用于水产养殖的可口服给药的免疫刺激产品
阅读：822发布：2020-05-11
专利汇可以提供用于水产养殖的可口服给药的免疫刺激产品专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及可口服 给药 的免疫刺激产品，其包含微囊化的细胞因子和用于保护所述细胞因子的肠保护 聚合物 ，所述细胞因子是鱼类、软体动物或甲壳类动物的细胞因子，优选重组细胞因子，例如在宿主 微 生物 中过度表达的 肿瘤 坏死 因子α(TNFα)。，下面是用于水产养殖的可口服给药的免疫刺激产品专利的具体信息内容。
1.可口服给药的免疫刺激产品，其至少包含微囊化的细胞因子和肠保护聚合物，其中所述细胞因子是鱼类细胞因子、或软体动物细胞因子或甲壳类动物细胞因子。
2.如权利要求1所述的免疫刺激产品，其中所述细胞因子是重组细胞因子。
3.如权利要求2所述的免疫刺激产品，其特征在于所述微囊化的重组细胞因子是肿瘤坏死因子α(TNFα)。
4.如权利要求2所述的免疫刺激产品，其特征在于所述微囊化的重组细胞因子在宿主微生物中过度表达，所述宿主微生物是酵母。
5.如权利要求4所述的免疫刺激产品，其特征在于所述酵母是巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)。
6.如权利要求1-5中任一项所述的免疫刺激产品，其特征在于所述细胞因子源自适于水产养殖的海洋生物，例如：金头鲷(Sparus aurata)、狼鲈(Dicentrarchus labrax)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、瘤棘鲆(Psetta maxima)、细点牙鲷(Dentex dentex)、尖吻重牙鲷(Diplodus puntazzo)、黑斑小鲷(Pagellus bogaraveo)、大西洋白姑鱼(Argyrosomus regius)、欧洲鳗鲡(Anguillaanguilla)、章鱼(Octopus sp.)。
7.如前述任一项权利要求所述的免疫刺激产品，其特征在于将所述产品饲喂给多细胞生物。
8.如权利要求7所述的免疫刺激产品，其中所述多细胞生物是卤虫(Artemia sp.)或轮形动物(phylum Rotifera)。
9.如前述任一项权利要求所述的免疫刺激产品，其特征在于用肠保护聚合物将所述细胞因子和/或所述包含所述重组细胞因子的宿主微生物微囊化。
10.制备如权利要求2所述的免疫刺激产品的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
-从鱼类、软体动物或甲壳类动物的组织中选择并分离编码所选细胞因子的cDNA，-在至少一种用于在至少一种适合的宿主微生物中表达细胞因子的表达载体中克隆所述cDNA，
-培养所述宿主微生物的宿主细胞，获得重组细胞因子或包含所述重组细胞因子的宿主微生物培养物，
-将所述重组细胞因子或所述包含所述重组细胞因子的宿主微生物微囊化，获得微囊化的重组细胞因子或微囊化的包含所述重组细胞因子的宿主微生物。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于所述宿主微生物是选自巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的酵母。
12.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于所述微囊化步骤是通过在肠保护聚合物的存在下经喷雾干燥实施雾化来进行的。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于所述肠保护聚合物选自：醋酸纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基纤维素邻苯二甲酸酯、羧甲基纤维素、甲基丙烯酸共聚物、麦芽糊精、壳聚糖、明胶、淀粉、阿拉伯胶。
14.如权利要求1-9中任一项所述的可口服给药的免疫刺激产品用于在水产养殖中免疫刺激鱼类、软体动物或甲壳类动物的用途。
15.如权利要求14所述的免疫刺激产品的用途，其中所述细胞因子源自所要免疫刺激的相同的鱼类、软体动物或甲壳类动物物种。
16.如权利要求14或15所述的用途，其中所述鱼类、软体动物或甲壳类动物选自：金头鲷、狼鲈、虹鳟、瘤棘鲆、细点牙鲷、尖吻重牙鲷、黑斑小鲷、大西洋白姑鱼、欧洲鳗鲡、章鱼。
17.如权利要求14-16所述的用途，其中所述免疫刺激是通过在饲喂期间将所述产品与食物共同给药来进行的。
18.如权利要求14-16所述的用途，其特征在于所述免疫刺激是通过以下步骤进行的：
将所述免疫刺激产品向多细胞生物给药，获得富集的多细胞生物，并随后向所述物种饲喂所述富集的多细胞生物。
19.如权利要求18所述的用途，其中所述多细胞生物是卤虫或轮形动物。
20.富集有可口服给药的免疫刺激产品的多细胞生物，所述免疫刺激产品至少包含微囊化的鱼类、软体动物或甲壳类动物的细胞因子。
21.如权利要求1-9中任一项所述的可口服给药的免疫刺激产品作为疫苗佐剂的用途。
22.如权利要求1-9中任一项所述的免疫刺激产品，其还包含用于鱼类、软体动物或甲壳类动物的疫苗。
23.如权利要求22所述的免疫刺激产品，其中将所述疫苗与所述细胞因子微囊化。
用于水产养殖的可口服给药的免疫刺激产品
[0001] 发明背景
[0002] 水产养殖似乎是满足渔业(extractive fishing)所无法满足的不断增长的水产食品需求的唯一可能。在过去的50年间，全世界的水产养殖产量已由50年代早期的不足100万吨的产量提高到2004年的5940万吨。该产量水平的价值为703亿美元。全世界总产量的69.6％产于中国，21.9％产于亚洲其它地区和太平洋地区，3.5％产于西欧地区，并且0.4％产于中东欧地区。在环境方面，2004年来自海水养殖(咸水水产养殖)的水产产量为3020万吨，占总产量的50.9％。淡水水产养殖提供2580万吨(43.4％)，而其余340万吨(5.7％)来自半咸水(brackish)环境的产量。所有数据均来自于FisheriesTechnical Paper 2006，State of World Aquaculture(FAO)。
[0003] 欧洲的水产产量仅占世界产量的3％，但在数个种类的生产方面处于领先地位，例如大西洋鲑鱼、鳟鱼、海鲈、金头鲷(gilthead seabream)、大菱鲆和贻贝。2002年的产量超过130万吨，价值32.8亿欧元。地中海国家中最重要的物种是金头鲷、海鲈和大菱鲆。2002年，金头鲷和海鲈二者的产量为181000吨，主要产地为希腊、土耳其、西班牙、意大利和法国。大菱鲆在2002年的产量为5320吨，其中75％产自西班牙。所有数据均来自FAO。
[0004] 鱼类疾病已经成为水产养殖的障碍，并且正对世界上很多国家的经济发展造成严重影响。疾病在很多情况下导致高死亡率，并且是重大产量损失的原因。水产损失还导致食物供应减少、收入和就业损失以及各种相关的社会后果。影响上述物种的最常见疾病及其病原(causal agent)(细菌或病毒)为：弧菌病(弧菌属美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselaesubsp.damselae，Vibrio spp.))、巴斯德菌病(美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacterium damselae subp.piscicida))、发光杆菌病(photobacteriosis)(美人鱼发光杆菌巴斯德菌亚种(Photobacterium damselae subp.pasteurella))、屈挠杆菌病(flexibacteriosis)(海洋屈挠杆菌(Tenacibaculum maritimum))、分 枝 杆 菌 病 (myxobacteriosis)(海 岸 屈 挠 杆 菌(Flexibacter maritimus))、疖病(杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida))、链球菌病(副乳房链球菌(Streptococcusparauberis))、冬季疾病综合症(病鳝假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica))、病毒性脑病和视网膜病(viral encephaloretinopathy)(野田村病毒(Nodavirus))、淋巴囊肿(虹膜病毒科(Iridoviridae))、肠胀气综合症(distendedgut syndrome)(病毒样颗粒)、感染性胰腺坏死(IPNV)、感染性造血组织坏死(IHNV)或病毒性出血性败血症(VHS)。所有数据均来自Cultured AquaticSpecies Information Programme(FAO)。
[0005] 水产养殖场中物种的养殖条件(即高密度的动物或水生环境)适合于传染性病原(disease agent)在个体之间的传播。此外，养殖场中的鱼类在对其处理(manipulation)期间产生的应激可能导致免疫系统抑制，所述免疫系统的抑制促进病原体的感染。因此，已在疫苗或免疫刺激产品的研发中投入大量研究精力以预防鱼类疾病。由于避免了抗生素在水产养殖中的大量使用，疾病的预防还减少了对环境的影响。现已有数种产品用于鱼类的疫苗接种或免疫系统刺激。实际上，已有可用于普通细菌性鱼类疾病(例如弧菌病、发光杆菌病、疖病、屈挠杆菌病、冬季疾病综合症或链球菌病)以及可用于普通病毒性鱼类疾病(例如IPNV或IHNV)的疫苗(参见Toranzo等人，2005和Sommerset等人，2005的综述)。
[0006] 疫苗接种有三种常见方法：浸渍、注射和口服给药。腹膜内注射是最有效的疫苗接种途径，这是因为其允许更好的剂量控制，并且可使用产生更好免疫应答的佐剂。但是，由于对鱼类的镇静和处理可能导致动物的应激，并且可能在疫苗给药不谨慎时对鱼类造成伤害，所以注射途径也存在一些缺点。此外，无法通过此途径对小鱼进行疫苗接种。由于简单快速，所以养殖场常使用浸渍法，但该方法不能进行严格的剂量控制，并且使鱼类产生应激并具有顽固的免疫系统抑制。疫苗的口服给药不需要对鱼类进行处理，并且是适合于对所有大小的动物进行免疫接种的方法，所述动物包括开始进食的幼鱼，由于这些鱼更易于被病原体感染，所以这一点非常重要。口服途径的几个缺点在于不能进行严格的剂量控制，并且需要大量抗原以进行免疫。口服给药的最大障碍是抗原常因酸性环境或蛋白酶活性而在肠中失活，并且阻止活性抗原的肠吸收。因此，有效的口服给药需要对抗原进行保护(即包封)，以防止抗原在肠中降解(Hart等人，1988；Quentel和Vigneulle，1997)。用于保护抗原免于降解的不同方法已显示出一些具有前景的结果，例如包埋在脂质体或藻酸盐微粒中(Ire等人，2005；Maurice等人，2004)。
[0007] 现有技术描述
[0008] 在水产养殖中使用免疫刺激剂(immunostimulant)以提高鱼类对疾病的抵抗力。已记载了很多不同免疫刺激剂的化学性质和作用方式，所述免疫刺激剂例如细菌的结构元件(LPS)、来自细菌和丝状真菌的各种β-1，3葡聚糖产物、来自酵母细胞壁的β-1，3/1，6葡聚糖、来自多种生物来源的复杂碳水化合物结构(葡聚糖)、存在于某些动物的提取物中或通过鱼类蛋白的酶解而制备的肽、核苷酸、合成产品(左旋咪唑)和维生素C(参见Raa，
1996的综述)。所用的某些免疫刺激剂还增强特异性抗体反应(参见Sakai，1999的综述)。水产养殖中的数种情形适合于免疫刺激剂的使用，例如对鱼类的处理、水温变化、较高的病原体暴露、疫苗佐剂和所有应激状态。现已公布了关于免疫刺激剂在金头鲷免疫系统中的作用的多项研究，所述免疫刺激剂例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞壁( 等人，2002；Rodríguez等人，2003)、壳多糖(Esteban等人，2000；Esteban等人，
2001；Cuesta等人，2003)、维生素C和E(Cuesta等人，2002； 等人，2003)和左旋咪唑(Mulero等人，1998；Cuesta等人，2002)。在已知对鱼类有效的免疫刺激剂中，葡聚糖、壳多糖和左旋咪唑增强吞噬活性，而酵母葡聚糖和维生素C还激活补体活性。现已公开了将B-1，3/1，6葡聚糖作为免疫刺激剂应用的数项研究，并且在涉及提高大比目鱼幼体在其发育关键期的存活率(Ottesen，Lunde和Engstad，1999)、增强对细菌性疾病的抵抗力(Raa等人，1990；Robertsen等人，1990)以及增强疫苗功效(Raa等人，1990；Rorstad，Aasjord和Robertsen，1993)的方面取得良好结果。
1996的综述)。所用的某些免疫刺激剂还增强特异性抗体反应(参见Sakai，1999的综述)。水产养殖中的数种情形适合于免疫刺激剂的使用，例如对鱼类的处理、水温变化、较高的病原体暴露、疫苗佐剂和所有应激状态。现已公布了关于免疫刺激剂在金头鲷免疫系统中的作用的多项研究，所述免疫刺激剂例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞壁( 等人，2002；Rodríguez等人，2003)、壳多糖(Esteban等人，2000；Esteban等人，
2001；Cuesta等人，2003)、维生素C和E(Cuesta等人，2002； 等人，2003)和左旋咪唑(Mulero等人，1998；Cuesta等人，2002)。在已知对鱼类有效的免疫刺激剂中，葡聚糖、壳多糖和左旋咪唑增强吞噬活性，而酵母葡聚糖和维生素C还激活补体活性。现已公开了将B-1，3/1，6葡聚糖作为免疫刺激剂应用的数项研究，并且在涉及提高大比目鱼幼体在其发育关键期的存活率(Ottesen，Lunde和Engstad，1999)、增强对细菌性疾病的抵抗力(Raa等人，1990；Robertsen等人，1990)以及增强疫苗功效(Raa等人，1990；Rorstad，Aasjord和Robertsen，1993)的方面取得良好结果。
[0009] 由于细胞因子调控重要生物过程(例如细胞生长、细胞活化、炎症、免疫力、组织修复、纤维化和形态发生)的量，所以细胞因子是属于广义概念的“免疫调节剂”的蛋白质。细胞因子是共享数种性质的不同种类的蛋白质，并且对于先天性及适应性免疫应答的介导效应期(mediate effectors phases)的发育和机能都至关重要。近几年已克隆了大量细胞因子，并在多个鱼类物种中进行测序(参见Bird等人，2002的综述)。可按照细胞因子的功能将其分成四类：
[0010] a)介导先天性免疫的细胞因子。在鱼类中得到最佳表征的此类细胞因子是包括IFNα和IFNβ的I型干扰素(IFN)，包括IL-1α、IL-1β、IL-1受体拮抗剂和IL-18的白细胞介素(IL-1)家族，以及包括TNFα、TNFβ、Ltβ和Fas配体的肿瘤坏死因子(TNF)家族，其中TNFα是在免疫系统中具有调控功能的最重要成员；
[0011] b)调控造血作用的细胞因子；
[0012] c)调控淋巴细胞的细胞因子；和
[0013] d)控制非特异性效应细胞的细胞因子。
[0014] 在鱼类中得到最佳表征的此类细胞因子是b)组中的白细胞介素2(IL-2)以及c)组中的干扰素γ(IFNγ)和转化生长因子β(TGFβ)。
[0015] TNFα是单核细胞/巨噬细胞在急性炎症期间产生的炎性细胞因子，并且负责细胞内不同范围的信号转导事件。TNFα在对抗寄生性、细菌性和病毒性感染中作为重要介质发挥作用(Czarniecki，1993；Goldfeld和Tsai，1996；Steinshamn等人，1996)。TNFα还具有其它重要的治疗功能，包括抗肿瘤(Vilcek和Lee，1991)、睡眠调节(Krueger等人，1998)和胚胎发育(Wride和Sanders，1995)。TNFα通过作为三聚体与细胞膜受体TNFR-1或TNFR-2结合来发挥这些功能(Dembic等人，1990；Loetscher等人，1990)，这两种受体均大量存在于大多数细胞中(Letscher等人，1991；Schoenfeld等人，1991)。
[0016] TNFαmRNA似乎在多种细胞中转录，并且主要以转录后水平受到调控(Han等人，1990)。TNFα以膜结合形式和可溶形式这两种形式存在，每种形式可能具有不同的生理作用(Watts等人，1997)。TNFα表达为26kDa的膜结合前体，其被解聚素金属蛋白酶(TACE:TNFα转化酶)溶蛋白性裂解，以产生17kDa的C端活性形式(Black等人，1997；
Moss等人，1997)。
Moss等人，1997)。
[0017] 已对数种哺乳动物的TNFα基因(TNFαgen)完全或部分测序，所述哺乳动物包括人(Pennica等人，1984)、黑猩猩(Kutsi等人，2002)、小鼠(Shirai等人，1988)、犬(Zucker等人，1994)或猫(McGraw等人，1990)。也已对数种鱼类的TNFα基因或TNFα基因片段测序，所述鱼类例如黑鲷(black seabream)(Cai等人，2003)、虹鳟(Laing等人，2001)、鲤鱼(Saeij等人，2003)或斑马鱼(Phelan等人，2003)或金头鲷(García-Castillo等人，2002)。
[0018] 金头鲷的TNFα基因具有4个外显子和3个内含子，长度为1244pb。cDNA由1359pb组成，其包括762pb的开放读码框(ORF)、142pb的5’-非翻译区(UTR)和455pb的3’UTR。推导蛋白具有253个氨基酸，估计分子量为28kDa，其(特别是在参与同受体相互作用的C-端末端)与其它鱼类的TNFα具有高序列同源性。TNFα蛋白包含在第37和第54残基之间的跨膜区以及与TACE溶蛋白性裂解相关的Thr-Leu保守序列(García-Castillo等人，2002)。因此，可以区分253个氨基酸的膜结合蛋白(proTNFα)和167个氨基酸的可溶蛋白(sbTNFα)。
[0019] 表达研究揭示TNFα在所检测的所有金头鲷组织(例如肝、腮、血液、头肾、腹膜渗出液、脑和脾)中的组成型表达，巨噬细胞是此分子的主要来源之一。
[0020] US 5871751公开了用于治疗对鲑鱼肾菌(Renibacterium salmoninarum)的感染敏感的鱼类的疫苗和方法。所述疫苗包括缺少完整细胞表面相关蛋白p57的灭活微生物，并可包被肠溶衣以供口服递送。所述肠溶衣包括聚合物包衣，其不在胃中溶解和/或降解，但在进入肠道的较高pH环境时溶解。所公开疫苗的优选实施方案是使用球形糖微球制成，其由包含缺少完整细胞表面相关蛋白p57的灭活微生物的第一层包被，随后由肠溶衣的第二层包被，所述第二层包含不在鱼类的胃中溶解和/或降解的材料。
[0021] WO 03/020040A1公开了由包封了含抗原的单细胞生物的多细胞生物组成的口服疫苗。此疫苗用于饲喂待接种疫苗的水生动物(例如鱼类)。根据WO 03/020040，通过两步饲喂将在单细胞微生物中表达的抗原递送到水生动物中，即将单细胞微生物(包含抗原)饲喂给多细胞生物以及将多细胞生物饲喂给水生动物。根据WO 03/020040，总是需要单细胞微生物和多细胞生物二者同时存在。待表达的抗原依赖于诱导的免疫应答是否针对目标病原体。WO 03/020040描述了作为细菌抗原的假单胞菌外毒素A(PE)、作为单细胞微生物的大肠杆菌(E.coli)、作为多细胞生物的卤虫无节幼体(Artemianauplii)。根据WO03/020040所公开的口服给药疫苗的制备，所选的抗原严格依赖于疫苗应当针对的目标病原体。
[0022] ES 2189608A1公开了用于生产重组金头鲷(Sparus aurata L.)IL-1β的方法及其在经济鱼类中作为疫苗佐剂和免疫刺激剂的用途。根据ES2189608，通过将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体中来生产重组IL-1β。将由此获得的重组蛋白纯化，并用作渔业养殖中的免疫刺激剂和疫苗佐剂。本发明的目的是提供适合于口服给药的免疫刺激产品，其不发生水解和/或降解，并可被所给药的生物完全吸收。
发明内容
[0023] 本发明的一目的是提供能够向目标个体直接给药的免疫刺激产品。
[0024] 本发明的另一目的是提供能够被生物吸收的免疫刺激产品，所述免疫刺激产品以大量的初始给药量向所述生物给药。
[0026] 本发明的目的还在于提供制备可口服给药的免疫刺激产品的方法，以及免疫刺激产品用于在鱼类水产养殖中激活免疫应答的用途。
[0027] 因此，本发明提供至少包含微囊化的重组鱼类细胞因子(特别是肿瘤坏死因子α(TNFα))的可口服给药的免疫刺激产品、制备包含微囊化重组鱼类细胞因子的可口服给药的免疫刺激产品的方法、及其用于在鱼类水产养殖中激活免疫应答的用途。
[0028] 本发明的一方面体现在充当免疫刺激剂的活性分子(即细胞因子，特别是肿瘤坏死因子α(TNFα))是属于期望激活其免疫应答的相同鱼类物种的细胞因子的事实。由于这样能够增强已属于某物种的一系列免疫刺激剂(immunostimulator)，从而激活该物种的免疫反应，因此这一方面非常重要。这意味着不通过任何方式向所述物种给药外源因子、化合物或产品，从而使所得结果具有极大的优势，并且获得较为安全的途径。
[0029] 如上所述，根据本发明，充当免疫刺激剂的活性分子是从鱼类本身获得的细胞因子，即肿瘤坏死因子α(TNFα)。因此，在提供免疫刺激产品时不会在动物中引入外源物质(strange substance)，并避免了副反应的可能性。
[0030] 根据本发明，从鱼类组织中分离编码所选细胞因子的基因，并将其克隆到用于在适合的宿主微生物中表达细胞因子的表达载体中。在生物反应器中使用适合的培养基培养宿主细胞，以获得最佳的细胞因子表达和高生物质产量。根据本发明的一优选实施方案，所述宿主微生物是酵母，优选巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和酿酒酵母，最优选巴斯德毕赤酵母。选择酵母作为宿主微生物不是偶然的，而是因为酵母是能够取决于所选的表达载体而在细胞外或细胞内表达所选细胞因子的真核微生物。这一方面使得能够决定如何表达重组蛋白，从而在发酵过程中以及在所得产品的纯化中提供多个优点。
[0031] 随后对所述重组蛋白(单独获得或在宿主微生物内获得)进行微囊化过程，由此在任选的纯化步骤后获得即可给药的微囊化蛋白。所述“微囊化过程”是指适合于为重组细胞因子提供至少部分包被的任何过程，所述包被适合于保护所述细胞因子免于肠降解。
[0032] 实际上，在口服给药免疫刺激物质的情况下，必须有有效的保护方法以避免所述物质的肠降解，并允许几乎完全的肠吸收。微囊化是使用聚合材料的连续薄膜环绕或包被液体或固体材料的极小液滴或颗粒，从而获得微粒的技术过程。微囊化技术广泛应用于多种生物和化学体系，并可生产大量的产品。根据本发明，用于对所关注及所选的细胞因子(特别是TNFα)成功实现微囊化的主要技术是通过喷雾干燥进行雾化。在通过喷雾干燥进行雾化的技术中，将活性分子溶解或悬浮在熔体或聚合物溶液中，并留在干燥颗粒中。根据本发明，用于保护重组蛋白微粒免受存在于肠中酸性pH影响的最有用的聚合物选自例如：醋酸纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基纤维素邻苯二甲酸酯、羧甲基纤维素、甲基丙烯酸共聚物(即甲基丙烯酸共聚物LS，例如Eudragit L-30和Kollicoat)。其它可用的聚合物选自例如：麦芽糊精、壳聚糖、明胶、淀粉或阿拉伯胶。
[0033] 在本发明中已使用TNFα作为在微生物中表达的细胞因子的实例，随后将其与多种聚合物混合以保护蛋白免受肠的酸性环境和蛋白酶活性的影响。当宿主微生物允许重组蛋白(即TNFα)在细胞外过度表达时，可以将其直接使用。另一优点在于，当所述蛋白在宿主微生物内过度表达时，对相同的微生物进行微囊化过程，从而获得能够直接使用并体现所有上述优点的微囊化微生物。通过喷雾干燥将所得的过度表达蛋白干燥，并添加到对健康鱼类具有有益效果的鱼食中。本发明开发的产品对水产市场具有重大意义，其预防感染所致的鱼类疾病、保护某些应激环境下的鱼类，并作为疫苗佐剂。
[0034] 根据本发明，由于微囊化过程而获得的优点，当所述免疫刺激产品用于成鱼的处理时，均可将其直接给药。反之，当所述免疫刺激产品用于小鱼或幼鱼的处理时，可将其饲喂给多细胞生物(例如卤虫无节幼体)，随后将易于被小鱼群食用的所述多细胞生物饲喂给小鱼。在上述两种情况下，所述免疫刺激产品的微囊化均使得能够安全地保持所述产品的主要特征和活性，从而产生巨大的优势。
[0035] 例如，现已将金头鲷的重组sbTNFα进行纯化，并在体内和体外测定其生物活性。重组蛋白在N-端末端包含六个组氨酸标记以用于亲和色谱纯化以及免疫印迹中的抗-多组氨酸mAb检测。腹膜内注射导致：a)引发腹膜渗出液和头肾(HK)白细胞的呼吸爆发；b)向注射位点快速募集吞噬粒细胞；以及c)在HK中诱导粒细胞生成。sbTNFα能够在体外诱导HK细胞的强烈增殖。
[0036] 本发明的另一优点体现在表达TNFα细胞因子的宿主微生物本身能够充当免疫刺激物质的额外来源的事实。实际上，细菌的某些结构元件(来自酵母细胞壁的葡聚糖或者来自多种生物来源的复杂碳水化合物结构(葡聚糖))可用作免疫刺激剂。
[0037] 现在通过以下实施例说明本发明，所述实施例是使用在水产养殖中具有重要意义的数个鱼类物种的TNFα进行的。然而，在实施本发明时，也可使用其它鱼类物种的TNFα以及其它细胞因子。然而，本发明也适用于提取的或通过合成获得的细胞因子。
[0039] 现在参考所附的以下非限制性实施例和附图更为详细地进一步公开本发明，其中：
[0040] 图1：显示用于基因构建体的引物。以斜体字显示EcoRI和BamHI限制位点。
[0041] 图2：包含金头鲷sbTNFα及推导蛋白序列的DNA片段。以斜体字显示BamHI限制位点。
[0042] 图3：包含金头鲷His6-sbTNFα及用于在巴斯德毕赤酵母中表达的推导蛋白序列的DNA片段。下划线标记6个CAT/C密码子和组氨酸。加重标记用于在巴斯德毕赤酵母中表达蛋白的共有序列中的ATG。以斜体字显示EcoRI和BamHI限制位点。
[0043] 图4：包含海鲈His6-sbTNFα及用于在巴斯德毕赤酵母中表达的推导蛋白序列的DNA片段。下划线标记6个CAT/C密码子和组氨酸。加重标记用于在巴斯德毕赤酵母中表达蛋白的共有序列中的ATG。以斜体字显示EcoRI和BamHI限制位点。
[0044] 图5：包含大菱鲆His6-sbTNFα及用于在巴斯德毕赤酵母中表达的推导蛋白序列的DNA片段。下划线标记6个CAT/C密码子和组氨酸。加重标记用于在巴斯德毕赤酵母中表达蛋白的共有序列中的ATG。以斜体字显示EcoRI和BamHI限制位点。
[0045] 图6：显示SDS-PAGE和使用抗多组氨酸mAb的蛋白质印迹法(分别为A和B)。箭头表示在1)大肠杆菌；2)酿酒酵母和3)巴斯德毕赤酵母中表达的金头鲷的His6-sbTNFα。
[0047] 图8：通过依赖鲁米诺化学发光显示由头肾白细胞产生的呼吸爆发活性。
[0048] 图9：头肾和肠中的数个炎性基因的mRNA水平。
[0049] 优选实施方案描述
[0050] 实施例1：金头鲷TNFα在大肠杆菌中的表达
[0051] 将sbTNFα克隆到pET15b中
[0052] 使用LPS刺激的头肾cDNA作为PCR中的模板，以使用引物FE4和RE5(图1)扩增sbTNFα。这两个引物都包含BamHI限制位点，用于随后在质粒pET15b(Novagen)的相同位点中克隆PCR产物。在包含cDNA模板、每种dNTP各50μM、0.2mM引物、含MgCl2的1X缓冲液PLUS和1单位Eco Taq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)的样品中进行扩增。在EppendorfMastercycler Gradient中进行循环反应，包括95℃2分钟的1个循环，95℃45秒、60℃45秒和72℃30秒的25个循环，以及随后72℃10分钟的1个循环。使用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)纯化PCR产物，并在室温下使用1单位的T4DNA连接酶(New England BioLabs，Inc.)以插入片段(insert)∶质粒＝3∶1的比例与质粒pGEM-T Easy(Promega)连接(ligate)16小时。使用连接混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布在包含氨苄西林和X-Gal(Sigma)的LB平板上。将平板在37℃下温育，并选择数个所得白色菌落以检测插入片段的存在，所述检测是通过用QIAprep SpinMiniprep Kit(Qiagen)分离质粒，并用BamHI消化来进行的。将包含插入片段(具有BamHI末端的sbTNFα；图2)的所选质粒命名为pVP81。使用10单位的BamHI消化此质粒和500ng的pET15b，从而释放pVP81的sbTNFα，并将pET 15b线性化。在低熔点琼脂糖(agarose low meelting)(Pronadisa)凝胶中电泳分离，然后使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)纯化插入片段和线性质粒二者，并在室温下使用1单位的T4DNA连接酶(New EnglandBioLabs，Inc.)连接16小时。使用连接混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布在包含氨苄西林的LB平板上。将平板在37℃下温育，并分离数个所得菌落的质粒，用BamHI消化以检测插入片段的存在，并用PvuII消化以检测插入片段的方向。使用ABI Prism 377基因分析仪(CIB，CSIC)对所选质粒进行测序。
[0053] 大肠杆菌的转化和表达试验
[0054] 使用包含sbTNFα的质粒pET15b转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，并将混合物涂布在包含氨苄西林的LB平板上。将数个所得菌落在LB-氨苄西林培养基中培养过夜。将培养物稀释到新鲜LB-氨苄西林中，然后在37℃下培养至OD600＝0.8，并在25℃或37℃下使用1mM异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG；Applichem)诱导0.25-4小时。通过离心
0.1ml诱导培养物(14000rpm)来检查全细胞提取物中的蛋白表达，并在SDS上样缓冲液中煮沸以溶解细胞团块(cell pellet)，以供SDS-PAGE分析和使用抗多组氨酸mAb(Sigma)的蛋白质印迹法。
0.1ml诱导培养物(14000rpm)来检查全细胞提取物中的蛋白表达，并在SDS上样缓冲液中煮沸以溶解细胞团块(cell pellet)，以供SDS-PAGE分析和使用抗多组氨酸mAb(Sigma)的蛋白质印迹法。
[0055] 实施例2：金头鲷sbTNFα在酿酒酵母中的表达
[0056] 将His6-sb TNFα克隆到p424-GPD中
[0057] 使用包含sbTNFα的质粒pET15b作为PCR中的模板，以使用引物TNF-ECOF和TNF-ECOR(图1)扩增包括613pb的His6-sbTNFα的片段。这两个引物都包含EcoRI限制位点，用于在质粒p424-GPD(ATCC 87357)的相同位点中克隆PCR产物。在包含5ng模板、2.5mM MgCl2、每种dNTP各50μM、0.2mM引物、1X High Speec添加剂、1X缓冲液PLUS和2单位Eco Taq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)的样品中进行扩增。在Smart Cycler II(Cepheid)中进行循环反应，包括95℃5分钟的1个循环，95℃30秒、62℃45秒和72℃2分钟的30个循环，以及随后72℃10分钟的1个循环。通过在包含0.5μg/ml溴乙啶的0.8％琼脂糖(Pronadisa)凝胶中进行电泳来分离PCR产物，并使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)进行纯化。在37℃下使用10单位的EcoRI(Fermentas)消化纯化片段和250ng p424-GPD，随后在22℃下使用5单位的T4DNA连接酶(Fermentas)进行连接。将连接反应转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并在含100μg/ml氨苄西林的LB平板上选择包含质粒的菌落。使用2X PCR Master Mix(Fermentas)和引物PRO-GPD和TER-GPD(图1)，通过菌落PCR鉴定重组体。使用QIAprep SpinMiniprep Kit(Qiagen)纯化包含His6-sbTNFα的所得质粒p424-GPD，并在使用EcoRI消化后检测插入片段的释放，并通过SmaI和NcoI消化检测插入片段的方向。
还使用ABI Prism 3130基因分析仪(University of Murcia)对质粒进行测序。
还使用ABI Prism 3130基因分析仪(University of Murcia)对质粒进行测序。
[0058] 酿酒酵母的转化和表达试验
[0059] 用于转化的酿酒酵母菌株为EGY48(Invitrogen)。为了制备用于转化的EGY48，将在YPD培养基(2％蛋白胨、1％酵母提取物、2％葡萄糖)中生长的OD600＝0.5的100ml培养物的细胞在4℃下以2500rpm离心5分钟。在用无菌水清洗(waste)的步骤后，将细胞重新悬浮于1X LiAc-TE(0.1M醋酸锂、10mM Tris pH 7.5、1mM EDTA pH 8.0)中。为了进行转化，将10μl 0.3μg/μl的DNA与50μl细胞和50μgDNA载体(预先煮沸的鲑鱼DNA)混合。随后将其加入到混合物(mix)1X LiAc-TE-PEG(如上文所述的LiAc-TE和PEG 40％)，并在30℃下温育30分钟，随后添加DMSO至10％，并在42℃下温育10分钟。将细胞涂布到MMSS+SDC-Trp(包含2％葡萄糖、0.17％酵母氮源、0.25％硫酸铵、1M山梨醇和SDC-Trp的基本培养基)平板上，在30℃下温育数天，直至出现菌落。SDC(合成葡萄糖补充剂(synthetic dextrosecomplete))包括20mg/l腺嘌呤、精氨酸、组氨酸、色氨酸和尿嘧啶，30mg/l亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸和异亮氨酸，50mg/l苯丙氨酸，200mg/l苏氨酸，150mg/l缬氨酸。
[0060] 为了检测His6-sbTNFα的表达，将数个菌落在YPD培养基或MM+SDC-Trp(包含2％葡萄糖、0.17％酵母氮源、0.25％硫酸铵和SDC-Trp的基本培养基)中培养数小时。为了检查蛋白表达，将全细胞提取物在Branson超声波仪150中以10个30秒的脉冲超声破碎，或者将其在珠磨式组织研磨器(bead beater)中以8个1分钟的脉冲用玻璃珠破碎。在处理后，通过离心收集细胞剩余物，并通过在SDS上样缓冲液中煮沸来对上清液进行His6-sbTNFα检测，以供SDS-PAGE分析和使用抗多组氨酸mAb(Sigma)的蛋白质印迹法。
[0061] 实施例3：金头鲷sbTNF在巴斯德毕赤酵母中的表达
[0062] 将His6-sb TNFα克隆到pPICZA中
[0063] 使用包含sbTNFα的质粒pET15b作为PCR中的模板，以使用引物TNF-ECOPP和TNF-ECOR(图1)扩增包括618pb的His6-sbTNFα的片段。这两个引物都包含EcoRI限制位点，用于在质粒pPICZA(Invitrogen)的相同位点中克隆PCR产物。在包含5ng模板、2.5mM MgCl2、每种dNTP各50μm、0.2mM引物、1X High Speec添加剂、1X缓冲液PLUS和2单位Eco Taq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)的样品中进行扩增。在Smart Cycler II(Cepheid)中进行循环反应，包括95℃5分钟的1个循环，95℃30秒、55℃45秒和72℃2分钟的30个循环，以及随后72℃10分钟的1个循环。通过在包含0.5μg/ml溴乙啶的0.8％琼脂糖(Pronadisa)凝胶中进行电泳来分离PCR产物，并使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)进行纯化。在37℃下使用10单位的EcoRI(Fermentas)消化纯化片段和200ng p424-GPD，随后在22℃下使用5单位的T4DNA连接酶(Fermentas)进行连接。将连接反应物转入大肠杆菌TOP10F’感受态细胞中，并在含25μg/ml博莱霉素(zeocin)(Invitrogen)的低盐LB平板上选择包含质粒的菌落。使用2X PCR MasterMix(Fermentas)和引物PIC5和PIC3，通过菌落PCR鉴定重组体。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)纯化包含His6-sbTNFα的所得质粒pPICZA，并通过用EcoRI消化检测插入片段的释放，并通过用XhoI消化检测插入片段的方向。还使用ABI Prism 3130基因分析仪(SACE，Universityof Murcia)对质粒进行测序。在重组质粒中，sbTNFα的起始密码子(star codon)ATG位于用于在酵母中进行外源基因表达的酵母共有序列AAAAATGTCT(图3)中(Romanos等人，1992)。此共有序列包含在引物TNF-ECOPP中。
[0064] 巴斯德毕赤酵母的电穿孔和表达试验
[0065] 在将巴斯德毕赤酵母电穿孔之前，通过在37℃下用SacI或PmeI消化来将包含His6-sbTNFα的质粒pPICZA线性化，以供随后在巴斯德毕赤酵母的基因组DNA中的重组及整合。使用MiniElute Reaction Cleanup Kit(Qiagen)纯化总量为5μg的线性质粒，并洗脱到10μl无菌水中。用于电穿孔的巴斯德毕赤酵母菌株为X-33。为了制备用于电穿孔的X-33，将OD600＝1.5的100ml培养物的细胞在4℃下以1500×g离心5分钟。在用无菌水清洗的2个步骤后，将细胞重新悬浮于1M山梨醇中，如前所述进行离心，并最后重新悬浮于1ml1M山梨醇中。为了电穿孔，将10μl DNA与80μl细胞混合，并转移到冰冷的0.2cm电穿孔管(electroporation cuvette，BioRad)中。温育5分钟，然后将细胞在MicroPulser电穿孔仪(BioRad)中在25μG、1.5kV和400Ω的条件下施以脉冲。随即向管中添加1ml冰冷的1M山梨醇，并将所得混合物在30℃下温育1小时。将细胞涂布到包含100μg/ml博莱霉素(Invitrogen)的YPDS平板上，在30℃下温育数天，直至出现菌落。使用引物PIC5和PIC3的PCR和2X PCR Master Mix(Fermentas)分析数个转化体是否存在插入片段，并测定His6-sbTNFα的表达。在所选的菌落中，使用Genomic DNA Purification Kit(Fermentas)分离基因组DNA，并使用EcoTaq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)扩增包含His6-sbTNFα的DNA片段，以使用ABI Prism 3130基因分析仪(SACE，University of Murcia)进行测序。
[0066] 在30℃和250rpm下，将带有His6-sbTNFα的重组巴斯德毕赤酵母菌株在包含甘油的25ml基本培养基中培养以产生生物质，随后进行甲醇诱导直至培养物达到OD600约为6。通过在3000×g下离心5分钟来收集细胞，并将团块重新悬浮于包含0.5％甲醇的200ml基本培养基中直至OD600约为1，以诱导表达。如前所述温育培养物，每24小时添加0.5％甲醇以维持诱导。在数个时间点收集样品以分析蛋白表达。为了检查蛋白表达，将全细胞提取物在Branson超声波仪150中以10个30秒的脉冲超声破碎，或者将其在珠磨式组织研磨器中以8个1分钟的脉冲用玻璃珠破碎。在处理后，通过离心收集细胞剩余物，并通过在SDS上样缓冲液中煮沸来对上清液进行His6-sbTNFα检测，以供SDS-PAGE分析和使用抗多组氨酸mAb(Sigma)的蛋白质印迹法。
[0067] 实施例4：海鲈sbTNFα在大肠杆菌中的表达
[0068] 将sbTNFα克隆到pET15b中
[0069] 使用得自肝的海鲈cDNA作为PCR中的模板，以使用引物FE4和RE5扩增sbTNFα。这两个引物都包含BamHI限制位点，用于随后在质粒pET15b(Novagen)的相同位点中克隆PCR产物。在包含cDNA模板、每种dNTP各50μM、0.2mM引物、含MgCl2的1X缓冲液PLUS和
1单位Eco Taq PLUSDNA聚合酶(Ecogen)的样品中进行扩增。在Smart Cycler(Cepheid)中进行循环反应，包括95℃5分钟的1个循环，95℃45秒、55℃45秒和72℃90秒的30个循环，以及随后72℃10分钟的1个循环。在0.8％琼脂糖凝胶(Pronadisa)中电泳分离，然后使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)纯化PCR产物。在37℃下使用10单位BamHI将纯化片段和质粒pET15b消化2小时，并在22℃下使用1单位T4DNA连接酶(Fermentas)将此前使用PCRPurification Kit纯化的DNA连接过夜。使用连接混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布在包含氨苄西林的LB平板上。将平板在37℃下温育，并使用2X PCR Master Mix(Fermentas)和引物T7F和T7R(图1)，通过菌落PCR鉴定重组体。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)分离数个所得菌落的质粒，用BamHI消化检测插入片段的释放，并用PvuII消化检测插入片段的方向。使用ABI Prism 3130基因分析仪(SACE，University of Murcia)对重组质粒进行测序。
1单位Eco Taq PLUSDNA聚合酶(Ecogen)的样品中进行扩增。在Smart Cycler(Cepheid)中进行循环反应，包括95℃5分钟的1个循环，95℃45秒、55℃45秒和72℃90秒的30个循环，以及随后72℃10分钟的1个循环。在0.8％琼脂糖凝胶(Pronadisa)中电泳分离，然后使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)纯化PCR产物。在37℃下使用10单位BamHI将纯化片段和质粒pET15b消化2小时，并在22℃下使用1单位T4DNA连接酶(Fermentas)将此前使用PCRPurification Kit纯化的DNA连接过夜。使用连接混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布在包含氨苄西林的LB平板上。将平板在37℃下温育，并使用2X PCR Master Mix(Fermentas)和引物T7F和T7R(图1)，通过菌落PCR鉴定重组体。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)分离数个所得菌落的质粒，用BamHI消化检测插入片段的释放，并用PvuII消化检测插入片段的方向。使用ABI Prism 3130基因分析仪(SACE，University of Murcia)对重组质粒进行测序。
[0070] 大肠杆菌的转化和表达试验
[0071] 如实施例1所述进行大肠杆菌的转化和海鲈His6-sbTNFα的表达试验。
[0072] 实施例5：海鲈sbTNF在巴斯德毕赤酵母中的表达
[0073] 将His6-sb TNFα克隆到pPICZA中
[0074] 如实施例3所述，将海鲈His6-sbTNFα克隆到pPICZA中。使用ABIPrism 3130基因分析仪(SACE，University of Murcia)对包含海鲈His6-sbTNFα的所得质粒pPICZA进行测序。与实施例3一样，sbTNFα的起始密码子ATG位于用于在酵母中进行外源基因表达的酵母共有序列AAAAATGTCT(图4)中(Romanos等人，1992)。此共有序列包含在引物TNF-ECOPP中。
[0075] 巴斯德毕赤酵母的电穿孔和表达试验
[0076] 如实施例3所述进行电穿孔，但使用PmeI(Fermentas)进行质粒的线性化。在所选的菌落中，使用Genomic DNA Purification Kit(Fermentas)分离DNA，并使用EcoTaq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)扩增包含His6-sbTNFα的DNA片段，以使用ABI Prism 3130基因分析仪(SACE，University of Murcia)进行测序。
[0077] 同样如实施例3所述进行表达试验。
[0078] 实施例6：大菱鲆sbTNFα在大肠杆菌中的表达
[0079] 将sbTNFα克隆到pET15b中
[0080] 使用得自肝的大菱鲆cDNA作为PCR中的模板，以使用引物TNFRO-BAMF和TNFRO-BAMR(图1)扩增sbTNFα。这两个引物都包含BamHI限制位点，用于随后在质粒pET15b(Novagen)的相同位点中克隆PCR产物。在包含cDNA模板、每种dNTP各50μM、0.2mM引物、含MgCl2的1X缓冲液PLUS和1单位Eco Taq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)的样品中进行扩增。在Smart Cycler(Cepheid)中进行循环反应，包括95℃5分钟的1个循环，95℃45秒、55℃45秒和72℃90秒的30个循环，以及随后72℃10分钟的一个循环。在0.8％琼脂糖凝胶(Pronadisa)中电泳分离，然后使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)纯化PCR产物。在37℃下使用10单位BamHI将纯化片段和质粒pET15b消化2小时，并在22℃下使用1单位T4DNA连接酶(Fermetas)将此前使用PCR Purification Kit纯化的DNA连接过夜。使用连接混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布在包含氨苄西林的LB平板上。将平板在37℃下温育，并使用2X PCR MasterMix(Fermentas)和引物T7F和T7R，通过菌落PCR鉴定重组体。分离数个所得菌落的质粒，用BamHI消化检测插入片段的释放，并用PvuII消化检测插入片段的方向。使用ABI Prism 377基因分析仪(CIB，CSIC)对所选质粒进行测序。
[0081] 大肠杆菌的转化和表达试验
[0082] 如实施例1所述进行大肠杆菌的转化和大菱鲆His6-sbTNFα的表达试验。
[0083] 实施例7：大菱鲆sbTNF在巴斯德毕赤酵母中的表达
[0084] 将His6-sb TNFα克隆到pPICZA中
[0085] 如实施例3所述，将大菱鲆His6-sbTNFα克隆到pPICZA中。使用ABIPrism 3130基因分析仪(SACE，University of Murcia)对包含大菱鲆His6-sbTNFα的所得质粒pPICZA进行测序。与实施例3一样，sbTNFα的起始密码子ATG位于用于在酵母中进行外源基因表达的酵母共有序列AAAAATGTCT(图5)中(Romanos等人，1992)。此共有序列包含在引物TNF-ECOPP中。
[0086] 巴斯德毕赤酵母的电穿孔和表达试验
[0087] 如实施例3所述进行电穿孔，但使用PmeI(Fermentas)进行质粒的线性化。在所选的菌落中，使用Genomic DNA Purification Kit(Fermentas)分离DNA，并使用EcoTaq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)扩增包含His6-sbTNFα的DNA片段，以使用ABI Prism 3130基因分析仪(SACE，University of Murcia)进行测序。
[0088] 同样如实施例3所述进行表达试验。
[0089] 实施例8：通过色谱纯化sbTNFα
[0090] 使用AKTA Explorer FPLC(GE Healthcare)，通过亲和色谱纯化在大肠杆菌、酿酒2+
酵母或巴斯德毕赤酵母中表达的His6-sbTNFα。通过带有Ni 的固定化金属离子亲和层析(IMAC)用HisTrap FF柱(GE Healthcare)进行纯化，这是用于纯化组氨酸标记蛋白的方法。通过UNICORN 5.10测量280nm的吸光度。以1ml/min的流速，使用至少5倍柱体积的结合缓冲液(20mM磷酸钠、0.5M NaCl、5mM咪唑，pH 7.4)平衡体积为1ml的柱。随后如实施例
2所述，通过超声处理或珠磨式组织研磨器溶解生长的培养物样品，并进一步离心以去除团块并获得澄清的上清液，此后将2mL此上清液的样品上柱。使用结合缓冲液洗柱，直到吸光度达到稳定的基线(10-15柱体积)。最后使用渐增量的20-25柱体积的线性梯度的洗脱缓冲液(20mM磷酸钠、0.5M NaCl、0.5M咪唑，pH 7.4)洗脱与柱结合的蛋白。使用自动流分收集器收集1ml洗脱物流分。通过SDS-PAGE和使用抗多组氨酸mAb(Sigma)的免疫印迹法检测包含蛋白的流分中是否存在His6-sbTNFα。将所选流分混合，并通过Bradford(Sigma)测定His6-sbTNFα的量。
酵母或巴斯德毕赤酵母中表达的His6-sbTNFα。通过带有Ni 的固定化金属离子亲和层析(IMAC)用HisTrap FF柱(GE Healthcare)进行纯化，这是用于纯化组氨酸标记蛋白的方法。通过UNICORN 5.10测量280nm的吸光度。以1ml/min的流速，使用至少5倍柱体积的结合缓冲液(20mM磷酸钠、0.5M NaCl、5mM咪唑，pH 7.4)平衡体积为1ml的柱。随后如实施例
2所述，通过超声处理或珠磨式组织研磨器溶解生长的培养物样品，并进一步离心以去除团块并获得澄清的上清液，此后将2mL此上清液的样品上柱。使用结合缓冲液洗柱，直到吸光度达到稳定的基线(10-15柱体积)。最后使用渐增量的20-25柱体积的线性梯度的洗脱缓冲液(20mM磷酸钠、0.5M NaCl、0.5M咪唑，pH 7.4)洗脱与柱结合的蛋白。使用自动流分收集器收集1ml洗脱物流分。通过SDS-PAGE和使用抗多组氨酸mAb(Sigma)的免疫印迹法检测包含蛋白的流分中是否存在His6-sbTNFα。将所选流分混合，并通过Bradford(Sigma)测定His6-sbTNFα的量。
[0091] 在必要时，使用凝血酶-琼脂糖(Recom-T；Sigma)去除His6标记。
[0092] 实施例9：通过SDS-PAGE和免疫印迹法检测sbTNFα
[0093] 通过用12.5％丙烯酰胺/双丙烯酰胺的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析带有His6-sbTNFα的样品。使用0.1％考马斯(coomassie)将凝胶染色30分钟，并区分出对应于His6-sbTNFα的21kDa带。
[0094] 为了通过免疫印迹法检测His6-sbTNFα，在上述SDS-PAGE后，在TBS(20mM Tris-HCl、150mM甘氨酸(glicine)、20％甲醇)中，在100V下将凝胶向硝酸纤维素膜(Sigma)中转移1小时。在4℃下使用含有5％BSA的TTBS(10mM Tris-HCl、100mM NaCl、0.1％Tween 20)将所述膜温育过夜以阻断蛋白。使用TTBS清洗所述膜，然后将其与TTBS+5％BSA+1∶1000抗多组氨酸mAb(Sigma)一起温育2小时。随后再次使用TTBS和TBS清洗所述膜，随后使用ECL(Amersham Biosciences)染色。显示出对应于His6-sbTNFα的21kDa单带(图6)。
[0095] 实施例10：通过发酵培养酵母
[0096] 在生物反应器系统(Applicon)中进行转化酵母的发酵培养。
[0097] 例如，将巴斯德毕赤酵母菌株在含有YPGly培养基的烧瓶中培养24小时直至培养物达到OD600高于30。随后将生长的培养物接种到含有MMG(含甘油的基本培养基)的生物反应器系统中。培养条件为：温度30℃，pH5.00(通过添加NH3进行控制)，在500-1250rpm下搅拌，以及搅拌下30％的氧级联。通过BioXpert V2测量参数。以分批方式进行发酵直到培养物达到OD600为50-80。此后以分批进料方式进行发酵，并开始供给甘油，持续10小时(OD600为260-280的培养物)。最后供给甲醇，持续40小时，在OD600为380-420时结束培养。
[0098] 通过免疫印迹法分析重组TNF His6-sbTNFα的表达分析(参见实施例9)。
[0099] 实施例11：重组酵母的微囊化
[0100] 在发酵达到预期的生物量和重组TNF His6-sbTNFα的最佳表达后，在无菌条件下收集液体培养基(broth)，并配以20％麦芽糊精(malodextrin)和10％保护聚合物Kollicoat MAE 100P(BASF)。
[0102] 通过免疫印迹法分析重组酵母的最终微囊以确定没有细胞存活并且存在TNF His6-sbTNFα(参见实施例10)。
[0103] 实施例12：利用微囊化的重组酵母富集卤虫无节幼体
[0104] 将卤虫无节幼体在装有500ml无菌全浓度(full-strength)海水的烧瓶中孵化(去被膜卵)过夜，通过与鱼池气泵相连的送风管曝气，并在往复振荡的水浴中保持在28℃。孵化后24小时，将无节幼体收集到富集系统中。此系统由装有100ml清洁海水的烧瓶组成，其放置于相同的水域中并各自曝气。
[0105] 对所有试验，通过采集自10个0.5ml海水的样品来评估孵化比例和无节幼体的数量。
[0106] 通过用DTAF染色微囊化重组酵母来评估用该酵母富集的卤虫无节幼体的最佳制备时间。随后，使用染色酵母饲喂卤虫无节幼体。在饲喂后0分钟、30分钟、45分钟、60分钟和120分钟杀死该卤虫无节幼体。使用荧光显微镜观察富集的卤虫。
[0108] 富集卤虫无节幼体的最佳时间为60分钟。
[0109] 实施例13：金头鲷sbTNFα在巴斯德毕赤酵母中的表达和分泌
[0110] 将His6-sb TNFα克隆到pPICZαA中
[0111] 使用包含sbTNFα的质粒pET15b作为PCR中的模板，以使用引物TNF-ECOF和TNF-ECOR(图1)扩增包括615pb的His6-sbTNFα的片段。这两个引物都包含EcoRI限制位点，用于在质粒pPICZαA(Invitrogen)的相同位点中克隆PCR产物。在包含5ng模板、2.5mM MgCl2、每种dNTP各50μM、0.2mM引物、1X High Speec添加剂、1X缓冲液PLUS和2单位Eco Taq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)的样品中进行扩增。在Smart Cycler II(Cepheid)中进行循环反应，包括95℃5分钟的1个循环，95℃30秒、55℃45秒和72℃2分钟的30个循环，以及随后72℃10分钟的1个循环。通过在包含0.5μg/ml溴乙啶的0.8％琼脂糖(Pronadisa)凝胶中进行电泳来分离PCR产物，并使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)进行纯化。在37℃下使用10单位的EcoRI(Fermentas)消化纯化片段和200ng pPICZA，随后在22℃下使用5单位的T4DNA连接酶(Fermentas)进行连接。将连接反应物转入大肠杆菌TOP10F’感受态细胞中，并在含25μg/ml博莱霉素(Invitrogen)的低盐LB平板上选择包含质粒的菌落。使用2X PCR MasterMix(Fermentas)和引物PICα和PIC3，通过菌落PCR鉴定重组体。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)纯化包含His6-sbTNFα的所得质粒pPICZαA，并通过用EcoRI消化检测插入片段的释放，并通过用NdeI消化检测插入片段的方向。还使用ABI Prism 3130基因分析仪(SACE，Universityof Murcia)对质粒进行测序。
[0112] 巴斯德毕赤酵母的电穿孔和表达试验
[0113] 在将巴斯德毕赤酵母电穿孔之前，通过在37℃下用SacI或PmeI消化来将包含His6-sbTNFα的质粒pPICZαA线性化，以供随后在巴斯德毕赤酵母的基因组DNA中的重组及整合。使用MiniElute Reaction Cleanup Kit(Qiagen)纯化总量为5μg的线性质粒，并洗脱到10μl无菌水中。用于电穿孔的巴斯德毕赤酵母菌株为X-33。为了制备用于电穿孔的X-33，将OD600＝1.5的100ml培养物的细胞在4℃下以1500×g离心5分钟。在用无菌水清洗的2个步骤后，将细胞重新悬浮于1M山梨醇中，如前所述进行离心，并最后重新悬浮于1ml1M山梨醇中。为了电穿孔，将10μl DNA与80μl细胞混合，并转移到冰冷的0.2cm电穿孔管(BioRad)中。温育5分钟，然后将细胞在MicroPulser电穿孔仪(BioRad)中在25μF、1.5kV和400Ω的条件下施以脉冲。随即向管中添加1ml冰冷的1M山梨醇，并将所得混合物在30℃下温育1小时。将细胞涂布到包含100μg/ml博莱霉素(Invitrogen)的YPDS平板上，在30℃下温育数天，直至出现菌落。使用引物PIC5和PIC3的PCR和2X PCR Master Mix(Fermentas)分析数个转化子是否存在插入片段，并测定His6-sbTNFα的表达。
在所选的菌落中，使用Genomic DNAPurification Kit(Fermentas)分离基因组DNA，并使用EcoTaq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)扩增包含His6-sbTNFα的DNA片段，以使用ABI Prism
3130基因分析仪(SACE，University of Murcia)进行测序。
在所选的菌落中，使用Genomic DNAPurification Kit(Fermentas)分离基因组DNA，并使用EcoTaq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)扩增包含His6-sbTNFα的DNA片段，以使用ABI Prism
3130基因分析仪(SACE，University of Murcia)进行测序。
[0114] 在30℃和250rpm下，将带有His6-sbTNFα的重组巴斯德毕赤酵母菌株在包含甘油的25ml基本培养基中培养以产生生物质，随后进行甲醇诱导直至培养物达到OD600约为6。通过在3000×g离心5分钟来收集细胞，并将团块重新悬浮于包含0.5％甲醇的200ml基本培养基中直至OD600约为1，以诱导表达。如前所述温育培养物，每24小时添加0.5％甲醇以维持诱导。在数个时间点收集样品以分析蛋白表达。为了检查蛋白表达，通过在SDS上样缓冲液中煮沸来对样品的上清液进行His6-sbTNFα检测，以供SDS-PAGE分析和使用抗多组氨酸mAb(Sigma)的蛋白质印迹法。
[0115] 实施例14：微囊化重组酵母的功效
[0116] 将体重为120g的健康金头鲷(Sparus aurata L.)(Sparidae，Perciform，3
Teleostei)样本饲养在天然温度和光照期的2m 流动海水池(溶解氧6ppm，流速20％池体积/小时)中，并使用商品饲料颗粒(Trouvit，Burgos，Spain)饲喂，每天两次。对实验组饲喂其基础食物，但每两天补充0.1％、1％或10％的对照酵母或过度表达成熟(活性)sbTNFα的微囊化酵母。在所有取样时间(处理后2天、4天、6天和10天)将该样本称重，并取出头肾和肠，并将其处理以供光学显微镜研究和基因表达研究。所描述的实验遵循欧盟理事会(European Union Council)(86/609/EU)和西班牙穆尔西亚大学生物伦理委员会(Bioethical Committee of the University of Murcia(Spain))有关使用实验动物的方针。测量作为不同刺激时间后由头肾白细胞悬液产生的依赖鲁米诺化学发光的呼吸爆发活性(Sepulcre等人，2007)。所有试验均使用五条鱼进行，一式三份。相同试验重复两次以验证结果。使用SPSS 13.0.1统计软件包进行所有统计分析。通过方差分析(ANOVA)和Tukey多范围检验(Tukeymultiple range test)来分析数据以测定组间差异。
Teleostei)样本饲养在天然温度和光照期的2m 流动海水池(溶解氧6ppm，流速20％池体积/小时)中，并使用商品饲料颗粒(Trouvit，Burgos，Spain)饲喂，每天两次。对实验组饲喂其基础食物，但每两天补充0.1％、1％或10％的对照酵母或过度表达成熟(活性)sbTNFα的微囊化酵母。在所有取样时间(处理后2天、4天、6天和10天)将该样本称重，并取出头肾和肠，并将其处理以供光学显微镜研究和基因表达研究。所描述的实验遵循欧盟理事会(European Union Council)(86/609/EU)和西班牙穆尔西亚大学生物伦理委员会(Bioethical Committee of the University of Murcia(Spain))有关使用实验动物的方针。测量作为不同刺激时间后由头肾白细胞悬液产生的依赖鲁米诺化学发光的呼吸爆发活性(Sepulcre等人，2007)。所有试验均使用五条鱼进行，一式三份。相同试验重复两次以验证结果。使用SPSS 13.0.1统计软件包进行所有统计分析。通过方差分析(ANOVA)和Tukey多范围检验(Tukeymultiple range test)来分析数据以测定组间差异。
[0117] 鱼的食欲、生长速率、游动行为和外观形态未受到处理的影响，并且在试验期间也未观察到死亡。此外，在饲喂包含sbTNFα的酵母达10天的鱼的肠中未发现组织病理学损伤和吞噬细胞(即嗜酸性粒性白细胞和巨噬细胞)浸润。如头肾白细胞呼吸爆发所测定的，单独给药酵母对鱼的免疫状态没有显著影响。与之明显不同的是，饲喂0.1％和1％过度表达sbTNFα的微囊化酵母的鱼在处理后4天表现出剂量依赖性增加的呼吸爆发(图8)。意外的是，给药酵母对头肾和肠中除TLR9之外的数个炎性基因的mRNA水平没有显著影响，但TLR9的表达显著上调(图9)。
[0118] 上述结果表明，达10天的给药所述免疫刺激剂未对鱼产生任何副作用。由于呼吸爆发活性被广泛用作鱼免疫状态的指标(Mulero等人，1998，García-Castillo等人，2004；Chaves-Pozo等人，2005；Sepulcre等人，2007)，因此在饲喂包含TNFα的酵母的鱼中激活此应答表明所述免疫刺激剂有效，并且会保护鱼类免于非生物应激(即由对鱼的处理导致的应激)和生物(病原体)应激。此外，由于TLR9受体是识别病毒和细菌病原体的关键成分，因此由给药所述免疫刺激剂所导致的肠中TLR9的表达上调同样表明鱼的肠道会受到更好的抗病毒和细菌感染保护(Ishii和Akira，2006)。综上所述，所有上述结果还表明重组sbTNFα是通过系统性激活先天免疫细胞并增加TLR9表达的优异口服疫苗佐剂。
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