重组酶系统，该系统能使基因在特 定的细胞或者组织和在生物发育的特定阶段沉默。
应用诸如β-肌动蛋白、鼠金属硫蛋白、HMGCR和组蛋白H4管 家基因的启动子可以获得通用的表达系统。
本发明的优选启动子是组织特异性启动子。即它们能控制NOI在 一种组织中转录而在其它组织中很大程度上保持“沉默”。
“组织特异性”指的是一种启动子，其活性并不仅限于单一的组 织类型，而是表现出选择性，即在一些组织中活化、其他一些组织中 活化较低或沉默的。
由特定的启动子控制的NOI表达水平可以通过操纵启动子区域来 调节。举例来说，启动子区域内的不同结构具有不同的基因调节活性。 这些不同区域的活性可用含有不同突变体的载体构建体有代表性地评 估，而这些突变体则含有缺失特定区域的启动子(即缺失分析)。举 例来说，该方法可用于鉴定组成启动子组织特异性的最小区域。
在本发明的实际应用中，以上所述的许多组织特异性启动子非常 有用。在多数实例中，这些启动子可易于酶解为适于克隆到侯选载体 中的限制性内切酶消化片段。可替代的方法是利用聚合酶链反应扩增 得到启动子片段。通过在引物5’端引入限制酶切位点是扩增片段易于 克隆。
适于心脏特异性表达的启动子包括衍生于鼠心脏α-肌球蛋白重 链(MHC)基因的启动子。适于血管内皮细胞特异性启动子包括Et-1启 动子和von Willebrand因子启动子。
适于前列腺特异性表达的启动子包括腺血管舒缓素-1(hklk2) 基因和前列腺特异性抗原(hklk3)的5’旁侧序列。
细胞特异性的启动子/增强子的例子包括诸如CSF-1启动子-增强子 的巨噬细胞特异性启动子或者增强子或者衍生于甘露糖受体基因启动 子-增强子的元件(Rouleux等1994 Exp Cell Res 214：113-119)。在 可替代的方法中，可使用优选在中性粒细胞中活化的启动子或者增强 子元件，或者一种诸如IL-2基因增强子的淋巴特异性增强子。
此外，NOI可利用一个或多个具有发育调节表达作用的序列控 制。NOIs可在转基因生物体或其后代的发育过程中的一个特定阶段 激活。
适应酶可以调节NOI转录。NOI和适应酶的连接可以激活转录本 的剪切，从剪切的转录本中释放NOI使其得以表达。在一个优选的实 施方案中，从包含siRNA、短发卡RNA、微RNA和反义RNA的群体中 选择NOI。举例来说，在短发卡编码的siRNA 5’引入适应酶能够控制 转录本自身剪切的诱导(或抑制)，短发卡能与适应酶结构分离，由 此而激活沉默。适应体(aptamer)的特异性配体可以体外提供、体内表 达或者从同一个载体表达获得。举例来说，一种表达受缺氧反应元件 (HRE)控制表达的蛋白质配体仅在缺氧条件下才合成，如果这能激 活适应酶的剪切反应，释放一个靶向结合血管内皮细胞生长因子 (VEGF)的短发卡结构，那么VEGF的表达在缺氧条件将被特异性 地下调。这将有助于治疗包括增殖性糖尿病性视网膜炎在内的一系列 疾病。在可替代的方法中，适应体的配体可以是VEGF本身。
在本发明的另一个方面中，适应酶诱导的剪切可以直接调节一种 NOI的表达。根据本发明，适应酶的使用包含了NOI的转录后调节。 通过增加或者消除能诱导转录本剪切的合适配体，适应酶可以被激活 (或者抑制)，因此NOI的表达受抑制。举例来说，适应酶可以在转 录本中编码甲硫氨酸的密码子处剪切，或者剪切转录本的UTR，这导 致转录本缺乏cap和/或者多聚腺嘌呤尾，随后转录本在翻译前将被降 解。
如果诸如因子IX之类的治疗基因水平太高，这提供了一种阻断 NOI合成的方法。转基因的表达可用这样的方式进行工程化的自身调 节。举例来说，可以设计成适应酶的活性是受葡萄糖结合的调节，因 此仅当高血糖水平时才可能高水平表达胰岛素。如果血糖水平下降 到临界值，随后适应酶被活化，胰岛素转基因转录本降解。一种受强 力霉素调节的适应酶可通过给予强力霉素调节NOIs体内和体外的表 达。
Tet调节系统可以用于控制适应酶的表达，提供更水平的控制。 当强力霉素消除时，在Tet抑制蛋白存在的条件下Tet操纵子序列插入 到启动子的下游可抑制转录，从而抑制重新转录。因为在强力霉素消 除时适应酶是活化的，任何存在的转录本将被剪切和破坏。
转基因敲除小鼠技术的发展极其有助于基因功能的研究，这和基 因疾病的哺乳动物模型有着特殊的相关性。然而，当前的技术限制于 某些病例。举例来说，具有重要医学的许多基因是生存所必需的。在 这样的病例中，小生命在胚胎发育过程中或者出生后死亡。本发明提 供了敲除调节性基因的有效的转基因方法，目的蛋白的产生可以是生 命体停止在特定的发育阶段，促进了成年哺乳动物疾病模型的建立。 然后转基因生物能够利用一种或者多种表型进行筛选。常用的表型筛 选方法包括眼底照相术、血压、行为分析、X射线荧光镜透视检查、 双能量X射线吸收比色法(DEXA)、CAT扫描、全血计数(CBC)、 尿液分析、血压化学、胰岛素水平、葡萄糖耐受量、荧光活化细胞分 选(FACS)、组织病理学、表达数据和发育生物学。本发明的方法 在时序基因调节有益的许多领域以及验证基因组计划中的假定药物靶 点方面将有着广泛的应用。
本发明可以用于调节和人类疾病相关的基因表达。一个并非穷举 的基因列表如下所示(包括基因的同源物)：
和癌症相关的基因包括但不仅限于Cdh3、Ncam、Akp2、Asgr2、 Bax、Bmp4、Ccnd1、Cd38、Cdc37、Cdkn1a、Cdkn1b、Cdkn1c、Csk、 Epas1、Fgf2、Grpr、HBV、Igf1、Inhbb、Inpp5d、IRS1、Itga5、Kcna1、 lacZ、Map2k4、Mdm2、Njkbia、Ngfb、Oxt、Pemt、Plp、Shh、Src、 Stat5a、Tcfap2a、Trp53、Blmh、Cd152、Cmkar2、Cmkbr5、Csf1、 Csf3、Egfr、Gzmb、Ifng、Ifngr、IGFBP3、Il1r1、Il1rap、Il2、Il2ra、 Il2rb、Il2rg、Il4、Il4ra、Il5、Il6、Il7r、Il10、Il12a、Il12b、Il12rb1、 Il12rb2、IRS1、Kdr、Lifr、Lta、Ncam、Ntf3、Ntf5、Ntrk1、Ntrk2、 Ntrk3、Ph、Prlr、Scya3、Smst、Tgfa、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Tnf、 Tnfrsf1a、Tnfrsf1b、Tnfrsf5、Apc、Prkdc、TAg、Amh、Kit、Kit1、 Ter、Fech、hr、Atm、E2f1、Hoxl1、Apc、Cdh3、Erbb2、Hras、Met、 Notch4、PIP、PyVT、Tag、Wnt1、Madh3、Nf1、Ptch、Rb1、Odc、 Bcl3、Fos、Fyn、Jun、Kras2、luc、Mos、Myc、Rab3a、Rela、Yes、 Cd44、Mgmt、Plg、Ahr、Pgy2、Rag1、Btk、Igh-6、Jak3、Tcra、Tcrb、 Tcrd、Ttp53、Ttpa、Vhlh和Wt1。
和糖尿病、肥胖症相关的基因包括但不仅限于Ins2、Ins1、H2-Ea、 H2-Ab1、Ifng、Prkdc、B2m、Rag1、Lep、Lepr、Cpe、Gck、Irs1、Irs2、 Irs3、Irs4、Slc2a1、Cre、Dgat、tub、Pcsk2、Insr、Nos1、Nos3、Tnf、 B2m、Thy1、Pomc、Ppara和Csf2。
和心血管系统疾病相关的基因包括但不仅限于Acact、Alox15、 Apoa2、Apob、Apoe、Ath1r、Cdkn1a、Cyp7a1、Epas1、Lcat、Ld1r、 Pemt、Soat1、fld、hr、Ace、Adra1b、Adrb2、Adrbk1、Anx6、Atp7a、 Cdh2、Evi1、Fn1、Gja1、Itga4、Jup、Kif3a，Nf1，Nos3，Nppa，Thra，Vcam1， Wt1，Agt，Bdkrb2，Bmp4，Drd3，Kcna1，Npr3，Ren，Apoc1，Apoc2，Apoc3， Apoa1，Cetp，Hp1，Lipc，Srb1，Adra2a，Agtr1a，Fgf2，Tnf，Asgr2，Lrpap1， Vld1r，Col3a1和Plg。
和内分泌系统疾病相关的基因包括但不仅限于Cpe、fld、Insr、 Lep、Lepr、tub、Acact、acd、Cacnb4、Crh、Foxn1、gl、Bmp4、Csf1、 dwg、fsn、Hcph、Kit、Kit1、Mitf、oc、Phex、Prlr、Sparc、Grpr、 Amh、Ar、Cga、Fshb、jsd、Ghrhr、Hmgic、Myo5a、Nr5a1、Oxt、 p、Pit1、Prop1、Smst、Agt、Igf1、Gck、Pcsk2、Egfr、Foxn1、Mc1r、 Tgfa、Thrb、Tshr和Ttr。
和凋亡相关的基因包括但不仅限于Fas、Ngfr、Tnfrsf1a、Tnfrsf1b、 Bax、Bcl2、E2f1、Mdm2、Pcc、Rb1、Trp53、Bdnf、Fas1、Gzmb、 Ntf3、Nt5、Pfp、Tag和Tnf。
和免疫、炎症相关的基因包括但不仅限于Cd1、Cd3e、Cd3z、Cd4、 Cd44、Cd5、Cd8a、Cd8b、Cd14、Cd152、Cd28、Cd38、Fcer1g、Fcgr2a、 Fcgr2b、Fcgr3、Gpi1、H2-Aa、H2-DMa、H2-Eb1、H2-Eb2、H2、Hc、 Icam1、Igh-1、Igh-5、Igh、Igk-C、Igl-1、Igl-5、Itga4、Itga5、Itgb2、 Itgp、Lyst、Mar1、Ncam、PCC、Pep3、Ptprc、Ptprcap、PVR、Sele、 Sell、Selp、Spn、Tapbh、Tcra、Tcrb、Tcrd、Thy1、Tlx1、Tnfrsf5、 Tnfrsf6、Tnfsf5、Bmp4、Cmkar2、Cmkbr5、Csf1、Csf3、Egfr、Gzmb、 Ifng、Ifngr、Il1r1、Il1rap、Il2、Il2ra、Il2rb、Il2rg、Il4、Il4ra、Il5、 Il6、Il7r、Il10、Il12a、Il12b、Il12rb1、Il12rb2、Il15ra、Irs1、Itgb7、 Kdr、Kitl、Lifr、Lta、Map2k4、Ntf3、Ntf5、Ntrk1、Ntrk3、Ph、Scya3、 Smst、Tgfa、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Tnf、Tnfrsf1a、Tnfrsf1b、A、 Atm、C3、C4、Cacnb4、Cd80、Cd86、Dh、Dsg3、Eef1a2、gl、hr、 Lama2、Lbp、Lep、Lepr、Mitf、Pit1、Prop1、Scn8a、Abcb2、Ada、 B2m、Bcl2、Bcl3、Btk、C2ta、Foxn1、H2-Ab1、Hcph、Igh-6、Igh- J、Ii、Jak3、Kit、Lck、Ltb、Lyn、Njkb1、Nfkbia、Pfp、Pnlliprp2、 Prkdc、Ptprcap、Rag1、Relb、Stat4、Stat6、Tlr4、Alox5、Alox5ap、 Alox15、Bdkrb2、Blmh、Bmp6、Cmo、Crh、Nos2、Ptgs2、Vr1、Bax、 E2f1、Inpp5d、Rb1、Stat5a、Trp53、Fyn和Irf1。
和神经生物学相关的基因包括但不仅限于Apoe、Atm、Bdnf、 Cdk5、Chrna7、Cmkar4、Cstb、Gad2、Gfap、Gria2、Grik2、HD、 Hdh、Nos1、Ntf3、Penk-rs、Prkcc、Psen1、Snca、Tnf和Vr1。
除了已描述的治疗基因或者基因和表达调节元件之外，传输系统 可以包括其它的有效遗传元件或者基因的表达调节或者含有启动子/ 增强子、翻译起始信号、内部核糖体进入位点(IRES)、剪切和多 聚腺苷酸化作用信号的基因。可通过结合诸如WPRE的元件来提高表 达水平。
根据本发明，通过运输系统运输的一个或者多个或者更多的治疗 基因可以单独使用，也可以结合其他治疗或者其他治疗成分共同使 用。在进一步优选的实施方案中，本发明第一个方面是一个或者多个 靶核苷酸序列(NOI)导入到载体的克隆位点。这样的治疗基因可以 由逆转录病毒LTR中的启动子启始表达，或者由导入克隆位点靶基因 内在的启动子启始表达。
举例来说，本发明的运输系统可以用于传输一个或者多个NOI (s)，有助于治疗在WO98/05635中列出的疾病。为了便于参考，现 在提供部分列表：癌症、炎症或炎症疾病、皮肤疾病、发烧、心血管 效应、出血、凝固和急性阶段反应、恶病质、厌食症、急性感染、HIV 感染、休克、移植排斥反应、自身免疫疾病、再灌注损伤、脑膜炎、 偏头痛、阿司匹林依赖性抗血栓，肿瘤生长、侵袭和扩散、血管再生、 转移、恶化、腹水和恶性胸膜渗出；大脑缺血、缺血性心脏病、骨关 节炎、风湿性关节炎、骨质疏松、哮喘、多发性硬化症、神经退变 (neurodegenration)、老年痴呆、动脉粥样硬化、中风、脉管炎、克罗 恩氏病和溃疡性结肠炎；牙周炎、牙龈炎；牛皮癣、过敏性皮炎、慢 性溃疡、大疱性表皮松解症；角膜溃疡、视网膜病和外科伤口愈合； 鼻炎、过敏性结膜炎、湿疹、过敏反应；再狭窄、充血性心力衰竭、 子宫内膜异位、动脉粥样硬化或内膜硬化。
除此之外还有，或者作为一个替代方案，本发明的运输系统可以 用于传输一个或者多个NOI(s)，有助于治疗在WO98/07859中列出 的疾病。为了便于参考，现在提供部分列表：细胞因子和细胞增值/ 分化活性；免疫抑制剂或者免疫活化(举例来说，治疗免疫缺陷包括 HIV病毒的感染；淋巴细胞生长的调节；治疗癌症和许多自身免疫疾 病，以及抑制移植排斥或者诱导肿瘤免疫)；造血作用调节，举例来 说，骨髓疾病的治疗或者淋巴疾病的治疗；促进骨、软骨、跟腱、韧 带和神经组织的生长，举例来说，用于治愈创伤、治疗烧伤、溃疡和 牙周疾病和神经退变；卵泡刺激激素的抑制或者活化(受精能力调 节)；趋化性/趋化动力学(chemotactic/chemokinetic)(举例来说，动 员特异性细胞迁移到受损伤或者感染部位)；止血和溶解血栓的活性 (举例来说，用于治疗血友病和中风)；抗炎活性(举例来说，用于 治疗败血病休克或者克罗恩氏病)；用作抗菌剂；诸如新陈代谢或者 行为的调节子；用作止痛剂；治疗特异性缺陷疾病；用于牛皮癣治疗， 用作人类或者兽医的药。
除此之外还有，或者作为一个替代方案，本发明的运输系统可以 用于传输一个或者多个NOI(s)，有助于治疗在WO98/09985中列出 的疾病。为了便于参考，现在提供部分列表：巨噬细胞抑制的和/或 者T细胞抑制的活性和抗炎活性；抗免疫活性，举例来说，对细胞和/ 或者体液免疫应答的抑制效应，包括和炎症无关的应答；抑制巨噬细 胞活性和T细胞黏附于细胞外基质成分和连接蛋白，以及上调T细胞 的fas受体表达；抑制有害的免疫反应和包括风湿性关节炎在内的关 节炎炎症、与超敏性相关的炎症、过敏反应、哮喘、系统性红斑狼疮、 胶原疾病和其他自身免疫疾病、与动脉粥样硬化相关的炎症、动脉 粥样硬化、动脉粥样硬化性的心脏病、再灌注损伤、心搏停止、心肌 梗塞、血管炎症疾病、呼吸道窘迫综合症或者其它与心肺有关的疾病、 和消化性溃疡相关的炎症、溃疡性结肠炎和其他胃肠道疾病、肝纤维 化、肝硬化或者其他肝脏疾病、甲状腺炎或者其他腺体疾病、肾小球 肾炎或者其他肾和泌尿疾病、耳炎或者其他耳鼻咽喉疾病、皮炎或者 其他皮肤病、牙周疾病或者其他牙病、睾丸炎或者其他附睾炎、不育、 orchidal trauma或者其他免疫相关testicular疾病、胎盘功能障碍、胎 盘功能不全、习惯性流产、惊厥、预惊厥和其他免疫和/或炎症相关 妇科疾病、后眼色素层炎、中眼色素层炎、前眼色素层炎、结膜炎、 脉络膜视网膜炎、眼色素层巩膜炎、视神经炎、诸如视网膜炎或者囊 样斑疹水肿的眼球内炎症、交感神经性眼炎、巩膜炎、色素性视网膜 炎，变质样干酪疾病(degenerative fondus)的炎症成分、眼部创伤的炎 症成分、感染引起的眼部炎症、增值性玻璃体-视网膜病变、急性缺 血视神经障碍、诸如青光眼过滤手术后的过度结疤、眼部移植的免疫 和/或者炎症反应和其它免疫和炎症相关眼部疾病、自身免疫相关的 炎症或者病症或者中枢神经系统(CNS)或者其他器官的紊乱、免疫 和/或者有益的炎症抑制、帕金森症、并发症和/或者治疗帕金森病的 不良反应、AIDS-相关痴呆复合症、HIV-相关的脑病、Devic病、 sydenham舞蹈病、Alzheimer病和其他退行性疾病、中枢神经系统的 病症或紊乱、stokes的炎症成分、小儿麻痹后(post-polio)综合症、精 神紊乱的免疫和炎症成分、脊髓炎、脑炎、亚急性致硬化脑炎、脑脊 髓炎、急性神经病、亚急性神经病、慢性神经病、Guillaim-Barre综 合症、sydenham舞蹈病、重症肌无力、大脑假性肿瘤、唐氏综合征、 huntington病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、中枢神经系统压迫或中枢神 经系统创伤或中枢神经系统感染产生的炎症成分、肌萎缩和营养不良 产生的炎症成分以及相关疾病的炎症和免疫、中枢和周围神经系统的 病症或紊乱、创伤后炎症、败血病休克、感染性疾病、外科炎症并发 症或者副作用、骨髓移植或者其他移植并发症和/或副作用、诸如病 毒载体引起基因治疗的炎症和/或免疫并发症和副作用，或者AIDS相 关的炎症，限制或抑制体液和/或者细胞免疫应答，通过降低单核细 胞和淋巴细胞数治疗或改善单核细胞或诸如白血病的白细胞增值病， 预防和/或者治疗在自身或者人造的细胞、组织和器官移植病例中的 移植排斥，这些细胞、组织和器官包括角膜、骨髓、器官、晶体、心 脏起搏器、自身的或者人造的皮肤组织。
本发明的方法所治疗的对象可以是动物受试者。优选的受试者是 哺乳动物，更优选是人。
本发明也提供了一种利用基因疗法治疗患者的药物组合物。本发 明中的这些组合物包括一种有治疗效应的的运输系统，同时可选择性 地包括一种或者多种可以运输的治疗性的和/或者诊断性的NOI(s)。 因为运输系统是一种病毒运送系统，可用一种替代的方法，包括一种 由产生的或同种方式获得的病毒颗粒。药物组合物可用于人或动物。 通常，内科医生将要特地确定适合于每个病人的有效剂量，有效剂量 将随年龄、重量、和特殊个体而改变。
这些组合物可选择性地包括制药上允许的的载体、稀释剂、赋形 剂或者佐剂。可根据给药的具体途径和标准的制药准则选择制药载 体、赋形剂或者稀释剂。药物组合物可以包括载体，或除了载体之外 还可以包括赋形剂或者稀释剂、任何合适的粘合剂、滑润剂、悬浮剂、 包衣成分、增溶剂和其他可帮助或者促进病毒进入靶位点的载体成 分，以上成分可帮助或者促进病毒进入靶位点(如脂质体转染系统)。
根据给药部位，利用一种或多种给药方式施用药物组合物：吸入、 以栓剂或者子宫托的形式、局部性地用药以洗液、溶液、乳剂、软膏 或者扑粉的形式、依靠皮肤贴片(skin patch)、口腔给药以含有诸如淀 粉或者乳糖的赋形剂的片剂形式、或者仅以胶囊或胚珠的形式或者胶 囊或胚珠和赋形剂混合、或者以酏剂(elixirs)、溶液或者含有香味或 色素成分的悬浮液的形式给药，或者可通过诸如腔内 (intracavernosally)、静脉、肌内或者皮下注射给药。对于胃肠道以外 给药，这些成分最好使用包括其它成分的无菌水溶液形式，举例来说， 足够的盐或者单糖能保持溶液和血液等渗。对于口腔或者舌下给药， 这些成分可以片剂或者锭剂(lozenges)的方式给药，锭剂可用常规方 式配制。
根据本发明，通过运输系统运送一个或者多个治疗基因可单独使 用或者与其它治疗或者其它治疗成分组合使用。
本发明中的非灵长类慢病毒载体颗粒是在合适的生产细胞中产生 的。生产细胞通常是哺乳动物细胞，但也可以是昆虫细胞。一种生产 细胞可以是含有病毒结构基因并整合进入其基因组的包装细胞。然 后，编码载体基因组的核苷酸转染包装细胞，从而产生感染性的、复 制缺陷载体的病毒颗粒。作为可替代方案，编码载体基因组和结构成 分的核苷酸序列可共转染生产细胞，和/或者利用一个或多个存在于 诸如质粒、腺病毒载体、疱疹病毒载体上的核苷酸序列可以共转染生 产细胞，或者用已知的方法运送功能DNA进入靶细胞。
本发明的载体，举例来说，本发明中第一方面的慢病毒载体可以 用来运输NOI进入任意的产前细胞(prenatal)。“产前”是指发生或者 出现在出生之前。在一个实施方案中，这个方法用于胚胎期的细胞。 胚胎包括在出生(或者孵化)前早期发育阶段的动物。此处所使用的 术语包括“前胚胎”，也就是卵子受精后、胚胎组织分化前形成的结 构，这包括受精卵和原始胚期。“胚胎”也包括胎儿细胞，也就是位 于发育后期的胚胎细胞。本发明也包含基因转导进入到一种围产期细 胞。“围产期”指的是产前3个月产后大约1个月这一段时间，同时也 包括新生儿阶段。“新生儿”指的是出生后的最初几周。
本发明的一般性载体，举例来说，本发明中第一方面的慢病毒载 体可用于运输NOI进入任意的生殖细胞，这些生殖细胞包括原始生殖 细胞或者能引起生殖细胞系改变的细胞。“生殖细胞”是多细胞生物 体的生殖器官中细胞的总称，多细胞生物体可通过减数分裂产生配 子。“配子”指的是单倍体生殖细胞-卵子和精子。然而，如上所示， 本发明也适用于配子发育细胞和诸如卵巢的配子发生部位的细胞。
现在通过实例，结合哺乳动物将讨论配子发生。慢病毒载体可用 于运输NOI进入到下文所讨论结构中的任何细胞。可预见到非哺乳动 物生物体的相同处理也包括在本发明之中。简而言之，配子发生是二 倍体生殖细胞形成配子(定义为单倍体，n)的过程。精子发生是通 过减数分裂(动物体内，植物体内是有丝分裂)在专门的性腺器官中 (雄性为受试者)形成精细胞的过程，分裂后的细胞经过分化成为精 细胞。卵子发生是通过减数分裂(动物体内，植物配偶体内是有丝分 裂)在专门的卵巢性腺中形成卵子的过程。
在精子发生过程中，精子由雄性生殖细胞精原细胞形成，精原细 胞位于睾丸的生精小管内膜。一个精原细胞通过有丝分裂形成原始精 母细胞，原始精母细胞经过减数分裂的初级分裂形成两个次级精母细 胞。每个次级精母细胞经过第二次有丝分裂形成两个精细胞，精细胞 成熟成为精子。睾丸由很多的生精小管构成，精子发生在生精小管壁 中进行。原始生殖细胞在位于生精小管外部的生殖上皮中生成，当细 胞分化产生子细胞后移行进入小管管腔。所有的这些细胞由邻近的滋 养细胞提供营养和支持。
在卵子发生过程中，卵原细胞分化形成初级卵母细胞，然后经过 第一次减数分裂形成极体和次级卵母细胞。次级卵母细胞成熟后，次 级卵母细胞经过第二次减数分裂形成成熟卵子和二级极体。卵巢含有 许多滤泡，外层的卵泡细胞围绕正在发育的卵细胞形成滤泡。排卵后 卵子移行沿输卵管进入子宫。
可预见到载体可在一个位置施用，但是NOI可能在生物体的其它 细胞中表达或者发挥作用，也就是说给药的位点可以不同于靶细胞。 非灵长类慢病毒载体可以转导的细胞包括上文所列的靶细胞例子。
更优选的是，细胞处于胚胎期，举例来说，位于子宫的细胞，慢 病毒载体可通过脐带、胎盘或者羊水，或者通过腹膜内、肝内途径施 用。慢病毒载体可借助超声波导入。
在本领域中人们熟知的转基因动物是利用ES细胞和其它细胞产生 的，举例来说，以下文献描述了产生转基因动物的方法：鼠胚胎操作， 第二版B.Hogan，R.Beddington，F.Costantini和E.Lacy冷泉港实验 室出版社1994年；转基因动物技术C.Pinkert学术出版社1994； 基因靶向：一种实用的方法A.L.Joyner.牛津大学出版社1995；转 基因动物科学的策略G.M.Monastersky和J.M.Robl.ASM出版社 1995；和小鼠遗传学：理论和应用Lee M.Silver牛津大学出版社 1995。关于这个主题的一本有用的常用参考书是Houdebine转基因动 物-生产和使用(哈佛，1997)——全面地篇综述了从鱼到小鼠和牛 产生转基因动物所应用的技术。
因此，举例来说，本发明准许利用慢病毒侵染使异种DNA导入哺 乳动物的受精卵。在一个实施方案中，从捐赠母亲体内收集处于单细 胞期的受精卵，被转导的细胞转移到代孕母亲体内。在单细胞期发生 整合才产生真正的转基因生物，也就是说，包括生殖细胞都发生了转 基因。如果在后期发生整合，则产生嵌合体。在一高度优选的方法中， 用含目的DNA的慢病毒载体转染发育的胚胎，被转染的胚胎产生了 转基因动物。传统的转基因方法需要在体外转染胚胎细胞，然后再植 入子宫。本发明的一个重要的优点是NOI能导入子宫(utero)。另一 个方法是用慢病毒感染导入一种核酸进入前核阶段的卵子用来产生转 基因动物。然后，被转导的卵子在植入假孕受体的输卵管之前进行培 养。
作为一个明确的实施例，一个建立诸如牛的转基因哺乳动物，包 含编码治疗蛋白序列的核酸构建体通过本发明的方法导入到卵母细 胞，卵母细胞是从新鲜的哺乳动物卵巢中分离获得。卵母细胞从滤泡 吸入，在与解冻的冻存精子受精之前停留在滤泡中，而解冻的精子必 须和肝素(heparin)结合而活化，可通过Percoll剃度分离具有活力的精 子部分。
举例来说，受精的卵母细胞在15,000g离心8分钟，观察生殖核并 用于注射，然后用输卵管组织-条件培养基培养使受精卵进入到桑椹 胚或胚泡。这种培养基是由输卵管刮掉的管腔(luminal)组织制备 的，在培养受精卵时需要进一步稀释。在微注射后，受精卵必须在培 养基中放置2小时。
然后，诸如牛待孕受试哺乳动物通过施用甾醇使其同时处于发情 期(Oestrous)。哺乳动物在2天内进入发情期，而胚胎在受试动物 动情期5～7天后转移。成功的转移可通过Southern杂交对转基因动物 后代评估。
作为可替代方案，预想的构建体能导入胚胎干细胞(ES细胞)， 培养胚胎干细胞并确保证被转基因变异。变异的细胞注射到囊胚，囊 胚再植入假孕宿主。由此生成的后代是包括ES细胞和宿主细胞的嵌 合体(chimetic)，而仅包含ES后代的非嵌合体细胞株可以通过常规 的交叉杂交方法获得。举例来说，这种技术已在WO91/10741中被描 述。
包含转基因序列的动物可依据标准的PCR或者Southern杂交方法 进行分析检测。如果有必要，生物体可以繁殖而获得纯合体。
本发明可用于产生转基因生物，在上文中已涉及到在基因治疗和 疾病模型建立方面的应用。在具体实施例中，疾病模型便于进行基因 功能的实验研究。通常情况下，表达新基因或带有异源启动子基因的 转基因生物表现为“功能获得”突变。基因缺失突变可通过基因打 靶获得，即所谓的“基因敲除”生物。转基因生物体也用于研究基因 控制区域和基因表达形式。转基因生物也可利用插入突变、基因俘获 (gene traps)和启动子俘获(promoter traps)等方法鉴定新基因。转基因 动物在农业中也有应用，举例来说，通过遗传改造提高牛奶产量、增 加体重、增加牛奶营养成分，提高疾病免疫能力等。转基因动物也用 作所谓的“制药农场”(pharmaceutical farming)，即是指转基因家畜 用来生产治疗性蛋白质。
作为一个实施例，SMN的调节性缺失(纯合子缺失导致出生前死 亡)可提供一个用于基因治疗研究的脊柱肌肉萎缩模型。一个CFTR 缺陷模型也是一种有用的模型。其它假定的候选基因包括：早老因子 -1、RARα、脑源性神经营养因子(BDNF)、血管内皮生长因子(VEGF) 和表皮生长因子受体(EGFR)。
可利用诸如组织分析和微矩阵基因表达谱(profiling)的标准技术进 行转基因结果的表型分析。
根据本发明优选的特征，一个优选的EIAV慢病毒载体用于产生 转基因小鸡，在其卵中产生治疗或诊断性蛋白。
利用慢病毒载体能产生转基因鸟类，经多代繁殖的众多转基因鸟 类个体都能使目的基因正常表达，利用某些逆转录病毒载体进行观察 没有发现外源基因沉默。举例来说，Mizuarai等(2001)(Biochemical and Biophysics Research Communications 286：456-463)观察到在转基因鹌 鹑中，基于MLV载体的LTR不能启始基因表达，同时鸟类自身的劳 氏肉瘤病毒(RSV)启动子能启始靶基因在G0、G1、G2期表达。
慢病毒载体编码治疗性蛋白或者诊断性蛋白，举例来说，含有一 种抗体或者一种抗体的片段的慢病毒载体可用于产生转基因小鸡。通 过工程改造后，抗体可以含有来自多个种类动物的结构域，或者含有 结合不同靶分子的结构域。编码靶基因的核苷酸序列可改变并增加 RNA的稳定性或者RNA转录水平，而不改变目的蛋白的氨基酸序列。
治疗/诊断基因可由一个组成性启动子或者一个具有组织特异性 启动子启动表达。举例来说，靶蛋白的表达可以限定在生殖结构(包 括输卵管或者生殖道)，通过这种方式，导致在卵中含有表达的靶蛋 白。在蛋清中存在卵清蛋白、溶菌酶、伴清蛋白和卵类粘蛋白等蛋白， 编码这些蛋白的基因的启动子或者启动子的元件可以使用。这些基因 的表达受甾体激素的调节，但是有证据表明其它细胞特异性转录因子 参与卵清蛋白和伴清蛋白启动子的表达调节(Dierich等，EMBOJ，1987 6(8)：2305-12)。已经证明卵白蛋白基因启动子在转录位点上游- 3200和-2800bp之间存在组织特异性沉默元件(Muramatsu等Mol Cell Biochem 1998 185：(1-2)：27-32)，而一种沉默元件位于从溶菌酶转 录位点上游的-2400bp处(Bonifer等J Biol Chem 1997 272(42)：26075- 8综述)。然而，Dierich等(1987)在-1348和-1的截短卵白蛋白中获 得了一定程度的细胞特异性。在原代培养的小鸡输卵管管腺细胞中对 于从-425延伸到-1的截短卵白蛋白来说，观察到了某种程度上的类固 醇调节作用(Dierich等1987)。
编码治疗/诊断性蛋白质的慢病毒载体通过注射的方法用来转导 新生卵的处于囊胚期胚胎的细胞。作为替换方案，使用诸如 WO90/13626中所述或者类似的已发表技术之类的技术，使用慢病毒 载体转导较早期胚胎。
简而言之，可以通过手工操作的方法或者通过诱导早产的方法来 获得子宫胚胎。胚胎用慢病毒载体转染，然后培养至成熟。这使胚胎 细胞在存在的细胞数量相对较低的时候得以转导，增加产生的转基因 鸡的数量，其中转基因存在于胚系中并可遗传。
本发明还涉及到RNAi的使用以增加来自于转基因鸟类的蛋白质 产量。
为了最大限度的增加目的蛋白的表达，如实施例8所描述，RNAi 可以被用作降低蛋中正常情况下存在的富含蛋白的比例，如卵白蛋 白、溶菌酶、伴清蛋白和类卵粘蛋白的比例。下调这些蛋白的产量可 以导致相伴的目的蛋白比例增加，产量提高。
这可以通过表达siRNAs或者短发卡前体，靶向所需的EIAV载体 mRNA来实现这一点。该载体可以包括siRNAs，siRNAs靶向mRNA中 一个或多个位点上的一个或多个mRNAs。
诸如卵白蛋白的蛋白质的有效靶向导致产生不具有繁殖能力的卵 子。因此可以鉴定转基因公鸡，并且将之和具有包含目的转基因的载 体的转基因母鸡交配，以获得具有两种性状的雌性后代，用作蛋白质 生产的生物反应器。siRNAs的调节(如实施例10中所述)也可以是 另外的方式：当卵子是用作蛋白质生产而非繁殖时，在产卵母鸡中诱 导基因沉默。这也可以克服整个生物体中靶基因表达下调所致的任何 可能有害作用。
现在，参照下面的非限制性实施例通过举例的方式来描述本发 明。
实施例1-围产期动物的EIAV转导
载体的制备
如前所述通过瞬时共转染293T人胚肾细胞来制备载体 (Mitrophanous等1999)。该EIAV载体基因组SMART2Z从一个内部 CMV启动子处表达β-半乳糖苷酶受体。它包含EIAV中心多嘌呤序列 (cPPT)(Stetor等1999)和土拨鼠肝炎转录后调节元件(WPRE) (Donelle等，1998)。
载体的施用
通过胎儿血管内注射施用载体，具体如下：异氟烷麻醉下，在腹 部中线切开以暴露怀孕16天的妊娠小鼠的子宫。对于每个鼠胎，使用 34号针头(Hamilton)注射载体进入外周卵黄囊血管，载体总体积20 μL，2×107T.U.(转导单位)。每个dam最多注射五个鼠胎。一层一层 缝合封闭打开的腹部，在温暖的笼子中使小鼠恢复。
转基因检测
妊娠18～19天后小鼠出生。异氟烷麻醉后处死各个发育阶段(3， 7，14，28，79天)的小鼠，制作样本用作组织学研究。器官置于100 ％乙醇溶液中2小时后，用X-gel溶液(1mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D- 半乳糖吡喃糖苷溶解于二甲基亚砜，5mM铁氰化钾，5mM亚铁氰化 钾，2mM氯化镁)对载体表达的β-半乳糖苷酶标记基因进行染色。 染色组织用10％甲醛固定2小时、石蜡包被、切片、中性红染色。染 色显示诸如肝脏、肺、心脏、肌肉、肾脏、骨骼肌和脑的一些器官的 转导情况。该结果见图1到11。
观察到：在研究期间表达水平不降低，且转导细胞和无性繁殖期 间。
除了注射进入卵黄囊血管或者脐静脉，也可以直接注射进入循环 系统、CSF其他组织或者羊水。后者对于肺或者皮肤组织的转导非常 适合。
实施例2：血友病
本实施例通过实施例1中的方法进行。血友病是血液疾病，该病 中一种重要的凝血因子部分或者完全缺失，是和X关联的隐形疾病。 有两种血友病，最常见的是血友病A，其中凝血因子VIII缺乏。在血友 病B中，凝血因子IX缺乏。EIAV用作转导VIII和IX进入血友病胎儿的脐 静脉或者肝脏门静脉。
载体的制备
一种载体，例如在我们共同未决的GB0202403.1.1中描述的载体。
具体细节：
pONY 8.4系列载体含有许多修饰，这些修饰使之作为瞬时或者稳 定载体系统发挥作用，这些系统完全独立于附属蛋白，并且对于滴度 没有有害作用。传统的慢病毒载体基因组需要生产细胞(瞬时或者稳 定转染)中存在病毒蛋白rev以获得足够的滴度。这包括目前的HIV 载体系统和更早期的EIAV载体。
和pONY8.1系列载体基因组相比有三种修饰，它们是：
a)所有来自于gag、形成包装信号一部分的ATG基序都被修饰 成为阅读ATTG。这可以插入一个受LTR中启动子驱动的开放阅读 框架。
b)基因组的长度，即R区域间的距离比wt病毒中所观察到的更 近(7.9kb)。
c)3’U3区域得以修饰含有来自于莫洛尼白血病病毒(MLV)U3 区域的序列，因此在转导时除了内部序列盒之外它还能驱动第二个开 放阅读框，在本实施例中，我们使用了MLV，但是可以是任何启动 子。
修饰LTRs的其他细节可以参考我们的WO96/37623和 WO98/17816。
图12是EIAV基因组示意图。可以根据本发明的方法使用这些 进行转染。转染时，3’LTR将被拷贝到5’LTR。图13提供了pONy8.1G 的全部质粒序列。图14提供了pONY8.4ZCG的全部质粒序列。图15 提供了pONY8.4GCZ的全部质粒序列。图16是杂合U3区域的示意 图。图17提供了是杂合LTR的序列。
EIAV/MLV杂合LTR的构建
PCR按照如下所述进行：
产物A＝引物KM001+KM003，pONY8.1Z作为靶分子。
产物B＝引物KM004+KM005，pHIT111作为靶分子。
产物C＝引物KM006+KM002，pONY8.1Z作为靶分子。
PCR产物(A，B和C)通过凝胶纯化。使用产物A和B(使用引 物KM001和KM005)进行PCR反应产生产物D。使用产物B和C (使用引物KM004和KM002)进行PCR反应产生产物E。产物D 和E用凝胶纯化，并用于PCR反应中的靶分子，使用引物KM001 和KM002生成产物F。PCR产物F用凝胶分离纯化(大约1kb)。 然后用Sap I切割并亚克隆进入用Sap I切割的pONY8.1Z，形成图18 和19所示的载体pONY8.1Zhyb。这时EIAV的3’LTR置换成了 EIAV/MLV杂合LTR。该EIAV U3几乎被MLV U3区域所取代。EIAV 的3’LTR的5’U3序列保留，因为该序列包括att位点，该位点是整 合所必需的序列。
引物序列如下：
1EIAV/MLV杂交U3
KM001
CAAAGCATGCCTGCAGGAATTCG
KM002
GAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAG
KM003
GCCAAACCTACAGGTGGGGTC
TTTCATTATAAAACCCCTCATAAAAACCCCACAG
KM004
CTGTGGGGTTTTTATGAGGGGTTTTATAATGAAAGACCCCAC CTGTAGGTTTGGC
KM005
GAAGGGACTCAGACCGCAGAATCTGAGTGCCCCCCGAGTGA GGGGTTGTGGGCTCT
KM006
AGAGCCCACAACCCCTCACTCGGGGG
GCACTCAGATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTC
最终PCR产物序列。
EIAV PPT/U3
CAAAGCATGCCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATA
CCGTCGAATTGGAAGAGCTTTAAATCCTGGCACATCTCATGTAT
CAATGCCTCAGTATGTTTAGAAAAACAAGGGGGGAACTGTGGG
GTTTTTATGAGGGGTTTTATAA
MLV U3
TGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTA
ACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACATAACTGAGAATAG
AGAAGTTCAGATCAAGGTCAGGAACAGATGGAACAGCTGAATA
TGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCT
CAGGGCCAAGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAG
GATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAA
CAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGAG
AACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACC
CTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTG
TTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAAC
CCCTCACTCGGG
MLV U3/EIAV R/U5
GGGCACTCAGATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTCTCTGCTGGGC
TGAAAAGGCCTTTGTAATAAATATAATTCTCTACTCAGTCCCTGT
CTCTAGTTTGTCTGTTCGAGATCCTACAGAGCTCATGCCTTGGCG
TAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTC
ACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAG
CCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTG
CGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCT
GCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGT
ATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTC
血友病A
一种表达因子VIII(野生型全长开放阅读框(ORF)或者截短形式B 结构域缺失的野生ORF或者密码子优化的ORF或者截短形式B结构域 缺失的优化ORF)的EIAV病毒载体(例如以上所描述的载体)按照 实施例1中的方法施用，施用方法包括静脉内或者肝内或者肌肉运送。 使用诸如CMV的适当启动子或者诸如PGK的人启动子/增强子来表达 基因。此外，还可以使用诸如Tet系统的可诱导启动子来调节表达。 作为替换方案，使用组织特异性启动子/增强子使表达局限于细胞型。
血友病B
一种表达因子IX(野生型ORF或者密码子优化的ORF)的EIAV病 毒载体(例如上述载体)按照实施例1中的方法学施用，施用方法包 括静脉内或者肝内或者肌肉途径。使用诸如CMV的适当启动子或者 诸如PGK的人启动子/增强子来表达基因。此外，还可以使用诸如Tet 系统的可诱导启动子来调节表达。作为可替换方案，使用组织特异性 启动子/增强子使表达局限于细胞型。
实施例3：囊性纤维化
本实施例根据实施例1中的方法学进行。囊性纤维化是一种遗传 性隐性疾病，由囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)突变引起。 CFTR是一种蛋白质，在离子转运、粘液流变学、炎症、细菌粘附中 具有作用。EIAV经由羊水转运CFTR从而对肺脏进行转导。
一种表达CFTR(野生型OFF或者一种密码子优化的ORF)的EIAV 病毒载体(例如上述所描写的载体)按照实施例1中的方法学施用， 施用方法包括胃肠道内、肺内或者羊膜内途径。一种合适的启动子诸 如CMV或者人启动子/增强子诸如PGK用来表达基因。此外，还可以 使用诸如Tet系统的可诱导启动子来调节表达。作为可替换方案，使 用组织特异性启动子/增强子使表达局限于细胞型。
实施例4：肌营养不良
本实施例根据实施例1中的方法学进行。Duchenne型肌营养不良 (DMD)是一种致命的和X染色体有关的隐性疾病。DMD是由位于 纹肌肉组织的肌营养不良蛋白水平和/或者活性的遗传缺陷引起。 EIAV用来携带最小的肌营养不良蛋白cDNA(对应于一种轻度的贝克 尔氏肌营养不良(BMD)表型)到perinates的脐静脉和/或者直接进 入胎儿骨骼肌。
一种表达肌营养不良蛋白(野生全长开放阅读框(ORF)或者截 短的的野生ORF或者密码子优化的ORF或者截短的密码子优化的 ORF)的EIAV病毒载体(例如上述所描写的载体)根据实施例1中的 方法施用，施用方法包括进入所有的肌群途径。一种合适的启动子诸 如CMV活或人启动子/增强子诸如PGK用来表达基因。此外，还可以 使用诸如Tet系统的可诱导启动子来调节表达。作为可替换方案，使 用组织特异性启动子/增强子使表达局限于细胞型。
实施例5：核酶
本实施例根据实施例1中的方法学进行。利用EIAV运输一个靶向 黑色素生物合成途径中一个基因的核酶。这个方法便于进行转基因鉴 定。
实施例6：用于帕金森症转基因模型的EIAV的使用
帕金森症(PD)是常见的神经退变性疾病之一，几乎2％的65岁 以上群体受此疾病侵袭。该病具有包括运动僵硬、休息性震颤和 bradykinesia(运动起始和运动迟钝)的运动紊乱-帕金森病-综合症特 征。这是由于黑质神经元丢失引起，黑质神经元产生神经递质多巴胺。 引起PD的病因很大程度上不清楚，尽管极少数家庭的疾病能遗传。 在带有常染色体显性PD的家族中，两种不同的错义突变定位于α- synuclein(Ploymeropoulos等1997，Kruger等1998)，其编码一个 小的磷蛋白，被认为与突触囊泡运输有关。一个在青春期发病的常染 色体隐性幼年期帕金森症(AR-JP)病例中，Kitade等(1998)发现基因 与帕金森症有关，最近提出E3泛素连接酶能催化α-synuclein的泛素 化(Shimura等2001)。因此已经推测α-synuclein降解功能的缺失 导致AR-JP和偶尔发生的PD(Haass和Kahle 2001)。
EIAV载体系统用来运输一个或多个下述核酸序列进入小鼠 spermatogonial干细胞(Nagano等2001)：
1.帕金森症的核酶
2.突变α-synuclein等位基因
3.酪氨酸羟化酶的核酶(多巴胺合成所需酶)
实施例7：血管生成
缺氧诱导因子(HIF)是一种转录复合物，保持氧动态平衡的作 用。在含氧量正常的条件下，由von Hippel-Lindau复合物识别HIF中 羟基化脯氨酸残基，HIFα亚单位降解被降解。因此，蛋白质的稳定 状态水平很低和转录复合物不能形成。一个脯氨酰-4-羟化酶家族已 被描述(Epstein等2001)，其酶活性受缺氧、铁离子螯合和二价钴 离子调节，该酶是实现调节HIF的氧传感器的必要条件。在培养的果 蝇属黑素细胞中，通过RNA干扰抑制脯氨酰-4-羟化酶导致在含氧量 正常的条件下缺氧诱导的基因表达增高。(Bruick和McKnight 2001)。
EIAV载体系统用于运输：
1.脯氨酰-4-羟化酶(或者VHL)的一种核酶。这可以使HIF-1α 亚单位组成性上调、HIF复合物的活化和HIF靶基因的过度表达。
2.组成性活化HIF-1(HIF在含氧量正常的条件下上调)或者PHD3 (HIF在组织缺氧条件下调)。
对于小鼠卵母细胞注射于卵周间隙(Chan等1998：2001)。
在健康相关研究中，转基因鼠模型的建立和应用已被详细描述。 计划研究能够发展更广泛的人类疾病模型，现有的“基因敲除”方法 不能满足产生人类疾病模型的需要。
优于现存技术的优点包括如下：
1)与注射DNA的非同源性重组相比，通过慢病毒转导提高转基 因效率。原核注射导致大的串连DNA插入，插入的DNA不稳定且易 于重排和丢失。慢病毒转导通常导致有限数量的载体拷贝稳定整合， 在染色体DNA上以不连续的转录盒分布。
2)和当前的“基因敲除”相比时间周期缩短。产生纯合基因缺 失的小鼠是一个相对工作强度大、耗时的过程，需要嵌合体杂合子交 叉繁殖，胚系细胞已丢失工程化缺失基因。相比之下，受精之前转导 卵母细胞，每个细胞将包含部分缺失的基因盒。不需要交叉繁殖，这 使得周期更短并且需要的动物数量显著下降。
3)下调基因表达产物的灵活性。如讨论所述，该技术在建立致 命靶基因的疾病模型中特别有用。有利于研究在特定的发育阶段或者 在特定的组织中基因表达的消除。
4)HIV载体有许多缺点，这限制它们在某些疾病中的治疗应用。 HIV-1具有人类致病源的缺点，携带潜在的原癌基因蛋白质和序列。 在包装细胞中形成的载体颗粒表达HIV gag-pol，HIV载体导入带来的 危险因素是使这些蛋白质进入个体而导致血清转化。在本发明具体实 施方案中使用的非灵长类慢病毒载体不会在个体内引入HIV蛋白质。
实施例8：产生转基因鸟类作为生物反应器用于合成蛋白
一种编码细菌β半乳糖苷酶的EIAV载体，10μL的pONY8Z 5’cppt，直接到注射新生卵囊胚层期的胚胎下，具体操作技术可以参 见专利号为US 5258307，或者注射更早期的胚胎，具体操作参见 WO90/13626所描述的技术。一种惰性的染料用于囊胚期注射以确定 载体的准确运输。通过收集在孵育和孵化后的不同发育阶段的胚胎分 析转导效率。然后，对胚胎进行切片并用β半乳糖苷酶染色以鉴定哪 些器官被转导和胚胎性腺的生殖细胞是否被转导。采集胚胎中诸如血 液和CAM的组织样品，使用定量PCR的方法评估被转导细胞的百分 率。一些雄性胚胎成长到性成熟，精液将被采集。遗传该转基因到其 后代的可能性也通过定量PCR方法进行评估。然后精液被用来使雌鸟 受孕，收集胚胎并用定量PCR方法评估以确定转基因后代的百分率。 此外，处于G1群中的该载体上β-半乳糖苷酶表达水平通过X-Gal染 色评估。
实施例9：用于RNA干扰(RNAi)的载体
图20图解了适于慢病毒的许多RNAi表达盒，距离来说，EIAV在 转基因细胞和动物中表达siRNA。在每个实施例中，都利用了一个RNA 聚合酶III启动子(U6)。RNA聚合酶III产生许多包括小的5S核糖体RNA 和转运RNAs在内小的、稳定RNAs。有效的RNAi由单一U6启动子启 动短发卡表达介导合成(图20A)，或者也可通过合并的两个U6启动 子介导调节，其中一种表达正义链区，另一种表达该靶序列的同一序 列的反向互补序列(图20B)。图20C给出了一个具体实施方案，两 个反向的启动子从表达盒的正链和互补链用来转录靶基因的正义和反 义序列。
实施例10：用于调节短RNAs生成的适应体/核酶(适应酶)
病毒载体诸如慢病毒载体用来产生转基因并运输siRNAs，能靶向 具有重要或必需功能基因的一个基因，导致转基因动物在发育过程中 死亡。因此，调节siRNAs转录使基因的沉默作用受到调节是值得做 的研究。在这个实施例中，我们描述了一种适应体/核酶杂交体用于 调节功能性siRNAs的合成。
适应体是核苷酸分子，形成一定结构，可结合许多包括蛋白质和 药物分子的配体。通过用一个适应体取代锤头状核酶的一个螺旋能形 成催化性RNA，通过在配体存在或者不存在的情况下构象被诱导改 变并没、能够剪切底物(底物可以是其自身)。图21A图解了一个表 达盒的设计，该表达盒可以在本发明的载体中和本发明的方法中使 用。在这个实施例中，适应酶短发卡编码的siRNA的5’端增加了一个 适应酶。这导致转录本自身剪切可以受调节性诱导(或抑制)，发卡 从适应酶结构中分离，并激活基因沉默。象图21B中图解的一样，配 体的增加或者去除可以触发催化活性、剪切转录本和使短发卡释放以 诱导靶基因沉默。
实施例11：低氧情况siRNAs诱导的VEGF沉默
在这个实施例中，我们描述了一种用于调节功能性siRNAs生成的 适应酶的应用，其中适应酶的特异性蛋白质配体是由同一个载体表达 的。一个载体根据图22的图解进行构建，RNA聚合酶III U6 snRNA基 因启动子用来启动一个与适应酶相连的作用于VEGF的短发卡表达。 在缺氧条件下，缺氧反应元件(HRE)被诱导转录基因X，基因X编 码的蛋白质X是适应体的一个配体。配体结合后引发催化、短发卡释 放和随后导致VEGF基因沉默。
因此，VEGF在缺氧条件下被特异性地下调，这可能有助于治疗 包括增生性糖尿病视网膜病在内的许多疾病。
在另一可替代的实施方案中，适应体的配体可以是VEGF本身。
实施例12：用于转录siRNA前体的RNA聚合酶II启动子的应用
在这个实施例中，我们描述在RNA聚合酶II启动子控制下siRNA 前体的转录。这可通过对短发卡引入旁侧区获得(图23A)，或者通 过siRNA序列引入编码有RNA催化活性的适应酶或其作用的靶序列 (图23B)而实现。旁侧序列的剪切使前体释放siRNA或者短发卡。
在图23A中的表达盒，短发卡的表达是受一种RNA聚合酶II启动 子CMV的控制。Tet操纵子下游的两个拷贝给出了其它水平的调节。 在Tet抑制蛋白的存在下转录被抑制(缺少强力霉素)，Tet抑制蛋白 可以独立表达或者由同一个载体表达。适应酶位于转录本的旁侧区， 能被活化并剪切设计的位点，释放短发卡，从而能启始靶基因的沉默 化。在这个具体实施方案中，有必要使用适应酶而不是核酶，因为后 者将导致慢病毒基因组的自身剪切。
在图23B中的表达盒，只有反义siRNA的表达是受适应酶的调节 控制。同样，适应酶位于靶序列旁侧区，剪切释放合适的RNA序列， 与正义RNA形成二聚体，正义RNA是用U6启动子组成性表达的。因 此，靶基因沉默的开启或者关闭依赖于适应酶配体的存在与否。
实施例13：用于转基因表达调节的含有适应酶序列的载体的应用
适应酶可以用于包括基因的任何核苷酸序列的转录后调节。适应 酶通过增加/去除合适的配体而被活化(或抑制)，从而诱导转录本的剪 切，适应酶可以去除转录本的部分片段，举例来说，去除编码起始甲 硫氨酸的密码子或者一段阻止RNA加帽和/或者转录本多聚腺苷酸化 的UTR区。这提供了一种关闭某种基因产物表达合成的方法，举例来 说，一种诸如因子IX的治疗性基因，如果其表达过高可通过此方法调 节。转基因的表达能通过工程设计用这种方式进行自身调节。
图24A图解了一个用于胰岛素表达调节的构建体。适应酶的活性 通过葡萄糖的结合来调节，因此，在血糖水平增高时胰岛素才会高水 平表达。如果血糖降低到能激活适应酶活性的正常临界值以下，胰岛 素转基因的转录本被破坏。
图24B图解了一个用于因子IX表达调节的构建体。在这个构建体 中，一种受强力霉素调节的适应酶在体内和体外都可以通过施用强力 霉素来调节转基因/短RNAs的表达。在这个构建体中，Tet操纵子序 列插入到启动子的下游。在Tet抑制蛋白(可以由同一个载体表达) 存在下，去除强力霉素转录受到抑制，因此阻断重新转录。由于在没 有强力霉素时适应酶被活化，因此任何现存的转录本将被剪切和降 解。
T-RexTM系统能选择性地结合并用这种策略来增加其它的的调节 水平。
实施例14：用于转基因表达调节的含有适应酶序列的载体的应用 —阻止载体基因组RNA自身剪切的方法
本发明的病毒载体应该在适应酶酶活性最小和载体基因组不被自 身剪切破坏的条件下进行合成，但是一种优选的措施是通过构建一个 分裂内含子载体而在物理结构上隔开(或者核酶)(Ismail等2000)。 这可确保全长的核酶仅存在于原病毒编码的转录本中，而不存在于载 体颗粒的RNA基因组中。
图25A图解了分裂内含子策略，图28B图解了本发明这一方面 的合适载体。在剪切供体逆转录过程中，核酶5’某些序列拷贝到病 毒5’LTR，因此仅当转录的前病毒剪切后才形成核酶。应用图25A 中的具体实施例，编码适应酶的序列在病毒产生细胞包装的基因组中 将被分割，这使得蓝色标注区域(AGAUCAU)将不会出现在黑色标 注区域(GAUGCU)的序列上游。相反，它将与包含一个剪切供体 (划线的)的其它序列同时出现在3’LTR中。一旦逆转录开始，将 拷贝到5’LTR。因此它位于剪切受体的上游与适应酶的其余序列相 邻。一旦开始转录，内含子序列
( GUAAAUAAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTG CGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCC TTTCTCTCCACAG)将被剪接从而形成一个完全的适应酶。因此， 适应酶仅存在于转导的细胞，阻止任何载体基因组的剪切，否则将导 致滴度下降。
图25B图解了分裂内含子载体在本发明这一方面的应用。载体含 有一个EIAV/MLV杂合LTR。在转录的起始下游和EIAV重复序列的 上游插入了剪切供体，其中包含了适应酶的5’部分序列。在逆转录过 程中，修饰的3’LTR拷贝到5’LTR。经转录和剪接后形成功能性适应 酶。适应酶活化剪切转录本导致自身降解。
另外一个防止病毒基因组中潜在的活化适应酶形成的方法是在启 动子的3’末端增加一段序列，该序列能和适应酶部分序列碱基互补， 从而降低适应酶形成正确构象的可能性。这在图26中有描述。如图所 示，U6启动子的3’末端进行修饰增加一段序列，该序列和形成发卡 的螺旋I的5’区域互补，阻止适应酶形成催化活性所必需的构象。这 仅出现于RNA基因组而不会出现于转录本，因为转录的起始将在启 动子修饰序列的下游。这不会影响被转录的原病毒的三级结构，因为 启动子序列并不存在。
不同的修改和本发明中所描述的方法和系统的改进为本领域的熟 练技术人员所熟知，它们不偏离本发明的范围和本质。虽然本发明结 合优选的实施方案加以描述，但必须注意本发明并不局限于这些具体 的实施方案。事实上，对本发明的已被描述的方法加以修饰，这些方 法对于那些化学、生物或者其他相关领域的研究人员是熟知的，本发 明也试图包括这些方法。以上说明中所有提及的出版物在此并入作为 参考。
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