糖基化/半乳糖基化肽、双官能接头和核苷酸单体/多聚体的缀合物以及相关的组合物和使用方法
阅读：2发布：2021-06-26
专利汇可以提供糖基化/半乳糖基化肽、双官能接头和核苷酸单体/多聚体的缀合物以及相关的组合物和使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种式A-L-P的缀合物，其中：A代表与细胞表面受体结合的糖基化/半乳糖基化肽，L代表双官能接头，它不包含天然存在的 氨 基酸且与A和P以区域专一性方式共价结合，而P代表包含至少一个核苷酸或其类似物的 单体 、同聚物或杂聚物，它以不依赖于序列的方式抑制核苷酸或核酸的细胞内 生物 合成，其中A与L之间的共价键和L与P之间的共价键之任一或二者可以在细胞内被切割；一种包含这种缀合物的组合物；和一种抑制 哺乳动物 异常 细胞增殖 的方法；和一种抑制病毒在哺乳动物中复制的方法。，下面是糖基化/半乳糖基化肽、双官能接头和核苷酸单体/多聚体的缀合物以及相关的组合物和使用方法专利的具体信息内容。
发明领域
本发明涉及化学确定的、结构均一的糖基化/半乳糖基化肽、双官 能接头和核苷酸单体/多聚体的缀合物，包含此缀合物的组合物和使用 方法，如用于抑制异常细胞增殖和抑制病毒复制。
发明背景
核苷酸和核酸生物合成对于不受控的癌细胞增殖和病毒病原体复 制都是基本的。核苷类似物选择性干扰核苷酸和核酸生物合成的能力 使这些化合物成为理想的抗癌和抗病毒药。
核苷类似物通过与核苷酸和核酸的天然存在的对应物竞争在核酸 生物合成中涉及的酶结合位点而抑制核苷酸和核酸的合成(Perigaud 等人，Nucleosides and Nucleotides(核苷和核苷酸)，11：903(1992))，因 而阻止核酸前体，包括核苷和核苷酸的形成。而且，往核酸分子中掺 入类似物阻碍这些分子的复制和/或转录。因此，将核苷类似物施用于 癌细胞可以抑制它们的增殖，而将这种类似物施用于病毒感染的细胞 可以抑制感染病毒的复制。
由于核苷类似物的尺寸较小且为静电中性，因此它们容易地横穿 质膜，有利于传送至它们的细胞内靶位点。但是，核苷类似物的治疗 作用大大受限于它们对将其转化为活性抑制剂的细胞内酶的依赖性。 磷酸基与核苷酸类似物的糖残基附着是抑制核苷酸和核酸生物合成的 必需步骤。在某些情况下，核苷类似物必须经过两步或更多步才能转 化为活性代谢物，由此增加它们用作抑制剂所需的时间和该类似物转 化为失活代谢物最终降低其有效性的机会。
通过使用包含磷酸基的核苷酸类似物减轻了对用于转化成活性抑 制剂的细胞内酶的依赖性。虽然与核苷类似物相比它们提供更为直接 的作用方式，但将核苷酸类似物递送至细胞内部受到磷酸基的高度负 电的严重阻碍。因此，期望一种将核苷酸类似物递送至它们的细胞内 靶体的机理。
Gmeiner等人(美国专利5,457,187)公开通过共价附着亲脂性或阳 离子部分，包括胆固醇、乙基间隔的金刚烷、1，2-二十六烷基甘油和聚 -L-赖氨酸而递送核苷酸类似物5-氟脱氧尿苷5′一磷酸。通过递送类似 物作为均寡聚体进一步促进进入细胞。虽然这些缀合物提供一种将药 物递送至细胞内的机理，但它们没有使核苷酸类似物靶向作用于特定 的组织或细胞。
如大部分药物一样，核苷酸类似物的临床应用由于它们不能到达 靶细胞群和它们给非靶细胞施加毒性而受到限制。组织特异性药物靶 向将不仅减少全身毒性，而且还通过富集靶细胞或组织中的药物而加 强药物作用(Wadhwa等人，J.Drug Targeting 3：111(1995))。因此需要 组织特异性方式靶向核苷酸类似物。
由此提出数种组织特异性药物靶向策略，以尝试克服这些问题。 一种这样的策略，载体介导的药物靶向，包括共价或非共价结合药物 与组织特异性靶向部分。在称为主动靶向的此策略的一个亚组中，靶 向部分是被特异性受体识别的配体，所述受体主要处在靶位点。配体 与受体结合导致受体介导的胞吞，其中药物-配体缀合物与受体一起被 靶细胞内化。缀合物一旦处在细胞内便对切割配体和药物之间的键的 细胞内酶易感，导致药物从缀合物中释放。通过这种方式实现将治疗 剂递送至靶细胞群。
配体定向的、受体介导的胞吞是几种药物靶向系统所依赖的基础。 抗体或其片段、激素、细胞因子和其它可溶蛋白如胃泌素和转铁蛋白 都已被用作递送药物至特定细胞群的靶向配体。例如，Myers等人(美 国专利5,087,616)公开一种药物递送缀合物，其中通过与激素配体上皮 生长因子结合而将药物道诺霉素特异性地递送至上皮细胞。此外， Gmeiner等人(美国专利5,663,321)公开通过与抗体或其片段结合而递 送包括核苷酸类似物5-氟脱氧尿苷5′一磷酸的单体的均寡聚体。
但是配体的性质并不总是蛋白质。糖部分用作已知为凝集素的受 体家族的配体。这些受体依据它们的组织表达和配体特异性而不同。 例如，Kupffer细胞上发现的凝集素对甘露糖具有特异性，而在肝内 皮细胞上发现的凝集素选择性地与岩藻糖残基结合。
已深入地研究了脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，这是一种主要在 肝细胞表面发现的凝集素，目的在于将治疗剂递送至肝。由于它介导 与实际上任何含有末端半乳糖或乙酰半乳糖胺残基的实体之间的高度 亲合相互作用而不管该实体的尺寸或结构，因而ASGPR是一种用于 药物递送的模型系统。Wu等人的开拓性工作(J.Biol.Chem.262： 4429(1987))证明与连接脱唾液酸血清类粘蛋白(含半乳糖/乙酰半乳糖 胺的蛋白)的聚-L-赖氨酸静电复合的反义寡核苷酸通过与ASGPR的 直接的相互作用而被有效和特异性地摄入人肝癌细胞。但是，由于反 义寡核苷酸与靶向部分非共价结合，有理由推断所得的缀合物的生物 稳定性小于共价结合的情况。
已将通过使用ASGPR的组织特异性药物靶向应用于核苷酸类似 物的递送。例如，Groman等人(美国专利5,554,386)公开一种包含核 苷酸类似物araAMP和多糖阿拉伯半乳聚糖的缀合物，该缀合物与 ASGPR结合以将药物递送至肝细胞。但是由于多糖含有多个药物结合 位点，这种缀合物的合成会产生缀合物的非均匀混合物，其中每一缀 合物中的核苷酸类似物的数目随每批而变化。因此，缀合物的IC50也 将随每批而各不相同，从而很难确定施用剂量。
Rohlff等人(Cancer Research(癌症研究)59：1268(1999))公开一种 药物-配体缀合物OGT719，其中单一的半乳糖部分与核苷类似物，5- 氟尿嘧啶共价结合。虽然此药物缀合物在动物模型中表现为有效，但 根据Lee等人的研究(Biochemistry (生物化学)23：4255(1984))，预测 它与ASGPR微弱地结合，在Lee等人的研究中含有三个或四个以特 定的构象排列的半乳糖残基的配体与ASGPR结合的亲合力比单一残 基大得多。期望高亲合力结合的缀合物，从而可以施用较低剂量的缀 合物以实现目标治疗效果。
在全盘考虑的情况下，期望有一种能够经过配体定向的、受体介 导的胞吞而以组织特异性的方式将核苷酸类似物递送至它们的细胞内 靶体的缀合物。构成该缀合物的组分应该彼此共价结合以具有最大的 生物稳定性。该缀合物应该是化学确定的和结构均一的，从而可以确 定单一的IC50。该缀合物还应该以高度亲合力与靶向受体结合。具有 这些性能的缀合物将具有改进的治疗指数。
本发明的一个目的是提供这样一种缀合物。从本文提供的详细描 述中可以明显看出这一目的和其它的目的和优点，以及另外的发明特 征。
发明概述
本发明提供一种化学确定的、结构均一的式A-L-P的缀合物，其 中：
A代表与细胞上的细胞表面受体结合的糖基化/半乳糖基化肽，
L代表双官能接头，它不包含天然存在的氨基酸并以区域专一性 方式与A和P共价结合，和
P代表包含至少一个核苷酸或其类似物的单体、同聚物或杂聚物， 其以不依赖于序列的方式抑制核苷酸或核酸的细胞内生物合成，
其中A与L之间的共价键和L与P之间的共价键之任一或二者可 以在细胞内被切割。当A被糖基化时，细胞表面受体在构成肝脏的细 胞上。当A被半乳糖基化时，细胞表面受体为脱唾液酸糖蛋白受体。 还提供包含这种缀合物的组合物。
本发明还提供一种抑制需要这种抑制的哺乳动物中的异常细胞增 殖的方法。所述方法包括给哺乳动物施用异常细胞增殖抑制量的上述 缀合物或包含该缀合物的组合物，由此抑制哺乳动物的异常细胞增殖。
本发明还提供一种抑制哺乳动物中病毒复制的方法。所述的方法 包括给哺乳动物施用病毒复制抑制量的上述缀合物或包含该缀合物的 组合物，由此抑制在哺乳动物中病毒的复制。
附图的简要说明
图1描述″A-L-P″缀合物的示意图，其中A包含配体，L包含交 联剂和修饰剂，而P包含n个核苷酸或其类似物，其中n＝核苷酸或其 类似物的数目。
图2描述含有示踪剂的配体特异性A-L-P缀合物的分子装配。
图3描述三-、四-、和多-触角配体的实例。
图4描述5′-C6-二硫化物5-氟-2′-脱氧尿苷的自动合成。
图5描述从固相载体上除去和合成5′-硫醇修饰的5-氟-2′-脱氧尿 苷。
图6描述YEE(ahGalNAc)3-SMCC-5-氟-2′-脱氧尿苷缀合物， po-1-mer和ps-1-mer的合成。
图7描述粗制磷酸二酯一核苷酸或其类似物(po 1-mer)缀合反应 混合物的HPLC分析。
图8描述粗制硫代磷酸酯一核苷酸或其类似物(ps 1-mer)缀合反 应混合物的HPLC分析。
图9描述从固相载体中除去和合成5′-硫代磷酸5-氟-2′-脱氧尿苷。
图10显示用于制备5-氟-2′-脱氧尿苷缀合物(18-聚体)的详述反应 路线。
图11描述含有5-氟-2′-脱氧尿苷的寡核苷酸(18-聚体)的合成。
图12描述氟脱氧尿苷缀合物(18-mer)的结构。
图13显示甲酰四氢叶酸缀合物的结构。
发明详述
本发明提供一种化学确定的、结构均一的式A-L-P的缀合物，其 中：
A代表与构成肝脏的细胞上的细胞表面受体结合的糖基化肽，
L代表双官能接头，它不包含天然存在的氨基酸并以区域专一性 方式与A和P共价结合，和
P代表包含至少一个核苷酸或其类似物的单体、同聚物或杂聚物， 其中该核苷酸或其类似物以不依赖于序列的方式抑制核苷酸或核酸的 细胞内生物合成，
其中A与L之间的共价键和L与P之间的共价键之任一或二者可 以在细胞内被切割。
本发明还提供一种化学确定的、结构均一的式A-L-P的缀合物， 其中：
A代表与细胞上的细胞表面脱唾液酸糖蛋白受体结合的半乳糖基 化肽，
L代表双官能接头，它不包含天然存在的氨基酸且它以区域专一 性方式与A和P共价结合，和
P代表包含至少一个核苷酸或其类似物的单体、同聚物或杂聚物， 其中该核苷酸或其类似物以不依赖于序列的方式抑制核苷酸或核酸的 细胞内生物合成，
其中A与L之间的共价键和L与P之间的共价键之任一或二者可 以在细胞内被切割。
本文所用的术语“化学确定的”描述具有明确的化学式例如 C6H12O2的实体。化学确定的实体的分子量是绝对的，因而它不是平 均分子量。而且，分子量不随批合成而改变。
本文所用的术语“化学均一的”意指至少95％的递送装配，最优 选至少99％的递送装配在组成和连接方面是单一种类。化学均一性可 以由聚丙烯酰胺凝胶电泳、反相高压液相色谱法、核磁共振、质谱和 化学分析来确定。短语“化学确定的、结构均一的”与“化学均一的” 可互换使用。
本文所用的术语“结构均一的”描述一种实体，其特征在于组分 的绝对比率。例如，本发明为包含组分A、L和P的缀合物，其中每 个缀合物中只存在一个A、一个L和一个P。A∶L∶P组分的1∶1∶1 比率不随批合成而改变。
“核苷”是一种包含碱基和糖的化合物。“核苷酸”是一种由如以 上定义的碱基、糖和磷酸基组成的化合物，它也称为单核苷酸。核苷 酸和核苷的碱基可以是，但不限于嘌呤和嘧啶。核苷酸和核苷的糖可 以是，但不限于核糖和脱氧核糖。嘌呤包括例如腺嘌呤和鸟嘌呤。嘧 啶包括例如胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。
“核苷类似物”是一种在糖或碱基部分含有至少一种修饰的天然 存在的核苷。例如，核苷类似物的修饰包括一个或数个糖原子的取代、 杂环碱基修饰、糖上的核苷键置换、异头反向(β→α)、糖残基的环碳 上多种官能团的添加、糖残基的羟基的取代或除去、环尺寸的改变、 糖构型的反向(D→L)和呋喃糖环分解成无环核苷。
本领域技术人员理解任何核苷类似物可以被磷酸化，从而使其成 为核苷酸类似物。术语“核苷酸类似物”是具有至少一个非天然存在 部分的部分，且它的功能类似于或优于天然存在的核苷酸。例如，核 苷酸类似物可以具有改变的糖部分、碱基或糖间键。核苷酸类似物的 修饰包括以上关于核苷类似物所述的修饰，和改变与磷酸基的磷原子 结合的原子或官能团。这些包括但不限于可以产生“非磷酸二酯核苷 酸间键，”即非磷酸二酯键的改变(例如，参见Waldner等人，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters，6(19)，2363-2366(1996))。甲基膦酸酯 核苷酸间键、硫代磷酸酯核苷酸间键及其组合是“非磷酸二酯核苷酸 间键”的实例。包含核苷酸或核苷酸类似物的聚合物中的一些、一个、 无或全部核苷酸间键可以被这些修饰键代替。
“P”部分包括以不依赖于序列的方式抑制核苷酸或核酸在细胞内 生物合成的任何适宜的核苷酸或其类似物。本领域技术人员理解抑制 作用不要求完全抑制，因为有益或治疗效果可以由任何程度的抑制作 用实现。相反，存在不同程度的抑制作用。本文所用的术语“不依赖 于序列的方式”应该指构成P的核苷酸或其类似物的碱基序列的非重 要性。“P”不是反义寡核苷酸，该术语用于本技术，即用于抑制转录 或翻译。可以根据本技术中已知和本文所列举的测定来确定给定的核 苷酸或其类似物是否抑制核苷酸和核酸的细胞内生物合成。
适宜的核苷酸类似物可以包含任何数目的核苷类似物。核苷类似 物包括但不限于苷元修饰的核苷类似物，它可以包含例如氟化嘧啶。 例如，氟化嘧啶可以是5-氟尿嘧啶(5FU)。或者苷元修饰的核苷类似物 可为5-氟-2′-脱氧尿苷(5FdU)，或者它可以为氮杂嘧啶核苷，例如5- 氮胞苷(还已知为5-azaCyd或4-氨基-1-(β-D-呋喃核糖基-1，3，5-三嗪-2- 酮))、5-氮尿苷(5-AzaUrd)、6-氮胞苷(6-AzaCyd)或6-氮尿苷 (6-AzaUrd)。而且，苷元修饰的核苷类似物可以为3-脱氮嘧啶核苷， 例如3-脱氮尿苷(3-DeazaUrd)。核苷类似物还包括糖修饰的核苷，例 如AraC(还已知为1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷、 阿糖胞苷(cytarabine和cytosar))、环胞苷、2′-O-硝基-AraC、AraA、 (还已知为9-β-D-阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤、阿糖腺苷和vira-A)、环杀 菌素(cyclaridine)、2′，2′二氟脱氧胞苷(吉西他滨)和2′-脱氧-2′-亚甲基- 胞苷(DMDC)。糖修饰的核苷可以是无环核苷，例如阿昔洛韦(还称为 9-(2-羟基乙氧基甲基)鸟嘌呤、无环鸟苷和ACV)或更昔洛韦(还已知为 cytovene、DHPG、9-(1，3-二羟基-2-丙氧基甲基)鸟嘌呤、2′-去甲-2′- 脱氧鸟苷、2′NDG、BIOLF-62或BWB759U)。
核苷类似物还包括磷酸氟达拉滨、2-卤代腺嘌呤-2′-脱氧核糖核 苷、2-氯腺嘌呤-阿拉伯核苷、2′-脱氧助间型霉素和2-卤代-2′-氟阿拉 伯核苷。本领域技术人员将认识到本文未具体提及名称的其它核苷类 似物可以用于本发明的范围，并可以容易地商购得到。
“P”是包含至少一个寡核苷酸或其类似物的单体、同聚物或杂聚 物。“P”在包含一个核苷酸或其类似物时为单体。“P”在包含至少两 个核苷酸或其类似物且其中所述至少两个核苷酸相同时为同聚物。当 “P”包含至少两个核苷酸或其类似物且至少一个核苷酸或其类似物与 另一个核苷酸或其类似物不同时，“P”为杂聚物。例如，“P”可以是 包含5FdU的单体、同聚物或杂聚物。当“P”为同-或杂聚物时，单 元的数目可以是2-50、2-40、2-30、2-20，优选2-12，更优选2-6，最 优选2-4。在一个优选的实施方案中，“P”为5FdU的同聚物。优选“P” 为包含2-12个5FdU的同聚物，更优选“P”为包含2-6个5FdU的 同聚物。特别优选“P”为5FdU单体。
当“P”为杂-或同聚物时，每一个核苷酸或其类似物与相邻的核 苷酸或其类似物共价结合。理想地，至少一个共价键可以在细胞内被 切割。优选所有的核苷酸间共价键可以在细胞内被切割。可以使用任 何适宜的核苷酸间共价键。优选的共价键包括磷酸二酯键(po)或硫代 磷酸酯键(ps)。例如，同聚物或杂聚物中的核苷酸间共价键可以相同或 不同，并可以交替。优选同聚物或杂聚物中的核苷酸间共价键相同。 为了监测ALP的递送和/或效力，“P”可以包含放射性核素。
“A”为与构成肝脏的细胞的细胞表面受体结合的糖基化肽或与 细胞上的细胞表面脱唾液酸糖蛋白受体结合的半乳糖基化肽，图3提 供了其非限制性的实例。本文所用的“糖基化肽”为任何含有至少一 个糖(即单糖或多糖)部分的聚酰胺。优选“A”为糖基化寡肽。本文所 用的“半乳糖基化肽”为任何含有至少一个半乳糖残基的聚酰胺。优 选“A”为半乳糖基化寡肽。“A”为合成的、化学确定的、结构均一 的寡肽支架，它被包括但不限于以下的多种糖残基中的任何一种糖基 化：葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖和岩 藻糖。优选“A”为
其中，特别优选YEE(ahGalNAc)3。适宜的“A”化合物可以使用 本领域中已知的方法制备(例如参见Lee等人，Biochem，23： 4255-4261(1984)；Lee等人，J Carbohydrate Chemistry，5(3)： 343-357(1986)；Lee等人，Targeted Diagn.Ther.4：65-86(1991)；Lee， Carbohydrate Research，67：509-514(1978))。
“L”为双官能接头，它不包括天然存在的氨基酸或由天然存在的 氨基酸形成的肽。“L”以区域专一性方式与“A”和“P”共价结合。 可以使用任何适宜的接头。理想的“L”为杂双官能性的。
适宜的接头为可商购(例如Pierce Chemical Co.)得到的交联剂产 物。通常，交联剂仅在能够以区域专一性方式与“A”和“P”连接的 末端包含反应基团，从而减少发生不期望的副反应的可能性。可以获 得大量能够与“A”和“P”上存在的多种官能团反应的交联剂。因此， 可以缀合许多化学独特的键。优选L为包括以下的交联剂的产物：活 性酯、异硫氰基、异氰基、酰基、卤素、马来酰亚氨基或活性二硫化 物基团。例如，“L”可以是以下交联剂的产物：
或α-柠康酰基-K-(ε-FMOC)PILFFRL(N-α-柠康酰基 -Lys(eFMOC)-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Lys-COOH)。优选L为交联 剂N-羟基琥珀酰亚氨基4-(N-甲基马来酰亚氨基)环己基-1-甲酸酯 (SMCC)的产物。
在“A”一个特定的实例中，YEE(ahGalNAc)3(图3)在其氨基末端 含有游离氨基。它将区域专一性和位点特异性地与杂双官能性交联剂 SMCC反应形成酰胺键。核苷酸或其类似物如果被化学修饰为包含游 离巯基，则它将与SMCC化学结合形成硫醚键。在此实例中，在“A” 和“P”之间形成的键可以概括为酰胺/硫醚。优选“A”通过酰胺键与 “L”共价结合，而“L”通过硫醚键与“P”共价结合。“A”和“P” 之间通过“L”的其它键包括但不限于酰胺/酰胺、硫醚/酰胺、二硫化 物/酰胺、酰胺/硫醚和酰胺/二硫化物。该键还可以归类为生物学稳定 的(硫醚、胺)、稍微生物学稳定的(酰胺)和生物学不稳定的(二硫化物)。 因此，可以将递送系统进行结构修饰以在细胞外和细胞内介质中遭遇 的不同的化学环境中起作用。
本发明的优选的缀合物为这样的缀合物，其中“A”为 YEE(ahGalNAc)3，“L”为交联剂SMCC的产物，而“P”包含至少一 个5FdU。“P”可以是5FdU的同聚物，优选“P”为5FdU单体。
本发明还提供一种包含上述缀合物的组合物。优选该组合物还包 含药学上可接受的载体。适宜的“药学上可接受的载体”在本技术中 是已知的。通常，该药物组合物可以包含生理盐水溶液；右旋糖或其 它糖溶液；或者乙烯、丙烯、聚乙烯或其它乙二醇。
本领域技术人员将认识到将A-L-P缀合物或其组合物施用于动 物，例如哺乳动物如人的合适方法是已知的，而且虽然可以使用多于 一种途径施用特定的组合物，但一种特定的途径可以提供比其它途径 更直接和更有效的反应。载体的选择将在部分程度上由特定的组合物 和用于施用组合物的特定方法所决定。因此，存在大量的本发明组合 物的适宜制剂。
适于口服的制剂可以由以下组成：(a)液体溶液，如溶于稀释剂， 如水或盐水的有效量的缀合物，(b)胶囊、小袋或片剂，每一种包含预 定量的作为固体或颗粒的活性成分，(c)在适宜液体中的悬浮液，和(d) 适宜的乳液。
片剂可以包含一种或多种以下成分：乳糖、甘露醇、玉米淀粉、 马铃薯淀粉、微晶纤维素、阿拉伯树胶、明胶、胶体二氧化硅、交联 羧甲纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、稀 释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂和药理学相容的载体。锭剂 (Lozenge)可以包含在调味剂，通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶中的 活性成分，而软锭剂(pastilles)包含在惰性碱，如明胶和甘油中的活性 成分，或蔗糖和阿拉伯树胶乳液、凝胶等除了活性成分以外还包含本 技术中已知的载体。
适于肠胃外施用的制剂包括水溶液和非水溶液、等渗无菌注射液， 所述溶液可以包含抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与目标接受者的 血液等渗的溶质；含水和非水无菌悬浮液，所述悬浮液可以包括悬浮 剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。制剂可以以单位剂量或多剂 量封闭容器如安瓿和小瓶呈现，并可以在仅要求在使用前即刻加入无 菌液体载体如注射用水的冷冻干燥(冻干)条件下储存。可以由无菌 粉末、颗粒和前述种类的片剂制备临时注射溶液和悬浮液。
本发明的缀合物可以单独施用或与其它适宜的组分联合施用。这 些组分包括帮助治疗剂(即″P″)更有效抑制异常细胞增殖或病毒复制 的组分。例如，配体衍生的甲酰四氢叶酸(甲酰四氢叶酸)可以同时施用 以增强5FdU的效力。
鉴于上述，本发明还提供一种抑制需要这种抑制的哺乳动物的异 常细胞增殖的方法。所述方法包括给哺乳动物施用异常细胞增殖抑制 量的上述缀合物或组合物，由此抑制哺乳动物的异常细胞增殖。“异常 细胞增殖抑制量”的缀合物是足以抑制异常细胞增殖至任何程度的缀 合物的量。优选异常细胞增殖为肝细胞癌。本发明缀合物和组合物还 在治疗学上用于治疗肝的其它疾病或障碍，如肿瘤和感染性疾病和病 症。
还鉴于上述，本发明提供一种抑制需要这种抑制的哺乳动物中的 病毒复制的方法。所述方法包括给哺乳动物施用病毒复制抑制量的上 述缀合物或组合物，由此抑制病毒在哺乳动物中的复制。缀合物的“病 毒复制抑制量”是足以抑制病毒复制至任何程度的缀合物的量。优选 病毒复制为肝炎病毒复制。
施用于本发明范围内的动物，特别是人的剂量应该足以在动物中 在合理的时间范围内产生治疗反应。所述剂量将由特定组合物的强度 和动物(如人)的病症，以及待治疗的动物(如人)的体重来确定。剂量的 大小还将由可能伴随特定组合物给药的任何不良副作用的存在、性质 和程度来确定。内部施用的适宜剂量为0.01-100mg/kg/天。优选的剂 量为0.01-35mg/kg/天。更优选的剂量为0.05-5mg/kg/天。局部施用 的药物组合物中缀合物的适宜浓度为0.05-15％(按重量计)。优选的浓 度为0.02-5％。更优选的浓度为0.1-3％。最后，主治医师将决定用于 治疗各个体患者的本发明缀合物的剂量和数量，考虑多种因素，如年 龄、体重、一般健康、饮食、性别、待施用的组合物、施用途径和所 治疗的疾病的严重程度。
实施例
以下实施例用于例示本发明，而不意在以任何方式限定其保护范 围。
缩写
为方便起见，使用以下缩写：AET，2-氨基巯基乙醇(氨基乙硫醇)； ATP，三磷酸腺苷；BAP，细菌碱性磷酸酶；CPG，可控孔度玻璃载 体；DIPEA，二异丙基乙胺；D-MEM，Dulbecco’s改良Eagle培养基； DMSO，二甲亚砜；DPBS，Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水；DTT，二 硫苏糖醇；EDAC，1-乙基-3-[3(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺；EDTA， 乙二胺四乙酸盐；FCS，胎牛血清；GalNAc，N-乙酰半乳糖胺；MEM， 含Earle盐的极限必需培养基；SMCC，N-羟基琥珀酰亚氨基4(N-甲 基马来酰亚氨基)环己基-l-甲酸酯；Tris，三(羟基甲基)胺；PNK，苯 基核苷酸激酶；Hep G2，人肝细胞癌；TSV，人前列腺腺癌；Caki-1， 人肾细胞；HBSS，Hank’s平衡盐溶液；RPMI，Roswell公园纪念研 究所；po 1-mer，磷酸二酯单核苷酸缀合物；ps 1-mer，硫代磷酸酯单 核苷酸缀合物；5FU 1-mer，5-氟尿嘧啶单核苷酸缀合物；AFP，α- 胎蛋白。
实施例1
此实施例描述5′-C6二硫化物5-氟-2′脱氧尿苷单核苷酸(4a和4b， 图4)的合成。
使用0.3701g(26μmole/g装载容量)的Universal-Q CPG(1，图4) 制备15μmole柱，并将其置于Millipore Expedite DNA/RNA合成器 的两个反应端口之一。具体而言，将含有5-氟-2′-脱氧尿苷合成子(0.25 g，在5ml CH3CN中)的CH3CN溶液置于“T”瓶，并将C6二硫化物 亚磷酰胺合成子(3，图4)置于“5”瓶(例如参见Smith等人，Nucleosides 和Nucleotides，15(10)，1581-1594(1996))。依次完成自动合成(从3′→5′- 端)，并使5-氟-2′-脱氧尿苷亚磷酰胺合成子(2，图4)与固相载体发生 反应，然后用硫醇修饰合成子(3，图4)处理。对于磷酸二酯连接的化 合物，使用标准氧化溶液(在四氢呋喃/吡啶/H2O的溶液中的3％I2)； Glen Research Inc.Sterling，VA)。如果需要的话，用Beaucage试剂 (Glen Research Inc.)代替氧化剂溶液以进行亚磷酸酯硫化以根据标准 的确定的方法得到硫代磷酸酯。该试剂使用的浓度为在10ml无水 CH3CN中含100mg试剂。遵循标准氧化时间(对于磷酸二酯和硫代磷 酸酯连接的化合物均为30秒)。最后留下5′-DMT以利于纯化。
然后从反应端口移出柱，并在真空下干燥。然后清空柱内含物至 50ml圆锥管，并用10ml等分试样的在1/1(v/v)CH3OH/H2O中的0.5 M NaOH将固相载体处理3小时，其后用20ml 0.5M磷酸钠溶液(pH 5.8)使溶液变为中性pH(pH7)。然后用蒸馏去离子H2O将该中性溶液 稀释至70ml，并将其用于经典的反相C18 SepPakTM柱体(Waters， Inc.)。在加入样品之前，用CH3OH(10ml)，在H2O中的50％(v/v) CH3CN，然后用10ml H2O预平衡柱。用H2O(20ml)，然后用25ml 在H2O中的5％CH3CN洗涤柱。然后将柱返回至H2O(25ml)，并使 用1％三氟乙酸水溶液(20ml)脱除三苯甲基。柱颜色快速变至橙色，然 后停止流动10分钟以完全除去该保护基。使用磷酸钠(1ml，pH 5.8， 0.5M溶液)以增加pH，然后用H2O洗涤(20ml)。然后用在H2O中的 50％CH3CN洗脱产物(5a和5b，图5)。然后通过反相HPLC分析此 馏分，并用UV分光光度法定量，λmax 268nm，λ268 5280M-1 cm-1； A268 0.02/20μl；最终产量为5.67μmole 5a(图5)。5a(图5)的HPLC分 析：洗脱时间24分钟(5a，图5)，使用在50mM磷酸钠(pH5.8)中的 CH3CN线性梯度(2％→50％CH3CN，在30分钟内)。
实施例2
此实施例例示硫醇修饰的单核苷酸的制备(图5)。
通过用DTT处理含有5′-二硫化物的化合物而将二硫化物部分还 原成硫醇。因此，用0.25M脱气(pH8)磷酸钠溶液处理在330μl H2O 中的16O.D.268(1.0μmole)二硫化物寡聚体。往此溶液中加入50μl新鲜 制备的和脱气的在H2O中的1M DTT溶液。将混合物在37℃下温育2 小时。
通过反相HPLC分析确认定量还原，所述分析表明硫醇修饰的单 核苷酸(洗脱时间：对于磷酸二酯连接的衍生物(6a，图5)为15.4分钟， 对于硫代磷酸酯连接的衍生物(6b，图5)为17.4分钟，相比之下对于 母体二硫化物磷酸二酯连接的寡聚体为20.4分钟，而对于母体二硫化 物硫代磷酸酯连接的寡聚体为24分钟)，使用在50mM磷酸钠(pH5.8) 中的CH3CN线性梯度(2％→50％CH3CN，在30分钟内)。然后用 Sephadex G-10柱(1.0×90cm，柱外水体积(Vo)：35ml)将还原产物纯 化以除去DTT和盐。进行柱填充，然后使用脱气的20％乙醇-水进行 样品洗脱。将含有纯硫醇寡聚体的馏分直接用于下一步反应以使不期 望的氧化反应最低限度。
实施例3
此实施例例示SMCC-YEE(ahGalNAc)3的合成。
将大约1-2μmole YEE(ahGalNAc)3(例如参见Lee等人， Glycoconjugate J.4，317-328(1987))干燥至1ml玻璃反应瓶。往此溶液 中加入无水DMSO(250μl)和无水DIPEA(3μl)。然后用150μl含有真空 干燥的在无水DMSO中的SMCC(6mg)溶液处理该溶液。将混合物简 短地涡动搅拌，并在室温下静置2小时。反相C18HPLC分析表明原料 YEE(ahGalNAc)3(洗脱时间：6.6分钟)完全转化为目标产物 SMCC-YEE(ahGalNAc)3(洗脱时间：10.1分钟)。然后用含有2％ CH3CN的50mM磷酸钠(pH5.8)将反应混合物稀释至10ml，并将其 装载到Sep-Pak柱体。用10ml含有2％CH3CN的50mM磷酸钠 (pH5.8)洗涤柱体，并用10ml 25％CH3CN/H2O洗脱产物。在 Speed-vac中将产物减压浓缩，并进一步用半制备型反相C18柱纯化。 收集合并用HPLC和UV光谱分析鉴定的含有 SMCC-YEE(ahGalNAc)3的馏分并用SepPakTM脱盐。最终产物的产量： 1.89O.D.276或1.35μmole。
实施例4
此实施例例示含有SMCC-YEE(ahGalNAc)3的单核苷酸(7a和7b， 图6)的合成。
磷酸二酯连接的单核苷酸缀合物(pol-mer)(7a，图6)
收集含有纯硫醇寡聚体(6a，图6)的G-10馏分后，立即将其与 SMCC-YEE(ahGalNAc)3(1.8μmoles)的50％CH3CN水溶液(5ml)和 5ml N2-脱气的0.25M磷酸钠(pH7)混合。然后在Speed-VacTM(Savant) 中将混合物浓缩至3/4体积，并密封24小时以使缀合进行完全。通过 反相HPLC分析粗反应混合物，使用在50mM磷酸钠中的CH3CN线 性梯度(2％→50％CH3CN，在30分钟内)洗脱，表明三种化合物，即 在15.77分钟洗脱的化合物#1，在18.09分钟洗脱的化合物#2，和在 18.46分钟洗脱的化合物#3(图7)。将粗反应混合物进一步浓缩至～1ml， 并将其应用于G-15Sephadex柱(1.0×43cm；用在H2O中的20％乙醇 填充)。用在H2O中的20％乙醇洗脱柱得到含有化合物#1和化合物#2 的混合物，所述产物在HPLC分离和质谱分析后鉴定。通过反相HPLC 完成最终的纯化，使用在50mM磷酸钠(pH5.8)中的CH3CN线性梯 度(2％→50％CH3CN，在30分钟内)。然后用H2O将纯化物质稀释， 并使用反相SepPakTM(Waters，Inc.)脱盐，得到398nmoles。使用 MALDI质谱(Scripps Research Institute)、高分辨率质谱(MALDI)完 成缀合物的最终确认，m/z 2051.859M-H++2Na+。 (C88H139FN12Na2O35PS+要求2051.870)。
硫代磷酸酯连接的单核苷酸缀合物(ps l-mer)(7b，图6)
收集含有纯硫醇寡聚体(6b，图6)的G-10馏分后，立即将其与 SMCC-YEE(ahGalNAc)3(1.8μmoles)的50％CH3CN水溶液(5ml)和 5ml N2-脱气的0.25M磷酸钠(pH7)混合。然后在Speed-VacTM(Savant) 中将混合物浓缩至3/4体积，并密封24小时以使缀合进行完全。通过 反相HPLC分析粗反应混合物，使用在50mM磷酸钠中的CH3CN线 性梯度(2％→50％CH3CN，在30分钟内)洗脱，表明三种化合物，即 在13.94分钟洗脱的化合物#1，在17.78分钟洗脱的化合物#2，和在 18.57分钟洗脱的化合物#3(图8)。将粗反应混合物进一步浓缩至～1ml， 并将其应用于G-15Sephadex柱(1.0×43cm；用在H2O中的20％乙醇 填充)。用在H2O中的20％乙醇洗脱柱得到含有化合物#1和化合物#3 的混合物，所述产物在HPLC分离和质谱分析后鉴定。通过反相HPLC 完成最终的纯化，使用在50mM磷酸钠(pH5.8)中的CH3CN线性梯 度(2％→50％CH3CN，在30分钟内)。然后用H2O将纯化物质稀释， 并使用反相SepPakTM(Waters，Inc.)脱盐，得到623nmoles。使用 MALDI质谱(Scripps Research Institute)、高分辨率质谱(MALDI)完 成缀合物的最终确认，m/z2067.8529. M-H++2Na+.(C88H138FN12Na2O34PS2 +要求2067.8475)。
实施例5
此实施例描述对在随后的生物实验(如细胞摄入和体内生物分布) 中所用的所有YEE(ahGalNAc)3衍生的缀合物的3′-末端放射标记方 法。
反应混合物(355μl最终体积)含有20nmole po 1-mer缀合物(7)， 30μl 10×TdT缓冲液，30μl 4mM CoCl2，50μl[35S]αS-ATP(10μCi/μl， 总共500μCi)和500单位(25μl)TdT。将此混合物在37℃下温育16小 时，然后冷却至室温，并用400μl 0.5M磷酸钠(pH5.8)稀释。将此溶 液于室温下温育1小时。通过尺寸排阻凝胶过滤(G-15Sephadex柱， 1.0×43cm，用H2O中的20％乙醇装填)完成产物的纯化。用UV分光 光度法然后用闪烁记数法分析对应于最大分子量的馏分；A268： 0.036/20μl；馏分的总体积：1.9ml；cpm/20μl：1372200；总cpm： 1.30×108；总质量：12.95nmoles；特定活性：4.58μCi/nmole。
实施例6
此实施例描述5-氟-2′-脱氧尿苷5′一硫代磷酸酯(8，图9)的合成。
使用0.342g(40μmole/g装载容量)的Universal-Q CPG(1，图9) 制备15μmole柱，并将其置于Millipore Expedite DNA/RNA合成器的 两个反应端口中的一个。具体地，将含有5-氟-2′-脱氧尿苷合成子(2， 图9)(0.25g，在5ml CH3CN中)的CH3CN溶液置于″T″瓶，并将C6 二硫化物亚磷酰胺合成子置于″5″瓶。顺序进行自动合成(从3′→5′- 端)，并同时使5-氟-2′-脱氧尿苷亚磷酰胺合成子(2，图9)与固相载体 反应，然后用“化学磷酸化I”合成子处理。对于磷酸二酯连接的化合 物，使用标准氧化溶液(在四氢呋喃/吡啶//H2O的溶液中的3％I2)(Glen Research Inc.)。用Beaucage试剂3H-1，2-苯并二硫杂环戊二烯-3-酮， 1，1-二氧化物(Glen Research Inc.)代替氧化剂溶液以根据标准确立方 法将亚磷酸酯硫化得到硫代磷酸酯。此试剂以在10ml无水CH3CN中 的100mg试剂的浓度使用。遵循标准氧化时间(对于磷酸二酯和硫代磷 酸酯连接的化合物均为30秒)。除去最终的5′-DMT以利于纯化。
然后从反应端口移去柱，并在真空下干燥。然后将柱的内容物清 空至120ml圆柱管，并用10ml等分试样的在1/1(v/v)CH3OH/H2O中 的0.5M NaOH处理固相载体3小时，然后用40ml 0.5M磷酸钠溶 液(pH5.8)使溶液变为中性pH(pH7)。然后用蒸馏去离子H2O将该中 和的溶液稀释至100ml，并将其应用于20cc(5g)反相C18SepPakTM 柱体(Waters，Inc.)。在样品加入之前，用CH3OH(30ml)、在H2O中 的50％(v/v)CH3CN，然后用30ml H2O预平衡柱。用H2O(30ml)洗 涤柱，然后用20-40ml在H2O中的5％CH3CN洗涤。然后恢复用H2O 洗涤柱，随后用在H2O中的50％CH3CN洗脱产物。然后用反相HPLC 法分析此馏分，并用UV分光光度法进行定量；λmax268nm，λ2685280 M-1cm-1；A268 0.067/100μl，最终得到62.3O.D.11.8μmole。HPLC 分析：洗脱时间：2.6分钟，使用在50mM磷酸钠(pH5.8)中的2％ CH3CN等梯度。
实施例7
此实施例描述用于评价po 1-mer缀合物(7a，图6)的血清稳定性 研究。
在生理条件下进行研究。使用反相HPLC和PAGE法完成分析。 原始数据呈现在表格(表1、2和3)中。由[A]＝[A0]e-kt计算得到血清半 衰期t1/2＝1/k(0.693)，其中[A0]为底物的最初量，[A]为测定的底物水平， t为时间(分)而k为一级速率常数。
HPLC分析方法
(a)反应条件：将50μl人血清加到24nmoles HPLC纯化的po 1-mer缀合物，并在37℃下温育指定的时间(0分钟、60分钟、180分 钟、360分钟)。柱1：流速1.0ml/min，Rainin MicroSorb C18反相柱 HPLC梯度：100％NH4OAc持续0分钟，然后在25分钟内 0→100％CH3CN(0.1M NH4OAc)。(表1)。
表1
试验1 试验2 平均值 标准偏差 时间(分) 峰面积 峰面积 峰面积 峰面积 0 17.64988 17.92 17.78494 0.191003684 60 15.10503 12.42582 13.76543 1.894487559 180 9.35569 10.9908 10.17325 1.156197369 360 11.4 11.4 0
y＝15.429e-0.0012x
t1/2＝577.5分钟或9.6小时
(b)反应条件：将100μl人血清加到20nmoles HPLC纯化的po 1-mer缀合物，并在37℃下温育指定的时间(0分钟、15分钟、60分钟、 120分钟、240分钟)。HPLC梯度：100％缓冲液A(0.05M NaxPO4(pH 5.8)，在2％CH3CN中)持续5分钟，然后在随后20分钟内2％CH3CN 至50％CH3CN。柱2：流速4.7ml/min，Rainin半制备型C18反相柱 (10mm i.d.×250mm L)(表2)。
表2
试验1 试验2 试验3 平均值 标准偏差 时间(分) 峰面积 峰面积 峰面积 峰面积 峰面积 0 13.07 12.68 14.97 13.57333 1.225166655 15 14.86 14.86 0 60 14.21954 14.21954 0 120 11.95526 11.95526 0 240 9.72692 9.72692 0
y＝14.698e-0.0017x
t1/2＝407分钟或6.79小时
PAGE分析
反应条件：将2μl人血清加到200,000cpm无水35S标记的po 1-mer缀合物。在37℃下在此血清存在下将放射标记的缀合物温育指 定的时间(15分钟、30分钟、60分钟、120分钟、240分钟)。用2μl H2O 稀释反应混合物，然后用4μl装样缓冲液稀释。通过在800V下进行 90分钟电泳的20％聚丙烯酰胺凝胶(0.75mm)放射自显影观测降解模 式。通过使用Fujix BAS 2000Phosphorimager进行条带定量(表3)。
表3
时间(分) 象素面积 归一化面积 标准化面积 0 42.57 0 1 15 57.43 0.1486 0.8514 30 66.61 0.2404 0.7596 60 76.92 0.3435 0.6565 120 81.57 0.39 0.61 240 80.13 0.3756 0.6244
y＝0.8387e-0.0016x
t1/2＝433分钟或7.2小时
表1-3的总平均t1/2＝7.8小时。
实施例8
此实施例证明5FU 1-mer缀合物 (YEE(ahGalNAc)3-SMCC-psFU(硫代磷酸酯连接的[ps]缀合物)或 YEE(ahGalNAc)3-SMCC-poFU(磷酸二酯连接的[po]缀合物))的细胞 摄入
将Hep G2细胞传代于2cm2孔并在RPMI 1640培养基中生长， 所述培养基中补充L-谷氨酰胺(10-040，CV)，至密度为0.3×106-0.4×106 细胞/孔(48孔平板，Costar，Cambridge，MA)。吸出维持培养基，并在 37℃下将细胞与0.2ml含有2％FCS和制成1μM的[5′-35S]标记的 YEE(ahGalNAc)3-SMCC-psFU(硫代磷酸酯连接的[ps]缀合物)或 YEE(ahGalNAc)3-SMCC-poFU(磷酸二酯连接的[po]缀合物)的培养基 一起培养。然后保存等分试样的培养基进行闪烁计数，并将残余培养 基从孔中吸出。用D-PBS(2×0.5ml)洗涤细胞，用0.25％胰蛋白酶处 理(37℃，2分钟；在含有1.0mM EDTA的HBSS中制备的胰蛋白酶)， 并将其悬浮在新鲜的含有10％FCS的生长培养基中。在1.7ml圆锥 形微离心管中将悬浮的细胞铺层于硅油(0.5ml)上，并在14,000 rpm(12,000g)下离心30分钟沉淀细胞。小心地滗析上清液，并用100μl 含有0.5％NP 40、100mM氯化钠、14mM Tris/HCl和30％乙腈的溶 液溶解细胞沉淀。通过闪烁计数来确定放射性量，推定与细胞溶解物 结合的新糖缀合物或寡聚体的量。
检查ps-和po-连接的、含5FU的新糖缀合物与Hep G2细胞的结 合以证明和比较肝脏来源细胞的摄入。首先，在RPMI 1640+10％FCS 中评价两种新糖缀合物的稳定性。在含有10％FCS的培养基中ps-连 接和po-连接的1-mer缀合物均稳定长达8小时，如PAGE分析所证 实。这些数据证明两种缀合物均表现出充足的体外稳定性，因而它们 可以用于细胞摄入研究。在细胞摄入方面，剂量为1μM的po-连接的 缀合物在体外被Hep G2细胞以渐进的方式迅速摄入至在480分钟时 为24.75pmoles/106细胞的程度。然后根据缀合物的施用剂量来分析细 胞摄入的速率。施用1μM po-连接的缀合物导致30分钟时细胞摄入5 pmoles/百万个细胞。在随后的30分钟内此数量倍增，且在480分钟 时达到峰值25pmoles/百万个细胞。倍增施用剂量至2μM并没有显著 增加细胞摄入，因为细胞内发现的缀合物的最初浓度和最大细胞摄入 类似于1μM剂量的情况。增加施用剂量至4μM和8μM分别导致最 大细胞摄入为36和43pmoles/百万个细胞。施用4μM缀合物导致缀 合物摄入随时间线性增加，而在施用8μM缀合物时发生的细胞摄入 的速率在120分钟时明显增大。缀合物摄入的方式不依赖于核苷酸包 含的键的类型，因为当缀合物为ps-连接时实现类似的细胞摄入方式。
当培养基中缀合物的浓度增加至2μM、4μM和8μM时，摄入随 浓度增加而增加，但不与剂量成比例。缀合物浓度倍增并没有显著增 加细胞摄入，施用2μM导致在480分钟时摄入大约26pmole/106细胞。 将缀合物浓度增大至4μM和8μM分别导致在480分钟时大约为36 pmoles/106细胞和42pmoles/106细胞的最大细胞摄入。但是，由于施 用8μM缀合物导致仅在120分钟内就摄入35pmoles/106细胞，因此 摄入的速率增大。
Hep G2细胞对YEE(ahGalNAc)3-SMCC-psFU的细胞摄入与po- 连接的缀合物非常类似，在480分钟时达到24.98pmoles/106细胞。同 样，当培养基中缀合物的浓度增加到2μM、4μM和8μM时，摄入随 浓度的增大而增大，但不与剂量成比例。
上述的数据表示po-和ps-连接的缀合物的摄入速率对于所有研究 的浓度基本上相同。这表明Hep G2细胞表面上的受体与独特的配体 的相互作用对细胞摄入程度起作用，而不管牢固“P”的化学键。细胞摄 入不与缀合物浓度的增大成比例的事实可能是细胞培养物的人工环境 造成的，其中受体的表达不是最理想的，包括在随后的体外生物效力 试验中所需的细胞增殖期间进行增殖所需的受体的表达。但是，上述 的实验表明在研究的条件下两种新糖缀合物的体外浓度的增大导致递 送至细胞的缀合物的水平增加。
实施例9
此实施例证明本发明缀合物对细胞增殖的作用。
将Hep G2细胞以5×104细胞/孔的密度接种到48孔平板中补 充10％FCS的RPMI中。然后在37℃、95％RH，5％CO2下将细 胞培养24小时。在此培养期之后，吸出维持培养基，并用多种浓度 的在200μl补充10％FCS的RPMI中的新糖缀合物处理细胞。用单 独的200μl RPMI+10％FCS处理对照孔。在0、24、48、72和96 小时，用0.5ml DPBS将每种条件的六个孔洗涤两次，并用0.5ml 胰蛋白酶(0.25％；在含有1.0mM EDTA的HBSS中制备)处理。使用 Coulter电子细胞计数器测定每种条件下的细胞数。在所有的情况 下，增殖抑制作用的程度作为时间的函数而增大。用非缀合的单体 处理Hep G2细胞导致大约20％的增殖抑制作用。将核苷酸类似物 进行缀合的作用是显著的，用po连接的缀合物处理导致最初10％ 抑制作用，抑制峰值为64％。用ps-连接的缀合物处理不那么有效， 最初的抑制作用为大约5％，其在96小时后增大至仅45％。因此核 苷酸类似物与YEE(ahGalNAc)3缀合的键的类型影响抑制增殖作用 的能力。
用1μM浓度的po-连接的新糖缀合物、ps-连接的新糖缀合物或 非缀合的单体处理Hep G2细胞。在24、48、72和96小时检测每 种处理和未处理对照的六个重复孔的平均细胞数。与未处理的对照 相比，用非缀合的单体处理Hep G2细胞导致15-20％增殖抑制作用。 用po-连接的新糖缀合物处理Hep G2细胞导致大约64％的增殖抑 制作用。与此相比，以相同浓度施用的ps-连接的新糖缀合物导致大 约44％的增殖抑制作用。
当培养基中任一缀合物的浓度增大至2μM、4μM和8μM时，增 殖抑制作用相对于1μM剂量的相同缀合物增大。因此，由ps-连接的 缀合物导致的抑制作用从1μm剂量下的44％增大到8μM剂量下的 60％。类似地，由po-连接的缀合物导致的抑制作用从1μM剂量下的 64％增大至8μM剂量下的90％。因此，po-连接的缀合物的活性比ps- 连接的缀合物在体外Hep G2细胞增殖方面的活性大大约30％。增殖 抑制作用的增加不与任一缀合物的施用剂量成比例。但是，来自上述 实验的数据证明递送增加量的新糖缀合物导致细胞增殖抑制作用的增 大。
实施例10
此实施例描述细胞毒性研究
将Hep G2细胞以密度为5×104细胞/孔接种于48孔平板内补充 10％FCS的RPMI中。然后在37℃、95％RH，5％CO2下将细胞培 养24小时。在此培养期之后，吸出维持培养基，并用多种浓度的在 200μl补充10％FCS的RPMI中的新糖缀合物处理细胞。用单独的200 μl RPMI+10％FCS处理对照孔。在0、24、48、72和96小时，用0.5 ml DPBS将每种条件的六个孔洗涤两次，并在37℃、95％RH，5％CO2 下用0.5ml胰蛋白酶(0.25％；在含有1.0mM EDTA的HBSS中制备) 处理5钟。加入0.5ml RPMI+10％FCS终止胰蛋白酶消化。然后将 细胞样品(900μl)接种到100μl台盼蓝，从而使染料的最终浓度为10％。 室温下将此溶液温育5分钟，并将100μl样品接种入血细胞计数器。 对于每孔读取三个视野的100个细胞。认为摄入并保持染料的细胞是 死亡的。数据表示为#存活细胞/总计数细胞＝％存活细胞。
用不同浓度的po-连接的新糖缀合物或ps-连接的新糖缀合物处理 Hep G2细胞。通过上述的台盼蓝排阻法测定毒性。所有的值与相同来 源的未处理细胞产生的值作比较。总的来说，毒性程度与施用剂量相 关。在72小时时，用2μM po-连接的缀合物处理细胞导致存活细胞 减少大约50％，而8μM处理导致存活细胞数减少75％。与po-连接的 缀合物相比，施用ps-连接的缀合物减少存活细胞数的作用较小，因为 在用2μM缀合物处理72小时时观察到存活细胞数仅减少大约25％， 而用8μM缀合物观察到大约减少45％。在所有的情况下，与72小时 的情况相比处理96小时不显著改变存活细胞数，除了用8μM ps-连接 的缀合物处理进一步减少存活细胞数。这提示ps-连接的缀合物减少存 活细胞数的效率较低。
实施例11
此实施例描述在po 1-mer和ps 1-mer存在下细胞中胸苷酸合成酶 的活性。
将CD-1小鼠(Charles River，Wilmington，MA)处死并取出肝。随 后用DPBS(Mediatech，Herndon，VA)洗涤大约1克组织，并将其置于 3体积缓冲液H。然后用Dounce匀浆器将组织匀浆，随后进行三次 15秒钟爆发式超声处理，然后在冰上处理1分钟。然后在4,000g下 将组织提取物离心10分钟，并将所得的上清液于7,000g下旋转20分 钟。然后将3份等量的此上清液加到0.9μCi等分试样的2′-脱氧尿苷 5′-一磷酸，二铵盐，[5-3H]。此时将5-氟-2′脱氧尿苷5′-一硫代磷酸加 到一份等分试样，将5-氟-2′-脱氧尿苷5′-一磷酸加到第二份等分试样， 留一份等分试样不作处理。在37℃下将三份样品温育30分钟，并用 炭沉淀。在1,600g下将所得的上清液离心10分钟。然后使用Beckman 闪烁计数器计数等分试样的每份样品。抑制百分比(％)表示如下：
对照值-处理值
对照值
这些试验测定10nM FdUMP(磷酸二酯底物)或FdUMPS(硫代磷 酸酯底物)抑制胸苷酸合成酶(TS)活性的能力。此试验的目的是测定TS 将[5-3H]-dUMP转化为3H-H2O的能力。如下表4所示，FdUMP表现 出大约两倍于FdUMPS的生物活性。
表4.
FdUMP和FdUMPS单体抑制TS催化活性的能力的比较 胸苷酸合成酶活性抑制百分比
试验[dUMP] 10nM FdUMP 10nM FdUMPS 10μM dUMP 28％ 13％ 1μM dUMP 48％ 27％
实施例12
此实施例例示po 1-mer由于对胸苷酸合成酶(TS)活性抑制作用增 强而对Hep G2细胞增殖的作用。
胸苷酸合成酶抑制作用导致用于DNA复制的胸苷酸水平不足，并 可能导致最终引起细胞死亡的细胞内信号过程。根据Keyomarsi等人 (J.Biol.Chem.268，15142-15149(1993))的方法测定此重要酶的活性。 简言之，105个Hep G2或TSU细胞培养生长48小时，然后将培养基 制成含1μM浓度的po 1-mer或非缀合的5FdU。在处理后以规律时 间间隔(24小时、48小时、72小时和96小时)，取出培养基，并用含 有脱氧尿苷/[3H]-脱氧尿苷混合物的培养基代替。在37℃下将细胞培养 30分钟。然后取出细胞培养基并与炭一起沉淀。然后计数上清液以确 定[3H]-H2O的存在。作为来自脱氧尿苷，5′-一磷酸(dUMP)底物的 [3H]-H2O的[3H]可测定释放反映胸苷酸合成酶活性。
在此方面，用浓度为1μM的po 1-mer处理Hep G2细胞导致对 [3H]-H2O释放的进行性抑制作用，指示TS活性受到严重抑制。在这 种情况下，在处理后96小时TS活性减小60％。与此相比，非缀合的 5FdU在相同的时间内将TS活性减小大约20％。这些数据与所述处理 对细胞生长抑制作用良好相关。po 1-mer导致的TS活性抑制作用是 细胞特异性的，在用po 1-mer处理的TSU癌细胞中没有观察到抑制 作用。而且，在用po 1-mer缀合物处理TSU癌细胞时这些细胞的存 活不受影响。
实施例13
此实施例例示用于测定po 1-mer在体内定位的生物分布实验。
对于这些研究，给雄性CD-1小鼠通过尾静脉i.v.注射[3′-35S]-放射 标记的po 1-mer或[6-3H]-非缀合的5FdU。以适宜的时间间隔，将小 鼠处死，切除器官，然后溶解。通过闪烁计数测定与每个器官相关的 放射性的量，并进行效率校正。将标准CD-1小鼠用于这些最初实验 以确定在正常小鼠中的基线分布，而随后的生物效力实验将使用CD-1 裸鼠。这些实验的结果是po 1-mer快速和特异性地定位至肝脏。57％ 注射的po 1-mer在15分钟内定位至肝脏，而与此相比10％注射的非 缀合的5FdU定位在肝脏(表5)。甚至在注射后60分钟，发现25％po 1-mer在肝脏(表6)。注射8小时后，基本上无po 1-mer定位在肝脏。 po 1-mer缀合物确实表现出显著的早期在肌肉中蓄积，然后在肠道中 蓄积(表5)。肌肉中多种β-半乳糖凝集素的存在可以在某些程度上竞争 GalNAc残基，导致这种早期蓄积(Barondes等人，J.Biol.Chem.269， 20807-20810(1994)；还参见Poirier 等人，Development，115， 143-155(1992))。但是，由于肌肉细胞的增殖指数低，被递送的核苷酸 类似物成为活性代谢物应该是极低的。在较后的时间点肠内放射性标 记的蓄积可能是5FU代谢物的肠肝再分布导致的。但是，携带带电磷 酸酯的核苷酸首先被递送至肝细胞，借此防此其被细胞清除。随后的 合成代谢/分解代谢过程可能导致放射性代谢物的再分布，使分布分析 复杂化。虽然肠肝再循环是要考虑的一个因素，但它的重要性受到怀 疑，因为通过胆汁途径排泄的5FU代谢物百分率低(Young等人， Nuklearmedizin，21，1-7(1982))。非肝分布的另一种可能的解释可以是 无特征标记物的使用，因为来自缀合物的放射性标记在细胞内快速离 解，随后标记物非特异性蓄积。尽管有上述的说明限定，这些实验清 楚地证明po 1-mer以快速和特异性方式将其负载递送至小鼠的肝脏。
表5.由尾静脉i.v.施用[3′-35S]-标记的PO 1-mer导致的CD-1正 常小鼠器官中5FU 1-mer的相对百分比
器官 15分钟 30分钟 60分钟 120分钟 240分钟 480分钟 肝 57.61±9.04 50.93±2.44 24.60±5.51 9.93±1.92 3.29±0.31 2.87±0.29 肾 0.96±0.12 1.07±0.17 2.50±1.34 1.52±0.14 0.56±0.14 0.44±0.11 脾 0.12±0.01 0.368±0.51 0.19±0.12 0.17±0.037 0.33±0.43 0.07±0.012 肌肉 3.80±1.69 7.87±3.55 10.33±8.85 5.54±3.96 5.48±0.7 4.58±3.9 小肠 2.56±3.58 4.00±5.01 4.26±14.94 5.77±2.4 3.31±4.74 3.7±3.84 大肠 1.02±0.34 4.217±5.93 2.45±2.16 0.95±0.032 3.29±0.31 7.94±0.65 肺 0.42±0.13 0.35±0.16 0.77±0.53 0.49±0.85 3.29±0.31 0.33±0.055 心 0.168±0.02 0.18±0.11 0.33±0.19 0.17±0.016 3.29±0.31 0.081±.006 血液 2.19±1.57 1.3±0.15 3.13 2.7 3.29±0.31 0.81±0.47 膀胱 3.05+0.33 0.33±0.3 6.97±9.8 6.85±5.97 3.29±0.31 4.23±5.83
表6.由尾静脉i.v.施用[6-3H]非缀合的5FdU导致的CD-1正常小 鼠器官中5FdU的相对百分比
％注射剂量-5FdU
器官 15分钟 30分钟 60分钟 120分钟 240分钟 480分钟 肝 9.56±3.83 8.8±1.23 4.35±1.35 ND 3.97±0.37 1.25±0.33 肾 0.42±0.28 0.38±0.3 0.84±0.31 0.44±0.12 0.13±.044 脾 0.11±0.044 0.19±0.26 0.57±0.18 0.38±0.04 0.09±0.05 肌肉 9.29±4.9 3.43±1.06 22.84 46.56 7.9±1.64 小肠 0.7±0.04 0.61±0.36 3.57±1.3 4.19±1.18 1.37±0.7 大肠 1.09±0.25 0.37±0.19 1.04±0.2 1.61±0.59 0.35±0.09 肺 0.17±0.07 0.05±0.006 0.98±0.3 1.03±0.39 0.08±0.04 心脏 0.21±0.13 0.03±.004 0.28±0.11 0.32±0.10 0.06±.02 血液 0.03±0.02 .008±.0025 .007±.0023 0.56±0..28 0.23±0.14 膀胱 0.91+0.07 2.3±1.58 2.99±1.01 0.010±.015 .001±.0006
ND：未测定。
实施例14
此实施例例示po 1-mer对CD-1小鼠的肝毒性和全身毒性的试验
以前将小鼠用作以以下方式进行的5FU药物试验体内模型(Ain等 人，J.Surg.Res.57，366-372(1994)；Wang等人，Cancer Res.50， 869s-872s(1990))。5FU在小鼠中的血浆曲线、诱导的毒性和药代动力 学类似于在人身上观察到的结果(Wagner等人，Cancer Res.46， 1499-1506(1986))。po 1-mer和5FdU均以每周1次共4次通过尾静脉 推注的临床相关方案施用(Anfield等人，Cancer，39，34-40(1977))。通 过外推体外数据而确定起始剂量为10mg/kg和15mg/kg。每次注射后 一周，将一群动物(6只动物/剂量/治疗)处死。从每只动物收集血液和 肝脏样本，并测定肝和全身毒性。血样分析包括Superchem panel和 全血计数。Superchem panel测定葡萄糖、尿素氮(BUN)、肌酐、总蛋 白、白蛋白、结合和非结合的胆红素、甘油三酯、SGOT、SGPT、甘 油三酯、CPK、碱性磷酸酶的血液水平和外周血分类。全血计数分析 血细胞比容以及红细胞和白细胞计数。对肝样本进行组织学分析以测 定与对照组相比的形态、结构变化以及坏死组织的增加。与未治疗的 对照组相比，代表器官损害的血液计数或血清组分的任何快速或持续 增加被认为代表毒性反应。此外，在整个治疗期间记录每一群的重量 作为它们临床情况的指示。
每周10mg/Kg剂量水平的po 1-mer
这些实验的结果表明与每种剂量相关的轻度毒性。在身体方面， 食物和水的消耗正常，而四周内重量增加是渐进的，并类似于盐水处 理的对照小鼠。但是，对小鼠以剂量水平为10mg/kg的po 1-mer治 疗导致显著降低的白细胞计数和轻度低色素性贫血。血液化学分析表 明SGPT水平在参考范围的最高限和显著增大的SGOT水平。这些结 果总结成表7。此外，乳酸脱氢酶水平和血清钾水平增高，表明细胞 质的丢失和细胞的过度破坏。还检测到尿素氮(BUN)和钠水平的升高 以及氯、钙水平的降低，这是轻度肾功能障碍的特征表现。但是，未 观察到代表重度肝损害的总胆红素和γ-谷氨酰转移酶(GT)水平升高。 组织学分析没有揭示超越轻度肝细胞肿胀的任何病理变化。在临床意 义上，小鼠未表现出不利的治疗影响。该剂量的毒性作用似乎是短暂 的。当治疗停止两周时，所有的血液值开始恢复至参考范围，且肝细 胞肿胀消退(第6周，在表7中)。
每周15mg/Kg剂量水平的po 1-mer
po 1-mer(15mg/kg)毒性试验的结果类似于对10mg/kg剂量水平 所见的结果。这些数据呈现在表8中。全血计数结果揭示白细胞计数 显著降低、轻度低色素性贫血和轻度血小板减少症。血液化学结果证 明SGPT水平在参考范围的最高限和SGOT水平显著升高，表明对肝 细胞有一定的干扰。此外，乳酸脱氢酶水平和血清钾水平升高，表明 细胞质丢失。与前面使用10mg/kg剂量一样，未观察到代表重度肝损 害的总胆红素和γ-GT水平的升高。而且，组织学分析揭示轻度细胞 肿胀和在1只小鼠中有限的被膜下纤维化。在临床意义上，小鼠未表 现出治疗的不利影响。食物和水消耗正常，尽管体重增加在一定程度 上小于未治疗的对照小鼠，增加速率仍是渐进的。目前正在分析在恢 复后停止治疗的效应。这些实验的数据表明po 1-mer的毒性最多是轻 度，并允许进一步试验考虑生物效力。
表7.以一周的时间间隔接受10mg/kg剂量水平的po 1-mer的 CD-1小鼠的血液学分析
参数 参考值 第1周 第2周 第3周 第4周 第6周 WBC 6.9-9.1thds/cmm 4.86 3.16 2.8 1.83 3.03 MCV 69-85fl 51.5 51 56 52.83 51.18 MCH 24-30pg 17.2 15.6 16.56 16.42 16.1 SGOT 24-472u/l 335.5 911.33 1174 1549.5 1211.61 SGPT 28-190u/l 46.5 110 177 125.66 137.55 钾 4.7-6.3meq/l 11.63 11.1 8.9 12.46 10.82 BUN 23-43mg/dl 24.66 18 22 21.33 22.44 钙 12-12.4mg/dl 7.56 7.75 8.85 6.5 7.7 钠 144-150meq/l 155.6 142.5 152.5 161.6 162.22 氯 104-120meq/l 106.33 95 87.5 86.66 89.72
表8.以一周的时间间隔接受15mg/kg剂量水平的po 1-mer的 CD-1小鼠的血液学分析
参数 参考值 第1周 第2周 第3周 第4周 WBC 6.9-9.1thds/cm 2 ＊ 2.1 1.85 MCV 69-85fl 50 56.556 51 MCH 24-30pg 16.83 16.56 14.2 SGOT 24-472u/l 730 1194 1669.5 SGPT 28-190u/l 67.5 120.3 123.66 钾 4.7-6.3meq/l 8.9 8.7 13.46 BUN 23-43mg/dl 26 22 20.33 钙 12-12.4mg/dl 9.15 7.73 6.7 钠 144-150meq/l 154.5 156.5 165.6 氯 104-120meq/l 101.33 87.5 81.66
实施例15
此实施例描述胸苷酸合成酶活性、细胞内核苷酸和辅因子浓度以 及生长抑制作用的测定
细胞TS水平和活性的测定
为了进一步评价递送的缀合物的有效性，使用准确和灵敏的方法 测定TS水平和活性。所用的方法由Spears等人((1988)，The Expanding Role of Folates and Fluoropyridmidines in Cancer Chemotherapy，Plenum Publishing，New York，NY，pp.97-104)和 Keyomarsi等人((1988)，J Biol. Chem.263：14402-14409)前述方法修 改而成。通过这些测定，可以确定各5FdUMP或甲酰四氢叶酸残基的 TS抑制作用。一式三份进行细胞组分定量，从而可以使用学生配对t 检验法确定统计学显著性。
TS水平
通过在过量叶酸(5，10-亚甲基四氢叶酸，5，10-CH2-H4PteGlu)存在 下用[3H]-FdUMP滴定活性位点而对胸苷酸合成酶水平进行定量。指 数生长的细胞与药物在监控湿度和CO2含量的条件下在补充10％透析 FCS的培养基中连续接触。在不同的时间点，洗涤等分试样的每种培 养物，并以确定的细胞密度将其悬浮在PBS中。然后将此混合物进行 超声处理并高速离心。从每种上清液中，通过尺寸排阻凝胶过滤法将 等分试样除去盐分，然后在30℃下与5，10-CH2-H4PteGlu和 [3H]-FdUMP一起温育。加入冰冷的右旋糖酐T-70-和BSA-处理的炭 的悬浮液，混合，然后离心大约5分钟。将放射性上清液加到三氯乙 酸稀溶液，温育并离心。然后将所得的沉淀溶于闪烁液以进行放射性 定量。
TS活性
根据Spears等人(上文)所述的氚释放试验测定TS活性。该试验 由以下步骤组成：将部分胞液和[3H]-dUMP和5，10-亚甲基四氢叶酸 (通常～0.5-1μm最终浓度和pH7.3)一起温育。经过37℃温育后，通 过冷却至0℃而终止反应。通常通过加入含有稀三氯乙酸的活性炭除 去过量的[3H]-dUMP。离心后，测定在温育期间形成的含氚水(3H2O)。 结果表示为毫微微摩尔形成的3H2O/分钟/毫克蛋白，基于得自温育时 间的线性回归。这种方法的灵敏度为10fmol/分钟/mg蛋白。
核苷酸浓度
对于缀合物效力判断同样重要的是准确地测定细胞内游离和结合 核苷酸的水平。这些水平在每次缀合物加入之前及之后测定。这些测 定的原理主要围绕已确定这些核苷的游离库控制细胞生长和调节TS 活性的研究(Berger，上文；Evans等人，(1980)，Cancer Res.40： 4113-4122；Evans等人，(1981)，Cancer Res.41：3288-3295)。过量水平 的细胞内FdUMP和dUMP之间的相互关系是竞争性的。显然，在高 水平的内源性dUMP下FdUMP的效力将减小。此外，由于在LV存 在下获得的FdUMP结合增加，可以获知LV浓度与效力的相互关系。 因此，每一种浓度的准确测定使对给定缀合物的效力进行评价成为可 能。为了获得这种信息，进行分析以测定dUMP、5FdUMP和甲酰四 氢叶酸的细胞内水平。
dUMP的测定
此试验修改自Moran(Proc.Natl.Acad.Sci.1979，76：1456-1460)。 在此试验中，使用纯胸苷酸合成酶(L.casei)以将dUMP样品定量转化 为已在14C-标记的5，10-14CH2-H4PteGlu存在下温育的[甲基 -14C]-dTMP。此过程包括用缓冲BSA和未知数量的来自细胞提取物 的dUMP处理TS酶。加入14C-标记的甲酰四氢叶酸(Amersham Life Sciences)并温育所得的混合物。用甲醛终止甲基转移反应，使用DEAE 纤维素柱分离标记的TMP，用缓冲的碳酸氢铵或甲酸铵洗脱。通过闪 烁计数测定洗脱物的放射性。可以可靠地获得小至10pmoles dUMP 的灵敏度水平。
游离和结合5FdUMP的测定
除了游离5FdUMP浓度之外，知道已与TS结合的[3H]-5FdUMP 的数量也是重要的，此比率将直接涉及细胞内5FU递送的有效性。此 测定仅适用于使用氚标记的底物的细胞摄入实验。一般地，此方法 (Moran，上文)包括将BSA-和右旋糖酐处理的炭加到未知的游离和结 合FdUMP的混合物。进行简单离心，对上清液进行萃取足以除去 90-99％未结合的、标记的FdUMP。游离与结合FdUMP的比率可以 通过除上清液和炭层的闪烁计数测定值而得到。此数据与细胞内 dUMP水平相比可以了解细胞系如何抵抗5FU的不利作用。
甲酰四氢叶酸的测定
此试验修改自Lu等人(上文)所述的方法。对于这些细胞摄入实验， 在2cm2孔中，在含有10％透析马血清的无叶酸培养基中，在37℃下 将肝细胞平板培养至预定密度，持续24小时。然后吸出培养基，并将 细胞悬浮在含有(6S)-[3H]-甲酰四氢叶酸的培养中，并在37℃下培养。 在培养期后，通过将细胞冷却至0℃并快速用冷PBS(pH7.4)洗涤而终 止细胞摄入。为了除去细胞表面结合的LV，用冷盐水(pH3.0)进一步 冲洗细胞。再次用PBS冲洗后，溶解细胞并分析含氚物质。从最终吸 收量中扣除非特异性结合。
实施例16
此实施例例示本发明缀合物，特别是靶向针对裸鼠中的人肝细胞 瘤异种移植的po 1-mer的生物效力。
先前显示异种移植肿瘤对5-FU化疗有反应，如通过直接实体测定 肿瘤(Houghton等人，Biochem.Pharmacol.36，1285-1289(1987))，组 织学改变和生物化学测定，如α-胎蛋白(AFP)水平(Lemoine等人， Pathol.Biol.(Paris)，47，903-910(1999))和胸苷酸合成酶水平(Peters等 人，J.Clin Oncol.12，2035-2042(1994))所测定。裸鼠上的异种移植肿 瘤是一种广泛应用的肿瘤研究模型，它允许直接测定人肿瘤的生长。 雄性CD-1裸鼠(6-8周龄，20-22g重量)用于这些生物效力研究。将 108Hep G2细胞皮下注射到每只小鼠的被膜下区。每天观察小鼠的肿 瘤形成。在肿瘤出现后，每周两次用游标卡尺测定两个维度。当肿瘤 达到以下式确定的100mg重量时：[(重量，mg)＝(长度(mm)×宽度 (mm))2/2]，开始治疗(Geran等人，Cancer Chemothe r.Rep. 3，51-61(1972))。首先用每周一次10mg/kg剂量治疗小鼠，持续8周。 然后，用每周15mg/kg治疗单独群体的小鼠，持续8周，最后以每周 两次10mg/kg治疗，持续8周。通过上述的直接测定值来判断治疗对 肿瘤生长的影响。此外，通过血清学测量值，如AFP水平来追踪肿瘤 进展。在每次注射之后每周分析AFP水平。从每只小鼠眶后取血。使 用由Abbott Laboratories(Waukegan，IL)提供的试剂盒并根据Wang 等人的方法(Cancer Res.50，869s-872s(1990))对AFP水平进行免疫化 学测定。AFP水平的测定意在补充直接实体测定作为肿瘤进展的指标。 一般地，血清AFP水平表现出它们似乎反映肿瘤质量。但是，应该 指出已在某些无并发症的肝病患者中发现AFP水平中度升高。尽管存 在这些假阳性，血清AFP水平已成功地用于监测治疗反应(Johnson，J， Gastroent Hepatol.14(Suppl.)，s32-s36(1999))，特别是用于长有肿瘤 的裸鼠，其中人肿瘤是人AFP的唯一来源。这些测定结果提供了在其 表现为实体肿瘤生长之前对HCC可能性的早期指示。由以上实验产 生的数据应该有助于推导较大哺乳动物试验和随后临床研究的起始剂 量。
每周10mg/Kg剂量水平的po 1-mer
用10mg/kg po 1-mer治疗长肝细胞瘤小鼠导致轻度的抑制肿瘤 生长作用。在大约5周之后注意到po 1-mer治疗的最初效果。但是， 总体上肿瘤在此时间点后继续生长，但其速率比对照组慢。例如，po 1-mer治疗后8周，CD-1裸鼠上异种移植的人肝细胞瘤的平均肿瘤重 量为大约7g，而盐水对照组的平均肿瘤重量为大约15g。在8周后进 行组织学分析以比较对照组的肿瘤和po 1-mer治疗裸鼠的肿瘤。这些 分析表明有丝分裂指数降低和治疗肿瘤中的坏死组织量增多。
而且，在治疗肿瘤中观察到TS活性降低，但在取自相同动物的 肝中没有观察到(表9)。总地来说，po 1-mer治疗小鼠和盐水对照组的 体重与不长有肿瘤的小鼠相比在治疗3周后稍稍下降。这种重量损失 可能由于肿瘤负担而不是治疗导致，并持续至第8周。
表9.每周10mg/kg剂量水平的po 1-mer对CD-1裸鼠肝脏和异 种移植人肝细胞瘤中的TS活性抑制的作用
组织 计数/MG蛋白 ％TS抑制作用 肿瘤 治疗 17641 50 未治疗 35197 --------- 肝 治疗 19718 3.84 未治疗 20504 -----------
每周15mg/Kg剂量水平的po 1-mer
当po 1-mer剂量水平增加到每周注射15mg/kg时，引起更大幅 度的对肿瘤重量的作用。在此剂量水平下，po 1-mer治疗对肿瘤进展 具有更大的影响，包括在5次注射后导致生长速率的显著降低。此时， 肿瘤进展几乎静止。再注射2次后，一只小鼠的肿瘤负担根除，而其 它小鼠的肿瘤减小。由于这些肿瘤减小，组织似乎呈干燥和坏死样。 盐水治疗的对照组则完全相反，其中肿瘤重量在4周的时间内增加至 大约12克。甲胎蛋白(AFP)测定值下降大致与肿瘤大小的减小平行。 PO 1-mer治疗显著地降低AFP水平，从而在治疗3周后使AFP的水 平小于200μg/ml。这种趋势持续至该值于第8周低于检测水平。
在治疗完成后，对肿瘤进行组织学分析并分析其TS活性。这些 分析表明治疗肿瘤中的TS活性大大降低，但来自相同动物的肝组织 则不是如此(表10)。po 1-mer治疗的肿瘤在组织学上表现出极低的有 丝分裂指数和广泛的坏死。在临床毒性的方面，po 1-mer治疗小鼠保 持与不长有肿瘤的小鼠相同的稳定体重增加。在实验期间处死的此生 物效力研究的裸鼠表现出与那些正常小鼠在毒性实验中大致相同的血 液化学特征。因此，可以推断增加po 1-mer剂量增大效力，而不增大 全身毒性。
表10.每周15mg/kg剂量水平的po 1-mer对CD-1裸鼠肝脏和异 种移植的人肝细胞瘤中的TS活性抑制的作用
组织 计数/MG蛋白 ％TS抑制作用 肿瘤 治疗 8591 75.6 未治疗 35197 ---- 肝 治疗 18989 7.39 未治疗 20504 ----
10mg/Kg剂量水平每周两次的po 1-mer
关于po 1-mer对HCC肿瘤的效力的进一步研究扩大到考虑改变 方案和剂量。在此改变中，用每周两次10mg/kg的po 1-mer或盐水 对照治疗长有肿瘤的小鼠。以此方案，po 1-mer治疗更迅速引起肿瘤 生长变化。在治疗3周后观察到肿瘤进展的显著降低，且体重中度下 降。随着常规的每周两次治疗肿瘤生长持续降低直至6周后检测不到 肿瘤。同样，po 1-mer治疗小鼠的AFP测定大致与第3周开始并持续 至在第6周低于检测限的肿瘤减小速率平行。相反，盐水治疗小鼠的 AFP水平在7周时间内从50μg/ml升至900μg/ml。此组中的一只动 物确实表现出对治疗的某种抵抗，且肿瘤生长持续至第5周。但是， 当由于病毒感染而处死此动物时，组织学分析表明与盐水对照组相比 其发生广泛的肿瘤坏死。
实施例17
此实施例例示使用或不使用C6-硫醇修饰剂合成5FdU 18-mer(图 11)。
在Applied Biosystems 392DNA合成器上，使用标准甲基膦酸酯/ 亚磷酰胺化学法合成所有寡核苷酸。固相DNA合成使用Glen research 化学物质(Universal-Q固相载体(500孔径)，亚磷酰胺活化剂溶液 (1H-四唑)和β-氰基乙基亚磷酰胺)或自制化学物质(去封闭溶液，cap A 溶液，cap B溶液和氧化剂溶液)。去封闭溶液含有在二氯甲烷(试剂级) 中的2.5％(v/v)二氯乙酸。Cap A为乙酐在无水四氢呋喃中和双蒸2，6- 二甲基吡啶的混合物(1∶8∶1；v/v/v)。Cap B为在无水CH3CN中的0.5 M 1-甲基咪唑的溶液。对于三价亚磷酸盐的硫化，使用10ml CH3CN(Glen Research)含100mg试剂的浓度的3H-1，2-苯并二硫杂环 戊二烯-3-酮-1，1-二氧化物(Beaucage试剂)的溶液。
开发两种用户程序用于合成这种寡核苷酸。调用称为“DBL SULFUR”的第一程序用于合成硫代磷酸酯键。此程序使正常量的合 成子以增加的偶合时间(即从25秒至60分秒)两次通过柱。氧化/硫化 时间设定在900秒。
通过稀释14∶1丙烯酰胺：N，N′-亚甲基-双(丙烯)酰胺的30％水溶 液(按重量计)制备聚丙烯酰胺凝胶，以提供15％或20％交联的凝胶， 如在特定操作中所述。最终的溶液含有尿素(7M最终浓度)。加入等分 试样的110μl 20％过硫酸铵水溶液，并通过加入四甲基乙二胺 (TMEDA)(55μl)而启动聚合反应。使凝胶聚合并凝固1小时。使容器 充满TBE缓冲液。将样品(8.0-12.0μl)加到凝胶孔。对于个别实验在其 特定的条件下进行凝胶电泳。通过放射自显影法观察放射标记的产物 条带。
使用现存的自动DNA合成技术和方法完成含5-氟-2’-脱氧尿苷的 寡核苷酸的合成(图11)。使用Universal-Q CPG固相载体以1μmole 规模进行合成。如上述，使用0.1M(0.25g，在3.4ml CH3CN中)浓度 的5FU寡核苷酸合成子，5′-二甲氧基三苯甲基-5-氟-2′-脱氧尿苷， 3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]亚磷酰胺(Glen Research)。监测二甲 氧基三苯甲基阳离子吸光度(λmax 498nm)并测定偶合效率。在完成最 后合成循环后，从合成器中取出固相载体结合的寡核苷酸并真空干燥， 然后去保护。可选择地，然后使用硫醇修饰剂C6S-S试剂，1-O-二甲 氧基三苯甲基-己基二硫化物，1′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷 酰胺(0.1M)，使固相载体结合的寡核苷酸暴露于标准亚磷酰胺条件。 为帮助纯化，使最终的二甲氧基三苯甲基(DMT)保持完整。
在使用和不使用硫醇修饰剂的两种情况下，室温(25℃)下用1ml 在50％CH3OH/H2O中的0.5M NaOH溶液将固相载体结合的寡核苷 酸处理1小时。然后用2ml 0.5M Na2PO4中和该溶液并用H2O稀释至 20ml。然后将粗溶液应用于预平衡的C18SepPak(20ml)以进行纯化。 连续地用CH3OH(30ml)，50％CH3OH/H2O(30ml)，然后H2O(100ml) 洗脱来预平衡柱。在应用粗寡聚体后，用H2O(30ml)，然后用5％ CH3CN/H2O洗柱以从合成中除去任何缺陷序列。然后恢复用H2O(30 ml)洗柱，并用0.5％(v/v)在H2O中的CF3CO2H处理。然后用H2O(30 ml)从柱上洗出过量酸。用35％CH3CN/H2O从柱上洗脱低聚产物，并 收集馏分。通过HPLC和PAGE分析鉴定含有产物的馏分并收集合并， 浓缩得到78O.D.(对于未用硫醇修饰的寡核苷酸)和37O.D.(对于硫 醇修饰的寡核苷酸)。分光光度法测定产率。
实施例18
此实施例例示硫醇修饰的寡核苷酸的制备(12，图10)。
通过使用DTT处理含有5′二硫化物的寡聚体而将其还原成硫醇 (12，图10)。因此，将3.6OD260(～40nmoles)二硫化物寡聚体(11，图 10)溶于400μl新鲜制备和脱气的在10mM磷酸钠(pH8)中的50mM DTT溶液。在37℃下将混合物温育2小时。然后用Sephadex G-25(细) 柱(1.0×43cm)纯化硫醇寡聚体以除去DTT和无机盐。使用脱气的含 20％乙醇的水进行柱填充和样品洗脱。将含有纯硫醇寡聚体的G-25 馏分直接用于下一反应以使可能的硫醇二聚产物降到最低限度。
实施例19
此实施例例示含硫醇寡聚体与SMCC-配体的缀合： YEE(ahGalNAc)3-SMCC-AHT-Poly5FU缀合物(图10&12)(13)。
收集含有3.6OD260(40hmoles)纯硫醇寡聚体(12，图10)的G-25馏 分后立即将其与SMCC-YEE(ahGalNAc)3(10，图10)(″A-L″缀合 物)(100nmoles)混合，并在真空下用Speed-vac将混合物浓缩至干。将 残余物溶于含有0.1M磷酸钠，pH7的100μl脱气的50％CH3CN。 在Speed-vac中通过应用真空大约5分钟而将溶液进一步脱气。然后 将溶液紧紧地封住，并在室温下温育过夜以使缀合完全。通过A267吸 光率强度来测定产量(1nmole为0.089O.D.)，然后用紫外投影 (shadowing)的20％变性PAGE分析。此结果指示硫醇寡聚体与新 糖肽定量缀合。通过在胰凝乳蛋白酶消化时发生显著的凝胶迁移率变 动和用DTT处理时不能发生移位而证实此缀合物(图13)。最后采用 Sephadex G-25柱，用20％乙醇洗脱而纯化缀合物，然后用于进一步 的研究。产量32.4nmoles(3.85OD260)；质谱(MALDI-TOF)，m/z 6712 (C241H291N46O63P18S5F18要求6712(M)+(Scripps Research Institute，La Jolla，CA))。
实施例20
此实施例例示35S放射标记示踪剂的装配(图2)。
反应混合物(300μl总体积)由18.1nmoles 5FU寡核苷酸底物 (18-mer)、5x末端脱氧核苷酸转移酶缓冲液(pH7.2)(60μl)、0.5mCi [35S]dATP S(Amersham，Uppsala，Sweden)和500单位末端脱氧核苷酸 转移酶(Life Technology，La Jolla，CA)组成。将所得的溶液于37℃下温 育17小时。然后将混合物冷却至室温，并用400μl 0.5M Na2PO4(pH 5.8)稀释，然后在1小时后将内容物应用于预平衡的NAP-25柱 (Pharmacia，Peapack，NJ)。装填700μl的样品后，装填300μl H2O， 并收集全部1ml等分试样作为馏分1。然后收集1ml馏分；馏分4包 含用UV和闪烁计数定量的产物。根据这些测定值计算特定活性 (μCi/nmole)。产量为10.42nmoles，包含总共183.3μCi。
实施例21
此实施例例示用于使用A-L-PP缀合物进行的细胞摄入实验的方 法和材料，其中PP为包含抗癌活性的药剂，该实施例还例示Hep G2 细胞在体外对新糖缀合物的增强的和特异性的细胞摄入。
将Hep G2、TSU和Caki-1细胞(ATCC，Rockville，MD)传代至2 cm2孔，并使其在补充L-谷氨酰胺和FCS的RPMI培养基1640中生 长至密度为0.2×106-0.5×106细胞/孔。
吸出维持培养基，并使细胞在37℃下与0.2ml含有2％FCS以及 1μM[5′-32P]标记的缀合物或相应的非缀合寡聚体的培养基一起温育。 在指定的时间过去后，保存5μl等分试样的培养基用于闪烁计数，并 从孔中吸出剩余物。用D-PBS(2×0.5ml)洗涤细胞，用0.25％胰蛋白酶 (0.25％；在含1.0mM EDTA的HBSS中制备)(GIBCO BRL， Carlsbad，CA)在37℃下处理2分钟，并悬浮于含10％FCS的新鲜生 长培养基中。在1.7ml圆锥形微离心管中将细胞铺层于硅油(0.5ml)上， 并通过在14,000rpm(12,000g)下离心30秒而沉淀细胞。小心地滗析 上清液，并用100μl含有0.5％NP 40,100mM氯化钠，14mM Tris/HCl 和30％乙腈的溶液溶解细胞沉淀。通过闪烁计数确定放射性的量，推 定与溶胞产物相关的新糖缀合物或寡聚体的量。
测定硫代磷酸酯连接的、含有5FU的新糖缀合物与Hep G2细胞 的细胞结合以证明肝脏来源的细胞的增强摄入。作为对照，还测定相 应的标记的非缀合寡聚体与Hep G2细胞的细胞结合。新糖缀合物快 速地与Hep G2细胞结合，其程度为在第0.5小时达19.54pmoles/106 细胞，并继续蓄积直至在第4小时达峰值39.91pmoles/106细胞。相比 之下，对应的非缀合的寡聚体表现出Hep G2细胞的细胞摄入速率低， 在第0.5小时结合至6.51pmoles/106的程度，并进一步蓄积至第4小 时达峰值11.88pmoles/106。还测定了化合物的细胞特异性。发现脱唾 液酸糖蛋白受体存在于肝细胞表面，且它是使多种治疗剂选择性靶向 作用于该组织的有效手段。通过分析新糖缀合物与两种人的非肝源细 胞系TSU和Caki-1的结合来测定组织特异性。
TSU细胞与非缀合的寡聚体一起培养导致最初在0.5小时时摄入 3.8，然后逐渐增加至在第4小时的11.43。这些结果类似于非缀合寡 聚体在与Hep G2细胞一起培养时观测到的结果。但是，当TSU细胞 与新糖缀合物接触时，摄入没有明显增加。新糖缀合物的摄入程度为 在第4小时为5.6，并逐渐蓄积至在第4小时为13.15，数值非常类似 于对非缀合的寡聚体的观测数值。
类似地，Caki-1细胞不表现出对新糖缀合物的摄入增加。与非缀 合的寡聚体相比，新糖缀合物蓄积至在0.5小时为6.4，而在第4小 时为10.553的程度。使用非缀合的寡聚体观测到类似的数据，其结合 在第0.5时为7.66，而在第4小时为11.86。新糖缀合物和对应的非缀 合的寡聚体都证明在细胞培养基中结构稳定长达96小时。
以上的数据证实新糖缀合物能够以增强和特异性的方式将化学治 疗剂即5FU递送至肝源细胞。
实施例22
此实施例描述5-FU寡核苷酸和对应的缀合物在体外和在Hep G2细胞内的酶促降解。
硫代磷酸酯寡核苷酸(通过硫代磷酸酯部分连接的5-氟-2′脱氧尿 苷(5FdU)单元的18个残基)首先降解至较小的寡核苷酸(大约5个寡聚 体，根据下述的HPLC分析)，然后在与酶或Hep G2细胞接触期间降 解为单体单元。对Hep G2-内化的寡核苷酸(100％产生单体5FdUMP 残基)观察到完全转化为单体单元，而对寡核苷酸的酶处理在144小时 后产生最大仅为72％计算量的5FdUMP。但是，尽管如此，重要的是 要指出用S1核酸酶进行的酶消化并不代表此实施例的最佳方式，而仅 仅代表一种使用更逼真的细胞模型的原则。而且，尽管没有观察到核 酸内切酶S1核酸酶导致完全降解为单体单元，寡核苷酸在仅24小时 后完全降解为较小的片段。
5FdUMP的摩尔消光系数的计算
将5FdUMP样品(5mg(0.015mmole))溶于5ml H2O。然后将此溶 液稀释得到以下溶液：1.9μM、3.8μM，9.5μM、19μM、38μM和 95μM。制作比尔定律图，并计算消光系数为5278cm-1L-1M-1；r2＝1.0。 根据此值，计算5FU寡核苷酸(ps5FU-18-mer)的消光系数。此数值在 0.089O.D.(260nm)时为1nmole。
制备5-氟-2′-脱氧尿苷5′-一磷酸的HPLC标准曲线
制备含有5-氟-2′-脱氧尿苷5′-一磷酸(Sigma-Aldrich，St.Louis， MO)的标准溶液：0.38μM、0.95μM、3.8μM、7.6μM、38μM和95μM。 通过UV光谱法测定这些浓度。使用Microsorb Rainin柱(5uM)(4.6 mm×150mm)；通过测定已知浓度的溶液(100μl样品，100μl注射器环 路)的HPLC峰面积来完成标准化。使用在2％CH3CN/H2O中的50 mM Na2PO4(pH5.8)，以1.0ml/min的流速处理在每份标准溶液中的 含5FdUMP的样品。使用在50mM Na2PO4(pH5.8)中的CH3CN线性 梯度(2％-50％CH3CN，在20分钟内)洗脱寡聚体产物。以一式三份处 理每种浓度和时间点。在267nm下监测洗脱液。标准品的洗脱时间和 浓度如下：5FdUMP：2.71分钟；5FU寡核苷酸：19.6分钟。绘制色 谱图上所示的峰面积和5FdUMP浓度之间的相互关系。方程为： 5FdUMP的浓度(μM)＝[(观测的峰面积-1575.060)/10158.229]。
S1核酸酶对5FU寡核苷酸的降解
反应混合物(320μl总体积)含有4.32O.D.(48.5nmoles)5FU寡聚 体，在30μl 10x S1反应缓冲液中并用50μl H2O稀释。往此溶液加入 等分试样的120μl S1核酸酶(Life Technologies，263单位/μl)(在37℃下 每分钟一单位产生1μg酸可溶性核苷酸)以开始反应。然后使反应混合 物在37℃下温育指定的时间：24、48、72和144小时。在每一个时间 点，提取10μl等分试样，使用UV光谱在260nm下检测而进行HPLC 分析。使用Microsorb Rainin柱(5μm)(4.6mm×150mm)；之前通过测 定已知浓度的溶液(100μl样品，100μl注射器环路)的HPLC峰面积来 完成标准化。使用在2％CH3CN/H2O中的50mM Na2PO4(pH5.8)， 以1.0ml/min的流速处理在每等份含5FdUMP的样品。使用在50mM Na2PO4(pH5.8)中的CH3CN线性梯度(2％-50％CH3CN，在20分钟内) 洗脱寡聚体产物。观察到5种寡聚体种类：15.9、17.2、17.5、18.35、 18.6分钟。
Hep G2细胞对5FU寡核苷酸缀合物的降解和缀合物处理
Hep G2细胞与培养基内含有的1μM 5FU寡核苷酸缀合物一起温 育24小时，以完成如前面实施例所述的充分摄入。然后将溶胞产物直 接用于HPLC分析寡聚体降解。使用Microsorb Rainin柱(5uM)(4.6 mm×150mm)。之前通过测定已知浓度的溶液(100μl样品，100μl注射 器环路)的HPLC峰面积来完成标准化。使用在2％CH3CN/H2O中的 50mM Na2PO4(pH5.8)，以1.0ml/min的流速处理在每份溶胞产物溶 液中的含5FdUMP的样品。使用在50mM Na2PO4(pH5.8)中的CH3CN 线性梯度(2％-50％CH3CN，在20分钟内)洗脱寡聚体产物。Hep G2 溶胞产物中没有观察到寡核苷酸片段。
所述缀合物的代谢是这种方法的治疗效力的一个关键步骤。以前 已确定该新糖肽配体在进入细胞后快速降解(Hangeland等人， Antisense Res.Nucl.Acid Drug Develop.7：141-149(1997))。而且，磷 酸二酯-连接的氟脱氧尿苷链也应该被快速水解，释放5FdUMP残基。 此时注意到寡核苷酸磷酸二酯是不稳定的活系统且快速降解(Sands等 人，Mol.Pharmacol.47：636-646(1995))是重要的。但是，这种降解是 有利的，因为5FdUMP是实际上的TS抑制剂，而不是5FU，从而避 免对胸苷磷酸化酶(Zimmerman等人，J Biol.Chem.239： 2618-2621(1964))和胸苷激酶(Umeda等人，Cancer Res.28： 2539-2538(1968))的需求。有关5FdUMP的进一步降解，肝和肾代表 对5-氟尿嘧啶的主要部位。这些降解产物已在以前作过研究(Diasio等 人，Clin.Pharmacokin.16：215-237(1989))。使用多种分析方法，如纸 色谱分析法和HPLC技术(Sommadossi等人，J.Biol.Chem.257： 8171-8176(1982)；Sommadossi等人，Cancer Res.45：116-121(1985)) 完成这种类型的测定。
此外，为了提高5FdUMP结合的效力，可以施用叶酸辅因子。为 了在细胞内水平实现此目的，施用配体衍生的甲酰四氢叶酸缀合物。 图13显示含有多个甲酰四氢叶酸的A-L-PP缀合物的结构。这些残基 会在连接它们与磷酸二酯，非核苷骨架的酰胺键被切割时释放。通过 缀合物的降解而在细胞内产生SFdUMP和LV应该对TS抑制有利而 对细胞功能有害。
总之，可以通过多种方法完成对降解产物的分析。最常用的是 HPLC分析，使用所述的含有多孔聚合物填充物的离子对反相柱 (Leyva等人，(1984)，Cancer Res.44：5928-5933；El-Sayed等人，(1983)， Pharmacokinetics of Anticancer Agents in Humans，Amsterdam， Elsevier，pp.209-227)。如果可能的话，使用商购或容易合成的可靠标 准品进行比较。
实施例23
此实施例例示含有硫代磷酸酯连接的5FU的寡聚体和硫代酯连接 的F50对细胞增殖的作用和对肝源细胞作用的特异性。
材料：从GIBCO BRL购买补充L-谷氨酰胺、D-PBS和胰蛋白酶 (0.25％；在含1.0mM EDTA的HBSS中制备)的RPMI。Hep G2、TSU 和Caki-1细胞购自ATCC。48-孔平板购自Costar Corp.(Cambridge， MA)。使用Coulter细胞计数器(Coulter Corporation，Hialeah，FL)对 细胞计数。
方法：以5×104细胞/孔的密度将Hep G2、TSU或Caki-1细胞接 种到48孔平板内补充10％透析FCS的RPMI中。然后使细胞在37 ℃、95％RH、5％CO2下培养24小时。在此培养期后，吸出维持培 养基，并用在补充10％透析FCS的200μM RPMI中的1μM新糖缀合 物或寡聚体处理细胞。单独用200μl RPMI+10％DFCS处理对照孔。 在0、24、48和72小时，用0.5ml DPBS将每种条件的六个孔洗两次， 并用0.5ml胰蛋白酶(0.25％；在含1.0mM EDTA的HBSS中制备)处 理。使用Coulter电子细胞计数器测定每种条件的细胞数。
用1μM实施例5中所述的新糖缀合物或寡聚体处理Hep G2、TSU 或Caki-1细胞。对每种处理和未处理的对照在24、48和72小时时测 定六个重复孔的平均细胞数。与未处理的对照相比，用非缀合的寡聚 体处理Hep G2细胞导致增殖显著降低30-40％。在细胞实验期间观察 到最低增殖，在处理72小时内仅实现0.5群体倍增。与之相比，未处 理的对照在相同的期间表现出2.5pd。与未处理的对照相比，用新糖缀 合物处理Hep G2细胞导致细胞数减少55-60％。此外，细胞数在用新 糖缀合物处理后实际上减少，并在实验期间没有恢复至最初的对照水 平，这表明该新糖缀合物在以此浓度使用时具有可能的细胞毒性作用。
还测定了所述处理对肝源细胞的特异性。以与Hep G2细胞类似 的方式，用1μM浓度的新糖缀合物或寡聚体处理TSU或Caki-1细胞。 在这种情况下，用非缀合的寡聚体处理导致细胞数与未处理的对照相 比减少30-50％。用肝特异性新糖缀合物处理这些细胞产生与用非缀 合的寡聚体处理细胞几乎相同的结果，没有导致细胞数进一步减少。 这些数据证明新糖缀合物在肝源细胞内的特异性和增大的生物效力。
实施例24
此实施例描述可以用于测试po 1-mer和ps 1-mer在抑制细胞周期 进展、病毒聚合酶活性和病毒致细胞病变作用方面的效力的试验。
细胞周期分布试验
将细胞接种于100mm培养皿，培养48小时并使其与多种浓度的 po 1-mer或ps 1-mer在37℃下(5％CO2)接触24小时或与一固定的浓 度接触多个时间段(0-48小时)。然后，将细胞与10μM BrdUrd在37 C(5％CO2)一起培养30分钟。在预冷却的(-20℃)乙醇(80％)中固定含 有死细胞的上清液和收集的活细胞，并在-20℃下保存多至3天。如前 述完成BrdUrd/碘化丙锭染色(例如，参见Horber等人，Br J Cancer， 72：1067-1073(1995))。简言之，在离心后，在20℃下用2M HCl将细 胞处理30分钟，将其重悬在50μl PBS、0.5％Tween-20和1％BSA 中，并与FITC标记的抗BrdURd抗体一起在20℃温育30分钟；然 后加入1ml PBS/碘化丙锭(10mg/ml)。用Epics Elite分析仪(Coulter， FL，USA)分析染色的细胞。使用单一荧光样品(FITC或碘化丙锭)以最 优化仪器设置，并确保适当的电子补偿。更详细参见Cattaneo等人，J. Cancer Res.Clin.Oncol.126：247-256(2000)。
致细胞病变作用抑制试验
简言之，用po 1-mer或ps 1-mer处理细胞，并用病毒感染细胞。 6天后，使用血细胞计数器与台盼蓝染料排阻法相结合计数活细胞。
对纯化的HIV-1 RT的抑制作用
20μl测定混合物包含50mM Tris(pH8.3)；10mM MgCl2；50mM KC1；5mM二硫苏糖醇；1.0μM预退火的引物模板，5′32P-标记的 dGpApTpTpCpApGpCpTpApGpTpCpCpA)引物和 d(CpApApApCpTpGpTpGpApTpApCpGpApTpGpGpApCpTpApGp CpTpGpApApTp C)模板；250μM每种dNTP；和可变浓度的po 1-mer 或ps 1-mer。通过加入10nM的HIV-1RT引发反应，并在37℃下持 续15分钟。在这些条件下，酶对于两种底物都是饱和的。通过变性聚 丙烯酰胺凝胶电泳对反应混合物进行分级分离。
对其它病毒DNA聚合酶的抑制作用
实验分析与关于HIV-1RT所述基本上相同(Marshall等人，Proc. Natl.Acad.Sci.89：6265-6269(1992))。纯化的小牛胸腺α聚合酶(Pol a) 可以得自R.Kuchta(科罗拉多大学)，禽成髓细胞瘤病毒(AMV)RT可 以得自Life Sciences(St.Petersburg，FL)，且大肠杆菌DNA聚合酶(Pol I)的克列诺片段可以得自U.S.Biochemical。所有情况下酶浓度相同 (10nM)。加入提供类似于对HIV-1RT观察到的聚合反应所需浓度的 引物模板。对AMV RT为0.05μM，对Pol I克列诺片段为5.0μM， 对Polα为2.0μM。
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核苷类似物通过与核苷酸和核酸的天然存在的对应物竞争在核酸 生物合成中涉及的酶结合位点而抑制核苷酸和核酸的合成(Perigaud 等人，Nucleosides and Nucleotides(核苷和核苷酸)，11：903(1992))，因 而阻止核酸前体，包括核苷和核苷酸的形成。而且，往核酸分子中掺 入类似物阻碍这些分子的复制和/或转录。因此，将核苷类似物施用于 癌细胞可以抑制它们的增殖，而将这种类似物施用于病毒感染的细胞 可以抑制感染病毒的复制。
由于核苷类似物的尺寸较小且为静电中性，因此它们容易地横穿 质膜，有利于传送至它们的细胞内靶位点。但是，核苷类似物的治疗 作用大大受限于它们对将其转化为活性抑制剂的细胞内酶的依赖性。 磷酸基与核苷酸类似物的糖残基附着是抑制核苷酸和核酸生物合成的 必需步骤。在某些情况下，核苷类似物必须经过两步或更多步才能转 化为活性代谢物，由此增加它们用作抑制剂所需的时间和该类似物转 化为失活代谢物最终降低其有效性的机会。
通过使用包含磷酸基的核苷酸类似物减轻了对用于转化成活性抑 制剂的细胞内酶的依赖性。虽然与核苷类似物相比它们提供更为直接 的作用方式，但将核苷酸类似物递送至细胞内部受到磷酸基的高度负 电的严重阻碍。因此，期望一种将核苷酸类似物递送至它们的细胞内 靶体的机理。
Gmeiner等人(美国专利5,457,187)公开通过共价附着亲脂性或阳 离子部分，包括胆固醇、乙基间隔的金刚烷、1，2-二十六烷基甘油和聚 -L-赖氨酸而递送核苷酸类似物5-氟脱氧尿苷5′一磷酸。通过递送类似 物作为均寡聚体进一步促进进入细胞。虽然这些缀合物提供一种将药 物递送至细胞内的机理，但它们没有使核苷酸类似物靶向作用于特定 的组织或细胞。
如大部分药物一样，核苷酸类似物的临床应用由于它们不能到达 靶细胞群和它们给非靶细胞施加毒性而受到限制。组织特异性药物靶 向将不仅减少全身毒性，而且还通过富集靶细胞或组织中的药物而加 强药物作用(Wadhwa等人，J.Drug Targeting 3：111(1995))。因此需要 组织特异性方式靶向核苷酸类似物。
由此提出数种组织特异性药物靶向策略，以尝试克服这些问题。 一种这样的策略，载体介导的药物靶向，包括共价或非共价结合药物 与组织特异性靶向部分。在称为主动靶向的此策略的一个亚组中，靶 向部分是被特异性受体识别的配体，所述受体主要处在靶位点。配体 与受体结合导致受体介导的胞吞，其中药物-配体缀合物与受体一起被 靶细胞内化。缀合物一旦处在细胞内便对切割配体和药物之间的键的 细胞内酶易感，导致药物从缀合物中释放。通过这种方式实现将治疗 剂递送至靶细胞群。
配体定向的、受体介导的胞吞是几种药物靶向系统所依赖的基础。 抗体或其片段、激素、细胞因子和其它可溶蛋白如胃泌素和转铁蛋白 都已被用作递送药物至特定细胞群的靶向配体。例如，Myers等人(美 国专利5,087,616)公开一种药物递送缀合物，其中通过与激素配体上皮 生长因子结合而将药物道诺霉素特异性地递送至上皮细胞。此外， Gmeiner等人(美国专利5,663,321)公开通过与抗体或其片段结合而递 送包括核苷酸类似物5-氟脱氧尿苷5′一磷酸的单体的均寡聚体。
但是配体的性质并不总是蛋白质。糖部分用作已知为凝集素的受 体家族的配体。这些受体依据它们的组织表达和配体特异性而不同。 例如，Kupffer细胞上发现的凝集素对甘露糖具有特异性，而在肝内 皮细胞上发现的凝集素选择性地与岩藻糖残基结合。
已深入地研究了脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，这是一种主要在 肝细胞表面发现的凝集素，目的在于将治疗剂递送至肝。由于它介导 与实际上任何含有末端半乳糖或乙酰半乳糖胺残基的实体之间的高度 亲合相互作用而不管该实体的尺寸或结构，因而ASGPR是一种用于 药物递送的模型系统。Wu等人的开拓性工作(J.Biol.Chem.262： 4429(1987))证明与连接脱唾液酸血清类粘蛋白(含半乳糖/乙酰半乳糖 胺的蛋白)的聚-L-赖氨酸静电复合的反义寡核苷酸通过与ASGPR的 直接的相互作用而被有效和特异性地摄入人肝癌细胞。但是，由于反 义寡核苷酸与靶向部分非共价结合，有理由推断所得的缀合物的生物 稳定性小于共价结合的情况。
已将通过使用ASGPR的组织特异性药物靶向应用于核苷酸类似 物的递送。例如，Groman等人(美国专利5,554,386)公开一种包含核 苷酸类似物araAMP和多糖阿拉伯半乳聚糖的缀合物，该缀合物与 ASGPR结合以将药物递送至肝细胞。但是由于多糖含有多个药物结合 位点，这种缀合物的合成会产生缀合物的非均匀混合物，其中每一缀 合物中的核苷酸类似物的数目随每批而变化。因此，缀合物的IC50也 将随每批而各不相同，从而很难确定施用剂量。
Rohlff等人(Cancer Research(癌症研究)59：1268(1999))公开一种 药物-配体缀合物OGT719，其中单一的半乳糖部分与核苷类似物，5- 氟尿嘧啶共价结合。虽然此药物缀合物在动物模型中表现为有效，但 根据Lee等人的研究(Biochemistry (生物化学)23：4255(1984))，预测 它与ASGPR微弱地结合，在Lee等人的研究中含有三个或四个以特 定的构象排列的半乳糖残基的配体与ASGPR结合的亲合力比单一残 基大得多。期望高亲合力结合的缀合物，从而可以施用较低剂量的缀 合物以实现目标治疗效果。
在全盘考虑的情况下，期望有一种能够经过配体定向的、受体介 导的胞吞而以组织特异性的方式将核苷酸类似物递送至它们的细胞内 靶体的缀合物。构成该缀合物的组分应该彼此共价结合以具有最大的 生物稳定性。该缀合物应该是化学确定的和结构均一的，从而可以确 定单一的IC50。该缀合物还应该以高度亲合力与靶向受体结合。具有 这些性能的缀合物将具有改进的治疗指数。
本发明的一个目的是提供这样一种缀合物。从本文提供的详细描 述中可以明显看出这一目的和其它的目的和优点，以及另外的发明特 征。
发明概述
本发明提供一种化学确定的、结构均一的式A-L-P的缀合物，其 中：
A代表与细胞上的细胞表面受体结合的糖基化/半乳糖基化肽，
L代表双官能接头，它不包含天然存在的氨基酸并以区域专一性 方式与A和P共价结合，和
P代表包含至少一个核苷酸或其类似物的单体、同聚物或杂聚物， 其以不依赖于序列的方式抑制核苷酸或核酸的细胞内生物合成，
其中A与L之间的共价键和L与P之间的共价键之任一或二者可 以在细胞内被切割。当A被糖基化时，细胞表面受体在构成肝脏的细 胞上。当A被半乳糖基化时，细胞表面受体为脱唾液酸糖蛋白受体。 还提供包含这种缀合物的组合物。
本发明还提供一种抑制需要这种抑制的哺乳动物中的异常细胞增 殖的方法。所述方法包括给哺乳动物施用异常细胞增殖抑制量的上述 缀合物或包含该缀合物的组合物，由此抑制哺乳动物的异常细胞增殖。
本发明还提供一种抑制哺乳动物中病毒复制的方法。所述的方法 包括给哺乳动物施用病毒复制抑制量的上述缀合物或包含该缀合物的 组合物，由此抑制在哺乳动物中病毒的复制。
附图的简要说明
图1描述″A-L-P″缀合物的示意图，其中A包含配体，L包含交 联剂和修饰剂，而P包含n个核苷酸或其类似物，其中n＝核苷酸或其 类似物的数目。
图2描述含有示踪剂的配体特异性A-L-P缀合物的分子装配。
图3描述三-、四-、和多-触角配体的实例。
图4描述5′-C6-二硫化物5-氟-2′-脱氧尿苷的自动合成。
图5描述从固相载体上除去和合成5′-硫醇修饰的5-氟-2′-脱氧尿 苷。
图6描述YEE(ahGalNAc)3-SMCC-5-氟-2′-脱氧尿苷缀合物， po-1-mer和ps-1-mer的合成。
图7描述粗制磷酸二酯一核苷酸或其类似物(po 1-mer)缀合反应 混合物的HPLC分析。
图8描述粗制硫代磷酸酯一核苷酸或其类似物(ps 1-mer)缀合反 应混合物的HPLC分析。
图9描述从固相载体中除去和合成5′-硫代磷酸5-氟-2′-脱氧尿苷。
图10显示用于制备5-氟-2′-脱氧尿苷缀合物(18-聚体)的详述反应 路线。
图11描述含有5-氟-2′-脱氧尿苷的寡核苷酸(18-聚体)的合成。
图12描述氟脱氧尿苷缀合物(18-mer)的结构。
图13显示甲酰四氢叶酸缀合物的结构。
发明详述
本发明提供一种化学确定的、结构均一的式A-L-P的缀合物，其 中：
A代表与构成肝脏的细胞上的细胞表面受体结合的糖基化肽，
L代表双官能接头，它不包含天然存在的氨基酸并以区域专一性 方式与A和P共价结合，和
P代表包含至少一个核苷酸或其类似物的单体、同聚物或杂聚物， 其中该核苷酸或其类似物以不依赖于序列的方式抑制核苷酸或核酸的 细胞内生物合成，
其中A与L之间的共价键和L与P之间的共价键之任一或二者可 以在细胞内被切割。
本发明还提供一种化学确定的、结构均一的式A-L-P的缀合物， 其中：
A代表与细胞上的细胞表面脱唾液酸糖蛋白受体结合的半乳糖基 化肽，
L代表双官能接头，它不包含天然存在的氨基酸且它以区域专一 性方式与A和P共价结合，和
P代表包含至少一个核苷酸或其类似物的单体、同聚物或杂聚物， 其中该核苷酸或其类似物以不依赖于序列的方式抑制核苷酸或核酸的 细胞内生物合成，
其中A与L之间的共价键和L与P之间的共价键之任一或二者可 以在细胞内被切割。
本文所用的术语“化学确定的”描述具有明确的化学式例如 C6H12O2的实体。化学确定的实体的分子量是绝对的，因而它不是平 均分子量。而且，分子量不随批合成而改变。
本文所用的术语“化学均一的”意指至少95％的递送装配，最优 选至少99％的递送装配在组成和连接方面是单一种类。化学均一性可 以由聚丙烯酰胺凝胶电泳、反相高压液相色谱法、核磁共振、质谱和 化学分析来确定。短语“化学确定的、结构均一的”与“化学均一的” 可互换使用。
本文所用的术语“结构均一的”描述一种实体，其特征在于组分 的绝对比率。例如，本发明为包含组分A、L和P的缀合物，其中每 个缀合物中只存在一个A、一个L和一个P。A∶L∶P组分的1∶1∶1 比率不随批合成而改变。
“核苷”是一种包含碱基和糖的化合物。“核苷酸”是一种由如以 上定义的碱基、糖和磷酸基组成的化合物，它也称为单核苷酸。核苷 酸和核苷的碱基可以是，但不限于嘌呤和嘧啶。核苷酸和核苷的糖可 以是，但不限于核糖和脱氧核糖。嘌呤包括例如腺嘌呤和鸟嘌呤。嘧 啶包括例如胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。
“核苷类似物”是一种在糖或碱基部分含有至少一种修饰的天然 存在的核苷。例如，核苷类似物的修饰包括一个或数个糖原子的取代、 杂环碱基修饰、糖上的核苷键置换、异头反向(β→α)、糖残基的环碳 上多种官能团的添加、糖残基的羟基的取代或除去、环尺寸的改变、 糖构型的反向(D→L)和呋喃糖环分解成无环核苷。
本领域技术人员理解任何核苷类似物可以被磷酸化，从而使其成 为核苷酸类似物。术语“核苷酸类似物”是具有至少一个非天然存在 部分的部分，且它的功能类似于或优于天然存在的核苷酸。例如，核 苷酸类似物可以具有改变的糖部分、碱基或糖间键。核苷酸类似物的 修饰包括以上关于核苷类似物所述的修饰，和改变与磷酸基的磷原子 结合的原子或官能团。这些包括但不限于可以产生“非磷酸二酯核苷 酸间键，”即非磷酸二酯键的改变(例如，参见Waldner等人，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters，6(19)，2363-2366(1996))。甲基膦酸酯 核苷酸间键、硫代磷酸酯核苷酸间键及其组合是“非磷酸二酯核苷酸 间键”的实例。包含核苷酸或核苷酸类似物的聚合物中的一些、一个、 无或全部核苷酸间键可以被这些修饰键代替。
“P”部分包括以不依赖于序列的方式抑制核苷酸或核酸在细胞内 生物合成的任何适宜的核苷酸或其类似物。本领域技术人员理解抑制 作用不要求完全抑制，因为有益或治疗效果可以由任何程度的抑制作 用实现。相反，存在不同程度的抑制作用。本文所用的术语“不依赖 于序列的方式”应该指构成P的核苷酸或其类似物的碱基序列的非重 要性。“P”不是反义寡核苷酸，该术语用于本技术，即用于抑制转录 或翻译。可以根据本技术中已知和本文所列举的测定来确定给定的核 苷酸或其类似物是否抑制核苷酸和核酸的细胞内生物合成。
适宜的核苷酸类似物可以包含任何数目的核苷类似物。核苷类似 物包括但不限于苷元修饰的核苷类似物，它可以包含例如氟化嘧啶。 例如，氟化嘧啶可以是5-氟尿嘧啶(5FU)。或者苷元修饰的核苷类似物 可为5-氟-2′-脱氧尿苷(5FdU)，或者它可以为氮杂嘧啶核苷，例如5- 氮胞苷(还已知为5-azaCyd或4-氨基-1-(β-D-呋喃核糖基-1，3，5-三嗪-2- 酮))、5-氮尿苷(5-AzaUrd)、6-氮胞苷(6-AzaCyd)或6-氮尿苷 (6-AzaUrd)。而且，苷元修饰的核苷类似物可以为3-脱氮嘧啶核苷， 例如3-脱氮尿苷(3-DeazaUrd)。核苷类似物还包括糖修饰的核苷，例 如AraC(还已知为1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷、 阿糖胞苷(cytarabine和cytosar))、环胞苷、2′-O-硝基-AraC、AraA、 (还已知为9-β-D-阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤、阿糖腺苷和vira-A)、环杀 菌素(cyclaridine)、2′，2′二氟脱氧胞苷(吉西他滨)和2′-脱氧-2′-亚甲基- 胞苷(DMDC)。糖修饰的核苷可以是无环核苷，例如阿昔洛韦(还称为 9-(2-羟基乙氧基甲基)鸟嘌呤、无环鸟苷和ACV)或更昔洛韦(还已知为 cytovene、DHPG、9-(1，3-二羟基-2-丙氧基甲基)鸟嘌呤、2′-去甲-2′- 脱氧鸟苷、2′NDG、BIOLF-62或BWB759U)。
核苷类似物还包括磷酸氟达拉滨、2-卤代腺嘌呤-2′-脱氧核糖核 苷、2-氯腺嘌呤-阿拉伯核苷、2′-脱氧助间型霉素和2-卤代-2′-氟阿拉 伯核苷。本领域技术人员将认识到本文未具体提及名称的其它核苷类 似物可以用于本发明的范围，并可以容易地商购得到。
“P”是包含至少一个寡核苷酸或其类似物的单体、同聚物或杂聚 物。“P”在包含一个核苷酸或其类似物时为单体。“P”在包含至少两 个核苷酸或其类似物且其中所述至少两个核苷酸相同时为同聚物。当 “P”包含至少两个核苷酸或其类似物且至少一个核苷酸或其类似物与 另一个核苷酸或其类似物不同时，“P”为杂聚物。例如，“P”可以是 包含5FdU的单体、同聚物或杂聚物。当“P”为同-或杂聚物时，单 元的数目可以是2-50、2-40、2-30、2-20，优选2-12，更优选2-6，最 优选2-4。在一个优选的实施方案中，“P”为5FdU的同聚物。优选“P” 为包含2-12个5FdU的同聚物，更优选“P”为包含2-6个5FdU的 同聚物。特别优选“P”为5FdU单体。
当“P”为杂-或同聚物时，每一个核苷酸或其类似物与相邻的核 苷酸或其类似物共价结合。理想地，至少一个共价键可以在细胞内被 切割。优选所有的核苷酸间共价键可以在细胞内被切割。可以使用任 何适宜的核苷酸间共价键。优选的共价键包括磷酸二酯键(po)或硫代 磷酸酯键(ps)。例如，同聚物或杂聚物中的核苷酸间共价键可以相同或 不同，并可以交替。优选同聚物或杂聚物中的核苷酸间共价键相同。 为了监测ALP的递送和/或效力，“P”可以包含放射性核素。
“A”为与构成肝脏的细胞的细胞表面受体结合的糖基化肽或与 细胞上的细胞表面脱唾液酸糖蛋白受体结合的半乳糖基化肽，图3提 供了其非限制性的实例。本文所用的“糖基化肽”为任何含有至少一 个糖(即单糖或多糖)部分的聚酰胺。优选“A”为糖基化寡肽。本文所 用的“半乳糖基化肽”为任何含有至少一个半乳糖残基的聚酰胺。优 选“A”为半乳糖基化寡肽。“A”为合成的、化学确定的、结构均一 的寡肽支架，它被包括但不限于以下的多种糖残基中的任何一种糖基 化：葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖和岩 藻糖。优选“A”为
其中，特别优选YEE(ahGalNAc)3。适宜的“A”化合物可以使用 本领域中已知的方法制备(例如参见Lee等人，Biochem，23： 4255-4261(1984)；Lee等人，J Carbohydrate Chemistry，5(3)： 343-357(1986)；Lee等人，Targeted Diagn.Ther.4：65-86(1991)；Lee， Carbohydrate Research，67：509-514(1978))。
“L”为双官能接头，它不包括天然存在的氨基酸或由天然存在的 氨基酸形成的肽。“L”以区域专一性方式与“A”和“P”共价结合。 可以使用任何适宜的接头。理想的“L”为杂双官能性的。
适宜的接头为可商购(例如Pierce Chemical Co.)得到的交联剂产 物。通常，交联剂仅在能够以区域专一性方式与“A”和“P”连接的 末端包含反应基团，从而减少发生不期望的副反应的可能性。可以获 得大量能够与“A”和“P”上存在的多种官能团反应的交联剂。因此， 可以缀合许多化学独特的键。优选L为包括以下的交联剂的产物：活 性酯、异硫氰基、异氰基、酰基、卤素、马来酰亚氨基或活性二硫化 物基团。例如，“L”可以是以下交联剂的产物：
或α-柠康酰基-K-(ε-FMOC)PILFFRL(N-α-柠康酰基 -Lys(eFMOC)-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Lys-COOH)。优选L为交联 剂N-羟基琥珀酰亚氨基4-(N-甲基马来酰亚氨基)环己基-1-甲酸酯 (SMCC)的产物。
在“A”一个特定的实例中，YEE(ahGalNAc)3(图3)在其氨基末端 含有游离氨基。它将区域专一性和位点特异性地与杂双官能性交联剂 SMCC反应形成酰胺键。核苷酸或其类似物如果被化学修饰为包含游 离巯基，则它将与SMCC化学结合形成硫醚键。在此实例中，在“A” 和“P”之间形成的键可以概括为酰胺/硫醚。优选“A”通过酰胺键与 “L”共价结合，而“L”通过硫醚键与“P”共价结合。“A”和“P” 之间通过“L”的其它键包括但不限于酰胺/酰胺、硫醚/酰胺、二硫化 物/酰胺、酰胺/硫醚和酰胺/二硫化物。该键还可以归类为生物学稳定 的(硫醚、胺)、稍微生物学稳定的(酰胺)和生物学不稳定的(二硫化物)。 因此，可以将递送系统进行结构修饰以在细胞外和细胞内介质中遭遇 的不同的化学环境中起作用。
本发明的优选的缀合物为这样的缀合物，其中“A”为 YEE(ahGalNAc)3，“L”为交联剂SMCC的产物，而“P”包含至少一 个5FdU。“P”可以是5FdU的同聚物，优选“P”为5FdU单体。
本发明还提供一种包含上述缀合物的组合物。优选该组合物还包 含药学上可接受的载体。适宜的“药学上可接受的载体”在本技术中 是已知的。通常，该药物组合物可以包含生理盐水溶液；右旋糖或其 它糖溶液；或者乙烯、丙烯、聚乙烯或其它乙二醇。
本领域技术人员将认识到将A-L-P缀合物或其组合物施用于动 物，例如哺乳动物如人的合适方法是已知的，而且虽然可以使用多于 一种途径施用特定的组合物，但一种特定的途径可以提供比其它途径 更直接和更有效的反应。载体的选择将在部分程度上由特定的组合物 和用于施用组合物的特定方法所决定。因此，存在大量的本发明组合 物的适宜制剂。
适于口服的制剂可以由以下组成：(a)液体溶液，如溶于稀释剂， 如水或盐水的有效量的缀合物，(b)胶囊、小袋或片剂，每一种包含预 定量的作为固体或颗粒的活性成分，(c)在适宜液体中的悬浮液，和(d) 适宜的乳液。
片剂可以包含一种或多种以下成分：乳糖、甘露醇、玉米淀粉、 马铃薯淀粉、微晶纤维素、阿拉伯树胶、明胶、胶体二氧化硅、交联 羧甲纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、稀 释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂和药理学相容的载体。锭剂 (Lozenge)可以包含在调味剂，通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶中的 活性成分，而软锭剂(pastilles)包含在惰性碱，如明胶和甘油中的活性 成分，或蔗糖和阿拉伯树胶乳液、凝胶等除了活性成分以外还包含本 技术中已知的载体。
适于肠胃外施用的制剂包括水溶液和非水溶液、等渗无菌注射液， 所述溶液可以包含抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与目标接受者的 血液等渗的溶质；含水和非水无菌悬浮液，所述悬浮液可以包括悬浮 剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。制剂可以以单位剂量或多剂 量封闭容器如安瓿和小瓶呈现，并可以在仅要求在使用前即刻加入无 菌液体载体如注射用水的冷冻干燥(冻干)条件下储存。可以由无菌 粉末、颗粒和前述种类的片剂制备临时注射溶液和悬浮液。
本发明的缀合物可以单独施用或与其它适宜的组分联合施用。这 些组分包括帮助治疗剂(即″P″)更有效抑制异常细胞增殖或病毒复制 的组分。例如，配体衍生的甲酰四氢叶酸(甲酰四氢叶酸)可以同时施用 以增强5FdU的效力。
鉴于上述，本发明还提供一种抑制需要这种抑制的哺乳动物的异 常细胞增殖的方法。所述方法包括给哺乳动物施用异常细胞增殖抑制 量的上述缀合物或组合物，由此抑制哺乳动物的异常细胞增殖。“异常 细胞增殖抑制量”的缀合物是足以抑制异常细胞增殖至任何程度的缀 合物的量。优选异常细胞增殖为肝细胞癌。本发明缀合物和组合物还 在治疗学上用于治疗肝的其它疾病或障碍，如肿瘤和感染性疾病和病 症。
还鉴于上述，本发明提供一种抑制需要这种抑制的哺乳动物中的 病毒复制的方法。所述方法包括给哺乳动物施用病毒复制抑制量的上 述缀合物或组合物，由此抑制病毒在哺乳动物中的复制。缀合物的“病 毒复制抑制量”是足以抑制病毒复制至任何程度的缀合物的量。优选 病毒复制为肝炎病毒复制。
施用于本发明范围内的动物，特别是人的剂量应该足以在动物中 在合理的时间范围内产生治疗反应。所述剂量将由特定组合物的强度 和动物(如人)的病症，以及待治疗的动物(如人)的体重来确定。剂量的 大小还将由可能伴随特定组合物给药的任何不良副作用的存在、性质 和程度来确定。内部施用的适宜剂量为0.01-100mg/kg/天。优选的剂 量为0.01-35mg/kg/天。更优选的剂量为0.05-5mg/kg/天。局部施用 的药物组合物中缀合物的适宜浓度为0.05-15％(按重量计)。优选的浓 度为0.02-5％。更优选的浓度为0.1-3％。最后，主治医师将决定用于 治疗各个体患者的本发明缀合物的剂量和数量，考虑多种因素，如年 龄、体重、一般健康、饮食、性别、待施用的组合物、施用途径和所 治疗的疾病的严重程度。
实施例
以下实施例用于例示本发明，而不意在以任何方式限定其保护范 围。
缩写
为方便起见，使用以下缩写：AET，2-氨基巯基乙醇(氨基乙硫醇)； ATP，三磷酸腺苷；BAP，细菌碱性磷酸酶；CPG，可控孔度玻璃载 体；DIPEA，二异丙基乙胺；D-MEM，Dulbecco’s改良Eagle培养基； DMSO，二甲亚砜；DPBS，Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水；DTT，二 硫苏糖醇；EDAC，1-乙基-3-[3(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺；EDTA， 乙二胺四乙酸盐；FCS，胎牛血清；GalNAc，N-乙酰半乳糖胺；MEM， 含Earle盐的极限必需培养基；SMCC，N-羟基琥珀酰亚氨基4(N-甲 基马来酰亚氨基)环己基-l-甲酸酯；Tris，三(羟基甲基)胺；PNK，苯 基核苷酸激酶；Hep G2，人肝细胞癌；TSV，人前列腺腺癌；Caki-1， 人肾细胞；HBSS，Hank’s平衡盐溶液；RPMI，Roswell公园纪念研 究所；po 1-mer，磷酸二酯单核苷酸缀合物；ps 1-mer，硫代磷酸酯单 核苷酸缀合物；5FU 1-mer，5-氟尿嘧啶单核苷酸缀合物；AFP，α- 胎蛋白。
实施例1
此实施例描述5′-C6二硫化物5-氟-2′脱氧尿苷单核苷酸(4a和4b， 图4)的合成。
使用0.3701g(26μmole/g装载容量)的Universal-Q CPG(1，图4) 制备15μmole柱，并将其置于Millipore Expedite DNA/RNA合成器 的两个反应端口之一。具体而言，将含有5-氟-2′-脱氧尿苷合成子(0.25 g，在5ml CH3CN中)的CH3CN溶液置于“T”瓶，并将C6二硫化物 亚磷酰胺合成子(3，图4)置于“5”瓶(例如参见Smith等人，Nucleosides 和Nucleotides，15(10)，1581-1594(1996))。依次完成自动合成(从3′→5′- 端)，并使5-氟-2′-脱氧尿苷亚磷酰胺合成子(2，图4)与固相载体发生 反应，然后用硫醇修饰合成子(3，图4)处理。对于磷酸二酯连接的化 合物，使用标准氧化溶液(在四氢呋喃/吡啶/H2O的溶液中的3％I2)； Glen Research Inc.Sterling，VA)。如果需要的话，用Beaucage试剂 (Glen Research Inc.)代替氧化剂溶液以进行亚磷酸酯硫化以根据标准 的确定的方法得到硫代磷酸酯。该试剂使用的浓度为在10ml无水 CH3CN中含100mg试剂。遵循标准氧化时间(对于磷酸二酯和硫代磷 酸酯连接的化合物均为30秒)。最后留下5′-DMT以利于纯化。
然后从反应端口移出柱，并在真空下干燥。然后清空柱内含物至 50ml圆锥管，并用10ml等分试样的在1/1(v/v)CH3OH/H2O中的0.5 M NaOH将固相载体处理3小时，其后用20ml 0.5M磷酸钠溶液(pH 5.8)使溶液变为中性pH(pH7)。然后用蒸馏去离子H2O将该中性溶液 稀释至70ml，并将其用于经典的反相C18 SepPakTM柱体(Waters， Inc.)。在加入样品之前，用CH3OH(10ml)，在H2O中的50％(v/v) CH3CN，然后用10ml H2O预平衡柱。用H2O(20ml)，然后用25ml 在H2O中的5％CH3CN洗涤柱。然后将柱返回至H2O(25ml)，并使 用1％三氟乙酸水溶液(20ml)脱除三苯甲基。柱颜色快速变至橙色，然 后停止流动10分钟以完全除去该保护基。使用磷酸钠(1ml，pH 5.8， 0.5M溶液)以增加pH，然后用H2O洗涤(20ml)。然后用在H2O中的 50％CH3CN洗脱产物(5a和5b，图5)。然后通过反相HPLC分析此 馏分，并用UV分光光度法定量，λmax 268nm，λ268 5280M-1 cm-1； A268 0.02/20μl；最终产量为5.67μmole 5a(图5)。5a(图5)的HPLC分 析：洗脱时间24分钟(5a，图5)，使用在50mM磷酸钠(pH5.8)中的 CH3CN线性梯度(2％→50％CH3CN，在30分钟内)。
实施例2
此实施例例示硫醇修饰的单核苷酸的制备(图5)。
通过用DTT处理含有5′-二硫化物的化合物而将二硫化物部分还 原成硫醇。因此，用0.25M脱气(pH8)磷酸钠溶液处理在330μl H2O 中的16O.D.268(1.0μmole)二硫化物寡聚体。往此溶液中加入50μl新鲜 制备的和脱气的在H2O中的1M DTT溶液。将混合物在37℃下温育2 小时。
通过反相HPLC分析确认定量还原，所述分析表明硫醇修饰的单 核苷酸(洗脱时间：对于磷酸二酯连接的衍生物(6a，图5)为15.4分钟， 对于硫代磷酸酯连接的衍生物(6b，图5)为17.4分钟，相比之下对于 母体二硫化物磷酸二酯连接的寡聚体为20.4分钟，而对于母体二硫化 物硫代磷酸酯连接的寡聚体为24分钟)，使用在50mM磷酸钠(pH5.8) 中的CH3CN线性梯度(2％→50％CH3CN，在30分钟内)。然后用 Sephadex G-10柱(1.0×90cm，柱外水体积(Vo)：35ml)将还原产物纯 化以除去DTT和盐。进行柱填充，然后使用脱气的20％乙醇-水进行 样品洗脱。将含有纯硫醇寡聚体的馏分直接用于下一步反应以使不期 望的氧化反应最低限度。
实施例3
此实施例例示SMCC-YEE(ahGalNAc)3的合成。
将大约1-2μmole YEE(ahGalNAc)3(例如参见Lee等人， Glycoconjugate J.4，317-328(1987))干燥至1ml玻璃反应瓶。往此溶液 中加入无水DMSO(250μl)和无水DIPEA(3μl)。然后用150μl含有真空 干燥的在无水DMSO中的SMCC(6mg)溶液处理该溶液。将混合物简 短地涡动搅拌，并在室温下静置2小时。反相C18HPLC分析表明原料 YEE(ahGalNAc)3(洗脱时间：6.6分钟)完全转化为目标产物 SMCC-YEE(ahGalNAc)3(洗脱时间：10.1分钟)。然后用含有2％ CH3CN的50mM磷酸钠(pH5.8)将反应混合物稀释至10ml，并将其 装载到Sep-Pak柱体。用10ml含有2％CH3CN的50mM磷酸钠 (pH5.8)洗涤柱体，并用10ml 25％CH3CN/H2O洗脱产物。在 Speed-vac中将产物减压浓缩，并进一步用半制备型反相C18柱纯化。 收集合并用HPLC和UV光谱分析鉴定的含有 SMCC-YEE(ahGalNAc)3的馏分并用SepPakTM脱盐。最终产物的产量： 1.89O.D.276或1.35μmole。
实施例4
此实施例例示含有SMCC-YEE(ahGalNAc)3的单核苷酸(7a和7b， 图6)的合成。
磷酸二酯连接的单核苷酸缀合物(pol-mer)(7a，图6)
收集含有纯硫醇寡聚体(6a，图6)的G-10馏分后，立即将其与 SMCC-YEE(ahGalNAc)3(1.8μmoles)的50％CH3CN水溶液(5ml)和 5ml N2-脱气的0.25M磷酸钠(pH7)混合。然后在Speed-VacTM(Savant) 中将混合物浓缩至3/4体积，并密封24小时以使缀合进行完全。通过 反相HPLC分析粗反应混合物，使用在50mM磷酸钠中的CH3CN线 性梯度(2％→50％CH3CN，在30分钟内)洗脱，表明三种化合物，即 在15.77分钟洗脱的化合物#1，在18.09分钟洗脱的化合物#2，和在 18.46分钟洗脱的化合物#3(图7)。将粗反应混合物进一步浓缩至～1ml， 并将其应用于G-15Sephadex柱(1.0×43cm；用在H2O中的20％乙醇 填充)。用在H2O中的20％乙醇洗脱柱得到含有化合物#1和化合物#2 的混合物，所述产物在HPLC分离和质谱分析后鉴定。通过反相HPLC 完成最终的纯化，使用在50mM磷酸钠(pH5.8)中的CH3CN线性梯 度(2％→50％CH3CN，在30分钟内)。然后用H2O将纯化物质稀释， 并使用反相SepPakTM(Waters，Inc.)脱盐，得到398nmoles。使用 MALDI质谱(Scripps Research Institute)、高分辨率质谱(MALDI)完 成缀合物的最终确认，m/z 2051.859M-H++2Na+。 (C88H139FN12Na2O35PS+要求2051.870)。
硫代磷酸酯连接的单核苷酸缀合物(ps l-mer)(7b，图6)
收集含有纯硫醇寡聚体(6b，图6)的G-10馏分后，立即将其与 SMCC-YEE(ahGalNAc)3(1.8μmoles)的50％CH3CN水溶液(5ml)和 5ml N2-脱气的0.25M磷酸钠(pH7)混合。然后在Speed-VacTM(Savant) 中将混合物浓缩至3/4体积，并密封24小时以使缀合进行完全。通过 反相HPLC分析粗反应混合物，使用在50mM磷酸钠中的CH3CN线 性梯度(2％→50％CH3CN，在30分钟内)洗脱，表明三种化合物，即 在13.94分钟洗脱的化合物#1，在17.78分钟洗脱的化合物#2，和在 18.57分钟洗脱的化合物#3(图8)。将粗反应混合物进一步浓缩至～1ml， 并将其应用于G-15Sephadex柱(1.0×43cm；用在H2O中的20％乙醇 填充)。用在H2O中的20％乙醇洗脱柱得到含有化合物#1和化合物#3 的混合物，所述产物在HPLC分离和质谱分析后鉴定。通过反相HPLC 完成最终的纯化，使用在50mM磷酸钠(pH5.8)中的CH3CN线性梯 度(2％→50％CH3CN，在30分钟内)。然后用H2O将纯化物质稀释， 并使用反相SepPakTM(Waters，Inc.)脱盐，得到623nmoles。使用 MALDI质谱(Scripps Research Institute)、高分辨率质谱(MALDI)完 成缀合物的最终确认，m/z2067.8529. M-H++2Na+.(C88H138FN12Na2O34PS2 +要求2067.8475)。
实施例5
此实施例描述对在随后的生物实验(如细胞摄入和体内生物分布) 中所用的所有YEE(ahGalNAc)3衍生的缀合物的3′-末端放射标记方 法。
反应混合物(355μl最终体积)含有20nmole po 1-mer缀合物(7)， 30μl 10×TdT缓冲液，30μl 4mM CoCl2，50μl[35S]αS-ATP(10μCi/μl， 总共500μCi)和500单位(25μl)TdT。将此混合物在37℃下温育16小 时，然后冷却至室温，并用400μl 0.5M磷酸钠(pH5.8)稀释。将此溶 液于室温下温育1小时。通过尺寸排阻凝胶过滤(G-15Sephadex柱， 1.0×43cm，用H2O中的20％乙醇装填)完成产物的纯化。用UV分光 光度法然后用闪烁记数法分析对应于最大分子量的馏分；A268： 0.036/20μl；馏分的总体积：1.9ml；cpm/20μl：1372200；总cpm： 1.30×108；总质量：12.95nmoles；特定活性：4.58μCi/nmole。
实施例6
此实施例描述5-氟-2′-脱氧尿苷5′一硫代磷酸酯(8，图9)的合成。
使用0.342g(40μmole/g装载容量)的Universal-Q CPG(1，图9) 制备15μmole柱，并将其置于Millipore Expedite DNA/RNA合成器的 两个反应端口中的一个。具体地，将含有5-氟-2′-脱氧尿苷合成子(2， 图9)(0.25g，在5ml CH3CN中)的CH3CN溶液置于″T″瓶，并将C6 二硫化物亚磷酰胺合成子置于″5″瓶。顺序进行自动合成(从3′→5′- 端)，并同时使5-氟-2′-脱氧尿苷亚磷酰胺合成子(2，图9)与固相载体 反应，然后用“化学磷酸化I”合成子处理。对于磷酸二酯连接的化合 物，使用标准氧化溶液(在四氢呋喃/吡啶//H2O的溶液中的3％I2)(Glen Research Inc.)。用Beaucage试剂3H-1，2-苯并二硫杂环戊二烯-3-酮， 1，1-二氧化物(Glen Research Inc.)代替氧化剂溶液以根据标准确立方 法将亚磷酸酯硫化得到硫代磷酸酯。此试剂以在10ml无水CH3CN中 的100mg试剂的浓度使用。遵循标准氧化时间(对于磷酸二酯和硫代磷 酸酯连接的化合物均为30秒)。除去最终的5′-DMT以利于纯化。
然后从反应端口移去柱，并在真空下干燥。然后将柱的内容物清 空至120ml圆柱管，并用10ml等分试样的在1/1(v/v)CH3OH/H2O中 的0.5M NaOH处理固相载体3小时，然后用40ml 0.5M磷酸钠溶 液(pH5.8)使溶液变为中性pH(pH7)。然后用蒸馏去离子H2O将该中 和的溶液稀释至100ml，并将其应用于20cc(5g)反相C18SepPakTM 柱体(Waters，Inc.)。在样品加入之前，用CH3OH(30ml)、在H2O中 的50％(v/v)CH3CN，然后用30ml H2O预平衡柱。用H2O(30ml)洗 涤柱，然后用20-40ml在H2O中的5％CH3CN洗涤。然后恢复用H2O 洗涤柱，随后用在H2O中的50％CH3CN洗脱产物。然后用反相HPLC 法分析此馏分，并用UV分光光度法进行定量；λmax268nm，λ2685280 M-1cm-1；A268 0.067/100μl，最终得到62.3O.D.11.8μmole。HPLC 分析：洗脱时间：2.6分钟，使用在50mM磷酸钠(pH5.8)中的2％ CH3CN等梯度。
实施例7
此实施例描述用于评价po 1-mer缀合物(7a，图6)的血清稳定性 研究。
在生理条件下进行研究。使用反相HPLC和PAGE法完成分析。 原始数据呈现在表格(表1、2和3)中。由[A]＝[A0]e-kt计算得到血清半 衰期t1/2＝1/k(0.693)，其中[A0]为底物的最初量，[A]为测定的底物水平， t为时间(分)而k为一级速率常数。
HPLC分析方法
(a)反应条件：将50μl人血清加到24nmoles HPLC纯化的po 1-mer缀合物，并在37℃下温育指定的时间(0分钟、60分钟、180分 钟、360分钟)。柱1：流速1.0ml/min，Rainin MicroSorb C18反相柱 HPLC梯度：100％NH4OAc持续0分钟，然后在25分钟内 0→100％CH3CN(0.1M NH4OAc)。(表1)。
表1
试验1 试验2 平均值 标准偏差 时间(分) 峰面积 峰面积 峰面积 峰面积 0 17.64988 17.92 17.78494 0.191003684 60 15.10503 12.42582 13.76543 1.894487559 180 9.35569 10.9908 10.17325 1.156197369 360 11.4 11.4 0
y＝15.429e-0.0012x
t1/2＝577.5分钟或9.6小时
(b)反应条件：将100μl人血清加到20nmoles HPLC纯化的po 1-mer缀合物，并在37℃下温育指定的时间(0分钟、15分钟、60分钟、 120分钟、240分钟)。HPLC梯度：100％缓冲液A(0.05M NaxPO4(pH 5.8)，在2％CH3CN中)持续5分钟，然后在随后20分钟内2％CH3CN 至50％CH3CN。柱2：流速4.7ml/min，Rainin半制备型C18反相柱 (10mm i.d.×250mm L)(表2)。
表2
试验1 试验2 试验3 平均值 标准偏差 时间(分) 峰面积 峰面积 峰面积 峰面积 峰面积 0 13.07 12.68 14.97 13.57333 1.225166655 15 14.86 14.86 0 60 14.21954 14.21954 0 120 11.95526 11.95526 0 240 9.72692 9.72692 0
y＝14.698e-0.0017x
t1/2＝407分钟或6.79小时
PAGE分析
反应条件：将2μl人血清加到200,000cpm无水35S标记的po 1-mer缀合物。在37℃下在此血清存在下将放射标记的缀合物温育指 定的时间(15分钟、30分钟、60分钟、120分钟、240分钟)。用2μl H2O 稀释反应混合物，然后用4μl装样缓冲液稀释。通过在800V下进行 90分钟电泳的20％聚丙烯酰胺凝胶(0.75mm)放射自显影观测降解模 式。通过使用Fujix BAS 2000Phosphorimager进行条带定量(表3)。
表3
时间(分) 象素面积 归一化面积 标准化面积 0 42.57 0 1 15 57.43 0.1486 0.8514 30 66.61 0.2404 0.7596 60 76.92 0.3435 0.6565 120 81.57 0.39 0.61 240 80.13 0.3756 0.6244
y＝0.8387e-0.0016x
t1/2＝433分钟或7.2小时
表1-3的总平均t1/2＝7.8小时。
实施例8
此实施例证明5FU 1-mer缀合物 (YEE(ahGalNAc)3-SMCC-psFU(硫代磷酸酯连接的[ps]缀合物)或 YEE(ahGalNAc)3-SMCC-poFU(磷酸二酯连接的[po]缀合物))的细胞 摄入
将Hep G2细胞传代于2cm2孔并在RPMI 1640培养基中生长， 所述培养基中补充L-谷氨酰胺(10-040，CV)，至密度为0.3×106-0.4×106 细胞/孔(48孔平板，Costar，Cambridge，MA)。吸出维持培养基，并在 37℃下将细胞与0.2ml含有2％FCS和制成1μM的[5′-35S]标记的 YEE(ahGalNAc)3-SMCC-psFU(硫代磷酸酯连接的[ps]缀合物)或 YEE(ahGalNAc)3-SMCC-poFU(磷酸二酯连接的[po]缀合物)的培养基 一起培养。然后保存等分试样的培养基进行闪烁计数，并将残余培养 基从孔中吸出。用D-PBS(2×0.5ml)洗涤细胞，用0.25％胰蛋白酶处 理(37℃，2分钟；在含有1.0mM EDTA的HBSS中制备的胰蛋白酶)， 并将其悬浮在新鲜的含有10％FCS的生长培养基中。在1.7ml圆锥 形微离心管中将悬浮的细胞铺层于硅油(0.5ml)上，并在14,000 rpm(12,000g)下离心30分钟沉淀细胞。小心地滗析上清液，并用100μl 含有0.5％NP 40、100mM氯化钠、14mM Tris/HCl和30％乙腈的溶 液溶解细胞沉淀。通过闪烁计数来确定放射性量，推定与细胞溶解物 结合的新糖缀合物或寡聚体的量。
检查ps-和po-连接的、含5FU的新糖缀合物与Hep G2细胞的结 合以证明和比较肝脏来源细胞的摄入。首先，在RPMI 1640+10％FCS 中评价两种新糖缀合物的稳定性。在含有10％FCS的培养基中ps-连 接和po-连接的1-mer缀合物均稳定长达8小时，如PAGE分析所证 实。这些数据证明两种缀合物均表现出充足的体外稳定性，因而它们 可以用于细胞摄入研究。在细胞摄入方面，剂量为1μM的po-连接的 缀合物在体外被Hep G2细胞以渐进的方式迅速摄入至在480分钟时 为24.75pmoles/106细胞的程度。然后根据缀合物的施用剂量来分析细 胞摄入的速率。施用1μM po-连接的缀合物导致30分钟时细胞摄入5 pmoles/百万个细胞。在随后的30分钟内此数量倍增，且在480分钟 时达到峰值25pmoles/百万个细胞。倍增施用剂量至2μM并没有显著 增加细胞摄入，因为细胞内发现的缀合物的最初浓度和最大细胞摄入 类似于1μM剂量的情况。增加施用剂量至4μM和8μM分别导致最 大细胞摄入为36和43pmoles/百万个细胞。施用4μM缀合物导致缀 合物摄入随时间线性增加，而在施用8μM缀合物时发生的细胞摄入 的速率在120分钟时明显增大。缀合物摄入的方式不依赖于核苷酸包 含的键的类型，因为当缀合物为ps-连接时实现类似的细胞摄入方式。
当培养基中缀合物的浓度增加至2μM、4μM和8μM时，摄入随 浓度增加而增加，但不与剂量成比例。缀合物浓度倍增并没有显著增 加细胞摄入，施用2μM导致在480分钟时摄入大约26pmole/106细胞。 将缀合物浓度增大至4μM和8μM分别导致在480分钟时大约为36 pmoles/106细胞和42pmoles/106细胞的最大细胞摄入。但是，由于施 用8μM缀合物导致仅在120分钟内就摄入35pmoles/106细胞，因此 摄入的速率增大。
Hep G2细胞对YEE(ahGalNAc)3-SMCC-psFU的细胞摄入与po- 连接的缀合物非常类似，在480分钟时达到24.98pmoles/106细胞。同 样，当培养基中缀合物的浓度增加到2μM、4μM和8μM时，摄入随 浓度的增大而增大，但不与剂量成比例。
上述的数据表示po-和ps-连接的缀合物的摄入速率对于所有研究 的浓度基本上相同。这表明Hep G2细胞表面上的受体与独特的配体 的相互作用对细胞摄入程度起作用，而不管牢固“P”的化学键。细胞摄 入不与缀合物浓度的增大成比例的事实可能是细胞培养物的人工环境 造成的，其中受体的表达不是最理想的，包括在随后的体外生物效力 试验中所需的细胞增殖期间进行增殖所需的受体的表达。但是，上述 的实验表明在研究的条件下两种新糖缀合物的体外浓度的增大导致递 送至细胞的缀合物的水平增加。
实施例9
此实施例证明本发明缀合物对细胞增殖的作用。
将Hep G2细胞以5×104细胞/孔的密度接种到48孔平板中补 充10％FCS的RPMI中。然后在37℃、95％RH，5％CO2下将细 胞培养24小时。在此培养期之后，吸出维持培养基，并用多种浓度 的在200μl补充10％FCS的RPMI中的新糖缀合物处理细胞。用单 独的200μl RPMI+10％FCS处理对照孔。在0、24、48、72和96 小时，用0.5ml DPBS将每种条件的六个孔洗涤两次，并用0.5ml 胰蛋白酶(0.25％；在含有1.0mM EDTA的HBSS中制备)处理。使用 Coulter电子细胞计数器测定每种条件下的细胞数。在所有的情况 下，增殖抑制作用的程度作为时间的函数而增大。用非缀合的单体 处理Hep G2细胞导致大约20％的增殖抑制作用。将核苷酸类似物 进行缀合的作用是显著的，用po连接的缀合物处理导致最初10％ 抑制作用，抑制峰值为64％。用ps-连接的缀合物处理不那么有效， 最初的抑制作用为大约5％，其在96小时后增大至仅45％。因此核 苷酸类似物与YEE(ahGalNAc)3缀合的键的类型影响抑制增殖作用 的能力。
用1μM浓度的po-连接的新糖缀合物、ps-连接的新糖缀合物或 非缀合的单体处理Hep G2细胞。在24、48、72和96小时检测每 种处理和未处理对照的六个重复孔的平均细胞数。与未处理的对照 相比，用非缀合的单体处理Hep G2细胞导致15-20％增殖抑制作用。 用po-连接的新糖缀合物处理Hep G2细胞导致大约64％的增殖抑 制作用。与此相比，以相同浓度施用的ps-连接的新糖缀合物导致大 约44％的增殖抑制作用。
当培养基中任一缀合物的浓度增大至2μM、4μM和8μM时，增 殖抑制作用相对于1μM剂量的相同缀合物增大。因此，由ps-连接的 缀合物导致的抑制作用从1μm剂量下的44％增大到8μM剂量下的 60％。类似地，由po-连接的缀合物导致的抑制作用从1μM剂量下的 64％增大至8μM剂量下的90％。因此，po-连接的缀合物的活性比ps- 连接的缀合物在体外Hep G2细胞增殖方面的活性大大约30％。增殖 抑制作用的增加不与任一缀合物的施用剂量成比例。但是，来自上述 实验的数据证明递送增加量的新糖缀合物导致细胞增殖抑制作用的增 大。
实施例10
此实施例描述细胞毒性研究
将Hep G2细胞以密度为5×104细胞/孔接种于48孔平板内补充 10％FCS的RPMI中。然后在37℃、95％RH，5％CO2下将细胞培 养24小时。在此培养期之后，吸出维持培养基，并用多种浓度的在 200μl补充10％FCS的RPMI中的新糖缀合物处理细胞。用单独的200 μl RPMI+10％FCS处理对照孔。在0、24、48、72和96小时，用0.5 ml DPBS将每种条件的六个孔洗涤两次，并在37℃、95％RH，5％CO2 下用0.5ml胰蛋白酶(0.25％；在含有1.0mM EDTA的HBSS中制备) 处理5钟。加入0.5ml RPMI+10％FCS终止胰蛋白酶消化。然后将 细胞样品(900μl)接种到100μl台盼蓝，从而使染料的最终浓度为10％。 室温下将此溶液温育5分钟，并将100μl样品接种入血细胞计数器。 对于每孔读取三个视野的100个细胞。认为摄入并保持染料的细胞是 死亡的。数据表示为#存活细胞/总计数细胞＝％存活细胞。
用不同浓度的po-连接的新糖缀合物或ps-连接的新糖缀合物处理 Hep G2细胞。通过上述的台盼蓝排阻法测定毒性。所有的值与相同来 源的未处理细胞产生的值作比较。总的来说，毒性程度与施用剂量相 关。在72小时时，用2μM po-连接的缀合物处理细胞导致存活细胞 减少大约50％，而8μM处理导致存活细胞数减少75％。与po-连接的 缀合物相比，施用ps-连接的缀合物减少存活细胞数的作用较小，因为 在用2μM缀合物处理72小时时观察到存活细胞数仅减少大约25％， 而用8μM缀合物观察到大约减少45％。在所有的情况下，与72小时 的情况相比处理96小时不显著改变存活细胞数，除了用8μM ps-连接 的缀合物处理进一步减少存活细胞数。这提示ps-连接的缀合物减少存 活细胞数的效率较低。
实施例11
此实施例描述在po 1-mer和ps 1-mer存在下细胞中胸苷酸合成酶 的活性。
将CD-1小鼠(Charles River，Wilmington，MA)处死并取出肝。随 后用DPBS(Mediatech，Herndon，VA)洗涤大约1克组织，并将其置于 3体积缓冲液H。然后用Dounce匀浆器将组织匀浆，随后进行三次 15秒钟爆发式超声处理，然后在冰上处理1分钟。然后在4,000g下 将组织提取物离心10分钟，并将所得的上清液于7,000g下旋转20分 钟。然后将3份等量的此上清液加到0.9μCi等分试样的2′-脱氧尿苷 5′-一磷酸，二铵盐，[5-3H]。此时将5-氟-2′脱氧尿苷5′-一硫代磷酸加 到一份等分试样，将5-氟-2′-脱氧尿苷5′-一磷酸加到第二份等分试样， 留一份等分试样不作处理。在37℃下将三份样品温育30分钟，并用 炭沉淀。在1,600g下将所得的上清液离心10分钟。然后使用Beckman 闪烁计数器计数等分试样的每份样品。抑制百分比(％)表示如下：
对照值-处理值
对照值
这些试验测定10nM FdUMP(磷酸二酯底物)或FdUMPS(硫代磷 酸酯底物)抑制胸苷酸合成酶(TS)活性的能力。此试验的目的是测定TS 将[5-3H]-dUMP转化为3H-H2O的能力。如下表4所示，FdUMP表现 出大约两倍于FdUMPS的生物活性。
表4.
FdUMP和FdUMPS单体抑制TS催化活性的能力的比较 胸苷酸合成酶活性抑制百分比
试验[dUMP] 10nM FdUMP 10nM FdUMPS 10μM dUMP 28％ 13％ 1μM dUMP 48％ 27％
实施例12
此实施例例示po 1-mer由于对胸苷酸合成酶(TS)活性抑制作用增 强而对Hep G2细胞增殖的作用。
胸苷酸合成酶抑制作用导致用于DNA复制的胸苷酸水平不足，并 可能导致最终引起细胞死亡的细胞内信号过程。根据Keyomarsi等人 (J.Biol.Chem.268，15142-15149(1993))的方法测定此重要酶的活性。 简言之，105个Hep G2或TSU细胞培养生长48小时，然后将培养基 制成含1μM浓度的po 1-mer或非缀合的5FdU。在处理后以规律时 间间隔(24小时、48小时、72小时和96小时)，取出培养基，并用含 有脱氧尿苷/[3H]-脱氧尿苷混合物的培养基代替。在37℃下将细胞培养 30分钟。然后取出细胞培养基并与炭一起沉淀。然后计数上清液以确 定[3H]-H2O的存在。作为来自脱氧尿苷，5′-一磷酸(dUMP)底物的 [3H]-H2O的[3H]可测定释放反映胸苷酸合成酶活性。
在此方面，用浓度为1μM的po 1-mer处理Hep G2细胞导致对 [3H]-H2O释放的进行性抑制作用，指示TS活性受到严重抑制。在这 种情况下，在处理后96小时TS活性减小60％。与此相比，非缀合的 5FdU在相同的时间内将TS活性减小大约20％。这些数据与所述处理 对细胞生长抑制作用良好相关。po 1-mer导致的TS活性抑制作用是 细胞特异性的，在用po 1-mer处理的TSU癌细胞中没有观察到抑制 作用。而且，在用po 1-mer缀合物处理TSU癌细胞时这些细胞的存 活不受影响。
实施例13
此实施例例示用于测定po 1-mer在体内定位的生物分布实验。
对于这些研究，给雄性CD-1小鼠通过尾静脉i.v.注射[3′-35S]-放射 标记的po 1-mer或[6-3H]-非缀合的5FdU。以适宜的时间间隔，将小 鼠处死，切除器官，然后溶解。通过闪烁计数测定与每个器官相关的 放射性的量，并进行效率校正。将标准CD-1小鼠用于这些最初实验 以确定在正常小鼠中的基线分布，而随后的生物效力实验将使用CD-1 裸鼠。这些实验的结果是po 1-mer快速和特异性地定位至肝脏。57％ 注射的po 1-mer在15分钟内定位至肝脏，而与此相比10％注射的非 缀合的5FdU定位在肝脏(表5)。甚至在注射后60分钟，发现25％po 1-mer在肝脏(表6)。注射8小时后，基本上无po 1-mer定位在肝脏。 po 1-mer缀合物确实表现出显著的早期在肌肉中蓄积，然后在肠道中 蓄积(表5)。肌肉中多种β-半乳糖凝集素的存在可以在某些程度上竞争 GalNAc残基，导致这种早期蓄积(Barondes等人，J.Biol.Chem.269， 20807-20810(1994)；还参见Poirier 等人，Development，115， 143-155(1992))。但是，由于肌肉细胞的增殖指数低，被递送的核苷酸 类似物成为活性代谢物应该是极低的。在较后的时间点肠内放射性标 记的蓄积可能是5FU代谢物的肠肝再分布导致的。但是，携带带电磷 酸酯的核苷酸首先被递送至肝细胞，借此防此其被细胞清除。随后的 合成代谢/分解代谢过程可能导致放射性代谢物的再分布，使分布分析 复杂化。虽然肠肝再循环是要考虑的一个因素，但它的重要性受到怀 疑，因为通过胆汁途径排泄的5FU代谢物百分率低(Young等人， Nuklearmedizin，21，1-7(1982))。非肝分布的另一种可能的解释可以是 无特征标记物的使用，因为来自缀合物的放射性标记在细胞内快速离 解，随后标记物非特异性蓄积。尽管有上述的说明限定，这些实验清 楚地证明po 1-mer以快速和特异性方式将其负载递送至小鼠的肝脏。
表5.由尾静脉i.v.施用[3′-35S]-标记的PO 1-mer导致的CD-1正 常小鼠器官中5FU 1-mer的相对百分比
器官 15分钟 30分钟 60分钟 120分钟 240分钟 480分钟 肝 57.61±9.04 50.93±2.44 24.60±5.51 9.93±1.92 3.29±0.31 2.87±0.29 肾 0.96±0.12 1.07±0.17 2.50±1.34 1.52±0.14 0.56±0.14 0.44±0.11 脾 0.12±0.01 0.368±0.51 0.19±0.12 0.17±0.037 0.33±0.43 0.07±0.012 肌肉 3.80±1.69 7.87±3.55 10.33±8.85 5.54±3.96 5.48±0.7 4.58±3.9 小肠 2.56±3.58 4.00±5.01 4.26±14.94 5.77±2.4 3.31±4.74 3.7±3.84 大肠 1.02±0.34 4.217±5.93 2.45±2.16 0.95±0.032 3.29±0.31 7.94±0.65 肺 0.42±0.13 0.35±0.16 0.77±0.53 0.49±0.85 3.29±0.31 0.33±0.055 心 0.168±0.02 0.18±0.11 0.33±0.19 0.17±0.016 3.29±0.31 0.081±.006 血液 2.19±1.57 1.3±0.15 3.13 2.7 3.29±0.31 0.81±0.47 膀胱 3.05+0.33 0.33±0.3 6.97±9.8 6.85±5.97 3.29±0.31 4.23±5.83
表6.由尾静脉i.v.施用[6-3H]非缀合的5FdU导致的CD-1正常小 鼠器官中5FdU的相对百分比
％注射剂量-5FdU
器官 15分钟 30分钟 60分钟 120分钟 240分钟 480分钟 肝 9.56±3.83 8.8±1.23 4.35±1.35 ND 3.97±0.37 1.25±0.33 肾 0.42±0.28 0.38±0.3 0.84±0.31 0.44±0.12 0.13±.044 脾 0.11±0.044 0.19±0.26 0.57±0.18 0.38±0.04 0.09±0.05 肌肉 9.29±4.9 3.43±1.06 22.84 46.56 7.9±1.64 小肠 0.7±0.04 0.61±0.36 3.57±1.3 4.19±1.18 1.37±0.7 大肠 1.09±0.25 0.37±0.19 1.04±0.2 1.61±0.59 0.35±0.09 肺 0.17±0.07 0.05±0.006 0.98±0.3 1.03±0.39 0.08±0.04 心脏 0.21±0.13 0.03±.004 0.28±0.11 0.32±0.10 0.06±.02 血液 0.03±0.02 .008±.0025 .007±.0023 0.56±0..28 0.23±0.14 膀胱 0.91+0.07 2.3±1.58 2.99±1.01 0.010±.015 .001±.0006
ND：未测定。
实施例14
此实施例例示po 1-mer对CD-1小鼠的肝毒性和全身毒性的试验
以前将小鼠用作以以下方式进行的5FU药物试验体内模型(Ain等 人，J.Surg.Res.57，366-372(1994)；Wang等人，Cancer Res.50， 869s-872s(1990))。5FU在小鼠中的血浆曲线、诱导的毒性和药代动力 学类似于在人身上观察到的结果(Wagner等人，Cancer Res.46， 1499-1506(1986))。po 1-mer和5FdU均以每周1次共4次通过尾静脉 推注的临床相关方案施用(Anfield等人，Cancer，39，34-40(1977))。通 过外推体外数据而确定起始剂量为10mg/kg和15mg/kg。每次注射后 一周，将一群动物(6只动物/剂量/治疗)处死。从每只动物收集血液和 肝脏样本，并测定肝和全身毒性。血样分析包括Superchem panel和 全血计数。Superchem panel测定葡萄糖、尿素氮(BUN)、肌酐、总蛋 白、白蛋白、结合和非结合的胆红素、甘油三酯、SGOT、SGPT、甘 油三酯、CPK、碱性磷酸酶的血液水平和外周血分类。全血计数分析 血细胞比容以及红细胞和白细胞计数。对肝样本进行组织学分析以测 定与对照组相比的形态、结构变化以及坏死组织的增加。与未治疗的 对照组相比，代表器官损害的血液计数或血清组分的任何快速或持续 增加被认为代表毒性反应。此外，在整个治疗期间记录每一群的重量 作为它们临床情况的指示。
每周10mg/Kg剂量水平的po 1-mer
这些实验的结果表明与每种剂量相关的轻度毒性。在身体方面， 食物和水的消耗正常，而四周内重量增加是渐进的，并类似于盐水处 理的对照小鼠。但是，对小鼠以剂量水平为10mg/kg的po 1-mer治 疗导致显著降低的白细胞计数和轻度低色素性贫血。血液化学分析表 明SGPT水平在参考范围的最高限和显著增大的SGOT水平。这些结 果总结成表7。此外，乳酸脱氢酶水平和血清钾水平增高，表明细胞 质的丢失和细胞的过度破坏。还检测到尿素氮(BUN)和钠水平的升高 以及氯、钙水平的降低，这是轻度肾功能障碍的特征表现。但是，未 观察到代表重度肝损害的总胆红素和γ-谷氨酰转移酶(GT)水平升高。 组织学分析没有揭示超越轻度肝细胞肿胀的任何病理变化。在临床意 义上，小鼠未表现出不利的治疗影响。该剂量的毒性作用似乎是短暂 的。当治疗停止两周时，所有的血液值开始恢复至参考范围，且肝细 胞肿胀消退(第6周，在表7中)。
每周15mg/Kg剂量水平的po 1-mer
po 1-mer(15mg/kg)毒性试验的结果类似于对10mg/kg剂量水平 所见的结果。这些数据呈现在表8中。全血计数结果揭示白细胞计数 显著降低、轻度低色素性贫血和轻度血小板减少症。血液化学结果证 明SGPT水平在参考范围的最高限和SGOT水平显著升高，表明对肝 细胞有一定的干扰。此外，乳酸脱氢酶水平和血清钾水平升高，表明 细胞质丢失。与前面使用10mg/kg剂量一样，未观察到代表重度肝损 害的总胆红素和γ-GT水平的升高。而且，组织学分析揭示轻度细胞 肿胀和在1只小鼠中有限的被膜下纤维化。在临床意义上，小鼠未表 现出治疗的不利影响。食物和水消耗正常，尽管体重增加在一定程度 上小于未治疗的对照小鼠，增加速率仍是渐进的。目前正在分析在恢 复后停止治疗的效应。这些实验的数据表明po 1-mer的毒性最多是轻 度，并允许进一步试验考虑生物效力。
表7.以一周的时间间隔接受10mg/kg剂量水平的po 1-mer的 CD-1小鼠的血液学分析
参数 参考值 第1周 第2周 第3周 第4周 第6周 WBC 6.9-9.1thds/cmm 4.86 3.16 2.8 1.83 3.03 MCV 69-85fl 51.5 51 56 52.83 51.18 MCH 24-30pg 17.2 15.6 16.56 16.42 16.1 SGOT 24-472u/l 335.5 911.33 1174 1549.5 1211.61 SGPT 28-190u/l 46.5 110 177 125.66 137.55 钾 4.7-6.3meq/l 11.63 11.1 8.9 12.46 10.82 BUN 23-43mg/dl 24.66 18 22 21.33 22.44 钙 12-12.4mg/dl 7.56 7.75 8.85 6.5 7.7 钠 144-150meq/l 155.6 142.5 152.5 161.6 162.22 氯 104-120meq/l 106.33 95 87.5 86.66 89.72
表8.以一周的时间间隔接受15mg/kg剂量水平的po 1-mer的 CD-1小鼠的血液学分析
参数 参考值 第1周 第2周 第3周 第4周 WBC 6.9-9.1thds/cm 2 ＊ 2.1 1.85 MCV 69-85fl 50 56.556 51 MCH 24-30pg 16.83 16.56 14.2 SGOT 24-472u/l 730 1194 1669.5 SGPT 28-190u/l 67.5 120.3 123.66 钾 4.7-6.3meq/l 8.9 8.7 13.46 BUN 23-43mg/dl 26 22 20.33 钙 12-12.4mg/dl 9.15 7.73 6.7 钠 144-150meq/l 154.5 156.5 165.6 氯 104-120meq/l 101.33 87.5 81.66
实施例15
此实施例描述胸苷酸合成酶活性、细胞内核苷酸和辅因子浓度以 及生长抑制作用的测定
细胞TS水平和活性的测定
为了进一步评价递送的缀合物的有效性，使用准确和灵敏的方法 测定TS水平和活性。所用的方法由Spears等人((1988)，The Expanding Role of Folates and Fluoropyridmidines in Cancer Chemotherapy，Plenum Publishing，New York，NY，pp.97-104)和 Keyomarsi等人((1988)，J Biol. Chem.263：14402-14409)前述方法修 改而成。通过这些测定，可以确定各5FdUMP或甲酰四氢叶酸残基的 TS抑制作用。一式三份进行细胞组分定量，从而可以使用学生配对t 检验法确定统计学显著性。
TS水平
通过在过量叶酸(5，10-亚甲基四氢叶酸，5，10-CH2-H4PteGlu)存在 下用[3H]-FdUMP滴定活性位点而对胸苷酸合成酶水平进行定量。指 数生长的细胞与药物在监控湿度和CO2含量的条件下在补充10％透析 FCS的培养基中连续接触。在不同的时间点，洗涤等分试样的每种培 养物，并以确定的细胞密度将其悬浮在PBS中。然后将此混合物进行 超声处理并高速离心。从每种上清液中，通过尺寸排阻凝胶过滤法将 等分试样除去盐分，然后在30℃下与5，10-CH2-H4PteGlu和 [3H]-FdUMP一起温育。加入冰冷的右旋糖酐T-70-和BSA-处理的炭 的悬浮液，混合，然后离心大约5分钟。将放射性上清液加到三氯乙 酸稀溶液，温育并离心。然后将所得的沉淀溶于闪烁液以进行放射性 定量。
TS活性
根据Spears等人(上文)所述的氚释放试验测定TS活性。该试验 由以下步骤组成：将部分胞液和[3H]-dUMP和5，10-亚甲基四氢叶酸 (通常～0.5-1μm最终浓度和pH7.3)一起温育。经过37℃温育后，通 过冷却至0℃而终止反应。通常通过加入含有稀三氯乙酸的活性炭除 去过量的[3H]-dUMP。离心后，测定在温育期间形成的含氚水(3H2O)。 结果表示为毫微微摩尔形成的3H2O/分钟/毫克蛋白，基于得自温育时 间的线性回归。这种方法的灵敏度为10fmol/分钟/mg蛋白。
核苷酸浓度
对于缀合物效力判断同样重要的是准确地测定细胞内游离和结合 核苷酸的水平。这些水平在每次缀合物加入之前及之后测定。这些测 定的原理主要围绕已确定这些核苷的游离库控制细胞生长和调节TS 活性的研究(Berger，上文；Evans等人，(1980)，Cancer Res.40： 4113-4122；Evans等人，(1981)，Cancer Res.41：3288-3295)。过量水平 的细胞内FdUMP和dUMP之间的相互关系是竞争性的。显然，在高 水平的内源性dUMP下FdUMP的效力将减小。此外，由于在LV存 在下获得的FdUMP结合增加，可以获知LV浓度与效力的相互关系。 因此，每一种浓度的准确测定使对给定缀合物的效力进行评价成为可 能。为了获得这种信息，进行分析以测定dUMP、5FdUMP和甲酰四 氢叶酸的细胞内水平。
dUMP的测定
此试验修改自Moran(Proc.Natl.Acad.Sci.1979，76：1456-1460)。 在此试验中，使用纯胸苷酸合成酶(L.casei)以将dUMP样品定量转化 为已在14C-标记的5，10-14CH2-H4PteGlu存在下温育的[甲基 -14C]-dTMP。此过程包括用缓冲BSA和未知数量的来自细胞提取物 的dUMP处理TS酶。加入14C-标记的甲酰四氢叶酸(Amersham Life Sciences)并温育所得的混合物。用甲醛终止甲基转移反应，使用DEAE 纤维素柱分离标记的TMP，用缓冲的碳酸氢铵或甲酸铵洗脱。通过闪 烁计数测定洗脱物的放射性。可以可靠地获得小至10pmoles dUMP 的灵敏度水平。
游离和结合5FdUMP的测定
除了游离5FdUMP浓度之外，知道已与TS结合的[3H]-5FdUMP 的数量也是重要的，此比率将直接涉及细胞内5FU递送的有效性。此 测定仅适用于使用氚标记的底物的细胞摄入实验。一般地，此方法 (Moran，上文)包括将BSA-和右旋糖酐处理的炭加到未知的游离和结 合FdUMP的混合物。进行简单离心，对上清液进行萃取足以除去 90-99％未结合的、标记的FdUMP。游离与结合FdUMP的比率可以 通过除上清液和炭层的闪烁计数测定值而得到。此数据与细胞内 dUMP水平相比可以了解细胞系如何抵抗5FU的不利作用。
甲酰四氢叶酸的测定
此试验修改自Lu等人(上文)所述的方法。对于这些细胞摄入实验， 在2cm2孔中，在含有10％透析马血清的无叶酸培养基中，在37℃下 将肝细胞平板培养至预定密度，持续24小时。然后吸出培养基，并将 细胞悬浮在含有(6S)-[3H]-甲酰四氢叶酸的培养中，并在37℃下培养。 在培养期后，通过将细胞冷却至0℃并快速用冷PBS(pH7.4)洗涤而终 止细胞摄入。为了除去细胞表面结合的LV，用冷盐水(pH3.0)进一步 冲洗细胞。再次用PBS冲洗后，溶解细胞并分析含氚物质。从最终吸 收量中扣除非特异性结合。
实施例16
此实施例例示本发明缀合物，特别是靶向针对裸鼠中的人肝细胞 瘤异种移植的po 1-mer的生物效力。
先前显示异种移植肿瘤对5-FU化疗有反应，如通过直接实体测定 肿瘤(Houghton等人，Biochem.Pharmacol.36，1285-1289(1987))，组 织学改变和生物化学测定，如α-胎蛋白(AFP)水平(Lemoine等人， Pathol.Biol.(Paris)，47，903-910(1999))和胸苷酸合成酶水平(Peters等 人，J.Clin Oncol.12，2035-2042(1994))所测定。裸鼠上的异种移植肿 瘤是一种广泛应用的肿瘤研究模型，它允许直接测定人肿瘤的生长。 雄性CD-1裸鼠(6-8周龄，20-22g重量)用于这些生物效力研究。将 108Hep G2细胞皮下注射到每只小鼠的被膜下区。每天观察小鼠的肿 瘤形成。在肿瘤出现后，每周两次用游标卡尺测定两个维度。当肿瘤 达到以下式确定的100mg重量时：[(重量，mg)＝(长度(mm)×宽度 (mm))2/2]，开始治疗(Geran等人，Cancer Chemothe r.Rep. 3，51-61(1972))。首先用每周一次10mg/kg剂量治疗小鼠，持续8周。 然后，用每周15mg/kg治疗单独群体的小鼠，持续8周，最后以每周 两次10mg/kg治疗，持续8周。通过上述的直接测定值来判断治疗对 肿瘤生长的影响。此外，通过血清学测量值，如AFP水平来追踪肿瘤 进展。在每次注射之后每周分析AFP水平。从每只小鼠眶后取血。使 用由Abbott Laboratories(Waukegan，IL)提供的试剂盒并根据Wang 等人的方法(Cancer Res.50，869s-872s(1990))对AFP水平进行免疫化 学测定。AFP水平的测定意在补充直接实体测定作为肿瘤进展的指标。 一般地，血清AFP水平表现出它们似乎反映肿瘤质量。但是，应该 指出已在某些无并发症的肝病患者中发现AFP水平中度升高。尽管存 在这些假阳性，血清AFP水平已成功地用于监测治疗反应(Johnson，J， Gastroent Hepatol.14(Suppl.)，s32-s36(1999))，特别是用于长有肿瘤 的裸鼠，其中人肿瘤是人AFP的唯一来源。这些测定结果提供了在其 表现为实体肿瘤生长之前对HCC可能性的早期指示。由以上实验产 生的数据应该有助于推导较大哺乳动物试验和随后临床研究的起始剂 量。
每周10mg/Kg剂量水平的po 1-mer
用10mg/kg po 1-mer治疗长肝细胞瘤小鼠导致轻度的抑制肿瘤 生长作用。在大约5周之后注意到po 1-mer治疗的最初效果。但是， 总体上肿瘤在此时间点后继续生长，但其速率比对照组慢。例如，po 1-mer治疗后8周，CD-1裸鼠上异种移植的人肝细胞瘤的平均肿瘤重 量为大约7g，而盐水对照组的平均肿瘤重量为大约15g。在8周后进 行组织学分析以比较对照组的肿瘤和po 1-mer治疗裸鼠的肿瘤。这些 分析表明有丝分裂指数降低和治疗肿瘤中的坏死组织量增多。
而且，在治疗肿瘤中观察到TS活性降低，但在取自相同动物的 肝中没有观察到(表9)。总地来说，po 1-mer治疗小鼠和盐水对照组的 体重与不长有肿瘤的小鼠相比在治疗3周后稍稍下降。这种重量损失 可能由于肿瘤负担而不是治疗导致，并持续至第8周。
表9.每周10mg/kg剂量水平的po 1-mer对CD-1裸鼠肝脏和异 种移植人肝细胞瘤中的TS活性抑制的作用
组织 计数/MG蛋白 ％TS抑制作用 肿瘤 治疗 17641 50 未治疗 35197 --------- 肝 治疗 19718 3.84 未治疗 20504 -----------
每周15mg/Kg剂量水平的po 1-mer
当po 1-mer剂量水平增加到每周注射15mg/kg时，引起更大幅 度的对肿瘤重量的作用。在此剂量水平下，po 1-mer治疗对肿瘤进展 具有更大的影响，包括在5次注射后导致生长速率的显著降低。此时， 肿瘤进展几乎静止。再注射2次后，一只小鼠的肿瘤负担根除，而其 它小鼠的肿瘤减小。由于这些肿瘤减小，组织似乎呈干燥和坏死样。 盐水治疗的对照组则完全相反，其中肿瘤重量在4周的时间内增加至 大约12克。甲胎蛋白(AFP)测定值下降大致与肿瘤大小的减小平行。 PO 1-mer治疗显著地降低AFP水平，从而在治疗3周后使AFP的水 平小于200μg/ml。这种趋势持续至该值于第8周低于检测水平。
在治疗完成后，对肿瘤进行组织学分析并分析其TS活性。这些 分析表明治疗肿瘤中的TS活性大大降低，但来自相同动物的肝组织 则不是如此(表10)。po 1-mer治疗的肿瘤在组织学上表现出极低的有 丝分裂指数和广泛的坏死。在临床毒性的方面，po 1-mer治疗小鼠保 持与不长有肿瘤的小鼠相同的稳定体重增加。在实验期间处死的此生 物效力研究的裸鼠表现出与那些正常小鼠在毒性实验中大致相同的血 液化学特征。因此，可以推断增加po 1-mer剂量增大效力，而不增大 全身毒性。
表10.每周15mg/kg剂量水平的po 1-mer对CD-1裸鼠肝脏和异 种移植的人肝细胞瘤中的TS活性抑制的作用
组织 计数/MG蛋白 ％TS抑制作用 肿瘤 治疗 8591 75.6 未治疗 35197 ---- 肝 治疗 18989 7.39 未治疗 20504 ----
10mg/Kg剂量水平每周两次的po 1-mer
关于po 1-mer对HCC肿瘤的效力的进一步研究扩大到考虑改变 方案和剂量。在此改变中，用每周两次10mg/kg的po 1-mer或盐水 对照治疗长有肿瘤的小鼠。以此方案，po 1-mer治疗更迅速引起肿瘤 生长变化。在治疗3周后观察到肿瘤进展的显著降低，且体重中度下 降。随着常规的每周两次治疗肿瘤生长持续降低直至6周后检测不到 肿瘤。同样，po 1-mer治疗小鼠的AFP测定大致与第3周开始并持续 至在第6周低于检测限的肿瘤减小速率平行。相反，盐水治疗小鼠的 AFP水平在7周时间内从50μg/ml升至900μg/ml。此组中的一只动 物确实表现出对治疗的某种抵抗，且肿瘤生长持续至第5周。但是， 当由于病毒感染而处死此动物时，组织学分析表明与盐水对照组相比 其发生广泛的肿瘤坏死。
实施例17
此实施例例示使用或不使用C6-硫醇修饰剂合成5FdU 18-mer(图 11)。
在Applied Biosystems 392DNA合成器上，使用标准甲基膦酸酯/ 亚磷酰胺化学法合成所有寡核苷酸。固相DNA合成使用Glen research 化学物质(Universal-Q固相载体(500孔径)，亚磷酰胺活化剂溶液 (1H-四唑)和β-氰基乙基亚磷酰胺)或自制化学物质(去封闭溶液，cap A 溶液，cap B溶液和氧化剂溶液)。去封闭溶液含有在二氯甲烷(试剂级) 中的2.5％(v/v)二氯乙酸。Cap A为乙酐在无水四氢呋喃中和双蒸2，6- 二甲基吡啶的混合物(1∶8∶1；v/v/v)。Cap B为在无水CH3CN中的0.5 M 1-甲基咪唑的溶液。对于三价亚磷酸盐的硫化，使用10ml CH3CN(Glen Research)含100mg试剂的浓度的3H-1，2-苯并二硫杂环 戊二烯-3-酮-1，1-二氧化物(Beaucage试剂)的溶液。
开发两种用户程序用于合成这种寡核苷酸。调用称为“DBL SULFUR”的第一程序用于合成硫代磷酸酯键。此程序使正常量的合 成子以增加的偶合时间(即从25秒至60分秒)两次通过柱。氧化/硫化 时间设定在900秒。
通过稀释14∶1丙烯酰胺：N，N′-亚甲基-双(丙烯)酰胺的30％水溶 液(按重量计)制备聚丙烯酰胺凝胶，以提供15％或20％交联的凝胶， 如在特定操作中所述。最终的溶液含有尿素(7M最终浓度)。加入等分 试样的110μl 20％过硫酸铵水溶液，并通过加入四甲基乙二胺 (TMEDA)(55μl)而启动聚合反应。使凝胶聚合并凝固1小时。使容器 充满TBE缓冲液。将样品(8.0-12.0μl)加到凝胶孔。对于个别实验在其 特定的条件下进行凝胶电泳。通过放射自显影法观察放射标记的产物 条带。
使用现存的自动DNA合成技术和方法完成含5-氟-2’-脱氧尿苷的 寡核苷酸的合成(图11)。使用Universal-Q CPG固相载体以1μmole 规模进行合成。如上述，使用0.1M(0.25g，在3.4ml CH3CN中)浓度 的5FU寡核苷酸合成子，5′-二甲氧基三苯甲基-5-氟-2′-脱氧尿苷， 3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]亚磷酰胺(Glen Research)。监测二甲 氧基三苯甲基阳离子吸光度(λmax 498nm)并测定偶合效率。在完成最 后合成循环后，从合成器中取出固相载体结合的寡核苷酸并真空干燥， 然后去保护。可选择地，然后使用硫醇修饰剂C6S-S试剂，1-O-二甲 氧基三苯甲基-己基二硫化物，1′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷 酰胺(0.1M)，使固相载体结合的寡核苷酸暴露于标准亚磷酰胺条件。 为帮助纯化，使最终的二甲氧基三苯甲基(DMT)保持完整。
在使用和不使用硫醇修饰剂的两种情况下，室温(25℃)下用1ml 在50％CH3OH/H2O中的0.5M NaOH溶液将固相载体结合的寡核苷 酸处理1小时。然后用2ml 0.5M Na2PO4中和该溶液并用H2O稀释至 20ml。然后将粗溶液应用于预平衡的C18SepPak(20ml)以进行纯化。 连续地用CH3OH(30ml)，50％CH3OH/H2O(30ml)，然后H2O(100ml) 洗脱来预平衡柱。在应用粗寡聚体后，用H2O(30ml)，然后用5％ CH3CN/H2O洗柱以从合成中除去任何缺陷序列。然后恢复用H2O(30 ml)洗柱，并用0.5％(v/v)在H2O中的CF3CO2H处理。然后用H2O(30 ml)从柱上洗出过量酸。用35％CH3CN/H2O从柱上洗脱低聚产物，并 收集馏分。通过HPLC和PAGE分析鉴定含有产物的馏分并收集合并， 浓缩得到78O.D.(对于未用硫醇修饰的寡核苷酸)和37O.D.(对于硫 醇修饰的寡核苷酸)。分光光度法测定产率。
实施例18
此实施例例示硫醇修饰的寡核苷酸的制备(12，图10)。
通过使用DTT处理含有5′二硫化物的寡聚体而将其还原成硫醇 (12，图10)。因此，将3.6OD260(～40nmoles)二硫化物寡聚体(11，图 10)溶于400μl新鲜制备和脱气的在10mM磷酸钠(pH8)中的50mM DTT溶液。在37℃下将混合物温育2小时。然后用Sephadex G-25(细) 柱(1.0×43cm)纯化硫醇寡聚体以除去DTT和无机盐。使用脱气的含 20％乙醇的水进行柱填充和样品洗脱。将含有纯硫醇寡聚体的G-25 馏分直接用于下一反应以使可能的硫醇二聚产物降到最低限度。
实施例19
此实施例例示含硫醇寡聚体与SMCC-配体的缀合： YEE(ahGalNAc)3-SMCC-AHT-Poly5FU缀合物(图10&12)(13)。
收集含有3.6OD260(40hmoles)纯硫醇寡聚体(12，图10)的G-25馏 分后立即将其与SMCC-YEE(ahGalNAc)3(10，图10)(″A-L″缀合 物)(100nmoles)混合，并在真空下用Speed-vac将混合物浓缩至干。将 残余物溶于含有0.1M磷酸钠，pH7的100μl脱气的50％CH3CN。 在Speed-vac中通过应用真空大约5分钟而将溶液进一步脱气。然后 将溶液紧紧地封住，并在室温下温育过夜以使缀合完全。通过A267吸 光率强度来测定产量(1nmole为0.089O.D.)，然后用紫外投影 (shadowing)的20％变性PAGE分析。此结果指示硫醇寡聚体与新 糖肽定量缀合。通过在胰凝乳蛋白酶消化时发生显著的凝胶迁移率变 动和用DTT处理时不能发生移位而证实此缀合物(图13)。最后采用 Sephadex G-25柱，用20％乙醇洗脱而纯化缀合物，然后用于进一步 的研究。产量32.4nmoles(3.85OD260)；质谱(MALDI-TOF)，m/z 6712 (C241H291N46O63P18S5F18要求6712(M)+(Scripps Research Institute，La Jolla，CA))。
实施例20
此实施例例示35S放射标记示踪剂的装配(图2)。
反应混合物(300μl总体积)由18.1nmoles 5FU寡核苷酸底物 (18-mer)、5x末端脱氧核苷酸转移酶缓冲液(pH7.2)(60μl)、0.5mCi [35S]dATP S(Amersham，Uppsala，Sweden)和500单位末端脱氧核苷酸 转移酶(Life Technology，La Jolla，CA)组成。将所得的溶液于37℃下温 育17小时。然后将混合物冷却至室温，并用400μl 0.5M Na2PO4(pH 5.8)稀释，然后在1小时后将内容物应用于预平衡的NAP-25柱 (Pharmacia，Peapack，NJ)。装填700μl的样品后，装填300μl H2O， 并收集全部1ml等分试样作为馏分1。然后收集1ml馏分；馏分4包 含用UV和闪烁计数定量的产物。根据这些测定值计算特定活性 (μCi/nmole)。产量为10.42nmoles，包含总共183.3μCi。
实施例21
此实施例例示用于使用A-L-PP缀合物进行的细胞摄入实验的方 法和材料，其中PP为包含抗癌活性的药剂，该实施例还例示Hep G2 细胞在体外对新糖缀合物的增强的和特异性的细胞摄入。
将Hep G2、TSU和Caki-1细胞(ATCC，Rockville，MD)传代至2 cm2孔，并使其在补充L-谷氨酰胺和FCS的RPMI培养基1640中生 长至密度为0.2×106-0.5×106细胞/孔。
吸出维持培养基，并使细胞在37℃下与0.2ml含有2％FCS以及 1μM[5′-32P]标记的缀合物或相应的非缀合寡聚体的培养基一起温育。 在指定的时间过去后，保存5μl等分试样的培养基用于闪烁计数，并 从孔中吸出剩余物。用D-PBS(2×0.5ml)洗涤细胞，用0.25％胰蛋白酶 (0.25％；在含1.0mM EDTA的HBSS中制备)(GIBCO BRL， Carlsbad，CA)在37℃下处理2分钟，并悬浮于含10％FCS的新鲜生 长培养基中。在1.7ml圆锥形微离心管中将细胞铺层于硅油(0.5ml)上， 并通过在14,000rpm(12,000g)下离心30秒而沉淀细胞。小心地滗析 上清液，并用100μl含有0.5％NP 40,100mM氯化钠，14mM Tris/HCl 和30％乙腈的溶液溶解细胞沉淀。通过闪烁计数确定放射性的量，推 定与溶胞产物相关的新糖缀合物或寡聚体的量。
测定硫代磷酸酯连接的、含有5FU的新糖缀合物与Hep G2细胞 的细胞结合以证明肝脏来源的细胞的增强摄入。作为对照，还测定相 应的标记的非缀合寡聚体与Hep G2细胞的细胞结合。新糖缀合物快 速地与Hep G2细胞结合，其程度为在第0.5小时达19.54pmoles/106 细胞，并继续蓄积直至在第4小时达峰值39.91pmoles/106细胞。相比 之下，对应的非缀合的寡聚体表现出Hep G2细胞的细胞摄入速率低， 在第0.5小时结合至6.51pmoles/106的程度，并进一步蓄积至第4小 时达峰值11.88pmoles/106。还测定了化合物的细胞特异性。发现脱唾 液酸糖蛋白受体存在于肝细胞表面，且它是使多种治疗剂选择性靶向 作用于该组织的有效手段。通过分析新糖缀合物与两种人的非肝源细 胞系TSU和Caki-1的结合来测定组织特异性。
TSU细胞与非缀合的寡聚体一起培养导致最初在0.5小时时摄入 3.8，然后逐渐增加至在第4小时的11.43。这些结果类似于非缀合寡 聚体在与Hep G2细胞一起培养时观测到的结果。但是，当TSU细胞 与新糖缀合物接触时，摄入没有明显增加。新糖缀合物的摄入程度为 在第4小时为5.6，并逐渐蓄积至在第4小时为13.15，数值非常类似 于对非缀合的寡聚体的观测数值。
类似地，Caki-1细胞不表现出对新糖缀合物的摄入增加。与非缀 合的寡聚体相比，新糖缀合物蓄积至在0.5小时为6.4，而在第4小 时为10.553的程度。使用非缀合的寡聚体观测到类似的数据，其结合 在第0.5时为7.66，而在第4小时为11.86。新糖缀合物和对应的非缀 合的寡聚体都证明在细胞培养基中结构稳定长达96小时。
以上的数据证实新糖缀合物能够以增强和特异性的方式将化学治 疗剂即5FU递送至肝源细胞。
实施例22
此实施例描述5-FU寡核苷酸和对应的缀合物在体外和在Hep G2细胞内的酶促降解。
硫代磷酸酯寡核苷酸(通过硫代磷酸酯部分连接的5-氟-2′脱氧尿 苷(5FdU)单元的18个残基)首先降解至较小的寡核苷酸(大约5个寡聚 体，根据下述的HPLC分析)，然后在与酶或Hep G2细胞接触期间降 解为单体单元。对Hep G2-内化的寡核苷酸(100％产生单体5FdUMP 残基)观察到完全转化为单体单元，而对寡核苷酸的酶处理在144小时 后产生最大仅为72％计算量的5FdUMP。但是，尽管如此，重要的是 要指出用S1核酸酶进行的酶消化并不代表此实施例的最佳方式，而仅 仅代表一种使用更逼真的细胞模型的原则。而且，尽管没有观察到核 酸内切酶S1核酸酶导致完全降解为单体单元，寡核苷酸在仅24小时 后完全降解为较小的片段。
5FdUMP的摩尔消光系数的计算
将5FdUMP样品(5mg(0.015mmole))溶于5ml H2O。然后将此溶 液稀释得到以下溶液：1.9μM、3.8μM，9.5μM、19μM、38μM和 95μM。制作比尔定律图，并计算消光系数为5278cm-1L-1M-1；r2＝1.0。 根据此值，计算5FU寡核苷酸(ps5FU-18-mer)的消光系数。此数值在 0.089O.D.(260nm)时为1nmole。
制备5-氟-2′-脱氧尿苷5′-一磷酸的HPLC标准曲线
制备含有5-氟-2′-脱氧尿苷5′-一磷酸(Sigma-Aldrich，St.Louis， MO)的标准溶液：0.38μM、0.95μM、3.8μM、7.6μM、38μM和95μM。 通过UV光谱法测定这些浓度。使用Microsorb Rainin柱(5uM)(4.6 mm×150mm)；通过测定已知浓度的溶液(100μl样品，100μl注射器环 路)的HPLC峰面积来完成标准化。使用在2％CH3CN/H2O中的50 mM Na2PO4(pH5.8)，以1.0ml/min的流速处理在每份标准溶液中的 含5FdUMP的样品。使用在50mM Na2PO4(pH5.8)中的CH3CN线性 梯度(2％-50％CH3CN，在20分钟内)洗脱寡聚体产物。以一式三份处 理每种浓度和时间点。在267nm下监测洗脱液。标准品的洗脱时间和 浓度如下：5FdUMP：2.71分钟；5FU寡核苷酸：19.6分钟。绘制色 谱图上所示的峰面积和5FdUMP浓度之间的相互关系。方程为： 5FdUMP的浓度(μM)＝[(观测的峰面积-1575.060)/10158.229]。
S1核酸酶对5FU寡核苷酸的降解
反应混合物(320μl总体积)含有4.32O.D.(48.5nmoles)5FU寡聚 体，在30μl 10x S1反应缓冲液中并用50μl H2O稀释。往此溶液加入 等分试样的120μl S1核酸酶(Life Technologies，263单位/μl)(在37℃下 每分钟一单位产生1μg酸可溶性核苷酸)以开始反应。然后使反应混合 物在37℃下温育指定的时间：24、48、72和144小时。在每一个时间 点，提取10μl等分试样，使用UV光谱在260nm下检测而进行HPLC 分析。使用Microsorb Rainin柱(5μm)(4.6mm×150mm)；之前通过测 定已知浓度的溶液(100μl样品，100μl注射器环路)的HPLC峰面积来 完成标准化。使用在2％CH3CN/H2O中的50mM Na2PO4(pH5.8)， 以1.0ml/min的流速处理在每等份含5FdUMP的样品。使用在50mM Na2PO4(pH5.8)中的CH3CN线性梯度(2％-50％CH3CN，在20分钟内) 洗脱寡聚体产物。观察到5种寡聚体种类：15.9、17.2、17.5、18.35、 18.6分钟。
Hep G2细胞对5FU寡核苷酸缀合物的降解和缀合物处理
Hep G2细胞与培养基内含有的1μM 5FU寡核苷酸缀合物一起温 育24小时，以完成如前面实施例所述的充分摄入。然后将溶胞产物直 接用于HPLC分析寡聚体降解。使用Microsorb Rainin柱(5uM)(4.6 mm×150mm)。之前通过测定已知浓度的溶液(100μl样品，100μl注射 器环路)的HPLC峰面积来完成标准化。使用在2％CH3CN/H2O中的 50mM Na2PO4(pH5.8)，以1.0ml/min的流速处理在每份溶胞产物溶 液中的含5FdUMP的样品。使用在50mM Na2PO4(pH5.8)中的CH3CN 线性梯度(2％-50％CH3CN，在20分钟内)洗脱寡聚体产物。Hep G2 溶胞产物中没有观察到寡核苷酸片段。
所述缀合物的代谢是这种方法的治疗效力的一个关键步骤。以前 已确定该新糖肽配体在进入细胞后快速降解(Hangeland等人， Antisense Res.Nucl.Acid Drug Develop.7：141-149(1997))。而且，磷 酸二酯-连接的氟脱氧尿苷链也应该被快速水解，释放5FdUMP残基。 此时注意到寡核苷酸磷酸二酯是不稳定的活系统且快速降解(Sands等 人，Mol.Pharmacol.47：636-646(1995))是重要的。但是，这种降解是 有利的，因为5FdUMP是实际上的TS抑制剂，而不是5FU，从而避 免对胸苷磷酸化酶(Zimmerman等人，J Biol.Chem.239： 2618-2621(1964))和胸苷激酶(Umeda等人，Cancer Res.28： 2539-2538(1968))的需求。有关5FdUMP的进一步降解，肝和肾代表 对5-氟尿嘧啶的主要部位。这些降解产物已在以前作过研究(Diasio等 人，Clin.Pharmacokin.16：215-237(1989))。使用多种分析方法，如纸 色谱分析法和HPLC技术(Sommadossi等人，J.Biol.Chem.257： 8171-8176(1982)；Sommadossi等人，Cancer Res.45：116-121(1985)) 完成这种类型的测定。
此外，为了提高5FdUMP结合的效力，可以施用叶酸辅因子。为 了在细胞内水平实现此目的，施用配体衍生的甲酰四氢叶酸缀合物。 图13显示含有多个甲酰四氢叶酸的A-L-PP缀合物的结构。这些残基 会在连接它们与磷酸二酯，非核苷骨架的酰胺键被切割时释放。通过 缀合物的降解而在细胞内产生SFdUMP和LV应该对TS抑制有利而 对细胞功能有害。
总之，可以通过多种方法完成对降解产物的分析。最常用的是 HPLC分析，使用所述的含有多孔聚合物填充物的离子对反相柱 (Leyva等人，(1984)，Cancer Res.44：5928-5933；El-Sayed等人，(1983)， Pharmacokinetics of Anticancer Agents in Humans，Amsterdam， Elsevier，pp.209-227)。如果可能的话，使用商购或容易合成的可靠标 准品进行比较。
实施例23
此实施例例示含有硫代磷酸酯连接的5FU的寡聚体和硫代酯连接 的F50对细胞增殖的作用和对肝源细胞作用的特异性。
材料：从GIBCO BRL购买补充L-谷氨酰胺、D-PBS和胰蛋白酶 (0.25％；在含1.0mM EDTA的HBSS中制备)的RPMI。Hep G2、TSU 和Caki-1细胞购自ATCC。48-孔平板购自Costar Corp.(Cambridge， MA)。使用Coulter细胞计数器(Coulter Corporation，Hialeah，FL)对 细胞计数。
方法：以5×104细胞/孔的密度将Hep G2、TSU或Caki-1细胞接 种到48孔平板内补充10％透析FCS的RPMI中。然后使细胞在37 ℃、95％RH、5％CO2下培养24小时。在此培养期后，吸出维持培 养基，并用在补充10％透析FCS的200μM RPMI中的1μM新糖缀合 物或寡聚体处理细胞。单独用200μl RPMI+10％DFCS处理对照孔。 在0、24、48和72小时，用0.5ml DPBS将每种条件的六个孔洗两次， 并用0.5ml胰蛋白酶(0.25％；在含1.0mM EDTA的HBSS中制备)处 理。使用Coulter电子细胞计数器测定每种条件的细胞数。
用1μM实施例5中所述的新糖缀合物或寡聚体处理Hep G2、TSU 或Caki-1细胞。对每种处理和未处理的对照在24、48和72小时时测 定六个重复孔的平均细胞数。与未处理的对照相比，用非缀合的寡聚 体处理Hep G2细胞导致增殖显著降低30-40％。在细胞实验期间观察 到最低增殖，在处理72小时内仅实现0.5群体倍增。与之相比，未处 理的对照在相同的期间表现出2.5pd。与未处理的对照相比，用新糖缀 合物处理Hep G2细胞导致细胞数减少55-60％。此外，细胞数在用新 糖缀合物处理后实际上减少，并在实验期间没有恢复至最初的对照水 平，这表明该新糖缀合物在以此浓度使用时具有可能的细胞毒性作用。
还测定了所述处理对肝源细胞的特异性。以与Hep G2细胞类似 的方式，用1μM浓度的新糖缀合物或寡聚体处理TSU或Caki-1细胞。 在这种情况下，用非缀合的寡聚体处理导致细胞数与未处理的对照相 比减少30-50％。用肝特异性新糖缀合物处理这些细胞产生与用非缀 合的寡聚体处理细胞几乎相同的结果，没有导致细胞数进一步减少。 这些数据证明新糖缀合物在肝源细胞内的特异性和增大的生物效力。
实施例24
此实施例描述可以用于测试po 1-mer和ps 1-mer在抑制细胞周期 进展、病毒聚合酶活性和病毒致细胞病变作用方面的效力的试验。
细胞周期分布试验
将细胞接种于100mm培养皿，培养48小时并使其与多种浓度的 po 1-mer或ps 1-mer在37℃下(5％CO2)接触24小时或与一固定的浓 度接触多个时间段(0-48小时)。然后，将细胞与10μM BrdUrd在37 C(5％CO2)一起培养30分钟。在预冷却的(-20℃)乙醇(80％)中固定含 有死细胞的上清液和收集的活细胞，并在-20℃下保存多至3天。如前 述完成BrdUrd/碘化丙锭染色(例如，参见Horber等人，Br J Cancer， 72：1067-1073(1995))。简言之，在离心后，在20℃下用2M HCl将细 胞处理30分钟，将其重悬在50μl PBS、0.5％Tween-20和1％BSA 中，并与FITC标记的抗BrdURd抗体一起在20℃温育30分钟；然 后加入1ml PBS/碘化丙锭(10mg/ml)。用Epics Elite分析仪(Coulter， FL，USA)分析染色的细胞。使用单一荧光样品(FITC或碘化丙锭)以最 优化仪器设置，并确保适当的电子补偿。更详细参见Cattaneo等人，J. Cancer Res.Clin.Oncol.126：247-256(2000)。
致细胞病变作用抑制试验
简言之，用po 1-mer或ps 1-mer处理细胞，并用病毒感染细胞。 6天后，使用血细胞计数器与台盼蓝染料排阻法相结合计数活细胞。
对纯化的HIV-1 RT的抑制作用
20μl测定混合物包含50mM Tris(pH8.3)；10mM MgCl2；50mM KC1；5mM二硫苏糖醇；1.0μM预退火的引物模板，5′32P-标记的 dGpApTpTpCpApGpCpTpApGpTpCpCpA)引物和 d(CpApApApCpTpGpTpGpApTpApCpGpApTpGpGpApCpTpApGp CpTpGpApApTp C)模板；250μM每种dNTP；和可变浓度的po 1-mer 或ps 1-mer。通过加入10nM的HIV-1RT引发反应，并在37℃下持 续15分钟。在这些条件下，酶对于两种底物都是饱和的。通过变性聚 丙烯酰胺凝胶电泳对反应混合物进行分级分离。
对其它病毒DNA聚合酶的抑制作用
实验分析与关于HIV-1RT所述基本上相同(Marshall等人，Proc. Natl.Acad.Sci.89：6265-6269(1992))。纯化的小牛胸腺α聚合酶(Pol a) 可以得自R.Kuchta(科罗拉多大学)，禽成髓细胞瘤病毒(AMV)RT可 以得自Life Sciences(St.Petersburg，FL)，且大肠杆菌DNA聚合酶(Pol I)的克列诺片段可以得自U.S.Biochemical。所有情况下酶浓度相同 (10nM)。加入提供类似于对HIV-1RT观察到的聚合反应所需浓度的 引物模板。对AMV RT为0.05μM，对Pol I克列诺片段为5.0μM， 对Polα为2.0μM。
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