哺乳动物眼睛提取物

本发明涉及的是一种哺乳动物眼睛的提取物，具体地讲，本发明涉及的是一种从猪眼睛中提取的一组多肽。

从医学上讲，视网膜属中枢神经系统的一部分，其神经元损伤后的再生和修复能力低下。各种原因引起的“视网膜神经损害”一直缺乏有效的治疗方法，近年来国外的研究表明，神经生长因子(NGF)、睫状体神经营养因子(CNTF)等在体内外中枢神经系及周围神经系的运动神经元、感觉神经元、交感神经元的发育、存活、分化及损伤后修复等方面具重要作用；另外，坐骨神经营养因子、脑来源营养因子等对成年鼠轴突损伤后视网膜神经节细胞存活有较好的支持作用。

据此，本发明的目的在于提供一种能够促进视网膜及视神经损伤后再生和修复的“神经营养物质”，具体地讲，本发明的目的在于提供一种从健康哺乳动物眼球组织中，用现代生化技术，提取的一组分子量约10KD左右的具生物活性的多肽，制成冻干注射制剂，用于治疗各类原因导致的视神经及视网膜损伤类疾患，即本发明所述的哺乳动物眼睛提取物。

本发明的目的可以通过如下的过程得以实现。

1、用现代生化技术从动物眼睛组织中提取多肽物质，分离出分子量约10KD左右的小分子量多肽，制成冻干制剂，每瓶多肽含量约1mg。

2、SDS-PAGE电泳分析的结果显示，本发明所述的哺乳动物眼睛提取物的分子量约为10KD的小分子多肽。

3、HPLC分析结果，哺乳动物眼睛提取物(批号960928)，进样量20μl，用C18柱分析，波长245nm，哺乳动物的提取物为保留时间约2.64-8.72min的八组份多肽；用凝胶柱分析，波长280nm，眼睛提取物为保留时间约13.13-17.03min的六组份多肽。

4、动物过敏试验、降压试验、热源试验及异常毒性试验均合格。

5、对新生鼠视网膜视神经元存活和生长促进作用试验。实验结果显示，本发明所述的哺乳动物眼睛提取物有维持视网膜神经元存活，促进神经元发育和易化突起生长的作用，且神经营养作用与眼睛提取物有明显的量效关系。

下面是附图说明

，通过附图说明并结合以后的详细说明，可以清楚地理解本发明的技术内容。

附图1是本发明所述的猪眼提取物以C18柱的HPLC的图谱；附图2是本发明所述的猪眼提取物的电泳照片；附图3是本发明所述的眼睛提取物对新生鼠培养视网膜神经元突起生长的作用的照片，其中，AB是相差显微镜照片。CD是硫堇染色的照片；AC是对照组；BD是实验组。

本发明所述的哺乳动物眼睛提取物的制备过程可通过以下的实施例得到进一步的描述。

实施例1本实施例具体地涉及正常健康猪眼球的提取物，将猪的眼球去除筋膜，清洗捣碎，经冷冻、加热处理，采用离心、超滤、层析等现代生化技术分离提纯出一组分子量约为10KD的多肽物质，经电泳、高效液相色谱等技术分析其组分，并经活性鉴定后，无菌分装冷冻干燥，制成每瓶生物活性物质为1mg的猪眼提取物。

本实施例所述的猪眼睛提取物的质量控制如下：SDS-PAGE电泳分析，所述的猪眼提取物的多肽分子量约3.0-15KD。

HPLC分析，分别以C18柱与凝胶柱分析，猪眼睛提取物各组分及各组分保留时间，峰值应基本与标准一致。

动物过敏试验，降压试验，热源试验等应合格。

无异常毒性物质，急性毒性试验及慢性毒性试验合格。

从上述实验结果看出，本发明所述的眼睛提取物可以用于视神经变性和视网膜损伤等方面疾患的治疗。

本发明所述的猪眼提取物在用于临床时还应满足如下的条件，即：规格：多肽含量1mg/支用法：每支用注射用水1ml稀释，充分混匀成澄清溶液，采取球后或球旁注射，隔日一次或每周二次。

保存：4-8℃。

本实施例所述的猪眼提取物对新生鼠视网膜神经存活和生长的促进作用试验如下：所用的材料和方法：用24只出生1-3天的SD大鼠，分为6批实验，每批4只，在无菌条件下取出双侧眼球，用Hank′s液冲洗三次，在解剖镜下沿角巩缘剪开眼球，剥离视网膜。视网膜在Hank′s液清洗三次，稍加剪碎，然后投入0.125％胰蛋白酶液中，于37℃培养箱中消化20-30分钟。

然后，吸去消化液，用含10％小牛血清的DMEM/F12接种培养基洗二次，加接种培养2ml，用光滑管口的细吸管轻轻吹打，制成细胞悬浮液。将视网膜细胞接种于96孔板和24孔板上，分别作存活率计数和形态观察。

存活率观察：视网膜细胞每孔1×105的细胞密度培养在多聚赖氨酸包被的96孔板上，每孔实验容量为100μl，细胞贴壁后，吸去种植培养液，重新加入100μl无血清培养基或含5％小牛血清的DMEM/F12培养基。其中每100μl培养液中分别含有4、2、1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.08、0.06μl等10个浓度的本发明所述的眼睛提取物(N=4)，对照组不加，于37℃含5％CO2的培养箱中培养48小时。吸去培养基后，用1％台盼蓝染色10分(室温下)，然后用10％福尔马林磷酸缓冲液固定，以PB洗一遍，在倒置镜下(×400)计数台盼蓝染色阳性细胞数，每组4孔，每孔至少计数400个细胞，以计算细胞存活率。

同时计数有突起的细胞，以细胞突起长度大于2倍细胞体的长径的细胞计为有突起细胞，并计算有突起细胞占存活细胞的百分比。

形态学观察：视网膜细胞按每孔3.5×105的细胞密度种于多聚赖氨酸包被的24孔板上，每孔实验容量为600μl，每100μl的加药量和其它实验步骤同上。

培养96小时后用固定液固定，用CajalⅢ氨酒精法镀银染色，或用硫堇染色，观察细胞形态、突起生长等情况，并用相差和明视野拍照。

结果光学显微镜观察发现，视网膜细胞在多聚赖氨酸支持物上生长。在添加了本发明所述的眼睛组织提取液的实验组和为添加眼睛提取液的对照组之间生长情况有差别。实验组视网膜细胞生长活跃，对照组细胞生长较差。

在对照组，培养48小时视网膜继胞多聚集成小团，为具有短突起或无突起的小细胞，台盼蓝染色计数有52％的阳性细胞，即死细胞；在添加了提取液的实验组，视网膜细胞生长良好，胞体饱满有光泽，一部分细胞胞体增加，有突起细胞增多，台盼蓝染色计数结果是，每100μl添加了4、2、1μg组的阳性细胞分别为40％、41％和47％。在0.8μg时的阳性细胞为51％。表1显示了视网膜培养细胞存活率情况，表明与对照组相比，本发明所述的眼睛提取液组细胞存活率较对照组升高，差异有显著意义(P＜0.01)。表1本发明所述的哺乳动物眼睛提取物对新生鼠视网膜神经元培养存活率的影响(％)本发明所述的猪眼提取物组(μg/100μl)对照组0.1    0.4    0.8    1    2    4存活率均数47.84 43.34 45.66 48.50 52.51*58.87**59.52**标准差     3.07  3.38  4.11  4.28  4.43   3.51    6.34*与对照组比较差异有显著意义(P＜0.05)**与对照组比较差异有极显著意义(P＜0.01)表2显示本发明所述的猪眼提取液对新生鼠视网膜神经元突起生长的作用，与对照组相比，含0.1μg提取液组尚未见突起生长效应，当增加到含0.4和0.8μg提取液时，有突起细胞排分比显著升高，差异分别有显著和极显著意义(P＜0.05,P＜0.01)。且随着剂量的增加突起生长效应进一步增强。表2本发明所的猪眼提取物对新生鼠视网膜神经元培养突起生长的作用(％)本发明所述的猪眼提取物(μg/100μl)对照组0.1  0.4    0.8      1       2       4均数  1.61 1.48 2.57*3.95**5.20**6.59**7.47**标准差0.25 0.24 0.31   0.34    0.42    0.44    0.65表中数据为有突起细胞占存活神经元总数的百分比*与对照组比较差异有显著意义(P＜0.05)**与对照组比较差异有极显著意义(P＜0.01)在培养4天时，银染色和硫堇染色显示，实验组视网膜神经元胞体进一步增大，突起延长，突起数及分支增多，对照组胞体较小，突起不明显(见附图3)。讨论视网膜神经细胞，特别是节细胞，在出生后的存活、生长和分化受许多因素和化学物质的影响，特别是靶源性的神经营养物质，如中脑顶盖组织提取液对节细胞生长的促进作用。

其它如脑来源营养因子(BDNF)和睫状节源性神经营养因子(CDNF)都显示了视网膜神经元的神经营养效应。

本研究将眼睛组织提取液添加到培养液中，结果显示提取物有维持视网膜神经元存活，促进神经元发育和易化突起生长的作用，这种神经营养作用呈明显的量效关系，其维持神经元存活的作用在约2％的剂量时似乎达到最大效应；其促神经突起生的作用在0.4％的剂量时即有效，但在达到4％的剂量时尚未饱和。表3是采用C18柱的HPLC(即图1)的测试数据System:P-W on Comn Port 2Analyst:AnalystAcquisitoin Method:C:\SPA\P-W｜Methods\DEFAULT.aqm    10-04-96 09:39:34Calculation Method:C:\SPA\P-W｜Methods\DEFAULT.aqm    07-31-96 08:25:40Report Method:C:\SPA\P-W\Methods\DEFAULT      .rpm    10-04-96 16:22:08Component RT(min)   Area    Height  Area％  Peak Type1         2.64    308570    27936   5.95    Fused2         3.55    180028    9868    3.47    Fused3         3.82    111047    5898    2.14    Fused4         4.20    1225014   85984   23.64   Fused5         4.50    49620     5802    0.96    Fused6         4.51    85119     5752    1.64    Fused7         4.96    55019     5118    1.06    Fused8         5.14    166584    9034    3.21    Fused9         5.37    1866965   97440   36.02   Fused10        5.59    696754    31200   13.44   Fused11        7.65    105138    7602    2.03    Fused12        7.66    131472    7470    2.54    Fused13        8.59    88690     6356    1.71    Fused14        8.60    10467     6366    0.20    Fused15        8.62    102175    6094    1.97    FusedTotals             5182662   317920  100.00表4是凝胶柱的HPLC的测试数据Mode:Acquired DataResults:O:\SPA\P-W1\Data\GMT1.resComponent RT(min)Area    Height   Area％  Peak Type1        12.96 930763   12752    7.42     Fused2        13.90 2066908  36462    16.47    Fused3        14.20 1799469  40028    14.34    Fused4        14.86 1449024  30044    11.54    Fused5        15.95 2839991  66448    22.63    Fused6        17.03 3466038  71476    27.61    FusedTotals          12552193 257210   100.00   Tailine上述结果证实本发明所述的哺乳动物眼睛提取物具有促进新生大鼠视网膜神经元培养的存活和生长的作用，可以用于视神经变性和视网膜损伤的治疗。