通过适体介导的多腺苷酸化调节来外源性控制哺乳动物基因表达专利检索-哺乳动物基因遗传学专利检索查询-专利查询网

通过适体介导的多腺苷 酸化调节来外源性控制 哺乳动物基因表达

阅读：946发布：2020-05-14

专利汇可以提供通过适体介导的多腺苷酸化调节来外源性控制哺乳动物基因表达专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开的实施方案涉及表达构建体的用途，其中至少一个polyA 信号嵌入可表达的转录物的上游，例如，诸如在转录物的5'UTR内。在某些实施方案中，polyA信号包含在配体-结合适体内，并且配体与适体的结合或其缺乏指示可表达的转录物的结果。在特定的实施方案中，配体的不存在导致在其5'UTR中具有polyA的表达的转录物被表达，但然后被降解，而配体的存在导致可表达的转录物在表达后的降解被抑制。在同一表达构建体上可存在多于一个配体-结合适体。，下面是通过适体介导的多腺苷酸化调节来外源性控制哺乳动物基因表达专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种调节基因表达的系统，所述系统包含polyA适体多核苷酸，所述多核苷酸以5'至
3'方向包含：
a)至少一个在其中包含至少一个polyA切割信号的配体-结合适体；和
b)可表达的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述包含所述polyA切割信号的配体结合适体位于所述可表达的多核苷酸的5'非翻译区内。
3.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述系统包含表达所述配体的多核苷酸。
4.根据权利要求3所述的系统，其中表达所述配体的所述多核苷酸是包含所述适体和可表达的多核苷酸的所述相同polyA适体多核苷酸。
5.根据权利要求3所述的系统，其中表达所述配体的所述多核苷酸是与包含所述适体和可表达的多核苷酸的所述polyA适体多核苷酸不同的多核苷酸。
6.根据权利要求3-6中任一项所述的系统，其中所述polyA适体多核苷酸在所述可表达的多核苷酸的5'UTR中包含两个、三个或更多个polyA信号。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的系统，其中所述polyA适体多核苷酸包含：
a)至少一个polyA信号；
b)至少一个包含所述至少一个polyA信号的配体-结合适体；和
c)至少一个富含U/UG的区域，至少一个富含G的区域，或至少一个富含U/UG的区域和至少一个富含G的区域两者。
8.根据权利要求7所述的系统，其中所述配体-结合适体包含一个、两个、三个或更多个富含U/UG的区域。
9.根据权利要求7所述的系统，其中在所述polyA适体多核苷酸的5'至3'方向上，至少一个polyA信号位于至少一个富含U/UG的区域的上游。
10.根据权利要求7所述的系统，其中在所述polyA适体多核苷酸的5'至3'方向上，所述配体-结合适体位于一个、两个或更多个富含U/UG的区域的上游。
11.根据权利要求7所述的系统，其中在所述polyA适体多核苷酸的5'至3'方向上，至少一个polyA信号位于至少一个富含G的区域的上游。
12.根据权利要求3所述的系统，其中在所述polyA适体多核苷酸的5'至3'方向上，所述配体-结合适体位于一个、两个或更多个富含G的区域的上游。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的系统，其中在所述polyA适体多核苷酸的5'至3'方向上，所述适体包含两个polyA信号和两个富含U/UG的区域。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的系统，其中所述polyA适体多核苷酸包含2个、3个、4个、5个或更多个适体。
15.根据权利要求14所述的系统，其中第一适体和第二适体在5’至3’线性方向上处于相同的取向。
16.根据权利要求14所述的系统，其中第一适体和第二适体在5’至3’线性方向上处于不同的取向。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的系统，其中所述polyA适体多核苷酸包含一个富含G的区域。
18.根据权利要求17所述的系统，其中在所述polyA适体多核苷酸的5'至3'方向上，所述富含G的区域在所述最3'适体中。
19.根据权利要求17所述的系统，其中在所述polyA适体多核苷酸的5'至3'方向上，所述富含G的区域在所述第二适体中。
20.根据权利要求14-19中任一项所述的系统，其中所述polyA适体多核苷酸不包含两个或更多个适体之间的碱基配对。
21.根据权利要求14-19中任一项所述的系统，其中所述polyA适体多核苷酸包含两个或更多个适体之间的碱基配对。
22.根据权利要求14-21中任一项所述的系统，其中在来自所述polyA适体多核苷酸中的两个不同适体的环的至少一部分之间存在碱基配对。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的系统，其中适体内的两个环之间的核苷酸数量为10-25个核苷酸。
24.根据权利要求1-22中任一项所述的系统，其中适体内的两个环之间的核苷酸数量为18-20个核苷酸。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的系统，其中所述配体是多肽、肽、核酸、小分子、药物、代谢物或其组合。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的系统，其中适体的长度为14至250个核苷酸。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的系统，其中所述可表达的多核苷酸是报告基因、治疗性基因或基因产物改变所述细胞的代谢状态的基因。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的系统，其中所述polyA适体多核苷酸为载体的至少一部分。
29.根据权利要求3所述的系统，其中表达所述配体的所述多核苷酸为载体的至少一部分。
30.根据权利要求28或29所述的系统，其中所述载体是质粒、病毒载体或线性DNA。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的系统，其中所述可表达的多核苷酸编码所述配体。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的系统，其中所述可表达的多核苷酸的表达由组织特异性启动子调节。
33.一种调节基因表达的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供系统，所述系统包含polyA适体多核苷酸，所述多核苷酸以5’至3’方向包含：
1)至少一个在其中包含至少一个polyA切割信号的配体-结合适体；
2)可表达的多核苷酸；和
3)任选的配体-表达构建体；和
b)使所述系统经受合适的条件，其中当不希望来自所述可表达的多核苷酸的mRNA时，所述配体不结合所述配体-结合适体或不存在于所述系统或其环境中，来自所述可表达的多核苷酸的mRNA被降解；或
c)使包含所述配体-表达构建体的所述系统经受合适的条件，其中当希望所述可表达的多核苷酸表达时，所述配体结合所述适体和/或存在于所述系统或其环境中，来自所述可表达的多核苷酸的mRNA不被降解。
34.一种调节基因表达的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供系统，所述系统包含polyA适体多核苷酸，所述polyA适体多核苷酸以5'至3'方向包含：
1)至少一个在其中包含至少一个polyA切割信号的配体-结合适体；
2)可表达的多核苷酸；和
3)任选的配体-表达构建体；和
b)使所述系统经受合适的条件，其中当所述配体不存在于所述系统或其环境中或不结合所述配体-结合适体时，来自所述可表达的多核苷酸的mRNA被降解；或c)使包含所述配体-表达构建体的所述系统经受合适的条件，其中当所述配体结合所述适体时，来自所述可表达的多核苷酸的mRNA不被降解，并且基因产物可由所述可表达的多核苷酸表达。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中在细胞中进行所述方法。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述配体对于所述细胞是内源性的。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述细胞是需要基因的基因疗法的干细胞、癌细胞或患病或有缺陷的细胞。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述基因是肌营养不良蛋白、白蛋白或因子IX。
39.根据权利要求33-38中任一项所述的方法，其中在体内进行所述方法。
40.根据权利要求33-39中任一项所述的方法，其中在哺乳动物中进行所述方法。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
42.根据权利要求33或34所述的方法，其中在体外进行所述方法。
43.根据权利要求33-41中任一项所述的方法，其中在个体的一个或多个细胞中进行所述方法，所述配体是葡萄糖，所述个体患有糖尿病、前驱糖尿病或糖尿病并发症，和/或可表达的多核苷酸是胰岛素。
44.根据权利要求33-41中任一项所述的方法，其中在个体的一个或多个细胞中进行所述方法，所述配体是癌症生物标志物的基因产物，并且所述可表达的多核苷酸是自杀基因。
45.根据权利要求33-41中任一项所述的方法，其中在个体中进行所述方法，所述可表达的多核苷酸是报告基因，并且所述报告基因表达的位置和/或强度提供了关于配体在所述个体的一个或多个细胞中的空间分布、时间波动或两者的信息。
46.根据权利要求33-45中任一项所述的方法，所述方法还包括设计适当地结合所述配体的适体的步骤。
47.根据权利要求33-46中任一项所述的方法，其中在个体、组织或细胞中进行所述方法，其中所述可表达的多核苷酸编码可检测的基因产物，并且其中对所述相应的个体、组织或细胞进行成像。
48.一种监测对个体的疗法的方法，所述方法包括向所述个体提供以下物质的步骤：
a)包含polyA适体多核苷酸的载体，所述多核苷酸以5’至3’方向包含：
1)至少一个在其中包含至少一个polyA切割信号的配体-结合适体；和
2)可表达的多核苷酸；和/或
b)一个或多个具有a)的所述载体的细胞，
其中配体是指示治疗功效的蛋白质的特定基因产物。
49.根据权利要求48所述的方法，其中在治疗之前、治疗期间和/或治疗之后向所述个体提供a)的所述载体和/或b)的所述细胞。
50.一种测定个体中医学病况的存在、风险或易感性的方法，所述方法包括向所述个体提供以下物质的步骤：
a)包含polyA适体多核苷酸的载体，所述多核苷酸以5’至3’方向包含：
1)至少一个在其中包含至少一个polyA切割信号的配体-结合适体；和
2)可表达的多核苷酸；和/或
b)一个或多个具有a)的所述载体的细胞，
其中所述可表达的多核苷酸的表达或不存在所述可表达的多核苷酸的表达鉴别所述配体是否存在以结合所述适体，其中所述配体在所述个体或其细胞中的相应存在或不存在表示医学病况的存在、易感性或风险。
51.一种polyA适体多核苷酸，其中所述多核苷酸以5'至3'方向包含：
a)至少一个在其中包含至少一个polyA切割信号的配体-结合适体；和
b)可表达的多核苷酸。
52.根据权利要求51所述的多核苷酸，其中所述配体-结合适体位于所述可表达的多核苷酸的5'UTR中。
53.根据权利要求50或51所述的多核苷酸，其中所述polyA适体多核苷酸还包含至少一个富含U/UG的区域，至少一个富含G的区域，或至少一个富含U/UG的区域和至少一个富含G的区域两者。
54.根据权利要求53所述的多核苷酸，其中在所述polyA适体多核苷酸的5'至3'方向上，至少一个polyA信号位于至少一个富含U/UG的区域的上游。
55.根据权利要求53所述的多核苷酸，其中在所述polyA适体多核苷酸的5'至3'方向上，所述配体-结合适体位于一个、两个或更多个富含U/UG的区域的上游。
56.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中在所述polyA适体多核苷酸的5'至3'方向上，至少一个polyA信号位于至少一个富含G的区域的上游。
57.根据权利要求53所述的多核苷酸，其中在所述polyA适体多核苷酸的5'至3'方向上，所述配体-结合适体位于一个、两个或更多个富含G的区域的上游。
58.一种细胞，所述细胞包含权利要求51-57中任一项所述的多核苷酸。
59.根据权利要求58所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
60.根据权利要求59所述的细胞，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
61.根据权利要求58-60中任一项所述的细胞，其中所述细胞存在于人中。
62.一种细胞，所述细胞包含权利要求1-32中任一项所述的系统。
63.根据权利要求62所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
64.根据权利要求63所述的细胞，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
65.一种载体，所述载体包含权利要求51-457中任一项所述的多核苷酸。
66.根据权利要求65所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
67.根据权利要求66所述的载体，其中所述病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体或慢病毒载体。
68.根据权利要求65所述的载体，其中所述载体是质粒。

说明书全文

通过适体介导的多腺苷 酸化调节来外源性控制 哺乳动物基因

表达

[0001] 本申请要求于2015年11月12日提交的美国临时专利申请序列第62/254,435号的优先权，所述专利申请通过引用整体并入本文。

[0002] 关于联邦政府资助的研究或开发的声明

[0003] 本发明是在国立卫生研究院授予的第1RO1EB013584-02号下由政府资助完成的。政府对本发明享有一定的权利。

技术领域

[0004] 本公开的实施方案至少涉及细胞生物学、分子生物学、基因调节、基因疗法、干细胞疗法、医学、分子成像、生物传感器和诊断学。

[0005] 发明背景

[0006] 为了阐明特定基因产物的功能或在安全范围内生成治疗性蛋白质，精确控制转基因表达的能力一直是不可或缺的。目前有几种基因调节系统可用1-3，它们已被证明是非常强大的实验工具。然而，尽管它们具有实用性，但这些系统由于它们依赖于杂合转录反式激活因子和专门的启动子而具有一些实际限制。这些限制包括：(i)需要具有两个转录单元，一个用于表达反式激活因子，另一个用于表达要被调节的转基因。因此，使用这些系统需要共同引入两种表达构建体。(ii)来自杂合反式激活因子表达的潜在毒性(例如诱导针对作为外来蛋白的反式激活因子的宿主免疫应答，反式激活因子对内源性转录的作用等)。(iii)由于需要专门的启动子，因此难以将此类系统以组织特异性方式用于调节。(iv)有限数量的可用于实验和治疗性应用的小诱导物分子(由于有限数量的可用系统)。这些限制可以通过基因调节系统来克服，所述基因调节系统包含RNA，基本上由RNA组成或仅由RNA组成，所述基因调节系统不涉及任何反式激活蛋白和专门的启动子。已经报告了用于控制基因表达的完全基于RNA的机制的存在。具体地，已经描述了基于自催化核酶的调节的系统4，为开发只有RNA的系统提供了令人信服的合理性，所述系统在基因疗法和生物学研究中具有更广泛得多的应用。

[0007] 与基于使用反式激活因子控制转录的基因调节系统相反，本文提供的基于polyA的系统不需要任何蛋白反式激活因子产物的表达，并且不依赖于任何专门的启动子元件的使用，因此在理论上代表一种‘便携式’调节系统，其可被‘嵌入’任何内源基因或工程化的载体转录单元。因此，该系统只需要一个转录单元(一个表达构建体)，并且是启动子灵活性的，以便其可用于以组织特异性(空间)和时间方式调节转基因。因为多腺苷酸化是所有哺乳动物细胞中发生的普遍过程，因此所描述的系统是广泛适用的。

[0008] 由于现有技术的限制，尚未充分利用的基因调节的另一个重要应用领域是使用基因调节系统作为生物传感器用于体内检测特定细胞蛋白质表达或病理事件的能力。此类生物传感器平台可以提供关于生物分子水平波动的体内时间和空间信息，并且输入信息可用于调节细胞行为或生成用于成像或检测的报告信号。例如，基因调节系统可以与作为其配体的致癌蛋白质结合，并作为响应打开或关闭一组特定的基因。这些基因可生成用于定量检测或成像的报告信号，影响代谢途径的过程或表达治疗性蛋白质。特定细胞蛋白质的分子传感将允许显示活细胞中疾病背后的生化异常。此类技术可用于通过监测特定标志物蛋白的表达来监测临床治疗的进展，并且在具体的实施方案中，形成使得能够测试和开发新的治疗范例的重要平台。此外，此类技术可用于理解特定基因产物在生物过程和疾病发展中的作用。

[0009] 现代蛋白质组学技术已经提供了用于使内源性细胞蛋白质可视化或鉴定所述蛋白质的几种有用的方法。方法诸如质谱法5允许鉴定哺乳动物细胞或组织中存在的数百种蛋白质分子。然而，这些方法在该过程中破坏了细胞和组织，并且与旨在检测活动物或人中的特定细胞蛋白质的目标不相容。使用具有缀合的信号生成基序的抗体的方法虽然对于使细胞膜外的特定蛋白质可视化是有效的，但不适用于检测构成活细胞内大部分表达的蛋白质的细胞内蛋白质或对所述细胞内蛋白质进行成像。缺乏检测体内特定天然蛋白质的有用方法表明需要新的生物传感策略，因为它们将在理解基本生物学过程和疾病状态方面产生重大影响。

[0010] 本公开满足了本领域中对提供用于使用基于RNA 开关的方法来检测天然蛋白质的表达以及调节活细胞中的目标基因的方法以及系统和组合物的长期需要。

[0011] 发明概述

[0012] 本公开的实施方案涉及使用适体介导的多腺苷酸化调节对基因调节进行的外源控制。本公开的实施方案涉及通过调节由配体对包含polyA信号的适体的结合的看门者作用控制的polyA切割来控制哺乳动物基因表达。

[0013] 本公开的实施方案涉及使用适体介导的多腺苷酸化调节来控制特定多核苷酸表达的分子开关。在具体的实施方案中，所述分子开关是基于5'UTR polyA信号的RNA开关(其在本文中可被称为polyA开关或polyA传感器)。

[0014] 在具体的实施方案中，本公开的系统被用作生物传感器系统，其检测活细胞、组织或生物体中的一个或多个细胞内“标记”。“标记”可以反映所述的一种或多种基因的表达；一种或多种内源性产生的化合物诸如蛋白质或代谢物的存在或不存在；指示疾病状态或正常状态或治疗功效或其组合的分子的存在或不存在；等等。所述系统可以指示一种或多种细胞或组织或生物体的代谢或生理状态。

[0015] 在具体的实施方案中，所述系统包含多核苷酸，所述多核苷酸以5'至3'方向包含一个或多个在其中包含至少一个polyA切割信号的配体-结合适体；和可表达的多核苷酸；将系统暴露于合适的条件下，使得当配体不存在于系统或其环境中时，或配体不结合所述配体-结合适体时，来自可表达的多核苷酸的mRNA被降解。在一些实施方案中，系统经历合适的条件，使得当配体-结合适体时，来自可表达的多核苷酸的mRNA不被降解，并且基因产物可由可表达的多核苷酸表达。

[0016] 在某些实施方案中，本公开的系统涉及调节所述一个或多个讨论的特定基因的表达的能力。所述系统允许通过使用能够抑制基于5’UTR polyA信号的RNA开关，从而导致基因的表达的特定配体来操纵基因的表达。所述系统允许使用配体诸如小分子定制基因表达来控制表达，包括例如以组织特异性和/或时间特异性的方式。在具体的实施方案中，所述系统充当生物传感器系统，用于使用定制的适体/可表达的多核苷酸组合来提供关于内源性配体在特定环境中的信息。

[0017] 在一个实施方案中，存在用于调节基因表达的系统，其包含多核苷酸，所述多核苷酸以5'至3'方向包含：a)至少一个各自在其中包含至少一个polyA切割信号(尽管在备选实施方案并非所有适体都具有polyA切割信号)的配体-结合适体；和b)可表达的多核苷酸。在特定的实施方案中，包含polyA切割信号的配体结合适体位于可表达的多核苷酸的5'非翻译区内。在特定的实施方案中，所述系统包含表达配体的多核苷酸。在一些方面，表达配体的多核苷酸是包含适体和可表达的多核苷酸的相同多核苷酸。在其它情况下，表达配体的多核苷酸是与包含适体和可表达的多核苷酸的多核苷酸不同的多核苷酸。

[0018] 在某些实施方案中，本公开内容涵盖的多核苷酸在可表达的多核苷酸的5’UTR中包含两个、三个或更多个polyA信号。在特定的实施方案中，多核苷酸包含：a)至少一个polyA信号；b)配体-结合适体；以及c)至少一个富含U/UG的区域，至少一个富含G的区域，或至少一个富含U/UG的区域和至少一个富含G的区域两者。在所述系统的一些实施方案中，配体-结合适体包含一个、两个、三个或更多个富含U/UG的区域。在某些方面，在多核苷酸的5'至3'方向上，至少一个polyA信号位于至少一个富含U/UG的区域的上游。在其它方面，在多核苷酸的5'至3'方向上，配体-结合适体位于1个、2个或更多个富含U/UG的区域的上游。在特定的方面，在多核苷酸的5'至3'方向上，至少一个polyA信号位于至少一个富含G的区域的上游。在一些方面，在多核苷酸的5'至3'方向上，配体-结合适体位于1个、2个或更多个富含G的区域的上游。在特定实施方案中，在多核苷酸的5'至3'方向上，适体包含2个polyA信号或两个富含U/UG的区域。在某些方面，在多核苷酸包含两个或更多个适体的情况下，多核苷酸可以仅包含一个富含G的区域。在这种情况下，在多核苷酸的5'至3'方向上，富含G的区域可位于多核苷酸的最3'适体上，或者可以位于第二适体中。

[0019] 在本公开的一些实施方案中，配体是多肽、肽、核酸、小分子、药物、代谢物或其组合。在特定方面，适体的长度为14至250个核苷酸。在具体的实施方案中，可表达的多核苷酸是报告基因、治疗性基因或基因产物改变细胞代谢状态的基因。在一些情况下，所述多核苷酸是载体的至少一部分。表达配体的多核苷酸可以是载体诸如质粒、病毒载体或线性DNA的至少一部分。在具体的实施方案中，可表达的多核苷酸编码配体。在一些方面，可表达的多核苷酸的表达可由组织特异性启动子调节。

[0020] 在某些实施方案中，存在调节基因表达的方法，包括以下步骤：a)提供系统，所述系统包含多核苷酸，所述多核苷酸以5'至3'方向包含：1)至少一个各自在其中包含至少一个polyA切割信号的配体-结合适体；2)可表达的多核苷酸；和3)任选的配体-表达构建体；和b)使系统经受合适的条件，其中当不希望来自可表达的多核苷酸的mRNA时，配体不结合所述配体-结合适体或不存在于系统或其环境中，来自可表达的多核苷酸的mRNA被降解；或c)使包含配体-表达构建体的系统经受合适的条件，其中当希望表达多核苷酸表达时，配体结合适体和/或存在于系统或其环境中，来自可表达的多核苷酸的mRNA不被降解。

[0021] 在一个实施方案中，存在调节基因表达的方法，其包括以下步骤：a)提供系统，所述系统包含多核苷酸，所述多核苷酸以5’至3’方向包含：1)至少一个各自在其中包含至少一个polyA切割信号的配体-结合适体；2)可表达的多核苷酸；和3)任选的配体-表达构建体；和b)使系统经受合适的条件，其中当配体不存在于系统或其环境中或不结合所述配体-结合适体时，来自可表达的多核苷酸的mRNA被降解；或c)使包含配体-表达构建体的系统经受合适的条件，其中当配体结合适体时，来自可表达的多核苷酸的mRNA不被降解，并且基因产物可由可表达的多核苷酸表达。在特定的实施方案中，在需要基因(诸如肌营养不良蛋白、白蛋白或因子IX)的基因疗法的细胞诸如干细胞、癌细胞或患病或有缺陷的细胞中进行所述方法。在特定方面，配体对于细胞是内源性的。在具体的方面，在体内，诸如在哺乳动物(包括人)中进行所述方法。在其它方面，在体外进行所述方法。在一些实施方案中，在个体的一个或多个细胞中进行所述方法，所述配体是葡萄糖，个体患有糖尿病、前驱糖尿病或糖尿病并发症，和/或可表达的多核苷酸是胰岛素。在一些方面，所述方法在个体的一个或多个细胞中进行，所述配体是癌症生物标志物的基因产物，并且可表达的多核苷酸是自杀基因。在具体的方面，所述方法在个体中进行，可表达的多核苷酸是报告基因，并且报告基因表达的位置和/或强度提供关于配体在个体的一个或多个细胞中的空间分布、时间波动或两者的信息。在一些实施方案中，所述方法还包括设计适当地结合配体的适体的步骤。在特定的实施方案中，在个体、组织或细胞中进行所述方法，其中可表达的多核苷酸编码可检测的基因产物，并且其中对相应的个体、组织或细胞进行成像。

[0022] 在某些实施方案中，存在监测对个体的疗法的方法，包括向个体提供以下物质的步骤：a)包含多核苷酸的载体，所述多核苷酸以5'至3'方向包含：1)至少一个各自在其中包含至少一个polyA切割信号的配体-结合适体；和2)可表达的多核苷酸；和/或b)一个或多个具有a)的载体的细胞，其中所述配体是指示治疗功效的蛋白质的特定基因产物。在特定的实施方案中，在治疗之前、治疗期间和/或治疗之后向个体提供a)的载体和/或b)的细胞。

[0023] 在一个实施方案中，存在测定个体中医学病况的存在、风险或易感性的方法，所述方法包括向个体提供以下物质的步骤：a)包含多核苷酸的载体，所述多核苷酸在以5'至3'方向包含：1)至少一个各自在其中包含至少一个polyA切割信号的配体-结合适体；和2)可表达的多核苷酸；和/或b)一个或多个具有a)的载体的细胞，其中可表达的多核苷酸的表达或不存在可表达的多核苷酸的表达鉴别配体是否存在以结合适体，其中配体在个体或其细胞中的相应存在或不存在表示医学病况的存在、易感性或风险。

[0024] 在某个实施方案中，存在多核苷酸，其中所述多核苷酸以5'至3'方向包含：a)至少一个各自在其中包含至少一个polyA切割信号的配体-结合适体；和b)可表达的多核苷酸。在特定的实施方案中，配体-结合适体位于可表达的多核苷酸的5'UTR中。在一些方面，多核苷酸还包含至少一个富含U/UG的区域，至少一个富含G的区域，或至少一个富含U/UG的区域和至少一个富含G的区域两者。在其它方面，在多核苷酸的5'至3'方向上，至少一个polyA信号位于至少一个富含U/UG的区域的上游。在特定的情况下，在多核苷酸的5'至3'方向上，配体-结合适体位于一个、两个或更多个富含U/UG的区域的上游。在具体情况下，在多核苷酸的5'至3'方向上，至少一个polyA信号位于至少一个富含G的区域的上游。在具体方面，在多核苷酸的5'至3'方向上，配体-结合适体位于一个、两个或更多个富含G的区域的上游。

[0025] 其它实施方案涉及包含本公开涵盖的任何多核苷酸的细胞。在特定的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，诸如人细胞，并且细胞可存在于人中。在一些实施方案中，所述细胞包含本公开所涵盖的任何系统。在特定的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，诸如人细胞，并且细胞可存在于人中。在具体的实施方案中，存在由本公开所涵盖的并且包含本公开所涵盖的任何多核苷酸的载体。在特定情况下，载体是病毒载体，诸如腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体或慢病毒载体。在特定的实施方案中，载体是质粒。

[0026] 附图简述

[0027] 图1A描绘通过调节polyA信号切割对特定细胞内蛋白进行成像的示例性策略。在5'UTR内工程化的polyA信号(pA)的高效切割导致mRNA的破坏和报告基因信号的表达丧失。
配体蛋白与偶联至polyA位点的适体的结合阻断了切割，导致完整mRNA的保存，并使得报告信号能够表达。三角形表示pA切割位点。为了清楚起见，通常将存在于3'UTR中的pA省略。通过将编码polyA开关的DNA质粒与(右)编码配体蛋白质(tat)的质粒一起或不与(左)编码配体蛋白质(tat)的质粒一起共转染人293T细胞来获得底部图像。配体蛋白的存在明确地诱导了容易通过成像检测到的生物发光报告信号的表达。图1B显示小分子-适体相互作用调节polyA切割。将具有结合小分子的经工程化的pA的适体插入基因的5'UTR中。5'UTR polyA切割导致mRNA的3'部分破坏，因此不存在基因表达。然而，施用的小分子与适体的结合阻断了5'UTR polyA并导致完整mRNA的生成，从而导致蛋白质表达。mRNA的5'UTR显示为黑色线，而目标基因显示为橙色框。小分子配体显示为粉红色六边形，切割位点为黑色三角形。图1C显示适体内经工程化的polyA组分的详细视图；

[0028] 图2说明通常发生在3'UTR处进行的多腺苷酸化涉及mRNA切割，向5'片段添加polyA尾，以及3'片段的降解；

[0029] 图3显示当牛生长激素的polyA切割位点(蓝色三角形)隐藏在稳定的RNA茎中时，多腺苷酸化大大降低(如所测量的从100％至40％)。(改编自Gimmi等，1989)[SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2]；

[0030] 图4说明polyA传感器系统使得能够利用现有的适体技术和成像报告分子来形成灵活的分子成像平台。pA：polyA信号。IFP：红外-荧光蛋白。Luc：萤光素酶；

[0031] 图5说明polyA信号在5'UTR可被高效切割。通过流式细胞术分析间接测量对于不同polyA基序的切割效率。X轴表示GFP表达水平。红色对角线将GFP阳性细胞与GFP阴性细胞分开。由于两个拷贝的polyA信号导致GFP水平极大地降低[SEQ ID NO:3]，底部构型导致最少的绿色细胞。

[0032] 图6说明“夹持”方法。配体结合有效地将适体锁定在稳定的双链茎结构中，并物理地阻断由三角形指示的切割位点；

[0033] 图7A-7C显示经设计用于检测病毒tat蛋白的polyA传感器的剂量依赖性响应。(图7A)在以转染的质粒的量计的不同的配体构建体剂量下的通过IVIS200生物发光成像仪可视化的报告分子表达水平。每个小孔约含有1万个细胞。无活性polyA载体的表达水平为参照100％的诱导。(图7B)计算为在不同剂量的转染的配体构建体存在对比不存在的情况下的报告信号(萤光素酶)的比率的诱导‘倍数’。报告信号是使用光度计测量的。显示了在以转染的质粒的量计的不同的配体剂量下的3种不同的polyA传感器(具有活性pA的传感器、具有无活性pA的传感器或无pA对照质粒)。(图7C)通过针对由所有质粒载体共有的5'UTR的探针可视化的萤光素酶mRNA表达的RNA印迹分析。通过针对mRNA的探针可视化Tat mRNA。使用针对GAPDH的探针作为内部对照。pA：polyA信号。结果确认了配体(tat)的存在导致完整的全长转基因mRNA(第5泳道，上方的条带)；

[0034] 图8A-8B显示PolyA切割的效率取决于polyA信号在四环素-结合适体(cb32tc-适体)的实例中的位置。(图8A)(SEQ ID NO:4)。显示了用作模板的tc-适体(左图)以及其中放置polyA信号(AAUAAA)的位置。为了产生polyA信号而在tc-适体内进行的突变以蓝色字母显示。(图8B)图表显示在四环素(tc)不存在的情况下测量的相对萤光素酶活性，从而反映了polyA切割的效率。将不含polyA开关的亲本质粒的活性设定为100％。在该系列中，A6构型表现出最高的polyA切割效率。A6的空心条是无活性polyA(CACACA)对照；

[0035] 图9A-9C显示P1茎长度和富含GU的区域的位置对调节基于构建体A6的效率的作用。红线指示两个polyA信号。P1长度和富含GU的区域与B1-2之间的距离以bp给出。基因表达的诱导通过在15μg/ml tc不存在(黑条)和存在(白条)的情况下构建体的相对萤光素酶活性来显示。测定为在利用和不利用tc的情况下相对萤光素酶活性的比率的调节效率由图下数字给出。(图9A)具有不同P1长度和2bp GU距离的构建体。结果显示，12bp的P1长度导致由tc诱导的基因表达。(图9B)P1长度为12bp但具有不同的富含GU的距离的构建体。5bp或8bp的富含GU的距离导致由tc诱导的最佳基因表达。(图9C)具有不同P1长度但具有固定的
8bp GU距离的构建体。当GU距离固定在8bp时，11bp或12bp的P1长度导致最佳的由tc诱导的基因表达；

[0036] 图10A-10B显示环中的第二polyA信号在polyA切割中发挥更重要的作用。(图10A)(SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7)P1长度为12bp且具有2bp GU距离的构建体。(图10B)(SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7)P1长度为12bp且具有8bp GU距离的构建体。左侧：各种构建体的示意图。活性polyA信号以红线标示，无活性polyA信号以蓝线标示，以及将活性polyA信号转换为无活性polyA信号(CACACA)的突变以蓝色字母标示。右侧：在
15μg/ml tc不存在(黑条)和存在(白条)的情况下的相对萤光素酶活性。测定为在tc存在和不存在的情况下的相对萤光素酶活性的比率的调节效率由图下的数字给出。在这两种情况下，环中的第二polyA信号在polyA切割中起着更重要的作用；

[0037] 图11A-11B显示部分嵌入新P1茎中的polyA信号，该polyA信号导致提高的调节效率。(图11A)(SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9)所测试的构建体的示意图。构建体A8和A8*相异在于如以蓝色框标示的一个A-U对。(图11B)在15μg/ml tc不存在(实心条)和存在(空心条)的情况下的相对萤光素酶活性。测定为在tc存在和不存在的情况下的相对萤光素酶活性的比率的调节效率由图下的数字给出；

[0038] 图12A-12B显示基于A8构建体P1区域的修饰的实例。(图12A)构建体的示意图。A8g构建体利用侧接polyA信号的两个tc适体。A8h构建体利用一个tc适体和一个侧接polyA信号的新霉素适体。(图12B)在15μg/ml tc不存在(实心条)和存在(空心条)的情况下的相对萤光素酶活性。请注意，将额外的G-C碱基对紧邻polyA信号的5’插入，其稳定P1茎，导致polyA活性丧失(构建体A8f)。这证实了通过稳定P1茎可以高效地使polyA信号失活。另外，通过两个tc适体侧接polyA信号进一步提高了调节效率(构建体A8g)。在所有情况下，使用15μg/ml tc，但其中使用15μg/ml tc和15ug/ml新霉素的A8h除外；

[0039] 图13A-13B显示polyA切割发生在tc结合核心的B1-2膨出部周围。(图13A；[SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12])5'UTR多腺苷酸化的mRNA片段的Sanger测序结果。垂直的黑线表示将polyA尾部添加至5'UTR片段的位置。(图13B；SEQ ID NO:13)经鉴定的polyA切割位点在tc结合核心的B1-2膨出部周围用黑色箭头标记；

[0040] 图14A-14B显示polyA-GU距离的改变、预测的切割位点及其对调节效率的作用。(图14A；SEQ ID NO:14)来自具有不同长度P1长度的A8的子构建体(A8a、A8b、A8c、A8d)的示意图。基于图13中显示的数据，箭头指向每个构建体的预测的主要polyA切割位点。(图14B)在15μg/ml tc不存在(实心条)和存在(空心条)的情况下具有不同P1长度的构建体的相对萤光素酶活性。该结果显示A8仍然是最有效的配置。

[0041] 图15A-15B显示对位置42的突变研究揭示了具有更好调节效率的构建体。已知由方框标记的位置不容许突变，而空心圆圈指示所有核苷酸交换不影响tc结合的位置。位置A13和A42形成非规范的碱基配对，并且被选择用于突变研究。结果表明A42G突变导致提高的调节效率(构建体A8-A42G)[SEQ ID NO:15]。(15B)在15μg/ml tc不存在(实心条)和存在(空心条)的情况下的相对萤光素酶活性。测定为在tc存在和不存在的情况下的相对萤光素酶活性的比率的调节效率由图下的数字给出；

[0042] 图16显示使用非变性凝胶对tc与适体的结合的可视化。将含有设计的polyA开关的体外转录的RNA适体(5uM)与或不与tc(50uM)一起孵育并施加至非变性的10％聚丙烯酰胺凝胶上。将Tc在365nm处用紫外光激发，并通过荧光发射直接显现(中图，蓝色)。然后将凝胶与SYBR金一起孵育以对RNA进行染色(上图，红色)。tc和RNA的共定位通过叠加(下图)证明。将来自tc通道的像素强度针对RNA通道的像素强度进行标准化，从而产生相对tc信号。与A8或cb32相比，构建体A8-A42G似乎具有更高的tc亲和力。构建体A8-A42G*，其在适体内的tc结合位点具有突变，导致非常少的tc结合；

[0043] 图17显示A8-A42G的剂量依赖性调节。显示了A8-A42G构建体(蓝色圆圈)、无活性适体对照A8-A42G*(红色正方形)和无活性pA对照(AAUAAA与CACACA突变，绿色三角形)的相对诱导倍数。每个数据点对应于测定为在tc存在和不存在的情况下的萤光素酶活性的比率的相对诱导倍数；

[0044] 图18A、18B和18C说明允许高效polyA切割和调节的额外的PolyA开关位置以及不同的适体构型；

[0045] 图19显示示例性适体的修饰的实例。在所指示的位置处修饰适体103G以产生103GP2和103GS3适体[SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18]；

[0046] 图20提供示例性103G、103GP2和103GS3适体的相应萤光素酶表达水平和诱导。构建体103GP2显示423倍的最高理论动态范围，以及通过tc产生的30倍的最高诱导。

[0047] 图21显示103GP2的P2区域的修饰变化和对基因表达诱导的相应作用[SEQ ID NO:19]。

[0048] 图22显示103GP3的L3区域的修饰变化和对基因表达的诱导倍数的相应作用[SEQ ID NO:20]。

[0049] 图23显示103GP3的L1区域的修饰变化和对基因表达诱导的相应作用[SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25]。

[0050] 图24说明稳定P1并因此导致对polyA活性的显著抑制的碱基配对的修饰的实例。经修饰的区域位于浅蓝色框中[SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:27]。

[0051] 图25提供polyA传感器构建体GP2的实例，其具有以不同取向侧接2个适体的polyA信号[SEQ ID NO:28、29、30]。

[0052] 图26说明polyA传感器构建体GP2SLGP2的实例，其具有允许可替代的折叠的背靠背连接的两个GP2适体的构型。5'GP2适体被称为辅助，3'GP2适体被称为中心。两者均含有活性polyA信号，但只有中心适体含有富含G的区域。

[0053] 图27显示辅助GP2和中心GP2的茎/环-II区域(加框区域)的长度和序列的变化，并且显示了对基因表达诱导的相应作用。显示不同构建体之间的序列变化[SEQ ID NO:31-58]。

[0054] 图28提供示例性polyA传感器GP2SLGP2[SEQ ID NO:59]、C12[SEQ ID NO:60]和D11A[SEQ ID NO:61]的完整序列。

[0055] 图29显示GP2SLGP2的剂量依赖性调节。每个数据点对应于测定为在tc存在和不存在的情况下的萤光素酶活性的比率的相对诱导倍数。显示了平均诱导倍数和标准偏差。在15μg/mL Tc下诱导达到104倍。

[0056] 图30显示C12的剂量依赖性调节。每个数据点对应于测定为在Tc存在和不存在的情况下的萤光素酶活性的比率的相对诱导倍数。显示了平均诱导倍数和标准偏差。在15μg/mL Tc下诱导达到151倍。

[0057] 图31显示D11A的剂量依赖性调节。每个数据点对应于测定为在tc存在和不存在的情况下的萤光素酶活性的比率的相对诱导倍数。显示了平均诱导倍数和标准偏差。在15μg/mL Tc下诱导达到127倍。

[0058] 发明详述

[0059] 适体是如同受体一样折叠并与特定配体结合的短RNA序列19-21。用于产生对特定配体具有高亲和力的适体的高效‘体外进化8,12方法已被良好地建立7,9,22。适体的结合亲和力通常可以达到纳摩尔范围，与抗体的结合亲和力相当。在这方面，适体可被视为由RNA制成的抗体。适体与抗体的区别在于其的小尺寸(通常小于50个碱基)及其模块化性质。这些特征使适体能够与其它RNA结构整合并控制所述RNA结构而不丧失其结合功能。已经证明，适体可以将自切割RNA核酶转换成以配体依赖性方式运行，并且像试管中的分子开关那样起作用23,24。

[0060] 自然界已经成功地利用“核糖开关”25形式的适体机制来调节基因表达。在细菌中发现了许多天然存在的适体，其中除了RNA切割以外，输入配体与适体的结合还通过转录减毒、翻译抑制和选择性剪接的机制调节基因表达25,26。据估计，所有细菌基因的2-3％和未知数量的酵母基因被认为以这种方式受到控制27。通过适体介导的机制，报告基因表达随时间推移的位置和强度将反映体内特定细胞内配体的空间分布和时间波动。报告基因产物，诸如荧光素酶、胸苷激酶、近红外或红外荧光蛋白(例如)可以例如通过现代成像仪器诸如生物发光成像仪或正电子发射断层成像术(PET)来监测。近红外或红外荧光蛋白对于体内全身成像技术是有用的。该方法不需要预先标记或操纵研究中的天然蛋白质，因此解决了以前在体内难以解决的一类测量。

[0061] RNA适体以高亲和力识别特定配体，但缺乏放大通过适体结合产生的信号的强大方法。尽管一些研究报告了使用适体来控制核酶切割并使其能够用作响应哺乳动物细胞中特定配体的分子开关，但由这些传感器展示的低动态范围(通常低于5倍可诱导范围)和高28,29
泄漏表达严重限制了它们的使用。

[0062] 可以认为在哺乳动物细胞中使用适体作为感应装置的障碍是缺乏将配体/适体的结合与报告基因表达耦合的强大转换/放大机制。本公开提供了这样的转换/放大机制，使得适体和报告基因(或者例如转基因)可被高效地耦合以检测活细胞中的特定分子标记或者控制转基因的表达。如本文所述，一个实施方案涉及通过配体-适体相互作用调节polyA信号切割。

[0063] 当在本说明书中与词语包含、包括所述项一起使用的词语“一个/种(a)”和“一个/种(an)”表示“一个/种或多个/种”。本公开的一些实施方案可由一个或多个本公开的元件、方法步骤和/或方法组成或基本上由其组成。可以预期的是，可对公开的本文所述的任何其它方法或组合物实施本文描述的任何方法或组合物，并且在不脱离本公开的精神和范围的情况下仍然获得相同或类似的结果。

[0064] 本公开涉及利用polyA切割的能力来生成高效的分子开关，其将使得能够灵敏地检测哺乳动物细胞中的特定分子标记或状态或者例如将使用小分子诸如药物或药物样分子来控制哺乳动物细胞中转基因的表达。工程化的分子开关可以通过适体介导的多腺苷酸化调节来控制报告基因或转基因(例如)的表达(图1A和1B)。多腺苷酸化是在所有哺乳动物细胞中普遍存在的必需mRNA加工机制。哺乳动物polyA信号通常位于3'非翻译区(UTR)。当在polyA位点从未以正常转录单元定位于其中的5'UTR处人工产生新的polyA位点时，该polyA信号的高效切割导致mRNA的破坏并因此丧失基因表达。然而，配体分子与工程化的polyA信号的结合有效地阻断了切割，导致完整mRNA的保存，从而使得能够诱导基因表达。

[0065] I.基于PolyA的开关的一般实施方案

[0066] 本公开涉及通常和有意地使用在除可表达的多核苷酸诸如基因的3'非翻译区(UTR)外的位置处存在于表达构建体的polyA信号的系统。在具体的实施方案中，polyA信号的异位定位允许利用本公开的系统来调节可表达的目标多核苷酸。在特定的实施方案中，polyA信号位于表达的多核苷酸(mRNA)的翻译起始位点的上游，并且在特定的实施方案中，polyA信号位于mRNA的5'UTR中。在具体的实施方案中，可表达的多核苷酸能够被RNA聚合酶II转录。在特定的实施方案中，表达构建体的设计有意地将polyA信号定位于可表达的多核苷酸的5'UTR。

[0067] 在某些实施方案中，5'UTR中polyA信号的存在靶向mRNA以降解，并且这种能力被利用在本公开的系统中。在具体的实施方案中，polyA信号与一种或多种配体可以结合的适体缔合，并且配体与适体的结合指示mRNA是否被降解。在特定的实施方案中，当希望mRNA表达时，提供结合适体的配体。在一些情况下，特定环境(例如细胞、组织或生物体)中是否存在配体的问题通过特定的可表达的多核苷酸在被特定的polyA/适体调节后是否表达来回答，所述特定的polyA/适体可被该配体结合。在其中配体结合适体并且mRNA被表达的实施方案中，该系统允许放大信号，因为可以从单个mRNA产生多个基因产物。

[0068] 如图1A和1B所示，特定配体与适体的结合阻断polyA切割，导致完整mRNA的保存并因此导致报告信号(诸如在本公开的生物传感器系统中)或特定基因诸如治疗性基因(诸如在本公开的基因调节系统中)的表达；配体可以是任何种类的，例如包括蛋白质或小分子。在具体的实施方案中，用于生物传感器实施方案的系统的配体对于特定细胞、组织或生物而言是内源性的，而用于基因调节系统的系统的配体不一定是内源性配体。

[0069] 在特定的实施方案中，在包含polyA信号的构建体中，适体在其内包含polyA信号。在一些实施方案中，适体包含一个或多个polyA信号，诸如一个、两个、三个或更多个polyA信号(参见图11)。CACACA替代AAUAAA在很大程度上使polyA信号失活，因此与当polyA信号被阻断时的基因表达水平的理论上限相似。将CACACA对比AAUAAA的表达水平的比率用于估计基因诱导倍数的理论动态范围。在一些情况下，polyA信号具有修饰，诸如与标准AAUAAA序列相比在序列中具有一个、两个或更多个改变。例如，代替AAUAAA，可使用另一序列，包括至少AUUAAA、AGUAAA、UAUAAA、CAUAAA、GAUAAA、AAUAUA、AAUACA、AAUAGA、AAAAAG或ACUAAA。在其中在构建体中利用两个或更多个polyA信号的实施方案中，polyA信号可以相同或可以不同。

[0070] 在特定的实施方案中，将靠近polyA切割位点的RNA结构的调节用来增强polyA切割的活性和/或增强配体结合。在具体的实施方案中，优化polyA信号在适体中或其附近的放置以允许改进的polyA位点切割和/或配体与适体的结合(例如参见图12)。可优化适体内polyA位点的间隔，并且所述间隔可以通常位于或可以通常不位于适体中心。polyA信号的位置可以使得适体的侧翼侧能够并置在彼此附近以允许配体与适体结合(参见图6，仅作为实例)。

[0071] 在包含polyA信号的构建体的实施方案中，可利用一个或多个其它序列来增强配体的结合和/或增强在polyA切割位点处的切割。在特定的实施方案中，包含polyA信号的构建体还在polyA信号的下游包含一个、两个、三个或更多个富含G的区域。在特定的实施方案中，包含polyA信号的构建体还在polyA信号的下游包含一个、两个、三个或更多个富含U/UG的区域。在某些实施方案中，一个或多个富含G的区域位于至少一个富含U/UG的区域的下游。在特定的实施方案中，特定适体中的一个或多个特定茎或环的长度和/或polyA信号、富含G的区域和/或富含U/UG的区域的位置可影响调节效率(图5、10、13-25)，并且技术人员可采用常规方法来优化合适的构型。

[0072] 包含polyA开关的构建体的放置可以通过任何合适的方式进行，但在特定的实施方案中，构建体存在于细胞、组织或生物体中并且可以外源地存在于载体(诸如病毒载体(腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、慢病毒等)或质粒)上，或者其可存在于细胞的基因组内。可以以裸核酸的形式向靶细胞、组织或生物体提供包含polyA开关和可表达的多核苷酸的多核苷酸，可将它们包含在合适的载体(诸如脂质体或纳米颗粒)中，或者可将它们包含在其本身可具有合适的运载体的载体上。

[0073] 在具体的实施方案中，例如，设计适体以使其结合特定的配体，或者其可以通过筛选适体文库来获得，或者其可由现有的适体进行建模。可修饰适体的不同区域以优化配体的结合和/或在polyA位点处的切割。在特定的实施方案中，polyA信号的位置与polyA切割的效率有关(参见，例如图8)。在一个实例中，调节适体A8(参见图13-15)并考虑所产生的对效力的作用。再次地，作为实例，表1显示了基于示例性A8适体的配体结合位点的突变分析结果。

[0074]

[0075] 本领域技术人员知道生成用于以高亲和力靶向化合物的常规方法7-12。

[0076] 在具体实施方案中，采用了利用两个或更多个单独的polyA开关的系统。在其中第一与第二适体不相同并且其中第一与第二配体不相同的特定实施方案中，一种polyA构建体可以响应于结合第一配体的第一适体，并且另一种polyA构建体可以响应于结合第二配体的第二适体。在其它情况下，具有多个适体的polyA构建体可响应于相同配体。

[0077] II.生物传感器系统的实施方案

[0078] 本公开提供了在本文中用作生物传感器方法的基于5'UTR polyA的RNA开关，其相对于用于检测活细胞中的细胞内标记的现有技术提供了几个至关重要的有利方面。首先，本文显示来自此类传感器的报告信号在活的人细胞中表现出极低的泄漏表达，并且在检测到特定配体蛋白时，信号被有效地诱导超过100倍。该信噪比比率比以前在活的人细胞中实现的要高至少一个数量级，从而给出了将允许在各种实验环境中进行新应用的动态范围。其次，polyA传感器使得能够在活细胞中无创检测内源蛋白质/对内源蛋白质进行成像而无需标记、标签或染色剂，从而解决了以前难以解决的一类测量问题。最后，通过高效地将现有的适体技术与当前的成像报告系统结合起来，该方法使得平台能够用于通过分子成像检测广泛的蛋白质配体。polyA传感器因此提供独特的体内检测分子标记的能力，在分子检测方面具有比目前可能的显著更广泛的应用，甚至可使用临床上适用的成像(即，PET、MRI、NIRF)报告探针将其转换用于临床。

[0079] 例如，此类生物传感器提供关于疾病中特定配体水平的空间及时间信息，并且输入信息可用于调节细胞行为以实现治疗目标。例如，polyA生物传感器的实例是经工程化以识别葡萄糖作为其配体，并且作为响应，调节工程化的胰岛素蛋白的表达以调节糖尿病患者的葡萄糖水平的polyA生物传感器。类似的polyA生物传感器还可用作安全开关。例如，可对生物传感器进行工程化以检测干细胞中癌症生物标志物的存在。当正常干细胞错误地转化为癌细胞时，生物传感器会开启自杀基因以实现自我毁灭。

[0080] 在特定的实施方案中，当用于生物传感器系统中时，用于基于polyA的开关的配体分子的实例包括至少细胞代谢物；核酸(包括调节核酸，诸如miRNA或RNA干扰分子(shRNA或siRNA))；小分子；细胞蛋白质(例如，与疾病状态相关的蛋白质，例如包括癌症蛋白质)或通过病毒感染产生的病毒蛋白质。

[0081] 在一些实施方案中，可表达的多核苷酸编码报告基因产物或治疗性基因产物。在一些实施方案中，可将报告基因产物与治疗性基因产物融合为融合蛋白。在其它实施方案中，使用IRES从单个mRNA分开翻译报告基因产物和治疗性基因产物的表达。报告基因的实例包括萤光素酶、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶等。治疗性基因的实例包括胰岛素、生长激素、肌营养不良蛋白、白蛋白、因子IX等。在其它情况下，该系统利用编码报告基因产物的可表达的多核苷酸和编码治疗性基因产物的单独的可表达的多核苷酸，并且它们的表达可由相同或不同的配体-结合适体控制。报告基因产物和治疗性基因产物的构建体可存在于相同的载体上或在不同的载体上。

[0082] 在某些实施方案中，多核苷酸包含以线性方式按5'至3'方向可操作地连接的2个、3个、4个、5个或更多个适体。适体可以具有或可以不具有基本上相同的序列或结构，并且每个可以包含或可以不包含polyA信号。当多个polyA信号存在于一个适体内或多个适体内时，polyA信号可以相同或可以不同。在具体的实施方案中，单个多核苷酸包含多个适体，但仅包含一个富含G的区域，并且富含G的区域在一些情况下可以存在于多核苷酸上的任何适体上，但在特定情况下在多核苷酸的5'至3'方向上存在于第二适体中，或者位于分子的最
3'适体上。包含两个或更多个适体的多核苷酸的折叠可以根据各种因素(包括多核苷酸的长度及其序列)而变化，但在特定情况下，单个多核苷酸能够通过多于一种折叠构型起作用。在特定的实施方案中，多核苷酸被配置来使得适体在适体之间不具有任何碱基配对(例如，图26中的左图)，尽管在其它情况下在适体之间存在至少一些碱基配对(包括沿着适配体的大部分序列)，例如图26中的右图。在一些折叠构型中，一个适体的茎环被配置来与相同分子中的另一个适体的茎环中相对(参见图26的右图)。

[0083] 在一些实施方案中，包含两个或更多个适配体的多核苷酸通过特定序列以5'至3'方向线性分离。该确定的序列可以是随机的或可以被定义的，诸如富含G的区域。在特定情况下，两个环之间按5'至3'方向的线性长度具有特定的长度。例如，两个环之间的核苷酸数量可以是10-25个、10-24个、10-23个、10-22个、10-21个、10-20个、10-19个、10-18个、10-17个、10-16个、10-15个、10-14个、10-13个、10-12个、10-11个、11-25个、11-24个、11-23个、11-22个、11-21个、11-20个、11-19个、11-18个、11-17个、11-16个、11-15个、11-14个、11-13个、11-12个、12-25个、12-24个、12-23个、12-22个、12-21个、12-20个、12-19个、12-18个、
12-17个、12-16个、12-15个、12-14个、12-13个、13-25个、13-24个、13-23个、13-22个、13-21个、13-20个、13-19个、13-18个、13-17个、13-16个、13-15个、13-14个、14-25个、14-24个、
14-23个、14-22个、14-21个、14-20个、14-19个、14-18个、14-17个、14-16个、14-15个、15-25个、15-24个、15-23个、15-22个、15-21个、15-20个、15-19个、15-18个、15-17个、15-16个、
16-25个、16-24个、16-23个、16-22个、16-21个、16-20个、16-19个、16-18个、16-17个、17-25个、17-24个、17-23个、17-22个、17-21个、17-20个、17-19个、17-18个、18-25个、18-24个、
18-23个、18-22个、18-21个、18-20个、18-19个、19-25个、19-24个、19-23个、19-22个、19-21个、19-20个、20-25个、20-24个、20-23个、20-22个、20-21个、21-25个、21-24个、21-23个、
21-22个、22-25个、22-24个、22-23个、23-25个、23-24或24-25个核苷酸。适体或多核苷酸中两个环之间的核苷酸数量可以是10、11、12、13、14、15,1 6、17、18、19、20、21、22、23、24或
25。在特定情况下，在其中在两个不同适体的至少一部分之间存在碱基配对的多个适体的构型中，一个环与另一个环之间的距离(并且包括适体的茎环2序列)(参见图26)为例如10-
25个核苷酸，包括18-20个核苷酸。

[0084] III.生物传感器系统的使用方法

[0085] 在本公开的实施例中，存在利用本公开的系统来感测或检测特定的期望的生物状态，包括例如用于检测特定位置或环境(包括某些细胞、组织和/或生物体)中是否存在一种或多种组合物的方法。生物传感器系统可以以空间和/或时间方式提供关于特定环境或位置的信息。生物传感器系统可以提供关于特定疾病状态或其易感性或风险的信息。生物传感器系统可以用于确定个体是否具有特定疾病或处于患有特定疾病的风险中或个体是否会响应于疾病的疗法的方法中。生物传感器系统可以提供某种疗法是否对个体有效的信息。

[0086] 在具体的实施方案中，生物传感器系统的配体对于细胞、组织或个体是内源性的。配体可以或不可以在所有时间和所有组织中内源性表达。内源性配体可以以组织特异性或时间特异性方式表达。在某些实施方案中，将包含系统的多核苷酸的载体靶向个体中的某个组织或区域，其中该组织或区域疑似具有或不具有特定的内源性配体。

[0087] 在其中使用生物传感器系统的实施方案中，可表达的多核苷酸的表达可由除polyA开关外的一种或多种实体调节。也就是说，在某些情况下，可存在允许或抑制在某些环境或某些时间背景(诸如生物发育的某些状态或疾病阶段)中的表达的一种或多种转录元件。在其中希望polyA开关系统的表达在特定环境中发生的情况下，多核苷酸的表达可由组织特异性启动子调节。组织特异性启动子的选择可以由所讨论的环境决定，组织特异性启动子的实例在本领域中是已知的，并且可以在例如TiProD等数据库中获得。

[0088] 在其中希望确定一种或多种疗法是否对个体有效的情况下，可以在提供治疗之前在个体中使用该系统，诸如以检测是否存在用于所述疗法的特定的指示化合物治疗，然后在提供所述疗法一次或多次后，可将该系统用于个体以检测特定的指示化合物是否存在。在其它实施方案中，直至向个体提供一次或多次治疗后，才将该系统用于监测疗法，诸如以鉴别是否存在指示治疗功效的特定化合物。

[0089] 在一些情况下，将生物传感器系统用来提供信息，但在其它实施方案中，可将生物传感器系统用于治疗目的(并且任选地也可提供信息)。例如，所述系统可以能够将代谢物识别为配体，并且在代谢物配体与适体结合时允许基因产物表达，这为所述代谢物为其标志物(或其存在或水平是指示医学病况或对其的易感性)的医学病况提供疗法。在其它实施方案中，可表达的多核苷酸本身不是治疗性基因产物，而是当存在指示有害医学病况或其易感性或风险的配体时表达的自杀基因产物；在特定的实施方案中，例如，配体存在于癌细胞或癌前细胞中。

[0090] 可调节本公开的生物传感器系统中的适体的配体的实例至少包括细胞代谢物、小RNA(诸如miRNA)、正常和异常细胞蛋白质、由病毒和其它病原体表达的外来蛋白、诱导细胞死亡的自杀蛋白等等。

[0091] 可以调节本公开的生物传感器系统中的适体的配体的实例至少包括细胞代谢物、小RNA(诸如miRNA)、细胞蛋白质等等。

[0092] IV.基因调节系统的实施方案

[0093] 为了阐明特定基因产物的功能或控制特定蛋白质的水平以实现治疗作用，控制基因表达的能力一直是有用的。在本公开的实施方案中，当polyA开关嵌入mRNA的5'UTR中时，polyA信号的切割导致mRNA的破坏并因此丧失转基因表达。能够抑制polyA开关的小药物样分子(例如)导致完整mRNA的保存，并因此诱导基因表达。如本文中别处所述，由此类开关控制的转基因表达在活的人细胞中表现出极低的泄漏表达，并且在施用小分子(在该情况下为四环素)时，转基因表达被有效诱导超过30倍。例如，可以进行该基因调节系统的优化和推广以导致许多定制的基因调节系统(每个调节系统都由配体诸如FDA批准的小分子药物控制)的生成。与基于使用反式激活因子的转录控制的当前基因调节系统相反，本文所述的基于polyA的系统不需要任何蛋白反式激活因子产物(其可导致严重的宿主免疫应答)的表达，并且不依赖于任何专门的启动子元件的使用，因此代表可被‘嵌入’任何内源性基因或工程化的载体转录单元的‘便携式’调节系统。因此，该系统只需要一个转录单元(一个表达构建体)，并且是启动子灵活的，使得其可用于以组织特异性(空间)和时间方式调节转基因。将安全小分子与基于RNA的非免疫原性polyA开关组合的此类基因调节系统可更安全地用于临床应用以及生物学研究。

[0094] 在特定的实施方案中，基因调节系统利用小分子化合物作为基于polyA的开关的配体分子。小化合物的实例包括四环素或四环素类似物(例如，诸如多西环素、地美环素、米诺环素、氯-四环素、山环素、美他环素或替加环素)或其功能性衍生物；氨基糖苷类或其功能衍生物；雷帕霉素或其功能性衍生物(例如，依维莫司、坦西莫司、地磷莫司(deforolimus)、雷帕霉素)；和FDA批准的药物或其功能性衍生物。在基因调节系统的其它实施方案中，使用不同于小分子的配体，诸如蛋白质、肽、核酸等，并且在特定的实施方案中，该系统被提供在合适的载体中。

[0095] 在某些实施方案中，基因调节系统利用两种或更多种适体来单独响应不同的配体，例如不同的四环素类似物。也就是说，如果一个polyA开关系统可被产生来对配体诸如四环素做出响应，那么可通过突变适体RNA序列以响应不同的四环素类似物(多西环素等)来生成许多定制的基因调节系统。

[0096] 在一些实施方案中，可表达的多核苷酸编码报告基因产物或治疗性基因产物。在一些实施方案中，可将报告基因产物与治疗性基因产物融合为融合蛋白。在其它实施方案中，使用IRES从单个mRNA分开翻译报告基因产物和治疗性基因产物的表达。报告基因的实例包括萤光素酶、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶等。治疗性基因的实例包括胰岛素、生长激素、肌营养不良蛋白、白蛋白、因子IX等。在其它情况下，该系统利用编码报告基因产物的可表达的多核苷酸和编码治疗性基因产物的单独的可表达的多核苷酸，并且它们的表达可由相同或不同的配体-结合适体控制。报告基因产物和治疗性基因产物的构建体可存在于相同的载体上或在不同的载体上。

[0097] V.基因调节系统的使用方法

[0098] 在特定的实施方案中，本公开的系统可用于基因调节应用，其中希望特定的可表达的多核苷酸在特定位置和/或在特定事件或时间表达。在某些实施方案中，基因表达的控制允许确定特定基因产物的功能，而在其它实施方案中，基因表达的控制提供治疗益处。在某些情况下，不希望转基因的可表达的多核苷酸表达(诸如在某些时间和/或位置)，并且可以不将配体与转基因一起提供，或者可抑制其表达，直至希望配体表达以允许与转基因的适体结合以进行其表达(例如，用某些调节元件)。

[0099] 在某些实施方案中，基因调节系统实施方案的配体对于特定的细胞、组织或生物而言不是内源性的。在具体的实施方案中，用于基因调节的系统中的配体是药物或药物样分子(在至少一些实施方案中，药物样被定义为分子量通常低于500道尔顿的小分子化合物)。在具体的实施方案中，将基因调节系统中的配体以任何合适的方式(诸如口服、肌内、通过吸入等)之一提供给个体。

[0100] 在某些实施方案中，基于polyA开关的基因调节系统可被配置为具有负反馈回路和正反馈回路的自动调节系统。通过其自身产物调节基因称为自动调节，其可为应用产生独特的性质。在特定实施例中，polyA开关可被配置为用作自动调节系统。也就是说，处于polyA开关控制下的基因产物可以正向或负向调节其自身表达。当基因产物抑制其自身表达时发生负向自动调节。已知这增加了稳态表达的稳健性并减少了细胞中基因表达水平的波动。(1)可用polyA开关配置的负向自动调节的一个实例是设计用于检测葡萄糖的生物传感器系统。在该情况下，用识别葡萄糖作为其配体，并且响应于葡萄糖结合而开启编码胰岛素蛋白质的转基因的表达的适体对polyA开关进行工程化。诱导的胰岛素表达降低了葡萄糖水平，这又减少了胰岛素的表达。相反，当基因产物促进其自身表达时发生正向自动调节。已知这产生双稳态。也就是说，一旦转基因被其配体激活，即使在原始输入配体消失后，其也可以被锁定在高表达状态并使其自身保持开启状态(2-6)。利用polyA开关配置的正反馈系统的一个实例是设计用于检测病毒tat蛋白的生物传感器系统。在该情况下，用识别tat作为其配体，并且响应于tat结合，开启编码tat蛋白的转基因的表达的适体对polyA开关进行工程化。tat蛋白的初始引入诱导更多tat蛋白表达。这建立了正反馈回路，并将系统锁定在高表达状态并使其自身保持开启状态。

[0101] VI.本公开的试剂盒

[0102] 可将本文所述的任何组合物包含在试剂盒中。在非限制性实例中，可将本公开涵盖的任何多核苷酸、配体或载体包含在试剂盒中。

[0103] 试剂盒可包含本公开的适当等分的组合物。可将试剂盒的组分以水性介质或冻干形式包装。试剂盒的容器装置通常将包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器装置，可将组分放置在其中，并且优选合适地进行等分。当试剂盒中有多于一种组分时，试剂盒通常还会包含第二个、第三个或其它额外的容器，可在所述容器中单独放置额外的组分。然而，可将组分的各种组合包含在小瓶中。本发明的试剂盒通常还包括用于以严格密封方式容纳容器以便商业销售的装置。例如，此类容器可包括将所需小瓶保留在其中的注射或吹塑的塑料容器。

[0104] 当在一种和/或多种液体溶液中提供试剂盒的组分时，液体溶液是水溶液，特别优选的是无菌水溶液。还可将组合物配制成可注射组合物。在该情况下，容器装置本身可以是注射器、移液管和/或其它类似的装置，可从其将制剂施用于身体的感染区域，注射入动物体内和/或甚至应用于试剂盒的另外的组分/或与试剂盒的另外组分混合。然而，可将试剂盒的组分作为干粉形式提供。当试剂和/或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重构粉末。可以设想，还可将溶剂在另一个容器装置中提供。实施例

[0105] 包括以下实施例以说明本公开的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本公开的实践中发挥良好作用的技术，并且因此可被认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应该理解，可以在公开的特定实施例中做出许多改变，并且在不脱离本公开的精神和范围的情况下仍然获得相似或类似的结果。

[0106] 实施例1

[0107] 本公开的创新

[0108] 利用polyA切割的能力来产生细胞内传感器系统

[0109] 多腺苷酸化是普遍存在于所有哺乳动物细胞中的必需mRNA加工机制。除组蛋白基因外，所有哺乳动物蛋白质编码mRNA均含有由约200-300个腺苷残基组成的3'末端30,31。polyA尾的形成涉及两个连续的步骤：切割前mRNA，随后向新切割的3'末端添加polyA尾。该多腺苷酸化过程由存在于前mRNA上的序列元件以及由多种多聚体蛋白质因子组成的多腺苷酸化机器来指导。在添加polyA尾之前，必须切割前mRNA。切割位点位于高度保守的AAUAAA信号与下游富含U或GU的基序之间(图2)。在‘A’核苷酸之后优先发生切割32。重要的是，切割的3'RNA片段由于缺少帽结构而迅速降解。

[0110] 一些报告指出，polyA位点内的RNA二级结构可以深刻地影响哺乳动物细胞中的多6,33,34
腺苷酸化效率。一项研究报告，通过简单地将切割位点隐藏在稳定化的RNA茎中，可使切割/多腺苷酸化的程度大大降低6(图3)。这表明可以通过局部RNA结构高效地控制切割。
在一个实施方案中，检测蛋白质结合和控制报告基因表达基于polyA切割位点附近的RNA结构的这种简单而有效的调节。如图1中所示，当在5'UTR处人工产生新的polyA位点时(所述新的polyA位点从未位于正常转录单元中)，由于切割的且未加帽的3'mRNA片段的快速降解，该polyA信号的高效切割导致mRNA的破坏以及报告基因表达的丧失。与在3'UTR处位于基因后面的正常polyA信号不同，5'UTR处人工插入的polyA信号用作mRNA中的“自杀单元”。
可以通过在切割位点插入适体来挽救mRNA自杀。特定配体与适体的结合阻断了切割，导致完整mRNA的保存，并因此表达报告信号或转基因产物。如本文其它地方所述，此类polyA切割介导的传感器通过经由适体结合对配体的动态感应而提供了特异度以及由于报告基因或转基因的配体依赖性指数扩增而提供了灵敏度。

[0111] polyA传感器作为遗传上可编码成像工具的有利方面

[0112] 可将polyA传感器序列编码为呈质粒或病毒载体形式的DNA用于递送(例如)，或将其遗传工程改造至细胞(诸如干细胞或癌细胞)或小鼠的基因组中以用于移植和转基因应用。遗传编码的传感器的一个关键有利方面是在体内限制它们的空间分布并控制它们的时间间隔的能力。与可以无意中对大面积的非靶向组织染色的化学染料探针不同，可以通过使用DNA载体中包含的组织特异性启动子将RNA传感器的表达有效地限制于靶细胞或组织。在特定的实施方案中，这些额外的安全特征将显著最小化由传感器与其靶配体结合造成的潜在副作用，以及降低体内背景噪音。此外，与缺乏信号放大的检测方法不同，细胞中单个编码的DNA拷贝可生成数百个相同的RNA传感器，这又可生成数千个报告蛋白，并且通过报告蛋白的进一步酶促反应，这可导致信号的指数放大。

[0113] PolyA传感器可以桥接用于体内监测分子标记的关键屏障

[0114] polyA传感器提供了通过将感测、放大与体内信号检测/成像联系起来监测天然蛋白质的亟需机制。如上所述，因为蛋白质含有丰富的用于化学相互作用的官能团，所以用于产生用于以高亲和力靶向蛋白质的适体的方法已被良好地建立7-12。例如，适体已被产生来特异性地结合HIV tat蛋白35,36、凝血酶37、血管内皮生长因子38、DNA修复蛋白Ku39和肿瘤调节剂骨桥蛋白40等。适体的特异性甚至允许识别相同蛋白质的不同同种型，诸如转录因子NF-kB的P50和P65同种型41,42，或蛋白激酶ERK2的未磷酸化和磷酸化形式43。这些实例证明了适体在识别疾病相关蛋白及其代谢状态中的有效性。

[0115] 成像报告分子领域也在快速发展。例如，GFP已将生物学的许多领域演化为基因表达的报告分子，尽管它们的用于体内成像的用途主要由于光学成像的组织渗透限制而被限制于透明组织。已开发了具有能够穿透深部组织并适合全身成像的激发/发射波长的工程化的红外荧光蛋白(IFP)44。此外，已经证明与放射性底物[18F]FHBG偶联的胸苷激酶可用于临床环境中的体内PET成像45-47。最近，新的磁共振成像(MRI)方法被开发来监测体内GFP的表达，为通过磁共振无创成像提供了GFP的新用途48。

[0116] 基于适体的感测和基于报告分子的检测/成像因此在它们的预期功能中是强大的，但组合起来甚至更强大，诸如在体内检测分子标记中。所缺乏的是能够将这两个功能联系起来并将‘适体感测’转换成可通过现有成像模式或其它检测方法检测的‘报告分子表达’的强大生物放大器。实现这一点的实施方案的一般方案示于图4中。为了监测特定蛋白质配体，首先通过体外进化产生高亲和力的适体。用作生物放大器的polyA开关将适体与成像报告分子相连接，形成传感装置。可将此类感测装置编码在DNA载体中，并使用适当的病毒或非病毒转移方法将其递送至靶细胞/组织。在细胞配体存在的情况下，适体结合通过报告基因的配体依赖性指数放大生成强信号。重要的是，适体的灵活性允许检测广泛的天然蛋白质的可能性，并且报告分子选择的灵活性允许通过不同的检测模式进行可视化。所提出的polyA传感器因此使得能够利用现有技术来提供灵活的无创体内分子检测策略，其依赖于天然分子标记的存在和浓度。

[0117] 在过去的十年中，从高通量测序和DNA微阵列获得的基因表达数据的爆炸已提供了数百种蛋白质及其突变体同种型，所述蛋白质和其突变体同种型可在将来用作疾病的生物标志物。体内探测分子标记不仅有助于诊断，而且还可提供细胞增殖、代谢变化以及基于特定蛋白质生物标志物的升高的治疗反应(例如)的测量。在某些实施方案中，polyA传感器解决了先前难以解决的这类测量，并且在分子检测中提供了比当前可能的显著更广泛的应用。

[0118] 在具体的实施方案中，本公开的方法和组合物提供了精确控制转基因表达但避免对目前使用的基因表达试剂诸如杂合转录反式激活因子和专门的启动子的依赖的能力。在特定的实施方案中，本发明方法避免必须利用多于一种表达构建体，由于表达杂合反式激活因子而避免潜在的毒性(包括诱导针对作为外源蛋白的反式激活因子的宿主免疫应答，避免对专门的启动子的需要的困难，以及避免必须使用有限数量的可用于实验性和治疗性应用的小诱导物分子(因为可用系统的数量有限))。

[0119] 相反，本公开的本发明的基于polyA的系统不需要表达任何蛋白质反式激活因子产物，并且不依赖于任何专门的启动子元件的使用。因此，其提供了‘便携式’调节系统，其可被‘嵌入’任何内源基因或工程化的载体转录单元。因此，该系统仅需要一个转录单元(一个表达构建体)，并且其启动子是灵活的，以便其可用于以组织特异性(空间)和时间方式调节转基因。存在于所有哺乳动物细胞中的多腺苷酸化的通用性质允许该系统具有广泛适用性。

[0120] 实施例2

[0121] 初步的示例性研究

[0122] 本实施例中描述的初步研究证实了polyA传感器系统的开发。具体而言，通过分析大量polyA信号，开发了polyA切割介导的传感器，当嵌入标准表达载体的5'UTR时，该传感器在人细胞中被高效地切割。重要的是，本文描述了经设计来结合特定配体(作为传感器的一部分)而不影响polyA切割效率的适体序列。最后，通过在活的人细胞中共表达配体蛋白，感受器很容易检测到其配体，导致报告信号增加超过一百倍。所述结果表明，特定的无标记细胞内蛋白质的检测容易在活的人细胞中实现，并且通过信噪比测量的诱导程度代表了对许多应用有用的范围。

[0123] 在人细胞中于5'UTR处高效发挥功能的polyA基序的鉴定

[0124] 通过调节polyA切割来检测蛋白质和对其进行成像的一般策略关键取决于5'UTR处的polyA信号的高效切割(图1)。第一步是测试候选polyA信号和相关的上游及下游基序，所述基序使得能够在细胞中进行高效polyA切割。为了测试polyA切割效率，将涉及哺乳动物表达载体49的转瞬时转染测定与GFP或萤光素酶报告分子一起使用(仅作为实例)。将候选polyA信号序列克隆至表达载体内的报告基因或转基因的5'UTR处。还制备了具有无活性polyA信号(AAUAAA至CACACA突变)50的对照载体以提供表达水平的上限，在转染人HEK293T细胞后将活性polyA信号的切割效率与所述表达水平的上限相比较。

[0125] 许多不同的polyA信号和相关的上游及下游基序被用于初始分析。尽管所测试的这些polyA信号中的大多数在某种程度上似乎在人细胞中起作用，如通过它们在5'UTR处不同程度地抑制报告基因表达的能力所反映的，但在特定实施方案中，由Proudfoot实验室51公布的一种合成polyA在测试条件下是特别有用的。基于其明显更高的切割活性水平，该polyA被用于进一步的研究目的。为了提高切割活性的效率，对polyA序列进行一系列修饰并进行评估。最值得注意的是，polyA位点下游富含G的序列52的定位可能地通过由富含G的序列引起的转录的短暂暂停显著增强了切割53,54。将富含G的区域的拷贝数从1增加至2进一步增强了切割。串联放置两个拷贝的‘AAUAAA’也明显增加了切割(参见图5)。将含有‘2AAUAAA+间隔子+富含G/U的区域+2个富含G的区域’的组合的所得polyA构型在随后研究中用作一般模板。

[0126] 在具体的实施方案中，将‘AAUAAA’与富含G/U的区域之间的间隔子的长度从14个碱基改变为25个碱基，或者用适体替代间隔子，对polyA切割效率几无影响，表明间隔子的长度在测试范围内是灵活的，可以适应具有不同长度的适体序列。因此，在人细胞中，polyA信号可在5'UTR中被有效地切割，并且间隔子内的一些序列改变被良好地耐受。

[0127] 将适体工程化至基于polyA的传感器中以检测人细胞中的细胞内配体的努力[0128] 已证明polyA信号在细胞中于5'UTR处切割的能力，在特定的实施方案中，将配体-结合适体设计为polyA传感器的一部分。这使得传感器能够结合特定的蛋白质配体，导致切割的抑制并因此诱导报告分子表达。作为特定的实施方案，利用了结合HIV tat蛋白的适体。该结合是简单的一对一相互作用，不涉及其它辅因子，并且具有与抗体所达到的亲和力相当的0.1nM35,36的解离常数Kd。为了产生高效的传感器，使用称为“夹持”的工程原理，利用'合理设计'方法(图6)。此处，将适体在策略上定位于AAUAAA信号的两侧，并替代大部分间隔子区域。所得RNA经设计来在两个主要构象之间切换：其中配体与传感器结合并因此“夹持”间隔子区域的构象；其中传感器未被结合并且间隔子主要以单链形式存在的构象。在第一个构象中，配体结合有效地将间隔子锁定在稳定的双链茎结构中，这显著地减少polyA介导的切割6,33,34。此外，配体物理地对接在切割位点上，基本上阻断了对启动切割所需的与polyA缔合的细胞蛋白质的接近。

[0129] 基于这种‘夹持’原理，设计了多于40种不同的构建体，其中调节间隔子的稳定性和长度以及间隔子内适体的位置以最大化‘结合’(配体存在，不切割)与‘未结合’(配体不存在，切割)状态之间的报告分子活性的比率。在人体细胞中测试这一系列设计表明，这种“夹持”策略导致具有出色的开关行为的高度灵敏的传感器。一种设计显示在未结合状态下的非常低的泄漏表达以及在细胞中存在配体时报告基因信号的强烈诱导(参见下文)。上述工程实施方案产生了高效的基于polyA的传感器系统，因为它们建立了如何高效地利用工程化的RNA来构建功能性传感器/放大器以用于检测活细胞中的细胞内配体的实例。

[0130] polyA传感器在细胞中响应于细胞配体的功能的证明

[0131] 对于工程化的polyA传感器，已显示将表达配体的载体与传感器载体一起转染至293T细胞中，导致萤光素酶报告信号的急剧增加(图7)。在配体不存在的情况下，来自此类传感器的报告信号表现出非常低的泄漏表达(图7a，低于无活性polyA对照的表达水平的
1％)。这种泄漏表达为诱导“倍数”(作为在配体存在的情况下对比在配体不存在的情况下的报告信号的比率)的计算提供了基础水平。重要的是，传感器的响应是‘可调谐的’，并且以剂量依赖性方式反映细胞中配体的量。此外，使用无活性polyA传感器的表达水平作为参考(图7A)，诱导达到高达理论可诱导的范围的120倍(图7b)或约76％。该诱导程度比之前已在活的人细胞中实现的高至约两个数量级，并且足以形成传感器平台的基础。相反，在用无活性polyA或无嵌入polyA传感器的亲本载体转染的细胞中未观察到显著的诱导(图7B)，这表明负责诱导的机制确实通过polyA信号介导。

[0132] 为了确定在mRNA水平上，响应也与所提出的机制一致，对响应于配体结合的萤光素酶mRNA进行RNA印迹分析。如图7C所示，在配体不存在的情况下(泳道4)，未观察到萤光素酶mRNA，表明切割的mRNA被迅速降解。相反，配体的存在显著增加萤光素酶mRNA的量(泳道5)。此外，在具有活性传感器的细胞(与泳道1相比的泳道4、5)中观察到略高于参照切割的
5'片段的条带，这表明所述切割的5'片段被多腺苷酸化。使用RT-PCR，随后使用cDNA测序来确认polyA尾确实被添加在5'切割的片段末端的预期切割位点。总之，结果与配体结合阻断polyA切割并保留完整mRNA(以用于诱导)的机制密切相符。

[0133] 基于RNA的传感器在体内的效用的先前证明

[0134] 已进行了基于在体内有效发挥功能的锤头状核酶的自切割的另一种RNA传感器的4,55
体内研究。这种核酶被用于构建RNA传感器，在所述RNA传感器中，嵌入5'UTR的核酶的自发自切割导致mRNA的破坏并因此丧失报告基因表达。丰加霉素(一种核酶的小分子抑制剂)的存在阻断了核酶的自切割，导致完整mRNA的保存，从而诱导报告分子表达。为了证明基于核酶的传感器在体内的功能，生成编码基于核酶的RNA传感器的重组腺相关病毒(AAV)，并将其递送至裸小鼠的眼(作为宿主组织)中。作为对照，将编码无活性核酶的AAV递送至病毒以感染腘绳肌。然后通过包埋在小鼠背部皮肤下的药物小丸施用分子丰加霉素。使用IVIS200成像仪对小鼠进行成像以提供基于光子检测的荧光素酶表达的定量测量56,57。在丰加霉素处理之前和之后拍摄的小鼠的代表性图像显示，该传感器能够检测视网膜中的丰加霉素的存在并且使诱导的荧光素酶报告基因表达下降高达180倍4。相反，在具有无活性核酶的肌肉中未观察到荧光素酶表达增加。这些结果表明，在病毒载体中编码并被递送至靶组织的RNA传感器能够在体内有效地发挥功能，并且通过全身成像可以容易地检测到诱导的报告信号的强度。虽然这些研究没有使用适体或polyA切割作为机制，但可改进用于体内成像的一般实验装置以证明polyA传感器在活小鼠中的效用。

[0135] 被开发用于HIV tat的优化的传感器是可用于在体内检测HIV感染的血细胞或组织和对其进行成像的实例。或者，可将该传感器或另一个传感器工程化至细胞系中，以产生稳定的‘传感器细胞’来测量患滴定患者血液中的感染性HIV颗粒的数量。最近生物标志物发现的迅猛发展已提供了数百种另外的蛋白质，所述蛋白质可类似地用作疾病的分子标记。在体内探查这些分子标记不仅有助于诊断，而且还可监测基于特定蛋白质的升高的治疗性响应。该技术可用于检测这些和其它特定的细胞蛋白质/对所述蛋白质成像，并且解决了之前难以实现的一类测量。可由polyA传感器检测到的分子标记谱可以不仅包括蛋白质，而且还包括其它生物分子，以及FDA批准的小分子。连同可通过红外44、PET45-47或MRI48成像的新一代临床上适用的报告分子，polyA传感器在分子成像上具有着广泛的应用。

[0136] 使用FDA批准的药物证明polyA开关用于基因调节的效用

[0137] 如图19所示，可在将四环素识别为其配体的适体内有效地工程化polyA信号。四环素是FDA批准的药物，其具有很长历史的临床使用和安全记录。在四环素不存在的情况下，转基因或报告基因表现出非常低的泄漏表达(图20)，低于0.2％的无活性polyA对照的表达水平。在四环素施用后，转基因或报告基因的表达被开启达～30倍。四环素的诱导是剂量依赖性的(图17)，从而允许通过FDA批准的安全药物精确控制转基因的表达。

[0138] 实施例3

[0139] 包含多个适体的POLYA适体

[0140] 在本公开的一些实施方案中，polyA适体分子包含2个、3个、4个、5个或更多个适体，并且在特定情况下，适体沿着单个分子的5'至3'方向线性连接。不同适体之间可以存在或可以不存在非适体序列。在特定的实施方案中，当存在多个适体时，一个适体相对于另一个适体可具有相反的适体取向(即，一个适体的5'至3'方向与第二适体的3'至5'方向相反)(图18A(中图)和25)，尽管在可选的情况下，第二适体处于相同的取向(图18A(最右侧图像))。在包含一个或多个适体的构建体的特定情况下，富含G的区域位于分子的最3'末端或其附近，富含G的区域的一个实例是MAZ区域(图25)。因此，图25说明新的构建体GP2，其中polyA信号被2个不同取向的适体侧接。设计基于图18所述的构型之一。当用5μg/mL Tc处理时，与图21中所述103GP2的10倍诱导相比GP2显示出12.6倍的诱导。还显示了GP2的P2b区的修饰变化和对基因表达的诱导的相应影响。

[0141] 在一些实施方案中，polyA适体分子包含线性连接的两个适体，尽管分子可具有各种形状的三维形状。图26说明其中两个GP2适体背靠背连接的新构建体GP2SLGP2。5'GP2适体被称为辅助，3'GP2适体被称为中心。两者均含有活性polyA信号，但只有中心适体含有富含G的区域。该构型经设计来允许两种不同结构之间的可选折叠：默认结构和超结构C。当用5μg/mL的Tc处理时，与GP2的12.6倍诱导相比GP2SLGP2显示70倍的显著提高的诱导。在其中存在多个形成三维结构的适体的情况下，两个环的序列可以对齐(参见图26的右图)。在其中分子中存在多个适体的情况下，在特定的实施方案中，分子中仅存在一个富含G的区域，并且富含G的区域可存在于第二适体上(以5'至3'方向)或者在某些情况下存在于分子的最
3'适体上。

[0142] 图27显示与图26的右侧图像类似的并且包含图25中所列的环P2b的GP2序列的特定超结构分子。显示了辅助GP2和中心GP2的茎/环II区域(加框的区域)的长度和序列的变化以及对基因表达诱导的相应影响。不同构建体之间的序列变化以红色显示。当折叠为超结构C结构时，GP2SLGP2的中心茎具有18bp的长度，而C12具有20bp的相同长度。构建体C12在5μg/mL Tc时达到94倍的诱导，而构建体D11A在5μg/mL Tc下达到84倍的诱导。在5μg/mL Tc下，两者均显著超过GP2SLGP2的70倍诱导。在特定的实施方案中，环2的序列(图27中的加框区域)使该区域作为双链区而不是环来存在。在如图26(右图)和图27中所示的超结构分子中，polyA(pA)“狗骨(dogbones)”之间的区域(并且包括加框的L2区域)的长度例如为10-25个核苷酸，诸如18-20个核苷酸。

[0143] 仅作为实例，图28提供了包含GP2茎环序列(参见图25)、C12茎环序列(参见图25)和D11A茎环序列(参见图25)的GP2SLGP2 polyA传感器构建体的完整序列。为了表征它们诱导表达的能力，以不同浓度的四环素(Tc，作为用于结合口袋的配体的实例)测试3种分子。图29显示GP2SLGP2的剂量依赖性调节。每个数据点对应于测量为在Tc存在与不存在的情况下的萤光素酶活性的比率的相对诱导倍数。显示了平均诱导倍数和标准偏差。在15μg/mL Tc下诱导达到104倍。图30显示包含C12序列的构建体的剂量依赖性调节。每个数据点对应于测量为在Tc存在与不存在的情况下的萤光素酶活性的比率的相对诱导倍数。显示了平均诱导倍数和标准偏差。在15μg/mL Tc下诱导达到151倍。图31显示包含D11A序列的构建体的剂量依赖性调节。每个数据点对应于测量为在tc存在与不存在的情况下的萤光素酶活性的比率的相对诱导倍数。显示了平均诱导倍数和标准偏差。在15μg/mL Tc下诱导达到127倍。

[0144] 本申请的范围不旨在限于说明书中描述的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法和步骤的具体实施方案。

[0145] 参考资料

[0146] 本说明书中提及的所有出版物均表明了本发明所属领域的技术人员的水平。本文中的所有出版物通过引用并入，其程度如同每个单独出版物被具体地和单独地表示为通过引用整体并入。

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[0204] 尽管已经详细描述了本公开及其有利方面，但应该理解，在不脱离由所附权利要求限定的本公开的精神和范围的情况下，可在本文中做出各种改变、取代和更改。此外，本申请的范围并非意在限于本说明书中描述的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法和步骤的具体实施方案。如本领域普通技术人员将容易地从本公开的公开内容中所理解的，可根据本公开利用目前存在或以要后开发的执行与本文所述的相应实施方案基本上相同的功能或实现与所述实施方案基本上相同的结果的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤。因此，所附权利要求意欲在其范围内包括此类过程、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤。

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