技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物技术领域，具体涉及一种表达载体及其应用。
背景技术
[0002] 一些培养的昆虫细胞系是各种研究应用以及作为
疫苗的病毒类颗粒(VLP)的重组蛋白异源表达的重要宿主(Cherezov等，2007；Imasaki等人，2011；Rasmussen等人，2007；White等人，2012)，(Metz和Pijlman，2011；Shrestha等人，2007；Treanor等人，2011；
Treanor等人，2011年)。这些工艺主要利用杆状病毒表达载体系统(BEVS)来感染源自鳞翅目的细胞系。(Berger等人，2004；Jarvis，2009；Kost等人，2005；Summers，2006)。
[0003] 我们发现鳞翅目杆病毒同源区域5(homologous region 5)增强子(hr5增强子)用于鳞翅目昆虫细胞的高效表达载体，可以显著提高鳞翅目昆虫细胞的重组蛋白表达能
力。
[0004] 而S2(Drosophila Schneider 2)细胞是一种果蝇细胞，属于
双翅目果蝇科果蝇属的一种昆虫细胞，通常由于种属隔离，应用于不同种属的重组表达载体通常无法通用，杆病毒是专
门针对性的传染鳞翅目昆虫，通常不在双翅目昆虫中传播。即在鳞翅目昆虫细胞中高效表达的表达载体，无法在双翅目昆虫细胞中有效表达。
发明内容
[0005] 针对
现有技术的不足，本发明旨在提供一种表达载体及其应用，通过构建了一个在双翅目昆虫果蝇S2细胞上高效表达的含鳞翅目杆病毒基因hr5增强子的重组蛋白表达载体，克服了现有技术中杆病毒不在双翅目昆虫中传播的技术偏见。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 一种表达载体，包含至少一个调控单元，所述调控单元含有增强子和启动子：
[0008] 其中，增强子为hrx增强子或其功能
片段或序列变体；启动子为MT启动子或其功能片段或序列变体，或Act5C启动子或其功能片段或序列变体；
[0009] 其中，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强子、Bombyx mori中的hr3增强，或AcMNPV中的hr3增强子；
[0010] 所述的MT启动子为果蝇细胞金属硫蛋白启动子，其为诱导性启动子，受
金属离子诱导；
[0011] 所述的Act5C启动子为果蝇细胞中的Actin 5C启动子。
[0012] 进一步地，所述hrx增强子与MT启动子或Act5C启动子连接。
[0013] 进一步地，作为优选方案，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强子。
[0014] 更进一步地，hr5增强子采用如SEQ NO ID.2第1-482位所示序列或与其具有70％以上同源的序列。
[0015] 进一步地，所述MT启动子功能片段为SEQ NO ID.1第1-422位所示序列或与其具有70％以上同源的序列。
[0016] 进一步地，所述Actin 5C启动子功能片段为SEQ NO ID.3第3411-3711位所示序列或与其具有70％以上同源的序列。
[0017] 上述表达载体可在果蝇S2细胞中应用，以果蝇S2细胞作为宿主细胞，所述果蝇S2细胞中包含有所述表达载体。
[0018] 上述所述的表达载体的构建方法如下：
[0019] 当启动子为MT启动子或其功能片段或序列变体时：
[0020] 1)使用特异性寡核苷酸引物在pMT/V5-His的模板上扩增MT，扩增产物使用SapI和NotI消化并在质粒pIEx-10亚克隆产生pMT；该特异性寡核苷酸引物为：
[0021] 5’-AAG CTC TTC TTG CAG GAC AGG ATG TGG T-3’；
[0022] 5’-AAG CGG CCG CCC CTT TAG TTG CAC TGA GAT-3’；
[0023] 2)使用另一特异性寡核苷酸引物在pMT/V5-His的模板上扩增MT并用NheI和NotI酶切在质粒pIEx-10中亚克隆产生phrMT；质粒phrMT即为所要构建的表达载体，其中保留了hr5增强子和MT启动子；该另一特异性寡核苷酸引物如下：
[0024] 5’-AAA GCT AGC TTG CAG GAC AGG ATG TGG TG-3’；
[0025] 5’-AAG CGG CCG CCC CTT TAG TTG CAC TGA GAT-3’；
[0026] 当启动子为Act5C启动子或其功能片段或序列变体时：
[0027] 1)在pUC-Act的模板上采用如下引物进行扩增Act5C：
[0028] 5’-AAG CTC TTC AGT ACA CTC TTC ATG GCG AT-3’；
[0029] 5’-AAG CGG CCG CTC TCT GGA TTA GAC GAC TGC-3’；
[0030] 扩增产物使用SapI和NotI消化并在质粒pIEx-10中亚克隆产生pAct5C；
[0031] 2)在pUC-Act的模板上采用如下引物扩增Act5C：
[0032] 5’-AAA GCT AGC AGT ACA CTC TTC ATG GCG AT-3’；
[0033] 5’-AAG CGG CCG CTC TCT GGA TTA GAC GAC TGC-3’；
[0034] 扩增产物并用NheI和NotI酶切在质粒pIEx-10中亚克隆产生质粒phrAct5C，即为所要构建的表达载体，其中保留了hr5增强子和Act5C启动子。
[0035] 本发明的有益效果在于：本发明构建了一个能够在双翅目昆虫果蝇S2细胞上高效表达的含鳞翅目杆病毒基因hrx增强子的重组蛋白表达载体，克服了现有技术中由于种属隔离的原因，杆病毒不在双翅目昆虫中传播的技术偏见。
附图说明
[0036] 图1为包含hr5增强子和MT启动子的表达载体，其中hr5增强子和MT启动子相连。图1中表达载体还包含了NotI及BamHI酶切位点以及终止子和抗性基因等部件；
[0037] 图2为包含hr5增强子和Act5C启动子的表达载体，其中hr5增强子和Act5C启动子相连。图2中表达载体还包含了SbfI和SphI酶切位点以及终止子和抗性基因等部件；
[0038] 图3为瞬时表达的EGFP阳性细胞比例示意图；
[0039] 图4为瞬时表达的EGFP相对
荧光单位示意图；
[0040] 图5为稳定表达的EGFP相对荧光单位；
[0041] 图6为瞬时表达的TNFR-Fc产量；
[0042] 图7为稳定表达的TNFR-Fc产量和
稳定性；
[0043] 图8为hr5增强子对MT启动子和Act5C启动子的相对产量影响；
[0044] 图9为每周取样通过夹心酶联免疫分析(sandwich ELISA)测定TNFR-Fc产量的结果示意图；
[0045] 图10为hr5增强子对MT启动子及Act5C启动子的相对蛋白产量的增强作用示意图。
具体实施方式
[0046] 以下将结合附图对本实用新型作进一步的描述，需要说明的是，本
实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本实用新型的保护范围并不限于本实施例。
[0047] 实施例1
[0048] 一种表达载体，包含至少一个调控单元，所述调控单元含有增强子和启动子：
[0049] 其中，增强子为hrx增强子或其功能片段或序列变体；启动子为MT启动子或其功能片段或序列变体，其中，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强子、Bombyx mori中的hr3增强，或AcMNPV中的hr3增强子；
[0050] 所述的MT启动子为果蝇细胞金属硫蛋白启动子，其为诱导性启动子，受金属离子诱导；
[0051] 进一步地，所述hrx增强子与MT启动子连接。
[0052] 进一步地，作为优选，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强子。
[0053] 更进一步地，hr5增强子采用如SEQ NO ID.2第1-482位所示序列或与其具有70％以上同源，优选80％以上同源，更优选90％以上同源，更优选95％以上同源，最优选98％以上同源的序列。
[0054] 进一步地，所述MT启动子功能片段为SEQ NO ID.1第1-422位所示序列或与其具有70％以上同源，优选80％以上同源，更优选90％以上同源，更优选95％以上同源，最优选
98％以上同源的序列。
[0055] 上述表达载体可在果蝇S2细胞中应用，以果蝇S2细胞作为宿主细胞，所述果蝇S2细胞中包含有所述表达载体。
[0056] 上述表达载体的构建方法如下：
[0057] 1)使用特异性寡核苷酸引物在pMT/V5-His(Invitrogen，巴塞尔，瑞士)的模板上扩增MT，扩增产物使用SapI和NotI消化并在质粒pIEx-10亚克隆产生pMT，如图2所示，其序列如SEQ NO ID.1所示；该特异性寡核苷酸引物为：
[0058] 5’-AAG CTC TTC TTG CAG GAC AGG ATG TGG T-3’；
[0059] 5’-AAG CGG CCG CCC CTT TAG TTG CAC TGA GAT-3’；
[0060] 2)使用另一特异性寡核苷酸引物在pMT/V5-His的模板上扩增MT并用NheI和NotI酶切在质粒pIEx-10中亚克隆产生phrMT；质粒phrMT即为所要构建的表达载体，序列如SEQ NO ID.2所示，其中保留了hr5增强子和MT启动子，如图1所示。该另一特异性寡核苷酸引物如下：
[0061] 5’-AAA GCT AGC TTG CAG GAC AGG ATG TGG TG-3’；
[0062] 5’-AAG CGG CCG CCC CTT TAG TTG CAC TGA GAT-3’。
[0063] 实施例2
[0064] 一种表达载体，包含至少一个调控单元，所述调控单元含有增强子和启动子：
[0065] 其中，增强子为hrx增强子或其功能片段或序列变体；启动子为Act5C启动子或其功能片段或序列变体；
[0066] 其中，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强子、Bombyx mori中的hr3增强，或AcMNPV中的hr3增强子；
[0067] 所述的Act5C启动子为果蝇细胞中的Actin 5C启动子。
[0068] 进一步地，所述hrx增强子与Act5C启动子连接。
[0069] 进一步地，作为优选方案，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强子。
[0070] 更进一步地，hr5增强子采用如SEQ NO ID.2第1-482位所示序列或与其具有70％以上同源，优选80％以上同源，更优选90％以上同源，更优选95％以上同源，最优选98％以上同源的序列。
[0071] 进一步地，所述Actin 5C启动子功能片段为SEQ NO ID.3第3411-3711位所示序列或与其具有70％以上同源，优选80％以上同源，更优选90％以上同源，更优选95％以上同源，最优选98％以上同源的序列。
[0072] 上述表达载体可在果蝇S2细胞中应用，以果蝇S2细胞作为宿主细胞，所述果蝇S2细胞中包含有所述表达载体。
[0073] 上述所述的表达载体的构建方法如下：
[0074] 1)在pUC-Act(Flybase)的模板上采用如下引物进行扩增Act5C：
[0075] 5’-AAG CTC TTC AGT ACA CTC TTC ATG GCG AT-3’；
[0076] 5’-AAG CGG CCG CTC TCT GGA TTA GAC GAC TGC-3’；
[0077] 扩增产物使用SapI和NotI消化并在质粒pIEx-10中亚克隆产生pAct5C，如图4所示，序列如SEQ NO ID.3所示；
[0078] 2)在pUC-Act的模板上采用如下引物扩增Act5C：
[0079] 5’-AAA GCT AGC AGT ACA CTC TTC ATG GCG AT-3’；
[0080] 5’-AAG CGG CCG CTC TCT GGA TTA GAC GAC TGC-3’；
[0081] 扩增产物并用NheI和NotI酶切在质粒pIE x-10中亚克隆产生质粒phrAct5C，即为所要构建的表达载体，序列如SEQ NO ID.4所示，其中保留了hr5增强子和Act5C启动子。如图2所示。
[0082] 实施例3：宿主细胞
[0083] S2细胞系：来自果蝇的Drosophila Schneider 2细胞系，已适应悬浮培养和无
蛋白质培养液。
[0084] S2细胞的增殖：S2细胞从TC Metrix公司(Epalinges，瑞士)获得，并在SF900 II SFM培养基中(Life Technologies公司，巴塞尔，瑞士)进行悬浮培养。细胞在TubeSpin
生物反应器50(TS50)或在TubeSpin生物反应器600(TS600)(TPP，Trasadingen，瑞士)中培养，其各自培养基的量分别为5-10mL或300mL。细胞每周传代2次，传代细胞
密度为1x106细胞/mL。所有培养物在ISF1-X振荡培养器(KühnerAG，Birsfelden，瑞士)中保持在28℃
温度下，摇晃速度为180rpm，摇动直径5厘米。细胞密度和活性通过台盼蓝排除法使用
血细胞计数器测定。
[0085] 在上述两个质粒的
基础上，分别导入EGFP和TNFR-Fc基因，使其能分别表达这两个蛋白。
[0087] 线性PEI(Polysciences，Eppenlheim，德国)配制为pH7.0，浓度1mg/ml的
水溶液，经过过滤除菌并保存在-20摄氏度。对于小规模转染，将细胞离心并重悬于含培养基的TS50管中。DNA和PEI直接加入细胞培养液中，或预混合在去离子水中再加入培养基。在不同的细胞密度下进行转染并用新鲜培养基稀释。所有的细胞都在28摄氏度180rpm摇晃培养。
[0088] 对于300ml的转染，将细胞离心并重悬于含培养基的TS600管中。DNA和PEI预混合在去离子水中再加入培养基。所有的细胞都在28摄氏度180rpm摇晃培养。
[0089] 蛋白质定量
[0090] 将上述质粒导入EGFP和TNFR-Fc基因，从而表达出EGFP以及TNFR-Fc蛋白。EGFP阳性细胞的百分比通过GUAVAEasyCyte流式细胞仪(GUAVAtechnologies，Hayward，美国)测定。激发光和发射光分别为488nm和532nm。EGFP的荧光定量通过TECANSaphireII荧光光度计(TECAN，Maennedorf，瑞士)测定，激发光和发射光分别为485nm和515nm。
[0091] TNFR-Fc的浓度通过ELISA方法确定。使用羊抗人Fcγ
抗体进行包被，并通过
碱性
磷酸酶共聚羊抗人IgGγ链来检测TNF-Fc。加入底物后，在405nm和490nm下用读板器检测吸收值。
[0092] 使用StreamlinerProtein A(GE，Uppsala，瑞典)纯化重组TNFR-Fc，并使用DC蛋白检测(BioRAD，Reinach，瑞士)方法进行检测。
[0093] 瞬时表达的EGFP阳性细胞比例和相对荧光单位(RFU)分别见图5、图6；稳定表达的EGFP相对荧光单位(RFU)见图7。
[0094] 细胞中，在细胞培养摇床(Kuhner，瑞士)内悬浮培养，转速180rpm，温度28℃。转染后48小时培养基中的TNFR-Fc浓度通过所述的夹心酶联免疫分析(sandwich ELISA)测定(Matasci等2011)。在瞬时表达中，采用了hr5增强子的表达载体其TNFR-Fc表达产量分别比无hr5增强子的表达载体增加126％和115％(图8)。
[0095] 而在稳定表达中，采用了hr5增强子的表达载体TNFR-Fc产量更高，而长期稳定性也有更好的保证。每周取样通过夹心酶联免疫分析(sandwich ELISA)测定TNFR-Fc产量，结果见图9。
[0096] 总结来说，hr5增强子对MT启动子及Act5C启动子的相对蛋白产量有着明显的增强作用，其结果见图10。
[0097] 对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，作出各种相应的改变和
变形，而所有的这些改变和变形都应该包括在本发明
权利要求的保护范围之内。
