携带人原癌基因的哺乳动物癌细胞和转基因哺乳动物以及利用上述原癌基因的癌症诊断试剂盒
阅读：883发布：2020-05-14
专利汇可以提供携带人原癌基因的哺乳动物癌细胞和转基因哺乳动物以及利用上述原癌基因的癌症诊断试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种由包含具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的人原癌基因的表达载体所 转染 的 哺乳动物 细胞；一种带有包含人的原癌基因的核苷酸构建体的哺乳动物胚胎；一种从哺乳动物胚胎中衍生的转癌基因哺乳动物；一种诊断 乳腺癌 、肾脏癌、卵巢癌和胃癌的 试剂 盒 ，此试剂盒含有一种可以与人的原癌基因转录的mRNA或一部分所述mRNA互补的核苷酸序列探针，或一种可以与mRNA的翻译蛋白或所述蛋白的一部分特异结合的 抗体 。，下面是携带人原癌基因的哺乳动物癌细胞和转基因哺乳动物以及利用上述原癌基因的癌症诊断试剂盒专利的具体信息内容。
1、一种被表达载体转化的哺乳动物细胞，所述的表达载体包含具有 SEQ ID NO：1核苷酸序列的人原癌基因。
2、权利要求1的哺乳动物细胞，其为小鼠细胞系HCCR-1M(KCTC 0923BP)或者人细胞系HCCR-1H(KCTC 0922BP)。
3、一种携带被引入的核酸构建体的哺乳动物胚胎，所述的核酸构建 体包含具有SEQ ID NO：1核苷酸序列的人原癌基因。
4、权利要求3的哺乳动物胚胎，其中的哺乳动物是小鼠FVB。
5、权利要求4的哺乳动物胚胎，其为小鼠胚胎HCCR-1(KCTC 0924BP)。
6、一种转基因患癌的哺乳动物，其衍生于权利要求3-5任何一项中 的胚胎。
7、权利要求6的转基因哺乳动物，其中的癌症是乳腺管乳突状腺癌。
8、一种用于癌症诊断的试剂盒，所述的癌症选自乳腺癌、肾脏癌、 卵巢癌和胃癌，该试剂盒包含一个探针，该探针包含互补于人HCCR-1 原癌基因转录的mRNA或一部分所述mRNA的核苷酸序列，所述的人 原癌基因具有SEQ ID NO：1核苷酸序列；或者所述试剂盒包含一种抗体， 该抗体特异结合于由所述mRNA翻译的蛋白或者一部分所述蛋白。
技术领域
本发明涉及一种由包含具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的人原癌基 因的表达载体所转染的哺乳动物细胞；一种带有包含人的原癌基因的核 苷酸构建体的哺乳动物胚胎；一种从哺乳动物胚胎中衍生的转癌基因哺 乳动物；和一种使用所述原癌基因诊断乳腺癌、肾脏癌、卵巢癌和胃癌 的试剂盒。
背景技术
包括人在内的每一个高等动物，都带有大约100,000个基因，但只有 约15％的这部分基因能够表达，个体的生命演化特征，如：发生、分化、 稳态、对刺激的反应、细胞周期的调控、衰老与编程性细胞死亡(细胞 程序性死亡)都取决于哪些基因在表达(Liang，P.和A.B.Pardee，Science， 257：967-971(1992))。
致病的现象如肿瘤发生是由于基因突变使基因表达的方式发生了变化 而导致的。
有报道说肿瘤的发生是由于各种各样的遗传变化，如：染色体杂合性 缺失、癌基因的激活以及抑癌基因的失活等等而导致的(Bishop，J.M.，Cell， 64，235-248(1991)；和Hunter，T.，Cell，64，249-270(1991))。而且，还有报 道说，有10％-30％的人类癌症是由于原癌基因的扩增使癌基因激活而引 起的。
因此，原癌基因的激活在许多肿瘤的病因学中是起主要作用的，所以 存在鉴定原癌基因的需要。
本发明人曾报道过子宫颈癌1(HCCR-1)的原癌基因在癌细胞内的 特异地过表达(韩国专利公开号No.2001-39566)。为了揭示肿瘤发生过 程中的机理，本发明的发明者努力去建立一种癌细胞系和一种利用 HCCR-1原癌基因使其发生癌症的转基因哺乳动物。
发明概述
依上所述，本发明的一个目的是提供了一种含有诱导的HCCR-1原癌 基因的哺乳动物细胞。
本发明的另外一个目的是提供了一种带有HCCR-1原癌基因的哺乳动 物胚胎和一种衍生于此哺乳动物胚胎的转基因哺乳动物。
本发明的另外一个目的是提供一个利用HCCR-1原癌基因来诊断乳腺 癌、肾脏癌、卵巢癌和胃癌的试剂盒。
按照本发明的一个方面，提供了一种被一种表达载体转化的哺乳动物 细胞，所述的表达载体包含带有SEQ ID NO：1核苷酸序列的人的HCCR-1 原癌基因。
附图说明
本发明的上述目的和特点在结合附图的下述优选实施方案中将会得到 清楚的体现。
图1A和图1B分别是单层培养的HCCR-1M细胞和亲代野生型 NIH/3T3细胞的相差特征；
图2是HCCR-1M的单层培养细胞的苏木精-伊红染色结果；
图3是HCCR-1M细胞的透射电子显微镜图片；
图4是同种异体移植HCCR-1M细胞的裸鼠照片，其显示出明显的节 状瘤；
图5是取自同种异体移植HCCR-1M细胞的裸鼠的明显节状瘤的苏木 精-伊红染色结果；
图6是取自同种异体移植HCCR-1M细胞的裸鼠的明显节状瘤的透射 电子显微镜图片；
图7A至7D是免疫组织化学法的分析结果，其分别显示了在取自接 种HCCR-1M细胞的裸鼠的明显节状瘤中的网硬蛋白纤维、角蛋白、上 皮膜抗原和波形蛋白的表达；
图8是单层培养细胞的HCCR-1MN的相差特征；
图9是HCCR-1M细胞和HCCR-1MN细胞中HCCR-1原癌基因表达 的蛋白质印迹分析结果；
图10A和图10B是HCCR-1H的单层培养细胞和亲代野生型293细胞 各自的相差特征；
图11是取自同种异体移植HCCR-1H细胞的裸鼠的明显节状瘤的苏 木精-伊红染色结果；
图12A至12C是免疫组织化学法的分析结果，其分别显示来在取自 接种HCCR-1H细胞的裸鼠的明显节状瘤中的细胞角蛋白8、细胞角蛋白 19和波形蛋白的表达结果；
图13是HCCR-1H细胞中HCCR-1原癌基因表达的RNA印迹分析结 果；
图14是一张图，其显示了在阳性对照293细胞、阴性对照细胞、亲 代野生型NIH/3T3细胞、转染了pcDNA3载体的比较NIH/3T3细胞、和 HCCR-1M细胞中的端粒末端转移酶活性；
图16A至16C分别是HCCR-1M细胞中egr-1基因，c-fos基因和甘油 醛-2-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因表达的RNA印迹分析结果；
图17A是HCCR-1H细胞中p53肿瘤抑制基因表达的蛋白质印迹分 析结果；图17B是β-肌动蛋白的蛋白质印迹分析结果；
图18所示为HCCR-1H细胞中p53肿瘤抑制基因表达的免疫沉淀分 析结果；
图19A、19C、19E、19G和19I分别是HCCR-1H细胞中MDM2，Bax， p21WAF1，p16INK4A和p14ARF基因表达的蛋白质印迹分析结果；图19B、 19D、19F、19H和19J是β-肌动蛋白的蛋白质印迹分析结果；
图20A是蛋白质印迹分析结果，其显示了沉淀中的GST蛋白，所属 沉淀是通过免疫沉淀CHO细胞中的FLAG蛋白来制备的，所述的CHO 细胞被表达FLAG和HCCR-1的融合蛋白的载体、以及表达GST和D52 的融合蛋白的载体所共沉淀；图20B是利用免疫沉淀GST蛋白制备的沉 淀中的PLAG蛋白；
图21是含有HCCR-1原癌基因的核苷酸构建体的示意图；
图22是衍生于具有诱导的HCCR-1原癌基因的胚胎的转基因患癌小 鼠；
图23是一张从携带诱导的HCCR-1原癌基因的胚胎中衍生的转基因 患癌小鼠的乳房肿瘤照片；
图24是从携带诱导的HCCR-1原癌基因的胚胎中衍生的转基因患癌 小鼠的乳房肿瘤的苏木精-伊红染色结果；
图25是从携带诱导的HCCR-1原癌基因的胚胎中衍生的转基因患癌 小鼠的乳房肿瘤的透射电子显微镜图片；
图26A是乳房、肾脏、卵巢和胃的肿瘤组织中HCCR-1原癌基因表 达的RNA印迹分析结果；图26B是使用β-肌动蛋白探针杂交的相同印 迹。
图27是人的乳房、肾脏、卵巢和胃的肿瘤组织中HCCR-1原癌基因 表达的蛋白质印迹分析结果；
图28是显示HCCR-1原癌基因在人染色体上位置的荧光原位杂交分 析结果；
发明详述
被用于本发明的哺乳动物细胞和转基因哺乳动物制备的SEQ ID NO： 1人原癌基因(以下称为“HCCR-1”原癌基因)，位于第12条染色体的 长臂上(12q)，其具有一个可读框，该可读框编码具有SEQ ID NO：2的 氨基酸序列、分子量为大约50kDa的蛋白。
考虑密码子的兼并性以及在HCCR-1原癌基因将要被表达的具体动 物中的优选密码子，可以例如在没有不利地改变所表达蛋白的氨基酸序 列的编码区中，或者在没有不利地影响HCCR-1原癌基因表达的非编码 区中，得到SEQ ID NO：1核苷酸序列的许多改变和变型。因此，本发明 的范围还包括具有与HCCR-1原癌基因及其片段基本上一致的碱基序列 的多聚核苷酸序列。这里使用的“基本上一致的多聚核苷酸序列”指的 是一个具有与HCCR-1原癌基因80％或更多，优选90％或更多，最优选 95％或更多同源性的多聚核苷酸序列。
HCCR-1原癌基因可以从人的肿瘤组织中获得或者采用常规的DNA 合成的方法获得。另外，如此制备的HCCR-1原癌基因可以插入到常规 载体中以获得表达载体。
接下来，表达载体可以转移到一个合适的哺乳动物细胞中以获得由 此表达载体转染的哺乳动物细胞。举例来说，NIH/3T3细胞(ATCC CRL 1658)，一种分化的小鼠成纤维细胞系，和293细胞(ATCC CRL 1573)， 一个人的胚胎肾脏细胞系，被分别转染包含HCCR-1原癌基因的表达载 体pcDNA3/HCCR-1以获得转染HCCR-1原癌基因的NIH/3T3细胞和293 细胞并被分别命名为HCCR-1M细胞和HCCR-1H细胞，根据布达佩斯条 约中有关专利程序中菌种保藏的规定，这两种细胞于2000年12月26日 被保藏在韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(地址：#52，Oun-dong， Yusong-ku，Taejon 305-333，韩国)，序列号分别为KCTC 0923BP和KCTC 0922BP。
如此获得的本发明哺乳动物细胞过表达HCCR-1原癌基因并显示出 肿瘤膨大细胞的形态特征。具体地说，小鼠HCCR-1M细胞具有多面体 形状，带有显著的核仁的细胞核，发育良好的粗糙内质网(rER)和高尔 基复合体，细胞表面带有细绒毛，并且呈现畸形的有丝分裂象。与野生 型细胞相比，人的HCCR-1H细胞具有增大的细胞直径和细胞体积。
本发明的哺乳动物细胞具有致瘤力，因此，移植此哺乳动物细胞的 哺乳动物可以产生肿瘤如可触瘤。而且，从肿瘤中分离的哺乳动物细胞 亦具有致瘤力。例如，一种被命名为HCCR-1MN，从移植HCCR-1M细 胞的裸鼠的可触瘤中分离到的小鼠细胞，具有与那些HCCR-1M细胞相 似的形态特征。
本发明的哺乳动物细胞产生大量与D52蛋白(基因库序列号 NM003288)相互作用的HCCR-1蛋白，据报道D52蛋白与乳腺癌有关 (Byrne，J.A.et al.，Cancer Res.，55，2896-2903(1995)；和Byrne，J.A.et al.， Oncogene，16，873-881(1998))。它同时增强细胞内的蛋白激酶C和端粒 末端转移酶的活性，引起特殊细胞周期关卡控制的丢失，和抑制egr-1的 表达，从而诱使细胞发生恶性转化。在此过程中，与细胞周期调控有关 的p53肿瘤抑制基因表达量增加，而绝大多数的p53蛋白是无活性的， 从而导致细胞恶性转化。HCCR-1原癌基因引起p53肿瘤抑制基因在上 游水平发生功能丧失。因此，如果能鉴定出控制p53基因的HCCR-1原 癌基因部分，那么通过改变相应的核苷酸序列就可能使p53基因恢复活 性。
此外，可以将包含HCCR-1原癌基因的核苷酸构建体导入合适的哺 乳动物如小鼠的胚胎，可以将如此得到的哺乳动物胚胎植入一个合适受 体的子宫中并使其发育形成转基因哺乳动物。这种建立转基因哺乳动物 的方法在本领域为人所熟知，优选在胚胎的8细胞期或更早时期导入此 核苷酸构建体。
以此法建立的转基因哺乳动物过表达HCCR-1原癌基因，并在乳房 内发展成为乳腺管乳突状腺癌(ductal papillary adenocarcinoma of breast)， 其表现出如下特征：有明显边界的无包膜的节状瘤；乳突状结构和腺或 鸭样结构；中心部分发生大面积的坏死；具有不明显界限的立方形或卵 圆形细胞；正常的乳房组织邻接在那里；和大量颗粒状嗜酸性胞质。
转基因胚胎也可以通过雌雄转基因哺乳动物交配而获得。典型转基 因胚胎是小鼠FVB/N胚胎(被命名为小鼠胚胎HCCR-1)，其携带图21 结构的核酸构建体。根据布达佩斯条约中有关专利程序中菌种保藏的规 定，这两种细胞于2000年12月26日被保藏在韩国典型培养物保藏中心 (KCTC)(地址：#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon 305-333，韩国)，序列 号为KCTC 0924BP。
由于本发明的哺乳动物细胞和转基因哺乳动物能够过表达HCCR-1 原癌基因以引发癌症，因此它们在筛选致癌物或抗癌制剂，如抗氧化剂 的应用上是有利的。
此外，HCCR-1原癌基因在乳房、肾脏、卵巢和胃的肿瘤组织中过 表达，因此其产物可以被有效地用于癌症的诊断。癌症的诊断可以通过 能与HCCR-1原癌基因表达的HCCR-1 mRNA或蛋白特异结合的探针或 抗体与来自受试者的乳房、肾脏、卵巢和胃的组织中的mRNA或蛋白的 相互作用来实现；可以利用许多本领域已知的实验技术来检测HCCR-1 mRNA或蛋白，从而确定受试者是否过表达HCCR-1原癌基因产物。利 用放射性同位素或酶标记的探针或抗体可以很容易的检测出原癌基因产 物的存在。所以，本发明还提供了一个诊断乳腺癌、肾脏癌、卵巢癌和 胃癌的试剂盒，此试剂盒含有一个可以与HCCR-1原癌基因表达的mRNA 或蛋白特异结合的探针或抗体。典型的探针包括一段可以与HCCR-1原 癌基因转录的mRNA或此mRNA的一部分互补的多核苷酸或者寡核苷 酸，这样使其可以与HCCR-1 mRNA特异结合，优选的情况是其具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列。所述的探针可以从人组织中获得或利用常规的 DNA合成方法合成。此外，抗体可以利用本领域熟知的常规方法制备。
以下实施例的目的是为了进一步对本发明进行描述，而不是为了限 制本发明。
参考实施例1：透射电子显微镜(TEM)
细胞或组织用2.5％的戊二醛磷酸缓冲液(pH7.4)固定，用2％的 四氧化锇进行后固定。样品用浓度梯度乙醇进行脱水处理，并包埋在Epon 812中。用乙酸双氧铀和柠檬酸铅将超薄切片染色，并用透射电子显微 镜(JEOL 1,200 EX，Tokyo，Japan)拍照。
参考实施例2：蛋白质印迹分析
参照Laemmli所述的方法(Nature，227，680-685(1970))将细胞收集 并在Laemmli样品缓冲液中裂解。细胞质蛋白用10％的SDS-PAGE分离 并电印迹到硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜与抗体一起温浴。冲洗后， 将膜在封阻液中温浴，此封闭液含有1∶1,000稀释的、作为二抗的过氧 化物酶偶联的羊抗鼠免疫球蛋白(Jackson免疫学研究)。蛋白用ECL蛋 白质印迹分析试剂盒(Amersham)显示。
参考实施例3：免疫组织化学分析
组织首先与一抗温浴，而后切成5μm的厚度。结合的一抗用生物 素酰化二抗，抗生物素蛋白，生物素酰化辣根过氧化物酶和氨乙基咔唑 (AEC)等色素原显色(HISTOSTAIN-BULKKITS，Zymed)。
参考实施例4：总RNA的提取
总RNA利用一个商品化的系统(RNeasy total RNA kit，Qiagen Inc.， Germany)从样品组织或细胞中抽提，并利用Message clean试剂盒 (GenHunter Corp.，USA)来去除污染的DNA。
参考实施例5：RNA印迹分析
20μg的总RNA用1％的甲醛琼脂糖凝胶电泳后转移到尼龙膜上 (Boehringer-Mannheim，Germany)。将印迹与由rediprime II随机引物标 记系统(Amersham，UK)制备的32P随机引物探针在42℃条件下杂交过夜。 连续重复两次RNA印迹分析，用光密度测定法进行定量，并用β-肌动 蛋白探针对同样的印迹进行杂交以确定mRNA的完整性。
制备实施例1：包含HCCR-1原癌基因的表达载体的构建
大肠杆菌JM-109/HCCR1(KCTC 0667BP)带有表达载体p CEV- LAC/HCCR-1，其包含由SEQ ID NO：1核苷酸序列代表的全长HCCR-1 cDNA。从大肠杆菌JM-109/HCCR1细胞培养物中分离表达载体pCEV- LAC/HCCR-1。然后用SalI酶切如此获得的表达载体pCEV-LAC/HCCR- 1以获得包含HCCR-1全长cDNA的2.1kb的DNA片段。
用XhoI酶切哺乳动物表达载体pcDNA3(Invitrogene)以得到与SalI 相配的末端。将2.1kb的SalI片段与XhoI消化的pcDNA3连接以获得包 含全长HCCR-1 cDNA的表达载体pcDNA3/HCCR-1。
制备实施例2：抗HCCR-1抗体产物
为了获得制备抗HCCR-1抗体时有用的HCCR-1蛋白，从大肠杆菌 JM-109/HCCR1(KCTC 0667BP)细胞培养物中分离表达载体pCEV- LAC/HCCR-1。以表达载体pCEV-LAC/HCCR-1为模板，以SEQ ID Nos：4 和5为引物进行聚和酶链式反应(PCR)以获得SEQ ID NO：1的123到 473的核苷酸序列(SEQ ID NO：2的39-155氨基酸残基)。将PCR产物 插入到载体pMAL-p2(New England Biolab，USA)的BamHI/SalI酶切位点 以获得重组载体(命名为pMAL-p2/HCR-1-c-末端)，随后，将pMAL- p2/HCCR-1-c-末端转化到大肠杆菌BL21中(ATCC CRL 47092)。将转化 体在LB培养基中培养，所得到的培养物用100倍体积的LB培养基稀释。 稀释培养物温浴3小时后加入1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 以诱导HCCR-1原癌基因的表达。衍生于载体pMAL-p2、与麦芽糖结合 蛋白(MBP，42kDa)融合的HCCR-1蛋白的C-末端得到表达，其分子量 为大约64kDa。利用pMAL蛋白融合和纯化系统(New England Biolab， USA)纯化了此64kDa的融合蛋白。
给10只3个月大的，各重约2.5kg的新西兰白兔进行腹部用药，每 周1mg的融合蛋白给予三次。把免疫兔子的血样进行离心以获得包含多 克隆抗体的血清。
实施例1：转染HCCR-1原癌基因的小鼠细胞的制备
利用从制备实施例1中得到的表达载体pcDNA3/HCCR-1用脂转胺 (lipofectamine)转染NIH/3T3细胞(ATCC CRL 1658)——分化的小鼠 成纤维细胞系，将得到的NIH/3T3细胞在补充有G418(Gibco)的Waymouth MB 752/1培养基中培养以获得转染HCCR-1原癌基因的NIH/3T3细胞， 其被命名为HCCR-1M，于2000年12月26日保藏在韩国典型培养物保 藏中心，保藏号为KCTC 0923BP。
实施例2：转染HCCR-1原癌基因的人源细胞的制备
除了以293细胞(ATCC CRL-1573)代替NIH/3T3细胞之外，重复 实施例1的操作程序，以获得转染HCCR-1原癌基因的293细胞细胞， 其被命名为HCCR-1H，于2000年12月26日保藏在韩国典型培养物保 藏中心，保藏号为KCTC 0922BP。
对照实施例：用载体pcDNA3转染的对照细胞的制备
除了以载体pcDNA3(Invitrogen)代替载体pcDNA3/HCCR-1之外， 重复实施例1的操作程序，以获得转染载体pcDNA3的对照细胞。
实施例3：HCCR-1M细胞的形态特征
(步骤1)HCCR-1M细胞的相差特征
由实施例1获得的HCCR-1M细胞在Waymouth MB 752/1培养基中 进行单层培养后在相差显微镜下观察。NIH/3T3的亲代野生型细胞为对 照。
图1A和图1B是HCCR-1M的单层培养细胞和NIH/3T3的亲代野生 型细胞各自的相差特征。从图1A和图1B中可以看出，NIH/3T3的亲代 野生型细胞呈纺锤体状，具有细长的细胞核和稀少的细胞质，而HCCR- 1M细胞呈多面体状，卵圆形的细胞核和饱满的细胞质。
(步骤2)苏木精-伊红染色
由实施例1获得的HCCR-1M细胞在Waymouth MB 752/1培养基中 进行单层培养后用苏木精-伊红染色。
图2是HCCR-1M单层培养细胞的苏木精-伊红染色结果。从图2中 可以看出，HCCR-1M细胞呈现细胞核多态性、清晰的核仁、颗粒状染色 质模式、瘤巨细胞和不典型的有丝分裂特征。
(步骤3)TEM
由实施例1获得的HCCR-1M细胞按照参考实施例1的程序进行处 理。
图3是HCCR-1M细胞的TEM照片，单位刻度代表3μm，插页是圆 圈所示部位的高度放大图(单位刻度，1μm)。从图3中可以看出，HCCR-1M 细胞表面带有细绒毛，带有显著的核仁的分叶细胞核，发育良好的粗糙 内质网(rER)和高尔基复合体(圆圈)。
上述结果显示HCCR-1M细胞具有肿瘤细胞的形态特征。
实施例4：HCCR-1M细胞的肿瘤发生能力
将由实施例1获得的5×106的HCCR-1M细胞以皮下组织注射的方 式被注射到9只裸鼠(背景为：5周龄的无胸腺nu/nu BALB/c)躯干后 侧面。
所有注射HCCR-1M细胞的9只裸鼠在21天后均发现可触的肿瘤。 图4是同种异体移植HCCR-1M细胞的裸鼠的照片。这说明HCCR-1M 细胞具有肿瘤发生能力。
当皮下组织中的肿瘤直径达到1.5-2.5cm时，裸鼠死亡，肿瘤被取出 并用于下面的肿瘤分析和细胞系的建立。
实施例5：移植HCCR-1M细胞的裸鼠的肿瘤结特征
同种异体移植HCCR-1M细胞的裸鼠的肿瘤结特征的检测如下。
(步骤1)苏木精-伊红染色
用苏木精-伊红染色由实施例4获得的肿瘤结。
图5是肿瘤结的苏木精-伊红染色结果(×250)。从图5中可以看出， 肿瘤结具有典型的由纤维基质分开的上皮细胞巢。
(步骤2)TEM
由实施例4获得的肿瘤结按照参考实施例2的程序进行处理。
图6是肿瘤结的TEM照片，单位刻度代表3μm，插页是圆圈所示部 位的高度放大图(单位刻度，0.5μm)。从图6中可以看出，肿瘤结细胞 具有发育良好的细胞器和紧密连接的桥粒。这说明HCCR-1M细胞已变 为表皮细胞。
(步骤3)免疫组织化学分析
将由实施例4获得的肿瘤结按照参考实施例3的程序进行免疫组织 化学分析，分别利用抗-网硬蛋白纤维、抗-角蛋白、抗-上皮膜抗原(EMA) 和作为一抗的抗-波形蛋白抗体(DAKO)。
图7A至7D分别是肿瘤结中网硬蛋白纤维、角蛋白、上皮膜抗原和 波形蛋白表达产物的免疫组织化学分析结果(×250)。从图7A至7D中 可以看出，细胞巢被网硬蛋白纤维包围(图7A)，细胞显示出上皮标记 如角蛋白(图7B)和EMA(图7C)，以及间充质标记如波形蛋白(图7D) 的共表达。这些结果说明HCCR-1原癌基因导致间充质NIH/3T3细胞向 上皮细胞转换。
特别是，导入原癌基因的间充质NIH/3T3细胞转化为肉瘤，而裸鼠 异体移植HCCR-1M细胞后形成可触瘤。
实施例6：从异体移植HCCR-1M细胞的裸鼠中制备癌细胞系
从由实施例4获得的肿瘤结中分离细胞并在添加20％的胎牛血清的 Waymouth MB 752/1培养基中进行培养，将其命名为HCCR-1MN细胞。
实施例7：HCCR-1MN细胞的特征
由实施例6获得的HCCR-1MN细胞按照实施例3的步骤1程序在相 差显微镜下观察。
图8是HCCR-1MN单层培养细胞的相差特征(×300)。从图8中可 以看出，HCCR-1MN细胞所具有的形态特征与实施例3的步骤1中 HCCR-1M细胞所具有的形态特征相似。
实施例8：HCCR-1M细胞与HCCR-1MN细胞的蛋白质印迹分析
为了检测HCCR-1M细胞与HCCR-1MN细胞中HCCR-1原癌基因的 表达情况，分别将由实施例1和实施例6获得的HCCR-1M细胞与 HCCR-1MN细胞，利用由制备实施例2获得的抗-HCCR-1血清，按照参 考实施例2程序进行蛋白质印迹分析。为了比较，亲代野生型NIH/3T3 细胞和从比较实施例中获得的NIH/3T3细胞也进行了蛋白质印迹分析。
图9是HCCR-1M细胞与HCCR-1MN细胞中HCCR-1原癌基因的表 达的蛋白质印迹分析结果。从图9中可以看出，HCCR-1M细胞与 HCCR-1MN细胞中HCCR-1蛋白过表达，但如图中弱带所示，亲代野生 型NIH/3T3细胞和转染载体pcDNA3的NIH/3T3细胞中却无过表达。
实施例9：HCCR-1H细胞的特征
为了检测HCCR-1H细胞的形态特征，将HCCR-1H细胞按照实施例 3的步骤1程序在相差显微镜下观察。以亲代野生型293细胞为对照。
图10A和10B分别是HCCR-1H单层培养细胞和亲代野生型293细 胞的相差特征(×300)。从图10A和10B中可以看出，HCCR-1H细胞 与亲代野生型293细胞相比具有增大的细胞直径和细胞结构。
实施例10：HCCR-1H细胞的致瘤力
为检测HCCR-1H细胞的致瘤力，将由实施例2得到的HCCR-1H细 胞按照实施例4的程序进行重复操作。
异种移植HCCR-1H细胞的裸鼠在21天后均发现可触的肿瘤。这说 明HCCR-1H细胞具有致瘤力。
当皮下组织中的肿瘤直径达到1-1.5cm时，裸鼠死亡，肿瘤被取出 并用于随后的肿瘤分析。
实施例11：移植HCCR-1H细胞的裸鼠的肿瘤结特征
同种异体移植HCCR-1H细胞的裸鼠的肿瘤结特征的检测如下。
(步骤1)苏木精-伊红染色
用苏木精-伊红染色由实施例10获得的肿瘤结。
图11是可触肿瘤结的苏木精-伊红染色结果(×250)。从图11中可 以看出，肿瘤结具有典型的上皮细胞癌的特征，如非典型细胞形状，多 型性，核仁增大，增加的细胞核与细胞质的比率。
(步骤2)免疫组织化学分析
由实施例10获得的肿瘤结按照参考实施例3的程序进行免疫组织化 学分析，分别利用抗-细胞角蛋白8、抗-细胞角蛋白19和作为一抗的抗- 波形蛋白的抗体(DAKO)。
图12A至12C分别是可触肿瘤结中细胞角蛋白8、细胞角蛋白19和 波形蛋白表达产物的免疫组织化学分析结果(×250)。从图12A至12C 中可以看出，肿瘤细胞显示出上皮标记如细胞角蛋白8、细胞角蛋白19 (图12A和图12B)，以及间充质标记，波形蛋白(图12C)的共表达。 这些结果说明HCCR-1原癌基因导致间充质293细胞向上皮细胞转换。
实施例12：HCCR-1H细胞的RNA印迹分析
为了检测HCCR-1H细胞中HCCR-1原癌基因的表达水平，按照参 考实施例4的程序，总RNA从由实施例2中获得的HCCR-1H细胞中分 离，利用32P标记的随机HCCR-1 cDNA作探针，按照参考实施例5程序 进行RNA印迹分析。
图13是HCCR-1H细胞与亲代野生型293细胞中HCCR-1原癌基因 的表达的RNA印迹分析结果。从图13中可以看出，在HCCR-1H细胞 中过表达约2.1kb的mRNA单转录体，而亲代野生型293细胞中却没有。
实施例13：小鼠细胞中由HCCR-1原癌基因诱导的肿瘤发生机理
为了检测小鼠细胞中由HCCR-1原癌基因诱导的肿瘤发生机理，以 下对据报道与肿瘤发生过程有关的蛋白酶C(PKC)和端粒末端转移酶活性 异常，细胞周期关卡控制的消失，egr-1、c-fos和GAPDH表达的变化等 进行评价。
(步骤1)PKC活性分析
通常，肿瘤发展的第二步是使PKC介导的信号传导途径发生异常。 为确保HCCR-1控制蛋白激酶C(PKC)的活性，利用亲代野生型NIH/3T3 细胞和从比较实施例中获得的被载体pcDNA3转染的比较NIH/3T3细胞 以及由实施例1获得的HCCR-1M细胞进行PKC分析。
PKC活性是按照开发商的介绍，利用Sigma TECTTM蛋白激酶C分 析系统(Promega)来检测的。PKC活性的定义是：在存在和不存在磷 脂的情况下，每分钟结合到底物中的PKC量的差。每个数值是三个独立 实验的平均值±s.d.。
图14是亲代野生型MH/3T3细胞，被载体pcDNA3转染的比较 NIH/3T3细胞和HCCR-1M细胞中PKC活性的图表。从图14中可以看出， HCCR-1M细胞中PKC的活性比野生型高出约10倍。这说明，HCCR-1 原癌基因提高了细胞的PKC活性。
(步骤2)端粒末端转移酶活性分析
基于PKC显著提高端粒末端转移酶活性的报道，利用亲代野生型 NIH/3T3细胞和从比较实施例中获得的被载体pcDNA3转染的比较 NIH/3T3细胞以及由实施例1获得的HCCR-1M细胞进行端粒末端转移 酶活性分析。
端粒末端转移酶活性是按照开发商的介绍，利用端粒末端转移酶 PCR-酶联免疫吸附测定试剂盒(Boehringer Mannheim，USA)来检测的。 试剂盒提供人端粒末端转移酶阳性永生肾细胞作为阳性对照。以经RNase 预处理的293细胞为阴性对照。对1×103的细胞提取数量进行分析。结 果显示了四次独立实验的平均光密度(OD)值的均值(平均值±s.d.)。
图15是阳性对照细胞、阴性对照细胞、亲代野生型NIH/3T3细胞、 被载体pcDNA3转染的比较NIH/3T3细胞和HCCR-1M细胞中端粒末端 转移酶活性示意图。从图15中可以看出，野生型NIH/3T3细胞显示可检 测到的端粒末端转移酶活性，而HCCR-1M细胞与野生型细胞相比具有 升高约7倍的端粒末端转移酶活性。阳性对照细胞中端粒末端转移酶活 性很高而阴性对照细胞中的端粒末端转移酶活性却检测不到。这些结果 与以往的研究是一致的(Holt，s.e.，Wright，W.E.和Shay J.W.Mol.Cell Biol. 16，2931-2939(1996))，这说明HCCR-1M细胞具有由活化PKC诱发的高 端粒末端转移酶活性。
(步骤3)细胞周期实验
肿瘤细胞特别对直接调控它们细胞周期的基因有必然的伤害。为了 检测HCCR-1M细胞中是否具有交替的生长机会，细胞周期概况的确定 如下所述。
HCCR-1M细胞和亲代野生型NIH/3T3细胞培养到中对数生长期后 在含有0.5％的胎牛血清的DMEM培养基中温浴36小时，使其生长停滞。 细胞用胰蛋白酶处理后收集并用70％乙醇固定。向2×106的细胞中添加 50ug/ml碘化丙锭染色液和100单位/ml的RNase A(Boerhinger Mannheim)。温浴30分钟后，用FACS Caliber(Becton Dickinson)在488nm 下进行荧光分析以确定细胞中DNA的含量。用Modfit 5.2软件对至少1 ×104的细胞/样品进行分析。
确定了亲代野生型NIH/3T3细胞和HCCR-1M细胞中G0/G1期、S期、 G2/M期所占的百分率，结果如表I所示。
表I 野生型NIH/3T3 HCCR-1M G0/G1 S G2/M G0/G1 S G2/M 细胞百分比 55.7 20.6 24 46.6 31.5 22.4
从表I中可以看出，亲代野生型NIH/3T3细胞和HCCR-1M细胞中S 期细胞的比率分别为20.6％和31.5％。这些结果说明，HCCR-1M细胞中 很大的群体明显的发生了从G0/G1期到S期的转变。
为了评价血清依赖的细胞周期进程，HCCR-1M细胞和亲代野生型 NIH/3T3细胞在含有0.5％的胎牛血清的DMEM培养基中温浴36小时使 其生长停滞。将细胞转移到含有20％的胎牛血清的DMEM培养基中，在 指定的时间内收集以确证G0/G1期、S期、G2/M期细胞所占的百分率， 结果如表II所示。
表II 时间 细胞百分比 野生型NIH/3T3 HCCR-1M G0/G1 S G2/M G0/G1 S G2/M 0 77 8.0 14.9 70 21.8 8.7 12 72.2 14.0 14.2 66.9 24.0 9.6 24 49.6 13.4 37.2 56.7 24.7 19.2 48 58.3 18.3 23.7 52.7 30.4 17.5
从表II中可以看出，在0小时时，亲代野生型NIH/3T3细胞中S期细 胞的比率为8％，而HCCR-1M细胞中S期细胞的比率为21.8％。这些结 果说明，持续过表达HCCR-1原癌基因可以产生相对量的、对血清剥夺 性诱导的G0/G1期生长停滞具有抵抗力的细胞。在转移到含有20％的胎 牛血清的DMEM培养基中使细胞从生长停滞状态解脱以后，HCCR-1M 细胞比野生型NIH/3T3细胞仍然多出超过10％的S期细胞。因此，过表 达HCCR-1原癌基因可以对细胞产生缩短G0/G1期，增加S期的细胞数 量等反调节。
(步骤4)egr-1、c-fos和GAPDH的表达模式
基于egr-1、c-fos和GAPDH的表达模式参与了肿瘤形成的事实，如 下检测了由实施例1获得的HCCR-1M细胞中egr-1、c-fos和GAPDH的 表达模式。
在含有0.5％的胎牛血清的DMEM培养基中温浴36小时后，处于中 对数生长期的HCCR-1M细胞和亲代野生型NIH/3T3细胞的生长停滞(休 眠期)。将细胞转移到新鲜的含有20％的胎牛血清的DMEM培养基中培 养0，15，30，60和120分钟以刺激生长(有丝分裂期)。按照参考实施 例4的程序从休眠期和有丝分裂期的细胞中抽提总RNA，并利用32P随 机引物标记的egr-1、c-fos和GAPDH的cDNA为探针，依据参考实施例 5的程序实施RNA印迹杂交。
图16A、16B和16C分别是HCCR-1M细胞和亲代野生型NIH/3T3 细胞中egr-1、c-fos和GAPDH表达产物的RNA印迹杂交结果。从图16A 至16C中可以看出，与野生型NIH/3T3细胞相比较，有丝分裂期的 HCCR-1M细胞对egr-1的表达显示出明显的负调节，对GAPDH显示出 正调节而对c-fos的表达无显著影响。
这些结果说明，小鼠NIH/3T3细胞中对HCCR-1基因的反调节引起 PKC和端粒末端转移酶活性的增高，细胞周期尤其是关卡控制的消失， egr-1表达的负调节等结果，从而诱使细胞发生恶性转化。
实施例14：人细胞中HCCR-1原癌基因诱发的肿瘤发生机理
为了确证人细胞中HCCR-1原癌基因诱发的肿瘤发生机理，下面检 测了p53肿瘤抑制子、MDM2、Bax、p21WAF1、p16INK4A、和p14ARF 等已报道的与肿瘤有关的基因的表达模式。
(步骤1)p53肿瘤抑制子的表达模式
为了确证HCCR-1H细胞中p53的表达模式，如下进行蛋白质印迹 分析与RNA印迹分析：
溶解由实施例2获得的HCCR-1H细胞和亲代野生型293细胞，依 据参考实施例2的程序，利用只与野生型p53作用的单克隆抗p53抗体 DO-7(氨基酸37至45；Novocastra Laboratories，Ltd.，UK)或者与野生 型与突变型p53均起作用的Ab-5(DO-7克隆)(氨基酸37至45； NEOMARKERS，INC.，CA)对胞溶产物进行蛋白质印迹分析。用鼠抗人 β-肌动蛋白抗体(Sigma)进行了同样的印迹分析以确定总的蛋白含量。
图17A是HCCR-1H细胞和亲代野生型293细胞中p53肿瘤抑制子 表达产物的蛋白质印迹分析结果；图17B是β-肌动蛋白同样的印迹分析 结果。从图17A可以看出，与亲代野生型293细胞相比，HCCR-1H细胞 中p53蛋白水平有显著提高。
另外，由实施例2获得的HCCR-1H细胞在含有2％的胎牛血清和2 mM的谷氨酰胺但不含甲硫氨酸的RPMI 1640培养基中培养2小时后， 用100μl的L-35S甲硫氨酸(Amersham)进行标记。将这些细胞用1×Hanks 缓冲液(Gibco，USA)冲洗，然后用正常的含L-甲硫氨酸的RPMI 1640 培养基中培养0.5，1，2或4小时。这些细胞在免测沉淀溶液(50mM Tris[pH8.0]，5mM EDTA，150mM NaCl，1％Np-40，1mM苯基甲基磺酰基 氟化物，10mM苯甲脒，1μg胃酶抑素(pepstain)/ml，10mM亚硫酸氢钠) 中溶解，用50μl的A-琼脂糖溶液(Sigma)冲洗后定量。利用抗-p53抗体 对这些细胞的胞溶产物进行免测沉淀(Kessler，S.W.，J.Immunol.，115， 1617-1623(1975))，然后进行SDS-PAGE。使用Hep 3B肝癌细胞重复上 述操作程序，作为缺少p53基因的对照。
图18显示的是HCCR-1H细胞和亲代野生型293细胞中p53肿瘤抑 制子表达的免测沉淀结果。从图18可以看出，与亲代野生型293细胞相 比，HCCR-1H细胞中p53蛋白水平有显著提高。由此，可以认为在由 HCCR-1原癌基因诱发的肿瘤发生机理中，p53蛋白大量表达，但并不能 抑制肿瘤，仍保持非活性状态。
(步骤2)：MDM2、Bax、p21WAF1、p16INK4A、和p14ARF等基因的表 达模式
尽管直接影响肿瘤抑制基因p21WAF1和p16INK4A，但是由于p53 只是调控圈中的一员，而此调控圈还涉及MDM2、Bax和p14ARF，所以 对MDM2、Bax、p21WAF1、p16INK4A、和p14ARF等基因的表达模式进 行分析。
利用由实施例2获得的HCCR-1H细胞；和抗-MDM2、抗-Bax、抗- p21WAF1、抗-p16INK4A抗体(Oncogene ResearchProducts，USA)和p14ARF (Lab Vision，USA)，依据参考实施例2程序进行蛋白质印迹分析。用抗- β-肌动蛋白抗体(Sigma)进行了同样的印迹分析以确定总的蛋白含量。
图19A、19C、19E、19G和19I是HCCR-1H细胞中MDM2，Bax， p21WAF1，p16INK4A和p14ARF等基因表达的蛋白质印迹分析结果；图 19B、19D、19F、19H和19J是β-肌动蛋白的蛋白质印迹分析结果。从 图19A、19C、19E、19G和19I可以看出，与亲代野生型293细胞相比， MDM2，Bax，p21WAF1，p16INK4A和p14ARF等蛋白水平下降。这些结果 说明，HCCR-1的过表达可以确定的抑制MDM2，Bax，p21WAF1， p16INK4A和p14ARF等的转录，从而降低它们的蛋白水平。
总结这些结果以及步骤1中的结果，可以相信HCCR-1的过表达可 以增加p53的稳定性，但p53蛋白却不能形成正向调控MDM2，Bax和 p21WAF1表达的自动调控圈。特别地，从图19E、和19G可以看出， HCCR-1H细胞中的激酶抑制家族基因p21WAF1和p16INK4A处于p53 非依赖性的机制的负调控。从图19I可以看出，p14ARF无论在亲代野生型 293细胞中，还是在HCCR-1H细胞中均无异常表达。这些结果说明， MDM2-p14ARF调控圈的改变不是p53失活的可能机理。
上述结果和实施例13的步骤3的结果表明，小鼠和人细胞中HCCR-1 原癌基因的过表达能够影响对细胞周期的控制，并和p53以及p21细胞 周期调控因子有关联。
(步骤3)：HCCR-1的蛋白质-蛋白质相互作用中的配偶体(partner)
为确证HCCR-1的蛋白质-蛋白质相互作用中的配偶体，下面进行了 酵母双杂交筛选试验。
大肠杆菌JM-109/HCCR1(KCTC 0667BP)培养后从中分离出表达载 体pCEV-LAC/HCCR-1。然后用SalI酶切表达载体pCEV-LAC/HCCR-1 并获得HCCR-1原癌基因，然后插入到包含pLexA DNA结合域的酵母双 杂交载体(Clontech，USA)的BamHI/SalI位点获得载体pLexA-HCCR-1， 并表达pLexADNA结合域与HCCR-1的融合蛋白。将载体pLexA-HCCR-1 与酵母EGY48(Clontech，USA)混合，42℃加热10分钟以转化酵母。 用同样的方法将融合有包含pLexA激活域的pB42AD的人胎脑cDNA文 库(Clontech，USA)转化所得到的酵母。将转化体影印培养到Trp-，Leu-， His-的筛选平板上进行β-半乳糖苷酶过滤提升分析。当转化体含有衍生 于cDNA文库的伴侣基因时，与pLexA激活域融合的伴侣蛋白结合到与 pLexA DNA结合域融合的HCCR-1蛋白上，在含有X-gal的平板培养基 上就形成一个蓝色菌落。为了估计假阳性，进行了酵母交配分析(Guarente， L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，1639-1641(1993))。
从通过上述方法得到的克隆中筛选到了一个编码HCCR-1的蛋白质- 蛋白质相互作用中的配偶体的基因。
将通过上述方法得到的菌落在葡萄糖培养基中培养，并从中利用玻 璃珠抽提到包含配偶体基因的载体。此载体用电穿孔法导入大肠杆菌KC8 (Clontech，USA)中，随后涂布于M9基本培养基上以筛选转化株。用 从转化株中抽提到的质粒DNA转化大肠杆菌DH5α，并在LB培养基中 培养以扩增质粒DNA。从培养物中抽提到的质粒DNA用HindIII酶切以 获得一个包含配偶体基因的1kb片段。配偶体基因的核苷酸序列被证明 与TPD52L2基因(基因库序列号NM003288)相同。TPD52L2基因编 码的D52蛋白最初是由于它在人乳腺癌中增高的表达水平而被发现的， 并在钙介导的信号传导途径和细胞增殖中起作用(Byrne，J.A.，et al.， Cancer Res.，55，2896-2903(1995)；and Byrne，J.A.，et al.，Oncogene，16，873- 881(1998))。
(步骤4)：共转染
为了检测HCCR-1蛋白和D52蛋白之间的相互作用，下面对它们开 展了共转染研究。
大肠杆菌JM-109/HCCR1(KCTC 0667BP)培养后从中分离出表达载 体pCEV-LAC/HCCR-1。然后用SalI酶切表达载体pCEV-LAC/HCCR-1 以获得HCCR-1全长cDNA，然后插入到表达载体N-末端pFALG- CMV(Sigma，USA)的SalI酶切位点以获得表达FLAG和HCCR-1融合蛋 白的表达载体pFLAG-HCCR-1。将由步骤3获得的TPD52L2基因插入到 表达载体pcDNA3(体外遗传，USA)的NotI酶切位点以获得表达GST 和D52融合蛋白的表达载体pGST-TPD52L2。
用表达载体pFLAG-HCCR-1和pGST-TPD52L2共转染CHO细胞， 并在RPMI 1640培养基中培养。48小时后，用胰蛋白酶处理并收集CHO 细胞。将CHO细胞用PBS冲洗并重悬于IP缓冲液(10mM Tris-HCl[pH7.4]， 150mM NaCl，1％Np40，2mM钒酸钠，10mM氟化钠，10mM焦磷酸钠， 5mM EDTA，10μg/ml抑肽酶(aprotinine)，10μg/ml白胃素(leupeptine)， 10μg/ml胃酶抑素(pepstatine)，1mM苯基甲基磺酰基氟化物)。随后 使细胞悬液通过27针仪并将离心所得到的胞溶产物以沉淀未破碎细胞。 上清液通过免疫前IgG和球蛋白A的混合物(Sigma，USA)预清除。利用抗 -FLAG或抗-GST抗体(Sigma，USA)免疫沉淀胞溶产物中的融合蛋白 FLAG-HCCR-1或GST-TPD52L2(Kesler，s.w.，J.Immunol.，115，1617- 1623(1975))。依据参考实施例2的程序利用抗-GST或抗-FLAG抗体对剩 余的蛋白样品进行蛋白质印迹分析。
图20A和20B分别是GST蛋白与FLAG蛋白的蛋白质印迹分析结 果。从图20A和20B中可以看出，在两种沉淀中均检测到融合蛋白。这 些结果表明，D52蛋白与HCCR-1蛋白相互作用。
实施例15：转基因小鼠的制备
为了证实HCCR-1原癌基因在体内诱导肿瘤发生，建立在CMV启 动子控制下表达HCCR-1原癌基因的转基因小鼠。
为了获得用于制备转基因小鼠的HCCR-1的全长cDNA，从大肠杆 菌JM-109/HCCR1(KCTC 0667BP)细胞培养物中分离表达载体pCEV- LAC/HCCR-1。用SalI酶切表达载体pCEV-LAC/HCCR-1，将获得的 HCCR-1全长cDNA插入到表达载体pcDNA3的XhoI酶切位点以获得表 达载体pcDNA3/HCCR-1。用SalI和XmnI酶切表达载体pCEV- LAC/HCCR-1，在0.7％的琼脂糖凝胶中进行电泳并用电洗脱分离。分离 出的DNA片段从10mM Tris-HCl(pH7.4)/0.2mM EDTA溶液中析出并调 至终浓度4ng/ml。如图21所示，所得DNA的结构包括CMV启动子， HCCR-1的cDNA基因和牛生长激素(bGH)polyA序列。
按照前核DNA微注射法(Gordon，J.W.，et al.，Pro.Natl.Acad.Sci.USA， 77，7382-7384(1980))，将DNA微注射到小鼠FVB/N系(Samyuk Corp.， CAMTAKO，Korea)的一个受精卵中：将DNA溶液微注射到1-细胞期的 受精卵前核中，并培养20小时以筛选2-细胞期胚胎。将2-细胞期的胚胎 植入到假孕受体ICR小鼠(Samyuk Corp.，CAMTAKO，Korea)的输卵管 内。从受体小鼠中获得子代小鼠，并将通过对其尾部活检而获得的DNA 样品进行DNA印迹分析。
图22是衍生于由HCCR-1原癌基因诱导的胚胎的转基因小鼠。从图 22中可以看出，大小为1.5cm×1.5cm的肿瘤结位于胸部相邻的右腋部 位。
分离出的肿瘤用裸眼进行了观察。
图23是转基因小鼠的乳房肿瘤图片。从图23中可以看出，转基因 小鼠的肿瘤是单一的，没有包膜却具清晰轮廓的节状瘤。
为了确证肿瘤的形态特征，对其进行了苏木精-伊红染色。图24是 肿瘤的苏木精-伊红染色结果。从图24中可以看出，此肿瘤包括乳突状 结构和腺或鸭样结构。中心部分发生大面积的坏死。正常乳房组织与肿 瘤明显相邻。立方形或卵圆形细胞具有不明显的界限并且具有适量的颗 粒状嗜酸性胞质。肿瘤细胞具有大的、多型的，含染色质多的核，并且 有许多有丝分裂，包括一些非典型形态。注意到一些小但是明显的核仁。 这些结果说明，转基因小鼠的肿瘤呈现乳腺管乳突状腺癌的特征。
图25是肿瘤的透射电子显微镜照片，单位刻度代表2μm。从图25 中可以看出，卵圆形肿瘤细胞具有丰富的胞质细胞器。细胞核具有聚集 的具边缘的染色体和明显的核仁。细胞质中充满了一些线粒体和许多囊 状的囊泡化的rER。一些桥粒是明显的。
所述转基因小鼠的胚胎被命名为HCCR-1，其于2000年12月26日 被保藏于韩国典型培养物保藏中心，序列号为KCTC 0924BP。
实施例16：HCCR-1原癌基因在乳房、肾脏、卵巢和胃肿瘤组织中的表 达
为了检测乳房、肾脏、卵巢和胃的肿瘤组织中HCCR-1原癌基因的 表达，按照参考实施例4的程序，从乳房、肾脏、卵巢和胃的肿瘤组织 中抽提总RNA，利用32P随机HCCR-1 cDNA作探针，按照参考实施例5 程序进行RNA印迹分析。为了比较，用乳房、肾脏、卵巢和胃的正常组 织重复上述操作。
图26A是乳房、肾脏、卵巢和胃的肿瘤组织中HCCR-1原癌基因的 表达的RNA印迹分析结果；图26B是β-肌动蛋白探针的RNA印迹分析 结果。从图26A和26B中可以看出，与正常组织相比，人的乳房、肾脏、 卵巢和胃的肿瘤组织中HCCR-1原癌基因的表达水平增高。
为了检测乳房、肾脏、卵巢和胃的肿瘤组织中HCCR-1蛋白的表达， 利用依据参考实施例2程序由制备实施例2获得的抗-HCCR-1血清对乳 房、肾脏、卵巢和胃的肿瘤组织进行了蛋白质印迹分析。
图27是乳房、肾脏、卵巢和胃的肿瘤组织中HCCR-1原癌基因表达 的蛋白质印迹分析结果。从图27中可以看出，分别与其相对应的正常组 织相比，人的乳房、肾脏、卵巢和胃的肿瘤组织中50kDa的HCCR-1蛋 白均显示出升高的表达。
实施例17：HCCR-1原癌基因在染色体上的位置
用随机引物标记试剂盒(Promega，USA)对由制备实施例1获得的 HCCR-1全长cDNA进行标记以获得探针。利用此探针对人类胎盘λ基 因组文库(Stratagene，USA)进行筛选以获得20kb的基因组DNA。
对基因组DNA进行荧光原位杂交(FISH)(Cherif，D.，et al.，Proc.Natl. Acad.Sci.USA，87，6639-6649(1990))：利用缺口翻译试剂盒(Vysis，USA)， 用SpectrumRed-dUTP对载片上的基因组DNA进行标记。用蔡斯荧光显 微镜观察载玻片。染色体用DAPI(Sigma，USA)进行复染。
图28是荧光原位杂交分析结果，其显示出HCCR-1原癌基因位于12 号染色体的长臂。
虽然仅仅参照优选的实施方案对本发明进行了描述，但是本领域的 技术人员可以在不离开本发明精神和范围的情况下制造出各种改变和变 型，这些改变和变型被限定在后附的权利要求中。
序列表 <110>金振宇 <120>携带人原癌基因的哺乳动物癌细胞和转基因哺乳动物以及利用上述原癌基因的癌 症诊断试剂盒 <130>pca10102/KJW <150>KR 2001-41 <151>2001-01-02 <160>5 <170>KOPATIN 1.5 <210>1 <211>2118 <212>DNA <213>智人 <220> <221>CDS <222>(9)..(1088) <220> <221>信号肽 <222>(9)..(83) <220> <221>混和特征 <222>(435)..(494) <223>跨膜结构域 <400>1 ctgtgaag atg gcg ctc tcc agg gtg tgc tgg gct cgg tcg gct gtg tgg 50
Met Ala Leu Ser Arg Val Cys Trp Ala Arg Ser Ala Val Trp
1 5 10 ggc tcg gca gtc acc cct gga cat ttt gtc acc cgg agg ctg caa ctt 98 Gly Ser Ala Val Thr Pro Gly His Phe Val Thr Arg Arg Leu Gln Leu 15 20 25 30 ggt cgc tct ggc ctg gct tgg ggg gcc cct cgg tct tca aag ctt cac 146 Gly Arg Ser Gly Leu Ala Trp Gly Ala Pro Arg Ser Ser Lys Leu His
35 40 45 ctt tct cca aag gca gat gtg aag aac ttg atg tct tat gtg gta acc 194 Leu Ser Pro Lys Ala Asp Val Lys Asn Leu Met Ser Tyr Val Val Thr
50 55 60 aag aca aaa gcg att aat ggg aaa tac cat cgt ttc ttg ggt cgt cat 242 Lys Thr Lys Ala Ile Asn Gly Lys Tyr His Arg Phe Leu Gly Arg His
65 70 75 ttc ccc cgc ttc tat atc ctg tac aca atc ttc atg aaa gga ttg cag 290 Phe Pro Arg Phe Tyr Ile Leu Tyr Thr Ile Phe Met Lys Gly Leu Gln
80 85 90 atg tta tgg gct gat gcc aaa aag gct aga aga ata aag aca aat atg 338 Met Leu Trp Ala Asp Ala Lys Lys Ala Arg Arg Ile Lys Thr Asn Met 95 100 105 110 tgg aag cac aat ata aag ttt cat caa ctt cca tac cgg gag atg gag 386 Trp Lys His Asn Ile Lys Phe His Gln Leu Pro Tyr Arg Glu Met Glu
115 120 125 cat ttg aga cag ttc cgc caa gac gtc acc aag tgt ctt ttc cta ggt 434 His Leu Arg GLn Phe Arg Gln Asp Val Thr Lys Cys Leu Phe Leu Gly
130 135 140 att att tcc att cca cct ttt gcc aac tac ctg gtc ttc ttg cta atg 482 Ile Ile Ser Ile Pro Pro Phe Ala Asn Tyr Leu Val Phe Leu Leu Met
145 150 155 tac ctg ttt ccc agg eaa cta ctg atc agg cat ttc tgg acc cca aaa 530 Tyr Leu Phe Pro Arg Gln Leu Leu Ile Arg His Phe Trp Thr Pro Lys
160 165 170 caa caa act gat ttc tta gat atc tat cat gct ttc cgg aag cag tcc 578 Gln Gln Thr Asp Phe Leu Asp Ile Tyr His Ala Phe Arg Lys Gln Ser 175 180 185 190 cac cca gaa att att agt tat tta gaa aag gtc atc cct ctc att tct 626 His Pro Glu Ile Ile Ser Tyr Leu Glu Lys Val Ile Pro Leu Ile Ser
195 200 205 gat gca gga ctc cgg tgg cgt ctg aca gat ctg tgc acc aag ata cag 674 Asp Ala Gly Leu Arg Trp Arg Leu Thr Asp Leu Cys Thr Lys Ile Gln
210 215 220 cgt ggt acc cac cca gca ata cat gat atc ttg gct ctg aga gag tgt 722 Arg Gly Thr His Pro Ala Ile His Asp Ile Leu Ala Leu Arg Glu Cys
225 230 235 ttc tct aac cat cct ctg ggc atg aac caa ctc cag gct ttg cac gtg 770 Phe Ser Asn His Pro Leu Gly Met Asn Gln Leu Gln Ala Leu His Val
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致病的现象如肿瘤发生是由于基因突变使基因表达的方式发生了变化 而导致的。
有报道说肿瘤的发生是由于各种各样的遗传变化，如：染色体杂合性 缺失、癌基因的激活以及抑癌基因的失活等等而导致的(Bishop，J.M.，Cell， 64，235-248(1991)；和Hunter，T.，Cell，64，249-270(1991))。而且，还有报 道说，有10％-30％的人类癌症是由于原癌基因的扩增使癌基因激活而引 起的。
因此，原癌基因的激活在许多肿瘤的病因学中是起主要作用的，所以 存在鉴定原癌基因的需要。
本发明人曾报道过子宫颈癌1(HCCR-1)的原癌基因在癌细胞内的 特异地过表达(韩国专利公开号No.2001-39566)。为了揭示肿瘤发生过 程中的机理，本发明的发明者努力去建立一种癌细胞系和一种利用 HCCR-1原癌基因使其发生癌症的转基因哺乳动物。
发明概述
依上所述，本发明的一个目的是提供了一种含有诱导的HCCR-1原癌 基因的哺乳动物细胞。
本发明的另外一个目的是提供了一种带有HCCR-1原癌基因的哺乳动 物胚胎和一种衍生于此哺乳动物胚胎的转基因哺乳动物。
本发明的另外一个目的是提供一个利用HCCR-1原癌基因来诊断乳腺 癌、肾脏癌、卵巢癌和胃癌的试剂盒。
按照本发明的一个方面，提供了一种被一种表达载体转化的哺乳动物 细胞，所述的表达载体包含带有SEQ ID NO：1核苷酸序列的人的HCCR-1 原癌基因。
附图说明
本发明的上述目的和特点在结合附图的下述优选实施方案中将会得到 清楚的体现。
图1A和图1B分别是单层培养的HCCR-1M细胞和亲代野生型 NIH/3T3细胞的相差特征；
图2是HCCR-1M的单层培养细胞的苏木精-伊红染色结果；
图3是HCCR-1M细胞的透射电子显微镜图片；
图4是同种异体移植HCCR-1M细胞的裸鼠照片，其显示出明显的节 状瘤；
图5是取自同种异体移植HCCR-1M细胞的裸鼠的明显节状瘤的苏木 精-伊红染色结果；
图6是取自同种异体移植HCCR-1M细胞的裸鼠的明显节状瘤的透射 电子显微镜图片；
图7A至7D是免疫组织化学法的分析结果，其分别显示了在取自接 种HCCR-1M细胞的裸鼠的明显节状瘤中的网硬蛋白纤维、角蛋白、上 皮膜抗原和波形蛋白的表达；
图8是单层培养细胞的HCCR-1MN的相差特征；
图9是HCCR-1M细胞和HCCR-1MN细胞中HCCR-1原癌基因表达 的蛋白质印迹分析结果；
图10A和图10B是HCCR-1H的单层培养细胞和亲代野生型293细胞 各自的相差特征；
图11是取自同种异体移植HCCR-1H细胞的裸鼠的明显节状瘤的苏 木精-伊红染色结果；
图12A至12C是免疫组织化学法的分析结果，其分别显示来在取自 接种HCCR-1H细胞的裸鼠的明显节状瘤中的细胞角蛋白8、细胞角蛋白 19和波形蛋白的表达结果；
图13是HCCR-1H细胞中HCCR-1原癌基因表达的RNA印迹分析结 果；
图14是一张图，其显示了在阳性对照293细胞、阴性对照细胞、亲 代野生型NIH/3T3细胞、转染了pcDNA3载体的比较NIH/3T3细胞、和 HCCR-1M细胞中的端粒末端转移酶活性；
图16A至16C分别是HCCR-1M细胞中egr-1基因，c-fos基因和甘油 醛-2-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因表达的RNA印迹分析结果；
图17A是HCCR-1H细胞中p53肿瘤抑制基因表达的蛋白质印迹分 析结果；图17B是β-肌动蛋白的蛋白质印迹分析结果；
图18所示为HCCR-1H细胞中p53肿瘤抑制基因表达的免疫沉淀分 析结果；
图19A、19C、19E、19G和19I分别是HCCR-1H细胞中MDM2，Bax， p21WAF1，p16INK4A和p14ARF基因表达的蛋白质印迹分析结果；图19B、 19D、19F、19H和19J是β-肌动蛋白的蛋白质印迹分析结果；
图20A是蛋白质印迹分析结果，其显示了沉淀中的GST蛋白，所属 沉淀是通过免疫沉淀CHO细胞中的FLAG蛋白来制备的，所述的CHO 细胞被表达FLAG和HCCR-1的融合蛋白的载体、以及表达GST和D52 的融合蛋白的载体所共沉淀；图20B是利用免疫沉淀GST蛋白制备的沉 淀中的PLAG蛋白；
图21是含有HCCR-1原癌基因的核苷酸构建体的示意图；
图22是衍生于具有诱导的HCCR-1原癌基因的胚胎的转基因患癌小 鼠；
图23是一张从携带诱导的HCCR-1原癌基因的胚胎中衍生的转基因 患癌小鼠的乳房肿瘤照片；
图24是从携带诱导的HCCR-1原癌基因的胚胎中衍生的转基因患癌 小鼠的乳房肿瘤的苏木精-伊红染色结果；
图25是从携带诱导的HCCR-1原癌基因的胚胎中衍生的转基因患癌 小鼠的乳房肿瘤的透射电子显微镜图片；
图26A是乳房、肾脏、卵巢和胃的肿瘤组织中HCCR-1原癌基因表 达的RNA印迹分析结果；图26B是使用β-肌动蛋白探针杂交的相同印 迹。
图27是人的乳房、肾脏、卵巢和胃的肿瘤组织中HCCR-1原癌基因 表达的蛋白质印迹分析结果；
图28是显示HCCR-1原癌基因在人染色体上位置的荧光原位杂交分 析结果；
发明详述
被用于本发明的哺乳动物细胞和转基因哺乳动物制备的SEQ ID NO： 1人原癌基因(以下称为“HCCR-1”原癌基因)，位于第12条染色体的 长臂上(12q)，其具有一个可读框，该可读框编码具有SEQ ID NO：2的 氨基酸序列、分子量为大约50kDa的蛋白。
考虑密码子的兼并性以及在HCCR-1原癌基因将要被表达的具体动 物中的优选密码子，可以例如在没有不利地改变所表达蛋白的氨基酸序 列的编码区中，或者在没有不利地影响HCCR-1原癌基因表达的非编码 区中，得到SEQ ID NO：1核苷酸序列的许多改变和变型。因此，本发明 的范围还包括具有与HCCR-1原癌基因及其片段基本上一致的碱基序列 的多聚核苷酸序列。这里使用的“基本上一致的多聚核苷酸序列”指的 是一个具有与HCCR-1原癌基因80％或更多，优选90％或更多，最优选 95％或更多同源性的多聚核苷酸序列。
HCCR-1原癌基因可以从人的肿瘤组织中获得或者采用常规的DNA 合成的方法获得。另外，如此制备的HCCR-1原癌基因可以插入到常规 载体中以获得表达载体。
接下来，表达载体可以转移到一个合适的哺乳动物细胞中以获得由 此表达载体转染的哺乳动物细胞。举例来说，NIH/3T3细胞(ATCC CRL 1658)，一种分化的小鼠成纤维细胞系，和293细胞(ATCC CRL 1573)， 一个人的胚胎肾脏细胞系，被分别转染包含HCCR-1原癌基因的表达载 体pcDNA3/HCCR-1以获得转染HCCR-1原癌基因的NIH/3T3细胞和293 细胞并被分别命名为HCCR-1M细胞和HCCR-1H细胞，根据布达佩斯条 约中有关专利程序中菌种保藏的规定，这两种细胞于2000年12月26日 被保藏在韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(地址：#52，Oun-dong， Yusong-ku，Taejon 305-333，韩国)，序列号分别为KCTC 0923BP和KCTC 0922BP。
如此获得的本发明哺乳动物细胞过表达HCCR-1原癌基因并显示出 肿瘤膨大细胞的形态特征。具体地说，小鼠HCCR-1M细胞具有多面体 形状，带有显著的核仁的细胞核，发育良好的粗糙内质网(rER)和高尔 基复合体，细胞表面带有细绒毛，并且呈现畸形的有丝分裂象。与野生 型细胞相比，人的HCCR-1H细胞具有增大的细胞直径和细胞体积。
本发明的哺乳动物细胞具有致瘤力，因此，移植此哺乳动物细胞的 哺乳动物可以产生肿瘤如可触瘤。而且，从肿瘤中分离的哺乳动物细胞 亦具有致瘤力。例如，一种被命名为HCCR-1MN，从移植HCCR-1M细 胞的裸鼠的可触瘤中分离到的小鼠细胞，具有与那些HCCR-1M细胞相 似的形态特征。
本发明的哺乳动物细胞产生大量与D52蛋白(基因库序列号 NM003288)相互作用的HCCR-1蛋白，据报道D52蛋白与乳腺癌有关 (Byrne，J.A.et al.，Cancer Res.，55，2896-2903(1995)；和Byrne，J.A.et al.， Oncogene，16，873-881(1998))。它同时增强细胞内的蛋白激酶C和端粒 末端转移酶的活性，引起特殊细胞周期关卡控制的丢失，和抑制egr-1的 表达，从而诱使细胞发生恶性转化。在此过程中，与细胞周期调控有关 的p53肿瘤抑制基因表达量增加，而绝大多数的p53蛋白是无活性的， 从而导致细胞恶性转化。HCCR-1原癌基因引起p53肿瘤抑制基因在上 游水平发生功能丧失。因此，如果能鉴定出控制p53基因的HCCR-1原 癌基因部分，那么通过改变相应的核苷酸序列就可能使p53基因恢复活 性。
此外，可以将包含HCCR-1原癌基因的核苷酸构建体导入合适的哺 乳动物如小鼠的胚胎，可以将如此得到的哺乳动物胚胎植入一个合适受 体的子宫中并使其发育形成转基因哺乳动物。这种建立转基因哺乳动物 的方法在本领域为人所熟知，优选在胚胎的8细胞期或更早时期导入此 核苷酸构建体。
以此法建立的转基因哺乳动物过表达HCCR-1原癌基因，并在乳房 内发展成为乳腺管乳突状腺癌(ductal papillary adenocarcinoma of breast)， 其表现出如下特征：有明显边界的无包膜的节状瘤；乳突状结构和腺或 鸭样结构；中心部分发生大面积的坏死；具有不明显界限的立方形或卵 圆形细胞；正常的乳房组织邻接在那里；和大量颗粒状嗜酸性胞质。
转基因胚胎也可以通过雌雄转基因哺乳动物交配而获得。典型转基 因胚胎是小鼠FVB/N胚胎(被命名为小鼠胚胎HCCR-1)，其携带图21 结构的核酸构建体。根据布达佩斯条约中有关专利程序中菌种保藏的规 定，这两种细胞于2000年12月26日被保藏在韩国典型培养物保藏中心 (KCTC)(地址：#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon 305-333，韩国)，序列 号为KCTC 0924BP。
由于本发明的哺乳动物细胞和转基因哺乳动物能够过表达HCCR-1 原癌基因以引发癌症，因此它们在筛选致癌物或抗癌制剂，如抗氧化剂 的应用上是有利的。
此外，HCCR-1原癌基因在乳房、肾脏、卵巢和胃的肿瘤组织中过 表达，因此其产物可以被有效地用于癌症的诊断。癌症的诊断可以通过 能与HCCR-1原癌基因表达的HCCR-1 mRNA或蛋白特异结合的探针或 抗体与来自受试者的乳房、肾脏、卵巢和胃的组织中的mRNA或蛋白的 相互作用来实现；可以利用许多本领域已知的实验技术来检测HCCR-1 mRNA或蛋白，从而确定受试者是否过表达HCCR-1原癌基因产物。利 用放射性同位素或酶标记的探针或抗体可以很容易的检测出原癌基因产 物的存在。所以，本发明还提供了一个诊断乳腺癌、肾脏癌、卵巢癌和 胃癌的试剂盒，此试剂盒含有一个可以与HCCR-1原癌基因表达的mRNA 或蛋白特异结合的探针或抗体。典型的探针包括一段可以与HCCR-1原 癌基因转录的mRNA或此mRNA的一部分互补的多核苷酸或者寡核苷 酸，这样使其可以与HCCR-1 mRNA特异结合，优选的情况是其具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列。所述的探针可以从人组织中获得或利用常规的 DNA合成方法合成。此外，抗体可以利用本领域熟知的常规方法制备。
以下实施例的目的是为了进一步对本发明进行描述，而不是为了限 制本发明。
参考实施例1：透射电子显微镜(TEM)
细胞或组织用2.5％的戊二醛磷酸缓冲液(pH7.4)固定，用2％的 四氧化锇进行后固定。样品用浓度梯度乙醇进行脱水处理，并包埋在Epon 812中。用乙酸双氧铀和柠檬酸铅将超薄切片染色，并用透射电子显微 镜(JEOL 1,200 EX，Tokyo，Japan)拍照。
参考实施例2：蛋白质印迹分析
参照Laemmli所述的方法(Nature，227，680-685(1970))将细胞收集 并在Laemmli样品缓冲液中裂解。细胞质蛋白用10％的SDS-PAGE分离 并电印迹到硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜与抗体一起温浴。冲洗后， 将膜在封阻液中温浴，此封闭液含有1∶1,000稀释的、作为二抗的过氧 化物酶偶联的羊抗鼠免疫球蛋白(Jackson免疫学研究)。蛋白用ECL蛋 白质印迹分析试剂盒(Amersham)显示。
参考实施例3：免疫组织化学分析
组织首先与一抗温浴，而后切成5μm的厚度。结合的一抗用生物 素酰化二抗，抗生物素蛋白，生物素酰化辣根过氧化物酶和氨乙基咔唑 (AEC)等色素原显色(HISTOSTAIN-BULKKITS，Zymed)。
参考实施例4：总RNA的提取
总RNA利用一个商品化的系统(RNeasy total RNA kit，Qiagen Inc.， Germany)从样品组织或细胞中抽提，并利用Message clean试剂盒 (GenHunter Corp.，USA)来去除污染的DNA。
参考实施例5：RNA印迹分析
20μg的总RNA用1％的甲醛琼脂糖凝胶电泳后转移到尼龙膜上 (Boehringer-Mannheim，Germany)。将印迹与由rediprime II随机引物标 记系统(Amersham，UK)制备的32P随机引物探针在42℃条件下杂交过夜。 连续重复两次RNA印迹分析，用光密度测定法进行定量，并用β-肌动 蛋白探针对同样的印迹进行杂交以确定mRNA的完整性。
制备实施例1：包含HCCR-1原癌基因的表达载体的构建
大肠杆菌JM-109/HCCR1(KCTC 0667BP)带有表达载体p CEV- LAC/HCCR-1，其包含由SEQ ID NO：1核苷酸序列代表的全长HCCR-1 cDNA。从大肠杆菌JM-109/HCCR1细胞培养物中分离表达载体pCEV- LAC/HCCR-1。然后用SalI酶切如此获得的表达载体pCEV-LAC/HCCR- 1以获得包含HCCR-1全长cDNA的2.1kb的DNA片段。
用XhoI酶切哺乳动物表达载体pcDNA3(Invitrogene)以得到与SalI 相配的末端。将2.1kb的SalI片段与XhoI消化的pcDNA3连接以获得包 含全长HCCR-1 cDNA的表达载体pcDNA3/HCCR-1。
制备实施例2：抗HCCR-1抗体产物
为了获得制备抗HCCR-1抗体时有用的HCCR-1蛋白，从大肠杆菌 JM-109/HCCR1(KCTC 0667BP)细胞培养物中分离表达载体pCEV- LAC/HCCR-1。以表达载体pCEV-LAC/HCCR-1为模板，以SEQ ID Nos：4 和5为引物进行聚和酶链式反应(PCR)以获得SEQ ID NO：1的123到 473的核苷酸序列(SEQ ID NO：2的39-155氨基酸残基)。将PCR产物 插入到载体pMAL-p2(New England Biolab，USA)的BamHI/SalI酶切位点 以获得重组载体(命名为pMAL-p2/HCR-1-c-末端)，随后，将pMAL- p2/HCCR-1-c-末端转化到大肠杆菌BL21中(ATCC CRL 47092)。将转化 体在LB培养基中培养，所得到的培养物用100倍体积的LB培养基稀释。 稀释培养物温浴3小时后加入1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 以诱导HCCR-1原癌基因的表达。衍生于载体pMAL-p2、与麦芽糖结合 蛋白(MBP，42kDa)融合的HCCR-1蛋白的C-末端得到表达，其分子量 为大约64kDa。利用pMAL蛋白融合和纯化系统(New England Biolab， USA)纯化了此64kDa的融合蛋白。
给10只3个月大的，各重约2.5kg的新西兰白兔进行腹部用药，每 周1mg的融合蛋白给予三次。把免疫兔子的血样进行离心以获得包含多 克隆抗体的血清。
实施例1：转染HCCR-1原癌基因的小鼠细胞的制备
利用从制备实施例1中得到的表达载体pcDNA3/HCCR-1用脂转胺 (lipofectamine)转染NIH/3T3细胞(ATCC CRL 1658)——分化的小鼠 成纤维细胞系，将得到的NIH/3T3细胞在补充有G418(Gibco)的Waymouth MB 752/1培养基中培养以获得转染HCCR-1原癌基因的NIH/3T3细胞， 其被命名为HCCR-1M，于2000年12月26日保藏在韩国典型培养物保 藏中心，保藏号为KCTC 0923BP。
实施例2：转染HCCR-1原癌基因的人源细胞的制备
除了以293细胞(ATCC CRL-1573)代替NIH/3T3细胞之外，重复 实施例1的操作程序，以获得转染HCCR-1原癌基因的293细胞细胞， 其被命名为HCCR-1H，于2000年12月26日保藏在韩国典型培养物保 藏中心，保藏号为KCTC 0922BP。
对照实施例：用载体pcDNA3转染的对照细胞的制备
除了以载体pcDNA3(Invitrogen)代替载体pcDNA3/HCCR-1之外， 重复实施例1的操作程序，以获得转染载体pcDNA3的对照细胞。
实施例3：HCCR-1M细胞的形态特征
(步骤1)HCCR-1M细胞的相差特征
由实施例1获得的HCCR-1M细胞在Waymouth MB 752/1培养基中 进行单层培养后在相差显微镜下观察。NIH/3T3的亲代野生型细胞为对 照。
图1A和图1B是HCCR-1M的单层培养细胞和NIH/3T3的亲代野生 型细胞各自的相差特征。从图1A和图1B中可以看出，NIH/3T3的亲代 野生型细胞呈纺锤体状，具有细长的细胞核和稀少的细胞质，而HCCR- 1M细胞呈多面体状，卵圆形的细胞核和饱满的细胞质。
(步骤2)苏木精-伊红染色
由实施例1获得的HCCR-1M细胞在Waymouth MB 752/1培养基中 进行单层培养后用苏木精-伊红染色。
图2是HCCR-1M单层培养细胞的苏木精-伊红染色结果。从图2中 可以看出，HCCR-1M细胞呈现细胞核多态性、清晰的核仁、颗粒状染色 质模式、瘤巨细胞和不典型的有丝分裂特征。
(步骤3)TEM
由实施例1获得的HCCR-1M细胞按照参考实施例1的程序进行处 理。
图3是HCCR-1M细胞的TEM照片，单位刻度代表3μm，插页是圆 圈所示部位的高度放大图(单位刻度，1μm)。从图3中可以看出，HCCR-1M 细胞表面带有细绒毛，带有显著的核仁的分叶细胞核，发育良好的粗糙 内质网(rER)和高尔基复合体(圆圈)。
上述结果显示HCCR-1M细胞具有肿瘤细胞的形态特征。
实施例4：HCCR-1M细胞的肿瘤发生能力
将由实施例1获得的5×106的HCCR-1M细胞以皮下组织注射的方 式被注射到9只裸鼠(背景为：5周龄的无胸腺nu/nu BALB/c)躯干后 侧面。
所有注射HCCR-1M细胞的9只裸鼠在21天后均发现可触的肿瘤。 图4是同种异体移植HCCR-1M细胞的裸鼠的照片。这说明HCCR-1M 细胞具有肿瘤发生能力。
当皮下组织中的肿瘤直径达到1.5-2.5cm时，裸鼠死亡，肿瘤被取出 并用于下面的肿瘤分析和细胞系的建立。
实施例5：移植HCCR-1M细胞的裸鼠的肿瘤结特征
同种异体移植HCCR-1M细胞的裸鼠的肿瘤结特征的检测如下。
(步骤1)苏木精-伊红染色
用苏木精-伊红染色由实施例4获得的肿瘤结。
图5是肿瘤结的苏木精-伊红染色结果(×250)。从图5中可以看出， 肿瘤结具有典型的由纤维基质分开的上皮细胞巢。
(步骤2)TEM
由实施例4获得的肿瘤结按照参考实施例2的程序进行处理。
图6是肿瘤结的TEM照片，单位刻度代表3μm，插页是圆圈所示部 位的高度放大图(单位刻度，0.5μm)。从图6中可以看出，肿瘤结细胞 具有发育良好的细胞器和紧密连接的桥粒。这说明HCCR-1M细胞已变 为表皮细胞。
(步骤3)免疫组织化学分析
将由实施例4获得的肿瘤结按照参考实施例3的程序进行免疫组织 化学分析，分别利用抗-网硬蛋白纤维、抗-角蛋白、抗-上皮膜抗原(EMA) 和作为一抗的抗-波形蛋白抗体(DAKO)。
图7A至7D分别是肿瘤结中网硬蛋白纤维、角蛋白、上皮膜抗原和 波形蛋白表达产物的免疫组织化学分析结果(×250)。从图7A至7D中 可以看出，细胞巢被网硬蛋白纤维包围(图7A)，细胞显示出上皮标记 如角蛋白(图7B)和EMA(图7C)，以及间充质标记如波形蛋白(图7D) 的共表达。这些结果说明HCCR-1原癌基因导致间充质NIH/3T3细胞向 上皮细胞转换。
特别是，导入原癌基因的间充质NIH/3T3细胞转化为肉瘤，而裸鼠 异体移植HCCR-1M细胞后形成可触瘤。
实施例6：从异体移植HCCR-1M细胞的裸鼠中制备癌细胞系
从由实施例4获得的肿瘤结中分离细胞并在添加20％的胎牛血清的 Waymouth MB 752/1培养基中进行培养，将其命名为HCCR-1MN细胞。
实施例7：HCCR-1MN细胞的特征
由实施例6获得的HCCR-1MN细胞按照实施例3的步骤1程序在相 差显微镜下观察。
图8是HCCR-1MN单层培养细胞的相差特征(×300)。从图8中可 以看出，HCCR-1MN细胞所具有的形态特征与实施例3的步骤1中 HCCR-1M细胞所具有的形态特征相似。
实施例8：HCCR-1M细胞与HCCR-1MN细胞的蛋白质印迹分析
为了检测HCCR-1M细胞与HCCR-1MN细胞中HCCR-1原癌基因的 表达情况，分别将由实施例1和实施例6获得的HCCR-1M细胞与 HCCR-1MN细胞，利用由制备实施例2获得的抗-HCCR-1血清，按照参 考实施例2程序进行蛋白质印迹分析。为了比较，亲代野生型NIH/3T3 细胞和从比较实施例中获得的NIH/3T3细胞也进行了蛋白质印迹分析。
图9是HCCR-1M细胞与HCCR-1MN细胞中HCCR-1原癌基因的表 达的蛋白质印迹分析结果。从图9中可以看出，HCCR-1M细胞与 HCCR-1MN细胞中HCCR-1蛋白过表达，但如图中弱带所示，亲代野生 型NIH/3T3细胞和转染载体pcDNA3的NIH/3T3细胞中却无过表达。
实施例9：HCCR-1H细胞的特征
为了检测HCCR-1H细胞的形态特征，将HCCR-1H细胞按照实施例 3的步骤1程序在相差显微镜下观察。以亲代野生型293细胞为对照。
图10A和10B分别是HCCR-1H单层培养细胞和亲代野生型293细 胞的相差特征(×300)。从图10A和10B中可以看出，HCCR-1H细胞 与亲代野生型293细胞相比具有增大的细胞直径和细胞结构。
实施例10：HCCR-1H细胞的致瘤力
为检测HCCR-1H细胞的致瘤力，将由实施例2得到的HCCR-1H细 胞按照实施例4的程序进行重复操作。
异种移植HCCR-1H细胞的裸鼠在21天后均发现可触的肿瘤。这说 明HCCR-1H细胞具有致瘤力。
当皮下组织中的肿瘤直径达到1-1.5cm时，裸鼠死亡，肿瘤被取出 并用于随后的肿瘤分析。
实施例11：移植HCCR-1H细胞的裸鼠的肿瘤结特征
同种异体移植HCCR-1H细胞的裸鼠的肿瘤结特征的检测如下。
(步骤1)苏木精-伊红染色
用苏木精-伊红染色由实施例10获得的肿瘤结。
图11是可触肿瘤结的苏木精-伊红染色结果(×250)。从图11中可 以看出，肿瘤结具有典型的上皮细胞癌的特征，如非典型细胞形状，多 型性，核仁增大，增加的细胞核与细胞质的比率。
(步骤2)免疫组织化学分析
由实施例10获得的肿瘤结按照参考实施例3的程序进行免疫组织化 学分析，分别利用抗-细胞角蛋白8、抗-细胞角蛋白19和作为一抗的抗- 波形蛋白的抗体(DAKO)。
图12A至12C分别是可触肿瘤结中细胞角蛋白8、细胞角蛋白19和 波形蛋白表达产物的免疫组织化学分析结果(×250)。从图12A至12C 中可以看出，肿瘤细胞显示出上皮标记如细胞角蛋白8、细胞角蛋白19 (图12A和图12B)，以及间充质标记，波形蛋白(图12C)的共表达。 这些结果说明HCCR-1原癌基因导致间充质293细胞向上皮细胞转换。
实施例12：HCCR-1H细胞的RNA印迹分析
为了检测HCCR-1H细胞中HCCR-1原癌基因的表达水平，按照参 考实施例4的程序，总RNA从由实施例2中获得的HCCR-1H细胞中分 离，利用32P标记的随机HCCR-1 cDNA作探针，按照参考实施例5程序 进行RNA印迹分析。
图13是HCCR-1H细胞与亲代野生型293细胞中HCCR-1原癌基因 的表达的RNA印迹分析结果。从图13中可以看出，在HCCR-1H细胞 中过表达约2.1kb的mRNA单转录体，而亲代野生型293细胞中却没有。
实施例13：小鼠细胞中由HCCR-1原癌基因诱导的肿瘤发生机理
为了检测小鼠细胞中由HCCR-1原癌基因诱导的肿瘤发生机理，以 下对据报道与肿瘤发生过程有关的蛋白酶C(PKC)和端粒末端转移酶活性 异常，细胞周期关卡控制的消失，egr-1、c-fos和GAPDH表达的变化等 进行评价。
(步骤1)PKC活性分析
通常，肿瘤发展的第二步是使PKC介导的信号传导途径发生异常。 为确保HCCR-1控制蛋白激酶C(PKC)的活性，利用亲代野生型NIH/3T3 细胞和从比较实施例中获得的被载体pcDNA3转染的比较NIH/3T3细胞 以及由实施例1获得的HCCR-1M细胞进行PKC分析。
PKC活性是按照开发商的介绍，利用Sigma TECTTM蛋白激酶C分 析系统(Promega)来检测的。PKC活性的定义是：在存在和不存在磷 脂的情况下，每分钟结合到底物中的PKC量的差。每个数值是三个独立 实验的平均值±s.d.。
图14是亲代野生型MH/3T3细胞，被载体pcDNA3转染的比较 NIH/3T3细胞和HCCR-1M细胞中PKC活性的图表。从图14中可以看出， HCCR-1M细胞中PKC的活性比野生型高出约10倍。这说明，HCCR-1 原癌基因提高了细胞的PKC活性。
(步骤2)端粒末端转移酶活性分析
基于PKC显著提高端粒末端转移酶活性的报道，利用亲代野生型 NIH/3T3细胞和从比较实施例中获得的被载体pcDNA3转染的比较 NIH/3T3细胞以及由实施例1获得的HCCR-1M细胞进行端粒末端转移 酶活性分析。
端粒末端转移酶活性是按照开发商的介绍，利用端粒末端转移酶 PCR-酶联免疫吸附测定试剂盒(Boehringer Mannheim，USA)来检测的。 试剂盒提供人端粒末端转移酶阳性永生肾细胞作为阳性对照。以经RNase 预处理的293细胞为阴性对照。对1×103的细胞提取数量进行分析。结 果显示了四次独立实验的平均光密度(OD)值的均值(平均值±s.d.)。
图15是阳性对照细胞、阴性对照细胞、亲代野生型NIH/3T3细胞、 被载体pcDNA3转染的比较NIH/3T3细胞和HCCR-1M细胞中端粒末端 转移酶活性示意图。从图15中可以看出，野生型NIH/3T3细胞显示可检 测到的端粒末端转移酶活性，而HCCR-1M细胞与野生型细胞相比具有 升高约7倍的端粒末端转移酶活性。阳性对照细胞中端粒末端转移酶活 性很高而阴性对照细胞中的端粒末端转移酶活性却检测不到。这些结果 与以往的研究是一致的(Holt，s.e.，Wright，W.E.和Shay J.W.Mol.Cell Biol. 16，2931-2939(1996))，这说明HCCR-1M细胞具有由活化PKC诱发的高 端粒末端转移酶活性。
(步骤3)细胞周期实验
肿瘤细胞特别对直接调控它们细胞周期的基因有必然的伤害。为了 检测HCCR-1M细胞中是否具有交替的生长机会，细胞周期概况的确定 如下所述。
HCCR-1M细胞和亲代野生型NIH/3T3细胞培养到中对数生长期后 在含有0.5％的胎牛血清的DMEM培养基中温浴36小时，使其生长停滞。 细胞用胰蛋白酶处理后收集并用70％乙醇固定。向2×106的细胞中添加 50ug/ml碘化丙锭染色液和100单位/ml的RNase A(Boerhinger Mannheim)。温浴30分钟后，用FACS Caliber(Becton Dickinson)在488nm 下进行荧光分析以确定细胞中DNA的含量。用Modfit 5.2软件对至少1 ×104的细胞/样品进行分析。
确定了亲代野生型NIH/3T3细胞和HCCR-1M细胞中G0/G1期、S期、 G2/M期所占的百分率，结果如表I所示。
表I 野生型NIH/3T3 HCCR-1M G0/G1 S G2/M G0/G1 S G2/M 细胞百分比 55.7 20.6 24 46.6 31.5 22.4
从表I中可以看出，亲代野生型NIH/3T3细胞和HCCR-1M细胞中S 期细胞的比率分别为20.6％和31.5％。这些结果说明，HCCR-1M细胞中 很大的群体明显的发生了从G0/G1期到S期的转变。
为了评价血清依赖的细胞周期进程，HCCR-1M细胞和亲代野生型 NIH/3T3细胞在含有0.5％的胎牛血清的DMEM培养基中温浴36小时使 其生长停滞。将细胞转移到含有20％的胎牛血清的DMEM培养基中，在 指定的时间内收集以确证G0/G1期、S期、G2/M期细胞所占的百分率， 结果如表II所示。
表II 时间 细胞百分比 野生型NIH/3T3 HCCR-1M G0/G1 S G2/M G0/G1 S G2/M 0 77 8.0 14.9 70 21.8 8.7 12 72.2 14.0 14.2 66.9 24.0 9.6 24 49.6 13.4 37.2 56.7 24.7 19.2 48 58.3 18.3 23.7 52.7 30.4 17.5
从表II中可以看出，在0小时时，亲代野生型NIH/3T3细胞中S期细 胞的比率为8％，而HCCR-1M细胞中S期细胞的比率为21.8％。这些结 果说明，持续过表达HCCR-1原癌基因可以产生相对量的、对血清剥夺 性诱导的G0/G1期生长停滞具有抵抗力的细胞。在转移到含有20％的胎 牛血清的DMEM培养基中使细胞从生长停滞状态解脱以后，HCCR-1M 细胞比野生型NIH/3T3细胞仍然多出超过10％的S期细胞。因此，过表 达HCCR-1原癌基因可以对细胞产生缩短G0/G1期，增加S期的细胞数 量等反调节。
(步骤4)egr-1、c-fos和GAPDH的表达模式
基于egr-1、c-fos和GAPDH的表达模式参与了肿瘤形成的事实，如 下检测了由实施例1获得的HCCR-1M细胞中egr-1、c-fos和GAPDH的 表达模式。
在含有0.5％的胎牛血清的DMEM培养基中温浴36小时后，处于中 对数生长期的HCCR-1M细胞和亲代野生型NIH/3T3细胞的生长停滞(休 眠期)。将细胞转移到新鲜的含有20％的胎牛血清的DMEM培养基中培 养0，15，30，60和120分钟以刺激生长(有丝分裂期)。按照参考实施 例4的程序从休眠期和有丝分裂期的细胞中抽提总RNA，并利用32P随 机引物标记的egr-1、c-fos和GAPDH的cDNA为探针，依据参考实施例 5的程序实施RNA印迹杂交。
图16A、16B和16C分别是HCCR-1M细胞和亲代野生型NIH/3T3 细胞中egr-1、c-fos和GAPDH表达产物的RNA印迹杂交结果。从图16A 至16C中可以看出，与野生型NIH/3T3细胞相比较，有丝分裂期的 HCCR-1M细胞对egr-1的表达显示出明显的负调节，对GAPDH显示出 正调节而对c-fos的表达无显著影响。
这些结果说明，小鼠NIH/3T3细胞中对HCCR-1基因的反调节引起 PKC和端粒末端转移酶活性的增高，细胞周期尤其是关卡控制的消失， egr-1表达的负调节等结果，从而诱使细胞发生恶性转化。
实施例14：人细胞中HCCR-1原癌基因诱发的肿瘤发生机理
为了确证人细胞中HCCR-1原癌基因诱发的肿瘤发生机理，下面检 测了p53肿瘤抑制子、MDM2、Bax、p21WAF1、p16INK4A、和p14ARF 等已报道的与肿瘤有关的基因的表达模式。
(步骤1)p53肿瘤抑制子的表达模式
为了确证HCCR-1H细胞中p53的表达模式，如下进行蛋白质印迹 分析与RNA印迹分析：
溶解由实施例2获得的HCCR-1H细胞和亲代野生型293细胞，依 据参考实施例2的程序，利用只与野生型p53作用的单克隆抗p53抗体 DO-7(氨基酸37至45；Novocastra Laboratories，Ltd.，UK)或者与野生 型与突变型p53均起作用的Ab-5(DO-7克隆)(氨基酸37至45； NEOMARKERS，INC.，CA)对胞溶产物进行蛋白质印迹分析。用鼠抗人 β-肌动蛋白抗体(Sigma)进行了同样的印迹分析以确定总的蛋白含量。
图17A是HCCR-1H细胞和亲代野生型293细胞中p53肿瘤抑制子 表达产物的蛋白质印迹分析结果；图17B是β-肌动蛋白同样的印迹分析 结果。从图17A可以看出，与亲代野生型293细胞相比，HCCR-1H细胞 中p53蛋白水平有显著提高。
另外，由实施例2获得的HCCR-1H细胞在含有2％的胎牛血清和2 mM的谷氨酰胺但不含甲硫氨酸的RPMI 1640培养基中培养2小时后， 用100μl的L-35S甲硫氨酸(Amersham)进行标记。将这些细胞用1×Hanks 缓冲液(Gibco，USA)冲洗，然后用正常的含L-甲硫氨酸的RPMI 1640 培养基中培养0.5，1，2或4小时。这些细胞在免测沉淀溶液(50mM Tris[pH8.0]，5mM EDTA，150mM NaCl，1％Np-40，1mM苯基甲基磺酰基 氟化物，10mM苯甲脒，1μg胃酶抑素(pepstain)/ml，10mM亚硫酸氢钠) 中溶解，用50μl的A-琼脂糖溶液(Sigma)冲洗后定量。利用抗-p53抗体 对这些细胞的胞溶产物进行免测沉淀(Kessler，S.W.，J.Immunol.，115， 1617-1623(1975))，然后进行SDS-PAGE。使用Hep 3B肝癌细胞重复上 述操作程序，作为缺少p53基因的对照。
图18显示的是HCCR-1H细胞和亲代野生型293细胞中p53肿瘤抑 制子表达的免测沉淀结果。从图18可以看出，与亲代野生型293细胞相 比，HCCR-1H细胞中p53蛋白水平有显著提高。由此，可以认为在由 HCCR-1原癌基因诱发的肿瘤发生机理中，p53蛋白大量表达，但并不能 抑制肿瘤，仍保持非活性状态。
(步骤2)：MDM2、Bax、p21WAF1、p16INK4A、和p14ARF等基因的表 达模式
尽管直接影响肿瘤抑制基因p21WAF1和p16INK4A，但是由于p53 只是调控圈中的一员，而此调控圈还涉及MDM2、Bax和p14ARF，所以 对MDM2、Bax、p21WAF1、p16INK4A、和p14ARF等基因的表达模式进 行分析。
利用由实施例2获得的HCCR-1H细胞；和抗-MDM2、抗-Bax、抗- p21WAF1、抗-p16INK4A抗体(Oncogene ResearchProducts，USA)和p14ARF (Lab Vision，USA)，依据参考实施例2程序进行蛋白质印迹分析。用抗- β-肌动蛋白抗体(Sigma)进行了同样的印迹分析以确定总的蛋白含量。
图19A、19C、19E、19G和19I是HCCR-1H细胞中MDM2，Bax， p21WAF1，p16INK4A和p14ARF等基因表达的蛋白质印迹分析结果；图 19B、19D、19F、19H和19J是β-肌动蛋白的蛋白质印迹分析结果。从 图19A、19C、19E、19G和19I可以看出，与亲代野生型293细胞相比， MDM2，Bax，p21WAF1，p16INK4A和p14ARF等蛋白水平下降。这些结果 说明，HCCR-1的过表达可以确定的抑制MDM2，Bax，p21WAF1， p16INK4A和p14ARF等的转录，从而降低它们的蛋白水平。
总结这些结果以及步骤1中的结果，可以相信HCCR-1的过表达可 以增加p53的稳定性，但p53蛋白却不能形成正向调控MDM2，Bax和 p21WAF1表达的自动调控圈。特别地，从图19E、和19G可以看出， HCCR-1H细胞中的激酶抑制家族基因p21WAF1和p16INK4A处于p53 非依赖性的机制的负调控。从图19I可以看出，p14ARF无论在亲代野生型 293细胞中，还是在HCCR-1H细胞中均无异常表达。这些结果说明， MDM2-p14ARF调控圈的改变不是p53失活的可能机理。
上述结果和实施例13的步骤3的结果表明，小鼠和人细胞中HCCR-1 原癌基因的过表达能够影响对细胞周期的控制，并和p53以及p21细胞 周期调控因子有关联。
(步骤3)：HCCR-1的蛋白质-蛋白质相互作用中的配偶体(partner)
为确证HCCR-1的蛋白质-蛋白质相互作用中的配偶体，下面进行了 酵母双杂交筛选试验。
大肠杆菌JM-109/HCCR1(KCTC 0667BP)培养后从中分离出表达载 体pCEV-LAC/HCCR-1。然后用SalI酶切表达载体pCEV-LAC/HCCR-1 并获得HCCR-1原癌基因，然后插入到包含pLexA DNA结合域的酵母双 杂交载体(Clontech，USA)的BamHI/SalI位点获得载体pLexA-HCCR-1， 并表达pLexADNA结合域与HCCR-1的融合蛋白。将载体pLexA-HCCR-1 与酵母EGY48(Clontech，USA)混合，42℃加热10分钟以转化酵母。 用同样的方法将融合有包含pLexA激活域的pB42AD的人胎脑cDNA文 库(Clontech，USA)转化所得到的酵母。将转化体影印培养到Trp-，Leu-， His-的筛选平板上进行β-半乳糖苷酶过滤提升分析。当转化体含有衍生 于cDNA文库的伴侣基因时，与pLexA激活域融合的伴侣蛋白结合到与 pLexA DNA结合域融合的HCCR-1蛋白上，在含有X-gal的平板培养基 上就形成一个蓝色菌落。为了估计假阳性，进行了酵母交配分析(Guarente， L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，1639-1641(1993))。
从通过上述方法得到的克隆中筛选到了一个编码HCCR-1的蛋白质- 蛋白质相互作用中的配偶体的基因。
将通过上述方法得到的菌落在葡萄糖培养基中培养，并从中利用玻 璃珠抽提到包含配偶体基因的载体。此载体用电穿孔法导入大肠杆菌KC8 (Clontech，USA)中，随后涂布于M9基本培养基上以筛选转化株。用 从转化株中抽提到的质粒DNA转化大肠杆菌DH5α，并在LB培养基中 培养以扩增质粒DNA。从培养物中抽提到的质粒DNA用HindIII酶切以 获得一个包含配偶体基因的1kb片段。配偶体基因的核苷酸序列被证明 与TPD52L2基因(基因库序列号NM003288)相同。TPD52L2基因编 码的D52蛋白最初是由于它在人乳腺癌中增高的表达水平而被发现的， 并在钙介导的信号传导途径和细胞增殖中起作用(Byrne，J.A.，et al.， Cancer Res.，55，2896-2903(1995)；and Byrne，J.A.，et al.，Oncogene，16，873- 881(1998))。
(步骤4)：共转染
为了检测HCCR-1蛋白和D52蛋白之间的相互作用，下面对它们开 展了共转染研究。
大肠杆菌JM-109/HCCR1(KCTC 0667BP)培养后从中分离出表达载 体pCEV-LAC/HCCR-1。然后用SalI酶切表达载体pCEV-LAC/HCCR-1 以获得HCCR-1全长cDNA，然后插入到表达载体N-末端pFALG- CMV(Sigma，USA)的SalI酶切位点以获得表达FLAG和HCCR-1融合蛋 白的表达载体pFLAG-HCCR-1。将由步骤3获得的TPD52L2基因插入到 表达载体pcDNA3(体外遗传，USA)的NotI酶切位点以获得表达GST 和D52融合蛋白的表达载体pGST-TPD52L2。
用表达载体pFLAG-HCCR-1和pGST-TPD52L2共转染CHO细胞， 并在RPMI 1640培养基中培养。48小时后，用胰蛋白酶处理并收集CHO 细胞。将CHO细胞用PBS冲洗并重悬于IP缓冲液(10mM Tris-HCl[pH7.4]， 150mM NaCl，1％Np40，2mM钒酸钠，10mM氟化钠，10mM焦磷酸钠， 5mM EDTA，10μg/ml抑肽酶(aprotinine)，10μg/ml白胃素(leupeptine)， 10μg/ml胃酶抑素(pepstatine)，1mM苯基甲基磺酰基氟化物)。随后 使细胞悬液通过27针仪并将离心所得到的胞溶产物以沉淀未破碎细胞。 上清液通过免疫前IgG和球蛋白A的混合物(Sigma，USA)预清除。利用抗 -FLAG或抗-GST抗体(Sigma，USA)免疫沉淀胞溶产物中的融合蛋白 FLAG-HCCR-1或GST-TPD52L2(Kesler，s.w.，J.Immunol.，115，1617- 1623(1975))。依据参考实施例2的程序利用抗-GST或抗-FLAG抗体对剩 余的蛋白样品进行蛋白质印迹分析。
图20A和20B分别是GST蛋白与FLAG蛋白的蛋白质印迹分析结 果。从图20A和20B中可以看出，在两种沉淀中均检测到融合蛋白。这 些结果表明，D52蛋白与HCCR-1蛋白相互作用。
实施例15：转基因小鼠的制备
为了证实HCCR-1原癌基因在体内诱导肿瘤发生，建立在CMV启 动子控制下表达HCCR-1原癌基因的转基因小鼠。
为了获得用于制备转基因小鼠的HCCR-1的全长cDNA，从大肠杆 菌JM-109/HCCR1(KCTC 0667BP)细胞培养物中分离表达载体pCEV- LAC/HCCR-1。用SalI酶切表达载体pCEV-LAC/HCCR-1，将获得的 HCCR-1全长cDNA插入到表达载体pcDNA3的XhoI酶切位点以获得表 达载体pcDNA3/HCCR-1。用SalI和XmnI酶切表达载体pCEV- LAC/HCCR-1，在0.7％的琼脂糖凝胶中进行电泳并用电洗脱分离。分离 出的DNA片段从10mM Tris-HCl(pH7.4)/0.2mM EDTA溶液中析出并调 至终浓度4ng/ml。如图21所示，所得DNA的结构包括CMV启动子， HCCR-1的cDNA基因和牛生长激素(bGH)polyA序列。
按照前核DNA微注射法(Gordon，J.W.，et al.，Pro.Natl.Acad.Sci.USA， 77，7382-7384(1980))，将DNA微注射到小鼠FVB/N系(Samyuk Corp.， CAMTAKO，Korea)的一个受精卵中：将DNA溶液微注射到1-细胞期的 受精卵前核中，并培养20小时以筛选2-细胞期胚胎。将2-细胞期的胚胎 植入到假孕受体ICR小鼠(Samyuk Corp.，CAMTAKO，Korea)的输卵管 内。从受体小鼠中获得子代小鼠，并将通过对其尾部活检而获得的DNA 样品进行DNA印迹分析。
图22是衍生于由HCCR-1原癌基因诱导的胚胎的转基因小鼠。从图 22中可以看出，大小为1.5cm×1.5cm的肿瘤结位于胸部相邻的右腋部 位。
分离出的肿瘤用裸眼进行了观察。
图23是转基因小鼠的乳房肿瘤图片。从图23中可以看出，转基因 小鼠的肿瘤是单一的，没有包膜却具清晰轮廓的节状瘤。
为了确证肿瘤的形态特征，对其进行了苏木精-伊红染色。图24是 肿瘤的苏木精-伊红染色结果。从图24中可以看出，此肿瘤包括乳突状 结构和腺或鸭样结构。中心部分发生大面积的坏死。正常乳房组织与肿 瘤明显相邻。立方形或卵圆形细胞具有不明显的界限并且具有适量的颗 粒状嗜酸性胞质。肿瘤细胞具有大的、多型的，含染色质多的核，并且 有许多有丝分裂，包括一些非典型形态。注意到一些小但是明显的核仁。 这些结果说明，转基因小鼠的肿瘤呈现乳腺管乳突状腺癌的特征。
图25是肿瘤的透射电子显微镜照片，单位刻度代表2μm。从图25 中可以看出，卵圆形肿瘤细胞具有丰富的胞质细胞器。细胞核具有聚集 的具边缘的染色体和明显的核仁。细胞质中充满了一些线粒体和许多囊 状的囊泡化的rER。一些桥粒是明显的。
所述转基因小鼠的胚胎被命名为HCCR-1，其于2000年12月26日 被保藏于韩国典型培养物保藏中心，序列号为KCTC 0924BP。
实施例16：HCCR-1原癌基因在乳房、肾脏、卵巢和胃肿瘤组织中的表 达
为了检测乳房、肾脏、卵巢和胃的肿瘤组织中HCCR-1原癌基因的 表达，按照参考实施例4的程序，从乳房、肾脏、卵巢和胃的肿瘤组织 中抽提总RNA，利用32P随机HCCR-1 cDNA作探针，按照参考实施例5 程序进行RNA印迹分析。为了比较，用乳房、肾脏、卵巢和胃的正常组 织重复上述操作。
图26A是乳房、肾脏、卵巢和胃的肿瘤组织中HCCR-1原癌基因的 表达的RNA印迹分析结果；图26B是β-肌动蛋白探针的RNA印迹分析 结果。从图26A和26B中可以看出，与正常组织相比，人的乳房、肾脏、 卵巢和胃的肿瘤组织中HCCR-1原癌基因的表达水平增高。
为了检测乳房、肾脏、卵巢和胃的肿瘤组织中HCCR-1蛋白的表达， 利用依据参考实施例2程序由制备实施例2获得的抗-HCCR-1血清对乳 房、肾脏、卵巢和胃的肿瘤组织进行了蛋白质印迹分析。
图27是乳房、肾脏、卵巢和胃的肿瘤组织中HCCR-1原癌基因表达 的蛋白质印迹分析结果。从图27中可以看出，分别与其相对应的正常组 织相比，人的乳房、肾脏、卵巢和胃的肿瘤组织中50kDa的HCCR-1蛋 白均显示出升高的表达。
实施例17：HCCR-1原癌基因在染色体上的位置
用随机引物标记试剂盒(Promega，USA)对由制备实施例1获得的 HCCR-1全长cDNA进行标记以获得探针。利用此探针对人类胎盘λ基 因组文库(Stratagene，USA)进行筛选以获得20kb的基因组DNA。
对基因组DNA进行荧光原位杂交(FISH)(Cherif，D.，et al.，Proc.Natl. Acad.Sci.USA，87，6639-6649(1990))：利用缺口翻译试剂盒(Vysis，USA)， 用SpectrumRed-dUTP对载片上的基因组DNA进行标记。用蔡斯荧光显 微镜观察载玻片。染色体用DAPI(Sigma，USA)进行复染。
图28是荧光原位杂交分析结果，其显示出HCCR-1原癌基因位于12 号染色体的长臂。
虽然仅仅参照优选的实施方案对本发明进行了描述，但是本领域的 技术人员可以在不离开本发明精神和范围的情况下制造出各种改变和变 型，这些改变和变型被限定在后附的权利要求中。
序列表 <110>金振宇 <120>携带人原癌基因的哺乳动物癌细胞和转基因哺乳动物以及利用上述原癌基因的癌 症诊断试剂盒 <130>pca10102/KJW <150>KR 2001-41 <151>2001-01-02 <160>5 <170>KOPATIN 1.5 <210>1 <211>2118 <212>DNA <213>智人 <220> <221>CDS <222>(9)..(1088) <220> <221>信号肽 <222>(9)..(83) <220> <221>混和特征 <222>(435)..(494) <223>跨膜结构域 <400>1 ctgtgaag atg gcg ctc tcc agg gtg tgc tgg gct cgg tcg gct gtg tgg 50
Met Ala Leu Ser Arg Val Cys Trp Ala Arg Ser Ala Val Trp
1 5 10 ggc tcg gca gtc acc cct gga cat ttt gtc acc cgg agg ctg caa ctt 98 Gly Ser Ala Val Thr Pro Gly His Phe Val Thr Arg Arg Leu Gln Leu 15 20 25 30 ggt cgc tct ggc ctg gct tgg ggg gcc cct cgg tct tca aag ctt cac 146 Gly Arg Ser Gly Leu Ala Trp Gly Ala Pro Arg Ser Ser Lys Leu His
35 40 45 ctt tct cca aag gca gat gtg aag aac ttg atg tct tat gtg gta acc 194 Leu Ser Pro Lys Ala Asp Val Lys Asn Leu Met Ser Tyr Val Val Thr
50 55 60 aag aca aaa gcg att aat ggg aaa tac cat cgt ttc ttg ggt cgt cat 242 Lys Thr Lys Ala Ile Asn Gly Lys Tyr His Arg Phe Leu Gly Arg His
65 70 75 ttc ccc cgc ttc tat atc ctg tac aca atc ttc atg aaa gga ttg cag 290 Phe Pro Arg Phe Tyr Ile Leu Tyr Thr Ile Phe Met Lys Gly Leu Gln
80 85 90 atg tta tgg gct gat gcc aaa aag gct aga aga ata aag aca aat atg 338 Met Leu Trp Ala Asp Ala Lys Lys Ala Arg Arg Ile Lys Thr Asn Met 95 100 105 110 tgg aag cac aat ata aag ttt cat caa ctt cca tac cgg gag atg gag 386 Trp Lys His Asn Ile Lys Phe His Gln Leu Pro Tyr Arg Glu Met Glu
115 120 125 cat ttg aga cag ttc cgc caa gac gtc acc aag tgt ctt ttc cta ggt 434 His Leu Arg GLn Phe Arg Gln Asp Val Thr Lys Cys Leu Phe Leu Gly
130 135 140 att att tcc att cca cct ttt gcc aac tac ctg gtc ttc ttg cta atg 482 Ile Ile Ser Ile Pro Pro Phe Ala Asn Tyr Leu Val Phe Leu Leu Met
145 150 155 tac ctg ttt ccc agg eaa cta ctg atc agg cat ttc tgg acc cca aaa 530 Tyr Leu Phe Pro Arg Gln Leu Leu Ile Arg His Phe Trp Thr Pro Lys
160 165 170 caa caa act gat ttc tta gat atc tat cat gct ttc cgg aag cag tcc 578 Gln Gln Thr Asp Phe Leu Asp Ile Tyr His Ala Phe Arg Lys Gln Ser 175 180 185 190 cac cca gaa att att agt tat tta gaa aag gtc atc cct ctc att tct 626 His Pro Glu Ile Ile Ser Tyr Leu Glu Lys Val Ile Pro Leu Ile Ser
195 200 205 gat gca gga ctc cgg tgg cgt ctg aca gat ctg tgc acc aag ata cag 674 Asp Ala Gly Leu Arg Trp Arg Leu Thr Asp Leu Cys Thr Lys Ile Gln
210 215 220 cgt ggt acc cac cca gca ata cat gat atc ttg gct ctg aga gag tgt 722 Arg Gly Thr His Pro Ala Ile His Asp Ile Leu Ala Leu Arg Glu Cys
225 230 235 ttc tct aac cat cct ctg ggc atg aac caa ctc cag gct ttg cac gtg 770 Phe Ser Asn His Pro Leu Gly Met Asn Gln Leu Gln Ala Leu His Val
240 245 250 aaa gcc ttg agc cgg gcc atg ctt ctc aca tct tac ctg cct cct ccc 818 Lys Ala Leu Ser Arg Ala Met Leu Leu Thr Ser Tyr Leu Pro Pro Pro 255 260 265 270 ttg ttg aga cat cgt ttg aag act cat aca act gtg att cac caa ctg 866 Leu Leu Arg His Arg Leu Lys Thr His Thr Thr Val Ile His Gln Leu
275 280 285 gac aag gct ttg gca aag ctg ggg att ggc cag ctg act gct cag gaa 914 Asp Lys Ala Leu Ala Lys Leu Gly Ile Gly Gln Leu Thr Ala Gln Glu
290 295 300 gta aaa tcg gct tgt tat ctc cgt ggc ctg aat tct acg cat att ggt 962 Val Lys Ser Ala Cys Tyr Leu Arg Gly Leu Asn Ser Thr His Ile Gly
305 310 315 gaa gat agg tgt cga act tgg ctg gga gaa tgg ctg cag att tcc tgc 1010 Glu Asp Arg Cys Arg Thr Trp Leu Gly Glu Trp Leu Gln Ile Ser Cys
320 325 330 agc ctg aaa gaa gct gag ctg tct ctc ttg ctg cac aac gtg gtc ctg 1058 Ser Leu Lys Glu Ala Glu Leu Ser Leu Leu Leu His Asn Val Val Leu 335 340 345 350 ctc tcc acc aac tac ctt ggg aca agg cgc tg aatgaaccat ggagcggatg 1110 Leu Ser Thr Asn Tyr Leu Gly Thr Arg Arg
355 360 gcattgtcct gcagtcgtat agtatagcag tgcaggaaca aacagcactt gccagcaaag 1170 tctgtgtgta ctgttaagtg tgtgggaggc agagagagga gcaggggcca tgggcttcac 1230 agcatggcac acctgtggga actgcagaca ttcctctcac agctagaact gaaacaaacc 1290 ctcttgctag gggtggtccg tgtgaggtgt catcctgtcc ccctcataat tactaatagc 1350 tggaactggc agcagcctct actgggcttt tactgtgatg tgttcagttc atgtcctagg 1410 aagtcagctt ttgccccagg tgggaatcct tatttggctt aggactgatc cacttccatg 1470 ttacttacat ctgtgggttt ttgttgttgc tgttagaaaa tttttggctg gtgaaaacag 1530 cactcctttg gctggagcac ttgtgtccat gcatgtactt gggtgtttcc ctccatcctt 1590 tctgatatga ccaaaaatca agttgttttg ttttttgtca ccttcactgg catgggctaa 1650 ccacttcttt ttcaaaccct ctgaacacct ttttctgatg ggtaacttgc aggaatattc 1710 tattggaaaa gataacagga agtacaagtg cttcttgacc ccttcctcaa tgtttctagc 1770 cttcactctc cattgtcttt tctgggctgt attacagccc tctgtggatc ttcaactctg 1830 ctgcctccac tgtgatgcag cagtccaact gtaactgaca gtggctgcct tctctgggcc 1890 atggatcaca cctgtaaggt actaattact gcccagcctg gggagatcag gagaggtctg 1950 catagttagt aagttgggtt tagcttttgt gtgtgcatca gtgacttaga gttctgtaat 2010 aacttattgt aaatgcatga agcactgttt ttaaacccaa gtaaagactg cttgaaacct 2070 gttgatggaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2118 <210>2 <211>360 <212>PRT <213>智人 <400>2 Met Ala Leu Ser Arg Val Cys Trp Ala Arg Ser Ala Val Trp Gly Ser 1 5 10 15 Ala Val Thr Pro Gly His Phe Val Thr Arg Arg Leu Gln Leu Gly Arg
20 25 30 Ser Gly Leu Ala Trp Gly Ala Pro Arg Ser Ser Lys Leu His Leu Ser
35 40 45 Pro Lys Ala Asp Val Lys Asn Leu Met Ser Tyr Val Val Thr Lys Thr
50 55 60 Lys Ala Ile Asn Gly Lys Tyr His Arg Phe Leu Gly Arg His Phe Pro 65 70 75 80 Arg Phe Tyr Ile Leu Tyr Thr Ile Phe Met Lys Gly Leu Gln Met Leu
85 90 95 Trp Ala Asp Ala Lys Lys Ala Arg Arg Ile Lys Thr Asn Met Trp Lys
100 105 110 His Asn Ile Lys Phe His Gln Leu Pro Tyr Arg Glu Met Glu His Leu
115 120 125 Arg Gln Phe Arg Gln Asp Val Thr Lys Cys Leu Phe Leu Gly Ile Ile
130 135 140 Ser Ile Pro Pro Phe Ala Asn Tyr Leu Val Phe Leu Leu Met Tyr Leu 145 150 155 160 Phe Pro Arg Gln Leu Leu Ile Arg His Phe Trp Thr Pro Lys Gln Gln
165 170 175 Thr Asp Phe Leu Asp Ile Tyr His Ala Phe Arg Lys Gln Ser His Pro
180 185 190 Glu Ile Ile Ser Tyr Leu Glu Lys Val Ile Pro Leu Ile Ser Asp Ala
195 200 205 Gly Leu Arg Trp Arg Leu Thr Asp Leu Cys Thr Lys Ile Gln Arg Gly
210 215 220 Thr His Pro Ala Ile His Asp Ile Leu Ala Leu Arg Glu Cys Phe Ser 225 230 235 240 Asn His Pro Leu Gly Met Asn Gln Leu Gln Ala Leu His Val Lys Ala
245 250 255 Leu Ser Arg Ala Met Leu Leu Thr Ser Tyr Leu Pro Pro Pro Leu Leu
260 265 270 Arg His Arg Leu Lys Thr His Thr Thr Val Ile His Gln Leu Asp Lys
275 280 285 Ala Leu Ala Lys Leu Gly Ile Gly Gln Leu Thr Ala Gln Glu Val Lys
290 295 300 Ser Ala Cys Tyr Leu Arg Gly Leu Asn Ser Thr His Ile Gly Glu Asp 305 310 315 320 Arg Cys Arg Thr Trp Leu Gly Glu Trp Leu Gln Ile Ser Cys Ser Leu
325 330 335 Lys Glu Ala Glu Leu Ser Leu Leu Leu His Asn Val Val Leu Leu Ser
340 345 350 Thr Asn Tyr Leu Gly Thr Arg Arg
355 360 <210>3 <211>18 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>特异结合到HCCR-1 mRNA的寡核苷酸序列 <400>3 cctggacatt ttgtcacc 18 <210>4 <211>25 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>PCR引物 <220> <221>混和特征 <222>(10)..(15) <223>BamHI限制酶切位点 <400>4 aggcaactag gatccaggca tttct 25 <210>5 <211>29 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>PCR引物 <220> <221>混合特征 <222>(1)..(6) <223>SalI的限制酶切位点 <400>5 gtcgacgcag ttcccacagg tgtgccatg 29
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