领域：本发明总体上涉及用于生产生物活性蛋白的遗传工程化的哺 乳动物细胞系。具体而言，本发明涉及由人胚胎肾(293S)细胞和非 洲淋巴瘤细胞融合而来的人杂合细胞克隆。这些人杂合细胞可用于生产 异源蛋白。

背景：迄今为止，多数治疗性重组蛋白由非人哺乳动物细胞生产。 一些实例是：

具有可扩增的选择标记二氢叶酸还原酶(Kaufman et al.，1982，Mol. Biol.159：601-621；Gasser et al.，1982，Proc Natl Acad Sci USA 79：6522- 6526)的中国仓鼠卵巢(CHO)(dhfr)细胞(Urlaub et al.，1980，Proc Natl Acad Sci USA 77：4216-4220)已被用于生产治疗性重组蛋白。

已知有多种重组治疗性蛋白在哺乳动物细胞中生产，如重组因子 VIII(rFVIII)(Kaufman et al.，1988，J Biol Chem 163：6352-6362)、组 织纤溶酶原激活物(tPA)(Goeddel等的美国专利4,766,075，1988)、 促红细胞生成素(EPO)(1987年授予Lin的美国专利4,703,008)和 单克隆抗体(mAbs)(Boss等的美国专利4,816,397，1989)。

幼仓鼠肾(BHK21)细胞在G418选择和氨甲喋呤(MTX)扩增 G418抗性细胞后被用于生产rFVIII(Capon等的美国专利4,965,199， 1990)。

小鼠骨髓瘤(NSO)细胞被用于生产工程化的人抗TNF抗体 (EHAT)(Boss等的美国专利4,816,397，1989)。但是，这种细胞 系生产的蛋白具有小鼠特异性碳水化合物谱，这对人用是不利的。

一种人细胞系Namalwa(非洲淋巴瘤来源的)被Wellcome Research Laboratory用来生产α干扰素，Tokyo Research Laboratories使用其生产 原脲激酶(Satoh et al.，1996，Cytotechnology 18：167-185，1996)、组织 纤溶酶原激活物(t-PA)(Khan et al.，1995，Biochem Soc Trans 23：S99)、 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Okamoto et al.，1991，Arch Biochem Biophys 286：562-568)、干扰素和淋巴毒素(Hosoi et al.，1991， Cytotechnology 5：17-34)以及粒细胞集落刺激因子(Hosoi et al.，1991， Cytotechnology 7：25-32)。但是，这些细胞很难用DNA转染。

Walls等(1989，Gene 81：139-149)报导了在人胚胎肾细胞(293S 细胞)中使用dhfr/MTX共扩增策略表达功能性蛋白C。已知293细胞 (Stillman et al.，1985，Mol.Cell.Biol.5：2051-2060)在悬浮液中形成大 聚集物，特别是在高钙浓度下(＞100μM)，高钙浓度会导致更大的聚 集物和更低的细胞活力(Peshwa et al.，1993，Biotech and Bioeng 41：179-187)。此处引用的所有参考文献本文引为参考。

发明概述

现已建立了容易通过电转化或阳离子脂质体转染并容易改造适于 在悬浮培养物中生长的杂合人细胞克隆。异源蛋白可以使用在人细胞环 境中低水平(50-100nM)MTX扩增来表达。此外，该细胞容易改造 适于在无血清培养基中生长。

这些细胞是人胚胎肾(293S)细胞和非洲淋巴瘤细胞融合的产物。 概况参见图1。这些称为HKB的杂合克隆携带有来自HH514-16的缺 陷EBV基因组，HH514-16是来自非洲淋巴瘤细胞P3HR1的细胞系 (Hinuma et al.，1967，J Virol 1：1045-1051)。P3HR1细胞携带非永生化 的EBV。HH514-16是携带非永生化EBV的P3HR1的克隆(Hinuma et al.，1967，J Virol 1：1045-1051)。HH514-16在克隆过程中失去了激动 DNA，即潜伏破坏DNA(Rabson et al.，1 983，Proc Natl Acad Sci USA 87：3660-3664)。因此，HKB克隆的EBV是非永生化的病毒，保持在 潜伏状态。

HKB是适合重组生产治疗性蛋白的人杂合宿主细胞。这些宿主细 胞通过分别具有不同优势特征的不同亲本细胞系的杂交获得。具有每一 亲本细胞系的优势特征的宿主细胞由杂交产生的细胞获得。

宿主细胞可以经遗传工程改造来高水平表达多种蛋白。可通过工程 化的宿主细胞生产的蛋白包括但不限于可溶性ICAM-1、重组白介素 -4(IL-4)、tPA、EPO、rFVIII和BDD-FVIII(B结构域缺失的因 子VIII变体)和这些蛋白的衍生物。因子VIII的结构域排列为A1- A2-B-A3-C1-C2，作为一个2351氨基酸的单链多肽合成，在转位 进入内质网腔时，19氨基酸的信号肽被切除。由于因子VIII是高度糖 基化的，高水平表达(＞0.2 pg/c/d)因子VIII难以实现(Lind et al.，1995， Eur J Biochem.232：19-27；Kaufman et al.，1989，Mol Cell Biol.9：1233- 1242)。在哺乳动物细胞中表达因子VIII通常比使用类似载体和途径 表达其它基因要低2-3个数量级。因子VIII的生产细胞系的生产率为 0.5-，1U/c/d(0.1-0.2pg/c/d)。

现已证实，因子VIII的B结构域是前凝血剂活性不可或缺的。几 个研究小组报导，使用截短的因子VIII变体获得了哺乳动物中因子VIII 的更高的表达(Lind et al.，1995，Eur J Biochem 232：19-27；Tajima et al.， 1990，Proc 6th Int Symp H.T.p.51-63；Almstedt的美国专利5,661,008， 1997)。但是，因子VIII变体从一个稳定细胞克隆的表达水平仍低于1 pg/c/d。也已经发现，尽管内源免疫球蛋白(Ig)没有表达，工程化宿 主细胞的重组Ig表达较高。HKB11细胞生产的蛋白具有人特异性糖基 化模式。因此，该克隆是生产基因工程Ig和其它蛋白的最佳宿主细胞。

在本文中，非洲淋巴瘤来源的细胞是指非洲淋巴瘤细胞的一种细 胞，来源于非洲淋巴瘤细胞，来源于非洲淋巴瘤来源的其它细胞，或是 一种上述任一种细胞有丝分裂产生的细胞。“来源于”在此包括但不限 于正常有丝分裂和转染、细胞融合或其它用来改变细胞或制备具有新特 性的细胞的遗传工程或细胞生物学技术等过程。同样，人胚胎肾细胞来 源的细胞是指人胚胎肾细胞的一种细胞，来源于人胚胎肾细胞，来源于 人胚胎肾细胞来源的另一种细胞，或是一种上述任一种细胞有丝分裂产 生的细胞。同样，293S来源的细胞是指293S细胞的一种细胞，来源于 293S细胞，来源于293S来源的另一种细胞，或是一种上述任一种细胞 有丝分裂产生的细胞。2B8来源的细胞是指2B8细胞的一种细胞，来 源于2B8细胞，来源于2B8来源的另一种细胞，或是一种上述任一种 细胞有丝分裂产生的细胞。异源蛋白是指一种细胞经过程改造后产生的 蛋白。

                   附图简述

图1显示HKB细胞来源的概况。

图2显示文中提及的表达载体的物理图谱。所有质粒基于pBR322 骨架构建，含有dhfr表达单位。所有编码目标蛋白的基因处于CMV增 强子/启动子(CMVe/p)的调控之下；5′内含子(MIS或CIS)位于基 因的5′端，但BZLF1除外。Poly A信号区标记为pA。两个质粒pSH157 和pCIS25DTR均含有EBV-TR序列(402bp)。

图3显示瞬时转染分析中用于基因表达的宿主细胞系的比较。转染 在相同条件下进行：同样数量的293S、2B8和HKB11细胞以等量的质 粒DNA使用相同的转染剂转染。转染后2天收集组织培养液。蛋白生 产水平通过ELISA(IgG和ICAM-1；表示为ng蛋白/106细胞/2日) 和Coatest分析试剂盒(rFVIII，表示为毫单位/107/2日)确定。

                  具体实施方案

材料与方法

HH514-16由Dr.George Miller(Yale University)惠赠。293S细胞 获自Dr.Brad Zerler(Molecular Therapeutic Institute，West Heaven， CT)。293S细胞是经改造适于生长在悬浮培养物中的293S细胞(ATCC CRL-1573)(Stillman et al.，1985，Mol Cell Biol 5：2051-2060)。

质粒

本文中使用的所有表达载体基本上是具有功能性dhfr基因表达片 段的基于pBR322的质粒。表达载体的物理图谱见图2。质粒pSH157 和pCIS25DTR也具有EB病毒的末端重复序列(EBV-TR)。关于EBV -TR序列，参见Cho和Chan的称作MSB-7254的申请“提高药物选 择比例的EB病毒末端重复序列”。载体pSH131已经保藏于美国典型 培养物保藏中心，保藏号为ATCC 98879，它可用来产生选定蛋白的表 达载体，如Cho和Chan所述(MSB-7254，上文)。

ELISA

为测定tICAM-1分泌，将ICAM-1的单克隆抗体C92.5(McClelland et al.，1991，Proc Natl Acad Sci USA 88：7993-7997)吸附在圆底微量板 上。用含有1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲盐水(PBS)溶液处 理封闭培养板，然后与含有tICAM-1的样品温育。平板然后用洗涤缓 冲液(PBS加0.005％Tween 20)洗涤，再与抗tICAM-1的另一个表位 的第二种单克隆抗体生物素化C78.5(McClelland et al.，1991，上文) 温育。洗涤后，平板与HRP-链亲和素温育。平板再用洗涤缓冲液洗 涤，与四甲基联苯胺(TMB)反应，用1N盐酸终止反应。通过450/570 nm读OD值并与纯化tICAM-1的标准曲线比较确定tICAM-1浓度。

为了测定免疫球蛋白(Ig)分泌，用抗Ig抗体包被平板，用生物 素化抗Ig抗体作为检测抗体。已知浓度的Ig分子被用作标准。其它方 面保持不变。

为了测定白介素-4(IL-4)分泌，用抗IL-4抗体包被平板，用 生物素化抗IL-4抗体作为检测抗体。纯化的IL-4分子被用作标准。

测定rFVIII分泌的试验

rFVIII分子用CoatestVIII：C/4试剂盒(Chromogenix，Molndal， Sweden)的试剂定量。被称为MEGA1的美国标准的抗嗜血因子(因 子VIII)  (Office of Biologics Research and Review，Bethesda，MD)被 用作测定在Select Heat Blocks(VWR Scientific，San Francisco，CA)上 预先加热到37℃的EIA/RIA A/2平板(Corning，Corning，NY)的标准。 将因子IXa、因子X、磷脂和氯化钙加入各个样品中，温育10分钟以 激活因子X。然后加入生色底物(S2222)，温育10分钟以释放生色团 pNA。该反应通过加入50％乙酸终止。然后在SPCETRAmax250分光 光度计微量板读数仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上于405/450 纳米测定比色吸收值，数据通过Molecular Devices提供的SOFTmax PRO软件计算。

HAT敏感和G418抗性非洲淋巴瘤细胞系的衍生

为了获得HAT敏感细胞，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRT)缺陷细胞系(Szybalska et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：2026-2034，1962；Littlefield，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 50：568-576， 1963)通过Siadak等(美国专利4,834,975，1989)介绍的标准方法建立。

不含EBV激动DNA(Rabson et al.，1983，Proc Natl Acad Sci USA 87：3660-3664)的HH514-16细胞(获自Dr.G.Miller，Yale University) 用RPMI-1640悬浮培养基(Life Science，Gaithersburg，MD)中的300 μg/ml甲磺酸乙酯(MSE)(Sigma，St.Louis，MO)处理24小时，培养 基中补加有15％胎牛血清(FBS)(Hyclone，Logan，UT)。用培养基 洗涤细胞后，细胞在含有6-巯基鸟嘌呤(6-TG)(Sigma)(5μg/ml) 的培养基中铺平板，以选择HGPRT阴性细胞。在6个月的选择期间， 6TG的浓度从5μg/ml增加到30μg/ml。然后测试细胞对含有HAT的 培养基的敏感性。单细胞克隆(SCC)由HAT敏感群体A5的有限稀 释克隆(96孔板中每孔一个细胞)获得。一个SCC即A5/1D7用pSV2neo 转染以得到G418抗性细胞，pSV2neo含有在pBR载体中SV40启动子 控制下的neo基因。一个被称为2B8的G418(1.5mg/ml)抗性SCC(保 藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号CRL-12569)用于融合。

                      实施例1

细胞融合和单细胞克隆的衍生

细胞融合主要按照Kenentt(1979，Meth Enzymol 58：5-359)所述的 聚乙二醇(PEG)融合法进行。处于对数生长期的293S和2B8细胞各 5,000,000用无钙离子和镁离子的PBS洗涤(Life Technologies，Rockville， MD)，接种到用花生凝集素(Sigma，5μg/ml)预处理的6孔板的一个 孔中。装载有细胞的6孔板在Beckman J-6M/E离心机(Beckman，Palo Alto，CA)中于400g离心6分钟。从细胞中除去PBS后，细胞用2ml 40％ (w/v)PEG(Sigma)处理1分钟。作为对照的一个孔不用PEG处理。细 胞用5ml含5％DMSO的PBS洗涤3次，然后用PBS洗涤3次。细 胞与补加有15％FBS的新鲜培养基温育25分钟。使用含G418(1mg/ml) 和HAT(Life Technology)并补加有15％FBS的新鲜培养基将细胞接 种到96孔板(1.2×106细胞/板)。细胞每周两次使用选择培养基饲喂。 在该实施例中，初次选择时，293S细胞具有对含HAT培养基不敏感的 所需特征，类似的是，2B8细胞具有抗G418的所需特征。

尽管融合细胞在选择条件下生长，混合细胞不在相同条件下生长。 选择后3周，起始群体转移到较大的单元中。为了获得SCC，将稳定 生长的20个群体混合，使用选择培养基进行有限稀释克隆(一孔一细 胞)。使用显微镜仔细观察单个克隆，从15×96孔板中选择出了19个 SCC。来源于融合试验的SCC被称为HKB细胞(人肾和B细胞杂合细 胞)。从转染试验中选择7个SCC。进一步测试这7个SCC稳定生产 各种蛋白的情况。7个SCC中的一个HKB11被选作生产异源蛋白的优 选哺乳动物细胞宿主。概况参见图1。

                    实施例2

HKB克隆的鉴定

尽管所有杂合细胞均在选择条件下选择，杂合状态通过计数细胞中 的染色体数目确证。确实，所有HKB具有90-110的染色体数目。这 些数目类似于293S和2B8染色体数目(分别为64和47，根据ATCC 数据)的总和。293S(Stillman et al.，1985，Mol Cell Biol 5：2051-2060) 是适应悬浮培养的293(ATCC CRL-1573)。

通过使用甲醇固定细胞的直接免疫荧光试验测定所有杂合细胞克 隆的内源Ig(μ和κ)表达，以确定哪些细胞克隆分泌内源Ig。在较长 期的重复试验中，根据免疫荧光试验(表1)和ELISA(数据未示出) 观察到这些细胞μ和κ链表达是阴性的。

表1  Ig基因表达的检测     细胞     基因表达    重链(μ)    轻链(κ)     293S     阴性     阴性     2B8     阳性     阳性     HKB     阴性     阴性

表1显示3类细胞免疫荧光试验观察到的结果。细胞重悬于PBS 中，制成玻璃涂片。细胞干燥后，在冷(-20℃)甲醇中固定涂片5 分钟。细胞用FITC-抗人κ和抗人μ链(1∶20稀释)(Zymed Laboratories， Inc.，So.Fan Francisco，CA)在湿盒中37℃染色45分钟。用PBS洗涂 片10分钟后，涂片用PBS/甘油(1∶1)以盖玻片封固。细胞在荧光显 微镜下观察(Carl Zeiss，Inc.，Thornwood，NY)。

α(2-6)唾液酸转移酶的人特异性模式唾液酸连键使用FITC辍 合的西洋接骨木凝集素(SNA)(Sigma，St.Louis，MO)通过HKB细 胞的FACS分析证实。通过寡糖足迹法(数据未示出)分析，HKB细 胞分泌的蛋白(克隆1G2)显示α(2-3)和α(2-6)连键唾液酸的 糖基化模式。这表明由293S和2B8细胞融合得到的HKB细胞保持了 人特异性糖基化酶。

为了测试这些杂合细胞是否具有表达外源基因的能力，细胞用 ICAM-1和IgG(抗TNF抗体)表达载体转染。为了测试IgG的分泌， HKB细胞(5×106细胞)通过电转化以10μg提供重链(γ)和轻链(κ) 的功能性表达的质粒DNA转染。为了测试可溶性ICAM-1的分泌水 平，HKB细胞(5×106细胞)通过电转化以10μg提供可溶性ICAM-l 的功能性表达的质粒DNA转染。通过ELISA确定IgG或ICAM-1的 分泌水平。所有19个SCC在瞬时转染试验中分泌相对高水平的ICAM -1(100-500ng/ml/ad)和IgG(30-200ng/ml/2d)(表2)。这些 数据表明，这些杂合细胞支持转染Ig基因的表达，尽管内源Ig基因表 达终止。

表2.克隆早期获得的HKB克隆IgG和可溶性ICAM分泌瞬时转 染试验，数值是蛋白的分泌水平(ng/ml/2d)     HKB克隆     IgG   可溶性ICAM-1     1     ～150     ～500     2     ～30     ～30     3     ～20     ～50     4     ～80     ～200     5     ～100     ～500     6     ～50     ～300     7     ～40     ～200     8     ～30       nd     9     ～80       nd     10     ～80     ～100     11     ～200       nd     12     ～100       nd     13     ～80     ～150     14     ～80       nd     15     ～30     ～200     16     ～80     ～200     17     ～160     ～500     18     ～80     ～200     19     ～80     ～100

            nd＝未试验

EB病毒(EBV)在2B8细胞中以附加体形式存在。所有SCC的 EBNA-1表达阳性(数据未示出)，这表明它们是EBV阳性的。但是， 尚不清楚在杂合细胞中是否还存在完整EBV基因组。因此，杂合细胞 中EBV基因组的状态通过用EBV基因组片段BZLF1转染细胞来测 定，BZLF1是潜伏破坏反式激活基因。HKB细胞(5×106细胞)用允许 BZLF1功能性表达的10μg质粒DNA(pSH121)转染。EBV衣壳抗原 (EBV-VCA)使用含有抗EBV-VCA滴度和FITC辍合的抗人IgG 的人血清通过间接免疫荧光进行检测。免疫荧光的技术细节如上所述。 如表3所示，模拟转染细胞的EBV衣壳抗原(EBV-VCA)表达是阴 性的，这表明其中EBV复制是阴性的。但是，少量转染细胞的抗原表 达是阳性的。这些数据表明杂合细胞携带潜伏形式的EBV基因组。

表3.BZLF1转染的EBV复制诱导     病毒衣壳抗原表达(％)     HKB克隆     模拟转染     BZLF1     HKB1     阴性     0.20％     HKB5     阴性     1-2％     HKB7     阴性     0.20％     HKB11     阴性     0.20％     HKB13     阴性     0.50％     HKB17     阴性     0.20％     HKB19     阴性     1-2％

在摇瓶中通过依次2倍稀释FBS使杂合细胞适应无血清培养基。2 周后，细胞生长在无FBS的培养基中。细胞在摇瓶中长成小聚集物。 与293S细胞不同，杂合细胞容易适应无血清悬浮培养。添加有转铁蛋 白和胰岛素的无血清和无白蛋白培养基中，杂合细胞可以使用摇瓶作为 悬浮培养物维持1年以上。

为了比较转染基因产物的水平，一个克隆HKB11与亲本细胞293S 和2B8用pSM98(可溶性ICAM-1)、pSH125(抗TNF IgG)和pCISF8 (rFVIII)转染。如图3所示，HKB11细胞中ICAM-1和IgG的分泌 水平大大高于293S细胞(约10倍)。2B8的2种蛋白分泌水平不可检 测。HKB11细胞中rFVIII的分泌水平类似于293S细胞。这些数据表明 HKB11细胞的转染效率明显高于亲本细胞。

                      实施例3

稳定分泌异源蛋白的HKB克隆的衍生

在基因扩增系统(dhfr/MTX)中测试杂合克隆的稳定蛋白表达。 细胞首先用合适的表达载体转染，然后将转染细胞(通常每个96孔板 上106细胞)接种到无次黄嘌呤和胸腺嘧啶但添加了FBS和MTX(50 nm)的选择培养基中进行选择/扩增。对平板进行第一轮筛选后，选择 高分泌孔细胞，转移到6孔板上。6孔板上的细胞以含有更高浓度MTX (100、200和400 nM)的培养基进一步扩增。对6孔板上的起始群体 进行进一步筛选以衍生最后的群体。最后，这些群体用来克隆单细胞衍 生的克隆。如表4所示，HKB11细胞最适合用来产生高水平异源人蛋 白。用于生产ICAM-1、Ig和IL-4衍生物时，HKB11细胞同CHO 细胞一样优良(数据未示出)。但是，HKB克隆生长较CHO克隆更快， 容易适应悬浮培养和无血清条件。用于生产BDD-FVIII时，HKB11 克隆显示出较CHO克隆高10倍的产率。上述结果表明，HKB11细胞 是用于表达治疗性人蛋白的最佳人细胞宿主。

表4.HKB克隆的异源蛋白生产 蛋白    细胞宿主    MTX扩增    特异性产率 ICAM-1    HKB11      100nM      10pg/c/d1  Ig       HKB13       50nM      12pg/c/d BDD-FVIII HKB11      400nM      5-10uU/c/d2   IL-4SA  HKB11      100nM      5pg/c/d3

1.HKB克隆的ICAM-1生产水平类似于293S细胞。分泌ICAM-1的HKB 克隆容易适应悬浮培养，而293S克隆难以适应悬浮培养。

2.BDD-FVIII分泌水平高于以相同表达载体转染的CHO细胞衍生的克隆约 10倍

3.使用HKB11转染后6个月可以产生克数级IL-4SA(T13D/R121E)，而使 用相同表达载体和类似方法在相同试验中采用CHO细胞所需时间要多几个月。

上述方法衍生的细胞系包括(i)在100nM MTX中扩增后以pSM98 转染的HKB11细胞衍生的可溶性ICAM-1分泌克隆(10pg/细胞/日)， (ii)在50nM MTX中扩增和无MTX有限稀释克隆后以pSS125转柒的 HKB13细胞衍生的单克隆抗体(抗TNF)分泌单细胞克隆(12pg/细胞 /日)，(iii)在400nM MTX中扩增和无MTX有限稀释克隆后以 pCIS25DTR转染的HKB11细胞衍生的截短的rFVIII(BDD-FVIII) 分泌单细胞克隆(5-10μU/c/d，无血清条件下)，(iv)MTX扩增后以 pSH157转染的HKB11细胞衍生的IL-4衍生物(IL-4选择性激动剂 IL-4SA；两个位置氨基酸突变，即T13D和R121E)分泌克隆(5 pg/c/d)。IL-4SA分泌HKB克隆1G2用来相对快速生产少量蛋白(克 数级)。上述表达载体的物理图谱参见图2。

                        讨论

本文所述杂合人细胞系表现出其亲本细胞系具有的有利特征。 HKB细胞系是通过人胚胎肾细胞(或来源于人胚胎肾细胞的细胞)与 非洲淋巴瘤细胞(或来源于非洲淋巴瘤细胞的细胞)的融合产生的，它 可用于发展表达异源蛋白的细胞系。

建立293S和2B8杂合细胞系的最初目的是解决293S细胞的聚集 问题，它们在悬浮培养时容易结块(不利的特征)。由杂合过程得到的 HKB细胞在T形瓶中培养时长成单层。但是，这些细胞以悬浮方式培 养时以悬浮细胞形式生长(不形成大的聚集物)。HKB细胞容易转染， 转染效率大大高于293S细胞。

尽管在产生稳定细胞系的大多数情况下需要的转化或杂交事件可 能导致改变的糖基化模式(Yamashita，1989，J Biol Chem 264：2415- 2423)，但发现体细胞杂合细胞系HKB11具有典型的人糖基化酶，例 如α(2-3)和α(2-6)唾液酸转移酶。而且，转染HKB细胞生产的 蛋白具有α(2-3)和α(2-6)唾液酸连键的正常人糖基化模式。

总而言之，HKB是具有各个亲本细胞系的有利特征的杂合人细 胞，即在悬浮培养时无聚集(同2B8细胞)，容易转染和有利的分泌 特征(同293S细胞)。优选的杂合人细胞系HKB11同293S细胞一样， 免疫球蛋白基因表达是阴性的。这一性状在重组生产人细胞的单克隆抗 体时是有利的。发现人细胞融合产生了具有有利特征的细胞的事实会促 进使用293S和B细胞来源的其它细胞系如Namalwa和6F11进行人细 胞融合的进一步研究，从而由不同亲本细胞系融合得到的杂合细胞中获 得性状的新组合。

上述实施例旨在说明本发明，本领域技术人员很容易设想到其它改 变形式。因此，本发明范围仅由权利要求书限定。

相关申请：Cho和Chan的称作MSB-7254(美国系列号 09/209,915)的申请“具有EB病毒末端重复序列的载体”和Cho等的 称作MSB-7255(美国系列号09/309,916)的申请“因子VIII的表达 系统”包含相关主题。两个申请在1998年12月10提交。

发明背景