本发明的技术领域

本发明属于生物防治技术领域。本发明涉及一种对鞘翅目害虫具有活性的苏云金芽孢杆 菌菌株，涉及对鞘翅目害虫高毒力的cry8E和cry8F基因的核苷酸序列和分别由其编码的蛋 白质的氨基酸序列，涉及协同组合使用cry8E与cry8F基因表达产物。

本发明的背景技术

金龟子属于鞘翅目金龟总科(Scarabaeidae)，其幼虫(俗称蛴螬，本发明以下也简称为 “蛴螬”)是一类重要的世界性分布地下害虫，可危害粮食、棉花、油料作物、蔬菜、糖料 作物、烟草、牧草、花卉、草坪草、果树等多种植物。大量调查表明，蛴螬在地下害虫中 的危害居首位，其中主要以鳃金龟科和丽金龟科幼虫为主，占总地下害虫量的70-80％以上。 据统计每年全国蛴螬发生面积约1亿亩，严重年份曾达3亿2千万亩，产量损失高达20％ 以上，有些地块甚至绝产。近年发生面积最大、发生量最多的为黄淮海地区，主要危害粮 食、油料等作物；其它地区的危害情况也很严重，如危害甘蔗的蛴螬，在广东、广西、云 南、四川、福建等地普遍发生；在西藏、青海、甘肃、新疆等西部地区，蛴螬的发生也很 严重(魏鸿钧等，《中国地下害虫》，上海：上海科学技术出版社，1989，1-41；王永祥等， “冀中平原区蛴螬种类及综合防治技术”，《河北师范大学学报》(自然科学版)，1998， 22(2)：268-270)。以在我国油料作物中种植面积仅次于油菜居第二位的花生为例。我国的花 生产量占世界花生总产量的35％左右，居世界首位，年出口收入达207亿美元，2001年全 国花生面积(500万公顷)和总产(1450万吨)均达到历史最高水平。但蛴螬对花生的危 害十分严重。为控制蛴螬的危害，一般采用农业、化学、物理等综合防治策略，这虽有一 定成效，却难以达到持续控制的效果。因此，寻找新的有效防治方法，已成为当务之急。

在获得对蛴螬高毒力Bt基因的基础上，培育杀蛴螬的转基因植物是一条值得探索的新 的防治途径。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细 菌。它在形成芽孢的同时，能产生蛋白性质的伴孢晶体(parasporal crystal)，对鳞翅目 (Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目 (Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多种昆虫，以及线虫、螨类 和原生动物具有特异性的杀虫活性(Schnepf，E.N.et al，Microbiol.And Molecular Biology Review，1998，62：3 775-806)。这种杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)又称δ- 内毒素(delta-endotoxin)，对人畜无害，不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中得到了 最广泛的应用。

目前人们已经克隆了300多种编码杀虫晶体蛋白的Bt杀虫基因，它们分属141种模式 基因。近年国际上cry8类基因的研究动向引人瞩目。研究表明，这类基因对金龟子科、象 甲科、叶甲科等多种鞘翅目害虫具有杀虫作用。1992年，Ohba等在世界上首次从Bt菌株 中筛选出对金龟子幼虫具有特异杀虫活性的新菌株(B.t.subsp.Japonensis BuiBui)(Ohba，M. et al.，A unique isolate of Bacillus thuringiensis serovar japonensis with a high larvicidal activity specific for scarabaeid beetles，Letters in Applied Microbiology，1992.14：54-57)，1994年Sato等 从中克隆出一种新的杀虫基因cry8C(Sato，R.et al，Cloning，heterologous expression，and localization of a novel crystal protein gene from Bacillus thuringiensis serovar japonensis strain buibui toxic to scarabaeid insects，Curr.Microbiol.1994.28：15-19.4)。目前已发现9种基因，编 码的蛋白由1160-1210个氨基酸组成，分子量在128-137kDa之间。详细的信息见表1(Asano， S.，Yamanaka，S.and Takeuchi，K.，Protein having insecticidal activity，DNA encoding the protein， and controlling agent and controlling method of noxious organisms，2002，JP 2002045186-A and JP2002045186-A/2))。其中美国Mycogen公司分离的Cry8Aa1和Cry8Ba1对金龟科的多种 害虫具有明显的杀虫活性(Tracy E.Michaels，et al.，Bacillus thuringiensis toxins active against scarab pests，1994，USP5554534)。美国从Bt菌株中分离了两种基因cry8Bb1和cry8Bc1基因， 发现对西方玉米根叶甲(Western corn rootworm)具有显著的杀虫效果并已用于转基因抗虫 玉米的开发(Abad，Andre，R.，Duck Nicholas，B.，Feng，Xiang，Flannagan Ronald，D.，Kahn， Theodore，W.，Sims，Lynne，E.Genes encoding novel proteins with pesticidal activity against coleopterans，2002，WO 02/34774A2)。在我国，河北省农业科学院植物保护研究所和河北农 业大学近年来先后筛选获得多株对黄褐丽金龟(Anomala exoleta)和铜绿丽金龟(A.corpulenta) 幼虫具有特异杀虫活性的Bt菌株，室内生测死亡率均达100％(冯书亮等，“一株对金龟子 类幼虫具有杀虫活性的苏云金杆菌新分离株”，《中国生物防治》，2000，16(2)：74-78)。

                    表1  苏云金芽孢杆菌Cry8类杀虫晶体蛋白 名称   编号 分子量 氨基酸   数   Bt菌株     活性   文献出处 CrygAa1 U04364  131.00  1157 kumamotoensis  scarabs     Tracy，et al，     1994 Cry8Ba1 U04365  133.54  1169 kumamotoensis  scarab     Tracy，et al，     1994 Cry8Bb1 AX543924  136.53  1206 Bt  Leptinotarsa  decemlineata，  Diabrotica virgifera  virgifera，  Deiabrotica  undecimpunctata  howardi     Abad，et al，     2002 Cry8Bc1 AX543926  137.20  1210 Bt     Abad，et al，     2002 Cry8Ca1 U04366  130.42  1160 japonensis Buibui  Anomala cuprea     Sato，et al.     1994 Cry8Da1 AB089299  128.05  1144 Bt galleriae  Anomala cuprea     unpublished Cry8Da2 BD133574  130.51  1167 Bt  scarabs     Asano，et al，     2002 Cry8Da3 BD133575  130.51  1167 Bt  scarabs     Asano，et al，     2002

本发明的内容

本发明的目的：

本发明的目的是提供对暗黑鳃金龟、椰心叶甲等鞘翅目重要害虫具有高毒力的一种苏云 金芽孢杆菌菌株和两种新的cry8E和cry8F模式基因序列，以及一种对暗黑鳃金龟具有明显 增效作用的cry8E和cry8F基因组合，以应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫 的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。

本发明的技术方案；

1.对鳃金龟地下害虫有效的Bt菌株185的筛选与鉴定

本发明自行分离了Bt菌株185。土壤采自河北省保定市顺平县苹果园。取0.1-0.2g土 样放入装有10ml灭菌水和玻璃珠的试管中，在旋涡振荡器上振荡3分钟，将土粒打碎，然 后放于200rpm摇床上振荡10分钟，75℃水浴锅中水浴17分钟，充分将非芽孢菌杀死，待 稍静置后，选取10-2、10-3、10-4三个稀释度，分别吸取100ul菌悬液于BP平板上，涂布 均匀，于37℃培养三天，挑取似Bt菌落涂片镜检。发现一株含有球形晶体的Bt菌株(见 附图1)。

该菌株的培养条件为30℃，普通LB培养基，pH7.0。该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)、 苏云金芽孢杆菌种，并已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日 期为2004年11月5日，保藏编号为CGMCC NO.1242。经鉴定，关于该菌株的信息包括： 能形成芽孢，同时能形成球形伴孢晶体，SDS-PAGE电泳表明其杀虫晶体蛋白约为130kDa (见附图2)；其晶体蛋白在14小时开始表达，而生长曲线表明其14小时已进入停滞期(见 附图3)，表明该晶体蛋白启动子可能为依赖芽孢形成的；生物学测定表明，该菌株对金龟 科地下害虫暗黑鳃金龟具有明显杀虫作用，7天校正死亡率达90％，对椰心叶甲也具有一 定的杀虫活性(见表2)。

              表2 Bt菌株185的杀虫活性   7天校正死亡率％   14天校正死亡率％ 暗黑鳃金龟 90  100 椰心叶甲 22  35

2.菌株185中cry基因鉴定

根据cry8类基因保守区设计了一对通用引物：

S5un8：5-’CGGCAAACTTAGTAGAATGC-3’

S3un8：5-’CTGACTGATTTCCACCATCACG-3。

表3是这些基因与引物的同源序列，表4是用这对引物预测的cry8基因扩增产物，以 及酶切片段大小，通过这种PCR-RFLP方法可以分别鉴定出将这些基因。

     表3  引物与cry8各基因的保守区配对情况及配对区在基因上的位置

                 引物S5un8/S3un8与基因的保守区配对情况

        引物S5un8：                     引物S3un8：

基因型

        5′-cggcaaacttagtagaat     位置     5′-gcactaccacctttagtcagt      位置

        gc-3′                              c-3

cry8Aa  cggcaaacttagtGgaatgc    2101～2120  cgtgatggtggaaatcaAtcag     3273～3294

cry8Ba  cggcCaacttagtGgaatgc    2089～2108  cgtgatggtggaaatcaAtcag     3261～3282

cry8Bb  cggcaaacttagtGgaatgc    2104～2123  cgtgatggtggaaacaAAcag      3276～3297

cry8Bc  cggcaaacttagtGgaatgc    2116～2135  cgtgatggtggaaatcaAAcag     3288～3309

cry8Ca  cggcaaacttaAtagaatgc    2092～2111  cgtgatggtgcaaatcagAcag     3282～3303

cry8Da  TAAAaaacttagtagaatgc    2044～2063  cgtgatggtgCGaatcagTcag     3234～3255

注：“N”为不配对碱基。

           表4 cry8的PCR扩增产物和限制性酶切长度多态性

                        PCR(S5un8/S3un8)

基因型    产物大小            EcoO109I和DraI酶切结果

          Size(bp)      Digested with EcoO109I and DraI(bp)

cry8Aa    1194                       197，442，555

cry8Ba    1194                       639，555，

cry8Bb    1194                       639，555

cry8Bc    1194                       639，555

cry8Ca    1212                  197，92，310，613

cry8Da    1212                  197，92，310，613

用下列PCR反应体系(50μL)鉴定了Bt菌株185： 10×PCR buffer  5μL MgCl2(20mM) 6μL dNTP(10mM) 1μL 引物对(10mM) 1μL/个 模板 1uL Taq聚合酶(5U/μL) 0.5μL

超纯水补至50μL，混匀离心，加石蜡油30μL。

扩增循环：94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，25个循环，最后 72℃延伸10分钟。

结果(见附图4)显示与已知cry8类基因的图谱不同，表明菌株185中可能含有新的 cry8杀虫基因。

3.菌株185中cry8E基因的克隆

用PstI和KpnI酶切Bt菌株总DNA，用载体pBluescript SK(+)分别建立了两个DNA 片段库，然后用引物S5un8/S3un8(见表3)和PCR方法检测两个DNA库，得到两个阳性克隆 pSS3612和pSS162，分别插入11kb的pstI片段和2.0kb的KpnI片段(见附图5)。酶切分 析pSS3612，7kb的PstI和KpnI双酶切片段含有cry8Ea1的全长基因，用pBluescript SK(+) 亚克隆该片段，得到pSS3612-7，同时亚克隆了4kb的KpnI片段中，得到pSS3612-4(见 附图6)。将pSS162和pSS3612-7的插入序列测序。得到序列SEQ ID NO 1。

4.cry8Ea1基因的序列分析

序列SEQ ID NO 1为pSS3612中PstI和KpnI双酶切片段，序列全长7276bps，分析表 明其含有两个较大的开放阅读框，ORF1的位置是3658-7152，ORF2的位置是2799-3377。

ORF1的位置是3658-7152，GC含量为38.03％，编码1164个氨基酸组成的蛋白。经测 定，其氨基酸序列为SEQ IDNO 2所示。同源分析表明该蛋白与Cry8类蛋白具有较高同源 性，表5为其同源性数据。由于与已知的Cry8类蛋白氨基酸同源性均低于78％，最高只有 58.2％(Cry8Bb1)，被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry8Ea1。

                                       表5 Cry8蛋白同源比较数据

 Cry8a1 Cry8Ba1  Cry8Bb1  Cry8Bc1  Cry8Da1  Cry8Ca1  Cry8Ea1  Cry8Fa1 Cry8Aa1  100％ Cry8Ba1  46.10％ 100％ Cry8Bb1  47.20％ 82.10％ 100％ Cry8Bc1  46.10％ 83.50％ 90.50％ 100％ Cry8Da1  51.30％ 26.20％ 25.60％ 25.50％ 100％ Cry8Ca1  36.70％ 21.20％ 21.30％ 21.00％ 63.10％ 100％ Cry8Ea1  26.60％ 55.60％ 57.00％ 58.20％ 26.10％ 21.00％ 100％ Cry8Fa1  24.40％ 42.50％ 42.40％ 42.10％ 24.60％ 20.60％ 64.80％ 100％

本发明进一步分析了Cry8Ea1蛋白的氨基酸组成(见表6，附图7)，得知其分子量为 131.56kDa，等电点为pH4.735(见附图8)。

                 表6 Cry8Ea1蛋白的氨基酸组成

氨基酸 数目 百分比％ 氨基酸 数目 百分比％  Ala(A)： 63  5.41  Asn(N)： 80  6.87  Asx(B)： 0  0  Pro(P)： 52  4.46  Cys(C)： 4  .34  Gln(Q)： 61  5.24  Asp(D)： 63  5.41  Arg(R)： 62  5.32  Glu(E)： 80  6.87  Ser(S)： 93  7.98  Phe(F)： 43  3.69  Thr(T)： 87  7.47  Gly(G)： 80  6.87  Val(V)： 81  6.95  His(H)： 9  .77  Trp(W)： 17  1.46  Ile(I)： 62  5.32  Unk(X)： 0  0  Lys(K)： 46  3.95  Tyr(Y)： 69  5.92  Leu(L)： 93  7.98  Glx(Z)： 0  0  Met(M)： 19  1.63  Total ：  1164

5.cry8Fa1基因的克隆

对pSS162质粒中插入序列进行了分析，片段长2.3kb，具有完整的3’端序列，与 cry8Ea1序列完全同源，但5’端差异较大，并且缺少完整的读码框，根据该序列的特异区 段设计了1对引物(5-185-KpnI：TTGGTATGGCGTTTCGTTG；和3-185-Kpnl： TATTGCAGGTCCAGGATTCAC)，用于克隆该全长基因，将菌株185的质粒DNA用XbaI酶切，与 载体pBluescript SK(+)连接，筛选得到插入约9Kb外源片段的阳性克隆pSS266(见附图9)， 进一步酶切分析表明ClaI酶切产生的3.0kb片段含有5’端读码框(见附图10)，用 pBluescript SK(+)亚克隆得到该片段，阳性克隆命名为pSS266-3，对该片段进行了测序， 把得到的序列与pSS162中的插入序列进行拼接得到3.9kb片段。

6.cry8F基因的序列分析

对上述3.9kb的核酸片段进行测序，得到的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。对该序 列进行分析表明：该序列含有1个较大的开放阅读框357-3878；GC含量为36.88％；编码 1174个氨基酸组成的蛋白(其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示)。进一步 的同源分析表明，该蛋白质与Cry8类蛋白有较高的同源性(同源性数据见以上表5)。由于 与已知的Cry8类蛋白氨基酸同源性均低于78％，最高只有64.8％(Cry8Ea1)，该蛋白被Bt 杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry8Fa1。

本发明用生物分析软件Bioedit进一步分析了Cry8Fa1蛋白的氨基酸组成，结果见表7 和附图11。结果表明，该蛋白的分子量为133.08kDa，等电点为pH4.565(见附图12)。

                表7 Cry8Ea1蛋白的氨基酸组成

氨基酸 数目 百分比％ 氨基酸 数目 百分比％  Ala(A)： 68  5.79  Asn(N)： 91  7.75  Asx(B)： 0  0  Pro(P)： 54  4.59  Cys(C)： 3  .25  Gln(Q)： 60  5.11  Asp(D)： 62  5.28  Arg(R)： 60  5.11  Glu(E)： 87  7.41  Ser(S)： 82  6.98  Phe(F)： 47  4  Thr(T)： 91  7.75  Gly(G)： 68  5.79  Val(V)： 79  6.72  His(H)： 12  1.02  Trp(W)： 15  1.27  Ile(I)： 72  6.13  Unk(X)： 0  0  Lys(K)： 40  3.4  Tyr(Y)： 63  5.36  Leu(L)： 102  8.68  Glx(Z)： 0  0  Met(M)： 18  1.53  Total 1174  100

7.cry8E和cry8F基因的表达

本发明根据克隆的cry8Ea1和cry8Fa1基因的全长序列，设计了用于表达两种基因的引 物，序列如下：

8E1：CGC GGATCC(BamHI)GATGAGTCCAAATAATCAAAATG

8E2：ACGC GTCGAC(SalI)CTCTACGTCAACAATCAATCAATTC

8F1：CGC GGATCC(BamHI)GATGAGTCCAAATAATCAAAATG

8F2：CATTAACTCTGCCCACGGATCT(C)TCTGGTGCAAAGAAGTCCAG

8F3：CTTGACTTCTTTGCACCAGAA(G)GATCCGTGGGCAGTTAATG

8F4：CCG CTCGAG(XhoI)CTCTACGTCAACAATCAATCAATTC

引物8E1和8E2分别引入BamHI和SalI位点，以含全长cry8Ea1的pSS3612质粒DNA 为模板，扩增得到全长基因，插入Bt表达载体pSXY422b中，转化大肠杆菌SCS110，提 取质粒，电击转化Bt无晶体突变株HD-73-中(该突变株来源于中国农业科学院植物保护研 究所生物技术实验室，可以向公众提供)，得到工程菌BioT8E。

由于cry8Fa1全长基因内存在1个BamHI切点，用重叠引物PCR的方法对这一位点进 行了突变，重叠引物8F2和8F3中引入了点突变(划线部分)、引物8F1和8F4分别引入 BamHI和XhoI。以含全长cry8Fa1基因的pSS266质粒DNA为模板，分别用8F1和8F2、 8F3和8F4扩增得到0.3kb和3.1kb产物，再分别以它们为模板，分别利用引物8F1和8F4 扩增得到3.4kb的全长基因，插入Bt表达载体pSXY422b中，转化大肠杆菌SCS110，提取 质粒，电击转化Bt无晶体突变株HD-73-中，得到工程菌BioT8F。

分别将上述两株工程菌30℃于牛肉膏培养基(蛋白胨5克，牛肉膏3克，葡萄糖10克，水 1000mL，121℃，20分钟高压蒸汽灭菌)中培养30小时，取500μL菌液至Eppendorf管中，超声 波破碎30秒钟(B.Braun U Labsonic，230V，T间隔＝0.5秒)；取100μL加入25μL新配0.5N NaOH，25 ℃作用5分钟；加入65μL 3×样品缓冲液(925μL上样缓冲液+75μL β-巯基乙醇)，100℃煮沸5 分钟。离心除去沉淀。上样10uL进行SDS-PAGE电泳分析结果(方法参见Sambrook，J.et al， Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1989)。结果(见附图13)表明，工程菌Biot8E和Biot8F中的cry8Ea1和 cry8Fa1基因均获得了表达，表达物的分子量为130kDa左右。

8.Cry8E和Cry8F蛋白的活性测定

将Bt工程菌株接种在普通细菌琼脂克氏瓶培养基上培养3天。将受体菌株HD-73-接种 在普通细菌琼脂克氏瓶培养基上培养4天。将培养物洗下，2倍梯度浓度稀释，将40ml菌 悬液加入到200g有均匀粗细土豆丝的细土(紫外线灭菌)中，混匀，使土壤含水量保持在 18％-20％。接入暗黑鳃金龟15天龄幼虫20头，以加入清水的处理为空白对照，28℃感染饲 养，14天检查死虫数，计算LC50。结果见表8，表明工程菌株对暗黑鳃金龟具有极高的毒杀 活性。其表达的Cry8E和Cry8F蛋白均具有杀暗黑鳃金龟幼虫的活性。

表8 Bt工程菌和185菌株对暗黑鳃金龟幼虫的毒力测定

  菌株 LC50(108cfu/ml)     回归方程   R值   Biot8E     0.5250  Y＝5.3841+1.3724X   0.9671   Biot8F     0.9464  Y＝5.0276+1.1515X   0.9918

菌种保藏信息：

菌种名称：芽孢杆菌属、苏云金芽孢杆菌，Bacillus thuringiensis

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏日期：2004年11月5日

保藏编号：CGMCC NO.1242

附图说明：

图1：185菌株芽孢和晶体形态。

图2：185菌株晶体蛋白SDS-PAGE分析。

图3：185菌株生长曲线。

图4：菌株185的PCR-RFLP图谱。其中：

     M.DNA分子量标准

     1.PCR产物

     2.PCR产物酶切

图5：重组质粒pSS162和pSS3162的PCR扩增产物和酶切分析。其中：

     M.λDNA/Eco 130I

     1.pSS162 PCR产物

     2.pSS3162 PCR产物

     3.pBlueScript SK(+)/KpnI

     4.pSS162/ KpnI

     5.pSS3162/PstI

图6：pSS3612插入片段的亚克隆酶切分析。其中：

     M.λDNA/Eco 130I

     1.pBlueScript SK(+)/KpnI

     2.pSS3162/PstI+KpnI

     3.pSS3612/KpnI

     4.pSS3162 /PstI+KpnI

图7：Cry8Ea1蛋白的氨基酸组成图。

图8：Cry8Ea1蛋白的滴定曲线。

图9：重组质粒pSS266的PCR扩增产物和酶切分析。其中：

     M.λDNA/Eco 130I

     1.pSS266 PCR产物

     2.pSS162/XbaI

     3.pBlueScript SK(+)/XbaI

图10：重组质粒pSS266的酶切分析。其中：

      1.XbaI

      2.NotI

      3.PstI

      4.NdeI

      5.ClaI

      6.SacI

      7.KpnI

      M.λDNA/Eco130I

图11：Cry8Fa1蛋白的氨基酸组成图。

图12：Cry8Fa1蛋白的滴定曲线。

图13：cry8Ea1和cry8Fa1基因在Bt无晶体突变株中的表达。其中：

      M.蛋白质分子量标准

      1.Biot8E

      2.Biot8F

      3.Bt 185

      4.HD-73-

具体实施方案

以下叙述根据本发明实施方案的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只 有说明作用，而没有限制作用。

实施例1、对鳃金龟地下害虫有效的Bt菌株185的筛选与鉴定

土壤采自河北省保定市顺平县苹果园。取0.1-0.2g土样放入装有10ml灭菌水和玻璃 珠的试管中，在旋涡振荡器上振荡3分钟，将土粒打碎，然后放于200rpm摇床上振荡10 分钟，75℃水浴锅中水浴17分钟，充分将非芽孢菌杀死，待稍静置后，选取10-2、10-3、10-4 三个稀释度，分别吸取100ul菌悬液于BP平板上，涂布均匀，于37℃培养三天，挑取似 Bt菌落涂片镜检。发现一株含有球形晶体的Bt菌株(见附图1)。

该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)、苏云金芽孢杆菌种。将该菌株在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心提交保藏，保藏日期为2004年11月5日，保藏编号为CGMCC NO.1242。经鉴定，关于该菌株的信息包括：能形成芽孢，同时能形成球形伴孢晶体， SDS-PAGE电泳表明其杀虫晶体蛋白约为130kDa(见附图2)，其晶体蛋白在14小时开始 表达，而生长曲线表明其14小时已进入停滞期(见附图3)，表明该晶体蛋白启动子可能为 依赖芽孢形成的；生物学测定表明，该菌株对金龟科地下害虫暗黑鳃金龟具有明显杀虫作 用，7天校正死亡率达90％，对椰心叶甲也具有一定的杀虫活性。

实施例2、菌株185中cry基因鉴定

根据cry8类基因保守区设计了一对通用引物

S5un8：5-’CGGCAAACTTAGTAGAATGC-3’

S3un8：5-’CTGACTGATTTCCACCATCACG-3。

用下列PCR反应体系(50μL)鉴定了Bt菌株185：

10×PCR buffer  5μL MgCl2(20mM) 6μL dNTP(10mM) 1μL 引物对(10mM) 1μL/个 模板 1uL Taq聚合酶(5U/μL) 0.5μL

超纯水补至50μL，混匀离心，加石蜡油30μL。

扩增循环：94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，25个循环，最后 72℃延伸10分钟。

结果(见附图4)显示与已知cry8类基因的图谱不同，表明菌株185中可能含有新的 cry8杀虫基因。

实施例3、菌株185中cry8E基因的克隆

用PstI和KpnI酶切Bt菌株总DNA，用载体pBluescript SK(+)分别建立了两个DNA 片段库，然后用引物S5un8/S3un8和PCR方法检测两个DNA库，得到两个阳性克隆pSS3612 和pSS162，分别插入11kb的pstI片段和2.0kb的KpnI片段(见附图5)。酶切分析pSS3612， 7kb的PstI和KpnI双酶切片段含有cry8Ea1的全长基因，用pBluescript SK(+)亚克隆该 片段，得到pSS3612-7，同时亚克隆了4kb的KpnI片段中，得到pSS3612-4(如附图6)。 将pSS162和pSS3612-7的插入序列测序，得到序列SEQ ID NO 1。该序列为pSS3612中PstI 和KpnI双酶切片段，序列全长7276bps，分析表明其含有两个较大的开放阅读框，ORF1的 位置是3658-7152，ORF2的位置是2799-3377。

ORF1的位置是3658-7152，GC含量为38.03％，编码1164个氨基酸组成的蛋白，经测 定，其氨基酸序列为SEQ ID NO 2所示。同源分析表明该蛋白与Cry8类蛋白具有较高同源 性(见表5)。由于与已知的Cry8类蛋白氨基酸同源性均低于78％，最高只有58.2％(Cry8Bb1)， 被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry8Ea1。

本发明进一步分析了Cry8Ea1蛋白的氨基酸组成(见表6和附图7)，得知其分子量为 131.56kDa，等电点为pH4.735(见附图8)。

实施例4、cry8Fa1基因的克隆

对pSS162质粒中插入序列进行了分析，片段长2.3kb，具有完整的3’端序列，与 cry8Ea1序列完全同源，但5’端差异较大，并且缺少完整的读码框，根据该序列的特异区 段设计了1对引物(5-185-KpnI：TTGGTATGGCGTTTCGTTG；和3-185-Kpnl： TATTGCAGGTCCAGGATTCAC)，用于克隆该全长基因，将185质粒DNA用XbaI酶切，与载体 pBluescript SK(+)连接，筛选得到插入约9Kb外源片段的阳性克隆pSS266(见附图9)， 进一步酶切分析表明ClaI酶切产生的3.0kb片段含有5’端读码框(见附图10)，用 pBluescript SK(+)亚克隆得到该片段，阳性克隆命名为pSS266-3，对该片段进行了测序， 把得到的序列与pSS162中的插入序列进行拼接得到3.9kb片段。对核酸片段进行测序，得 到如SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。对该序列进行分析表明：该序列含有1个较大的开 放阅读框357-3878；GC含重为36.88％；编码1174个氨基酸组成的蛋白(该蛋白质的氨基 酸序列如SEQ ID NO 4所示)。进一步的同源分析表明，该蛋白质与Cry8类蛋白有较高的 同源性(见表5)。由于与已知的Cry8类蛋白氨基酸同源性均低于78％，最高只有 64.8％(Cry8Ea1)，该蛋白被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry8Fa1。

本发明用生物分析软件Bioedit进一步分析了Cry8Fa1蛋白的氨基酸组成(见表7和 附图11)。结果表明，该蛋白质的分子量为133.08kDa，等电点为pH4.565(见附图12)。

实施例5、cry8E和cry8F基因的表达

根据克隆的cry8Ea1和cry8Fa1基因的全长序列，设计了用于表达两种基因的引物，序 列如下：

8E1：CGC GGATCC(Bam HI)GATGAGTCCAAATAATCAAAATG

8E2：ACGC GTCGAC(Sal I)CTCTACGTCAACAATCAATCAATTC

8F1：CGC GGATCC(Bam HI)GATGAGTCCAAATAATCAAAATG

8F2：CATTAACTCTGCCCACGGATC T(C)TCTGGTGCAAAGAAGTCCAG

8F3：CTTGACTTCTTTGCACCAGA A(G)GATCCGTGGGCAGTTAATG

8F4：CCG CTCGAG(Xho I)CTCTACGTCAACAATCAATCAATTC

引物8E1和8E2分别引入BamHI和SalI位点，以含全长cry8Ea1的pSS3612质粒DNA 为模板，扩增得到全长基因，插入Bt表达载体pSXY422b中，转化大肠杆菌SCS110，提 取质粒，电击转化Bt无晶体突变株HD-73-中，得到工程菌BioT8E。

由于cry8Fa1全长基因内存在1个BamHI切点，用重叠引物PCR的方法对这一位点进 行了突变，重叠引物8F2和8F3中引入了点突变(划线部分)、引物8F1和8F4分别引入 BamHI和XhoI。以含全长cry8Fa1基因的pSS266质粒DNA为模板，分别用8F1和8F2、 8F3和8F4扩增得到0.3kb和3.1kb产物，再分别以它们为模板，分别利用引物8F1和8F4 扩增得到3.4kb的全长基因，插入Bt表达载体pSXY422b中，转化大肠杆菌SCS110，提取 质粒，电击转化Bt无晶体突变株HD-73-中，得到工程菌BioT8F。

分别将上述两株工程菌30℃于牛肉膏培养基中培养30小时，取500μL菌液至Eppendorf管 中，超声波破碎30秒钟(B.Braun U Labsonic，230V，T间隔＝0.5秒)；取100μL加入25μL新配0.5N NaOH，25℃作用5分钟；加入65μL 3×样品缓冲液(925μL上样缓冲液+75μL β-巯基乙醇)，100 ℃煮沸5分钟。离心除去沉淀。上样10uL进行SDS-PAGE电泳分析结果。结果(见附图13)表 明，工程菌Biot8E和Biot8F中的cry8Ea1和cry8Fa1基因均获得了表达，表达物的分子量为 130kDa左右。

实施例6、Cry8E和Cry8F蛋白的活性测定

将Bt工程菌株接种在普通细菌琼脂克氏瓶培养基上培养3天。将受体菌株HD-73-接种 在普通细菌琼脂克氏瓶培养基上培养4天。将培养物洗下，2倍梯度浓度稀释，将40ml菌 悬液加入到200g有均匀粗细土豆丝的细土(紫外线灭菌)中，混匀，使土壤含水量保持在 18％-20％。接入暗黑鳃金龟15天龄幼虫20头，以加入清水的处理为空白对照，28℃感染饲 养，14天检查死虫数，计算LC50。结果(见表8)表明工程菌株对暗黑鳃金龟具有极高的毒 杀活性。其表达的Cry8E和Cry8F蛋白均具有杀暗黑鳃金龟幼虫的活性。

附：本发明所涉及的DNA序列和蛋白质序列

SEQ ID NO 1(cry8Ea1基因的核苷酸序列)：

ctgcagaata gacacggata cgatcgcctt cacataaatg ctgaaatctt cttctagaca    60

PstI

ttcttgtgtc acctcatttt ttgtttttaa actacagtat gttatatgca aaagaagggg    120

tagaggattg ggccttttac tacaaaaata caaaaacata cttatgattg catatggaga    180

tgtcaaagtg catgcattaa aaatggatta gaaatgattt caaataggca aaagcctatt    240

ccaatgaaga aagattgaca taggctattg tatatagaag aaggtaacga ggaacatact    300

gttagggtac acctaacata gaagtatgct tgtttgaagc atgtacatct tgaaatacca    360

gtagaaatat gggggaacat gttattttaa taattggtaa aatcttttgt tagaaggtga    420

aggcgtatga gacaacaaag agtatgtgag tgtaacaatt gtaggaaaaa gggtgagaag    480

aatcatcttt gtcaatatat aaaacgtggg gattgtatat gggtcagttc ctttggaagc    540

aagttacaaa agagtggtat tttcctgtta ataaaagatt cttttttatt atggtttgat    600

gaaaaacatc aattaaatca aaccagtcta caggggatcc atattgaaaa aagacaataa    660

atgaagaagg agtctcattg ttaacgaagt gtgtacatct atcatgtaca catcgtaagt    720

cgtatgttct acctgtatct ggtaggaaag aattgtcgca tgtgcaaggc gtatatacac    780

aaacatgttt tgttatattt ttgaataatt tgaaaataaa tatgttataa ttaatatact    840

ttcgtgtgtt ttttttgcga aatccctaga aagtatcgta aaaagtccct aacaattttg    900

tgaactgaac ccaaaaaatt agacaaatat attaagcagc tactaaggat tgaactctgt    960

attgcacggg ggacaatcct tttagttttg ttttaattct tttgtgattg tagtaatgaa    1020

tataagtttc tagttcttgc ttaaattgtt ccatactttc aaactcttta agataaagta    1080

attcagactt taataagcca aagaaatttt ccatgactgc attatctaag caatttccct    1140

tacgggacat actttggata acgttatgtt ttttaagcga ctgatgatat tgtcgcattt    1200

gataatgcca accttgatcc gagtgtaaaa taggagtttc cttatcattc aaacattgaa    1260

acgccttatt taacatttta gaaacaaggg aataggcagg tctatgttct atattgtaag    1320

ctataatttc tccgttatat aagtcttaaa tgggtgatag atatagtttt ttaccatgta    1380

agtggaactc cgtcacatct gttacccatt tctcgtttgg ttttgatgcg tgaaaattac    1440

gttttaaaat attaggagcg aatttcccga cagtcccttt atatgaacga tattttttta    1500

atcgaacaag acattttaat cccaggatat tcattaaacg tcgaacggtt ttatgattta    1560

atgcatggcc tcgattacgt aattccaatg taatacgacg ataaccatac ctcccaaaat    1620

tctcactaaa aatctcttta attaattctt taactttctt atatttatct ggacgtttcg    1680

cttgtttcat ccagtaataa tacgtactac gagcgatatt agcgactttc acaaggtcaa    1740

cgaccttata tttatgcctt aattcataaa tcaattgcgc tttgtcttgg tctgtgatgt    1800

tttcttcttt tgaactaagg cattcaactt ttttaaatag tcattttcca tacgcagacg    1860

ttcattctct gcttgtagcg cttctataga accttcaaga aatacttcgt tttgttttaa    1920

atgttgtagc ttagcttttt ctttggccat ggttagacgc ccctttttct ttgattttag    1980

ggcatctaat ccttctgttt cataagctac tttccatttt cggagtgttt cgcaagaagg    2040

aatattaaaa aaagcagctg tttctctcag agatgtccca ttttcattca tataatgaat    2100

tacatctagt ttatactcga gagggtaagt tgtatagcgt ttttcaaacg ccttttcccc    2160

tgaaaattca aaccgtttaa tccattgata aagttctcta ggatgaaccc ctatagaatt    2220

agcaatggtt tttccgcctt ccgtaccttc tagatatcgt tttactgctt gtattttatc    2280

ttttgaagaa aatttagcca taaaaaatgc acctccaatt gttaattatg tgtctaacaa                        2340

ttggggtgca cttcattgtt ggggactttt gtatgttcct ttttagacat tcttttaagt                        2400

tctttatata gaaagactga agaaagcaga ataagaagtc catcccctga ttcatgagaa                        2460

ccgaaaaatt catgatgcac tggatgccaa atatttagat acatttccta ttgatattct                        2520

acgagattga attgatgtaa tgttgttccc ttttggtcaa actgaccaat ggcgatagct                        2580

ctccttgcat gagtacttct caaacttcca ttacacattg tattccccat cttttttatg                        2640

tatatctttt ggggaaaatc gtaatttctg cttatgatga caagatttta ctaaaataag                        2700

aagagtggaa tattttactc tatgtcaaac aaaaaagcaa tatatgttta aacgcgaaaa                        2760

                                              ORF2→

ttcgaaaagg ctccattgat tcgataggag gtgcacagaa aaaaatggaa gaacaatatg                        2880

catcgcaaga tcagtcagat gtagaaggtt tcaagcggaa gaaaaaacat accattccct                        2940

ttcaatgtat ggtttctatt ccaacagggt ttcaaattca aaaaccgaat acaccaaaac                        3000

ttgtttatga tgtaagccat ttatctatgg taaaagagat gtgtaaacga gtgattgacg                        3060

tagaggattg tgggcaagtc gaaatcgatt tacatgtctt aaaaatcaaa ggtgtcttac                        3120

cctttattgt gaacgtttcc attgagccgc ttagtatgga acatgtgtat accacaagtg                        3180

gtagagacac atccctattt ttaagttgtc aagaaaccgt atatgtggat catattttaa                        3240

aatatagtgt cgatcatgtc ccgtattatg tgattgatgg tcatcatatt ctagtacgtg                        3300

atgtcgtgat aaagttgttg gaagaaaacc cgcaaacggc tcaaatatca ggtgtttttt                        3360

                End codon

agcatcgcca ccttttttat catacaatag ttcgttctaa gaagagccgt aatatttttc                         3480

tatctaacag gaattttatc atctacagaa gaatattctt atcatggtaa tgaggagagg                         3540

gattgaaagt caaaagatta cctgatttgt catgtaagaa aaaggaatcg atcgtacagg                         3600

                                                            RBS    ORF1→

agtccaaata atcaaaatga atatgaaatt atagatatgg caccttctac atctgtatcc                         3720

aatgattcta acagataccc ttttgcgagt gatccaacaa atgcattaca aaatatgaat                         3780

tataaagagt atttaagaat gtctgaggga tatgatagtg aatattctgg ctcacctgaa                         3840

gtgcttatta gtgagcgaga tgcggttaag acagcaatca gtttggtagg tactatatta                         3900

ggaaaattag gagttccatt ggtaggaccg attgtgagcc tatatagtac acttattgat                         3960

gttttgtggc caggtggaaa gagtcaatgg gaaattttta tggaacaagt agaagcactt                         4020

attaatcaaa aaatagcaga atacgcaagg gctaaggcac ttgcagaatt agaagggtta                         4080

ggaaataact atcaattata tttaacagca cttgaagaat ggcaggaaaa tccaagcagt                         4140

acaagagtct tacgtgatgt tcggaatcga tttgaaatcc ttgatagctt atttacacaa                         4200

tatatgcctt cttttcgggt aacaggttat gaagtaccat tactttcagt atatgcgcaa                         4260

gcagctaacc ttcatttatt gttattaaag gacgcttcta tttttggaga agaatggggg                         4320

ttctctacaa ccgctattaa taactattat aatcgtcaaa tgagtcttat cgcgcaatat                         4380

tctgatcatt gtgtacaatg gtatagaact gggttagatc gattaaaagg atcgaatgct                         4440

aaacaatggg ttgaatataa ccgcttccga agagaaatga cattatcggt gttagatatt                         4500

atgacattat ttccaatgta tgacatgcgc acgtacccaa tggaaacaaa agcacaacta                         4560

acaagggaag tatatacaga tccaattggt gccataggag cgcaaggttc ttggtatgac                         4620

tcagcacctt ctttcaatac tctggaaagt acttttataa gaggaaagca tctatttgat                         4680

tttataacta gactctctat atatacaggg cgaagctcat tcagtgctag taattactta                         4740

aaaaaatgga tagggcatca aatatcctct caacctatag gcggcagtat acaaactcaa                         4800

acctatggca ctacgagtgg cagttctgtt attgctacgc agcaaattgg ctttacaggt                         4860

tttgacgttt ataagacttt atcaacagcg ggggttctgt ttgcttatac ttcgaaatat                             4920

tatggcgtat ctaaagttgt ttttgatgcg atatatcctg acaacaagta taaaacaaca                             4980

tttacctata atcctggatc tgaaggtatt ggagcgcaag aaaaggattc agaagttgaa                             5040

ttgccaccag aaacattaga tcaacccaat tatgaggcgt atagccatag attgaattat                             5100

gttacattta ttagaaatcc agatgtacca gtattttctt ggacacatcg gagtgcggat                             5160

cgtacgaata cagtttattc agataaaatc actcaaatac cagttgtaaa ggccagtgac                             5220

ggccctaaac cttccgctaa cgaagttgga cactatcttg gtggagatcc aatatcattt                             5280

aactcttctg gtagcactgg agtgataagg ttaaatataa attcaccatt atcccaaaaa                             5340

taccgtgtga gaattcgcta ttgctcttca gttgattttg acttagatgt agttcgtgga                             5400

ggcactactg taaataatgg tagatttaac aaaagcgcgc ctaacgtcgg atggcaaagt                             5460

ttgaagtatg aaaattttaa atttgcaagc ttttctacac cttttacatt taatcaagct                             5520

caagatacat taaaaataag tgtaaggaat tttagttcaa tcgtaggagg cagcgtagtt                             5580

tatatagacc gaatcgagct catcccagta aatgcaacat atgaggcaga acaagattta                             5640

gattcggcaa agaaagcagt gaataccttg tttacgaata caaaagatgg tttacgacca                             5700

ggggtaacgg attatgaagt gaatcaagcg gcaaacttag tggaatgcct atcggatgat                             5760

ttgtatccaa atgaaaaacg cttgttattt gatgcagtga aagaggcaaa acgactcagc                             5820

gaggcacgta acttactaca agatccagat ttccaagaga taaatggaga aaatggatgg                             5880

accgcaagta caggaattga ggttgtagaa ggagatgctc tatttaaagg gcgttatcta                             5940

cgcctaccag gtgcgagaga aatggataca gaaacgtatc caacgtatct gtatcaaaaa                             6000

gtagaggaag gtgtattaaa accatacaca agatatagat tgagagggtt tgtcggaagc                             6060

agtcaaggct tggaaatttc cacaattcgt catcagacga accgaattgt aaaaaatgtt                             6120

ccagatgatt tattaccaga tgtacctcct gtaaactctg atggtagaat caatcgatgc                             6180

agcgaacaaa agtatgtgaa tagccgttta gaaggagaaa gaggattacc aaatgggaat                             6240

cgttctgctg aagcgcatga attctctctc cctattgata taggagagct ggattacaat                             6300

gaaaatgcag gaatatgggt tggatttaag attacggacc cagagggata tgcaacactc                             6360

ggtaaccttg aattggtaga agagggacca ttgtcaggag acgcactaga acgcctgcaa                             6420

agagaagaac aacagtggaa gcttcaaatg acaaaaagac gtgaagagac ggatagaaaa                             6480

tatacggcag caaaacaagc ggtagatcgt ttatatgcag attaccaaga tcaacaattg                             6540

aatccaaacg tagaaattac ggatattact gcggcccaaa acctgataca gtccattcct                             6600

tatgtatata atgaaatgtt cccagaaata caagggatga actatacgaa gtacacagag                             6660

ttaacaaatc gactccaaca agcgtggggt ttgtatgatc aacgaaacgc cataccaaat                             6720

ggtgatttcc gaaatgaatt aagtaattgg aatacaacat ctggtgtaaa tgtacaacaa                             6780

atcaacaata cgtctgtctt agtcatgcca aactgggatg ggcaagtttc gcaacagttt                             6840

acagttcaac cgaatcaaag atatgtatta cgagttactg caagaaaaga aggggtaggg                             6900

aatgggtatg tgagtatccg tgatggtgga aatcaaacag aaacgcttac gtttagtgca                             6960

agcgattata acacagatag tgtgtataat acgcaagtgt cgaatacaaa tggtttgtac                             7020

aatgagcaaa caggatatac cacaaaaaca gtgacattca tcccatatac agatcaagtg                             7080

tggattgaga tgagcgagac cgaaggtatg ttctatatag aaagtgtcga attgattgtt                             7140

        End codon

gaaaaagggc ctttttgtag agaagaatcc gattatttta ttacgattat atattttgtg                             7260

gatagatcat  ggtacc                                                                           7276

            KpnI

SEQ ID NO 2(Cry8Ea1蛋白的氨基酸序列)：

MSPNNQNEYE IIDMAPSTSV SNDSNRYPFA SDPTNALQNM NYKEYLRMSE GYDSEYSGSP                              60

EVLISERDAV KTAISLVGTI LGKLGVPLVG PIVSLYSTLI DVLWPGGKSQ WEIFMEQVEA                              120

LINQKIAEYA RAKALAELEG LGNNYQLYLT ALEEWQENPS STRVLRDVRN RFEILDSLFT                              180

QYMPSFRVTG YEVPLLSVYA QAANLHLLLL KDASIFGEEW GFSTTAINNY YNRQMSLIAQ                              240

YSDHCVQWYR TGLDRLKGSN AKQWVEYNRF RREMTLSVLD IMTLFPMYDM RTYPMETKAQ                              300

LTREVYTDPI GAIGAQGSWY DSAPSFNTLE STFIRGKHLF DFITRLSIYT GRSSFSASNY                              360

LKKWIGHQIS SQPIGGSIQT QTYGTTSGSS VIATQQIGFT GFDVYKTLST AGVLFAYTSK                              420

YYGVSKVVFD AIYPDNKYKT TFTYNPGSEG IGAQEKDSEV ELPPETLDQP NYEAYSHRLN                              480

YVTFIRNPDV PVFSWTHRSA DRTNTVYSDK ITQIPVVKAS DGPKPSANEV GHYLGGDPIS                              540

FNSSGSTGVI RLNINSPLSQ KYRVRIRYCS SVDFDLDVVR GGTTVNNGRF NKSAPNVGWQ                              600

SLKYENFKFA SFSTPFTFNQ AQDTLKISVR NFSSIVGGSV VYIDRIELIP VNATYEAEQD                              660

LDSAKKAVNT LFTNTKDGLR PGVTDYEVNQ AANLVECLSD DLYPNEKRLL FDAVKEAKRL                              720

SEARNLLQDP DFQEINGENG WTASTGIEVV EGDALFKGRY LRLPGAREMD TETYPTYLYQ                              780

KVEEGVLKPY TRYRLRGFVG SSQGLEISTI RHQTNRIVKN VPDDLLPDVP PVNSDGRINR                              840

CSEQKYVNSR LEGERGLPNG NRSAEAHEFS LPIDIGELDY NENAGIWVGF KITDPEGYAT                              900

LGNLELVEEG PLSGDALERL QREEQQWKLQ MTKRREETDR KYTAAKQAVD RLYADYQDQQ                              960

LNPNVEITDI TAAQNLIQSI PYVYNEMFPE IQGMNYTKYT ELTNRLQQAW GLYDQRNAIP                              1020

NGDFRNELSN WNTTSGVNVQ QINNTSVLVM PNWDGQVSQQ FTVQPNQRYV LRVTARKEGV                              1080

GNGYVSIRDG GNQTETLTFS ASDYNTDSVY NTQVSNTNGL YNEQTGYTTK TVTFIPYTDQ                              1140

VWIEMSETEG MFYIESVELIVDVE                                                                      1164

SEQ ID NO 3(cry8Fa1基因的核苷酸序列)：

atcgataaag ggaatggaag acaactcgca aatggctcaa atatcgggtg ttttttattt                              60

tgattatgca taattacaat gaaaacaaaa agaattcatt tgtatagtat tcccagaaat                              120

atcgtgacat cgtttatcat acaataattc gttctaagaa gagccggatt atttttcaat                              180

ctaacaggaa ttttattgtc tacagaagaa tattcttatc acggtaatga ggagagggag                              240

tgaaaatcaa aagagtacct gatttgtcat gtaagaacaa aagaaatcga tcgtacagga                              300

                                         RBS    ORF→

agtccaaata atcaaaatga atatgaaatt atagatatgg caccttctac atctgtaacc                               420

aatgattcta acagataccc ttttgcgaat gagcccacaa atgcattaca aaatatgaat                               480

tataaggatt atttaagaat gtctgaggga tattctcctg aatatttaac aagcctaagt                               540

ccttacagcc agtttggcac agttgataag atcatcagta ttattagtct attgaatagt                               600

gctgcaggta ttcctggtct tgattttttt actggattgc tgcaatttat tcttgacttc                               660

tttgcaccag aggatccgtg ggcagagtta atggaactag tggaacaact catagatcaa                               720

aaaataacag ttgctacaag agaaaaggcg ctcgcagaat taagaggact gataaatgga                               780

taccttgtat atcagcaatc attagaaagt tggctggaaa atccaaatgc tacaagagct                               840

agtatagttc gagaacaata tgtcgcttta gaacttgatt ttgttacttc gatttcatct                               900

tttgcgatag ctggacagga agtaccgtta ttagccgtgt acgcacaagc tgctaattta                               960

catttgttat tattgagaga tgtgtcaata tttggagaag aatggggatt aacagtaaat                               1020

gaggttaata ccttctatat tcgtcaaatg acttatacaa ctgagtatag tgattattgt                               1080

gtaagaattt ataatactgg cttaaataaa ttaaaaggat ctagtgcatc tagttgggtt                               1140

gattataatc gctttcgtag agaaatgaac ttactagtac tagatattat tgcgttattt                               1200

ccaaactatg atgttcgtag gtatccaatg gaaacaacaa cggaattaac aagagtagtt                               1260

tacactgatc caattgtgtt tgacgaaagg aagggggtgg cgtcgactca tagttggacg                        1320

gcgattgcac catctttctc aagtatagaa tctctaactc gacgaccagg attatttaca                        1380

tggttagatc aactaactat tttttcgaaa cgcatatcgc aacctagtgt atttataaat                        1440

agttgggcgg ggcataagat tagcaccttt agaacacaaa aaacagatat actcataaat                        1500

accacccatg gagatactaa taatcctata aaagaatttg tagtagatac caaaaaagta                        1560

gaagatattt atcaaacgat agcataccca catgcagtag caaatgaagt attctattta                        1620

ttcggtgtcc caaaagttga ttttaatatg gtacctgcag gtggctctgc aaactctgca                        1680

cacaccctca ttttttctga tagtacggga gggagactgg aaagtattac gaagaactca                        1740

gaagcagaat tacctccaac agagtcatta tcagatacac ctcaaccaaa ccaagtaact                        1800

tattctcaca gattagatta tgctacaata attaaagcaa ataaaagtta tggaagtggg                        1860

tatattccat tattaggttg gacccatcgg agtgtagatc gtaataatac aatttatccg                        1920

aataaaatca ctcaaatacc agcagtaaaa gctttctcat atactgaatc atttaatgta                        1980

aatgttattg caggtccagg attcacagga ggagatttaa taagtttagg tcatttagag                        2040

aatatttata tgaaattaaa cgttccaaat cctcaaaaat tccgtgttcg tattcgttat                        2100

gctgctagta caacttcgta tttgcaaata actgggctat ctaatttagc tcagtctgat                        2160

cgtttcgaac agacgtattc taatgaaaat gaaaacaatt tgatgtttga aaattttcaa                        2220

tatgtagaac ttagaaatat tttttcggta gatgctccat tagaaaatca tcaagtaagt                        2280

atacaaaatt atcaaggtaa tggttttgtt attatagacc gaatcgaatt catcccagta                        2340

aatgcaacat atgaggcaga acaagattta gattcggcaa agaaagcagt gaataccttg                        2400

tttacgaata caaaagatgg tttacgacca ggggtaacgg attatgaagt gaatcaagcg                        2460

gcaaacttag tggaatgcct atcggatgat ttgtatccaa atgaaaaacg cttgttattt                        2520

gatgcagtga aagaggcaaa acgactcagc gaggcacgta acttactaca agatccagat                        2580

ttccaagaga taaatggaga aaatggatgg accgcaagta caggaattga ggttgtagaa                        2640

ggagatgctc tatttaaagg gcgttatcta cgcctaccag gtgcgagaga aatggataca                        2700

gaaacgtatc caacgtatct gtatcaaaaa gtagaggaag gtgtattaaa accatacaca                        2760

agatatagat tgagagggtt tgtcggaagc agtcaaggct tggaaatttc cacaattcgt                        2820

catcagacga accgaattgt aaaaaatgtt ccagatgatt tattaccaga tgtacctcct                        2880

gtaaactctg atggtagaat caatcgatgc agcgaacaaa agtatgtgaa tagccgttta                        2940

gaaggagaaa gaggattacc aaatgggaat cgttctgctg aagcgcatga attctctctc                        3000

cctattgata taggagagct ggattacaat gaaaatgcag gaatatgggt tggatttaag                        3060

attacggacc cagagggata tgcaacactc ggtaaccttg aattggtaga agagggacca                        3120

ttgtcaggag acgcactaga acgcctgcaa agagaagaac aacagtggaa gcttcaaatg                        3180

acaaaaagac gtgaagagac ggatagaaaa tatacggcag caaaacaagc ggtagatcgt                        3240

ttatatgcag attaccaaga tcaacaattg aatccaaacg tagaaattac ggatattact                        3300

gcggcccaaa acctgataca gtccattcct tatgtatata atgaaatgtt cccagaaata                        3360

caagggatga actatacgaa gtacacagag ttaacaaatc gactccaaca agcgtggggt                        3420

ttgtatgatc aacgaaacgc cataccaaat ggtgatttcc gaaatgaatt aagtaattgg                        3480

aatacaacat ctggtgtaaa tgtacaacaa atcaacaata cgtctgtctt agtcatgcca                        3540

aactgggatg ggcaagtttc gcaacagttt acagttcaac cgaatcaaag atatgtatta                        3600

cgagttactg caagaaaaga aggggtaggg aatgggtatg tgagtatccg tgatggtgga                        3660

aatcaaacag aaacgcttac gtttagtgca agcgattata acacagatag tgtgtataat                        3720

acgcaagtgt cgaatacaaa tggtttgtac aatgagcaaa caggatatac cacaaaaaca                        3780

gtgacattca tcccatatac agatcaagtg tggattgaga tgagcgagac cgaaggtatg                        3840

                                 End codon

tacaggtttc atctggaggg gtttttttct gaaaaagggc ctttttgtag agaagaatcc                        3960

gattatttta ttacgattat atattttgtg gatagatcat ggtacc                   4006

SEQ ID NO 4(Cry8Fa1蛋白的氨基酸序列)：

MSPNNQNEYE IIDMAPSTSV TNDSNRYPFA NEPTNALQNM NYKDYLRMSE GYSPEYLTSL    60

SPYSQFGTVD KIISIISLLN SAAGIPGLDF FTGLLQFILD FFAPEDPWAE LMELVEQLID    120

QKITVATREK ALAELRGLIN GYLVYQQSLE SWLENPNATR ASIVREQYVA LELDFVTSIS    180

SFAIAGQEVP LLAVYAQAAN LHLLLLRDVS IFGEEWGLTV NEVNTFYIRQ MTYTTEYSDY    240

CVRIYNTGLN KLKGSSASSW VDYNRFRREM NLLVLDIIAL FPNYDVRRYP METTTELTRV    300

VYTDPIVFDE RKGVASTHSW TAIAPSFSSI ESLTRRPGLF TWLDQLTIFS KRISQPSVFI    360

NSWAGHKIST FRTQKTDILI NTTHGDTNNP IKEFVVDTKK VEDIYQTIAY PHAVANEVFY    420

LFGVPKVDFN MVPAGGSANS AHTLIFSDST GGRLESITKN SEAELPPTES LSDTPQPNQV    480

TYSHRLDYAT IIKANKSYGS GYIPLLGWTH RSVDRNNTIY PNKITQIPAV KAFSYTESFN    540

VNVIAGPGFT GGDLISLGHL ENIYMKLNVP NPQKFRVRIR YAASTTSYLQ ITGLSNLAQS    600

DRFEQTYSNE NENNLMFENF QYVELRNIFS VDAPLENHQV SIQNYQGNGF VIIDRIEFIP    660

VNATYEAEQD LDSAKKAVNT LFTNTKDGLR PGVTDYEVNQ AANLVECLSD DLYPNEKRLL    720

FDAVKEAKRL SEARNLLQDP DFQEINGENG WTASTGIEVV EGDALFKGRY LRLPGAREMD    780

TETYPTYLYQ KVEEGVLKPY TRYRLRGFVG SSQGLEISTI RHQTNRIVKN VPDDLLPDVP    840

PVNSDGRINR CSEQKYVNSR LEGERGLPNG NRSAEAHEFS LPIDIGELDY NENAGIWVGF    900

KITDPEGYAT LGNLELVEEG PLSGDALERL QREEQQWKLQ MTKRREETDR KYTAAKQAVD    960

RLYADYQDQQ LNPNVEITDI TAAQNLIQSI PYVYNEMFPE IQGMNYTKYT ELTNRLQQAW    1020

GLYDQRNAIP NGDFRNELSN WNTTSGVNVQ QINNTSVLVM PNWDGQVSQQ FTVQPNQRYV    1080

LRVTARKEGV GNGYVSIRDG GNQTETLTFS ASDYNTDSVY NTQVSNTNGL YNEQTGYTTK    1140

TVTFIPYTDQ VWIEMSETEG MFYIESVELI VDVE                                1174