微生物
阅读：949发布：2020-05-11
专利汇可以提供微生物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且通常杆菌放置到新的环境(培养基)时，在开始增殖前都存在数小时的所谓的增殖准备期，但本 发明 的目的在于提供完全没有准备期的，立即开始增殖的非溶血性的Bacillus sp.OYK-01-600(FERM BP-6394)、Bacillus sp.OYK-03-600(FERM BP-6395)、和Bacillus sp.OYK-04-000(FERM BP-6396)等新 微 生物 。其特征就象前面所叙述的那样，在OYK菌对数增殖期间存在着数小时其它菌几乎不增殖的时期，如果只看这数小时的话，OYK增殖的菌数是其它菌的数万倍。OYK菌本身对有害菌(包括二 氧 甲基苯青霉素抗性的黄色葡萄球菌在内的黄色葡萄球菌、包括0-157在内的病原性大肠杆菌、军团菌、 肺 炎杆菌等)有抗菌性。像上述那样增殖速度上的差异可抑制恶臭的发生和很多有害感染菌。若用在堆肥制造上，通过最重要的初期产生的热量引起的 发酵 槽的 温度 急剧上升，使得完全成熟堆肥的制造变得容易。，下面是微生物专利的具体信息内容。
技术领域
本发明是有关没有溶血性的新微生物及其应用的发明，详细地讲是有 关对因增殖产生恶臭的有害菌(例如黄色葡萄球菌、肺炎杆菌等)具有 抗菌活性的，因此可以除去诸如由排水处理设施发生的恶臭，对其它细 菌(例如二氧甲基苯青霉素抗性的黄色葡萄球菌、病原性大肠杆菌O- 157、军团菌等)也有高的抗菌活性的具有广泛用途的新微生物及其应用 的发明。
另外本发明的新微生物中的抗菌活性不仅是由该新微生物的菌体外、 内生成物引起的，而且通过如下的机制也能发挥抗菌活性。
就是说，本发明的新微生物于20～40℃的培育条件下进行培育，例如 103个/g(ml)菌浓度大约在2小时可达到106个/g(ml)，而且在6小时以 内可达108个/g(ml)，从增殖开始就以通常没有想到那样的急剧增殖的速 度繁殖。可是通常的细菌的增殖要经过6小时左右的增殖准备期(菌体 置于新环境时，为适应新环境开始增殖的准备期)，即经过所谓的“诱导 期”，而本发明的新微生物几乎没有象上述那样的“诱导期”，实际上培 育开始后，在发生了迅速地而且是爆发式的细胞分裂后，就一直进行着 指数式增殖。这样一来，在上述杂菌的诱导期内，本发明的微生物一边 贪婪地消化循环中的营养成分，一边进行爆发式的繁殖，因此抑制了上 述杂菌的繁殖，结果可以说表现出了对上述有害菌等的抗菌活性。即几 乎没有诱导期，培育后迅速增殖的新微生物就抑制了有害菌的增殖。
背景技术
最近在排水处理技术中也盛行利用微生物的技术。排水处理中使用的 微生物有很多种，其中主要的有以下一些。作为细菌有Zooglea、 Sphaerotilus等，作为原生动物有阿米巴类、纤毛虫类、鞭毛虫类等， 而作为藻类有蓝藻类、绿藻类、硅藻类等。
这些微生物可以分解有机物以及一部分无机物，但在进行分解时有时 发出恶臭(氨、硫化氢等)以及产生发出恶臭的物质，而且处理场产生 的恶臭屡次作为社会问题引起人们的诉讼。就是说依据生物学的处理方 法进行排水处理，可以有效地进行有机物质或无机物质的分解，但从处 理场发生的恶臭仍然搁置在那没有解决。特别是沉淀槽内沉淀的活性污 泥逐渐地成了厌氧性的，随着厌氧菌的增殖产生了大量的恶臭，该污泥 返送到曝气槽时，大量的恶臭飘浮到排水处理场的周边地区。
本发明人以上述发生的问题为背景锐意探索新的有用的微生物，结果 终于从土壤中成功地分离出了新的有用的微生物，该微生物在分解有机 物时不发生硫化氢、甲硫醇等引起的恶臭，而且对由于增殖产生恶臭的 细菌Staphylococcus aureus和Klebsiella pneumonia等、二氧甲基苯 青霉素抗性的黄色葡萄球菌、病原性大肠杆菌O-157、军团菌或绿浓菌 等细菌有抗菌性，然后发现在广泛领域内可以利用该新的微生物，直至 本发明完成。
这些微生物可以分解有机物以及一部分无机物，但在进行分解时有时 发出恶臭(氨、硫化氢等)以及产生发出恶臭的物质，而且处理场产生 的恶臭屡次作为社会问题引起人们的诉讼。就是说依据生物学的处理方 法进行排水处理，可以有效地进行有机物质或无机物质的分解，但从处 理场发生的恶臭仍然搁置在那没有解决。特别是沉淀槽内沉淀的活性污 泥逐渐地成了厌氧性的，随着厌氧菌的增殖产生了大量的恶臭，该污泥 返送到曝气槽时，大量的恶臭飘浮到排水处理场的周边地区。
本发明人以上述发生的问题为背景锐意探索新的有用的微生物，结果 终于从土壤中成功地分离出了新的有用的微生物，该微生物在分解有机 物时不发生硫化氢、甲硫醇等引起的恶臭，而且对由于增殖产生恶臭的 细菌Staphylococcus aureus和Klebsiella pneumonia等、二氧甲基苯 青霉素抗性的黄色葡萄球菌、病原性大肠杆菌O-157、军团菌或绿浓菌 等细菌有抗菌性，然后发现在广泛领域内可以利用该新的微生物，直至 本发明完成。
发明内容
本发明的新微生物是非溶血性枯草杆菌类缘菌，菌体体积是标准枯草 杆菌(IFO3134株)的4倍以上，而且在37℃通过营养肉汤浸透培育时， 由于培育初期几乎没有诱导期，103个/ml的初期菌在4小时后增加到107 个/ml以上，由于协同效果，通过增殖发生的代谢能与上述标准枯草杆菌 相比可达1万倍以上，对黄色葡萄球菌、肺炎杆菌、二氧甲基苯青霉素 抗性的黄色葡萄球菌、病原性大肠杆菌O-157、军团菌、绿浓菌、镰刀 霉菌、酵母霉菌、青霉菌、白癣菌以及蜘蛛状霉菌有抗菌性。
作为本发明的新微生物的枯草杆菌类缘菌的具体例子如以下的OYK菌 (国际保藏于通商产业省工业技术院生命工程工业技术研究所专利微生 物保藏中心)。
(1)Bacillus sp.OYK-01-600(FERM BP-6394)、
(2)Bacillus sp.OYK-03-600(FERM BP-6395)、
(3)Bacillus sp.OYK-04-000(FERM BP-6396)。
以下也将OYK-01-600、OYK-03-600、OYK-04-000菌简单地称之为[OYK] 菌。
OYK菌消化蛋白质后繁殖很快。而OYK菌具有不产生溶血素的特征， 是对人安全性很高的菌。而将该菌对动物进行静脉注射、经气道、经口 服以及皮肤注射4种给菌方式可以确认该菌的安全性。
OYK菌即使在枯草杆菌种属中也是比较大型的菌，例如它大约是枯草 杆菌标准菌(IFO-3134(0.4～0.6×1.5～3.2μm))体积的4倍(体积 比)。然而OYK菌在培育开始后的初期增殖力有优势，因此可以产生大量 的代谢能(标准菌只有在培育开始后4小时增殖6倍左右，而OYK菌可 以大约80000倍的极高速度进行增殖)。而且由于OYK菌是个兼性厌氧菌， 所以在好氧、厌氧两种条件下都有可能进行极强的增殖。因此在进行堆 肥化时，会使有机废弃物迅速升温，然后促进作为高温菌的放线菌、真 菌(丝状菌)的活动，在缩短堆肥化期的同时可得到完全成熟的堆肥。
附图的简单说明
图1是表示比较OYK菌和B.subtilis标准菌的增殖速度的曲线图。
发明的最佳实施方式
以下说明本发明的实施例，这些实施例是为了说明本发明的一个例 子，并不限定本发明的范围。
A.新微生物的筛选
从土壤中分离出3株对由于增殖产生恶臭的细菌具有抗菌性的微生 物。一般来说土壤菌毒性小，可以说从这样的土壤中分离的3个OYK菌 对人体也是安全的(温和的)。
B.菌株的鉴定
根据下面的①、②鉴定这里分离选出的菌体的菌学性质。即依据以下 记载进行鉴定：
①Bergey’s Mannual of Determinative Bacteriology Vol.2(1986)， Eillismd & Eilkind U.S.A
②R.E.Gordon，W.Chaynes，C.H.Pang.(1973)The Genus Bacillus.Agr. Handbook No.427 United states department of Agriculture. Washington D.C.
试验按以下手法进行。
1.形态上的性质(结果如下面[表1]所示)
(1)细胞的大小
(2)细胞的形状
(3)细胞形态有无多样性
用倍率5,000～30000倍的电子显微镜观察。试验菌是从用普通的琼 脂平板培养基于37℃下培养1天后形成的菌落中获得的。使用的普通琼 脂培养基由肉提取物5g、胨10g、NaCl15g、琼脂15g、蒸馏水1000ml 组成。
(4)有无运动性
1)用西泽.菅原的方法将鞭毛染色，于电子显微镜(倍率10000倍) 下观察。第1种溶液由单宁酸100ml、日本药典氯化铁液1.5ml、福 尔马林2ml、1％NaOH1ml、蒸馏水100ml组成，第2种溶液由硝酸银 2g、日本药典氨水少量、蒸馏水100ml组成。
2)在半流动性普通琼脂高层培养基上进行穿刺培养，以培养基整体的 混浊判定。使用的半流动性普通琼脂培养基由肉提取物5g、胨10g、
NaCl15g、琼脂5g、蒸馏水1000ml组成。
(5)有无孢子
1)将于普通肉汤培养基上振荡培养的培养液于85℃加热15分钟后， 转向普通琼脂培养基进行混合稀释培养，以菌落的出现进行判断。使用 的普通肉汤由肉提取物3g、胨5g、蒸馏水1000ml组成。
2)用Wirtz法(Schaeffer-Fulton修改法)对孢子染色，以菌体 为红色、孢子为绿色进行判断。菌体的红色来自0.5％藏红水溶液，而 孢子的绿色来自5％碱性孔雀石绿水溶液。
(6)孢子囊的形状
(7)孢子形状
(8)孢子的形成部位
(9)孢子的大小
用Wirtz法(Schaeffer-Fulton修改法)对孢子染色，于倍率5000倍 的电子显微镜观察。试验菌是从用普通的琼脂平板培养基于37℃下培 养1天后，于4℃在冷藏箱冷却1天的菌落中获得的。
(10)革兰氏染色
以Hucker修改法进行。阳性以结晶紫的紫色，阴性以对比染色的碱 性藏花红的红色判定。试验菌是从用普通的琼脂平板培养基于37℃下 培养1天后形成的菌落中获得的。
(11)抗酸性
依据Ziiehl-Neeisen染色法进行。阳性以苯酚品红的红色，阴性以对 比染色的碱性孔雀石绿的绿色判定。试验菌是从用普通的琼脂平板培养 基于37℃下培养1天后形成的菌落中获得的。
表1
形态学上的性质 形态学性质观察 项目 Bacillus sp. OYK-01-600 (FERM BP-6394) Bacillus sp. OYK-03-600 (FERM BP-6395) Baciillus sp. OYK-04-000 (FERM BP-6396) ①细胞的大小 0.7～0.9× 2.5～5.1μ 0.7～0.9× 2.5～5.1μ 0.7～0.9× 2.5～5.1μ ②细胞形状 杆菌 杆菌 杆菌 ③细胞的多形性 无 无 无 ④有无运动性 有 有 有 ⑤有无孢子 有 有 有 ⑥孢子囊的形状 未膨出 未膨出 未膨出 ⑦孢子的形状 长圆 长圆 长圆 ⑧孢子的形成部 位 中位～亚端位 中位～亚端位 中位～亚端位 ⑨孢子的大小 0.8～1.0× 1.5～1.8μ 0.8～1.0× 1.5～1.8μ 0.8～1.0× 1.5～1.8μ ⑩革兰氏染色 阳性 阳性 阳性 (11)抗酸性 阳性 阳性 阳性
2.在各个培养基中的繁殖状态(结果如下面的[表2][表3]所示)
(1)普通琼脂平板培养基
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
肉提取物5g、氯化钠5 g、胨10g、琼脂15g(pH7.0±0.1)、蒸馏水 1000ml
[培养条件]
在灭菌的平皿上固定培养基，在它上面进行划线培养。37℃×3日。
(2)普通琼脂斜面培养
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
同上
[培养条件]
在灭菌的试管内斜面固定培养基，在它上面进行划线培养。37℃×3日。
(3)普通肉汤液体培养
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
肉提取物5g、氯化钠5g、胨10g、pH7.0±0.1
[培养条件]
向灭菌的试管加入培养基，将菌悬浮于培养基中。37℃×3日、170 转/分，振荡培养。
(4)明胶穿刺培养
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
肉提取物5g、氯化钠5g、胨10g、明胶15g(pH7.0±0.1)
[培养条件]
在灭菌的试管高层固定培养基，进行穿刺培养。25℃×7日。
[繁殖以外的观察项目]
由于蛋白质的消化引起的明胶液化。
(5)石蕊汁液体培养
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
脱脂奶粉110g、石蕊适量、pH7.0±0.1
[培养条件]
向灭菌的试管加入培养基，将菌悬浮于培养基中。25℃×14日、静置培 养。
[繁殖以外的观察项目]
乳糖分解时，由于酸的产生引起的牛奶的凝固
乳糖分解时，由于凝乳酶的产生引起的牛奶的凝固
乳糖分解时，由于凝乳酶的产生引起的乳清的析出。
表2
于各个培养基中的繁殖状态 繁殖状态观察项目 Bacillus sp. OYK-01-600 (FERM BP-6394) Bacillus sp. OYK-03-600 (FERM BP-6395) Bacillus sp. OYK-04-000 (FERM BP-6396) ①普通琼脂平板培养 37℃×3日 繁殖状态 3变异株大致表现出同样的繁殖状况。 生长极快，1天直径长成2～3mm，2天4～6mm 表面状态 半透明，仅存在颗粒状凹凸。 颜色 近似冰激凌色的乳白色 大小 直径6～8mm 光泽 少许 形状 圆形 隆起 虽是扁平，但菌台厚 周边 没形成完整的边缘，成微毛或波状 色素的生成 无
表3 繁殖状态观察项目 Bacillus sp. OYK-01-600 (FERM BP-6394) Bacillus sp. OYK-03-600 (FERM BP-6395) Bacillus sp. OYK-04-000 (FERM BP-6396) ②普通琼脂平板培养 37℃×3日 繁殖状态 3变异株大致表现出同样的繁殖状况。 生长很好，在斜面上扩展良好 表面状态 半透明，仅存在颗粒状凹凸。 颜色 近似冰激凌色的乳白色 光泽 少许 形状 虽是扁平，但菌台重厚 ③普通肉汤液体培养 37℃×3日 混浊程度 高 高 高 液面的繁殖 存在多点 存在多点 存在多点 沉淀 中等程度 多 多 ④明胶穿刺培养 25℃×7日 繁殖状态 3变异株大致表现出同样的繁殖状况。 极好 液化 从高层表面可看到1.5cm白色混浊的液化层。 液化层是层状的。 ⑤石蕊汁培养 液体培养 25℃×14日 酸的产生 无 无 无 凝固 有 有 有 乳清的析出 有 有 有
3.生理学性质(1)(结果如[表4]所示)
(1)硝酸盐的还原
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
硝酸钾1g、胨5g、
[培养条件]
将培养基加到灭菌的试管，其中悬浮一铂金勺的菌。37℃×5日、170转 /分振荡培养。
[观察项目]
亚硝酸盐的检测：将α-萘胺液1ml和对氨基苯磺酸1ml与培养基充分混 合，如果成桃红色，就判定为阳性。
(2)脱氮反应
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
1)硝酸钠10g、肉提取物5g
2)肉提取物5g
[培养条件]
向灭菌的试管中分别加入上述1、2培养基，各2支，其中悬浮一铂金勺 的菌。2支中一支再加上1～2cm的液体石蜡。37℃×1～3日、静置培养。
[观察项目]
硝酸盐存在下有无厌氧繁殖：观察有无硝酸盐、4支有无液体石蜡的 试管的浊度、气体产生来判定。
(3)VP测试
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
胨5g、磷酸二氢钾5g、葡萄糖5g
[培养条件]
将培养基加到灭菌的试管，其中悬浮一铂金勺的菌。37℃×3日、170转 /分振荡培养。
[观察项目]
调查是否存在葡萄糖的分解产物乙酰基甲基甲醇：向1ml培养液中加入 α-萘酚溶液0.6ml和40％KOH水溶液0.2ml，如变成红色，就判定为阳 性。
(4)MR测试
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
胨5g、磷酸二氢钾5g、葡萄糖5g
[培养条件]
将培养基加到灭菌的试管，其中悬浮一铂金勺的菌。37℃×3日、170转 /分振荡培养。
[观察项目]
调查由于葡萄糖分解产生的酸：向1ml培养液中滴入甲基红，红色为阳 性，黄色判定为阴性。
(5)吲哚的产生
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
胨10g、氯化钠5g
[培养条件]
将培养基加到灭菌的试管，其中悬浮一铂金勺的菌。37℃×3日、170转 /分振荡培养。
[观察项目]
吲哚的检测：调查由氨基酸色氨酸有无产生吲哚的能力。向培养液中加 入培养液的1/5～1/10的Kovac试剂(参照下面)，充分振荡后，静置， 分为2层，上层如是红色判定为阳性，若为黄色判定为阴性。
对二甲胺基苯甲醛5g、戊醇75ml、浓盐酸25ml。
(6)硫化氢的产生
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中、市售TSI琼脂培养基)
肉提取物5g、葡萄糖1g、氯化钠5g、柠檬酸铁0.2g、胨15g、硫代 硫酸钠0.2g、乳糖10g、酚红0.002g、白糖10g、琼脂15g
[培养条件]
在灭菌的试管半斜面固定培养基，于高层部位进行穿刺培养，于斜面 进行涂布培养。37℃×1日
[观察项目]
硫化氢的检测：斜面低的部位如果有黑的变异物判定为阳性。
(7)淀粉水解
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
淀粉2g、肉提取物5g、胨10g、氯化钠5g、琼脂15g
[培养条件]
在灭菌的平皿上固定培养基，在其上面进行划线培养。室温×5日
[观察项目]
淀粉的检测：将碘、碘化钾液(参照下面)滴入可看到菌增殖的平皿， 如浓的紫色消失判定为阳性。
<碘、碘化钾液>
碘化钾5g、碘4g/200ml。
(8)酪蛋白的液化
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
脱脂乳2g、琼脂5g
[培养条件]
上述培养基分别灭菌，混合固定于灭菌的平皿上，在其上面进行划线培 养。37℃×1日
[观察项目]
酪蛋白的残留：若是划线部分的周围看到透明部分，判定为阳性。
(9)柠檬酸的利用
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中、市售CIT琼脂培养基)
磷酸氢二钾1g、磷酸氢二铵1g、柠檬酸钠2g、硫酸镁0.2g、氯化钠5 g、BTB 0.024g、琼脂15g
[培养条件]
在灭菌的平皿上固定培养基，在其上面进行划线培养。37℃×1～3日
[观察项目]
作为碳营养源只利用柠檬酸后有无繁殖：培养基变蓝或确认菌的繁殖 时，判定为阳性。
(10)色素的生成
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
胨20g、甘油10g、K2SO410g、MgCl21.4g、琼脂15g
[培养条件]
在灭菌的平皿上固定培养基，在其上面进行划线培养。25℃×5日
[观察项目]
色素生成：只在菌落周围部位着色时判定为非水溶性色素、培养基整 体着色时判定为水溶性各种色素的生成。
(11)脲酶
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
尿素20g、胨2g、葡萄糖1g、氯化钠5g、磷酸二氢钾2g、0.2％酚红 6ml、琼脂15g(其中琼脂进行121℃×15分钟灭菌，其它进行过滤灭 菌)
[培养条件]
在灭菌的试管斜面固定培养基，在斜面进行涂布培养。37℃×1日
[观察项目]
氨的检测：培养基变成红色时判定为阳性。
(12)氧化酶
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
肉提取物5g、胨10g、氯化钠5g、琼脂15g
[培养条件]
在灭菌的平皿上固定培养基，在其上面进行划线培养。37℃×1日
[观察项目]
是否存在细胞色素：向平板上的菌落滴1％二甲基-对苯二胺水溶液， 滴下颜色经粉红色变成黑色时，判定为阳性。
(13)过氧化氢酶
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
肉提取物5g、胨10g、氯化钠5g、琼脂15g
[培养条件]
在灭菌的平皿上固定培养基，在其上面进行划线培养。37℃×1日
[观察项目]
是否存在过氧化氢酶：是否存在催化过氧化氢分解的酶。向载玻片上 滴一滴3％H2O2液，然后加1铂金勺菌充分混合。氧气气泡多或持续产生 时，判定为阳性。
表4
生理学性质(1) Bacillus sp. OYK-01-600 (FERM BP-6394) Bacillus sp. OYK-03-600 (FERM BP-6395) Bacillus sp. OYK-04-000 (FERM BP-6396) (1)硝酸盐的还原 阳性 阳性 阳性 (2)脱氮反应 阴性 阴性 阴性 (3)VP测试 阳性 阳性 阳性 (4)MR测试 阴性 阴性 阴性 (5)吲哚的产生 阴性 阴性 阴性 (6)硫化氢的产生 阴性 阴性 阴性 (7)淀粉的水解 阳性 阳性 阳性 (8)酪蛋白的液化 阳性 阳性 阳性 (9)柠檬酸的利用 阳性 阳性 阳性 (10)色素的生成 阴性 阴性 阴性 (11)脲酶 阴性 阴性 阴性 (12)氧化酶 阳性 阳性 阳性 (13)过氧化氢酶 阳性 阳性 阳性
4.生理学性质(2)(结果如下面的[表5][表6]所示)
(1)pH对繁殖的影响
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中、市售的营养肉汤)
肉提取物3g、胨5g、pH调节剂(酸：H2SO41ml/100ml，碱：NaOH4g/1,000ml)、pH的变化在3.6～10.9范围变化15次。
[培养条件]
将培养基加到灭菌的试管，其中悬浮一铂金勺的菌。37℃×1日、170转 /分振荡培养。
[观察项目]
有无繁殖
++...... 繁殖良好
+.........进行繁殖
-+...... 只有少量繁殖
-.........极微量繁殖
--...... 完全不繁殖
(2)温度对繁殖的影响
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中、市售的普通琼脂培养基) 肉提取物5g、氯化钠5g、胨10g、琼脂15g(pH7.0±0.1)
[培养条件]
将培养基固定于灭菌的平皿上，在上面进行划线培养 温度分别变为4、10、20、30、37、40、50℃，各温度下培养1天
[观察项目]
有无繁殖
++...... 繁殖良好
+.........进行繁殖
-+...... 只有少量繁殖
-.........极微量繁殖
--...... 完全不繁殖
(3)对氧的反应
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中、市售普通琼脂培养基) 肉提取物5g、氯化钠5g、胨10g、琼脂15g(pH7.0±0.1)
[培养条件]
以将菌与培养基混合稀释的状态高层固定于灭菌的试管后进行培养。37 ℃×1日
[观察项目]
好氧、厌氧下有无繁殖
只在表面繁殖...............好氧性
在表面和高层内繁殖...... 兼性厌氧性
只在高层内繁殖.............偏向厌氧性
(4)O-F测试
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
胨2g、氯化钠5g、K2HPO40.3g、琼脂3g、0.2％BTB15ml、葡萄糖10g(其 中葡萄糖过滤灭菌，其它进行121℃×15分钟灭菌)
[培养条件]
向两支灭菌试管灌注培养基，进行高层固定。分别进行穿刺培养，其中 一支再加上1～2cm液体石蜡。37℃×3～4日
[观察项目]
糖分解是以氧化方式进行，还是以发酵方式进行。
“O”.......氧化方式的糖分解(只有在厌氧条件下变黄时)
“F”.......发酵方式的糖分解(无论是有氧、还是厌氧条件下都变黄时)
(5)PPA测试
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
酵母提取物3g、苯丙氨酸2g、磷酸钠1g、氯化钠5g、琼脂15ml
[培养条件]
在灭菌的试管斜面固定培养基，在斜面进行涂布培养。37℃×1日
[观察项目]
苯丙氨酸有无脱氨基变成苯丙酮酸：利用10％氯化铁水溶液滴定，变绿 时判定为阳性。
(6)丙酸的利用
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
硫酸镁0.2g、丙酸钠2g、磷酸氢二钾1g、磷酸氢二铵1g、氯化钠5g、 琼脂10g、0.2％BTB溶液12ml
[培养条件]
在灭菌的平皿上固定培养基，在其上面进行划线培养。37℃×1日
[观察项目]
调查作为碳营养源只利用丙酸有无繁殖：培养基变蓝或确认有菌的繁殖 时，判定为阳性。
(7)酪氨酸的分解
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
L-酪氨酸5g、肉提取物3g、胨5g、琼脂15g(其中酪氨酸和营养琼脂 分别湿热灭菌，然后进行混合)
[培养条件]
在灭菌的平皿上固定培养基，在其上面进行划线培养。37℃×7～14 日
[观察项目]
酪氨酸有无分解：在菌落的下面以结晶存在的酪氨酸溶解时，判断为 阳性。
(8)卵黄反应
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
胨10g、Na2HPO45g、KH2PO41g、NaCl 2g、MgSO40.1g、葡萄糖2g、卵黄 15ml(其中除去卵黄以外，都进行湿热灭菌，然后加入无菌条件下得到 的卵黄15ml，在冷藏室放置过夜。也要准备不加卵黄的培养基)
[培养条件]
向2支灭菌的试管中分别灌注有无卵黄的培养基，在每支试管各悬浮 一铂金勺的菌。37℃×7日。在第1、3、5、7日进行观察。170转/分振 荡培养。
[观察项目]
有无白色沉淀：与无卵黄相比，有卵黄的试管中，在试管的底部和表 面看到白色沉淀物时，判定为阳性。
(9)2％NaCl条件下的繁殖
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
肉提取物3g、胨5g、NaCl 20g
[培养条件]
将培养基加到灭菌的试管，其中悬浮一铂金勺的菌。37℃×14日、170 转/分振荡培养。
[观察项目]
有无繁殖
++...... 繁殖良好
+.........进行繁殖
-+...... 只有少量繁殖
-.........极微量繁殖
--...... 完全不繁殖
(10)5％NaCl条件下的繁殖
(11)7％NaCl条件下的繁殖
(12)12％NaCl条件下的繁殖
(13)20％NaCl条件下的繁殖
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
将上述9中的NaCl变为70g、120g、200g
[培养条件]
与上述9相同
[观察项目]
与上述9相同
(14)溶菌酶存在下的繁殖
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
肉提取物3g、胨5g、溶菌酶0.1g(溶菌酶在0.01N的HCl溶液中，煮 沸20分钟后，加入到营养肉汤内)
[培养条件]
将培养基加到灭菌的试管，其中悬浮一铂金勺的菌。37℃×14日、170 转/分振荡培养。
[观察项目]
有无繁殖
++......繁殖良好
+.........进行繁殖
-+...... 只有少量繁殖
-.........极微量繁殖
--..... 完全不繁殖
(15)溶血素的产生
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中，市售的羊血液琼脂培养基)
酪蛋白的胰酶降解产物14.5g、大豆汁的木瓜蛋白酶的降解产物5.0g、 氯化钠5.0g、生长因子1.5g、琼脂14.0g、去纤维的羊血5.0％。
[培养条件]
在灭菌的平皿上固定培养基，在其上面进行划线培养。37℃×1日
[观察项目]
有无产生溶血素
α型溶血......在菌落周边有绿色带(血红蛋白变质)
β型溶血......使菌落周边透明(红细胞膜破坏)
表5
生理学性质(2) Bacillus sp. OYK-01-600 (FERM BP-6394) Bacillus sp. OYK-03-600 (FERM BP-6395) Bacillus sp. OYK-04-000 (FERM BP-6396) (1)pH值对繁殖的影响 pH3.6 -- -- -- pH4.1 -- -- -- pH4.5 -- -- -- pH4.9 -- -- -- pH5.4 -- -- -- pH6.1 ++ ++ ++ pH6.5 ++ ++ ++ pH7.1 ++ ++ ++ pH7.5 ++ ++ ++ pH8.0 ++ ++ ++ pH8.6 ++ ++ ++ pH9.1 + ++ ++ pH9.5 + + + pH10.2 + + + pH10.9 -+ -+ -+ (2)温度对繁殖的影响 4℃ -- -- -- 10℃ -+ -+ -+ 20℃ + + + 30℃ ++ ++ ++ 37℃ ++ ++ ++ 40℃ ++ ++ ++ 50℃ + + +
表6 Bacillus sp. OYK-01-600 (FERM BP-6394) Bacillus sp. OYK-03-600 (FERM BP-6395) Bacillus sp. OYK-04-000 (FERM BP-6396) (3)对氧的反应 兼性厌氧 兼性厌氧 兼性厌氧 (4)O-F测试 F F F (5)PPA测试 阴性 阴性 阴性 (6)丙酸的利用 阴性 阴性 阴性 (7)酪氨酸的分解 阴性 阴性 阴性 (8)卵黄反应 阴性 阴性 阴性 (9)2％NaCl条件下的繁殖 ++ ++ ++ (10)5％NaCl条件下的繁殖 + - - (11)7％NaCl条件下的繁殖 - -- - (12)12％NaCl条件下的繁殖 -- -- -- (13)20％NaCl条件下的繁殖 -- -- -- (14)溶菌酶条件下的繁殖 ++ ++ ++ (15)溶血素的产生 阴性 阴性 阴性
5.碳源的酸和气体的生成(结果如[表7]所示)
(1)D-葡萄糖
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
胨1g、氯化钠5g、琼脂10g、0.2％BTB15ml、D-葡萄糖8g
[培养条件]
向灭菌试管灌注培养基，进行高层固定。分别进行穿刺培养。37℃×14 日
[观察项目]
酸的生成：以BTB试剂变黄程度判定
++.........生成很多
+......... 生成
-+...... 生成微量
-........没有生成 气体的生成：以高层部位有无龟裂判定
++...... 生成很多
+.........生成
-+...... 生成微量
-.........没有生成
(2)L-阿拉伯糖
(3)D-木糖
(4)D-甘露醇
(5)D-甘露糖
(6)D-半乳糖
(7)D-山梨糖
(8)肌醇
(9)海藻糖
(10)乳糖
(11)麦芽糖
(12)果糖
[培养基组成](蒸馏水100ml中)
将上述(1)的糖(D-葡萄糖)部分换成以上的(2)～(12)的糖。
[培养条件]
与上述(1)相同
[观察项目]
与上述(1)相同
表7
碳源的酸及气体的生成 Bacillus sp. OYK-01-600 (FERM BP-6394) Bacillus sp. OYK-03-600 (FERM BP-6395) Bacillus sp. OYK-04-000 (FERM BP-6396) 酸 气体 酸 气体 酸 气体 (1)D-葡萄糖 ++ - ++ - ++ - (2)L-阿拉伯糖 ++ - ++ - ++ - (3)D-木糖 + - + - + - (4)D-甘露醇 + - + - + - (5)D-甘露糖 -+ - -+ - -+ - (6)D-半乳糖 - - - - - - (7)D-山梨糖 - - - - - - (8)肌醇 + - + - + - (9)海藻糖 + - + - + - (10)乳糖 -+ - -+ - -+ - (11)麦芽糖 - - - - - -
6.鉴定结果
OYK-01-600、OYK-03-600和OYK-04-000 3菌株根据下面的文献进行分类。
①Bergey’s Mannual of Determinative Bacteriology Vol.2(1986)， Eillismd & Eilkind U.S.A
②R.E.Gordon，W.Chaynes，C.H.Pang.(1973) The Genus Bacillus.Agr. Handbook No.427 United states department of Agriculture. Washington D.C.
表8
鉴定结果(1)属的鉴定 Bacillus OYK-01-600 OYK-03-600 OYK-04-000 (1)杆状细胞 + + + + (2)直径2.5μm以上 - - - - (3)纤丝 - - - - (4)杆，纤丝的弯曲 - - - - (5)4连或集块状球菌 - - - - (6)内孢子形成 + + + + (7)运动性 + + + + (8)繁殖期内革兰氏染色阳性 + + + + (9)偏向厌氧性 D - - - (10)兼性厌氧性或微好氧性 D + + + (11)兼性 - - - - (12)类似乳酸发酵 D + + + (13)磷酸盐的还原 - - - - (14)过氧化氢酶 + + + + (15)氧化酶 D + + + (16)由葡萄糖产生的酸 + + + + (17)硝酸盐的还原 D + + + (18)Mol％G+C 32-69 ND ND ND
+：90％以上阳性 -：10％以下阳性 D：因种属而异 ND：没有有 效的数据
表9
鉴定结果(2)种的鉴定 subt-il is fir-mu s pumi-l us lichen-i formis lentus OYK01 -600 OYK-03 -600 OYK-04 -000 1)细胞直径小于1.0μm - - - - - - - - 2)形成球状孢子 - - - - - - - - 3)形成鼓出的孢子囊 - - - - - - - - 4)Parasporal crystals的有无 - - - - - - - - 5)过氧化氢酶 + + + + + + + + 6)厌氧下繁殖 - - - + - + + + 7)Voges-Proskauer测试 + - + + - + + + 8)VP培养基中的繁殖pH＜6 pH＞7 d - - + - + - - ND d + d + d + 9)由糖产生酸D-葡萄糖 L-阿拉伯糖 D-木糖 D-甘露糖醇 + + + + + - - + + + + + + + + + + + + + + + d d + + d d + + d d 10)由葡萄糖产生气体 - - - - - - - - 11)水解能力 酪蛋白 明胶 淀粉 + + + + + + + + - + + + d d + + + + + + + + + + 12)作为碳源利用的酸 柠檬酸 丙酸 + - - - + - + + - - + - + - + - 13)酪氨酸的分解 - d - - - - - - 14)苯丙氨酸的脱氨 - d - - d - - - 15)卵黄反应 - - - - - - - - 16)硝酸向亚硝酸的还原 + d - + d + + + 17)吲哚的产生 - - - - - - - -
表10 subt-il is fir-mu s pumi-l us lichen-i formis lentus OYK-01 -600 OYK-03 -600 OYK-04 -000 18)二羟丙酮的产生 ND - ND ND - ND ND ND 19)NaCl和KCl的需求 - - - - - - - - 20)尿囊素或尿酸盐的需求 - - - - - - - - 21)在pH6.8肉汤中的繁殖 + + + + + + + + 22)在pH5.7肉汤中的繁殖 + - + + - d d d 23)在NaCl中的繁殖 2％ 5％ 7％ 10％ + + + ND + + + ND + + + ND + + + ND ND ND d ND + d d - + - - - + d - - 24)繁殖温度 5℃ 10℃ 30℃ 40℃ 50℃ 55℃ 60℃ - d + + d - - - d + + - - - - + + + d - - - - + + + + - ND ND + ND - - - - d + + d - - - d + + d - - - d + + d - - 25)在溶菌酶存在下的繁殖 d - d d - + + + 26)以H2+CO2或CO作为碳源的 繁殖 - - - - - - - -
+：90％以上阳性 -：90％以上阴性 d：11～89％阳性 ND：没有 有效的数据
因此从[表8]可以认为上述3株都属于Bacillus属，从[表9]、[表 10]又可认为都属于B.subgtilis的类缘菌，但根据厌氧条件下可以繁殖， 由糖产生酸微弱，以及在7％NaCL条件下不能繁殖等现象又不能鉴定， 所以判断为新种，定为Bacillus sp.。
①保藏机关的名称：通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所专 利微生物保藏中心
地址：邮编305-0046
日本国茨城且筑波市东1-1-3(TEL：0298-54-6029)
②保藏日：1998年6月29日
③保藏号：(1)FERM BP-6394
(2)FERM BP-6395
(3)FERM BP-6396
C.OYK菌增殖速度试验(参照图1)
本发明的新微生物培养开始后不需要诱导期，就开始迅速增殖。例如 菌约103个/ml(g)的菌浓度于20～40℃的培养条件下，在6小时以内 就增加到108个/ml(g)以上。
图1表示了Bacillus sp.OYK-01-600随时间推移的增殖状况，OYK 菌株，B.subtilis(IFO3134)菌株增殖试验37℃，振荡培养，NB培养基。 另外作为对照，图中也给出了B.subtilis标准菌(IFO3134)的增殖状 况。图1表示的曲线，纵轴取菌数的对数，横轴为时间画出的曲线。就 象从该曲线了解到的那样，本发明的OYK菌几乎没有诱导期，培养开始 后就开始迅速增殖，约103个/ml(g)的菌浓度在5小时左右就达到108 个/ml(g)以上。与此相比，B.subtilis标准菌(IFO3134)培养开始后， 经过6～8小时的诱导期后才真正开始增殖，达到约108个/ml(g)的菌 浓度大约需要12小时。另外OYK菌的体积是上述标准菌体积的4倍，而 且4小时后标准菌增殖6倍时，OYK菌增殖是20000倍，体积为标准菌的 20000×4＝80000倍。如果单纯比较体积，80000÷6＝13333...，体积大1 万倍以上。
作为本发明的新微生物的枯草杆菌类缘菌的具体例子如以下的OYK菌 (国际保藏于通商产业省工业技术院生命工程工业技术研究所专利微生 物保藏中心)。
(1)Bacillus sp.OYK-01-600(FERM BP-6394)、
(2)Bacillus sp.OYK-03-600(FERM BP-6395)、
(3)Bacillus sp.OYK-04-000(FERM BP-6396)。
以下也将OYK-01-600、OYK-03-600、OYK-04-000菌简单地称之为[OYK] 菌。
OYK菌消化蛋白质后繁殖很快。而OYK菌具有不产生溶血素的特征， 是对人安全性很高的菌。而将该菌对动物进行静脉注射、经气道、经口 服以及皮肤注射4种给菌方式可以确认该菌的安全性。
OYK菌即使在枯草杆菌种属中也是比较大型的菌，例如它大约是枯草 杆菌标准菌(IFO-3134(0.4～0.6×1.5～3.2μm))体积的4倍(体积 比)。然而OYK菌在培育开始后的初期增殖力有优势，因此可以产生大量 的代谢能(标准菌只有在培育开始后4小时增殖6倍左右，而OYK菌可 以大约80000倍的极高速度进行增殖)。而且由于OYK菌是个兼性厌氧菌， 所以在好氧、厌氧两种条件下都有可能进行极强的增殖。因此在进行堆 肥化时，会使有机废弃物迅速升温，然后促进作为高温菌的放线菌、真 菌(丝状菌)的活动，在缩短堆肥化期的同时可得到完全成熟的堆肥。
附图的简单说明
图1是表示比较OYK菌和B.subtilis标准菌的增殖速度的曲线图。
发明的最佳实施方式
以下说明本发明的实施例，这些实施例是为了说明本发明的一个例 子，并不限定本发明的范围。
A.新微生物的筛选
从土壤中分离出3株对由于增殖产生恶臭的细菌具有抗菌性的微生 物。一般来说土壤菌毒性小，可以说从这样的土壤中分离的3个OYK菌 对人体也是安全的(温和的)。
B.菌株的鉴定
根据下面的①、②鉴定这里分离选出的菌体的菌学性质。即依据以下 记载进行鉴定：
①Bergey’s Mannual of Determinative Bacteriology Vol.2(1986)， Eillismd & Eilkind U.S.A
②R.E.Gordon，W.Chaynes，C.H.Pang.(1973)The Genus Bacillus.Agr. Handbook No.427 United states department of Agriculture. Washington D.C.
试验按以下手法进行。
1.形态上的性质(结果如下面[表1]所示)
(1)细胞的大小
(2)细胞的形状
(3)细胞形态有无多样性
用倍率5,000～30000倍的电子显微镜观察。试验菌是从用普通的琼 脂平板培养基于37℃下培养1天后形成的菌落中获得的。使用的普通琼 脂培养基由肉提取物5g、胨10g、NaCl15g、琼脂15g、蒸馏水1000ml 组成。
(4)有无运动性
1)用西泽.菅原的方法将鞭毛染色，于电子显微镜(倍率10000倍) 下观察。第1种溶液由单宁酸100ml、日本药典氯化铁液1.5ml、福 尔马林2ml、1％NaOH1ml、蒸馏水100ml组成，第2种溶液由硝酸银 2g、日本药典氨水少量、蒸馏水100ml组成。
2)在半流动性普通琼脂高层培养基上进行穿刺培养，以培养基整体的 混浊判定。使用的半流动性普通琼脂培养基由肉提取物5g、胨10g、
NaCl15g、琼脂5g、蒸馏水1000ml组成。
(5)有无孢子
1)将于普通肉汤培养基上振荡培养的培养液于85℃加热15分钟后， 转向普通琼脂培养基进行混合稀释培养，以菌落的出现进行判断。使用 的普通肉汤由肉提取物3g、胨5g、蒸馏水1000ml组成。
2)用Wirtz法(Schaeffer-Fulton修改法)对孢子染色，以菌体 为红色、孢子为绿色进行判断。菌体的红色来自0.5％藏红水溶液，而 孢子的绿色来自5％碱性孔雀石绿水溶液。
(6)孢子囊的形状
(7)孢子形状
(8)孢子的形成部位
(9)孢子的大小
用Wirtz法(Schaeffer-Fulton修改法)对孢子染色，于倍率5000倍 的电子显微镜观察。试验菌是从用普通的琼脂平板培养基于37℃下培 养1天后，于4℃在冷藏箱冷却1天的菌落中获得的。
(10)革兰氏染色
以Hucker修改法进行。阳性以结晶紫的紫色，阴性以对比染色的碱 性藏花红的红色判定。试验菌是从用普通的琼脂平板培养基于37℃下 培养1天后形成的菌落中获得的。
(11)抗酸性
依据Ziiehl-Neeisen染色法进行。阳性以苯酚品红的红色，阴性以对 比染色的碱性孔雀石绿的绿色判定。试验菌是从用普通的琼脂平板培养 基于37℃下培养1天后形成的菌落中获得的。
表1
形态学上的性质 形态学性质观察 项目 Bacillus sp. OYK-01-600 (FERM BP-6394) Bacillus sp. OYK-03-600 (FERM BP-6395) Baciillus sp. OYK-04-000 (FERM BP-6396) ①细胞的大小 0.7～0.9× 2.5～5.1μ 0.7～0.9× 2.5～5.1μ 0.7～0.9× 2.5～5.1μ ②细胞形状 杆菌 杆菌 杆菌 ③细胞的多形性 无 无 无 ④有无运动性 有 有 有 ⑤有无孢子 有 有 有 ⑥孢子囊的形状 未膨出 未膨出 未膨出 ⑦孢子的形状 长圆 长圆 长圆 ⑧孢子的形成部 位 中位～亚端位 中位～亚端位 中位～亚端位 ⑨孢子的大小 0.8～1.0× 1.5～1.8μ 0.8～1.0× 1.5～1.8μ 0.8～1.0× 1.5～1.8μ ⑩革兰氏染色 阳性 阳性 阳性 (11)抗酸性 阳性 阳性 阳性
2.在各个培养基中的繁殖状态(结果如下面的[表2][表3]所示)
(1)普通琼脂平板培养基
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
肉提取物5g、氯化钠5 g、胨10g、琼脂15g(pH7.0±0.1)、蒸馏水 1000ml
[培养条件]
在灭菌的平皿上固定培养基，在它上面进行划线培养。37℃×3日。
(2)普通琼脂斜面培养
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
同上
[培养条件]
在灭菌的试管内斜面固定培养基，在它上面进行划线培养。37℃×3日。
(3)普通肉汤液体培养
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
肉提取物5g、氯化钠5g、胨10g、pH7.0±0.1
[培养条件]
向灭菌的试管加入培养基，将菌悬浮于培养基中。37℃×3日、170 转/分，振荡培养。
(4)明胶穿刺培养
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
肉提取物5g、氯化钠5g、胨10g、明胶15g(pH7.0±0.1)
[培养条件]
在灭菌的试管高层固定培养基，进行穿刺培养。25℃×7日。
[繁殖以外的观察项目]
由于蛋白质的消化引起的明胶液化。
(5)石蕊汁液体培养
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
脱脂奶粉110g、石蕊适量、pH7.0±0.1
[培养条件]
向灭菌的试管加入培养基，将菌悬浮于培养基中。25℃×14日、静置培 养。
[繁殖以外的观察项目]
乳糖分解时，由于酸的产生引起的牛奶的凝固
乳糖分解时，由于凝乳酶的产生引起的牛奶的凝固
乳糖分解时，由于凝乳酶的产生引起的乳清的析出。
表2
于各个培养基中的繁殖状态 繁殖状态观察项目 Bacillus sp. OYK-01-600 (FERM BP-6394) Bacillus sp. OYK-03-600 (FERM BP-6395) Bacillus sp. OYK-04-000 (FERM BP-6396) ①普通琼脂平板培养 37℃×3日 繁殖状态 3变异株大致表现出同样的繁殖状况。 生长极快，1天直径长成2～3mm，2天4～6mm 表面状态 半透明，仅存在颗粒状凹凸。 颜色 近似冰激凌色的乳白色 大小 直径6～8mm 光泽 少许 形状 圆形 隆起 虽是扁平，但菌台厚 周边 没形成完整的边缘，成微毛或波状 色素的生成 无
表3 繁殖状态观察项目 Bacillus sp. OYK-01-600 (FERM BP-6394) Bacillus sp. OYK-03-600 (FERM BP-6395) Bacillus sp. OYK-04-000 (FERM BP-6396) ②普通琼脂平板培养 37℃×3日 繁殖状态 3变异株大致表现出同样的繁殖状况。 生长很好，在斜面上扩展良好 表面状态 半透明，仅存在颗粒状凹凸。 颜色 近似冰激凌色的乳白色 光泽 少许 形状 虽是扁平，但菌台重厚 ③普通肉汤液体培养 37℃×3日 混浊程度 高 高 高 液面的繁殖 存在多点 存在多点 存在多点 沉淀 中等程度 多 多 ④明胶穿刺培养 25℃×7日 繁殖状态 3变异株大致表现出同样的繁殖状况。 极好 液化 从高层表面可看到1.5cm白色混浊的液化层。 液化层是层状的。 ⑤石蕊汁培养 液体培养 25℃×14日 酸的产生 无 无 无 凝固 有 有 有 乳清的析出 有 有 有
3.生理学性质(1)(结果如[表4]所示)
(1)硝酸盐的还原
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
硝酸钾1g、胨5g、
[培养条件]
将培养基加到灭菌的试管，其中悬浮一铂金勺的菌。37℃×5日、170转 /分振荡培养。
[观察项目]
亚硝酸盐的检测：将α-萘胺液1ml和对氨基苯磺酸1ml与培养基充分混 合，如果成桃红色，就判定为阳性。
(2)脱氮反应
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
1)硝酸钠10g、肉提取物5g
2)肉提取物5g
[培养条件]
向灭菌的试管中分别加入上述1、2培养基，各2支，其中悬浮一铂金勺 的菌。2支中一支再加上1～2cm的液体石蜡。37℃×1～3日、静置培养。
[观察项目]
硝酸盐存在下有无厌氧繁殖：观察有无硝酸盐、4支有无液体石蜡的 试管的浊度、气体产生来判定。
(3)VP测试
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
胨5g、磷酸二氢钾5g、葡萄糖5g
[培养条件]
将培养基加到灭菌的试管，其中悬浮一铂金勺的菌。37℃×3日、170转 /分振荡培养。
[观察项目]
调查是否存在葡萄糖的分解产物乙酰基甲基甲醇：向1ml培养液中加入 α-萘酚溶液0.6ml和40％KOH水溶液0.2ml，如变成红色，就判定为阳 性。
(4)MR测试
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
胨5g、磷酸二氢钾5g、葡萄糖5g
[培养条件]
将培养基加到灭菌的试管，其中悬浮一铂金勺的菌。37℃×3日、170转 /分振荡培养。
[观察项目]
调查由于葡萄糖分解产生的酸：向1ml培养液中滴入甲基红，红色为阳 性，黄色判定为阴性。
(5)吲哚的产生
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
胨10g、氯化钠5g
[培养条件]
将培养基加到灭菌的试管，其中悬浮一铂金勺的菌。37℃×3日、170转 /分振荡培养。
[观察项目]
吲哚的检测：调查由氨基酸色氨酸有无产生吲哚的能力。向培养液中加 入培养液的1/5～1/10的Kovac试剂(参照下面)，充分振荡后，静置， 分为2层，上层如是红色判定为阳性，若为黄色判定为阴性。
对二甲胺基苯甲醛5g、戊醇75ml、浓盐酸25ml。
(6)硫化氢的产生
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中、市售TSI琼脂培养基)
肉提取物5g、葡萄糖1g、氯化钠5g、柠檬酸铁0.2g、胨15g、硫代 硫酸钠0.2g、乳糖10g、酚红0.002g、白糖10g、琼脂15g
[培养条件]
在灭菌的试管半斜面固定培养基，于高层部位进行穿刺培养，于斜面 进行涂布培养。37℃×1日
[观察项目]
硫化氢的检测：斜面低的部位如果有黑的变异物判定为阳性。
(7)淀粉水解
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
淀粉2g、肉提取物5g、胨10g、氯化钠5g、琼脂15g
[培养条件]
在灭菌的平皿上固定培养基，在其上面进行划线培养。室温×5日
[观察项目]
淀粉的检测：将碘、碘化钾液(参照下面)滴入可看到菌增殖的平皿， 如浓的紫色消失判定为阳性。
<碘、碘化钾液>
碘化钾5g、碘4g/200ml。
(8)酪蛋白的液化
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
脱脂乳2g、琼脂5g
[培养条件]
上述培养基分别灭菌，混合固定于灭菌的平皿上，在其上面进行划线培 养。37℃×1日
[观察项目]
酪蛋白的残留：若是划线部分的周围看到透明部分，判定为阳性。
(9)柠檬酸的利用
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中、市售CIT琼脂培养基)
磷酸氢二钾1g、磷酸氢二铵1g、柠檬酸钠2g、硫酸镁0.2g、氯化钠5 g、BTB 0.024g、琼脂15g
[培养条件]
在灭菌的平皿上固定培养基，在其上面进行划线培养。37℃×1～3日
[观察项目]
作为碳营养源只利用柠檬酸后有无繁殖：培养基变蓝或确认菌的繁殖 时，判定为阳性。
(10)色素的生成
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
胨20g、甘油10g、K2SO410g、MgCl21.4g、琼脂15g
[培养条件]
在灭菌的平皿上固定培养基，在其上面进行划线培养。25℃×5日
[观察项目]
色素生成：只在菌落周围部位着色时判定为非水溶性色素、培养基整 体着色时判定为水溶性各种色素的生成。
(11)脲酶
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
尿素20g、胨2g、葡萄糖1g、氯化钠5g、磷酸二氢钾2g、0.2％酚红 6ml、琼脂15g(其中琼脂进行121℃×15分钟灭菌，其它进行过滤灭 菌)
[培养条件]
在灭菌的试管斜面固定培养基，在斜面进行涂布培养。37℃×1日
[观察项目]
氨的检测：培养基变成红色时判定为阳性。
(12)氧化酶
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
肉提取物5g、胨10g、氯化钠5g、琼脂15g
[培养条件]
在灭菌的平皿上固定培养基，在其上面进行划线培养。37℃×1日
[观察项目]
是否存在细胞色素：向平板上的菌落滴1％二甲基-对苯二胺水溶液， 滴下颜色经粉红色变成黑色时，判定为阳性。
(13)过氧化氢酶
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
肉提取物5g、胨10g、氯化钠5g、琼脂15g
[培养条件]
在灭菌的平皿上固定培养基，在其上面进行划线培养。37℃×1日
[观察项目]
是否存在过氧化氢酶：是否存在催化过氧化氢分解的酶。向载玻片上 滴一滴3％H2O2液，然后加1铂金勺菌充分混合。氧气气泡多或持续产生 时，判定为阳性。
表4
生理学性质(1) Bacillus sp. OYK-01-600 (FERM BP-6394) Bacillus sp. OYK-03-600 (FERM BP-6395) Bacillus sp. OYK-04-000 (FERM BP-6396) (1)硝酸盐的还原 阳性 阳性 阳性 (2)脱氮反应 阴性 阴性 阴性 (3)VP测试 阳性 阳性 阳性 (4)MR测试 阴性 阴性 阴性 (5)吲哚的产生 阴性 阴性 阴性 (6)硫化氢的产生 阴性 阴性 阴性 (7)淀粉的水解 阳性 阳性 阳性 (8)酪蛋白的液化 阳性 阳性 阳性 (9)柠檬酸的利用 阳性 阳性 阳性 (10)色素的生成 阴性 阴性 阴性 (11)脲酶 阴性 阴性 阴性 (12)氧化酶 阳性 阳性 阳性 (13)过氧化氢酶 阳性 阳性 阳性
4.生理学性质(2)(结果如下面的[表5][表6]所示)
(1)pH对繁殖的影响
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中、市售的营养肉汤)
肉提取物3g、胨5g、pH调节剂(酸：H2SO41ml/100ml，碱：NaOH4g/1,000ml)、pH的变化在3.6～10.9范围变化15次。
[培养条件]
将培养基加到灭菌的试管，其中悬浮一铂金勺的菌。37℃×1日、170转 /分振荡培养。
[观察项目]
有无繁殖
++...... 繁殖良好
+.........进行繁殖
-+...... 只有少量繁殖
-.........极微量繁殖
--...... 完全不繁殖
(2)温度对繁殖的影响
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中、市售的普通琼脂培养基) 肉提取物5g、氯化钠5g、胨10g、琼脂15g(pH7.0±0.1)
[培养条件]
将培养基固定于灭菌的平皿上，在上面进行划线培养 温度分别变为4、10、20、30、37、40、50℃，各温度下培养1天
[观察项目]
有无繁殖
++...... 繁殖良好
+.........进行繁殖
-+...... 只有少量繁殖
-.........极微量繁殖
--...... 完全不繁殖
(3)对氧的反应
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中、市售普通琼脂培养基) 肉提取物5g、氯化钠5g、胨10g、琼脂15g(pH7.0±0.1)
[培养条件]
以将菌与培养基混合稀释的状态高层固定于灭菌的试管后进行培养。37 ℃×1日
[观察项目]
好氧、厌氧下有无繁殖
只在表面繁殖...............好氧性
在表面和高层内繁殖...... 兼性厌氧性
只在高层内繁殖.............偏向厌氧性
(4)O-F测试
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
胨2g、氯化钠5g、K2HPO40.3g、琼脂3g、0.2％BTB15ml、葡萄糖10g(其 中葡萄糖过滤灭菌，其它进行121℃×15分钟灭菌)
[培养条件]
向两支灭菌试管灌注培养基，进行高层固定。分别进行穿刺培养，其中 一支再加上1～2cm液体石蜡。37℃×3～4日
[观察项目]
糖分解是以氧化方式进行，还是以发酵方式进行。
“O”.......氧化方式的糖分解(只有在厌氧条件下变黄时)
“F”.......发酵方式的糖分解(无论是有氧、还是厌氧条件下都变黄时)
(5)PPA测试
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
酵母提取物3g、苯丙氨酸2g、磷酸钠1g、氯化钠5g、琼脂15ml
[培养条件]
在灭菌的试管斜面固定培养基，在斜面进行涂布培养。37℃×1日
[观察项目]
苯丙氨酸有无脱氨基变成苯丙酮酸：利用10％氯化铁水溶液滴定，变绿 时判定为阳性。
(6)丙酸的利用
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
硫酸镁0.2g、丙酸钠2g、磷酸氢二钾1g、磷酸氢二铵1g、氯化钠5g、 琼脂10g、0.2％BTB溶液12ml
[培养条件]
在灭菌的平皿上固定培养基，在其上面进行划线培养。37℃×1日
[观察项目]
调查作为碳营养源只利用丙酸有无繁殖：培养基变蓝或确认有菌的繁殖 时，判定为阳性。
(7)酪氨酸的分解
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
L-酪氨酸5g、肉提取物3g、胨5g、琼脂15g(其中酪氨酸和营养琼脂 分别湿热灭菌，然后进行混合)
[培养条件]
在灭菌的平皿上固定培养基，在其上面进行划线培养。37℃×7～14 日
[观察项目]
酪氨酸有无分解：在菌落的下面以结晶存在的酪氨酸溶解时，判断为 阳性。
(8)卵黄反应
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
胨10g、Na2HPO45g、KH2PO41g、NaCl 2g、MgSO40.1g、葡萄糖2g、卵黄 15ml(其中除去卵黄以外，都进行湿热灭菌，然后加入无菌条件下得到 的卵黄15ml，在冷藏室放置过夜。也要准备不加卵黄的培养基)
[培养条件]
向2支灭菌的试管中分别灌注有无卵黄的培养基，在每支试管各悬浮 一铂金勺的菌。37℃×7日。在第1、3、5、7日进行观察。170转/分振 荡培养。
[观察项目]
有无白色沉淀：与无卵黄相比，有卵黄的试管中，在试管的底部和表 面看到白色沉淀物时，判定为阳性。
(9)2％NaCl条件下的繁殖
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
肉提取物3g、胨5g、NaCl 20g
[培养条件]
将培养基加到灭菌的试管，其中悬浮一铂金勺的菌。37℃×14日、170 转/分振荡培养。
[观察项目]
有无繁殖
++...... 繁殖良好
+.........进行繁殖
-+...... 只有少量繁殖
-.........极微量繁殖
--...... 完全不繁殖
(10)5％NaCl条件下的繁殖
(11)7％NaCl条件下的繁殖
(12)12％NaCl条件下的繁殖
(13)20％NaCl条件下的繁殖
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
将上述9中的NaCl变为70g、120g、200g
[培养条件]
与上述9相同
[观察项目]
与上述9相同
(14)溶菌酶存在下的繁殖
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
肉提取物3g、胨5g、溶菌酶0.1g(溶菌酶在0.01N的HCl溶液中，煮 沸20分钟后，加入到营养肉汤内)
[培养条件]
将培养基加到灭菌的试管，其中悬浮一铂金勺的菌。37℃×14日、170 转/分振荡培养。
[观察项目]
有无繁殖
++......繁殖良好
+.........进行繁殖
-+...... 只有少量繁殖
-.........极微量繁殖
--..... 完全不繁殖
(15)溶血素的产生
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中，市售的羊血液琼脂培养基)
酪蛋白的胰酶降解产物14.5g、大豆汁的木瓜蛋白酶的降解产物5.0g、 氯化钠5.0g、生长因子1.5g、琼脂14.0g、去纤维的羊血5.0％。
[培养条件]
在灭菌的平皿上固定培养基，在其上面进行划线培养。37℃×1日
[观察项目]
有无产生溶血素
α型溶血......在菌落周边有绿色带(血红蛋白变质)
β型溶血......使菌落周边透明(红细胞膜破坏)
表5
生理学性质(2) Bacillus sp. OYK-01-600 (FERM BP-6394) Bacillus sp. OYK-03-600 (FERM BP-6395) Bacillus sp. OYK-04-000 (FERM BP-6396) (1)pH值对繁殖的影响 pH3.6 -- -- -- pH4.1 -- -- -- pH4.5 -- -- -- pH4.9 -- -- -- pH5.4 -- -- -- pH6.1 ++ ++ ++ pH6.5 ++ ++ ++ pH7.1 ++ ++ ++ pH7.5 ++ ++ ++ pH8.0 ++ ++ ++ pH8.6 ++ ++ ++ pH9.1 + ++ ++ pH9.5 + + + pH10.2 + + + pH10.9 -+ -+ -+ (2)温度对繁殖的影响 4℃ -- -- -- 10℃ -+ -+ -+ 20℃ + + + 30℃ ++ ++ ++ 37℃ ++ ++ ++ 40℃ ++ ++ ++ 50℃ + + +
表6 Bacillus sp. OYK-01-600 (FERM BP-6394) Bacillus sp. OYK-03-600 (FERM BP-6395) Bacillus sp. OYK-04-000 (FERM BP-6396) (3)对氧的反应 兼性厌氧 兼性厌氧 兼性厌氧 (4)O-F测试 F F F (5)PPA测试 阴性 阴性 阴性 (6)丙酸的利用 阴性 阴性 阴性 (7)酪氨酸的分解 阴性 阴性 阴性 (8)卵黄反应 阴性 阴性 阴性 (9)2％NaCl条件下的繁殖 ++ ++ ++ (10)5％NaCl条件下的繁殖 + - - (11)7％NaCl条件下的繁殖 - -- - (12)12％NaCl条件下的繁殖 -- -- -- (13)20％NaCl条件下的繁殖 -- -- -- (14)溶菌酶条件下的繁殖 ++ ++ ++ (15)溶血素的产生 阴性 阴性 阴性
5.碳源的酸和气体的生成(结果如[表7]所示)
(1)D-葡萄糖
[培养基组成](蒸馏水1,000ml中)
胨1g、氯化钠5g、琼脂10g、0.2％BTB15ml、D-葡萄糖8g
[培养条件]
向灭菌试管灌注培养基，进行高层固定。分别进行穿刺培养。37℃×14 日
[观察项目]
酸的生成：以BTB试剂变黄程度判定
++.........生成很多
+......... 生成
-+...... 生成微量
-........没有生成 气体的生成：以高层部位有无龟裂判定
++...... 生成很多
+.........生成
-+...... 生成微量
-.........没有生成
(2)L-阿拉伯糖
(3)D-木糖
(4)D-甘露醇
(5)D-甘露糖
(6)D-半乳糖
(7)D-山梨糖
(8)肌醇
(9)海藻糖
(10)乳糖
(11)麦芽糖
(12)果糖
[培养基组成](蒸馏水100ml中)
将上述(1)的糖(D-葡萄糖)部分换成以上的(2)～(12)的糖。
[培养条件]
与上述(1)相同
[观察项目]
与上述(1)相同
表7
碳源的酸及气体的生成 Bacillus sp. OYK-01-600 (FERM BP-6394) Bacillus sp. OYK-03-600 (FERM BP-6395) Bacillus sp. OYK-04-000 (FERM BP-6396) 酸 气体 酸 气体 酸 气体 (1)D-葡萄糖 ++ - ++ - ++ - (2)L-阿拉伯糖 ++ - ++ - ++ - (3)D-木糖 + - + - + - (4)D-甘露醇 + - + - + - (5)D-甘露糖 -+ - -+ - -+ - (6)D-半乳糖 - - - - - - (7)D-山梨糖 - - - - - - (8)肌醇 + - + - + - (9)海藻糖 + - + - + - (10)乳糖 -+ - -+ - -+ - (11)麦芽糖 - - - - - -
6.鉴定结果
OYK-01-600、OYK-03-600和OYK-04-000 3菌株根据下面的文献进行分类。
①Bergey’s Mannual of Determinative Bacteriology Vol.2(1986)， Eillismd & Eilkind U.S.A
②R.E.Gordon，W.Chaynes，C.H.Pang.(1973) The Genus Bacillus.Agr. Handbook No.427 United states department of Agriculture. Washington D.C.
表8
鉴定结果(1)属的鉴定 Bacillus OYK-01-600 OYK-03-600 OYK-04-000 (1)杆状细胞 + + + + (2)直径2.5μm以上 - - - - (3)纤丝 - - - - (4)杆，纤丝的弯曲 - - - - (5)4连或集块状球菌 - - - - (6)内孢子形成 + + + + (7)运动性 + + + + (8)繁殖期内革兰氏染色阳性 + + + + (9)偏向厌氧性 D - - - (10)兼性厌氧性或微好氧性 D + + + (11)兼性 - - - - (12)类似乳酸发酵 D + + + (13)磷酸盐的还原 - - - - (14)过氧化氢酶 + + + + (15)氧化酶 D + + + (16)由葡萄糖产生的酸 + + + + (17)硝酸盐的还原 D + + + (18)Mol％G+C 32-69 ND ND ND
+：90％以上阳性 -：10％以下阳性 D：因种属而异 ND：没有有 效的数据
表9
鉴定结果(2)种的鉴定 subt-il is fir-mu s pumi-l us lichen-i formis lentus OYK01 -600 OYK-03 -600 OYK-04 -000 1)细胞直径小于1.0μm - - - - - - - - 2)形成球状孢子 - - - - - - - - 3)形成鼓出的孢子囊 - - - - - - - - 4)Parasporal crystals的有无 - - - - - - - - 5)过氧化氢酶 + + + + + + + + 6)厌氧下繁殖 - - - + - + + + 7)Voges-Proskauer测试 + - + + - + + + 8)VP培养基中的繁殖pH＜6 pH＞7 d - - + - + - - ND d + d + d + 9)由糖产生酸D-葡萄糖 L-阿拉伯糖 D-木糖 D-甘露糖醇 + + + + + - - + + + + + + + + + + + + + + + d d + + d d + + d d 10)由葡萄糖产生气体 - - - - - - - - 11)水解能力 酪蛋白 明胶 淀粉 + + + + + + + + - + + + d d + + + + + + + + + + 12)作为碳源利用的酸 柠檬酸 丙酸 + - - - + - + + - - + - + - + - 13)酪氨酸的分解 - d - - - - - - 14)苯丙氨酸的脱氨 - d - - d - - - 15)卵黄反应 - - - - - - - - 16)硝酸向亚硝酸的还原 + d - + d + + + 17)吲哚的产生 - - - - - - - -
表10 subt-il is fir-mu s pumi-l us lichen-i formis lentus OYK-01 -600 OYK-03 -600 OYK-04 -000 18)二羟丙酮的产生 ND - ND ND - ND ND ND 19)NaCl和KCl的需求 - - - - - - - - 20)尿囊素或尿酸盐的需求 - - - - - - - - 21)在pH6.8肉汤中的繁殖 + + + + + + + + 22)在pH5.7肉汤中的繁殖 + - + + - d d d 23)在NaCl中的繁殖 2％ 5％ 7％ 10％ + + + ND + + + ND + + + ND + + + ND ND ND d ND + d d - + - - - + d - - 24)繁殖温度 5℃ 10℃ 30℃ 40℃ 50℃ 55℃ 60℃ - d + + d - - - d + + - - - - + + + d - - - - + + + + - ND ND + ND - - - - d + + d - - - d + + d - - - d + + d - - 25)在溶菌酶存在下的繁殖 d - d d - + + + 26)以H2+CO2或CO作为碳源的 繁殖 - - - - - - - -
+：90％以上阳性 -：90％以上阴性 d：11～89％阳性 ND：没有 有效的数据
因此从[表8]可以认为上述3株都属于Bacillus属，从[表9]、[表 10]又可认为都属于B.subgtilis的类缘菌，但根据厌氧条件下可以繁殖， 由糖产生酸微弱，以及在7％NaCL条件下不能繁殖等现象又不能鉴定， 所以判断为新种，定为Bacillus sp.。
①保藏机关的名称：通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所专 利微生物保藏中心
地址：邮编305-0046
日本国茨城且筑波市东1-1-3(TEL：0298-54-6029)
②保藏日：1998年6月29日
③保藏号：(1)FERM BP-6394
(2)FERM BP-6395
(3)FERM BP-6396
C.OYK菌增殖速度试验(参照图1)
本发明的新微生物培养开始后不需要诱导期，就开始迅速增殖。例如 菌约103个/ml(g)的菌浓度于20～40℃的培养条件下，在6小时以内 就增加到108个/ml(g)以上。
图1表示了Bacillus sp.OYK-01-600随时间推移的增殖状况，OYK 菌株，B.subtilis(IFO3134)菌株增殖试验37℃，振荡培养，NB培养基。 另外作为对照，图中也给出了B.subtilis标准菌(IFO3134)的增殖状 况。图1表示的曲线，纵轴取菌数的对数，横轴为时间画出的曲线。就 象从该曲线了解到的那样，本发明的OYK菌几乎没有诱导期，培养开始 后就开始迅速增殖，约103个/ml(g)的菌浓度在5小时左右就达到108 个/ml(g)以上。与此相比，B.subtilis标准菌(IFO3134)培养开始后， 经过6～8小时的诱导期后才真正开始增殖，达到约108个/ml(g)的菌 浓度大约需要12小时。另外OYK菌的体积是上述标准菌体积的4倍，而 且4小时后标准菌增殖6倍时，OYK菌增殖是20000倍，体积为标准菌的 20000×4＝80000倍。如果单纯比较体积，80000÷6＝13333...，体积大1 万倍以上。
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