作为植物害虫特别是鳞翅目和双翅目的生物防治剂的侧孢短芽孢杆菌的新菌株
阅读：504发布：2020-05-11
专利汇可以提供作为植物害虫特别是鳞翅目和双翅目的生物防治剂的侧孢短芽孢杆菌的新菌株专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了对至少一个鳞翅目种类和至少一个 双翅目 种类具有 杀虫活性 的分离的侧孢短芽孢杆菌菌株。特别地，本发明提供了分离的侧孢短芽孢杆菌菌株NMI No.V12/001946、NMI No.V12/001945和NMI No.V12/001944。本发明提供了含有本发明的一种或多种菌株的组合物。本发明还提供了使用本发明的一种或多种菌株或组合物以防治 害虫 ，尤其是昆虫害虫的方法。，下面是作为植物害虫特别是鳞翅目和双翅目的生物防治剂的侧孢短芽孢杆菌的新菌株专利的具体信息内容。
1.一种对至少一个鳞翅目种类和至少一个双翅目种类具有杀虫活性的分离的侧孢短芽孢杆菌菌株。
2.根据权利要求1所述的分离的侧孢短芽孢杆菌菌株，其中，所述至少一个鳞翅目种类选自小菜蛾(Plutella xylostella)和甘蓝尺蠖蛾(Trichoplusia ni)。
3.根据权利要求1所述的分离的侧孢短芽孢杆菌菌株，其中，所述鳞翅目选自卷蛾科和菜蛾科。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的分离的侧孢短芽孢杆菌菌株，其中，所述双翅目种类是蚊种类。
5.根据权利要求4所述的分离的侧孢短芽孢杆菌菌株，其中，所述蚊种类选自库蚊(Culex pervigilans)和棕色造物主(Opifex fuscus)。
6.一种对小菜蛾(Plutella xylostella)和至少一个蚊种类都具有杀虫活性的分离的侧孢短芽孢杆菌菌株。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的分离的侧孢短芽孢杆菌菌株，所述分离的侧孢短芽孢杆菌菌株是生物纯培养物的形式。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的分离的侧孢短芽孢杆菌菌株，所述分离的侧孢短芽孢杆菌菌株选自侧孢短芽孢杆菌菌株NMI No.V12/001946、侧孢短芽孢杆菌菌株NMI No.V12/001945和侧孢短芽孢杆菌菌株NMI No.V12/001944。
9.侧孢短芽孢杆菌菌株NMI No.V12/001946的生物纯培养物。
10.侧孢短芽孢杆菌菌株NMI No.V12/001945的生物纯培养物。
11.侧孢短芽孢杆菌菌株NMI No.V12/001944的生物纯培养物。
12.一种含有至少一种根据权利要求1-11中任意一项所述的侧孢短芽孢杆菌菌株以及农业上可接受的载体的组合物。
13.根据权利要求12所述的组合物，所述组合物含有两种或三种根据权利要求1-11中任意一项所述的侧孢短芽孢杆菌菌株。
14.根据权利要求12或13所述的组合物，其中，所述组合物为杀虫剂组合物。
15.一种用于防治至少一种害虫的方法，所述方法包括用根据权利要求12-14中任意一项所述的组合物，或者一种或多种根据权利要求1-11中任意一项所述的侧孢短芽孢杆菌菌株接触至少一种害虫。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述至少一种害虫为昆虫。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，至少一种昆虫害虫选自鳞翅目种类和双翅目种类。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中，至少一种昆虫为鳞翅目种类。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述鳞翅目为卷蛾科或菜蛾科。
20.根据权利要求18所述的方法，其中，所述鳞翅目种类为小菜蛾(Plutell a xylostella)，或者甘蓝尺蠖蛾(Trichoplusia ni)。
21.根据权利要求18所述的方法，其中，所述鳞翅目种类选自苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、普通森 林尺蠖蛾 (Pseudocoremia suavis)、棉铃虫 蛾(Helicoverpa armmigera)、苹果浅褐卷叶蛾(Epiphyas postvittana)、黑腿稻纵卷叶螟蛾(Planotortrix notophaea)和黑琴稻纵卷叶螟(Cnephasia jactatana)。
22.根据权利要求17所述的方法，其中，所述双翅目种类是蚊种类。
23.根据权利要求21所述的方法，其中，所述蚊种类选自库蚊和棕色造物主。
24.根据权利要求15所述的方法，其中，所述害虫为线虫。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述线虫为微虫。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述微虫为全齿复活线虫。
27.根据权利要求15或16所述的方法，其中，所述害虫为胡峰。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述胡峰为普通黄胡蜂。
作为植物害虫特别是鳞翅目和双翅目的生物防治剂的侧孢
短芽孢杆菌的新菌株
技术领域
背景技术
[0003] 一些昆虫害虫也会危害动物包括人类的健康，例如，已知蚊子会携带多种疾病。因此，它们会作为疾病传播的载体。
[0004] 传统上，昆虫害虫的防治一直追求杀虫剂(insecticide)和农药(pesticide)的使用。然而，消费者越来越关心化学残留物以及它们对动物和植物健康以及环境的影响。此外，很多昆虫害虫变得耐农药和杀虫剂。
[0005] 生物防治代表着一种防治昆虫害虫的替代方法，以减少对化学品的依赖。这种“天然”方法比化学防治方法更容易被公众接受，且更有效和更可持续。
[0007] 芽孢杆菌是一个包括具有从对动物和植物健康有害到对昆虫防治有好处而变化的性质的许多不同细菌种类的属。
[0008] 特别地，苏云金芽孢杆菌(Bt基因)是一个众所周知的生物防治剂，可 商购的产品如 和
[0009] 近年来已经出现了昆虫对Bt发展的抗性的证据，请参阅例如Tabashnik等(1990)；Baxter等(2011)；和Tabashnik等(1998)。因此，仍然需要一种用于防治害虫(包括昆虫害虫)的新芽孢杆菌种类。
[0010] 本发明的申请人现在已经确定了一些作为生物防治剂有效的新侧孢短芽孢杆菌。
[0011] 因此，本发明的一个目的是提供作为生物防治剂有用的侧孢短芽孢杆菌新菌株，另一个目的是提供含有至少一种本发明的新的侧孢短芽孢杆菌菌株的组合物；和/或至少为公众提供一种有用的选择。
发明内容
[0012] 一方面，本发明提供了一种对至少一个鳞翅目种类和至少一个双翅目种类具有杀虫活性的分离的侧孢短芽孢杆菌菌株。
[0013] 在一种实施方式中，至少一个鳞翅目种类是小菜蛾(diamondback moth，Plutella xylostella)。
[0014] 在一种实施方式中，至少一个鳞翅目种类是甘蓝尺蠖蛾(cabbage looper moth，Trichoplusia ni)。
[0015] 在一种实施方式中，至少一个鳞翅目种类选自卷蛾科和菜蛾科。
[0016] 在另一种实施方式中，至少一个双翅目种类是蚊种类。
[0017] 在另一种实施方式中，蚊种类选自库蚊(Culex pervigilans)和棕色造物主(Opifex fuscus)。
[0018] 在另一种实施方式中，侧孢短芽孢杆菌菌株对小菜蛾(Plutella xylostella)和选自库蚊(Culex pervigilans)和棕色造物主(Opifex fuscus)的至少一种蚊种类都有活性。
[0019] 在一种实施方式中，侧孢短芽孢杆菌菌株是生物纯培养物的形式。
[0020] 分离的侧孢短芽孢杆菌菌株或生物纯培养物可选自菌株NMI No.V12/001946，NMI No.V12/001945和NMI No.V12/001944。
[0021] 一方面，本发明提供了侧孢短芽孢杆菌菌株NMI No.V12/001946的生物纯培养物。
[0022] 另一方面，本发明提供了侧孢短芽孢杆菌菌株NMI No.V12/001945的生物纯培养物。
[0023] 另一方面，本发明提供了侧孢短芽孢杆菌菌株NMI No.V12/001944的生物纯培养物。
[0024] 另一方面，本发明提供了一种含有至少一种本发明的侧孢短芽孢杆菌菌株以及农业上可接受的载体的组合物。
[0025] 在一种实施方式中，本发明提供了含有一种或多种选自NMI No.V12/001946，NMI No.V12/001945和NMI No.V12/001944的侧孢短芽孢杆菌菌株以及农业上可接受的载体的组合物。
[0026] 在一种实施方式中，所述组合物可含有两种本发明的侧孢短芽孢杆菌菌株。在另一种实施方式中，所述组合物可含有三种本发明的侧孢短芽孢杆菌菌株。
[0027] 在一种实施方式中，所述组合物基本上由一种或多种选自NMI No.V12/001946、NMI No.V12/001945和NMI No.V12/001944的侧孢短芽孢杆菌菌株和农业上可接受的载体组成。
[0028] 在一种实施方式中，所述组合物基本上由两种本发明的侧孢短芽孢杆菌菌株和农业上可接受的载体组成。在另一种实施方式中，所述组合物基本上由三种本发明的侧孢短芽孢杆菌菌株组成。
[0029] 在一种实施方式中，所述组合物为杀虫剂组合物。
[0030] 另一方面，本发明提供了一种用于防治至少一种害虫的方法，该方法包括用本发明的组合物接触至少一种害虫。
[0031] 另一方面，本发明提供了一种用于防治至少一种害虫的方法，该方法包括用本发明的一种或多种侧孢短芽孢杆菌菌株接触至少一种害虫。
[0032] 优选地，所述至少一种害虫为昆虫害虫，更特别地，所述至少一种害虫选自鳞翅目和双翅目。
[0033] 所述菌株的应用，本发明方法中的本发明的菌株或组合物可防治一种以上类型的害虫。
[0034] 因此，在另一种实施方式中，所述至少一种害虫为昆虫害虫，选自鳞翅目、双翅目中的一种或两种。
[0035] 在一种实施方式中，所述至少一种昆虫害虫选自小菜蛾和蚊子。
[0036] 在另一种实施方式中，所述至少一种害虫为选自小菜蛾、蚊子中的一种或两种的昆虫害虫。
[0037] 在一种实施方式中，鳞翅目选自卷蛾科(Tortricidae)、菜蛾科(Plutellidae)和夜蛾科(Noctuidae)。在一种具体的实施方式中，鳞翅目选自卷蛾科和菜蛾科。
[0038] 在另一种实施方式中，所述至少一种昆虫害虫是蛾。在一种实施方式中，所述蛾选自由小菜蛾(Plutella xylostella)、甘蓝尺蠖蛾(Trichoplusia ni)、苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、普通森林尺蠖蛾(Pseudocoremia suavis)、棉铃虫蛾(Helicoverpa armigera)、苹果浅褐卷叶蛾(Epiphyas postvittana)、黑腿稻纵卷叶螟蛾(Planotortrix notophaea)和黑琴稻纵卷叶螟(black lyre leafroller，Cnephasia jactatana)组成的组。
[0039] 在另一种实施方式中，所述害虫为线虫。在一种具体的实施方式中，所述线虫为微虫(microworm)。优选地，所述微虫为全齿复活线虫(Panagrellus redivivus)。
[0040] 在另一种实施方式中，所述昆虫害虫为胡蜂(wasp)。在一种具体的实施方式中，所述胡蜂为普通黄胡蜂(Vespula vulgaris)。
[0041] 在另一种实施方式中，所述昆虫害虫为麦卢卡甲虫(Pyronta sp.)。
[0042] 定义
[0043] 本文所用的术语“杀虫剂”是指作用为杀死或防治昆虫生长的药剂。
[0044] 本文所用的术语“接触”是指以一种对有效的害虫防治有用的方式将本发明的组合物或菌株提供给害虫。最普遍的接触将会涉及将含有本发明的组合物或菌株的材料对害虫喂食，但不限于此。因此，接触包括喂食。
[0045] 本文可互换使用的术语“防治(control)”，“防治中(controlling)”，“生物防治(biocontrol)”或“生物的防治(biological control)”是指使用本发明的菌株或组合物以实现害虫特别是昆虫害虫的数量的减少。一般理解的是数量上的减少，或害虫的消灭，或它们繁殖率的抑制。
[0046] 本说明书中所用的术语“含有(comprising)”意思是“由至少部分组成(consisting at least in part of)”，当解释说明书中包括术语“含有(comprising)”的每个语句时，除了由该术语开头的那些特征也可以存在。相关术语例如“含有(comprise)”和“含有(comprises)”，以及术语“包括(including)”，“包括(include)”和“包括(includes)”也以相同的方式解释。
[0048] 术语“农业上可接受的载体”涵盖了本领域中所有已知的液体和固体载体，例如水和油，以及佐剂、分散剂、粘合剂、湿润剂(wettants)、表面活性剂、保湿剂、增粘剂等，它们是已知常规的用于在防治组合物(包括杀虫剂组合物)的制备中应用的。
[0049] 本文中所用的术语“有效量”的意思是对防治或消灭害虫(特别是昆虫害虫)起作用的用量。
[0050] 本文所用的术语“生物纯培养物”或者“生物纯分离物”是指含有至少90％，优选为95％，优选为99％，更优选为至少99.5％的侧孢短芽孢杆菌菌株细胞的本发明的侧孢短芽孢杆菌菌株的培养物。
[0051] 本文所用的术语“害虫”是指给人类带来不便的有机体。在一种实施方式中，该术语是指对动物(包括人类)，或植物造成伤害的有机体。该伤害可涉及植物或动物健康、生长、产量、繁殖或生存能力(viability)，且可以是表面的伤害(cosmetic damage)。优选地，该伤害是商业上显著的。在一种优选实施方式中，术语“害虫”是指对植物造成伤害的有机体。优选地，该植物为栽培植物。
具体实施方式
[0052] 一方面，本发明涉及具有杀虫(包括昆虫害虫以及特别是鳞翅目和双翅目)活性的侧孢短芽孢杆菌菌株。
[0053] 侧孢短芽孢杆菌是一种形成昆虫病原细菌的需氧孢子，已知其对一些昆虫种类是致病的。像苏云金芽孢杆菌，侧孢短芽孢杆菌的特征在于孢子囊裂解后，在孢子的一侧上产生的典型的独木舟状类芽孢体(CSPB)的制剂。
[0054] 侧孢短芽孢杆菌已被记录为目标寄生线虫(Bone and Singer,1991；Huang et al.,2005；Singer,1996)、软体动物、鞘翅目(Boets et al.,2004；Schnepf et al.,2003；Singer,1996；Singer et al.,1997)、双 翅 目(Favret and Yousten,1985；Rivers et al.,1991)和鳞翅目黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)(De Oliveira et al.,2004)的卵和幼虫的病原体。不同的毒力因子已被记录在不同的侧孢短芽孢杆菌菌株间(Favret and Yousten,1985；Rivers et al.,1991；Zahner et al.,1999)。
[0055] Orlova等(1998)在对双翅目种类(包括黄热病蚊子Aedes aegypti)的幼虫的生物检测中首次证明了侧孢短芽孢杆菌的毒性活性与它的孢子和晶体 的相关性。这种蚊子可作为黄热病和其它疾病如登革热和切昆贡亚热(Chikungunya)的载体。对黑蝇(Simulium vittatum)、蚊子(Culex quinquefasciatus和Aedes aegypti)(Favret和Yousten,1985；Rivers et al.,1991)，和家蝇(Musca domestica(Ruiu et al.2006))，EP2,079,314的幼虫的活性也已有报道。
[0056] 侧孢短芽孢杆菌对鞘翅目种类的活性首次在初步生物检测中进行了报道，该种类包括烟草甲虫Lasioderma serricorne和科罗拉多甲虫Leptinotarsa decemlineata(Rivers et al.,1991)。不同侧孢短芽孢杆菌菌株对玉米根虫(Diabratica spp.)的 活 性 已 有 报 道 (Aronson et al.,1991；Schnepf et al.,2002；Boets et al.,2011)。玉米根虫是玉米作物的主要的农业害虫。
[0057] De Oliveira等(2004)报道了对墨西哥棉铃象甲Anthonomus grandis(与粮食伤害相关的害虫)的高毒性，在相同的研究中也报道了对黎豆毛虫Anticarsia gemmatalis的鳞翅类的活性。
[0058] 然而，迄今为止没有任何报道来讨论菌株对双翅目和鳞翅目的活性。Rivers等(1991)筛选了28株针对毛虫、蚊子和鞘翅目(马铃薯甲虫)的菌株，发现对毛虫没有活性，但对其它两个组有活性。Favret和Yousten(1985)也发现对蚊子有活性，但是对鞘翅目没有活性。
[0059] 令人惊讶的是，申请人现在已经确定了对一系列昆虫害虫(包括一些鳞翅目和双翅目)具有活性的侧孢短芽孢杆菌菌株。特别地，已从甘蓝种子和新西兰土壤中分离出来了三种细菌，侧孢短芽孢杆菌的菌株。筛选检测显示这三种菌株对小菜蛾幼虫，小菜蛾Plutella xyostella和蚊子幼虫(Culex pervigilans和Opifex fuscus)均具有活性。
[0060] 根据用于专利程序目的的布达佩斯条约，这三种侧孢短芽孢杆菌新菌株均已于2012年9月3日，在国家计量院实验室(National Measurement Institute Laboratories，NMI)，萨瓦金街，平布尔，新南威尔士州，澳大利亚(Suakin Street,Pymble,New South Wales,Australia)进行了保藏，分离物已被分别授予保藏号NMI No.V 12/001946、NMI No.V12/001945和NMI No.V12/001944。
[0061] 获得分离物所采用的分离和筛选步骤的细节将在实施例中示出，实施例3中提供了本发明的侧孢短芽孢杆菌的形态和生理特征的确定。
[0062] 申请人首次提供了分离形式的侧孢短芽孢杆菌菌株NMI No.V12/001946、NMI No.V12/001945和NMI No.V12/001944。
[0063] 因此，一方面，本发明提供了侧孢短芽孢杆菌NMI No.V12/001946。
[0064] 另一方面，本发明提供了侧孢短芽孢杆菌NMI No.V12/001945。
[0065] 另一方面，本发明提供了侧孢短芽孢杆菌NMI No.V12/001944。
[0066] 在一种实施方式中，分离了本发明的侧孢短芽孢杆菌菌株，优选地，以生物纯培养物的形式提供了该菌株。
[0067] 已经证明了本发明的菌株对一系列昆虫害虫(包括一些鳞翅目和双翅目)具有杀虫活性，表现出这种活性的三种菌株均是首次提供。更特别地，这些菌株均对小菜蛾和蚊子具有活性。
[0068] 菌株NMI No.V12/001946已显示出对一系列其他昆虫害虫具有杀虫活性，所述其他昆虫害虫包括：苹果蠹蛾(Cydia pomonella)，棉铃虫蛾(Helicoverpa armigera)，黑琴稻纵卷叶螟蛾(black lyre leaf roller moth，Cnephasia jactatana)，黑腿稻纵卷叶螟蛾(Planotortrix notophaea)，苹果浅褐卷叶蛾(Epiphyas postvittana)，麦卢卡甲虫(Pyronta spp)和胡蜂(Vespula vulgaris)。
[0069] 同样已经证明了菌株NMI No.V12/001944和V12/001945对甘蓝尺蠖蛾(Trichoplusia ni)具有活性。
[0070] 菌株NMI No.V12/001944对苹果蠹蛾(Cydia pomonella)也具有活性。
[0071] 同样证明了菌株NMI No.V12/001944和NMI No.V12/001946对线虫微 虫(Panagrellus redivivus)具有活性。
[0072] 本发明的菌株可以针对鳞翅目卷蛾科和鳞翅目菜蛾科具有特定的应用，对鳞翅目夜蛾科也显示具有一些活性。
[0073] 上面讨论的昆虫害虫是特别会引起问题的，会造成植物和动物健康的一系列问题，特别是蛾种类是造成农业和园艺作物显著经济损失的原因。例如，目前全球范围内每年防治小菜蛾(DBM)的花费超过了10亿美元。
[0074] 目前每年防治蚊子的花费超过了4亿美元。
[0075] 在一种实施方式中，本发明分离的侧孢短芽孢杆菌菌株对至少一个鳞翅目种类和至少一个双翅目种类具有杀虫活性。
[0076] 在一种实施方式中，鳞翅目种类来自于选自卷蛾科、菜蛾科、夜蛾科和尺蛾科的科。
[0077] 优选地，卷蛾科种类包括：苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、苹果浅褐卷叶蛾(Epiphyas postvittana)、黑腿稻纵卷叶螟蛾(Planotortrix notophaea)和黑琴稻纵卷叶螟(Cnepasia jactatana)。
[0078] 一种优选的菜蛾科种类为小菜蛾(Plutella xyostella)。
[0079] 优选的夜蛾科种类包括甘蓝尺蠖蛾(Trichoplusia ni)和棉铃虫蛾(Helicoverpa armigera)。
[0080] 一种优选的尺蛾科种类为普通森林尺蠖蛾(Pseudocoremia suavis)。
[0081] 在一种实施方式中，双翅目种类来自于蚊科。
[0082] 优选的蚊科种类包括库蚊(Opifex fuscus)和棕色造物主(Culex pervigilans)。
[0083] 本发明还提供了含有至少一种本发明的侧孢短芽孢杆菌菌株和农业上可接受的载体的组合物。
[0084] 在一种优选的实施方式中，本发明提供了一种含有选自以下至少一种侧孢短芽孢杆菌菌株：
[0085] (a)侧孢短芽孢杆菌NMI No.NMI No.V12/001946
[0086] (b)侧孢短芽孢杆菌NMI No.NMI No.V12/001945
[0087] (c)侧孢短芽孢杆菌NMI No.NMI No.V12/001944
[0088] 和农业上可接受的载体或佐剂的组合物。
[0089] 该组合物可包括任意两种或更多种本发明的侧孢短芽孢杆菌菌株的组合，即(a)和(b)，(a)和(c)或(b)和(c)。在一种实施方式中，该组合物可含有本发明的所有三种菌株。
[0090] 本发明的菌株以防治目标害虫的有效用量存在于组合物中。有效浓度可以依赖所用的侧孢短芽孢杆菌的形式，组合物施用的环境，虫害的类型、浓度和程度；温度；季节；湿度；植物生长季节的阶段；植物年龄；施用的方法、速率和频率；施用的常规杀菌剂、农药等的数量和类型，和植物治疗(例如修剪、放牧和灌溉)的变化而变化。所有的因素均应该在配制组合物中考虑到。
[0091] 本发明的组合物可通过将一种或多种本发明的产生毒素的侧孢短芽孢杆菌菌株与所期望的农业上的载体混合而制得。
[0092] 通常情况下，用于喷洒配制时，产品将含有侧孢短芽孢杆菌的发酵材料，而无需分离芽孢和晶体。可使用超过2天龄，典型4天龄的发酵材料。组合物中的侧孢短芽孢杆菌可与所期望的农业上的载体配制成细胞悬浮液，该细胞直接或通过孢子或晶体产生杀虫毒素。
[0093] 当以完整细胞的形式存在于组合物中时，侧孢短芽孢杆菌通常的浓度范围为3 14 4 10 6 8
1×10至1×10 ，优选1×10至1×10 ，更优选1×10至1×10 细胞/mg。应当理解的
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是，如果需要，可在施用之前制备并稀释具有1×10 至1×10 细胞浓度顺序的组合物。
1×10至1×10 ，优选1×10至1×10 ，更优选1×10至1×10 细胞/mg。应当理解的
11 14
是，如果需要，可在施用之前制备并稀释具有1×10 至1×10 细胞浓度顺序的组合物。
[0094] 使用本领域公知的标准干燥和发酵技术制备侧孢短芽孢杆菌用于在组合物中使用。在生物反应器中，在用于生长的合适的温度和pH值下，在需 氧条件下，通常可以有效地生长。通常的生长温度为15到37℃，一般为27℃到32℃。
[0095] 生长培养基可以是适于侧孢短芽孢杆菌培养的任何本领域公知的培养基，例如，营养酵母提取物盐培养基(NYSM)(Favret,和Youstein 1985)。
[0096] 可使用常规的洗涤，过滤或沉积技术如离心分离来收获菌株，或者可使用旋流器系统收获菌株。可立即使用或者在冷冻条件下(例如4℃)贮存收获的细胞，或者可冷冻干燥收获的细胞。优选地，收获后不久就应该使用细胞。
[0097] 也可以在使用前处理侧孢短芽孢杆菌细胞以生产具有活性的细胞提取物、细胞悬浮液、细胞匀浆、细胞裂解物、细胞上清液、细胞滤液、细胞沉淀物，或者可被用作全细胞制剂。
[0098] 本发明的组合物可包括保湿剂、分散剂(spreaders)、粘着剂(sticker)，稳定剂、渗透剂、乳化剂、分散剂(dispersants)、表面活性剂、缓冲剂、粘合剂(binders)和本领域公知的通常使用的其它杀虫或防治组合物的组分。
[0100] 该组合物可以是喷洒剂、悬浮液、浓缩物、泡沫、浸液(drenches)、浆剂(slurries)、注射剂、凝胶剂、药浴液(dips)、糊剂(pastes)等的形式。
[0101] 液体组合物可以通过混合农业上可接受的液体载体与侧孢短芽孢杆菌细胞而制得，常规的制剂技术可用于生产液体组合物。
[0102] 在一种实施方式中，组合物为固体形式，该组合物可通过干燥本发明的液体组合物而生产。可选地，本发明所用的固体组合物可通过混合本发明的侧孢短芽孢杆菌细胞和各种无机或生物材料进行制备。例如，固体无机农业载体可包括碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐或硅酸盐、浮石、石灰、膨润土、或它们的混合物。固体生物材料可包括粉状的棕榈壳、玉米芯壳和坚果壳。
[0103] 组合物可配制成粉剂(dusts)、颗粒剂、种子包衣、可湿性粉剂等。该组合物可在施用前配制以提供液体组合物。
[0104] 本发明的组合物可以为控释制剂或缓释制剂的形式。
[0106] 当直接使用本发明的菌株时，如上所述的菌株的相同组合，制备和施用标准同样适用。
[0107] 另一方面，本发明还提供了用于防治害虫的方法，该方法包括将害虫与本发明的组合物接触。
[0108] 在另一种实施方式中，本发明提供了一种用于防治害虫的方法，该方法包括将害虫与本发明的一种或多种侧孢短芽孢杆菌菌株接触。
[0109] 在一种实施方式中，由本发明的方法防治的害虫选自昆虫和线虫。
[0110] 优选的线虫包括微虫，一种优选的微虫为全齿复活线虫(Panagrellus redivivus)。在一种实施方式中，所述害虫为昆虫。
[0111] 在一种实施方式中，所述昆虫选自鳞翅目、双翅目、膜翅目(Hymentoptera)和鞘翅目的一种。
[0112] 在一种实施方式中，鳞翅目种类选自卷蛾科、菜蛾科、夜蛾科和尺蛾科中的一类。
[0113] 优选的卷蛾科种类包括：苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、苹果浅褐卷叶蛾(Epiphyas postvittana)、黑腿稻纵卷叶螟蛾(Planotortrix notophaea)和黑琴稻纵卷叶螟(Cnepasia jactatana)。
[0114] 一种优选的菜蛾科种类为小菜蛾(Plutella xyostella)。
[0115] 优选的夜蛾科种类包括甘蓝尺蠖蛾(Trichoplusia ni)和棉铃虫蛾(Helicoverpa armigera)。
[0116] 一种优选的尺蛾科种类为普通森林尺蠖蛾(Pseudocoremia suavis)。
[0117] 在一种实施方式中，双翅目种类来自于蚊科。
[0118] 优选的蚊科种类包括库蚊(Opifex fuscus)和棕色造物主(Culex pervigilans)。
[0119] 在一种实施方式中，膜翅目种类选自胡蜂科。
[0120] 一种优选的胡蜂科种类为胡蜂普通黄胡蜂(Vespula vulgaris)。
[0121] 在一种实施方式中，鞘翅目种类选自金龟子科(Scarabaeidae)。
[0122] 一种优选的金龟子科种类为麦卢卡甲虫(Pyronta sp.)。一种优选的Pyronta种类为Pyronta festiva。
[0123] 一种实施方式中，将本发明的组合物或菌株直接施用于害虫。例如，通过喷洒、浸渍、撒粉等。
[0124] 在另一种实施方式中，将本发明的组合物或菌株施用于害虫的环境中，通常施用在所要保护的植物或动物上、设备、地面或空气中。喷洒、撒粉、土壤浸泡、种子包衣、叶面喷洒、喷雾、雾化熏蒸均是可能应用的技术。
[0125] 在一种实施方式中，将本发明的组合物或菌株施用于植物或动物，通常在表面上或害虫喂食的部分上。
[0126] 施用可以为仅一次或根据需要重复。也可以考虑在植物生命周期中的不同时间施用。例如，在收获时，以防止或者最小化害虫的收获后攻击。
[0127] 更常见的是，在1010孢子/公顷到1014孢子/公顷，优选为1012孢子/公顷到1013孢子/公顷的施用量范围内，将本发明的组合物或菌株施用于植物幼苗。
[0128] 通常地，施用量可以为50g/公顷到10,000g/公顷。一般从100g/公顷到5,000g/公顷，或从500g/公顷到1500g/公顷。
[0129] 可以使用本发明的组合物处理范围广泛的一系列植物，这类植物包括谷类、蔬菜和耕地作物、草(grasses)、草坪(lawns)、牧草(pastures)、果树 和观赏树木和农作物(plants)。
[0130] 特别得益于本发明的组合物和菌株的使用的耕地作物包括十字花科植物(crucifers)和芸苔属植物(brassicas)。例如，甘蓝、西兰花、菜花、抱子甘蓝(brussel sprouts)和白菜(bok choy)。
[0131] 当配制用于施用时，本发明的组合物通常可以以从1重量％到99重量％，5重量％到95重量％，10重量％到90重量％，15重量％到85重量％，20重量％到80重量％，30重量％到70重量％，或40重量％到60％的浓度存在于制剂中。附图说明
[0132] 现在将参考附图的图表描述本发明：
[0133] 图1示出了宿主范围研究中所用的生物检测的示意图。
[0134] 图2示出了苹果浅褐卷叶蛾检测的示意图。
[0135] 图3示出了显示侧孢短芽孢杆菌菌株NMI No.V12/0001946，NMI No.V12/0001945和NMI No.V12/000194；意大利侧孢短芽孢杆菌菌株NCIMB41419和欧文氏菌(ICMP)对小菜蛾(Plutella xyostella)幼虫(n＝10,22℃)的活性比较的系列图。
[0136] 图4示出了显示侧孢短芽孢杆菌菌株NMI No.V12/001946对蚊子库蚊(Culex pervigilans)和棕色造物主(Opifex fuscus)活性的柱状图。处理物为在10ml中500μl NMI No.V12/001946分离物，在10ml中50μl NMI No.V12/001946分离物和在10ml中5μl NMI No.V12/001946(1821-2)(500ppm)分离物。
[0137] 图5示出了显示对于每只蚊子幼虫，库蚊(Culex pervigilans)蚊子接种于含有20μl NMI No.V12/001946，NMI No.V12/001945和NMI No.V12/001944，ICMP或NCIMB41419细菌悬浮液的1ml水的死亡百分率的柱 状图，对于每个稀释液单独处理12只幼虫。
[0138] 图6示出了显示NMI No.V12/001944和V12/001945对Bt CrylA抗性的(图8A)和易感的(图8B)甘蓝尺蠖蛾的效果的曲线图。
[0139] 图7示出了显示Cry 1A抗性小菜蛾(DBM)和易感的CrylA DBM第2龄幼虫之间对减弱V12/001944的溶液的作用的比较的曲线图。
[0140] 图8示出了显示NMI No.V12/001944对苹果蠹蛾幼虫的作用的曲线图。
[0141] 图9示出了显示用V12/001946和V12/001944处理的微虫(Panagrellus redivivus)存活的柱状图，存活率可分为5个级别。
[0142] 图10示出了用于确定NMI No.V12/001944，V12/001945和V12/001946，和意大利NCIMB41419菌株中的每个菌株的16s rDNA序列的多重序列比对，破折号(-)表示与在上述序列中的正上方相同的核苷酸。
[0143] 实施例
[0144] 提供了下面的非限制性实施例以说明本发明，并不以任何方式限制本发明的保护范围。
[0145] 实施例1-侧孢短芽孢杆菌的选择过程
[0146] 作为用于芸苔属的疾病和害虫的新生物防治剂的研究的一部分，从36批8种芸苔属植物类型，蔬菜西兰花，甘蓝，苤蓝(kohl rabi)，小白菜(pak choi)，和饲用植物羽衣甘蓝(kale)，芜菁(leaf turnip)，油菜和瑞典甘蓝(swede)的种子中分离出微生物。
[0147] 在标准微生物培养基上分离出总共811种微生物并进行纯培养。它们的组成如下：
[0148] 584种细菌分离物
[0149] 227种真菌分离物。
[0150] 大多数微生物出现在有菌的种子中(84％)。细菌形态种类占所有回收 的细菌分离物的74％，但是仅2种分离物属于短芽孢杆菌属。
[0151] 采用离体叶片检测法评价21种微生物(17种细菌分离物和4种真菌)对小菜蛾(diamondback moth)幼虫、小菜蛾(Plutella xylostella)的生物活性。还筛选了来自林肯大学菌种保藏的另外的2种细菌种类和6种真菌种类对小菜蛾(P.xylostella)的活性。叶表面染上细菌和真菌溶液，并喂食两种幼虫，检测死亡率。在该筛选中确定了一种侧孢短芽孢杆菌分离物。相同种类的另一种分离物在剩下的分离物中被发现，同样针对小菜蛾(P.xylostella)筛选，并表现出活性。
[0152] 从来自一个不相关的项目的表面无菌的马铃薯匍匐茎获得了侧孢短芽孢杆菌的另一分离物。在叶面检测中它也表现出对DBM幼虫的活性，将这些菌株进一步进行生物检测并鉴定确认。
[0153] 实施例2-侧孢短芽孢杆菌的分离
[0154] 从新西兰植物或种子中分离了3种侧孢短芽孢杆菌菌株，使用无菌环选择营养琼脂分离平板上形成的菌落，并在新平板上划线以提供纯培养。
[0155] 从南太平洋种子(新西兰，NZ)有限公司获得的杂交甘蓝种子中分离出NMI No.NMI No.V12/001946。
[0156] 从新西兰莱特森种子有限公司获得的牧草油菜种子中分离出NMI No.NMI No.V12/001945。
[0157] 从新西兰南桥(Southbridge,New Zealand)附近的商业农场获得的伊拉姆耐寒马铃薯植物(potato plant，cv Ilam hardy)中分离出NMI No.NMI No.V12/001944。
[0158] 分离方法
[0159] 对于芸苔属种子(brassica seed)，从种子的有菌表面上将细菌分离到营 养琼脂上，然后将单个菌落进行纯培养。
[0161] 实施例3-形态及生理鉴定
[0162] 使用光学显微镜来鉴定所有侧孢短芽孢杆菌分离物以确定短芽孢杆菌属的特征。
[0163] 使用API 50CH(生物梅里埃公司，bioMérieux)检测生物化学特性。
[0164] 按照制造商的指示使用商购的底物利用试剂盒API 50CH(生物梅里埃公司，bioMérieux)来进一步鉴定NMI No.V12/001946和NMI No.V12/001945菌株。按照制造商的建议将每个菌株与细菌接种在API 50CHB/E培养基中。生物梅里埃公司的鉴定结果显示与它们的数据库中的侧孢短芽孢杆菌有99.9％的同一性。
[0165] 形态特征
[0166] 侧孢短芽孢杆菌是好氧的、革兰氏阳性、内生-孢子形成细菌，它也是兼性厌氧菌(Shida et al.,1996)。
[0167] 三种侧孢短芽孢杆菌NMI No.V12/001946、V12/001945和V12/001944具有以下形态特征，典型的种类如下：所有三种菌株最初生长为营养细胞(vegetative cell)，然后形成含有类芽孢体(parasporal body)(CSPB)和邻近孢子的孢子囊。
[0168] 生长特征
[0169] 好氧、兼性厌氧菌；琼脂上的菌落为白色-微黄色、边缘不规则的菌落。16s rDNA鉴定
[0170] 从4个侧孢短芽孢杆菌菌株的每个菌株的基因组序列中获得16s rDNA区。由新西兰基因组学公司(新西兰，达尼丁)对基因组DNA进行测序，使用来自侧孢短芽孢杆菌的另一个16s RDNA序列和提取的全16s rDNA基因寻找重叠群(Contigs)，并使用程序基因(programmes Geneious)(http[colon]//www[dot]geneious[dot]com/)和DNAman(Lynnon Biosoft，加拿大)进行比对。
[0171] SEQ ID NO.1用于表征NMI V12/001946；SEQ ID NO.2用于表征NMI V12/001945；SEQ ID NO.3用于表征NMI V12/001944，SEQ ID NO 4.用于表征NCIMB41419，在EP
2,079,314中鉴定的NCIMB41419是一个获自NCIMB有限公司(弗格森大厦，克莱斯通村，巴克斯本，阿伯丁，AB219YA，苏格兰)的侧孢短芽孢杆菌菌株。
2,079,314中鉴定的NCIMB41419是一个获自NCIMB有限公司(弗格森大厦，克莱斯通村，巴克斯本，阿伯丁，AB219YA，苏格兰)的侧孢短芽孢杆菌菌株。
[0172] SQ ID NO:1到SQ ID NO:4的序列比对示于图10中，显示了表示每个菌株的特征的每个序列间的差异。
[0173] 实施例4-生物检测程序
[0174] 小菜蛾(Plutella xylostella)(鳞翅目：菜蛾科)，甘蓝白蝴蝶菜粉蝶(鳞翅目：粉蝶科)和甘蓝尺蠖蛾(Trichoplusia ni)(鳞翅目：夜蛾科)
[0175] 在林肯大学，在芸苔属(甘蓝)上饲养小菜蛾幼虫，或者获得对CrylA和CrylC有抗性的菌株以及易感的(G88)菌株，并在纽约州农业试验站，农业和生命科学学院，康奈尔大学(位于日内瓦，纽约，美国)进行试验。甘蓝白蝴蝶幼虫均从新西兰林肯大学农场收集。
[0176] 使用10 只2-3 龄幼虫并放置在用 20μL 含有细菌的菌株 (NMINo.:V12/00944,V12/001945或V12/001946)的溶液处理的或浸在该溶液中的3cm甘蓝叶盘上。将意大利侧孢短芽孢杆菌菌株NCIMB41419和另一种细菌属Erwina(ICMP)的培养物用作针对DBM幼虫的对照。使用<0.05％的湿润剂， Siliwet L-77(迈图高新材料，纽约，美国)或Triton X-100(罗门哈斯公司，费城，美国)。每个处理重复3-5次(每次处理3-50幼虫)，处理后的幼虫在23℃16L：8HD(林肯)或者27℃16hL：8hD(美国)下仍然留在甘蓝叶上，并每天检查幼虫死亡情况。
[0177] 同样获得了易感的且CrylA抗性Trichoplusia ni并在纽约州农业试验站，农业和生命科学学院，康奈尔大学(位于日内瓦，纽约，美国)进行了试验。接种并培养对于DBM的第二批第3龄幼虫，除了每个重复仅使用5只幼虫外(每个处理总共25只幼虫)，处理后，幼虫仍然保持在27℃16hL：8hD下。
[0178] 苹果蠹蛾(Cydia pomonella)生物检测(鳞翅目：卷蛾科)
[0179] 使用来自由新西兰奥克兰植物和食品研究中心(PFR)提供的卵的苹果蠹蛾幼虫进行生物检测，PFR也供给饲养昆虫所用的人工饲料。
[0180] 进行初步的和验证性的试验以评价昆虫对NMI NO.V12/001946的反应。每个生物检测有两个由以下组成的处理：a)用全效(full strength)NMI No.V12/001946或V12/001944处理饲料(在30℃下生长在NYSM中的4日龄摇瓶材料，用作湿润剂的0.25％接触剂未稀释)，和b)作为对照的未处理的饲料。在初步的试验中，每个处理重复10次，1管代表一个重复。对于验证性的试验，每个处理具有30个重复或1管作为一个重复。对于处理的饲料，将10μl NMI No.V12/001946分散在表面上并使其在空气中干燥10分钟。将2只第2龄幼虫加入每个管中并用封口膜盖上管。
[0181] 将所有的管放置在一个架子上并放在25℃且光周期为16:8(L：D)的孵化器中，接种后1天收集初始数据并每日观察幼虫死亡率。
[0182] 家蝇(Musca domestica)生物检测(双翅目：蝇科)
[0183] 使用购自生物供给昆虫公司(Biosuppliers Insects，供给活昆虫的公司(www[dot]biosuppliers[dot]com)，设在新西兰奥克兰)的幼虫(蛆)和蛹进行生物检测试验，在该试验中使用Ruiu等2006的人工饲料。
[0184] 在两个处理中观察NMI No.V12/001946对蛆和蛹的反应，a)用全效(full strength)NMI No.V12/001946处理饲料，和b)作为对照的未处理的饲料。在初步的试验中使用蛆，每个处理用具有10mL饲料的三个陶瓷杯(pottel cups)(普乐公司，亨德森，奥克兰，新西兰)。对于经处理的饲料，在加入6只蛆前，将全效200μL NMI No.V12/001946与饲料完全混合。在使用蛹的试验中，每个处理具有一个陶瓷杯子(pottel)，每个杯子放置有5只蛹。
[0185] 上述设置被放在21℃且光周期为16:8(L：D)的孵化器中，每天完成该设置的观察。
[0186] 普通森林尺蠖蛾(Pseudocoremia suavis)生物检测(鳞翅目：尺蛾科)[0187] 普通森林尺蠖蛾的卵由PFR供给，使得该卵在一间具有20℃和16:8(L：D)光周期的新西兰林肯大学生物保护中心的控温(CT)室中孵化，然后在新西兰林肯大学苗圃生长的离体辐射松芽上饲养孵出的幼虫，充分洗涤松芽，拍干并放置在内衬湿纸巾的塑料容器中。用网状盖子盖住该容器以使得通风，每天供给新鲜松叶直到幼虫达到可用于生物检测的第3龄。
[0188] 使用叶浸法完成了两个生物检测。每个生物检测具有如下两个处理：a)将辐射松叶浸渍在具有0.01％Triton×100(湿润剂，罗门哈斯公司，费城，美国)的细菌中，和b)将叶子浸渍在具有0.01％Triton×-100的无菌蒸馏水中，作为对照。每个处理有2个叶子-1样品，代表2个重复。在第一个生物检测中，使用10 细菌稀释液，而在第二个试验中全效利用。将5只幼虫放到叶子中前，使叶子在空气中干燥，该设置放置在具有20℃且光周期为
16:8(L：D)的CT室内。
16:8(L：D)的CT室内。
[0189] 新西兰草金龟(Grass grub)(Costelytra zealandica)生物检测(鞘翅目：金龟子科)
[0190] 从附近田野收集新西兰草金龟幼虫，生物检测前，在12孔组织培养板中用立方形胡萝卜(carrot cube)预先喂食幼虫，需要用新鲜的立方形胡萝卜进行再喂食。2天后，选择所有积极吃食的幼虫用于生物检测。
[0191] 生物检测有两个处理，即用NMI No.V12/001946处理的立方形胡萝卜和作为对照的未处理的立方形胡萝卜。对于用NMI No.V12/001946处理的立方形胡萝卜，每个立方形胡萝卜翻滚过在营养琼脂中生长2天的NMI No.V12/001946。每个处理用12个孔，每个孔中有1只幼虫。将平板放置在内衬湿纸巾的托盘中，并用透明塑料袋盖上以增加湿度和防止立方形胡萝卜干燥。将托盘放置在21℃且光周期为16:8(L：D)的孵化器中，每天进行观察。
[0192] 麦卢卡甲虫(Pyronota spp.)生物检测(鞘翅目：金龟子科)
[0193] 进行涉及麦卢卡甲虫幼虫的两个生物检测，立方形胡萝卜生物检测和土壤生物检测。麦卢卡甲虫幼虫由新西兰西港土地保育养殖有限公司(Landcare Farming Ltd,Westport,New Zealand)提供。
[0194] 对于立方形胡萝卜生物检测，进行与新西兰草金龟相同的步骤。在土壤生物检测中，在12孔组织培养平板中用立方形胡萝卜预先喂食幼虫2天。选择积极吃食的幼虫用于生物检测，将10g无菌的土壤放置在普通的瓶子中。将2mL无菌蒸馏水移液到土壤中并充分混合，经处理的土壤有与土壤完全混合的500mL全效NMI No.V12/001946。对照仅有2mL与土壤混合的无菌蒸馏水。将1只幼虫放入每个瓶子中并用1个立方形胡萝卜喂食，将瓶子盖松松地盖上并放置在21℃且光周期为16:8(L：D)的孵化器中，每天完成幼虫死亡率的观察。
[0195] 苹果浅褐卷叶蛾(LBAM)(Epiphyas postvittana)生物检测(鳞翅目：卷蛾科)[0196] 生物检测基于韦尔林等(Wearing et al.2003)的工作的改进，他们的方法使用完全展开的苹果叶，每周将幼虫转移到新叶子上直到第4龄，叶子平坦地放置，背面朝下。将来自林肯大学BHU的嫩苹果叶和来自由植物和食品研究中心友好提供的卵的LBAM幼虫用于该设置。
[0197] 在初步的试验中，完成了来自韦尔林等(2003)方法的改进，具体如下：1)代替整片叶子，将叶子切成1平方英寸；2)使用2片叶子的叶轴(leaf orientation)；3)不将幼虫转移到新叶子中。
[0198] 初步的生物检测有两个处理：未处理的叶子作为对照，以及用1821全效处理的叶子。从很嫩的展开良好的叶子上切下1平方英寸叶子。对于经处理的叶子样品，将40μL全效V12/001946分散在表面上并进行空气干燥。将对照和经处理的叶子样品以2种方式放置在水琼脂的表面上：1)叶子的远轴侧(较低)与琼脂接触和叶子的近轴侧(较高)与琼脂接触。每个处理和每个叶轴(leaf orientation)有2个叶子样品，5只幼虫放置在每个叶子样品上。
[0199] 用整叶法进行第二个生物检测，处理和程序与第一个生物检测相同。
[0200] 番茄夜蛾(又名螟蛉(corn earworm)和普通棉铃虫蛾)(Helicoverpa armigera)生物检测(鳞翅目：夜蛾科)
[0201] 用来自由PFR友好提供的卵的幼虫和基于Singh(1983)的改进的人工饲料，在生物检测中评价V12/001946对番茄夜蛾的反应。该改进为防腐剂、抗生素和抗真菌剂并未掺入饲料中。
[0202] 生物检测有两个处理：用全效V12/001946处理饲料，和未处理的饲料作为对照。每个处理使用具有5mL饲料的6部分杯子(Six portion cups) (Huhtamaki Co.,Henderson,Auckland)。在经处理的饲料中，将20μL全效V12/001946分散在饲料的表面上并进行空气干燥。将5只幼虫放入每个杯子的经处理和未经处理的饲料中，用封口膜盖上杯子以防止饲料的干燥。将经处理的和未处理的杯子放置在具有25℃和16:8(L：D)的光周期的孵化器中。
[0203] 蚊子生物检测(Culex pervigilans and Opifex fuscus)(双翅目：蚊科)[0204] 用由林肯大学从新西兰坎特伯雷牛津废弃的游泳池中收集(Culex pervigilans)或者由基督城林肯新西兰生物安全昆虫学研究实验室提供(Culex pervigilans和opifex fuscus)的蚊子幼虫(两个种类)来完成生物检测。该检测有7个处理，即全效NMI -2 -4 -6 -8 -10No.V12/001946(来自摇瓶)，10 、10 、10 、10 、10 的5个细菌稀释液，和作为对照的未处理的幼虫。每个处理有12个孔，代表着12个重复且是一个完全随机设计。
[0205] 将1mL水和1只幼虫移液到12孔组织培养平板的每个孔中，对于经处理的幼虫，将20μL的NMI No.V12/001946放入每个孔中，用盖子盖上平板并放置在25℃和光照期为16：8(L：D)的孵化器中。当轻轻摇动时，以幼虫缺乏移动为指标来评价每天幼虫的死亡率。
[0206] 用3个菌株NMI V12/001944、V12/001945和V12/001946重复该检测，意大利侧孢短芽孢杆菌菌株NCIMB41419和另一个细菌属培养物Erwina(ICMP)均用作对照。
[0207] 热带粘虫蛾(Spodoptera litura)生物检测(鳞翅目：夜蛾科)
[0208] 用于生物检测的幼虫由PFR提供的卵孵化而来，孵出1天后，在针对番茄夜蛾研发的人工饲料中饲养该幼虫过夜。通过饲料表面上排泄物的存在证明了该饲料对于热带粘虫蛾来说也是合适的。
[0209] 生物检测中有两个处理，用全效NMI No.V12/001946处理饲料，和作为对照的未处理的饲料。每个处理有6个陶瓷杯代表6个重复。将20μL细菌分散在饲料的表面上并进行空气干燥。将5只幼虫放入每个陶瓷杯中，放入后用封口膜盖上杯子。
[0210] 将该设置放置在具有25℃且光周期为16:8(L：D)的孵化器中，每日观察幼虫死亡率。
[0211] 黑腿稻纵卷叶螟蛾(Planotortrix notophaea)和黑琴稻纵卷叶螟(Cnephasia jactatana)生物检测(鳞翅目：卷蛾科)
[0212] 2个生物检测的测试昆虫和人工饲料由PFR提供，从卵孵出1天后，将幼虫在人工饲料中饲养过夜并放置在具有21℃且光周期为16:8的孵化器中。
[0213] 两个生物检测都有2个处理，用全效NMI No.V12/001946处理的饲料，和作为对照的未处理的饲料。在涉及黑腿稻纵卷叶螟蛾的生物检测中，对照有15管，每管代表1个重复，而经处理的饲料有14个重复。对于黑琴稻纵卷叶螟生物检测，经处理和未处理的饲料各有15个重复，将两个第2龄幼虫放入每个管中并用封口膜盖上。
[0214] 在两个生物检测中经处理的和未处理的管均放置在具有21℃且光周期为16:8(L：D)的孵化器中，在立体显微镜下每天观察幼虫死亡率，当用骆驼毛刷轻轻刷过时，缺乏运动的幼虫为评为死亡。
[0215] 粉虫(Tenebrio molitor)生物检测(鞘翅目：拟步甲科)
[0216] 用于生物检测的幼虫和饲料购自新西兰奥克兰的生物供给活昆虫公司。有两个处理，用全效NMI No.V12/001946处理的饲料，和作为对照的未处理的饲料，每个处理有2个重复，1个容器作为1个重复。
[0217] 将250mg饲料放置在每个容器中。对于经处理的饲料，将200μL完全 充分地与饲料混合并进行空气干燥，将相同量的无菌蒸馏水与饲料混合作为对照。将5只幼虫放置在每个容器中，并用盖子盖上，该盖子中心有个孔，然后将该容器放置在具有25℃且光周期为16：8(L：D)的孵化器中。
[0218] 酸酱线虫(Sour paste nematode)/微虫(Panagrellus redivivus)生物检测(线虫：小杆目)
[0219] 自生生活(free living)的线虫购自生物供给公司。完成两个生物检测以测定侧孢短芽孢杆菌细菌对微虫的反应。对于两个生物检测，微虫以糊(paste)的形式提供并且从糊中舀出，并将其放置在有无菌蒸馏水的深培养皿中以使得线虫个体分离。具有尖端切口的1mL吸管尖端用于使得微虫个体进入到无菌蒸馏水中。
[0220] 在第一个生物检测中有3个处理：1)用全效V12/001946处理微虫，2)用全效V12/001944处理微虫，和3)作为对照的未处理的微虫。将10只微虫放置在12孔组织培养平板的每个孔中，将1mL无菌蒸馏水放置在每个孔中，每个处理有6个重复的孔且是一个完全随机设计。在经处理的微虫中，每个孔加入10μL细菌，生物检测在室温下进行。
[0221] 每天评价微虫死亡率直到接种后3天。在立体显微镜下观察幼虫死亡率。
[0222] 在第二个生物检测中，细菌肉汤(broth)用于代替离心分离材料。有5个用于评-2 -3 -4价的处理，即1)V12/001944全效肉汤，2)10 稀释液，3)10 稀释液，4)10 稀释液，和5)未处理作为对照。每个孔有10只微虫，每个处理有6个孔，完全随机设计。对于经处理的微虫，每个孔添加20μL细菌肉汤，该生物检测也在室温下完成。
[0223] 每天评价死亡率直到接种后3天，在立体显微镜下观察幼虫死亡率。
[0224] 阿根廷茎象鼻虫(Argentine stem weevil)(Listronotus bonariensis)(鞘翅目：象鼻虫科)
[0225] 进行两个生物检测以评价V12/001946对阿根廷茎象鼻虫的反应。用于两个生物检测的测试材料、黑麦草和象鼻虫来自新西兰坎特伯雷的田野收集材料。
[0226] 初始的生物检测有两个处理：1)用V12/001946全效肉汤处理黑麦草，和作为对照的未处理的叶子。将黑麦草切成2英寸长，对于V12/001946处理的草，将草样品浸渍在V12/001946全效肉汤中并进行空气干燥10-15分钟。将对照和经处理的草样品放置在培养皿中。经处理的草中有5个培养皿，对照中有四个培养皿。将10只象鼻虫放置在每个草样品中，然后用包装膜密封培养皿。将所有的培养皿放置在具有22℃和光周期为12:12(L/D)的孵化器中，每天观察幼虫死亡率。
[0227] 第二个生物检测利用整个黑麦草苗。使用3周龄的黑麦草苗。将黑麦草苗的根放置在小塑料袋中，且放入足够的水以防止苗干掉。在根部以上，用塑料拉链带系牢塑料袋以防止水从袋中出来。
[0228] 生物检测有如下两个处理：1)V12/001946处理黑麦草，和作为对照的未处理的黑麦草。每个处理有3株黑麦草苗。对于未处理的黑麦草，使用喷枪将500μL无菌蒸馏水喷洒到每株苗中。在经处理的黑麦草中，喷洒500μL的V12/001946肉汤。喷洒后允许苗进行空气干燥并放置在具有孔眼的盖子的矩形塑料容器中。将10只象鼻虫放入到每株苗中，所有的容器放置在22℃且光周期为12:12(L/D)的孵化器中，每天完成幼虫死亡率的评价。
[0229] 划蝽(Waterboatmen)(半翅目：划蝽科)
[0230] 使用从新西兰牛津田野收集的划蝽进行生物检测，有两个处理：1)用V12/001946处理划蝽，和未处理的作为对照。将1只划蝽放置在具有5mL无菌蒸馏水的普通瓶子中，每个处理有5个瓶子。在经处理的划蝽中，将40μL全效V12/001946添加到无菌蒸馏水中，在室温(20-24℃)下完成试验，每 天评价死亡率。
[0231] 龙虱(Diving beetle)(Antiporus duplex)(鞘翅目：龙虱科)
[0232] 用于生物检测的龙虱是从新西兰牛津田野收集来的。生物检测有两个处理，即1)V12/001946处理龙虱，和未处理的作为对照。
[0233] 在生物检测中利用12孔组织培养平板。将1只龙虱放置在每个孔中，每个处理6个孔。将2mL无菌水放置在每个孔中。对于V12/001946处理的龙虱，添加10μL全效V12/001946。在室温(20-24℃)下完成生物检测，每天记录死亡率。
[0234] 普通胡峰Vespula vulgaris成虫(膜翅目：胡蜂科)
[0235] 使用从林肯大学周围的开花植物收集来的胡峰成虫完成生物检测。两个处理用来评价：V12/001946处理胡峰，和未处理的作为对照。将5只胡峰放置在一个具有小冲孔盖子的塑料容器中。
[0236] 用放置在小塑料盖中的2mL 10％蔗糖溶液喂食对照中的胡峰。对于V12/001946处理的胡峰，用1mL全效V12/001946(浓缩的)与2mL 10％蔗糖混合，在将胡峰放入每个容器前，放入蔗糖溶液(有和没有V12/001946)。
[0237] 在室温(20-24℃)下完成生物检测，每天记录死亡率。
[0238] 三种新西兰侧孢短芽孢杆菌(NMI No.V12/001944、V12/001945和V12/001946))分离物显示了对DBM幼虫具有活性(参见图3)。针对其它一系列鳞翅目，细菌对某些种类是有毒的(表1)。稻纵卷叶螟蛾(黑腿稻纵卷叶螟蛾，黑琴稻纵卷叶螟，苹果浅褐卷叶蛾，所有卷蛾科)、苹果蠹蛾(卷蛾科)和DBM(菜蛾科)和夜蛾科是易感的。
[0239] 蚊子(双翅目：蚊科)对细菌也是非常易感的(图4和图5)。
[0240] 在麦卢卡甲虫(金龟子)中具有一定的易感性，但是当将幼虫接种到土 壤中时，并没有看到这种易感性。新西兰草金龟，另一种金龟子，是不易感的(表2)，膜翅目胡峰，普通黄胡蜂(Vespula vulgaris)成虫似乎是易感的。
[0241] 针对一种被称作微虫(Panagrellus redivivus)的线虫种类，证明了线虫的活性(图9)。
[0242] 侧孢短芽孢杆菌菌株NCIMB 41419对小菜蛾(图3)或蚊子(图5)是没有效果的。
[0243] 表1：使用菌株V12/001946对鳞翅目昆虫生物检测的总结(全效大约为1010个细胞/mL 3-4天培养物)
[0244]
[0245]
[0246] 表2:其它种类
[0247]
[0248]
[0249] 三种从新西兰植物分离的侧孢短芽孢杆菌菌株对某些鳞翅目和双翅目均显示出了活性。在鳞翅目中，测试的所有的卷蛾科和菜蛾科种类均是易感的，在双翅目中，蚊子是易感的。
[0250] 在本说明书中，已参考了专利说明书、其它外部文献，或者其它的信息来源，其主要目的是为了提供用于讨论本发明的特征的背景内容。除非另有明确规定，参考这样的外部文献不应被理解为一种以任何权限的准入，即，这样的文献，或这样的信息来源是现有技术，或者形成本领域公知常识的部分。
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