因为雌激素水平在绝经期间下降，所以雌激素依赖性组织开始退化并出现雌激素缺乏的特有现象。在绝经期，宫颈粘液水平下降，阴道粘膜退化。随着年龄增加，阴道缩短，皱褶消失，弹性丧失。阴道分泌不足。当给予雌激素时，这些效应中的某些方面可逆转：宫颈可分泌更多粘液，阴道粘膜可更新失去的各层。然而，这些症状通常不会完全消失，这部分是因为所提供的用于激素替代的雌激素的数量低于正常月经周期间的循环雌激素水平。
约40％的绝经后妇女会经历萎缩性阴道炎或阴道干燥。在阴道萎缩期间，阴道上皮的厚度、水合作用(hydration)、皱褶(皱襞)和血流都会减少。萎缩性阴道炎的原因包括局部和全身雌激素含量下降以及环境因素，例如化学治疗、抗组胺药、吸烟、过量运动和使用会阴产品(即冲洗器、除臭剂和香水)。雌激素或激素替代疗法(HRT)能有效减轻阴道干燥。然而，可能的危险副作用包括乳癌、子宫内膜癌、血栓、恶心、胸部触痛和头痛的发病率较高。
非处方(over-the-counter)市售产品包括润滑剂(例如Astroglide和KY Lubricating Jelly)以及保湿剂(例如Replens和KY Long LastingMoisturizer)。这些产品在其组合物中大部分是水，仅能暂时缓解症状(1-2天)，但其实并不能对阴道组织提供长期益处。
因此，阴道干燥和阴道粘膜退化是个问题，特别是在绝经后。刺激宫颈粘液的产生，可有助于缓解阴道干燥，也可以增强外源给予雌激素的作用，以缓解阴道干燥。而且也需要用于防止阴道粘膜退化的组合物和方法。
发明概述
本发明提供非激素疗法，所述疗法用于治疗某些生殖和阴道方面的问题，包括萎缩性阴道炎。一般而言，这些疗法具有最小副作用，刺激天然的和非激素的作用机制，促进阴道细胞生长和更新，增加粘液分泌，刺激基因表达，用新组织替代衰老组织并保持或恢复健康的组织功能。
因此，本发明涉及多种用于治疗或预防雌性哺乳动物的阴道和/或生殖方面问题的组合物和方法。所述组合物包括有效量的包含维生素E和/或植物激素例如茉莉酮酸或赤霉酸的组合物。本发明的组合物也可包括类视黄醇或类胡萝卜素(例如维生素A)和/或一种或多种核苷酸或核苷。一般而言，这些组合物可通过局部或阴道内给予。本发明的组合物和方法尤其能够在雌性哺乳动物体内增加阴道细胞生长、刺激阴道细胞各层的更新(renewal)或周转(turnover)和/或缓解或减轻阴道干燥。本发明的组合物和方法也可刺激胶原蛋白和纤连蛋白的产生。
在一个实施方案中，本发明提供一种增加阴道或宫颈上皮细胞生长的方法，所述方法包括给予雌性哺乳动物有效量的维生素E和/或植物激素例如茉莉酮酸或赤霉酸。本发明的组合物也可包含类视黄醇或类胡萝卜素(例如维生素A)和/或一种或多种核苷酸或核苷。
在另一个实施方案中，本发明提供一种增加阴道或宫颈上皮细胞的粘蛋白(例如粘蛋白-4)表达的方法，所述方法包括给予雌性哺乳动物具有有效量的维生素E和/或植物激素例如茉莉酮酸或赤霉酸的组合物。本发明的组合物也可包括类视黄醇或类胡萝卜素(例如维生素A)和/或一种或多种核苷酸或核苷。
在另一个实施方案中，所述方法包括增加阴道或宫颈上皮细胞的P2Y2受体或雌激素受体或血管内皮生长因子的表达的方法，所述方法包括给予雌性哺乳动物具有有效量的维生素E和/或植物激素例如茉莉酮酸或赤霉酸的组合物。本发明的组合物也可包含类视黄醇或类胡萝卜素(例如维生素A)和/或一种或多种核苷酸或核苷。
这类方法可促进哺乳动物的退化阴道粘膜的更新，预防或治疗阴道干燥，或者维持或增强哺乳动物阴道粘液的正常保护功能。一般而言，维生素E、植物激素(例如茉莉酮酸或赤霉酸)和其它化合物都可经由阴道内给予。
附图简述
图1说明1μM维生素E在24小时内增加粘蛋白-4表达。经溴化乙锭染色的2.0％琼脂糖凝胶显示出分离的β-肌动蛋白(350bp阳性对照)和粘蛋白-4(800bp)的PCR产物。第1道含有DNA标记。第2-5道含有PCR产物，分别使用宫颈cDNA、胎盘cDNA、ME-180cDNA(未处理)和ME-180cDNA(1μM维生素E)作为模板。
图2A-2C说明在2天时间内，三个浓度的反-视黄酸(○)、9-顺-视黄酸(□)和13-顺-视黄酸(◇)对ME-180细胞生长的影响。作为阴性对照，也图示了不含视黄酸的培养基(×)对细胞生长的影响。图2A图示了在2天时间内，10μM反-视黄酸(○)、9-顺-视黄酸(□)和13-顺-视黄酸(◇)对ME-180细胞生长的影响。图2B图示了在2天时间内，1μM反-视黄酸(○)、9-顺-视黄酸(□)和13-顺-视黄酸(◇)对ME-180细胞生长的影响。图2C图示了在2天时间内，100nM反-视黄酸(○)、9-顺-视黄酸(□)和13-顺-视黄酸(◇)对ME-180细胞生长的影响。Y轴是ME-180细胞数。
图3提供一幅照片，显示经溴化乙锭染色的PCR产物的2％琼脂糖凝胶，采用来自ME-180宫颈上皮细胞mRNA的cDNA作为模板。用两组引物产生第2-11道的产物：P2Y2-特异性引物(上面的条带，650bp，第2-11道)和β-肌动蛋白-特异性引物(下面的条带，300bp)。第1道和第12道是DNA大小标记。肉眼可见P2Y2产物在第2、3和7道，其中模板cDNA分别来自宫颈细胞(第2道)、不含维生素A的ME-180细胞(第3道)和不含维生素A或血清的ME-180细胞(第7道)。将100nM维生素A加入到ME-180细胞中，在血清存在下(第4-6道)和在血清不存在下(第8-11道)，引起P2Y2表达的增加。
图4提供一幅照片，显示经溴化乙锭染色的PCR产物的2％琼脂糖凝胶，使用来自ME-180宫颈上皮细胞cDNA作为模板。第1道提供DNA大小标记。用两组引物产生第2-10道的PCR产物：ER-α-特异性引物(上面的条带)和β-肌动蛋白-特异性引物(下面的条带)。在第2道，模板是来自在血清存在下培养的ME-180细胞的cDNA。在第3道和第7道，模板是来自血清不存在时培养的ME-180细胞的cDNA。在第4-6道，模板是来自无血清培养、且用100nM维生素A分别处理4小时、8小时和16小时的ME-180细胞的cDNA。将100nM维生素A加入到ME-180细胞中，导致ER-α表达增加。
图5提供一幅照片，显示经溴化乙锭染色的PCR产物的2％琼脂糖凝胶，使用来自不同细胞类型的RNA作为模板。第1道和第7道提供DNA大小标记。用两组引物产生第2-6道的PCR产物：血管内皮生长因子(VEGF)特异性引物(上面的条带)和β-肌动蛋白-特异性引物(下面的条带)。第2道和第6道提供来自未处理ME-180细胞的cDNA的PCR产物。第3-5道提供来自用100nM维生素A分别处理4小时、8小时和16小时的ME-180细胞cDNA的PCR产物。
图6提供一幅照片，显示经溴化乙锭染色的PCR产物的2％琼脂糖凝胶，使用来自不同细胞类型的RNA作为模板。图6中凝胶的第1道含有DNA大小标记，尤其是大小标记的100bp梯标记(最亮条带是600bp)。第2道含有RT-PCR反应产物，用来自宫颈RNA的模板cDNA和粘蛋白-4引物(800bp产物)以及β-肌动蛋白引物(300bp产物)。第3道含有类似PCR反应产物，用来自ME-180细胞的模板cDNA。第4含有类似PCR反应产物，用来自经100nM维生素A处理24小时的ME-180细胞的模板cDNA。
图7图示与未接受茉莉酮酸或赤霉酸的人类志愿者(对照)进行比较，茉莉酮酸和赤霉酸对健康人类志愿者的细胞更新时间的影响。如图所示，在未接受茉莉酮酸或赤霉酸的人类志愿者体内，细胞更新较缓慢。茉莉酮酸使人皮肤细胞更新所需时间增加了约28％，而赤霉酸使细胞更新时间增加了约20％。
图8图示经血细胞计数器测定的茉莉酮酸对细胞生长随时间的影响。未接受茉莉酮酸的对照细胞(○)具有最小的细胞生长。接受1μg/ml茉莉酮酸(▲)、10μg/ml茉莉酮酸(×)和100μg/ml茉莉酮酸(◆)的细胞以剂量依赖方式表现出增加的细胞生长。
图9图示经直接细胞计数法测定的茉莉酮酸对细胞生长随时间的影响。未接受茉莉酮酸的对照细胞(○)的细胞生长最少。接受1μg/ml茉莉酮酸(■)、10μg/ml茉莉酮酸(◆)和100μg/ml茉莉酮酸(×)的细胞以剂量依赖方式表现出增加的细胞生长。这些数据表明，植物激素例如茉莉酮酸可以增加表皮细胞的细胞生长，因此可用于治疗阴道萎缩。
发明详述
本发明提供用于在雌性哺乳动物生殖系统内增加粘液分泌并刺激细胞生长和表皮层更新的组合物和方法。本发明的组合物包含维生素E和/或植物激素，例如茉莉酮酸或赤霉酸。给予这类组合物可以增加雌性生殖系统的粘液产生、刺激细胞生长、促进阴道和宫颈细胞的更新。因此，本发明的组合物可以促进新细胞替代老细胞，因而更新雌性生殖道内衬。
本发明利用价麻易得的活性化合物，所述化合物有效增强阴道和宫颈组织更新自身并产生水分的天然能力。因此，本发明的方法和组合物避免了强烈的化学品和非天然物质，而这些物质对使用者的健康和生殖的影响是未知的。
本发明的方法可从质量及数量上改善生殖器分泌，修复和置换衰老组织并影响生殖细胞、上皮细胞和粘膜细胞内的基因表达。其表达受到本发明方法影响的基因包括粘蛋白基因。
粘蛋白是指高分子量的糖蛋白家族，由粘膜组织的杯状和非杯状上皮细胞分泌或表达。粘蛋白可形成粘液，粘液是一种具有特定结构和功能的高度水合的凝胶。不同物种的粘蛋白具有类似的功能特征，尤其是粘蛋白的蛋白质骨架。已经鉴定出了9种不同的粘蛋白基因(MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7和MUC8)。粘蛋白是含有50-80％糖的糖蛋白。它们是具有蛋白质骨架的又大又长的分子(分子量105-107道尔顿)，蛋白质骨架上连接有呈瓶刷构型的寡糖。寡糖侧链即瓶刷在其组成上可以是高度可变的，这表明该分子的更基本的功能源自蛋白质核心。这些分子可通过二硫桥交联，构成分子量非常高的凝胶。不同组织可产生不同种类的粘蛋白。
根据本发明，维生素E可以增加粘蛋白的表达，因此使雌性哺乳动物生殖道分泌增加并形成粘液。
本发明所提供的对粘液分泌的影响包括但不限于粘蛋白(例如硫粘蛋白和/或唾液粘蛋白)的数量和种类、粘度变化、氢离子阻滞、疏水性、磷脂含量变化、糖基化和硫酸化、大分子组装、表面张力、粘着性、运动性质、弹性模量、拉伸性能、刚性系数(rigidity factor)、反冲系数(recoil factor)、粘液成丝现象、精子穿入性能、稠度、多孔性、蕨样变(ferning)等。
本发明的方法可改变局部生殖系统的组成并刺激分泌，包括阴道、宫颈、子宫、输卵管、前庭大腺(Bartholin gland)或前庭腺的组成和尿道分泌。本发明的方法和组合物可影响生殖系统内粘液基因的功能，所述基因包括但不限于在宫颈、子宫和前庭大腺以及具有粘液分泌细胞的生殖系统其它部分内控制粘液产生的基因。下生殖道(例如阴道)的鳞状上皮和宫颈上皮细胞可以用本发明的方法处理。以下方法包括在内：影响或改变粘液基因的分泌效果、粘液分泌细胞、以及影响所有上述生殖系统各腺体的分泌特性和细胞表面粘蛋白的细胞的方法。
粘液可以按其化学、物理和生物学性质来定义。粘液的流变学即流动性能包括粘液的粘度、流速、剪切指数、粘液成丝现象或延伸性，这些都是因为增加了粘弹性和蕨样变(结晶)参数所致。阴道分泌物的水合作用、粘度、数量或其它性能的变化或刺激，可影响大量病症和障碍，包括但不限于避孕、不育、绝经、交媾困难(dyspareunia)、感染和其它相关及无关病症。这些器官的功能和解剖学描述可参见以下文献：Novak′s Gynecology，12.sup.th edition，Berek，Adashi和Hillard编著，Williams和Wilkins，Baltimore，Md.，1996。
本发明的方法和组合物也可以增加雌性生殖道内衬细胞(例如阴道细胞和宫颈细胞)的生长。这样的细胞生长增加可快速发生，或者仅在治疗数日后就可发生。例如，仅在治疗2-3天后，大量新形成的细胞几乎是未治疗个体细胞的2-3倍或4-5倍。随着治疗进程，大量新形成的细胞还可进一步增加。例如，与未治疗个体相比，接受治疗的个体可具有约2倍至约20倍数量的新形成的年幼细胞。与未治疗个体相比，其它个体可具有约2倍至约10倍数量的新形成的年幼细胞。这类增加的细胞生长可修复和置换衰老细胞和组织，更新雌性生殖道内衬，提供更大弹性并改善参与生殖组织的健康。
因此，本发明具有至少两个一般性用途。首先，本发明可以增加粘液数量和/或生殖器官分泌物的含水量，以改善雌性生殖系统的健康并且增加其润滑度。其次，本发明可通过例如刺激细胞生长、基因表达和粘液分泌，用于更新衰老组织并增强这些组织的健康和弹性。
维生素E
至少有8种天然存在的化合物具有维生素E活性。每种维生素E化合物都是6-苯并二氢吡喃醇衍生物。参见ULLMANN′SENCYCLOPEDIA OF INDUSTRIAL CHEMISTRY，第A27卷，VitaminE，第4章：478-488(VCH Verlagsgesellschaft，1996)。生育酚类化合物(化合物Ia-d)具有饱和侧链，而生育三烯酚(tocotrienol)类化合物(化合物IIa-d)具有不饱和侧链。生育酚类化合物包括下式I的化合物：

其中R1、R2和R3都独立地为氢(H)、甲基(CH3)或羟基(OH)。α-生育酚化合物(Ia)是式I化合物，其中R1、R2和R3都为甲基。β-生育酚化合物(Ib)是式I化合物，其中R1和R3为甲基，R2为氢。γ-生育酚化合物(Ic)是式I化合物，其中R1为氢，而R2和R3为甲基。δ-生育酚化合物(Id)是式I化合物，其中R1和R2为氢，而R3为甲基。
生育三烯酚类化合物包括下式II的化合物：

其中R1、R2和R3都独立地为氢(H)、甲基(CH3)或羟基(OH)。α-生育三烯酚化合物(IIa)是式II化合物，其中R1、R2和R3都为甲基。β-生育三烯酚化合物(IIb)是式II化合物，其中R1和R3为甲基，R2为氢。γ-生育三烯酚化合物(IIc)是式II化合物，其中R1为氢，而R2和R为甲基。δ-生育三烯酚化合物(IId)是式II化合物，其中R1和R2为氢，而R3为甲基。
在本发明之内，维生素E被认为包括具有维生素E活性的所有上述生育酚和生育三烯酚。
当本发明组合物中含有维生素E化合物时，维生素E化合物的用量占本发明组合物的约0.0001％至约50％、或约0.001％至约20％、或约0.001％至约10％、或约0.01％至约5％、或约0.05％至约2％。根据本发明，原位浓度范围为约10-5M至约10-7M的活性赤霉酸对于增加上皮细胞增殖和粘蛋白-4表达来说是有效的。
赤霉酸
赤霉酸包括一类化合物，也称为赤霉素。赤霉素是影响植物生命周期的各种各样过程的植物激素，这些过程包括种子萌发、抽茎、开花诱导、花药发育和种子与果皮生长。赤霉素是四环双萜类酸，可从真菌和高等植物中分离，具有下式(III)结构的内赤霉素烷(ent-gibberellane)环系：

赤霉素首次是由日本研究人员于1930年自真菌藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi，Fusarium moniliforme)中分离获得的。赤霉素是次生代谢物，已经知道它们也存在于其它真菌、某些蕨类和许多裸子植物及被子植物中。在121种已知的赤霉素中，已经鉴定出96种仅存于高等植物中，12种仅存于赤霉属(Gibberella)中，12种在这两者中都同时存在。在赤霉属中观察到许多不同的赤霉素可存在于个别被子植物中。
主要存在两类赤霉素：具有20个碳原子的C20-赤霉素(以下结构IV)，以及第20个碳原子因代谢而失去的C19-赤霉素(以下结构V)。在几乎所有C19-赤霉素中，碳-19的羧酸与碳-10键合，产生内酯桥。


内赤霉素烷环系可含有许多结构修饰，由此得到大量已知的赤霉素。具有已鉴定结构的天然存在的赤霉素被称为“A号”(MacMillan等(1968)Nature 217：170-171)。目前，来自植物和真菌的126种天然存在的赤霉素是已知的。有关赤霉素的最新结构信息可在以下网站查找到：plant-hormones.bbsrc.ac.uk/gibberellin_information2.htm。
赤霉素的结构变化有多种方式。碳-20可以不同氧化态存在，例如甲基(-CH3)、羟甲基(-CH2OH)、醛基(-CHO)或羧基(-COOH)。内赤霉素烷骨架(尤其是C19-赤霉素骨架)也可含有其它官能团。羟基(-OH)经常插入到环系中；也可发生环氧基(＞O)和酮基(＝O)官能团的插入，虽然不那么常见。取代基的位置和/或立体化学可影响分子的生化及生理特性。认为位于环平面之上的取代基是呈β构型；它们与环的连接用实线拉伸的三角形来表示。认为位于环平面之下的取代基是呈α构型；它们与环的连接用虚线拉伸的三角形来表示。取代基与环系平面的连接用直线表示。
赤霉素可以缀合物(conjugate)的形式存在，例如与己糖或戊糖分子(例如葡萄糖)构成的缀合物。醚键或酯键可将这样的葡萄糖分子与赤霉素连接在一起。这样的连接可使植物体内的赤霉素活性暂时或永久性失活。
不同赤霉素的生物活性不同，植物体内各种赤霉素可以是活性赤霉素的前体、生物合成中间体或失活产物。三种结构特征通常与赤霉素生物活性相关：3-羟基、7-羧基和内酯环。一般而言，可以认为，具有内赤霉素烷环系、但缺乏这些结构特征中的一个或多个结构特征的化合物是赤霉素前体、中间体或衍生物。
本发明的组合物和方法通常使用活性形式的赤霉酸、赤霉酸前体、赤霉酸中间体或赤霉酸衍生物，例如具有上述式IV和式V相关结构的那些形式。具有所述结构的赤霉素在不同位置上可具有多种取代基，包括羟基(-OH)、羧基(-COOH)、醚基(-O)、甲基(-CH3)、亚甲基(＝CH2)、内酯(-CO-O-)环、羟基亚甲基(-CH2-OH)、甲酰基(CHO)和相关取代基。所用的赤霉素在其环结构的不同位置上也可具有双键。
在某些实施方案中，赤霉酸可具有式VI、VIa或VIb中的任一个。

具有式VI的赤霉素通常称为赤霉素A3。

具有式VIa的赤霉素通常称为赤霉素A4。

具有式VIb的赤霉素通常称为赤霉素A7。
当本发明组合物中含有赤霉酸或其衍生物时，赤霉酸或其衍生物的用量占本发明组合物的约0.001％至约50％、或约0.01％至约20％、或约0.01％至约10％、或约0.05％至约5％、或约0.05％至约2％。根据本发明，原位浓度为约10-4M至约10-6M的活性赤霉酸对于增加表皮细胞增殖来说是有效的。具有约0.5％赤霉酸的组合物表现出能促进皮肤周转。
茉莉酮酸化合物
本发明所用的茉莉酮酸化合物包括茉莉酮酸和本领域技术人员可用的茉莉酮酸衍生物。所述化合物包括茉莉酮酸、茉莉酮酸甲酯及其异构体。在本发明中所用的茉莉酮酸和茉莉酮酸衍生物也包括茉莉酮酸、二氢茉莉酮酸、羟基茉莉酮酸和二氢-羟基茉莉酮酸的合成及天然立体异构体。可用于本发明的茉莉酮酸衍生物的其它实例包括具有式VII、VIII、IX或X中的任一个的化合物。

其中：
R4为烷基；
R5为COOR或-(CH2)n-OX，其中n为1-20的整数；
R为H或烷基；和
X为H或1-6个糖残基(例如己糖或戊糖)。
一般而言，这些茉莉酮酸化合物中所用的烷基具有约1-20个碳原子，尽管在某些实施方案中可使用低级烷基，例如约1-8个碳原子的烷基。也可使用具有更少碳原子数的烷基，例如1-6个或1-3个碳原子的烷基。
在某些实施方案中，本发明的组合物中使用茉莉酮酸。茉莉酮酸是式VII的化合物，其中R4为C2H5，R5为COOH。
本发明所用的另一个茉莉酮酸化合物是下式VIII的化合物。

其中：
R4为烷基；
R5为COOR或-(CH2)n-OX，其中n为1-20的整数；
R为H或烷基；和
X为H或1-6个糖残基(例如己糖或戊糖)。
在某些实施方案中，本发明的组合物中使用二氢茉莉酮酸。二氢茉莉酮酸是式VIII的化合物，其中R4为C2H5，R5为COOH。
本发明所用的另一个茉莉酮酸化合物是下式IX的化合物：

其中：
R4为烷基；
R5为COOR或-(CH2)n-OX，其中n为1-20的整数；
R为H或烷基；
X为H或1-6个糖残基(例如己糖或戊糖)；和
Y为H、烷基或1-6个糖残基(例如己糖或戊糖)。
在某些实施方案中，本发明的组合物中使用羟基茉莉酮酸。羟基茉莉酮酸是式IX的化合物，其中R4为C2H5，R5为COOH。
本发明所用的另一个茉莉酮酸化合物是下式X的化合物。

其中：
R4为烷基；
R5为COOR或-(CH2)n-OX，其中n为1-20的整数；
R为H或烷基；
X为H或1-6个糖残基(例如己糖或戊糖)；和
Y为H、烷基或1-6个糖残基(例如己糖或戊糖)。
在某些实施方案中，本发明的组合物中使用二氢-羟基茉莉酮酸。二氢-羟基茉莉酮酸是式X的化合物，其中R4为C2H5，R5为COOH。
当本发明组合物中含有茉莉酮酸或茉莉酮酸衍生物时，茉莉酮酸或茉莉酮酸衍生物的用量占本发明组合物的约0.001％至约50％、或约0.01％至约20％、或约0.01％至约10％、或约0.05％至约5％、或约0.05％至约2％。根据本发明，原位浓度范围为约10-4M至约10-6M的茉莉酮酸对于增加表皮组织的细胞增殖来说是有效的。如本文所述，约0.025％的茉莉酮酸溶液对促进皮肤周转和更新来说是有效的。
其它成分
在另一个实施方案中，本发明的组合物和方法包括给予雌性哺乳动物有效量的类视黄醇或类胡萝卜素和/或一种或多种核苷酸或核苷。这些组合物和方法可以增加阴道或宫颈上皮细胞中的P2Y2受体或雌激素受体或血管内皮生长因子的表达。
在某些实施方案中，本发明的组合物可包含一种或多种类视黄醇或类胡萝卜素。IUPAC-IUB Joint Commission on BiochemicalNomenclature规定“类视黄醇是一类由4个类异戊二烯单位头尾相连而组成的化合物”。所有类视黄醇在形式上都由含5个碳-碳双键和非环状部分末端官能团的单环母体化合物衍生而成。类视黄醇的基本结构可再细分为三部分，分别称为极性末端、缀合侧链(conjugatedside chain)和环己烯基环。大多数常见的天然类视黄醇的基本结构都称为视黄醇、视黄醛和视黄酸。然而，本发明的类视黄醇不仅仅局限于视黄醇、视黄醛和视黄酸。而且，本发明的类视黄醇和类胡萝卜素也包括落入下式XIA或XIB范围内的化合物：

其中：
Z为CH或N；
R为H或1-6个碳的烷基；
m为0-5的整数；
n为0-2的整数；
r为0-2的整数；
L为-(C＝Z)-NH-或-NH-(C＝Z)-，其中Z为O或S；
Q为苯基、萘基、吡啶基、噻吩基、呋喃基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、噻唑基、噁唑基、咪唑基或吡唑基(pyrrazolyl)，其中所述苯基、萘基、吡啶基、噻吩基、呋喃基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、噻唑基、噁唑基、咪唑基或吡唑基(pyrrazolyl)可被一个或两个R1基团取代；
W为F、Br、Cl、I、C1-6烷基、氟-取代的C1-6烷基、NO2、N3、OH、OCH2OCH3、OC1-10烷基、四唑、CN、SO2C1-6-烷基、SO2C1-6-氟-取代的烷基、SO-C1-6烷基、CO-C1-6烷基、COOR8、苯基，苯基本身又可被不是苯基或取代苯基的W基团取代，前提条件是当X为CH且r为0时，则n不为0，至少一个W基团不为烷基；
A为(CH2)q(其中q为0-5)、3-6个碳的低级支链烷基、3-6个碳的环烷基、2-6个碳和1-2个双键的烯基、2-6个碳和1-2个三键的炔基；和
B为COOH或其药学上可接受的盐、COOR8、CONR9RR10、CH2OH、CH2OR11、CH2OCOR11、CHO、CH(OR12)2、CHOR13O、COR7、CR7(OR12)2、CR7OR13O，其中R7为含有1-5个碳的烷基、含有1-5个碳的环烷基或含有1-5个碳的烯基，R8为1-10个碳的烷基或三甲基甲硅烷基烷基(其中烷基具有1-10个碳)或5-10个碳的环烷基，或者R8为苯基或低级烷基苯基，R9和R10独立地为氢、1-10个碳的烷基或5-10个碳的环烷基或苯基或低级烷基苯基，R11为低级烷基、环烷基、低级烷基取代的环烷基、苯基或低级烷基苯基，R12为低级烷基，R13为2-5个碳的二价烷基。
在某些实施方案中，类视黄醇或类胡萝卜素是下式XII所限定的化合物：

其中：
R20、R21和R22各自独立地为C1-6烷基、氟-取代的C1-6烷基、羟基-取代的C1-6烷基、CH2OH、CH2OR11、CH2OCOR11、CHO、CH(OR12)2、CHOR13O、COR7、CR7(OR12)2或CR7OR13O。
术语烷基是指并包括被认为是直链烷基、支链烷基和环烷基的任何及所有基团。术语烯基是指并包括具有一个或多个不饱和位的直链烯基、支链烯基和环烯基。同样，术语炔基是指并包括具有一个或多个三键的直链炔基和支链炔基。
低级烷基是指1-6个碳的烷基以及3-6个碳的低级支链烷基和环烷基。低级烯基同样定义为2-6个碳的直链低级烯基，以及3-6个碳的支链低级烯基和环低级烯基。低级炔基也同样定义为2-6个碳的直链低级炔基，以及4-6个碳的支链低级炔基。
可以按照美国专利6,437,129和美国专利6,437,003所述，制备式XIA、XIB和XII的化合物，所述文献通过引用全部结合到本文中。
可以制备任何本发明化合物的药学上可接受的盐，所述化合物具有能形成所述盐的官能团，例如酸或胺官能团。药学上可接受的盐是保留母体化合物活性的任何盐，并且对于接受所述盐的患者来说在给药前后都没有任何毒性或不想要的作用。药学上可接受的盐可衍生自有机碱或无机碱。盐可以是一价离子或多价离子。特别重要的是钠、钾、钙和镁等无机离子。有机盐可以用胺来制备，特别是铵盐，例如一烷基胺、二烷基胺、三烷基胺或乙醇胺。也可用咖啡因、三羟甲基氨基甲烷和类似分子形成盐。当所含有的氮具有足够碱性而能形成酸加成盐时，可以用任何无机酸或有机酸或烷化剂(例如甲基碘)来形成所述盐。优选的盐是用无机酸所形成的盐，所述无机酸例如盐酸、硫酸或磷酸。也可使用任何简单有机酸，例如一元酸、二元酸或三元酸。
某些本发明的化合物可具有反式异构体和顺式异构体。另外，本发明的化合物可含有一个或多个手性中心，因此可以对映体形式和非对映体形式存在。本发明的范围内包括所有这些异构体，以及顺反异构体的混合物、非对映体混合物和对映体的外消旋混合物(旋光异构体)。
本发明的组合物可包含一种或多种核苷或核苷酸。这类核苷酸或核苷可包括例如dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、ATP、GTP、CTP、TTP、UTP，以及本领域技术人员可用的所述核苷酸或核苷的任何衍生物。
在某些实施方案中，核苷酸或核苷是下式XIII所限定的化合物：

其中：
X1、X2和X3各自独立地为O-或S-。在某些实施方案中，X2和X3都为O-；
R31为O、亚氨基、亚甲基或二卤代亚甲基(例如二氯亚甲基、二氟亚甲基)。在某些实施方案中，R31为氧或二氟亚甲基。
R32为H或Br。在某些实施方案中，R32为H。式XIII化合物的实例是尿苷5′-三磷酸(UTP)和尿苷5′-O-(3-硫代三磷酸)(UTPγS)。
在其它实施方案中，核苷酸或核苷是下式XIV所限定的化合物：

其中V是尿嘧啶或腺嘌呤。
在本发明的另一些实施方案中，核苷酸或核苷是下式XV所限定的化合物：

其中：
X1、X2、X3和R31如上定义；
当R35不存在且N-1和C-6之间有双键时，R33和R34为H(腺嘌呤)，或者当R35为O且N-1和C-6之间有双键时，R33和R34为H(腺嘌呤1-氧化物)，或者R33、R34和R35结合在一起为-CH＝CH-，从N-6至N-1构成环，其中在N-6和C-6之间具有双键(1，N6-亚乙烯基腺嘌呤)。
在本发明的又一些实施方案中，核苷酸或核苷是下式XVI所限定的化合物：


其中：
X1、X2、X3和R31如上定义；
当R38不存在且N-3和C-4之间有双键时，R36和R37为H(胞嘧啶)，或者R36、R37和R38结合在一起为-CH＝CH-，并且从N-3至与R36和R37连接的氮构成环(3，N4-亚乙烯基胞嘧啶)。
因此，本发明的组合物可含有式XIII、XIV、XV或XVI化合物中的一个或多个化合物，其数量足以有效刺激雌性阴道或生殖道的粘液分泌。
上式XIII化合物的说明性化合物包括：(a)尿苷5′-三磷酸(UTP)；(b)尿苷5′-O-(3-硫代三磷酸)(UTPγS)；和(c)5-溴-尿苷5′-三磷酸(5-BrUTP)。这些化合物是已知的，或者可按已知方法或本领域技术人员显而易见的修改方法来制备。一般参见N.Cusack和S.Hourani，Annals N.Y.Acad.Sci.603，172-81(标题″Biological Actions ofExtracellular ATP″)。例如，可以按照Kenner等，J.Chem.Soc.1954，2288；或者Hall和Khorana，J.Am.Chem.Soc.76，5056(1954)所述方法制备UTP。参见Merck Index，Monograph No.9795(第11版，1989)。可以按照R.S.Goody和F.Eckstein，J.Am.Chem.Soc.93，6252(1971)所述方法制备UTPγS。
式XIV化合物的说明性化合物包括P1，P4-二(腺苷-5′)四磷酸或P1，P4-二(尿苷-5′)四磷酸。可以按照已知方法或其修改方法来制备这些化合物，所述方法参见P.Zamecnik等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，838-42(1981)；K.Ng和L.E.Orgel，Nucleic Acids Res.15(8)，3572-80(1987)。可以按照C.Vallejo等，Biochem.Biophys.Acta 438，304-09(1976)所述的类似方法，制备P1，P4-二(尿苷-5′)四磷酸。
上式XV化合物的说明性化合物包括(a)腺苷5′-三磷酸(ATP)和(b)1，N6-亚乙烯基腺苷5′-三磷酸。上式XIV化合物的说明性化合物包括(a)胞苷5′-三磷酸和(b)3，N4-亚乙烯基胞苷5′-三磷酸。可按已知方法或本领域技术人员显而易见的修改方法，制备这些化合物。例如，可按以下文献及其中的参考文献所述的标准方法，进行核苷的磷酸化：D.Hoard和D.Ott，J.Am.Chem.Soc.87，1785-1788(1965)；M.Yoshikawa等，Tetrahedron Lett.5065-68(1967)和M.Yoshikawa等，Bull.Chem.Soc.(Jpn)42，3505-08(1969)；J.Moffatt和H.Khorana，J.Am.Chem.Soc.83，649-59(1961)；B.Fischer等，J.Med.Chem.36，3937-46(1993)。可按诸如以下文献中所述的已知方法制备胞苷和腺苷的亚乙烯基衍生物：N.Kotchetkov等，Tetrahedron Lett.1993(1971)；J.Barrio等，Biochem.Biophys.Res.Commun.46，597(1972)；J.Secrist等，Biochemistry 11，3499(1972)；J.Bierndt等，Nucleic AcidsRes.5，789(1978)；K.Koyasuga-Mikado等，Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)28，932(1980)。具有α、β和γ硫代磷酸基团的衍生物可按以下方法或其修改方法来衍生：J.Ludwig和F.Eckstein，J.Org.Chem.54，631-35(1989)；F.Eckstein和R.Goody，Biochemistry15，1685(1976)；R.Goody和F.Eckstein，J.Am.Chem.Soc.93，6252(1971)。
可按G.Blackburn等，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，1119-25(1984)中所述的类似方法，制备R1为CCl2和CF2的式XIII、XV或XVI化合物。可按T.Myers等，J.Am.Chem.Soc.85，3292-95(1963)所述的类似方法，制备R1为CH2的式I、II、III化合物。
另外，UTP、ATP、CTP、P1，P4-二(腺苷-5′)四磷酸、3，N4-亚乙烯基胞苷三磷酸、1，N6-亚乙烯基腺嘌呤5′-三磷酸、腺苷1-氧化物5′-三磷酸、ATPγS、ATPβS、ATPαS、AMPPCH2-P、AMPPNHP、N4-亚乙烯基胞苷和1，N6-亚乙烯基腺苷都是市售的，例如来自SigmaChemical Company，PO Box 14508，St.Louis，Mo.63178。
使用方法
本发明涉及多种治疗或预防雌性哺乳动物阴道和/或生殖问题的方法。这些方法包括给予雌性哺乳动物有效量的维生素E和/或植物激素例如赤霉酸或茉莉酮酸。一般而言，给药是经局部或阴道内给予。
对雌性哺乳动物阴道和/或生殖问题进行的治疗，包括调节粘液水平，以增加或减少雌性哺乳动物的生育力，或者缓解或减轻雌性哺乳动物的阴道干燥。因此，治疗可包括缓解或减少雌性哺乳动物的不止一个阴道和/或生殖问题。
在一个实施方案中，所述方法增加阴道或宫颈表皮细胞的生长。在另一个实施方案中，所述方法包括增加粘蛋白基因的表达，所述粘蛋白基因例如粘蛋白-1基因、粘蛋白-2基因、粘蛋白-3A基因、粘蛋白-3B基因、粘蛋白-4基因、粘蛋白-5B基因、粘蛋白-5AC基因、粘蛋白-6基因、粘蛋白-7基因、粘蛋白-11基因、粘蛋白-13基因、粘蛋白-15基因、粘蛋白-17基因、粘蛋白-19基因、粘蛋白-20基因和类似的粘蛋白基因。所述方法可预防或治疗哺乳动物的阴道干燥，或者维持或增强哺乳动物阴道粘液的正常保护功能。
本文所用的术语“哺乳动物”是指动物，通常是指温血动物。哺乳动物包括家牛(cattle)、野牛(buffalo)、绵羊、山羊、猪、马、狗、猫、大鼠、兔、小鼠和人。也包括其它牲畜、驯养动物和捕获动物。
治疗包括给予有效量的维生素E和/或植物激素。维生素E、赤霉酸和/或茉莉酮酸可作为组合物给予，所述组合物还含有其它成分，例如，一种或多种核苷酸或核苷、其它维生素(例如类视黄醇或类胡萝卜素例如维生素A)、芦荟(aloe vera)等。一般而言，含有维生素E、赤霉酸或茉莉酮酸以及还含或不含其它成分的组合物是经阴道内给予的。
组合物
给予本发明的组合物，以改善雌性生殖系统的健康，刺激润滑液(粘液)的分泌，促进细胞生长，治疗阴道粘膜退化并更新雌性生殖系统。
为了达到所需效果，可以以单剂量或分次剂量给予组合物，例如，至少约0.001μg/kg至约100-200mg/kg，约0.01μg/kg至约30-50mg/kg，约0.1μg/kg至约10-20mg/kg或约1.0μg/kg至约1.0mg/kg至约10mg/kg体重的一种或多种类视黄醇或类胡萝卜素或核苷酸或核苷，尽管其它剂量也可提供有益结果。给药量将随以下因素的不同而异：包括但不限于疾病、哺乳动物体重、身体状况、健康状况、年龄，以及是想要达到防止生育还是想达到治疗阴道干燥的目的。临床医师用动物模型或本领域可用的其它试验系统，就可容易地确定这些因素。
给予本发明的治疗剂，可以是单剂量、多剂量，以连续或间歇方式，这取决于例如受体的生理状况，给药目的是为了治疗还是预防，以及熟练医师已知的其它因素。可以在预先选定的一段时间内基本连续给予本发明的组合物，或者可以以一系列间隔剂量给药。通常考虑局部给药。
将活性成分按合适浓度混合，制备本发明组合物。可以任选添加本领域技术人员所选定的其它活性剂或钝化剂。包括在单位剂量中的给定活性剂的绝对重量可以在宽范围内变动。例如，可以给予约0.001μg至约50mg、或约0.01μg至约10mg、或约0.1μg至约1mg的至少一种维生素E、赤霉酸或茉莉酮酸，或者多种维生素E化合物或赤霉酸化合物或茉莉酮酸化合物。或者，单位剂量可以在以下范围内变动：约0.001μg至约1000μg，约0.01μg至约750μg，约0.1μg至约1mg，约1.0μg至约750μg，约2.5μg至约600μg，约5.0μg至约500μg，或约7.5μg至约400μg。
本发明组合物的日用量同样也可变动。所述日用量的范围为例如约0.001mg/天至约50mg/天，约0.01mg/天至约25mg/天，约0.1mg/天至约12mg/天，约0.1mg/天至约8mg/天，约0.1mg/天至约4mg/天和约0.1mg/天至约2mg/天的一种或多种维生素E、赤霉酸或茉莉酮酸化合物。
组合物中的维生素E、赤霉酸或茉莉酮酸浓度也可变动。例如，浓度范围为约0.1μM至约1000μM，或约0.5μM至约500μM，或约1μM至约300μM，或约5μM至约200μM，或约10μM至约100μM。
因此，可以通过各种途径，给予一种或多种包含本发明治疗用组合物的合适单位剂型，所述途径包括口服、胃肠外(包括皮下、静脉内、肌内和腹膜内)、直肠、皮肤、经皮、胸内、肺内、阴道内和鼻内(呼吸)途径。治疗用组合物也可配制成缓释剂型(例如采用微囊法，参见WO 94/07529和美国专利第4,962,091)。如果合适的话，可以以分离的单位剂型形式便利地提供制剂，并且可以通过制药领域众所周知的任何方法来制备。这类方法可包括以下步骤：将治疗剂与液体载体、固体基质、半固体载体、微细固体载体或其组合混合在一起，然后在必要时将产物引入想要的给药系统或者成型中。
当制备本发明治疗用组合物供阴道内给药用时，通常将它们与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合在一起，制成药物制剂或单位剂型。对于阴道内给药，可以溶液剂、混悬剂、乳剂、粉剂、颗粒制剂形式提供组合物，或者使组合物存在于天然或合成聚合物或树脂中。也可以快速注射剂(bolus)或贴剂的形式提供活性组合物。阴道内给予的本发明治疗用组合物，也可配制成供缓释之用，例如可以将组合物包衣、微囊化或用其它方法放入缓释给药装置中。这类制剂中所含的总活性成分占制剂重量的0.1-99.9％。
“药学上可接受的”是指与制剂的其它成分相容且对其受体无毒的载体、稀释剂、赋形剂和/或盐。
可以通过本领域已知方法，使用众所周知的易得成分，制备含本发明治疗用组合物的药物制剂。例如，组合物可与常用赋形剂、稀释剂或载体配制在一起，制成片剂、胶囊剂、溶液剂、混悬剂、粉剂、气雾剂等。适于这类制剂的赋形剂、稀释剂和载体的实例包括缓冲剂、以及填充剂和增量剂，例如淀粉、纤维素、糖、甘露醇和硅衍生物。也可包括粘合剂，例如羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素及其它纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮。可包括保湿剂(例如甘油)、崩解剂(例如碳酸钙和碳酸氢钠)。也可包括延迟溶解的试剂，例如石蜡。也可包括吸收加速剂(例如季铵化合物)。可包括表面活性剂(例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯)。可添加吸附载体，例如高岭土和皂土。也可包括润滑剂(例如滑石粉、硬脂酸钙和硬脂酸镁)和固体聚乙烯醇。也可添加防腐剂。本发明的组合物也可含有增稠剂，例如纤维素和/或纤维素衍生物。它们也可含有树胶，例如黄原胶、瓜尔胶或carbo胶或阿拉伯胶，或者聚乙二醇、有机皂土和蒙脱土等。本发明的组合物也可含有其它维生素，例如维生素A、维生素B、维生素C或维生素D。在一个实施方案中，本发明的组合物也可含有芦荟。
本发明治疗用组合物也可制备成乳剂、混悬剂、含水或无水溶液剂或分散体，或者可以呈乳剂或混悬剂或软膏剂的形式，便于阴道内给药。活性组合物和其它成分可制成分散在油性或水性溶媒中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并且可含有配方剂(formulatory agent)，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性组合物和其它成分可以呈粉针剂形式，这是通过无菌固体的无菌分离或者通过由溶液冻干而制得的，这类粉针剂在临用前用合适溶媒(例如无菌、无热源水)来配制。
这些制剂可含有本领域众所周知的药学上可接受的载体、溶媒和辅料。除了水之外，还可以使用例如一种或多种选自以下的生理上可接受的有机溶剂来配制溶液剂：丙酮、乙醇、异丙醇、乙二醇醚(例如以商品名“Dowanol”销售的产品)、聚乙二醇和聚氧乙烯、短链酸的C1-C4烷基酯、乳酸乙酯或乳酸异丙酯、脂肪酸甘油三酯(例如以商品名“Miglyol”销售的产品)、豆蔻酸异丙酯、动物油、矿物油和植物油以及聚硅氧烷等。
必要时，可以添加以下辅料：抗氧化剂、表面活性剂、其它防腐剂、成膜剂、角质软化剂或粉刺药、香料、矫味剂和着色剂。可以添加抗氧化剂，例如叔丁基对苯二酚、丁羟茴醚、丁羟甲苯和α-生育酚及其衍生物。
此外，组合物也很适于配制成缓释剂型等。可以这样配制制剂，使得它们在一段时间内在雌性生殖系统中释放活性组合物。例如，可以用以下聚合物来制备包衣、包膜和保护性基质：聚交酯-羟乙酸酯、脂质体、微型乳剂、微粒、纳米粒或蜡。
对于阴道内给药，可以将治疗剂配制成本领域已知的制剂，供阴道部位直接使用。主要适于阴道使用的形式是例如乳膏剂、乳剂、凝胶剂、分散剂或微型乳剂、稠度不等的洗剂、浸渍垫(impregnatedpad)、软膏剂、气溶胶制剂(例如喷雾剂或泡沫剂)、乳膏剂、洗剂、贴剂、胶冻剂、喷雾剂和气雾剂。或者，组合物可配制成粘合聚合物的组成部分，例如聚丙烯酸酯或丙烯酸酯/乙酸乙烯酯共聚物。
软膏剂和乳膏剂可用例如水性或油性基质来配制，并添加合适的增稠剂和/或胶凝剂。洗剂可用例如水性或油性基质配制，并且通常还含有一种或多种以下的赋形剂：乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。可用加压包装方便地喷出液体喷雾剂，例如通过特殊形状的封口。也可通过例如美国专利第4,140,122号、第4,383,529号或第4,051,842号所公开的离子电渗疗法，给予活性组合物。本发明治疗剂在阴道制剂中的重量百分比将取决于各种因素，但通常范围为制剂总重量的0.01％-95％(重量)，通常为0.1-85％(重量)。
本发明的药物制剂可包括作为任选成分的药学上可接受的载体、稀释剂、增溶剂或乳化剂以及本领域可用的盐形式。这类物质的实例包括生理盐水溶液，例如生理缓冲盐溶液和水。用于本发明药物制剂的载体和/或稀释剂的具体的非限制性实例包括水和生理上可接受的缓冲盐溶液，例如磷酸缓冲盐溶液，pH约4.5至约5.5。
此外，活性成分也可与例如以下的其它治疗药联用：抗微生物药、镇痛药、消炎药、维生素(例如维生素A、B、C或D)、芦荟等，无论是用于所述病症还是其它病症。
本发明还涉及用于控制生殖和/或阴道干燥的包装药物组合物，例如药盒或其它容器。药盒或容器中装有治疗有效量的控制生殖和/或阴道干燥的药物组合物以及用于控制生殖和/或阴道干燥的药物组合物的使用说明书。药物组合物包括本发明的组合物，其用量是控制阴道干燥的治疗有效量。
另外，本发明提供阴道插入剂(insert)，所述插入剂可以控制方式释放维生素E、赤霉酸或茉莉酮酸。这类阴道插入剂可以是生物可降解的或者是生物不可降解的。阴道插入剂以合适速率提供持续释放的活性成分，以达到粘液分泌、基因表达和细胞增殖的所需水平。
在某些实施方案中，活性成分可以用油性基质或软膏来配制，以制成阴道插入剂。这类制剂包含活性成分和烃基半固体，其含有溶解的和/或悬浮的抑菌剂/防腐剂和缓冲系。在这些基质中的矿脂成分可以是粘度范围从矿物油至固体石蜡的任何石蜡，所述矿物油中使用了掺合的异丁烯、胶态二氧化硅或硬脂酸盐。这类体系的实例是白凡士林和黄凡士林。可以通过熔融，将高熔点蜡掺入到液体矿物油中，或者通过在高温下将聚乙烯掺入到矿物油中，来制备这类基质。聚硅氧烷(也称为硅酮)适用于这些基质，通常粘度范围在约0.5-10.sup.6厘沲。与聚硅氧烷连接的有机实体优选为各自具有1-8个碳的低分子量烃部分(例如低级烷基、低级烯基、苯基和烷基取代的苯基)以及苯基(低级)烷基(例如苄基)。在这一部分中，每个低级烷基或烯基优选具有1-3个碳(1和3也包括在内)，例如在二甲基硅氧烷聚合物中。
吸收基质可以与这样的油性体系一起使用。除了活性成分外，还可使用能够乳化大量水的其它成分。可以制成油包水(w/o)乳剂，其中外相是油性的。可以将防腐剂/抑菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、缓冲系等)掺入到这些基质中，作为与活性成分混合在一起的乳化水溶液。可便利地使用不同添加剂作为乳化剂，这些乳化剂包括但不限于胆固醇、羊毛脂(其含有胆固醇和胆固醇酯和其它乳化剂)、羊毛脂衍生物、蜂蜡、脂肪醇、羊毛蜡醇、低HLB(疏水物/疏油物平衡)乳化剂，以及各种离子型和非离子型表面活性剂，单独使用或联合使用。
油包水(W/O)乳剂基质可用于本发明的阴道插入剂。这些制剂可以扩充包括液体或乳膏在内的通用吸收基质。可以通过制备活性成分与油相成分、抑菌剂/防腐剂和溶解或悬浮于其中的缓冲盐的混合物，再向其中加入水，形成油包水乳液，从而制得这些制剂。
水包油(O/W)乳剂基质也可用于本发明的阴道插入剂。这些体系是半固体乳剂、微型乳剂或泡沫乳剂体系，其中含有甲硝唑。通常这样的体系具有“乳白色”外观。通常，内部油相占组合物重量百分比的范围为约10％至约40％的油，而外相可含有80％以上的水。油相可含有但不限于长链醇(鲸蜡醇、硬脂醇)、长链酯(肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯)、长链酸(棕榈酸、硬脂酸)、植物油、动物油和各种蜡。这些可以用阴离子型、阳离子型、非离子型或两性表面活性剂制备而成，或者尤其是用非离子型表面活性剂的组合制备而成。以下实例是这些体系的示例，但是本领域技术人员将会知道，本领域技术人员可以对具体成分进行替换和增加或删除。
含有活性成分的阴道插入剂和栓剂可以是例如油性组合物(在体温下可融化)，或者是基于聚乙二醇的组合物(溶解于阴道液体内)。栓剂的基它基质是甘油和甘油明胶。
活性成分也可用由胶凝剂制备的缓冲凝胶配制成阴道插入剂。这些胶凝剂的某些实例是：纤维素制品、阳离子型聚合物、聚氧化烯和羧基乙烯聚合物。用于本发明制剂的纤维素制品包括例如甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素和羟丙基纤维素。用于本发明制剂的阳离子型聚合物包括“Polyquaternium-10”，这是一种由羟乙基纤维素与三甲基铵-取代的环氧化物等反应而生成的聚合季铵盐。用于本发明制剂的聚氧化烯包括羊毛脂及其衍生物的聚氧乙烯-聚氧丙烯酯。用于本发明制剂的羧基乙烯聚合物包括交联丙烯酸聚合物，例如B.F.Goodrich Co.，Akron，Ohio的市售产品，商品名是CARBOPOLTM。
阴道插入剂可包括聚合物混合物或包衣，其可在延长的时间周期内、以恒定速率释放活性剂。在某些实施方案中，阴道插入剂包括水溶性发泡剂，例如聚乙二醇(PEG)，它可与水不溶性聚合物混合，延长插入剂的持久性并延长释放活性成分。该水溶性发泡剂可以是聚乙二醇、聚丙二醇、糖(乳糖、蔗糖、葡萄糖等)的混合物或聚合物、盐、泊洛沙姆、聚乙烯醇和其它水溶性食品级和其它赋形剂。
当PEG用作发泡剂时，PEG的分子量范围为约200至约20,000，或者约400至约8,000。例如，使用分子量约540至约8,000的PEG。在另一个实施方案中，PEG分子量为约1,000至约8,000或更高。对本发明制剂进行包衣的PEG的分子量取决于PEG形成不粘结、有足够强度并产生适当孔径的包衣膜的能力，以便在所需时间周期内、在体外和体内控制释放活性成分。
用于本发明制剂的发泡剂的用量能有效调节生物活性化合物以所需速率释放。优选发泡剂的有效量能长期释放活性剂，因而增加持续释放药物植入物的使用寿命。有效量的发泡剂取决于所需速率和释放周期，以及在包衣工艺中形成连续微孔膜的能力。为了能在更长时间周期中进行释放，使用具有更高分子量的PEG。例如当PEG8000的使用浓度为10-50％、优选20-45％和最优选30-45％时，可在超过100天的时间周期内进行释放。本文中的PEG浓度表示为每干基的％重量，并且表示干燥后包衣膜中的PEG浓度。同样，包衣膜的厚度为5-50μm，优选10-30μm，最优选15-25μm。
根据实施例所述的体外和体内研究，活性剂的溶出率和掺入到包衣膜中的发泡剂用量之间具有良好相关性。根据所需释放长度，PEG浓度范围可以按需进行调节。例如，可以根据活性剂在120小时时间点的体外溶出率，简单地预测包衣插入剂的体内持续周期。
本发明的阴道插入剂也可包含水不溶性聚合物。这类聚合物的实例是乙基纤维素、丙烯酸树脂、甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯的共聚物、聚乳酸、PLGA、聚氨酯、聚乙烯乙酸乙烯酯共聚物、聚苯乙烯-丁二烯共聚物和硅橡胶或其混合物。例如，可以使用商标名为AquacoatECD 30和Eudragit RS 30和NE 30D(Rhom Tech，Inc.的注册商标)的聚合物。
适用于本发明的聚合物是在与发泡剂的喷雾干燥工艺中能够形成连续包衣膜的聚合物。在植入过程中，控制由此类聚合物制成的膜的速率是非常稳定的。该膜应具有足够强度，以抵抗磨损和内部渗透压，并具有稳定性，在植入期间不会膨胀或发生水合作用。
在一个实施方案中，对本发明制剂进行包衣，用于将含有活性成分并压制成固体、生物可降解的插入剂的小丸包裹起来，然后给药，以刺激粘液分泌、基因表达和/或细胞增殖。
下面的非限制性实例用于进一步说明本发明。
实施例1：维生素E增加阴道细胞生长和粘液分泌
该实施例表明，在萎缩性阴道炎模型中，维生素E可以增加人宫颈上皮细胞生长并且增加粘蛋白-4的表达。
材料与方法
细胞培养。在37℃/5％CO2中，人宫颈上皮细胞(ME-180，ATCC)用含10％热灭活胎牛血清(Invitrogen)的McCoy氏5A培养基(Invitrogen)进行增殖。维生素E购自ICN Biomedicals。用无水乙醇配制维生素E贮液。
从ME-180细胞中提取RNA。按每T75瓶2×105细胞(15ml总体积)的浓度接种ME-180细胞，让该细胞增殖4天。第4天更换培养基。向ME-180细胞中加入15ml含有或不含10％FBS的McCoy氏5A培养基(含0或1μM维生素E)，一式两份。将ME-180细胞与这些溶液一起孵育24小时。弃去培养基，将1500μl裂解缓冲液加入到瓶内。用细胞刮刀将细胞从瓶壁刮下。按照制造商的说明书，使用Ambion RNAqueous试剂盒，分离RNA。将沉淀的RNA重悬于经DEPC处理过的水(含1μl RNA酶抑制剂)中。
RNA的反转录。在80℃，将约7μl RNA与3μl引物一起保温10分钟，然后立即放在冰上。配制含有4μlDEPC水、4μl 5x反应缓冲液、1μl dNTP、1μl RNA酶抑制剂和1μl反转录酶的混合母液(mastermix)，进行反应。将10μl混合母液加入到RNA/引物溶液中，在42℃放置2小时。在70℃，将所得cDNA与3.5μl NaOH溶液一起保温10分钟，水解残余RNA。加入5μl 0.5M Tris/EDTA以中和溶液。为了沉淀cDNA，加入125μl 3M NH4OAc、5μl直链聚丙烯酰胺和700μl无水乙醇。将溶液涡旋混合，在-20℃放置过夜。将样品以14000rpm在4℃离心30分钟。除去乙醇，将样品干燥10分钟。将cDNA重悬于10-12μl PCR级的水中。
聚合酶链式反应(PCR)。用Advantage 2PCR试剂盒(Ambion)配制混合母液，用于PCR反应，其中含有37-38μlPCR级的水、5μl10×PCR缓冲液、1μldNTP、1μl β-肌动蛋白引物(10μM，任选对照)和2μl试验引物(10μM，P2Y2或粘蛋白-4(MUC-4))。加入2毫升cDNA和1mlDNA聚合酶。循环条件如下：95℃5分钟；25-30次循环(95℃30秒，65℃1分钟，68℃3分钟)；68℃5分钟。
使用的PCR引物如下：
P2Y2-特异性引物(产生PCR产物为650bp)：
编码链：5′-TGTCTTCGCCCTCTGCTTCC-3′(SEQ ID NQ：1)
非编码链：5′-GTCAGGCCAGGGGTGTCATT-3′(SEQ ID NO：2)
β-肌动蛋白-特异性引物(PCR产物为300bp)：
编码链：5′-AGTCGGTTGGAGCGAGCATC-3′(SEQ ID NO：3)
非编码链：5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′(SEQ ID NO：4)
粘蛋白-4(MUC-4)特异性引物(PCR产物为800bp)：
编码链：5′-AGCCCAGGACTGTGGTCTGC-3′(SEQ ID NO：5)
非编码链：5′-GCTCACGTTCAGGGCTGTCA-3′(SEQ ID NO：6)
结果
将ME-180细胞与不同浓度的维生素E一起孵育3天。在10μM维生素E中，ME-180细胞生长受到抑制(数据未显示)。然而，这可能是因为培养基中存在较高浓度乙醇(用作维生素E的溶剂)所致。用同样含量的乙醇(没有维生素E)的阴性对照也显示出ME-180细胞未生长。在1μM维生素E中，与相应阴性对照相比，ME-180细胞生长增加。在100nM维生素E中，与阴性对照相比，细胞生长不受影响。因此，用浓度为1μM维生素E来测定24小时内RNA表达的变化。
在胎牛血清存在或不存在时，将ME-180细胞用0或1μM维生素E处理。本发明人的先期结果表明，在血清存在下，RNA表达很少有变化。然而，当去除血清时，ME-180细胞生长放缓，这是在阴道萎缩中观察到的结果。因此，在没有血清时维持ME-180细胞，可用作萎缩性阴道炎模型。
当用维生素E处理24小时后，从ME-180细胞中分离出RNA。用反转录，将RNA转化成cDNA，用作PCR反应的模板。在血清存在下，不出所料，观察到P2Y2或粘蛋白-4的表达没有显著变化(数据未显示)。
在没有血清时，用维生素E处理24小时后，ME-180细胞中粘蛋白-4的表达显著增加(图1)。在没有血清时，用维生素E处理24小时，导致在24个时间点，在P2Y2表达、DTR表达或VEGF表达上没有观察到差异(数据未显示)。然而，先前用维生素A的实验表明，在没有血清时约24小时后，ME-180细胞开始表达P2Y2。因此，可能在24小时孵育期间或之后发生变化，该变化在该实验中没有检出。
这些数据表明，在萎缩性阴道炎模型中，维生素E能够增加人宫颈上皮细胞生长以及增加粘蛋白-4的表达。因此，维生素E可用于治疗萎缩性阴道炎。
实施例2：维生素A影响宫颈细胞生长和基因表达
对ME-180宫颈细胞与几种浓度的维生素A衍生物之间的相互作用进行了研究，以确定维生素A衍生物是否会影响ME-180细胞生长和基因表达。
ME-180细胞的细胞增殖。将ME-180细胞与维生素A衍生物一起孵育至多3天。每天对ME-180细胞进行计数。这些实验的结果见图2和图3。
当使用极低浓度的维生素A时，几乎没有观察到对细胞生长的影响。例如，浓度为0.0nM(阴性对照)、1nM、10nM和100nM反-视黄酸、9-顺-视黄酸或13-顺-视黄酸对细胞生长几乎没有影响。然而，暴露给反-视黄酸的细胞看来比起暴露给其它试剂的细胞或无试剂的细胞(未暴露，阴性对照细胞)来说，生长稍微快一点。
因此，进行了另一个实验，使用视黄酸的浓度范围为100nM-10μM。如图2所示，用1μM或10μM反-视黄酸处理后，比不用视黄酸(阴性对照)处理后，存在更多细胞。这些数据表明，在培养中，反-视黄酸增加了ME-180细胞生长。相比之下，用13-顺-视黄酸处理的细胞以及阴性对照细胞均不生长，表明13-顺-视黄酸在微摩尔浓度时对ME-180细胞有毒性。
用聚合酶链式反应和ME-180cDNA的表达测定。ME-180细胞用1μM或10nM反-视黄酸(维生素A)处理24小时后，分离RNA。沉淀后，通过如上所述的反转录，将所得RNA作为DNA合成模板。再采用PCR技术，扩增新合成DNA，测定P2Y2受体基因转录的大致水平(约600bp PCR产物)。“管家基因”即保持恒定表达水平的基因也通过PCR进行扩增，用于比较。用P2Y2测定的管家基因是β-肌动蛋白(～300bp产物)。
如图3所示，加入对照β-肌动蛋白引物，导致合成约300bp cDNA产物，该产物在所有样品中大致等量存在。该结果说明，大致等量的模板RNA存在于所有样品中。然而，也如图3所示，P2Y2产物仅在第2、3和7道中可见，其中PCR模板是宫颈cDNA对照，ME-180细胞(没有维生素A)和ME-180细胞(分别没有维生素A或血清)。因此，在没有维生素A时，ME-180细胞中几乎不存在P2Y2mRNA。
然而，一旦将100nM维生素A加入到ME-180细胞中，就观察到在培养基中存在血清(图3，第4-6道)和没有血清(图3，第8-11道)的条件下，P2Y2表达都会增加。这些数据表明，低浓度维生素A可用于治疗萎缩性阴道炎。
也测定了在血清不存在时暴露给维生素A的细胞样品中也可影响萎缩性阴道炎的其它基因的表达。采用设计用于扩增雌激素受体α(ER-α)基因的引物，用来自经受血清饥饿的细胞的RNA进行PCR。在对照(图4，第2道)中可以观察到ER-α产物(650bp)，其中模板是来自无血清条件下培养的ME-180细胞的cDNA。在不含血清或维生素A的样品中，未检出表明ER-α基因表达的cDNA片段(第3道和第7道，图4)。然而，在暴露给100nM维生素A(但没有血清)达4小时、8小时和16小时的样品中，表达了ER-α基因(分别为第4-6道)。这些数据表明，在无血清条件下培养的宫颈上皮细胞中，维生素A可诱导ER-α的表达。在生殖道上皮细胞上雌激素受体数量增加，可以增加受体被雌激素活化的概率。
此外，用100nM维生素A处理ME-180细胞也增加了血管内皮生长因子(VEGF)的表达，VEGF是参与血管形成的重要因子。如图5所示，在用100nM维生素A处理的ME-180细胞中，检测到约700bp的VEGF特征性产物。
这些实验表明，维生素A(反-视黄酸)无毒性，可用于增加罹患萎缩性阴道炎的妇女的天然阴道水分。微摩尔浓度的维生素A就可增加宫颈细胞生长，这有助于强化阴道组织。维生素A的存在增加了宫颈上皮细胞的雌激素受体α、血管内皮生长因子和P2Y2受体基因的表达。这类表达上的增加，可有助于治疗萎缩性阴道炎症状。
实施例3：维生素A增加粘蛋白-4的表达
材料与方法
如上所述，从经0nM或100nM维生素A(没有血清)处理的ME-180宫颈细胞中分离RNA。将RNA反转录，得到cDNA，采用PCR技术(如上所述)，测定维生素A对粘蛋白-4(MUC-4)表达的影响。
结果
如图6所示，加入对照β-肌动蛋白引物，导致合成300bp的DNA产物，该产物在所有样品中大致等量存在。该结果表明，大致等量的模板RNA存在于所有样品中。然而，也如图6所示，MUC-4产物(800bp)存在于宫颈cDNA对照(第2道)中。在没有维生素A的ME-180细胞(图6，第3道)中，MUC-4产物不存在。然而，一旦将100nM维生素A加入到ME-180细胞中，就观察到在处理4小时或8小时后(图6，分别是第4道和第5道)可检出MUC-4的表达。用100nM维生素A处理16小时后(图6，第6道)，MUC-4表达下降，但仍可检出。这些数据表明，低浓度维生素A可增加MUC-4的表达，因此可用于治疗萎缩性阴道炎。
实施例4：对角质化细胞生长的刺激
该实施例提供的数据表明茉莉酮酸和赤霉酸对人皮肤角质化细胞的细胞增殖效果。
材料与方法
将来自Clonetics(Walkersville，MD，正常人表皮角质化细胞，新生儿，目录号cc-2503)的人皮肤角质化细胞细胞系，暴露给茉莉酮酸和赤霉酸(来自Sigma Chemical Co.)，测定对角质化细胞增殖的影响。所用的赤霉酸结构如下(赤霉素A3)。

在96孔测定系统中，用角质化细胞基础培养基(KBM，Clonetics，目录号CC-3103)作为对照，测定这些人皮肤角质化细胞对试验化合物的增殖反应。所有化合物都测试三个浓度：1×10-4M、1×10-5M和1×10-6M。将细胞接种在96孔板上，浓度为2×103细胞/100μl KBM。将板在37℃/增湿5％CO2气氛中孵育24小时。孵育后，将100μl1×10-4M、1×10-5M或1×10-6M茉莉酮酸和赤霉酸溶液分别加入到5个孔中。另外，将100μl溶媒KBM加入到5个孔中，作为对照。将板在37℃/增湿5％CO2气氛中孵育48小时。孵育后，将20μl Cell Titer 96Aqueous One Solution(Promega，Madison，WI)加入到所有的孔中。轻轻旋转板，放回培养箱达3小时。在490nm处读取各孔的分光光度吸收值。
用单因素ANOVA对数据进行统计学分析。认为P＜0.05具有显著性，而认为P＜0.0001是极显著，P＜0.001是非常非常显著。
结果
表1表明茉莉酮酸对人角质化细胞的细胞增殖的影响，其中茉莉酮酸的浓度在1×10-4M(称为JA4)、1×10-5M(称为JA5)和1×10-6M(称为JA6)之间变化。
表1：茉莉酮酸对细胞增殖的影响
  组别   点数   平均值   标准差   平均标准误   中位数   JA4   5   0.5732   0.02720   0.01216   0.5860   JA5   5   0.7628   0.03805   0.01702   0.7750   JA6   5   0.7734   0.06328   0.02830   0.7970   对照   5   0.5094   0.07334   0.03280   0.5050
表1所示数据表明，茉莉酮酸在较低浓度时具有强烈的细胞增殖活性(P＜0.001，在10-5M和10-6M的浓度下)。在较低浓度、而非较高浓度时对细胞增殖的影响更大。
表2表明赤霉酸对人角质化细胞的细胞增殖的影响，其中赤霉酸浓度在1×10-4M(称为GA4)、1×10-5M(称为GA5)和1×10-6M(称为GA6)之间变化。
表2：赤霉酸对细胞增殖的影响
  组别   点数   平均值   标准差   平均标准误   中位数   GA4   5   0.6512   0.01256   0.005616   0.6510   GA5   5   0.8184   0.04813   0.02152   0.8210   GA6   5   0.7854   0.04743   0.02121   0.7900   对照   5   0.5308   0.06833   0.03056   0.5220
表2所示数据表明，赤霉酸在所有浓度下都具有强烈的细胞增殖活性(P＜0.001，在所有浓度下)。在较低浓度、而非较高浓度时对细胞增殖的影响更大。
实施例5：对产生胶原蛋白的刺激
该实施例提供的数据表明茉莉酮酸和赤霉酸刺激胶原蛋白的产生。
采用由Panvera(Madison，WI)销售的Takara Biomedicals EIA测定试剂盒(TAK MK101)，测定茉莉酮酸和赤霉酸(赤霉素A3，式V)对人皮肤成纤维细胞系(Clonetics，Walkersville，MD，正常人皮肤成纤维细胞，新生儿，目录号CC-2509)产生胶原蛋白的刺激反应。先在96孔测定系统中，将细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)中，这两者都购自Sigma Chemical Co，St.Louis，MO。用无血清DMEM作为对照。所有化合物都测试三个浓度：1×10-4M、1×10-5M和1×10-6M。将细胞接种在96孔板上，浓度为5×103细胞/100μl含10％胎牛血清(FBS，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的DMEM。将板在37℃/增湿5％CO2气氛中孵育24小时。孵育后，吸出培养基，各孔用100μl无血清DMEM清洗两次。吸出最后的清洗液，将100μl 1×10-4M、1×10-5M或1×10-6M试验化合物溶液加入到孔内(对于每一浓度，n＝2)。另外，将100μl溶媒(无血清DMEM)加入到4个孔中，作为对照。将板在37℃/增湿5％CO2气氛中孵育48小时。
按照推荐，对取自96孔板各孔的20μl上清液进行测定。在进行测定前，新鲜配制标准缓冲液和终止液。向各孔中加入100μl抗体-POD缀合物溶液(随试剂盒供应)，用预先包被抗体的96孔板(随试剂盒供应)。将20μl标准液和测定液(来自其它装有成纤维细胞的96孔板)加入到合适的孔中。将板轻轻混合，密封，在37℃孵育3小时。
孵育后，各孔用PBS缓冲液(400μl)小心洗涤4次。洗涤后，将所有孔中的任何液体完全倒空。
向各孔中加入100μl底物溶液(过氧化氢和四甲基联苯胺缓冲液，随试剂盒供应)，将板孵育15分钟。在此时，将100μl终止液(新鲜配制的1N H2SO4)按照与底物相同顺序加入到各孔中。将板轻轻混合，在450nm处读取吸收值。
用单因素ANOVA对数据进行统计学分析。认为P＜0.05具有显著性，而认为P＜0.0001是极显著，P＜0.001是非常非常显著。
结果
表3表明暴露给不同浓度的茉莉酮酸和赤霉酸的人成纤维细胞的胶原蛋白产生情况。茉莉酮酸浓度在1×10-4M(称为JA4)、1×10-5M(称为JA5)和1×10-6M(称为JA6)之间变动。赤霉酸浓度在1×10-4M(称为GA4)、1×10-5M(称为GA5)和1×10-6M(称为GA6)之间变动。
表3：茉莉酮酸或赤霉酸对人成纤维细胞产生胶原蛋白的影响
  组别   点数   平均值   标准差   平均标准误   中位数   JA4   2   0.8040   0.009899   0.007000   0.8040   JA5   2   0.7895   0.006364   0.004500   0.7895   JA6   2   0.7475   0.007778   0.005500   0.7475   GA4   2   0.7780   0.01838   0.01300   0.7780   GA5   2   0.8365   0.04172   0.02950   0.8365   GA6   2   0.8630   0.008485   0.006000   0.8630   CNA5   4   0.7483   0.006238   0.003119   0.7495   对照   4   0.7388   0.01431   0.007157   0.7330
表3所示数据表明，茉莉酮酸和赤霉酸都可刺激人成纤维细胞产生胶原蛋白。赤霉酸对胶原蛋白产生的影响更大，尤其是在较低浓度、而非较高浓度下。然而，茉莉酮酸在较高浓度下强烈刺激胶原蛋白的产生。
实施例6：对产生纤连蛋白的刺激
该实施例提供的数据表明茉莉酮酸和赤霉酸对产生纤连蛋白的影响。
材料与方法
采用由Panvera(Madison，WI)销售的Takara Biomedicals EIA测定试剂盒(TAK MK115)，测定茉莉酮酸和赤霉酸(赤霉素A3，式V)对人皮肤成纤维细胞系(Clonetics，Walkersville，MD，正常人皮肤成纤维细胞，新生儿，目录号CC-2509)产生纤连蛋白的刺激反应。先在96孔测定系统中，将细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)中，这两者都购自Sigma Chemical Co，St.Louis，MO。用无血清DMEM作为对照。所有化合物都测试三个浓度：1×10-4M、1×10-5M和1×10-6M，一式两份。将细胞接种在96孔板上，浓度为1×104细胞/100μl含10％胎牛血清(FBS，Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)的DMEM。将板在37℃/增湿5％CO2气氛中孵育48小时。孵育后，吸出培养基，各孔用100μl无血清DMEM清洗两次。吸出最后的清洗掖，将100μl 1×10-4M、1×10-5M或1×10-6M试验化合物溶液以及100μl无血清DMEM一起加入到孔内(对于每一浓度，n＝2)。另外，将100μl溶媒(无血清DMEM)加入到2个孔中，作为对照。将板在37℃/增湿5％CO2气氛中孵育48小时。
按照推荐，用取自96孔板各孔的100μl上清液进行纤连蛋白测定。在进行测定前，新鲜配制标准缓冲液和终止液。用预先包被抗体的96孔板(随试剂盒供应)转移试验样品和对照。将板轻轻混合，密封，在37℃孵育1小时。除去样品液后，洗涤所有孔，用洗涤缓冲液洗涤3次(300μl)。向各孔中加入100μl抗体-POD缀合物溶液。混合板，密封并于37℃孵育1小时。取出溶液，将各孔用洗涤缓冲液洗涤3次。洗涤后，将所有孔中的任何液体完全倒空。向各孔中加入100μl底物溶液(过氧化氢和四甲基联苯胺缓冲液)，将板在室温下孵育15分钟。将100μl终止液(新鲜配制的1N H2SO4)按照与底物相同顺序加入到各孔中。将板轻轻混合，在450nm处读取吸收值。
用单因素ANOVA对数据进行统计学分析。认为P＜0.05具有显著性，而认为P＜0.0001是极显著，P＜0.001是非常非常显著。结果
表4表明暴露给不同浓度的茉莉酮酸或赤霉酸的人成纤维细胞的纤连蛋白产生情况。
表4：数据总结
  组别   点数   平均值   标准差   平均标准误   中位数   JA4   2   0.2060   0.002828   0.002000   0.2060   JA5   2   0.2025   0.0007071   0.0005000   0.2025   JA6   2   0.1955   0.0007071   0.0005000   0.1955
  组别   点数   平均值   标准差   平均标准误   中位数   GA4   2   0.2150   0.005657   0.004000   0.2150   GA5   2   0.2090   0.004243   0.003000   0.2090   GA6   2   0.2225   0.002121   0.001500   0.2225   对照   2   0.1660   0.004243   0.003000   0.1660
茉莉酮酸浓度在1×10-4M(称为JA4)、1×10-5M(称为JA5)和1×10-6M(称为JA6)之间变动。赤霉酸浓度在1×10-4M(称为GA4)、1×10-5M(称为GA5)和1×10-6M(称为GA6)之间变动。
与对照相比，统计所有3种化合物在所有试验浓度下对产生纤连蛋白的刺激作用。由此得知，茉莉酮酸和赤霉酸都能有效刺激人成纤维细胞产生纤连蛋白。
实施例7：增强人皮肤的更新
该实施例提供的数据表明，含有茉莉酮酸或赤霉酸的组合物可以增加健康雌性志愿者的皮肤更新速率。
角质层更新时间是总厚度的角质层脱落并被来自分裂表皮的新细胞置换所花费的时间。该更新时间是皮肤健康的基本指征。先前的工作已经证明，可以使用与无活力表皮细胞紧密结合的荧光标记染料来浸渍皮肤，非侵入性地测定角质层的更新时间。参见Jansen LH，Hojyo-Tomoko MT，Kligman AM.，Improved fluorescence stainingtechnique for estimating turnover of the human stratum corneum(改进的用于估计人角质层更新的荧光染色技术)，Br J Dermatol，90，9-12，1974；Ridge BD，Batt MD，Palmer HE，Jarrett A，The dansyl chloridetechnique for stratum corneum renewal as an indicator of changes inepidermal mitotic activity following topical treatment(角质层更新作为局部治疗后表皮有丝分裂活性变化指标的丹磺酰氯技术)，Br JDermatol，118，167-74，1988；Grove GL，Kligman AM，Age-associatedchanges in human epidermal cell renewal(人表皮细胞更新中的衰老相关变化)，J Geron.，38，137-142，1983。因此，染料消失所需时间就成为角质层更新的标志。因此我们认为，在处理和未处理位点上染料消失所需的时间差异，反映出产品增加表皮更新的能力。
材料与方法
在43-64岁健康女性志愿者中，进行丹磺酰氯细胞更新研究。该项研究由两周治疗期组成，在这段时间内，将产品每天(包括周末)两次局部施用于试验部位。用药部位是指定的，约5cm×10cm，在上臂内侧。另一臂不施用产品，作为对照。茉莉酮酸(JA)和赤霉酸(GA，赤霉素A3，式V)两种化合物均以0.25％的透明质酸(0.5％水溶液)的浓度单独进行试验。8名女性接受茉莉酮酸，7名女性接受赤霉酸。
用标记染料消失所需时间来测定细胞更新速率。这些数据见表
表5：经茉莉酮酸(JA)、赤霉酸(GA)或对照处理的皮肤的细胞更新时间
  JA患者  #   对照  (天)   JA更新  (天)   GA患者  #   对照  (天)   GA更新  (天)   1   27   12   1   20   14   2   26   12   2   26   21   3   17   16   3   19   14   4   20   15   4   15   12   5   20   17   5   19   19   6   17   14   6   20   17   7   17   15   7   14   12   8   14   11
如表5中的数据所示，当使用0.25％茉莉酮酸(JA)或0.25％赤霉酸(GA)的组合物时，与未接受治疗的对照皮肤相比，皮肤细胞更新所需时间显著缩短。茉莉酮酸的总体细胞更新率比对照快28％，赤霉酸比对照快20％(图7)。在任何研究志愿者中，没有可见的任何皮肤刺激或发红现象。
已经报道α羟基酸类化合物(例如乙醇酸)能缩短细胞更新时间。此外，用α羟基酸进行治疗，通常伴有不想要的副作用，例如皮肤刺激和发红。本发明的组合物可满足目前对皮肤细胞更新的抗衰老组合物的需求，所述组合物不引起不想要的副作用而且对皮肤无刺激。
实施例8：茉莉酮酸增加上皮细胞生长
该实施例说明茉莉酮酸能增加宫颈上皮细胞的细胞增殖。
材料与方法
在37℃/5％CO2中，将人宫颈上皮细胞(ME-180，ATCC)在含有10％热灭活胎牛血清(Invitrogen)的McCoy氏5A培养基(Invitrogen)中培养增殖。将茉莉酮酸(Sigma)用ME-180培养基稀释至100微克(μg)/ml、10μg/ml和1μg/ml。在较高浓度下，茉莉酮酸使培养基颜色变黄，表明pH对维持正常细胞生长来说过低。
将ME-180细胞接种在12个孔板上，浓度为5×104细胞/孔/2ml培养基。让细胞生长1天。用胰酶消化，然后用血细胞计数器对3个孔内的细胞进行计数，以确定在第0天时的细胞数。取出所有其它孔内的培养基，更换为新鲜培养基，培养基(2ml)中含有100μg/ml、10μg/ml或1μg/ml茉莉酮酸，一式三份。在第1天和第2天对细胞进行计数，测定茉莉酮酸对细胞生长的影响。
结果
如图8和图9所示，孵育后2天，茉莉酮酸增加上皮细胞生长。因此，茉莉酮酸以及其它植物激素可用于治疗萎缩性阴道炎。
参考文献
本文所引用的这些参考文献和其它参考文献都通过引用全部结合到本文中。
美国专利第6,264,975号，发明名称为“Methods of hydratingmucosal surfaces(粘膜表面的水合方法)。”
美国专利第5,981,506号、第5,972,904号、第5,958,897号、第5,789,391号，发明名称为“Method of treating sinusitis with UTPs andother related compounds(用UTP和其它相关化合物治疗鼻窦炎的方法)。”
美国专利第6,277,855号，发明名称为“Method of treating dry eyedisease with nicotinic acetylcholine receptor agonists(用烟碱乙酰胆碱受体激动剂治疗干眼病的方法)。”
美国专利第6,200,981号，发明名称为“Pyrimidine derivatives(嘧啶衍生物)。”
美国专利第6,107,091号，发明名称为“Antisense inhibition ofG-alpha-16-expression(G-α-16表达的反义抑制)。”
美国专利第5,837,861号，发明名称为“Dinucleotides and their useas modulators of mucociliary clearance and ciliary beat frequency(二核苷酸及其作为粘液纤毛清除和纤毛差频调节剂的用途)。”
美国专利第5,985,849号，发明名称为“Phosphate compounds andtheir use as medicaments(磷酸酯化合物及其作为药物的用途).”
美国专利第6,107,297号，发明名称为“2，4-Dithi(oxo)-pyrimidin-5-yl compounds bearing a tricyclic substituent useful as P2purinoceptor antagonists(用作P2嘌呤受体拮抗剂的带有三环取代基的2，4-二硫(氧)-嘧啶-5-基化合物)。”
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本说明书引用或提及的所有专利和出版物都表明本发明所属领域技术人员的水平，并且这些引用的专利或出版物分别通过引用结合到本文中，其程度与每篇参考文献都通过引用全部结合到本文中一样。申请人保留将来自这些引用的专利或出版物的任何和所有材料和信息结合到本说明书中的权利。
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其它实施方案是在所附权利要求书范围之内。另外，当按照马库什要素描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员能理解，马库什要素中的各成员或各成员组同样为本发明的组成部分。