增强生物活性的长效重组人红细胞生长因子融合蛋白及方法
阅读：4发布：2021-06-27
专利汇可以提供增强生物活性的长效重组人红细胞生长因子融合蛋白及方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种增强 生物 活性的长效重组人红细胞生长因子融合蛋白。该方法把两个/三个相同的能表达红细胞生长因子的基因通过一段/两段连接多肽连起来，并构建入 哺乳动物 细胞表达质粒，将其转入哺乳动物细胞后得到了表达。融合蛋白不仅具有红细胞生长因子的生理活性，而且延长了蛋白在生物体内的储留时间，进而增强其生物功效，延长体内 半衰期 ，减少 给药 次数，极大地提高了红细胞刺激因子的临床实用价值。，下面是增强生物活性的长效重组人红细胞生长因子融合蛋白及方法专利的具体信息内容。
1.一种增强生物活性的长效重组人红细胞生长因子融合蛋白，其特征在于：该结构包括在两单体中间由一个连接片段将两个单体连接为二聚体融合蛋白，或在其三单体中间有两个连接片段将三个单体连接为三聚体融合蛋白，并具有红细胞生长因子的蛋白自然顺序，二聚体融合蛋白具有如下所示的序列：
EPO-L-EPO，
三聚体融合蛋白具有如下所示的序列：
EPO-L-EPO-L-EPO。
2.按权利要求1所述的增强生物活性的长效重组人红细胞生长因子融合蛋白，其特征在于：所述的在两单体中间由一个连接片段，其连接片段是将一红细胞生长因子的3′端与另一红细胞生长因子的5′连接而成。
3.按权利要求1所述的增强生物活性的长效重组人红细胞生长因子融合蛋白，其特征在于：所述的在三聚体中间由二个段连接片段而成。
4.按权利要求3所述的增强生物活性的长效重组人红细胞生长因子融合蛋白，其特征在于：所述的在三单体中间有二段连接片段是：第一个红细胞生长因子的3′端通过连接片段与第二个红细胞生长因子的5′端连接，再通过第二个连接片段把第二个红细胞生长因子的3′端与第三个红细胞生长因子5′端连接而成。
5.按权利要求1-3中任意一项权利要求所述的有增强生物活性的长效重组人红细胞生长因子双或多聚体融合蛋白，其特征在于：所述的连接片段为连接肽，该连接肽是具有9-20个相同的或不相同的氨基酸连接顺序。
6.按权利要求5所述的增强生物活性的长效重组人红细胞生长因子融合蛋白，其特征在于，所述的连接肽包括但不限于如下序列：
Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-；
Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala；
Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly；
Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Ala-Ala；
Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala；
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Glr-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala；
7.按权利要求1所述的增强生物活性的长效重组人红细胞生长因子融合蛋白，其特征在于：所述的二聚体/三聚体红细胞生长因子的质粒构建，在构建中使用设汁合成的引物寡聚脱氧核苷酸P1，P2，P3，P4，P5，P6，它们的核苷酸序列分别是：
P1：5’TGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’；
P2：5’TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGG 3’；
P3：5’AAGCTAGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’；
P4：5’AGCTAGAATCCACCCGCGGATCCACCTCCTGATCCA
CCTCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’；
P5：5’AGCTAGAATCCGGATCCGCGGGTGGTGGATCTGGC
GGAGCCCCACCACGCCTCATC 3’；
P6：5’AGCTAAAGCTTTCATCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’。
8.一种制备权利要求1所述的有增强生物活性的长效重组人红细胞生长因子二聚或多聚体融合蛋白，即EPO-EPO二聚体/EPO-EPO-EPO三聚体融合蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)获得EPO-EPO及EPO-EPO-EPO的融合基因质粒，首先从细胞中提取信息核糖核酸mRNA，利用逆转录酶-DNA聚合酶链反应RT-PCR方法制备单链和双链互补脱氧核糖核酸cDNA，经过分离纯化，将EPO cDNA克隆到载体上，以此为基础进行融合蛋白的构建；
(2)利用聚合酶链状反应试验，对EPO cDNA进行了亚克隆和末端改造，同时在蛋白之间增加了一小段连接片段；
(3)通过限制性内切酶，构建成了能够表达EPO-EPO及EPO-EPO-EPO的融合蛋白质粒，并将其质粒转化进入CHO(CHO-dhfr-)或COS7细胞株，转化后的细胞株能分泌EPO-EPO及EPO-EPO-EPO融合蛋白；
(4)通过稀释克隆方法，筛选出均一、高效表达二聚或多聚人红细胞生长因子的工程细胞株；
(5)蛋白的提取工艺；收集细胞培养液，浓缩，过CM Sepharose FF柱，梯度洗脱，收集活性部分，过Sepharose分子筛层析柱，收集活性部分。
8、如权利要求1所述的增强生物活性的长效重组人红细胞生长因子融合蛋白，在用于治疗肾性贫血的药物中的应用。
9、如权利要求1所述的增强生物活性的长效重组人红细胞生长因子融合蛋白，在用于癌症相关性贫血(CRA)、自身免疫性疾病伴发性贫血、骨髓增生异常综合症(MDS)、再生障碍性贫血(AA)、单纯红细胞再生障碍性贫血(PRCA)、慢性髓系白血病(CML)、特发性骨髓纤维化(IMF)、溶血性贫血、艾滋病引起的贫血和化疗引起的贫血等疾病的治疗、对于造血干细胞移植及用于择期手术的自身输血血液储备的药物中的应用。
增强生物活性的长效重组人红细胞生长因子融合蛋白及方法
[0001] 技术领域
[0002] 本发明涉及一种增强生物活性的长效重组人红细胞生长因子融合蛋白及其制备方法。
[0003] 背景技术
[0004] 红细胞生长因子是红细胞生长分化的重要刺激因子，其功能为调节和促进幼稚红细胞的生长分化，对晚期BFU-E(Burst Forming Units-Erythrocytes)及CFU-E(Colony Forming units-Erythrocytes)有促进分化作用，并使其合成的血红蛋白变成成熟红细胞。它也能促进网质红细胞的提前释放，并能刺激骨髓巨核细胞。
[0005] 临床已广泛使用红细胞生长因子治疗肾脏疾病引起的贫血，肿瘤病人化疗后引起的贫血，以及外伤引起的大出血，即可以刺激患者自身的造血功能，弥补各种原因造成的红细胞减少。因红细胞生长因子只是造血因子的一种，另有其它造血因子能刺激血细胞的生长发育(如粒细胞和淋巴细胞等)，因此，世界上已有几种构建复合性刺激因子的例子，如IL3-EPO，EPO-IL3，IL3-6CSF(WO 92/06116，专利)。实验证明，IL3-EPO和EPO-IL3具有刺激BFU-E和CFIJ-E的作用。复合因子的构建是根据其自身功能，同时又具有双重协同作用。最新一例证明是生产红细胞生长因子/粒细胞集落因子(EPO/GM-CSF)(Antonio M et al，US Patent 5916773)。
[0006] 根据红细胞生长因子的生长和代谢过程，其二聚体及三聚体(二聚体以下简称EPO-EPO，三聚体以下简称EPO-EPO-EPO)也能够促进其生物活性。红细胞生长因子产生于肾脏，作用于骨髓，然而它的分子量较低，由肾脏产生进入血液循环后，可很快曲肾脏经尿液排出，而且尿液排出后的红细胞生长因子经提纯仍具有生物活性。尽管利用生物工程技术生产的红细胞生长因子已广泛应用，但仍有同样问题。针对其应用与不足，为提高红细胞生长因子的半衰期，增长其在血液中的停留时间以发挥更长功效，研究人员进行了各方面的实验，如用多聚乙二醇连接蛋白，用化学方法将蛋白连接成二聚及多聚体等，其结果均为增大分子量，增长其体内循环时间。在以前的研究中，有的获得成功，有的没有成功。在这里我们利用基因工程的方法制造出二/三聚体的蛋白，经过初步实验证明，其合成药物具有和天然单体一样的生物功效，而且延长了蛋白的生物活性，进而减少了用药次数。
[0007] 发明内容
[0008] 本发明提供增强生物活性的长效重组人红细胞生长因子融合蛋白及方法，的目的在于：克服已有的用化学方法将蛋白连接成二聚及多聚体，其结果均为大分子量的混合物，且活性低的缺点，为了提高红细胞生长因子的半衰期，增长其在血液中的停留时间以发挥更长功效，而且延长了蛋白的生物活性，进而减少了用药次数；从而提供一种增强生物活性的长效重组人红细胞生长因子融合蛋白。
[0009] 本发明的目的是这样实现的：该结构包括在两单体中间由一个连接片段将两个单体连接为二聚体融合蛋白，或在其三单体中间有两个连接片段将三个单体连接为三聚体融合蛋白，并具有红细胞生长因子的蛋白自然顺序，二聚体融合蛋白具有如下所示的序列：
[0010] EPO-L-EPO，
[0011] 三聚体融合蛋白具有如下所示的序列：
[0012] EPO-L-EPO-L-EPO 。
[0013] 本发明一种实施方案是：在两单体中间由一个连接片段，其连接片段是将一红细胞生长因子的3′端与另一红细胞生长因子的5′连接而成。
[0014] 本发明一种实施方案是：在三聚体中间由二个段连接片段而成。
[0015] 本发明一种实施方案是：在三单体中间有二段连接片段是：第一个红细胞生长因子的3′端通过连接片段与第二个红细胞生长因子的5′端连接，再通过第二个连接片段把第二个红细胞生长因子的3′端与第三个红细胞生长因子5′端连接而成。
[0016] 本发明一种实施方案是：连接片段为连接肽，该连接肽是具有9-20个相同的或不相同的氨基酸连接顺序。
[0017] 本发明一种实施方案是：所述的连接肽包括但不限于如下序列：
[0018] Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Gly；
[0019] Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser；
[0020] Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala；
[0021] Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly；
[0022] Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly；
[0023] Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly；
[0024] Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Ala-Ala；
[0025] Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly；
[0026] Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala；
[0027] Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly；
[0028] Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly；
[0029] Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala；
[0031] P1：5’TGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’；
[0032] P2：5’TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGG 3’；
[0033] P3：5’AAGCTAGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’；
[0034] P4：5’AGCTAGAATCCACCCGCGGATCCACCTCCTGATCCA CCTCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’；
[0035] P5：5’AGCTAGAATCCGGATCCGCGGGTGGTGGATCTGGC GGAGCCCCACCACGCCTCATC 3’；
[0036] P6：5’AGCTAAAGCTTTCATCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’。
[0037] 本发明提供的一种用基因工程方法生产增强其生物活性的红细胞生长因子二聚体/三聚体融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：
[0038] 1.获得EPO-EPO及EPO-EPO-EPO的融合基因质粒，首先从细胞中提取信使核糖核酸(mRNA)，利用逆转录酶-DNA聚合酶链反应(RT-PCR)方法制备单链和双链互补脱氧核糖核酸(cDNA)，经过分离纯化，将EPO cDNA克隆到载体上，以此为基础进行融合蛋白的构建(重组质粒的构建如图1所示的)；
[0039] 2.利用聚合酶链反应(PCR)对EPO cDNA进行了亚克隆和未端改造，然后 在末端改造的两/三个蛋白之间增加了一/两小段连接片段(连接肽Linker，L见图2A，2B，2C)；
[0040] 3.通过限制性内切酶，构建成了能够表达如图3所示的EPO-EPO及如图4所示的EPO-EPO-EPO的融合蛋白质粒，并将其质粒转化进入细胞株如CHO或COS细胞株。转化后的细胞能分泌EPO-EPO及EPO-EPO-EPO融合蛋白。以下详细描述制备方法：
[0041] 所使用的材料包括：
[0042] 一.细胞株：包括CHO细胞株，COS细胞株。
[0043] 菌株：包括菌株DH5α，菌株HB101，
[0044] 质粒：包括TopoTA连接质粒(3.9Kb，Ampr)，pBR322，pUC18。
[0045] 真核细胞表达质粒：包括pBS1(4.6Kb，DHFR)，pMCM(5.6Kb，Ampr)。
[0046] 二.酶类：DNA聚合酶(Clonetech)；限制性内切酶(Promega，Biolab).
[0047] T4 DNA连接酶(Life Technologies)；mRNA纯化Kit(Invitrogen)；
[0048] cDNA合成Kit(Strategen)。
[0049] 三.主要生化试剂和材料：
[0050] EPO标准品(Amgen)； dNTP(Perkin Elmer)；琼脂糖(BRL)；氨卞青霉素(Sigma)；蛋白分子量标准(Bio-Rad)；DNA分子量标准(Life Technologies)；EPO ELISAKit(R&D)。马丁培养基，肉汤培养基购自天坛生物制药；支原体培养基，购自长春生物制品所。以上所需的材料均是市场上可以买到的。
[0051] 四.质粒的制备：质粒筛选，
[0052] 1.将含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期(OD600约0.6)，将含有相应抗生素的LB培养液(预温到37℃)放入烧瓶内，加入对数晚期培养物，于37℃剧烈振摇培养25小时，所得培养物的OD600值约0.4，于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清；将细菌沉淀重悬于用冰预冷的STE溶液中(STE溶液：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl，pH8.0，1mmol/LEDTA，pH8.0)，离心收集细菌细胞。将收集细菌的细胞重悬于用冰预冷的含10％蔗糖，50mmol/LTris·Cl，pH8.0的溶液中，加溶菌酶溶液，混匀，在冰上放10分钟，加10％十二烷基硫酸钠(SDS)，混匀，立刻加5mol/LNaCI(终浓度为1mol/L)混匀，在冰上放1小时，离心，将上清用酚：氯仿和氯仿各提一次，将水相于室温加入2倍体积乙醇混匀，于室温放1.2小时，离心，回收质粒。
[0053] 2.DNA片段的放大
[0054] 用PCR方法将EPOcDNA(以及其它DNA片段)放大，放置PCR仪中进行扩增：94℃，45秒，55℃，45秒，72℃，1-2分钟，循环35次后，72℃，7-10分钟。
[0055] 3.DNA片段的连接
[0056] 用相同限制性内切酶切质粒和EPOcDNA(以及其它DNA片段)，37℃，30-60分钟，经琼脂糖电泳纯化后，用T4 DNA连接酶连接，形成重组质粒的构造。
[0057] 4.限制性内切酶分析
[0058] 用限制性内切酶切重组质粒，经琼脂糖电泳纯化后，得到EPOcDNA(以及其它DNA片段)，由此证明连接的正确性。
[0059] 5.DNA序列分析
[0060] 用Sanger双脱氧链终止法，将dNTP，DNA模板，Klenow，等量加在4个管中，55℃，30分钟，分别加入ddA，ddG，ddT，ddC，保存于室温15-20分钟，按常规方法处理，用聚丙烯酰胺凝胶电泳测序。
[0061] 6.SDS-PAGE电泳等常规方法均参照下述文献(Sambrook J et al，ALaboratory Methods-Molecular Cloning，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York，2ndEdition，1989；Current Protocol of Molecular Biology，John wiley & Sons)进行电泳检测。
[0062] 五、细胞培养：
[0063] 从液氮中取出冷冻细胞，置37℃水浴中迅速融化，将细胞悬液移入离心管内，加入培养基，离心10分钟，用含10％小牛血清(Life Technologies)的培养基重悬细胞，然后移入培养瓶内，接种量为3×104cells/cm2，将细胞置于CO2，培养箱内，37℃，5％CO2，，活细胞比例＞85％(48-72小时)。
[0064] 六、样品蛋白含量测定：
[0066] 2.测定方法：若蛋白量为＞0.2mg/ml，取0.1ml样品与5ml染色液均匀混合，静置10-30分钟后测定A600nm；若蛋白量为5-100μg/ml，取0.8ml样品与0.2ml染色液均匀混合后进行测定；
[0067] 以BSA测得曲线为标准曲线。
[0068] 本发明的优点在于：本发明为一种利用基因工程技术生产红细胞生长因子(简称EPO)二聚体/三聚体融合蛋白的亚克隆和末端改造及用聚合酶链反应(Polymeraase Chain Reaction，PCR)方法，把两个/三个相同的能表达红细胞生长因子的基因通过一段/两段多肽连接起来，并接入哺乳动物细胞表达质粒，将其转入哺乳动物细胞后得到了表达。融合蛋白不仅具有红细胞生长因子的生理活性，而且延长了蛋白在生物体内的储留时间，进而增强其生物功效。该方法简单，并且得到的二聚体/三聚体融合蛋白具有天然的红细胞生长因子的生物活性，而且，实施例中EPO-EPO具有生物活性为135000IU/mg，三聚体EPO-EPO-EPO具有生物活性为150,000IU/mg本发明的EPO-EPO/EPO-EPO-EPO通过增强生物效应，延长体内半衰期，减少用药次数，极大地提高了红细胞刺激因子的临床实用价值。
[0070] 图1是EPO cDNA的合成及重组质粒的构建；
[0071] 图2A，2B，2C是中间连接片段的设计，构造以及通过PCR方法修饰和构建
[0072] 的EPO质粒。cDNA序列的两端都得到了修饰，即末端改造。
[0073] 图3是构建pTrm-EPO-Linker-EPO质粒的流程图。
[0074] 图4是pMNAD EPO-Linker-EPO-Linker-EPO质粒的构建流程图。
[0075] 图5是转染CHO-dhfr-细胞的阳性克隆照片。
[0076] 图6A是CHO-dhfr-细胞形态照片，图6B是工程细胞株CHO-BTE形态照片。
[0077] 图7是Linker’s氨基酸序列图例。
[0078] 图8A是二聚体融合蛋白的序列，和图8B是三聚体融合蛋白的序列。
[0079] 图9A是构建后二聚体融合蛋白的示意图，和图9B是三聚体融合蛋白的示意图。
[0080] 图10是是融合蛋白的纯化图(SDS-PAGE)。
[0081] 具体实施方式
[0082] 实施例1本实施例中所用的连接片段是连接肽，其连接肽顺序的一级结构，即连接二聚体/三聚体的蛋白顺序，是9-20个氨基酸连接顺序，具有这些连接顺序的氨基酸都可以用，图7所示的一种序列是本例中应用的。
[0083] 引物寡聚脱氧核糖核酸的设计与制备：
[0084] P1：5’TGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’
[0086] P2：5’TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGG 3’
[0087] P2是互补于3’末端的寡聚脱氧核糖核酸，与P1一起，通过PCR，
[0088] 放大并克隆全长(蛋白编码)EPO cDNA。以后的亚克隆及二联/三聚体的构建均用该质粒为基础。
[0089] P3：5’AAGCTAGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’
[0090] P3的后部分与EPO的起始密码之后的脱氧核糖核酸序列一致。在起始密码之前，我们加了一个BamH I位点。
[0091] P4：5’AGCTAGAATCCACCCGCGGATCCACCTCCTGATCCACCTCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’
[0092] P4是与EPO cDNA终止密码之前的序列互补(不包括终止密码)，并额外加了一段连接肽的核苷酸序列，其中含有一个Sac II位点。在SacII位点之后又加了一个EcoR I位点。P4与P3一起，通过PCR方法，将EPO基因的3’末端的终止密码去掉，并加上一段连接片段(Linker)。
[0093] P5：5’AGCTAGAATCCGGATCCGCGGGTGGTGGATCTGGCGGA GCCCCACCACGCCTCATC 3’
[0094] P5是与EPO成熟蛋白的5’脱氧核糖核酸的起始序列一致(在信号肽下游不包括信号肽)，在上游加了一段连接肽的核苷酸序列，其中包括了Sac II位点，同时在Sac II位点前插入了一个EcoR I位点。P4和P5一起，通过PCR方法，将EPO基因的起始因子和终止因子去掉，并将EPO基因两端各加上一段连接片段(Linker)。
[0095] P6：5’AGCTAAAGCTTTCATCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’
[0096] P6与EPO cDNA的末端互补(包括终止密码)，并带有一个Hind III位点。
[0097] P5和P6一起，通过PCR方法，将EPO基因的5’末端的起始因子去掉，并加上一段连接片段(Linker)。
[0098] 实施例2 EPO-EPO和EPO-EPO-EPO所用LINKER序列的筛选及确定：
[0099] 经过一些列预试验及检测，确定了下述的连接肽序列，包括但不限于如下序列：
[0100] Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Gly；
[0101] Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser；
[0102] Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala；
[0103] Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly；
[0104] Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly；
[0105] Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly；
[0106] Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Ala-Ala；
[0107] Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly；
[0108] Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala；
[0109] Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly；
[0110] Gly-Gly-Scr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly；
[0111] Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala；
[0112] 以下实施例中均为应用其中由14个氨基酸组成的LINKER所构建的EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合蛋白所得到结果，其它各种LINKER所构建的EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合蛋白的生物活性及功能与之相似。
[0113] 实施例3 EPO，EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合基因全长核苷酸序列的测定：
[0114] 为了获得EPO基因，EPO-EPO以及EPO-EPO-EPO融合基因，对cDNA及改造后序列进行了亚克隆和末端改造，并利用常规方法对每一cDNA及改造后的融合基因进行了核苷酸序列测定(详见实施例1，图2，图3，图4)。
[0115] 实施例4 EPO cDNA的制备：
[0116] 用1ug mRNA为起始物，将mRNA溶于20ul去离子的水中，加热65℃，10-20分钟，置于冰浴中备用；然后加入cDNA合成缓冲混合液和AMV逆转录酶，其中含有1ug mRNA，50mM Tris·HCl(pH 8.3)，40mM KCl，6mM MgCl2，4mM DTT，0.5mM dNTP，0.1mMpoly(dT)12-18，0.1mg/ml BSA。在37℃反应一小时。从上面的反应液中，取5ul，放入DNA聚合酶链反应(PCR)的试管中，依次加入100pmolP1和P2的上下游引物，(见实施例1)，5ul PCR缓冲液(10X)，2.5mmol/L的dNTP和5单位的DNA聚合酶(Taq DNAPolymerase)，最终体积为50ul；放置PCR仪中进行扩增：94℃，45秒，55℃，45秒，72 0C，1-2分钟，循环35次后，72℃，7.10分钟；反应完成后立刻取出，放置冰浴中待用。
[0117] 实施例5 EPO重组质粒的构建：
[0118] 按照图1，PCR反应完成后，从试管中取5ul反应液，加入另一试管中，其中含有Topo载体以及T4 DNA连接酶，形成EPO的基本构造，成为以后基因改造的基础。本发明对所有质粒均进行了限制性内切酶的分析以保证序列的正确性。
[0119] 实施例6 EPO-EPO重组质粒的构建：
[0120] 参考图3，经过改建和亚克隆后形成EPO-EPO重组质粒。经过对其最后表达质粒的限制性内酶的分析和序列测定后，证明其结构与所设计的结构一致。
[0121] 实施例7 EPO-EPO-EPO重组质粒的构建：
[0122] 参考图4，经过改建和亚克隆后形成EPO-EPO重组质粒。经过对其最后表达质粒的限制性内酶的分析和序列测定后，证明其结构与所设计的结构一致。
[0123] 实施例8 EPO-EPO及EPO-EPO-EPO融合基因在真核细胞中的高效表达：
[0124] 用于表达EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合蛋白真核细胞株为CHO-dhfr-(CHO，DUKXBl)(Urlaub G，et al，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.77，1216)。利用Lipofectin(LifeTechnologies)将EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合基因进行转化；转化克隆生长于含有氨甲蝶蛉(Methotrexate，Sigma)的细胞培养液中，在含5％CO2培养箱中，37℃培养；逐渐增加氨甲蝶蛉浓度以选择出高效表达细胞株。本发明用EPO ELIsA Kit(R&D)对融合蛋白的活性进行了测定。
[0125] 1.CHO-dhfr-细胞稳定转染预试验
[0127] 2.CHO-dhfr-细胞转染
[0128] 将真核表达质粒及Lip2000分别与DMEM混合，室温20分钟，加入CHO-dhfr-细胞中，两周后出现阳性克隆，参考图5。
[0129] 3.MTX加压方法如下：CHO-dhfr-细胞2.4×106+真核表达质粒+Lip2000，完全培养基，转染48小时+筛选培养基+10nM MTX加压，出现克隆，逐步提高MTX浓度，用100 nM的MTX筛选培养基传代，挑选克隆细胞测EPO的表达量，将高表达细胞株继续加压，增至500nM MTX水平，将高表达细胞株扩大培养，冻存，亚克隆，获得高效稳定表达株，经MTX反复加压，逐步加大MTX的浓度，扩大细胞培养，收取上清，最终筛选到高效表达的细胞株CHO-BTE，参考图6。
[0130] 4.CHO-BTE细胞形态和特征
[0131] CHO-BTE细胞株在体外连续传代25代，其形态与转染前的CHO-dhfr-无明显差别。为多角形类似上皮细胞。参考图7A及7B。
[0132] 5.CHO-BTE细胞株、细菌、真菌、支原体检查
[0133] 用配制好的马丁、肉汤培养基，使用前121℃15分钟高压灭菌。分装10ml/枝。将CHO-BTE上清(2天)抽取1ml分别加入马丁、肉汤各1ml，每个样品各两管。盖好盖。同时设阴性对照2管，放37℃培养7天。每天观察结果。7天判定CHO-BTE株阴性。
[0134] 支原体检查
[0135] 将支原体培养基用前煮沸15分钟，冷却56℃以下，加入牛血清2ml(培养基8ml+2ml血清)，充分振摇，取CHO-BTE细胞上清1ml分别加入支原体培养基中，每个样品接种4管，同时设空白对照，放37℃观察21天，结果判定阴性。此细胞株无支原体污染。
[0136] 6.CHO-BTE细胞外源性检测(红细胞吸附试验)
[0137] 取CHO-BTE细胞3瓶，制成1×105/ml，每瓶接种5ml，待细胞生长单层，换维持液(IMDM+2％FCS+丙酮酸钠+非必须氨基酸)10ml/瓶，继续观察2周，每三天换液一次，每日镜检细胞，CHO-BTE细胞基本保持正常形态，即多角形。上皮细胞。14天后，取1/3细胞培养瓶细胞，用0.2％-0.5％豚鼠红细胞混合细胞悬液，做红细胞吸服试验，加入红细胞后置4-8℃，30分钟，镜下观察结果，阴性，无细胞凝集。然后将其细胞置于20-25℃、30分钟。镜下观察结果阴性，无细胞凝集。说明此细胞没有外源性病毒污染。
[0139] 具体试验结果如下：
[0140] 动物体内接种法进行外源病毒检查结果，(其结果见表1)。
[0141] 表1CHO-BTE细胞外源性检测
[0142]
[0143] 7.CHO-BTE细胞稳定性试验
[0144] CHO-BTE细胞经反复液氮冻存，复苏，细胞形态正常，无改变。经检测CHO-BTE细胞株，室温、4℃、-20℃冻存上清，EPO的表达量无明显影响，说明CHO-BTE细胞株稳定表达的细胞株。
[0145] 实施例9 EPO-EPO及EPO-EPO-EPO融合蛋白的分离纯化：
[0146] 经克隆后的细胞株，在无血清细胞培养液中培养(CHO-S-SFM II，LifeTechnologies)，待细胞长到80％充满时(约48-72小时)，收集细胞培养液.将细胞培养液进行浓缩，然后进行透析(pH4.2，100mM磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液)4℃，24小时.将透析后的溶液上样于已平衡后的CM Sepharose FF柱(柱为5×20cm；用pH4.2，100mM磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液平衡5-10倍柱体积).分别用含100mmol/L、300mmol/L、500mol/L NacL的缓冲液进行盐梯度洗脱，收集融合蛋白，经活性测定后收集有活性部分，将其浓缩并交换成pH7.0 10mmol/L磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液.将浓缩并交换缓冲液后的样品上样于已平衡好的Sepharose分子筛层析柱(柱为2.6×100cm；平衡液流动相均为10mmol/L pH7.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液).分管收集各洗脱峰，经活性测定有活性部分即为纯化的融合蛋白.所得融合蛋白经SDS-PAGE测定(参考图10)纯度达95％。
[0147] 实施例10 EPO，EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合蛋白生物活性的测定：
[0148] 1.用R&D EPO免疫试剂盒为工具，其中的标准品为标准，进行体外活性测量。对每一个样品用统一的稀释液稀释。稀释液含有细胞培养液，5％小牛血清，1％的β-Mercaptoethanol，和抗菌素(青霉素，链霉素及Fungizone)(其结果见表2)。
[0149] 2.集落生成实验，测定红系爆式集落形成单位(burst forming unit-erythroid，BFU-E)的集落数目。利用低密度粘着于培养皿的骨髓细胞，对所有集落进行测定。低密度细胞在IMDM(Iscov’s Modified Dulbecco’s Media)培养液中(含有小牛血清)，37℃，培养1-2小时，按Ficoll-Hypague方法分离。对BFU-E的测定：在1mLIMDM培养液中(含有0.8％甲基纤维素，20％小牛血清，0.05mM巯基乙醇，1IUrhEPO或者rhEPO二聚体融合蛋白)放置1×105细胞，培养十四天后，检测其集落数目和形态，通过系列稀释后与标准品对照。
[0150] 表3的结果表明，培养14天后rhEPO二聚体及三聚体的BFU-E集落数显著高于rhEPO单体，差异有统计学意义(P＜0.01)。上述结果表明rhEPO二聚体及三聚体的体外生物活性高于rhEPO单体。
[0151] 3.表4中所示的体内活性测量由8-10周的小鼠被麻醉后，从眼眶抽血，测其血沉计数，然后按照小鼠体重，根据表1中所测表达蛋白的活性，以300IU/Kg体重给予一次皮下注射。每三只小鼠为一组，共四组(单体、二聚体、三聚体、对照组)，在第九天麻醉小鼠，重新从眼眶抽血，测其血沉，其结果如表4所示。
[0152] 综上所述，EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合蛋白的体内、体外生物活性比单体EPO显著提高，说明本例中的EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合蛋白有增强的生物活性。
[0153] 表2 体外活性测量
[0154]
[0155] 表3rhEPO二聚体蛋白的集落生成实验结果
[0156]
[0157] 表4体内活性测量
[0158]
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