哺乳动物促孕液
阅读：1457发布：2020-05-11
专利汇可以提供哺乳动物促孕液专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 哺乳动物 繁殖技术领域，特别是可以改善冷冻保存精液授精能 力 的哺乳动物促孕液，它是以母液、肝素、咖啡因、 牛 血清 白蛋白 为原料，根据各组分的重量配比称取原料，按先后顺序加入容器中混合均匀，过滤除菌、放入干净消毒的容器内，保存于4℃的 冰 箱 中待用。本发明促孕液提高精液活力，延长精子存活时间，减少人工授精的精液使用量，促进精子获能受精，提高受胎率。本发明促孕液成分简单，容易获得，成本低，易于推广。，下面是哺乳动物促孕液专利的具体信息内容。
技术领域
本发明属于哺乳动物繁殖技术领域，是可以改善冷冻保存精液的受精能力 的哺乳动物促孕液。
背景技术
受精是一个复杂的生物学过程，精子必须具备良好的运动能力，同时需经 历获能和顶体反应才能实现受精。随着精液冷冻保存技术的进步，在养牛生产 实践和实际研究应用时，冷冻保存精液使用普遍，但精液经冷冻一解冻过程后， 其精液活力远不及新鲜精液，受胎率往往低于自然交配时的受胎率。
专利申请号：97106855.0公开了一种“混合牛、山羊精子的保存与使用”， 其技术内容为：配制稀释液→磁化稀释液→采集稀释牛、山羊精子→混合牛、 山羊精子→磁化保存→人工授精。稀释液的配方为：1000毫升基础液中含蔗糖 40克、乳糖38.1克、葡萄糖19.1克、柠檬酸钠9.5克；按基础液79.5％、卵 黄16％、甘油4.5％的比例混合。该发明可以提高良种公牛和名贵山羊精子的利 用率，提高精子冷冻后的复苏率和活力。但是效果还不够理想。
目前，在实验室使用的一种受精液为BO液，其成分比较复杂由11种成分 组成。BO液能使获能精子与牛成熟卵母细胞进行体外受精。但是，效果不够显 著，而且成分复杂，不易获得，成本高，很难在基层牛场大范围推广，仅适于 实验室使用。
专利申请号：97106855.0公开了一种“混合牛、山羊精子的保存与使用”， 其技术内容为：配制稀释液→磁化稀释液→采集稀释牛、山羊精子→混合牛、 山羊精子→磁化保存→人工授精。稀释液的配方为：1000毫升基础液中含蔗糖 40克、乳糖38.1克、葡萄糖19.1克、柠檬酸钠9.5克；按基础液79.5％、卵 黄16％、甘油4.5％的比例混合。该发明可以提高良种公牛和名贵山羊精子的利 用率，提高精子冷冻后的复苏率和活力。但是效果还不够理想。
目前，在实验室使用的一种受精液为BO液，其成分比较复杂由11种成分 组成。BO液能使获能精子与牛成熟卵母细胞进行体外受精。但是，效果不够显 著，而且成分复杂，不易获得，成本高，很难在基层牛场大范围推广，仅适于 实验室使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种哺乳动物促孕液，可以提高精液活力，加速精 子的获能和受精，减少人工授精的精液使用量，提高受胎率，其成分简单，容 易获得，成本低，易于推广。
本发明的目的是：一种哺乳动物促孕液，它是由下列组分制成的：(用量为 重量份)母液90-110、肝素0.002-0.005、咖啡因5-10、牛血清白蛋白0.3-0.5。
制备本发明促孕液的配方优选重量(份)配比范围是：
母液95-105、肝素0.003-0.004、咖啡因6-9、牛血清白蛋白0.35-0.45。
制备本发明促孕液的配方最佳重量(份)配比范围是：
母液100、肝素0.0035、咖啡因7.5、牛血清白蛋白0.4。
将上述各组分制成本发明促孕液的生产方法是：
1、按上述组分配比用精确度为十万分之一的电子天平称取原料后，将肝素、 咖啡因、牛血清白蛋白放入干净消毒的容器中；
2、将母液倒入上述容器中，混合均匀；
3、过滤除菌，用孔径为0.22μm的过滤器过滤去除混均液中的杂质；
4、过滤后放入干净消毒的容器内，保存于4℃的冰箱中待用。
母液为浓度为0.9％的生理盐水或pH值为7.2-7.4的PBS缓冲液。
生理盐水：含有NaCl的生理盐水溶液。
PBS缓冲液(Phosphate Buffered Saline)
成分及配制方法：将NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na2HPO4·H2O 1.56g、KH2PO4 0.2g 倒入盛有1000ml蒸馏水的烧杯中，混匀、消毒。
肝素钠(Heparin Sodium)它是一种生物活性较高的粘多糖，富含氨基硫 酸基，是硫酸化程度最高的氨基葡聚糖(GAGS)。GAGS不仅在体内对精子获能和 顶体反应起重要作用，而且能诱导牛附睾精子和射出精子的体外获能和顶体反 应，肝素的硫酸根部分以硫酸酯形式存在，且可与氨基葡萄糖的氨基缩合，这 就使肝素可与某些肽的活性氨基和糖蛋白的活性氨基结合，改变其构型和生化 特性，达到消除抑制并激活受体酶的目的。
[药品名]肝素
[英文名]Heparinum
[来源]本品最初来自肝脏，故名肝素。现多是从猪、羊、牛等动物的肠粘 膜或肝、肺中提取的一种粘多糖的硫酸酯。
[性状]为白色或类白色粉末；有引湿性。易溶于水。
[作用与用途]为体内外均能延长凝血时间的抗凝血药。其抗凝血作用极为 复杂，对凝血过程的许多环节都有影响，其作用可通过几个方面：①抑制凝血 致活酶的形成及作用，从而妨碍凝血酶原变为凝血酶；②在较高浓度时尚有抗 凝血酶作用，使纤维蛋白原不能变为纤维蛋白；③能阻止血小板的凝集和破坏 等。一般认为肝素的抗凝血作用与其分子中具阴电荷的硫酸根有关，具有阳电 荷的碱性物质如鱼精蛋白或甲苯胺蓝都能中和其阴电荷，故能抑制其抗凝血作 用。
用于防治各种原因引起的血栓形成与栓塞，如心肌梗塞、肺栓塞、脑血管 栓塞、外周静脉血栓、血管手术及各种原因引起的弥散性血管内凝血症等。早 期应用，以防止纤维蛋白原和凝血因子的耗竭；也可用于输血时代替构橼酸盐 或体外循环时作为体外抗凝血药。本品口服和直肠给药均无效，必须注射给药。
肝素是一种高度硫酸化的氨基多糖类化合物，是一种常用的诱导动物精子 体外获能的物质，当它与精子结合后，能引起钙离子进人细胞内部而导致精子 获能和顶体反应的发生，进而提高受精率，并促进原核的发育。肝素作为一种 有效的获能诱导剂，在牛的体外受精中取得了良好的效果。它是一种生物活性 较高的粘多糖，富含氨基硫酸基，是硫酸化程度最高的氨基葡聚糖(GAGS)。研 究表明，GAGS不仅在体内对精子获能和顶体反应起重要作用，而且能诱导牛附 睾精子和射出精子的体外获能和顶体反应，肝素的硫酸根部分以硫酸酯形式存 在，且可与氨基葡萄糖的氨基缩合，这就使肝素可与某些肽的活性氨基和糖蛋 白的活性氨基结合，改变其构型和生化特性，达到消除抑制并激活受体酶的目 的。
咖啡因(Caffeine)咖啡因是一种小分子的嘌呤碱，能增强精子尾部运动 强度和精子的入卵能力，从而使受精率提高，咖啡因对精子受精能力的刺激作 用在于抑制磷酸二酯酶活性，随之引起细胞内cAMP的升高，从而刺激精子活力 并有利于顶体反应。
牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)BSA是一些酶和其它生物分子 的稳定剂，是血清中的主要大分子物质，在细胞中的直接作用是吸取长链的脂 肪酸。血清白蛋白为大分子物质，能有效防止获能液中活精子发生聚头，维持 溶液的胶体渗透压。其在促使精子获能中的首要作用是介导胆固醇外流，它具 有疏水中心，可能通过提供质膜周围相对疏水的环境，使胆固醇有效分散到水 相中。其中牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)在同时有丙酮酸钠和乳 酸钠的存在下，受精率可高达83％-95％。初步认为，BSA具有很强的结合胆固 醇和锌的能力，因而可去除精子膜中的部分胆固醇和锌，调整精子膜的脂肪水 平，从而改变了精子膜的稳定性。精子一旦获能，BSA可促进其迅速穿透卵子。
为了说明本发明促孕液的优点，进行了本发明促孕液与BO也进行了对比试 验。BO也为在实验室使用的受精液，表1为BO液的成分。
表1
表2为本发明促孕液与BO液对性控精子存活时间的影响。
由表可知：促孕液与常用精子处理液相比，能够有效延长精子的存活时间， 在获能后6小时，促孕液中的精子活力仍然大于0.1，但BO液中的精子活力只 有0.05，两者差异极显著(P＜0.01)。
表3为比较促孕液与BO液用于牛成熟卵母细胞体外受精试验
表3不同获能液中的精子与牛成熟卵母细胞进行体外受精试验结果
由表可知：使用促孕液获能精子与牛成熟卵母细胞进行体外受精的分裂率 较BO液组高，差异显著(P＜0.05)，但囊胚率两者差异不显著。
从上述的对比试验可知，本发明促孕液提高了精液活力，可以延长精子的 存活时间，可以减少人工授精的精液使用量，促进精子获能受精，提高受胎率。 本发明促孕液成分简单，容易获得，保存、携带、使用方便，成本低，易于推 广，适用于基层牛场。
本发明的目的是：一种哺乳动物促孕液，它是由下列组分制成的：(用量为 重量份)母液90-110、肝素0.002-0.005、咖啡因5-10、牛血清白蛋白0.3-0.5。
制备本发明促孕液的配方优选重量(份)配比范围是：
母液95-105、肝素0.003-0.004、咖啡因6-9、牛血清白蛋白0.35-0.45。
制备本发明促孕液的配方最佳重量(份)配比范围是：
母液100、肝素0.0035、咖啡因7.5、牛血清白蛋白0.4。
将上述各组分制成本发明促孕液的生产方法是：
1、按上述组分配比用精确度为十万分之一的电子天平称取原料后，将肝素、 咖啡因、牛血清白蛋白放入干净消毒的容器中；
2、将母液倒入上述容器中，混合均匀；
3、过滤除菌，用孔径为0.22μm的过滤器过滤去除混均液中的杂质；
4、过滤后放入干净消毒的容器内，保存于4℃的冰箱中待用。
母液为浓度为0.9％的生理盐水或pH值为7.2-7.4的PBS缓冲液。
生理盐水：含有NaCl的生理盐水溶液。
PBS缓冲液(Phosphate Buffered Saline)
成分及配制方法：将NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na2HPO4·H2O 1.56g、KH2PO4 0.2g 倒入盛有1000ml蒸馏水的烧杯中，混匀、消毒。
肝素钠(Heparin Sodium)它是一种生物活性较高的粘多糖，富含氨基硫 酸基，是硫酸化程度最高的氨基葡聚糖(GAGS)。GAGS不仅在体内对精子获能和 顶体反应起重要作用，而且能诱导牛附睾精子和射出精子的体外获能和顶体反 应，肝素的硫酸根部分以硫酸酯形式存在，且可与氨基葡萄糖的氨基缩合，这 就使肝素可与某些肽的活性氨基和糖蛋白的活性氨基结合，改变其构型和生化 特性，达到消除抑制并激活受体酶的目的。
[药品名]肝素
[英文名]Heparinum
[来源]本品最初来自肝脏，故名肝素。现多是从猪、羊、牛等动物的肠粘 膜或肝、肺中提取的一种粘多糖的硫酸酯。
[性状]为白色或类白色粉末；有引湿性。易溶于水。
[作用与用途]为体内外均能延长凝血时间的抗凝血药。其抗凝血作用极为 复杂，对凝血过程的许多环节都有影响，其作用可通过几个方面：①抑制凝血 致活酶的形成及作用，从而妨碍凝血酶原变为凝血酶；②在较高浓度时尚有抗 凝血酶作用，使纤维蛋白原不能变为纤维蛋白；③能阻止血小板的凝集和破坏 等。一般认为肝素的抗凝血作用与其分子中具阴电荷的硫酸根有关，具有阳电 荷的碱性物质如鱼精蛋白或甲苯胺蓝都能中和其阴电荷，故能抑制其抗凝血作 用。
用于防治各种原因引起的血栓形成与栓塞，如心肌梗塞、肺栓塞、脑血管 栓塞、外周静脉血栓、血管手术及各种原因引起的弥散性血管内凝血症等。早 期应用，以防止纤维蛋白原和凝血因子的耗竭；也可用于输血时代替构橼酸盐 或体外循环时作为体外抗凝血药。本品口服和直肠给药均无效，必须注射给药。
肝素是一种高度硫酸化的氨基多糖类化合物，是一种常用的诱导动物精子 体外获能的物质，当它与精子结合后，能引起钙离子进人细胞内部而导致精子 获能和顶体反应的发生，进而提高受精率，并促进原核的发育。肝素作为一种 有效的获能诱导剂，在牛的体外受精中取得了良好的效果。它是一种生物活性 较高的粘多糖，富含氨基硫酸基，是硫酸化程度最高的氨基葡聚糖(GAGS)。研 究表明，GAGS不仅在体内对精子获能和顶体反应起重要作用，而且能诱导牛附 睾精子和射出精子的体外获能和顶体反应，肝素的硫酸根部分以硫酸酯形式存 在，且可与氨基葡萄糖的氨基缩合，这就使肝素可与某些肽的活性氨基和糖蛋 白的活性氨基结合，改变其构型和生化特性，达到消除抑制并激活受体酶的目 的。
咖啡因(Caffeine)咖啡因是一种小分子的嘌呤碱，能增强精子尾部运动 强度和精子的入卵能力，从而使受精率提高，咖啡因对精子受精能力的刺激作 用在于抑制磷酸二酯酶活性，随之引起细胞内cAMP的升高，从而刺激精子活力 并有利于顶体反应。
牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)BSA是一些酶和其它生物分子 的稳定剂，是血清中的主要大分子物质，在细胞中的直接作用是吸取长链的脂 肪酸。血清白蛋白为大分子物质，能有效防止获能液中活精子发生聚头，维持 溶液的胶体渗透压。其在促使精子获能中的首要作用是介导胆固醇外流，它具 有疏水中心，可能通过提供质膜周围相对疏水的环境，使胆固醇有效分散到水 相中。其中牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)在同时有丙酮酸钠和乳 酸钠的存在下，受精率可高达83％-95％。初步认为，BSA具有很强的结合胆固 醇和锌的能力，因而可去除精子膜中的部分胆固醇和锌，调整精子膜的脂肪水 平，从而改变了精子膜的稳定性。精子一旦获能，BSA可促进其迅速穿透卵子。
为了说明本发明促孕液的优点，进行了本发明促孕液与BO也进行了对比试 验。BO也为在实验室使用的受精液，表1为BO液的成分。
表1
表2为本发明促孕液与BO液对性控精子存活时间的影响。
由表可知：促孕液与常用精子处理液相比，能够有效延长精子的存活时间， 在获能后6小时，促孕液中的精子活力仍然大于0.1，但BO液中的精子活力只 有0.05，两者差异极显著(P＜0.01)。
表3为比较促孕液与BO液用于牛成熟卵母细胞体外受精试验
表3不同获能液中的精子与牛成熟卵母细胞进行体外受精试验结果
由表可知：使用促孕液获能精子与牛成熟卵母细胞进行体外受精的分裂率 较BO液组高，差异显著(P＜0.05)，但囊胚率两者差异不显著。
从上述的对比试验可知，本发明促孕液提高了精液活力，可以延长精子的 存活时间，可以减少人工授精的精液使用量，促进精子获能受精，提高受胎率。 本发明促孕液成分简单，容易获得，保存、携带、使用方便，成本低，易于推 广，适用于基层牛场。
具体实施方式
一种哺乳动物促孕液，按下述重量配比称取原料(克)：浓度为0.9％的生理 盐水100、肝素0.0035、咖啡因7.5、牛血清白蛋白0.4。
生产方法如下：
1、按上述组分配比用精确度为万分之一的电子天平称取原料后，将肝素、 咖啡因、牛血清白蛋白放入干净消毒的容器中；
2、将浓度为0.9％的生理盐水倒入上述的容器中，混合均匀；
3、过滤除菌，用孔径为0.22μm的过滤器过滤去除混均液中的杂质；
4、过滤后放入干净消毒的容器内，保存于4℃的冰箱中待用。
本发明使用方法：在母牛或其他动物发情后12-24小时，将促孕液2-5ml 注入子宫体或发情侧子宫角的受精部位，然后马上将精液输入相同部位稍后的 位置。此促孕液可用于精子数少活力稍差的性控冻精和常规精液配种，也可用 于输精时间较晚牛的追配。
生产方法如下：
1、按上述组分配比用精确度为万分之一的电子天平称取原料后，将肝素、 咖啡因、牛血清白蛋白放入干净消毒的容器中；
2、将浓度为0.9％的生理盐水倒入上述的容器中，混合均匀；
3、过滤除菌，用孔径为0.22μm的过滤器过滤去除混均液中的杂质；
4、过滤后放入干净消毒的容器内，保存于4℃的冰箱中待用。
本发明使用方法：在母牛或其他动物发情后12-24小时，将促孕液2-5ml 注入子宫体或发情侧子宫角的受精部位，然后马上将精液输入相同部位稍后的 位置。此促孕液可用于精子数少活力稍差的性控冻精和常规精液配种，也可用 于输精时间较晚牛的追配。
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