本发明涉及一种生物反应器。

本发明具体涉及一种使用固定化活生物材料的生物反应器。

本发明更具体涉及一种包括硅质层的生物反应器，所述硅质层在 存在或未存在支架材料和基质的情况下能固定上述活生物材料。

已知可通过在基质表面上沉积的硅质层固定或截留生物材料，其 中基质容纳有下文称为“生物质”的诸如酶，细菌，酵母，植物或动 物细胞的上述生物材料。

上述硅质层应具有以下特征：

a)固定上述生物质以防止生物质从基质释放进入生物反应器的 液体培养基中。

b)保持生物质的活性，使得在固定相与培养基之间进行可控和 确定的输送，和

c)是生物相容的，这样活体动物的体器官或体液就可与固定化 生物质接触。

已知可通过溶胶-凝胶法固定生物质，该方法在溶液中进行，从 液相中的金属或烷氧化硅开始。

然而，该方法具有多个缺点，例如：

a)在许多生物系统中产生有毒的醇，

b)所需pH也许不适合于活细胞或可加快某些生物活性酶变 性，

c)所需搅拌操作对于对流体-机械应力敏感的细胞系可能是有害 的，

d)某些实验步骤与所需的无菌环境不相容，和

e)该方法不适用于那些需确定的结构组织以避免功能丧失的生 物质。

为克服上述缺点，人们建议通过使用载有烷氧化硅气体介质的方 法将截留的生物质固定在基质内。

具体来说，US 5 998 162描述了通过与气态烷氧化硅反应将植物 细胞固定在在细胞表面上获得的硅质层内。上述固定化细胞在六个月 后没有从溶液中逃逸且保持其存活率，并产生了次生代谢物。可将上 述固定化细胞用于制药应用。

WO 97/45537描述了通过与气态烷氧化硅反应由直接沉积在细胞 表面上的硅质层将动物细胞截留。该方法无毒且存活细胞未经介质淋 洗，同时不会由于介质侵入而繁殖。可将截留细胞用于生物人造器官 及所需产品。

然而，在某些情况下，人们已观察到将硅质层直接沉积在细胞表 面上降低了效果和功能并污染活体动物的体器官和/或体液以及使活生 物质的活力消失。

因此，本发明的发明人研究了上述现象并发现在某些情况下发挥 效果和功能需要凝胶基质中的生物质成分之间自由接触，同时上述污 染是由于源自生物质的病原物质，而生物质活力的消失是由于宿主生 物体的体液的抗体所致。

确实，生物体的抗体能识别生物质的异种动物细胞表面上的表 位，从而将其破坏。

因此，本发明要解决的主要问题是提供一种能防止上述不便的生 物质固定系统。

通过如本发明所附的权利要求书中列举的生物反应器及其制备方 法解决了上述问题。

本发明的发明人通过进一步研究指出，一方面，抗体和病原物质 具有大于150,000Da的分子量，同时另一方面，现有技术的硅质层所 具有的孔隙不能够完全保留或排除上述分子。

因此本发明的首要目的在于提供一种能够固定生物质并选择性阻 断分子量大于所选阈值的大分子的硅质层的制备方法，该方法包括以 下步骤：

a)提供被选自(1)Si(OR)4，(2)SiH(OR)3，(3)R′Si(OR)3和 (4)R′SiH(OR)2的烷氧化硅混合物饱和的载气气流，其中R和R′相 同或不同，分别为烷基和/或芳基，其中所述气流通过使载气在20至 180℃的温度下鼓泡通过混合比为(1)40-85/(2)0-60/(3)0-60/(4) 0-60(％v/v)，优选混合比为(1)40-85/(2)0-50/(3)0-50/(4) 0-50(％v/v)，更优选混合比为(1)50-80/(2)0-20/(3)5-30/(4) 5-30(％v/v)的上述烷氧化物的液体混合物制备，和b)将含生物质 的支持体在步骤a)的气流中暴露预定时间，

其中，选择所述分子量阈值在10000道尔顿和150000道尔顿之 间，在步骤a)中选择(1)，(2)，(3)和(4)硅衍生物的混合比作为 待阻断大分子分子量的函数。

考虑到生物反应器的预定特殊应用，可根据不同情况选择待阻断 大分子的分子量。

例如，阻断分子量大于150,000道尔顿的大分子使得可排除源自 宿主生物体体液的抗体和源自生物质的病原体通过硅孔。这样就防止 体液与生物质的相互伤害。70,000道尔顿的阻断阈值也阻止了诸如C1s (90kD)，C1qINH(80kD)，C3bINA(80kD)，C9(80kD)和C3PA (80kD)的补体系统成分通过硅膜，从而防止发生补体的非抗体触 发活性。另一方面，70kD的阻断阈值足够大，使得大分子量物质从 生物质扩散至体液。上述物质可以是诸如胶原蛋白，粘多糖或纤连蛋 白的胞外基质分子，它们对于移植应用中的生物相容性是必不可少 的。相反，90kD的阻断阈值在阻止补体系统成分方面选择性小，但 允许更大量的物质进行交换。

通常，可将具有130kD至150kD阻断阈值的硅质膜用于工业规 模的生物反应器，其中必须最大限度的提高由生物质产生的高分子量 分子分泌并扩散到培养基中。相反，当生物质产生低分子量分子并将 低分子量分子从培养基中分离时也可以在工业型生物反应器中再次使 用10kD阻断阈值。

本发明的硅质层阻断具有所选分子量阈值的大分子的能力取决于 下述步骤a)中硅衍生物的混合物组分，将描述如下。

作为一般指导，硅衍生物中烷氧基的存在有助于交联的形成，从 而使所形成的硅膜中孔的尺寸减少。在混合物中引入相对于每个硅原 子具有较少烷氧基的相对少量的硅衍生物(例如R′Si(OR)3或 R′SiH(OR)2)会增大膜孔。

具体来说，Si(OR)4和R′SiH(OR)2混合比为75∶25至80∶20的 二元混合物(A)会形成具有约90kD阻断值的硅膜。通过向上述混 合物中加入最高为约10％v/v的R′Si(OR)3替换相同量的Si(OR)4于 是可得到Si(OR)4/R′SiH(OR)2)/R′Si(OR)3为65-78％/20-25％/1-10％的 混合物(B)，将得到阻断值最高为150kD的硅膜。

当向上述硅衍生物的混合物中进一步加入最高含量为约20％v/v 的R′Si(OR)3并替换相同量的Si(OR)4时，膜的阻断阈值逐渐降低至10 kD。该结构对应于Si(OR)4/R′SiH(OR)2)/R′Si(OR)3的混合比为53-70 ％/20-25％/10-22％的混合物(C)。不受任何理论的限制，上述效果可 能是由于疏水性增加和由于更大量的烷基(R′基团)所产生的阻碍， 从而阻塞孔隙。

由上述讨论清楚可知，通过例如上述具有合适组成的三元混合物 (B)或三元混合物(C)(R′Si(OR)3含量不超过10％v/v)反应可得 到介于90kD和150kD之间的相同阻断阈值。另外，通过二元混合 物(A)也可以得到约90kD的阻断值，而通过诸如R′Si(OR)3组分含 量超过10％v/v的混合物(C)反应可得到介于10kD和90kD之间 的阻断阈值。

优选R为乙基或甲基，R′为甲基。

通常，步骤a)的载气是空气。

优选对应于每平方厘米暴露表面为1至100mL的总气体，步骤a) 的总气体流量在暴露期间为0.05至10升/分钟。

优选步骤a)的饱和温度为20至100℃。

通常，步骤b)的支持体为粘附于支架材料的基质。

在本发明的另一实施方案中，步骤b)的支持体为粘附于支架材 料的微球形基质。优选微球的直径为0.1至1.0mm。

在本发明的另一实施方案中，步骤b)的支持体为无支架材料的， 优选直径为0.1至1mm的微球形基质。

在本发明的另一实施方案中，步骤a)是在承载于支架材料而无 基质的生物质上进行的。

基质的典型实例为胶原蛋白凝胶，琼脂，右旋糖苷，胨，海藻酸 盐，角叉藻聚糖和胶体。上述基质可进一步含有诸如钡盐的不透射线 材料和/或诸如磁性颗粒及NMR位移试剂的NMR成像检测促进剂。

支架材料的典型实例是多孔纸张，玻璃纤维，织物，纺织纤维， 多孔陶瓷，玻璃体，天然海绵和泡沫有机聚合物。特别优选的支架材 料是天然海绵。

优选本发明硅质层的厚度为0.01至10μm，更优选为0.05至 0.3μm。

优选本发明硅质层的临界剪切稀化应力高于10Pa，更优选为12 至20Pa。

因此，本发明的目的在于提供一种含硅质层的生物反应器，所述 硅质层能够固定生物质并选择性阻断分子量高于所选阈值的高分子， 通过以混合比为(1)40-85/(2)0-60/(3)0-60/(4)0-60(％v/v)， 优选(1)40-85/(2)0-50/(3)0-50/(4)0-50(％v/v)，更优选(1) 50-80/(2)0-20/(3)5-30/(4)5-30(％v/v)混合选自(1)Si(OR)4， (2)SiH(OR)3，(3)R′Si(OR)3和(4)R′SiH(OR)2的烷氧化硅可获得 上述硅质层，其中R和R′相同或不同，分别为烷基和/或芳基。

本发明的特殊方面是在该生物反应器中使用固定化酶。在该情况 下，所述硅质层必须防止所述酶释放进入液体培养基中。通常，许多 生物相关酶具有大于10,000Da的分子量。

因此，本发明提供了一种制备硅质层的方法，所述硅质层能够固 定生物质，并选择性阻断分子量高于所选阈值的大分子，其中所述阈 值选自10,000Da至150000Da，该方法包括以下步骤：

a)提供被选自(1)Si(OR)4，(2)SiH(OR)3，(3)R′Si(OR)3和 (4)R′SiH(OR)2的烷氧化硅混合物饱和的载气气流，其中R和R′相 同或不同，分别为烷基和/或芳基，其中通过使载气在20至180℃的 温度下鼓泡通过混合比为(1)40-85/(2)0-60/(3)0-60/(4)0-60 (％v/v)，优选(1)40-85/(2)0-50/(3)0-50/(4)0-50(％v/v)， 更优选1)50-80/(2)0-20/(3)5-30/(4)5-30(％v/v)的上述烷 氧化物的液体混合物制备所述气流，和

b)将含有生物质的载体暴露在步骤a)的气流中。

术语“生物质”指的是能够执行生物类型功能的动物或植物源生 物材料。

“生物类型功能”的典型例子包括生产用于治疗疾病的产品，生 产诸如酶，生长因子，细胞因子和激素的次生代谢物和蛋白质。

上述生物质的例子包括动物和植物细胞，或初级细胞系，干细胞 系和突变细胞系，其聚集体，酶和微生物，所有上述生物材料可以未 经过或经过基因工程修饰。

能够生产适于治疗疾病的产品的生物质的例子包括用于治疗慢性 疼痛，用阿黑皮素原基因转染能够产生β-内啡肽的Neuro 2A细胞系 (如Saiton，Y.et al.CELL Transport.1995，4Suppl 1：S 13-7所述)；用 于治疗帕金森症，能够产生多巴胺的肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞 (ATCC CRL-1720)；用于治疗阿尔茨海默氏症，能够产生神经生长 因子(NGF)的下颌下腺SCA-9clone 15(ATCC CRL-1734)；用于治 疗肿瘤，能够产生IL-2的人淋巴瘤H33HJ-JA1(ATCC CRL-8163)； 用于治疗垂体侏儒症，能够产生生长激素的垂体GH3细胞(ATCC CCL-82.1)；用于治疗血友病，能够产生因子VIII的猪的初级肝细胞； 用于治疗哈格曼病症，能够产生因子XII的猪的初级肝细胞；用于治 疗贫血症，能够产生红细胞生成素的猪初级肾细胞或Hep-G2细胞(如 Mark A.Goldberg Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 84：7972-7976，1988中所 述)；用于治疗I型胰岛素依赖性糖尿病，能够产生胰岛素的猪的胰岛； 在体外人造肝脏中所使用的猪初级肝细胞。

术语“生物反应器”既是指本发明图1所述类型的设备，也是指 通过本发明的硅质层将生物质固定在基质上形成的生物单元。

因此，当本发明的生物反应器为生物单元时，它也可以是细胞尺 寸的。

本发明的发明人进一步研究发现，当本发明的生物反应器的支持 体为含生物质而不含支架材料的微球形基质时，可将所述生物反应器 直接注射到病人的器官中。

可直接注射本发明生物反应器的器官的典型例子包括脊髓背根， 脑髓，基底神经节，梅纳德氏(Meynert)基底核，外科手术摘除肿瘤 的病灶，门静脉，腹膜以及肝脏。

因此，本发明的另一目的是使用由上述方法得到的生物反应器制 备可注射的药物组合物以执行其生物类型功能。

通常，可将本发明生物的反应器用作人造器官以整合或代替受损 器官。

用以整合或代替受损人体器官的生物质的例子包括用于受损胰腺 例如胰岛的胰细胞；用于受损肝脏的猪肝细胞；用于受损甲状腺，甲 状旁腺和肾上腺的源自甲状腺，甲状旁腺，脑皮层和髓状肾上腺的细 胞。

本发明的可注射药物组合物包括悬浮在常规生理溶液中的有效量 的微球形生物反应器。

本发明的可注射药物组合物中微球形生物反应器的含量可在相当 宽的范围内变化，这取决于许多已知因素，例如待治疗疾病类型，疾 病的严重程度，病人体重，日服药剂型的次数和所选生物质的效力。

然而，本领域技术人员能够容易地按常规确定其最佳量。

通常，本发明的可注射药物组合物中微球形生物反应器的含量为 100-50.000个微球/每毫升生理溶液。

例如，当本发明的微球形生物反应器中含有胰岛作为生物质时， 可注射药物组合物中微球的含量为每千克体重含2000至25000个委 微球，优选每千克体重含10000个微球，其中每个微球含一个或多个 胰岛。

可根据本领域技术人员的已知技术制备本发明的可注射药物组合 物，其步骤包括混合，溶解和消毒。

另外，通过以下非限制性实施例中优选实施方案的描述，本发明 的特征和优点变得更加清晰。对于附图，其中：

图1是本发明生物反应器(10)的示意性剖面图。

图1A是与图1的生物反应器(10)的入口区域19″相连的可拆 除气体供给设备19的示意性剖面图。

图2是承载在聚氨酯泡沫体上并用实施例2的硅质层涂覆的芸香 (Ruta graveolens)细胞的显微照片。

图3是与从实施例3a的非固定化细胞所得蛋白质相比，由硅质 层固定的Hep-G2细胞所得蛋白质的分子量分布(从T1至T5)。

图4A-4D是在直径为500μm的Ca2±海藻酸盐微球中Jurkat细胞 的显微照片。4C表示涂覆硅质层的相同微球。4B表示无硅质层并去 除Ca2+的相同样品。4D表示涂覆硅质层但去除Ca2+的相同样品(实 施例6)。

图5表示在对照(正方形点)和二氧化硅涂覆(三角形点)胰岛 上进行的灌注实验。实线条跨过葡萄糖耐受期。

图6表示移植有胰岛的Sprague Dawley雄性大鼠的血糖水平。 大鼠(每组6个)接受约600个对照(圆点)或涂覆硅质层(正方形) 的胰岛。每个点是六个独立测量值的平均值，每个点的标准偏差低于 平均值的15％。

图1表示本发明的生物反应器，包括容器11，具有入口和出口13， 14的恒温护套12，pH和温度传感器15，16，溶氧探针17，辅助端 口18，可拆除顶部19，可拆除底部19″和气体供给设备19。

在本发明的优选实施方案中，图1的生物反应器包括由无毒的生 物相容材料如PyrexTM或不锈钢制造的圆柱形容器11，护套12包裹着 容器11，通过入口和出口13，14的热流体循环对其进行温度控制。 可选择性使用加热/冷却流体内部蛇形管。将pH探针15，温度传感器 16，溶氧探针17以及进料和作业关闭期间收集样品的端口18连接在 容器11上。容器11具有的可拆除顶部19和可拆除底部19″通过O 形圈(未表明)和/或插销或螺栓(未表明)与容器密封连接。生物反 应器10包括使容器11保持水平或垂直放置，优选由钢制成的外壳。 可将生物反应器10，容器11，顶部19和底部19″打开以便操作者进 入内部维护和手工作业。

将生物质和诸如胶原蛋白，琼脂，右旋糖苷，胨，海藻酸盐，角 叉藻聚糖或类似有机大分子的基质化合物的悬浮液通过底部19″的合 适开口加入到圆柱形容器11中，该悬浮液的浓度在低于40℃的温度 下产生固体基质凝胶。上述基质可进一步含有诸如钡盐的不透射线材 料和/或诸如磁性颗粒及NMR位移试剂的NMR成像检测促进剂。

通常，胶原蛋白的浓度为0.01至3％(w/v)，琼脂的浓度为0.5 至3％(w/v)。

或者，将诸如玻璃纤维，织物，普通纤维或织物，多孔陶瓷体， 纸张，有机合成聚合物或天然聚合物的泡沫体和纤维素固体的多孔支 架材料装入容器11中，所有上述支架材料容纳包括在上述基质化合 物中的生物质。上述支架材料可选择性填充容器11并用生物质和基 质化合物的悬浮液浸透。

或者，在植物或酵母细胞的情况下，使用生物质而不含有基质化 合物的悬浮液。

将上述填充好的容器11暴露于用本发明的气态烷氧化硅混合物 饱和的气流中。通过与底部19″可拆除连接的气体供给设备19提供 上述气流。

本发明的气态烷氧化硅混合物在基质凝胶的表面或生物质表面上 形成均匀且连续的硅质层。烷氧化硅气流的暴露时间取决于硅质层的 厚度(V.M.Sglavo et al.Mat.Science 34，3587 1999)。

硅质层的厚度与暴露时间呈线形函数，直至每平方厘米的处理表 面沉积最高为500μg的硅。由此得到的硅质层提供了附着于基质表面 上的无机沉淀物，其独立于基质的化学组成，几何形状，或支架材料 的存在。

当根据本发明的方法形成硅质层时，生物反应器的流动相通过可 拆除底部19″循环，后者装配有使生物质氧化的气体扩散器20。可使 用上述流动相进料生物质和回收产品。通过进料泵(未表明)提供上 述流动相循环并通过可拆除顶部19使流动相在封闭循环中移动。

可拆除顶部19包括释放烷氧化硅饱和气流和硅质层形成中的挥 发性副产品的出口21。

或者，顶部19可包括用于流动相循环的出口。在该实施方案中， 上述出口可与一排提取器(未表明)连接以从流动相中液/液和/或汽/ 液连续分离所需产品。或者使用与顶部19相连的贮存器置换生物反 应器不连续工作时用过的流动相及其储藏。

另外，顶部19可包括喷嘴22以形成基质溶液的液滴。将气态烷 氧化硅混合物进料到上述喷嘴22以在液滴上涂覆硅质层。在该实施 方案中，可拆除的底部19″可含有鼓泡装置19以用包围下落液滴的 烷氧化硅饱和无毒气流。

下面通过非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例1

1％琼脂中用硅质层固定的脲酶活性

在水中将640U的脲酶(购自Sigma，纯度99％)与20mL 1％ (w/w)琼脂(购自FMC，纯度99％)混合。在无菌环境中将上述溶 液倾入到直径为30mm，高300mm的玻璃PyrexTM圆筒中。将圆筒的 入口和盖关闭，然后将其放入外壳中并保持容器在37℃恒温浴中水平 放置。通过外部电动马达使圆筒以5rpm的速率轴向转动直至在圆筒 的内壁形成0.7mm厚的凝胶。使圆筒的入口与饱和气流相连，其中通 过使气流在80℃下鼓泡通过CH3SiH(OEt)2/Si(OEt)4体积比为25/75的 液体溶液得到上述饱和气流。其中载气为空气且流量为0.4升/分钟。 使所述气流持续12分钟。上述操作结束后，向上述圆筒中加入pH＝ 8.0的磷酸缓冲液，并在5rpm的转速下于37℃存储15小时。然后， 收集缓冲液样品；将含有同样脲酶的0.7mm厚凝胶但未经硅质层涂覆 的另一容器在pH＝8.0的条件下储存15小时候后收集样品。根据改进 的Lowry′s法(Peterson G.L.，Anal.Biochem.83：346(1977))测定样 品中蛋白质的含量。在未经硅质层固定的生物反应器中，样品的蛋白 质含量相应于从琼脂凝胶中浸出100％脲酶。而使用硅质固定层的生 物反应器中，样品蛋白质含量为0.7％(100％＝在未固定的样品情况 下测得的蛋白质含量)。在1U游离或固定化脲酶中含5μg脲的起始 情况下，通过检测溶液中脲浓度随时间的下降来测定脲酶的活性。其 中用二乙酰一肟法(Ceriotti G.and Spadaro L.，Clin.Chim.Acta.11：519 1965)测定脲的浓度。同时对下述溶液进行实验：1.含有游离脲酶， 2.在琼脂中含有未经硅质层涂覆的脲酶，3.在琼脂中含有经硅质层涂 覆的脲酶。在例1和例2中酶的活性相同(相同的最大速率和相同的 Michaelis-Menten常量)。在例3中，可观察到活性明显提高(最大速 率与Michaelis-Menten常量提高80％)。

实施例2

从通过硅质层固定的芸香细胞生产lignanic类药物

将如泡沫聚氨酯层的1cm厚(密度为0.1g/mL)海绵切成直径 3.0cm的圆片。用120℃蒸汽将圆片消毒并用每毫升含0.1g湿细胞团 的芸香细胞悬浮液培养基(1995年，源自苗芽)处理。上述培养基是 添加有3％(w/v)蔗糖，2.6m克/升2，4-二氯苯氧乙酸，0.3m克/升 激动素，和0.3m克/升萘乙酸的Gamborg′s基部生长B5溶液。用磷 酸将pH调节至5.7。将悬浮液中的圆片在25℃无菌条件下用100rpm 的转动摇床以12小时周期保持10天。然后将圆片取出，在30℃下悬 挂在无菌罩中干燥2小时。每圆片体积中平均装有0.3g湿细胞团。将 用金属线相连的1000个圆片放入10L PyrexTM圆柱形玻璃生物反应器 中(直径15mm，高57mm)。保持反应器于垂直位置并从其底部入口 用30℃干燥气体(流量＝0.8升/分钟)处理1小时，然后用5升/分钟 的饱和气流处理80min，其中通过使气流在75℃鼓泡通过CH3SiH(OEt)2 和Si(OEt)4体积比为30/70的混合物得到上述饱和气流。其中每2分 钟从底部入口进气改成从上部盖进气，从而起到联系上下侧与气流进 出的四路开关作用。然后立即用上述培养基填充该反应器，30分钟后 改变上述培养基。通过MTT(Mossman T.J.Immunol，Methods 65：55 (1983))测定保留细胞存活率，固定化前测得的存活率为92％。

图2的显微照片详细说明了在聚氨酯支架材料上用硅质层固定的 细胞。

通过围绕反应器的护套中恒温水的循环保持温度为23℃。通过 排量为5L/hr的外部蠕动泵提供介质的循环。使液体通过4个液/液萃 取器；优选的萃取剂为氯代溶剂。底部入口区装配有能提供10L/hr气 流的气体扩散器。气体被运送到顶部盖并通过鼓泡进入pH＝7.2的磷 酸缓冲液进行洗涤。在用于液体萃取的氯代溶剂中以及用于洗涤排放 气体的水溶液中观察到lignanic类药物的产生。通过用丁醇-乙酸乙酯 萃取回收lignanic类产品，并用交联葡聚糖色谱法和溶剂氯仿/甲醇体 积比为9/1的HPLC(Jasco Model PU 1580)进行分离。总产量为每天 160mg。通过FAB质谱进行lignanic类产品的鉴定。所鉴定产品的主 要成分为鬼臼脂素、山荷叶素和爵床定甲，其占总量的80％。将上述 反应器连续生产20周且每5天添加蔗糖以保持浓度为3％(w/v)。硅 质层固化16周后出现细胞死亡，20周后全部死亡。

实施例3

由不同的烷氧化硅混合物所得硅质层的分子阻断

a)在沉积于直径为6cm的皮氏培养皿中的胶原蛋白层中培养 Hep-G2细胞。通过于37℃加热0.1％(w/v)的胶原蛋白溶液得到胶 原蛋白基质。培养基是添加有10％胎牛血清的Dulbecco氏改性Eagle 培养基。当细胞汇合成单层形态时，在细胞上涂覆50μm 0.1％(w/v) 的胶原蛋白溶液层。固结后，通过台盼蓝排斥实验测定细胞存活率为 96％。将样品用培养基处理后在含95％空气和5％CO2的潮湿气体中 于37℃下储存24小时。去掉培养基后将8个皮氏培养皿安装在直径 70mm，高25mm的PyrexTM玻璃圆筒中。金属框使培养皿之间相距 1.5cm。根据实施例1进行硅质层沉积(圆筒中温度＝30℃，暴露时间＝8 分钟，8个皮氏培养皿)。反应之后，立即将样品用特定培养基覆盖， 该培养基在3小时候被替换。Tiazolyl blue MTT检测表明细胞存活率 为95％。硅质层涂覆18小时后，通过与50mM pH＝8.0的Tris-HCl(购 自Sigma)，0.02％(w/v)NaN3和1μg/mL抑酶肽(购自Sigma)的 溶液反应，生物质发生溶胞。24小时后，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶 分离法(Sambrook J.et al.“Molecular Cloning：a laboratory manual”Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989)分析上述溶液。将样品于100℃ 下在1x SDS凝胶加样缓冲液(50mM Tris-HCl，pH＝6.8，100mM二 硫苏糖醇，2％w/v SDS，0.1％(w/v)溴酚蓝，10％(w/v)丙三醇) 中变性3分钟。层析试验是在180V下运行的小型PROTEAN II设备 Biorad(25mM Tris，250mM甘氨酸，0.1％(w/v)SDS，pH＝8.3作 为流动相)上进行45分钟。接着将凝胶用50％(v/v)甲醇和12％(v/v) 乙酸培养30分钟，然后用10％(v/v)乙醇加5％v/v乙酸溶液洗涤 三次，共5分钟，接着用3.4mM铬酸钾和3.2mM硝酸溶液培养后 再用二重蒸馏水洗涤三次。将样品用12mM硝酸盐溶液培养30分钟。 用0.28M Na2CO3和0.02％(w/v)甲醛溶液处理并用1％(v/v)醋酸 溶液定影显影蛋白质带。对于图3，蛋白质分布表示成涂覆有硅质层 并发生溶胞的5个样品与没有涂覆硅质层但发生相似溶胞的2个对照 样品(C1，C2)的分子量函数。由覆层样品得到的编号为T1至T5的 蛋白质分布表明没有分子量高于90,000Da的痕量蛋白质。

b)重复实施例3a的相同步骤，在硅质层沉积时使用0.4升/分钟 的饱和气流，其中通过使气流在80℃下鼓泡通过 CH3SiH(OEt)2/CH3Si(OEt)3/Si(OEt)4体积比为10/20/70的混合物得到上 述饱和气流。由溶胞后的涂层样品得到的蛋白质分布表明没有分子量 高于150,000Da的蛋白质。

c)重复实施例3a的相同步骤，其中通过使气流在75℃下鼓泡 通过CH3SiH(OEt)2/CH3Si(OEt)3/Si(OEt)4体积比为20/20/60的混合物 得到所述饱和气流。由溶胞后的涂层样品得到的蛋白质分布表明没有 分子量高于10,000Da的蛋白质。

实施例4

在1％琼脂中用硅质层固定的多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa) 和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的活性

原种多粘芽孢杆菌购自ATCC。在50mL由酵母提取物/酪蛋白/ 葡萄糖/蔗糖/NaCl/MgSO4＝2.5/2.5/8/2/1/0.5克/升的溶液构成的培养基 中接种部分上述菌种。悬浮液中被缓冲到pH＝7.3，然后补加1mL  CaCl22H2O/FeSO4.7H2O/ZnSO4.7H2O/CuSO4 5H2O/MnSO4 4H2O＝1/1/1/0.5/4 克/升的溶液。将悬浮液在27℃储存3天。将上述5mL悬浮液用浓度 为2.5/2.5/18/2/1/0.5克/升的上述化合物构成的介质稀释，并补加胰化 蛋白胨(2克/升)和硫酸铵(1克/升)，然后缓冲到pH＝7.3。将由此 得到的悬浮液在搅拌下于27℃下储存5天。向上述悬浮液中加入琼脂 至其浓度最高为1％(w/v)。将30L的悬浮液倾入到填充有5000个直 径为35mm，高10mm的玻璃棉圆片的直径为20cm，高100cm的不 锈钢圆筒中，所述玻璃棉来自于密度为0.2克/毫升的织物。将上述圆 片随意放置在圆筒内。将悬浮液放置30分钟，然后从圆筒中喷出。 将圆筒置于外壳中并使容器在5rpm的转速下处于水平位置。将圆片 用实施例2所述的烷氧化硅气流处理6小时。用上述培养基填充到处 于垂直方向的容器中。通过检测8星期内的葡萄糖的消耗量来测定生 物质的存活率。每天葡萄糖的消耗量为1.3克/升。通过每两天添加葡 萄糖保持葡萄糖的原始浓度为18克/升。

使用相同方法固定枯草芽孢杆菌。在上述两种情况下，通过显微 镜观察揭示了在溶液中完全没有微生物释放。收集培养基的样品以分 别检测多粘菌素和杆菌肽的浓度。通过多粘菌素敏感原种大肠杆菌 (Escherichia coli)和杆菌肽敏感生物金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗菌谱测定抗菌活性。用盐水稀释原始样品以检测在8周 内多粘菌素和杆菌肽的发展趋势。

实施例5

测定胶原蛋白上的0.1μm厚硅质层的临界剪切应力

通过流体机械实验测定胶原蛋白上的硅质层的临界剪切应力。将 120cm长，8cm宽，2cm高的玻璃管与给水泵连接。从5升/分钟的最 小流量开始将水输送到水平放置的玻璃管中。将由0.1％(w/v)溶液 固结得到的0.1mm厚的胶原蛋白层沉积在管的基部，然后使水流增加 至冲掉所述层。由相应的临界水流得到胶原蛋白的临界剪切应力为 0.5Pa。根据实施例2所述方法处理3分钟，将硅质层沉积在胶原蛋白 上后进行同样的实验，结果临界剪切应力为15Pa。

实施例6

含Jurkat细胞的海藻酸盐微球的硅质层涂层

通过常规的气体喷射挤出法(Lim F.and Sun A.M.Science，210：908 (1980))制造(含1×107细胞/毫升；～2,400细胞/微球)海藻酸盐微 球。将含有人淋巴细胞系Jurkat细胞的海藻酸盐溶液(1.5％w/v藻 酸钠在0.9％的NaCl溶液中)加入到无菌注射器管中并通过均匀驱动 推进设备来操纵活塞。使无菌注射针(内径0.3mm，外径0.5mm)与 注射器连接并共轴置于气体喷射挤出喷嘴(直径0.65mm)中。在80 ℃下使气流以0.4升/分钟至0.8升/分钟鼓入CH3SiH(OEt)2和Si(OEt)4(体积为25/75)的溶液中。

使上述有机硅烷饱和气流进入气体喷射挤出喷嘴，以提供硅质涂 层并使硅酸盐液滴从针尖滴下。微球直径为0.2mm至0.8mm，这取决 于上述气流。将滴入到100mM氯化钙溶液中的微球在该溶液中保持5 分钟，然后转移到细胞培养基(RPMI 1640)中。通过MTT试验测试 细胞存活率，结果显示存活率超过80％。用佛波醇酯刺激装入胶囊内 的Jurkat细胞分泌白细胞介素2(IL-2)，其中白细胞介素2(IL-2) 是分子量为15,000Da的淋巴因子。刺激24小时后，用人IL-2ELISA 检测试剂盒(Sigma Chemical Company，Saint Louise，Missouri，USA，I- 8273)检测培养基周围的IL-2水平(226pg/mL)。通过微球在软化水 中的渗透溶胞证明硅质层的存在。

钙离子的稀释导致海藻酸盐微球的破裂，从而使游离细胞释放在 溶液中(图4B)。参照图4D，在用硅质层涂覆微球的情况下，可以观 察到硅质层的残留部分和游离细胞。

实施例7

涂覆有硅质层的胰岛

按照标准方法从外科手术分离得到的Lewis大鼠胰腺中得到胰 岛。将200/300个胰岛沉积在悬挂于1.5mL Swining过滤漏斗上的200 目筛网上，并在80℃下通以0.1升/分钟的CH3SiH(OEt)2和Si(OEt)4(体 积比25/75的混合物)饱和气流15秒钟。

将胰岛转移至细胞培养基(DMEM)中并在37℃下在5％CO2气 氛中培养24小时。在体外用带有Hank′s平衡盐溶液(HBSS，0.5毫升/ 分钟)的灌注室测试胰岛并进行葡萄糖耐量试验(在20Mm HBSS中 由组分4至组分10，图5中的实线条)以检测胰岛素的分泌。每2分 钟收集小份并通过ELISA装置中的大鼠特异胰岛素抗体试剂盒来检测 每一小份中胰岛素的含量。覆层胰岛的胰岛素释放趋势与对照胰岛相 同(参见图5)。根据文献方法(Wang T.et al.Nature Biotechnology 15：358 (1997))进行上述实验。

使用源自Lewis大鼠(重240g)的胰岛，包括对照胰岛及用本实 施例前述的硅质层涂覆的胰岛，进行雄性Sprague-Dawley大鼠(重 280g)异源外科手术移植，其中通过对雄性Sprague-Dawley大鼠腹膜 腔内施加链脲菌素(6mg/100g)产生稳定的糖尿病(血糖超过 300mg/100mL)。在无菌手术室中通过氟烷麻醉对供体和受体大鼠进行 手术。将每只大鼠为约600个胰岛移植入肾和肾上腺之间。手术后的 护理包括注射胰岛素以使大鼠和移植的胰岛从手术应激反应中恢复过 来。为检测血糖水平，在手术之前以及在术后前两周每隔3至4天， 两周后每星期一次从对照和移植大鼠的尾部采集血样(100μL)。如图 6所示，移植有未覆层胰岛的对照动物组(n＝6)在术后15天恢复到 糖尿病的血糖水平(300mg/100mL)，而移植有用硅质层涂覆胰岛的动 物(n＝6)至移植后43天血糖量仍正常。

实施例8

硅质层的生物相容性

a)体外生物相容性

(i)补体激活。按照实施例3a所述步骤在皮氏培养皿中培养 HepG2细胞。将0.5ml的无补体或用酵母聚糖活化的人血浆沉积在胶 原蛋白层上。将样品在37℃储存30分钟(Fushimi F.，Nakayama M.，Nishimura K.，Hiyoshi T.Artificial organs 22(10)：821-826(1998))。通 过溶液的ELISA分析检测C5a水平：测量用酵母聚糖处理的样品，将 其水平认为是100％。在根据实施例3a(暴露时间6分钟，6个皮氏 培养皿)制备的涂有硅质层的胶原蛋白中对HepG2细胞进行同样的实 验。C5a补体浓度为酵母聚糖处理样品的5％。

(ii)激肽释放酶活性。根据实施例3a所述步骤在皮氏培养皿 中培养HepG2细胞。将0.5mL牛血浆溶液(含柠檬酸盐并用 60mLTris-HCl稀释3至5倍)沉积在胶原蛋白层上。将样品在4℃储 存60分钟。用z-铁-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素处理上清液，从而能 够检测到由因子XII引起的从前激肽释放酶到激肽释放酶的转换 (Fushimi F.，Nakayama M.，Nishimura K.，Hiyoshi T.Artificial organs 22(10)：821-826(1998))。将上述分析得到的激肽释放酶水平认为是100 ％。在根据实施例8a(i)制备的涂有硅质层的胶原蛋白中对HepG2细 胞进行同样的实验。激肽释放酶水平是未覆层样品的3％。

(iii)血小板粘附。根据实施例8a(i)(Fushimi F.，Nakayama M.，Nishimura K.，Hiyoshi T.Artificial organs 22(10)：821-826(1998))进 行血小板在沉积于胶原蛋白基质上的硅质层上的粘附实验。结果表明 了由于硅质层血小板完全没有活化。

(iv)红细胞的溶血作用。根据已报道方法(Drabkin D.L.，Austin J.H.J.Biol.Chem.98：719(1932))，通过测量所保存血液样品中血红蛋 白的分光光度浓度(λ＝540nm)来评价可能由于与硅质层接触或硅质 层释放出有毒物质所引起的红细胞溶解，其中所述血液样品与根据实 施例8沉积在胶原蛋白基质上的硅质层接触。在37℃ 3小时后没有 观察到任何溶胞。

b)体内的生物相容性

通过在大鼠的后腿肌肉中注射硅处理的和标准的涂覆胶原蛋白的 右旋糖苷微球(Cytodex，Pharmacia，直径约100μm)评价体内的生物 相容性。

将各组微球放于220目不锈钢筛网上，所述筛网在30mL圆柱形 聚四氟乙烯反应室内且反应室在筛网的相对两侧各有入口和出口。微 球用实施例2所述饱和气流处理30分钟。然后收集处理后的微球并 放入3mL无菌细胞培养基中，通过离心作用(200Xg 5分钟)浓缩。 将上述处理过的和对照微球再次悬浮于无菌磷酸盐缓冲液(Ph＝7.4) 中，浓度为6百万微球/每毫升缓冲液。用无菌注射器在3组大鼠中注 射50μL硅处理微球悬浮液，与上相似，用未处理微球注射三组大鼠 作为对照，其中每组大鼠均为5只。在手术期间将全部大鼠麻醉。然 后将大鼠处死进行实地观察并在注射后2周，4周和12周采集其组织。 在微球注射和处死期间所有组均没有出现发炎，疼痛或功能丧失的迹 象。在试验末期，用过量麻醉剂将大鼠处死并采集其后腿肌肉作显微 镜检查和组织学分析。在所有动物组的注射部位均没有肉眼可见的感 染，发炎，流血或纤维化迹象。随后将5μm厚的组织切片经Geimsa 染色后肉眼观察肌肉组织形态，结果发现，尽管在对照动物中对照的 未覆层微球周围的组织中有纤维化反应的痕迹，但在治疗动物组的注 射部位没有任何浮肿，蛋白质溢出，白细胞渗透和纤维化疤痕组织形 成的迹象。