技术领域
[0001] 本
发明涉及一种用于细胞因子和
细胞增殖分析的标准对照参考材料。本发明也涉及一种生产这种材料的方法。
背景技术
[0002] 利用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测细胞因子的释放，以及利用流式细胞术定量和鉴定分析胞内细胞因子，已广泛地被用作细胞免疫应答的指标。在所谓的酶联免疫斑点法(ELISPOT)中，固定细胞中释放的细胞因子发生典型地免疫反应，例如酶联
免疫吸附(ELISA)，在分析平板中显示出一个有色的“斑点”，以此提供细胞因子定性(如免疫蛋白的种类)和定量(反应细胞的数量或比例)的信息。为了使监测供试样品中胞内细胞因子
水平和细胞因子释放的分析方法能够标准化，有必要开发出可靠的参考标准样品，从而使不同的实验室或分析方法之间能够具有可比性。
[0003] 用于胞内流式细胞术分析(Becton Dickinson，Oxford，UK)的经过刺激(细胞因子阳性)、固定、冷藏保存的细胞商业上可用于胞内流式细胞术进行分析(Becton Dickinson，Oxford，UK)，而
冷冻干燥的未受刺激细胞可用于表面
染色法或血液学分析(Beckman Coulter UK Ltd，High Wycombe，UK)。
[0004] 目前，可采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)或其它分析方法监测细胞所释放的细胞因子情况，但也只是针对来源于个别供体的冷藏保存的活细胞。
[0005] 目前可用的方法所提供的标准化参考材料有几个缺点：为了使标准化的参考材料可以用于世界范围内数量众多的实验室，同时要使所提供的参考材料能使用很多年，因而需要大量的稳定材料。然而，来源于多样供体的活细胞不能大单批次的混合在一起，因为这会导致混合淋巴细胞反应，其结果是导致细胞死亡和细胞因子的过度表达。
[0006] 冷藏保存的细胞也需要专
门的贮藏，例如使用液氮或
干冰装运，这样增加了成本。冷冻装置也可能会发生停电事故，在装运期间发生融化和二次冷冻的
风险，导致材料变质，因此使得参考标准样品失去作用。而且，冷藏保存的细胞一定要小心地使之融化以保证反应的一致性。然而，已经证实采用该途径难以在不同的实验室间获得一致性的结果。
[0007] 测量
哺乳动物细胞的细胞增殖也是一项重要的技术，如外源制剂对区分细胞的能
力或倾向影响的分析。例如，这类分析技术能够在免疫应答反应中检测被标记的免疫系统细胞的增殖。目前多个技术均采用在细胞某处标记上可检测标记的方法来区分子代细胞。
[0008] 其中一个该类技术使用的是
荧光染料羟基荧光素二
醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE或CFDA，SE)。该技术在Lyons，B.所发表的论文中有所描述(Immunol.Cell Biol 1999；77(6)：509-515″The technique can be used both in vitro and in vivo，allowing eight to 10successive divisions to be resolved by flow cytometry.Furthermore，viable cells from defined generation numbers can be sorted by flow cytometry for functional analysis″)。其他技术包括将溴脱
氧尿苷或氚化胸腺嘧啶掺入细胞。
[0009] 虽然这些分析方法是众所周知的，但是当这些分析技术用于不同分析实验室或连续长期分析时(如临床纵向研究)，则难以提供可进行相互校正和
质量控制的参考标准样品。
[0010] 由于缺乏用于细胞因子和细胞增殖分析的参考材料阻碍了可靠的测试方法学的发展，尤其是阻隔了不同的实验室和分析方法之间可比性。本发明的目标就是试图解决这些问题。
发明内容
[0011] 因此，在第一个方面，本发明提供了一种制备细胞参考材料的方法，其包括以下步骤：(a)从人体或动物体分离获取细胞样品，上述的细胞样品所包括的细胞选取于以下类群的细胞：嗜
碱性粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞(B-淋巴细胞和T-淋巴细胞)、自然杀伤细胞(所有外周血单核细胞，PBMC)、凝血细胞以及细胞系；(b)在存在细胞因子分泌
抑制剂的情况下，刺激上述细胞产生细胞因子；(c)添加
固定剂固定上述受刺激细胞；(d)冷冻干燥保藏上述固定的受刺激细胞。
[0012] 使用细胞系，我们的意图是能够为细胞培养物的增殖提供适当的新鲜培养基和空间，这些细胞最初分离自人体或动物体，并且能够产生细胞因子。这些细胞原本就可以产生细胞因子，或者也可以经外源遗传物质编码修饰，导致一个或多个细胞因子的合成，如包括但不限于TNF-α、IFN-γ、IL-1和IL-6。可以通过如微量注射、电穿孔、使用
磷酸钙或脂质体
转染试剂将外源DNA导入受体真核细胞中，并且上述的遗传物质可能随着整合进入细胞的染色体DNA，或者如质粒般的残留存在。对于原本就能够产生细胞因子的细胞，这些细胞也可以通过启动子序列的导入上调细胞因子的产生。如果需要则可以刺激细胞，例如通过使用促细胞分裂剂产生细胞因子，并根据在此描述的技术进行保存。
[0013] 已知将细胞因子基因转导进入
肿瘤细胞会引起强烈的宿主
炎症反应(参见″The boosting effect of co-transduction with cytokine genes on cancer vaccine therapy using genetically modified dendritic cells expressing tumor-associated antigen ″，International journal of oncology；OJIMA Toshiyasu et al：ISSN1019-64392006，vol.28，no4，pp.947-953)。在体内，这将损害肿瘤的生长。在体外，胞内细胞因子可能根据本文描述的技术得到保存。
[0014] 这些细胞系可以包括来自于以下衍生的细胞系：嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞(B-淋巴细胞和T-淋巴细胞)、自然杀伤细胞(所有外周血单核细胞，PBMC)、凝血细胞，或者如HeLa、HL-60、A-549、Jurkat、LNCap和CAPAN-1细胞的细胞系。
[0015] 在优选的
实施例中，本发明提供一种制备细胞参考材料的方法。包括以下步骤：(a)从人体或动物体分离获取细胞样品，上述的细胞样品所包括的细胞选取于以下类群：
嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞(B-淋巴细胞和T-淋巴细胞)、自然杀伤细胞(所有外周血单核细胞，PBMC)和凝血细胞；(b)在存在细胞因子分泌抑制剂的情况下，刺激上述的细胞产生细胞因子；(c)添加固定剂固定上述刺激细胞；(d)冷冻干燥保藏上述固定的刺激细胞。
[0016] 在独立的第二个方面，本发明也提供另一种制备细胞参考材料的方法，包括以下步骤：(i)从人体或动物体分离获取一个混合细胞群，上述的混合细胞群所包括的多个细胞类型选取于以下类群：外周血单核细胞、凝血细胞；(ii)分离上述混合细胞群成几个组分，在每个组分中含有独特的细胞类群；(iii)在存在细胞因子分泌抑制剂的情况下，对上述的一个或多个组分进行细胞刺激，产生细胞因子；(iv)添加固定剂对各组分内的上述细胞进行固定；(v)合并上述多个组分，制成混合差异刺激细胞；(vi)冷冻干燥保藏或超低温保藏上述混合差异刺激细胞。
[0017] 用这种方法，可以生产出模仿不同类型细胞中细胞因子表达的特殊模式的参考标准样品。这些细胞因子表达的标准样品通过协助潜在型
疾病的诊断/预测以及研究室/实验设置中对材料/实验结果的分析，从而为临床和研究设置提供帮助。
[0018] 在本发明的任何一个方面中，上述细胞样品最好是分离自哺乳动物体，优选的是分离自人体。
[0019] 此外，在本发明的任意一个方面，上述细胞优选的是通过添加促细胞分裂剂而被刺激。优选的是，同时特别的对胞内细胞因子进行染色，上述促细胞分裂剂包括PMA(12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐)。同样优选的，上述促细胞分裂剂含有离子霉素。更优选的是上述促细胞分裂剂包括PMA(12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐)与离子霉素的混合物。同样优选的，同时特别的用于酶联免疫斑点法(ELISPOT)，上述促细胞分裂剂包括PHA(
植物凝集素)、IL-2(白介素-2)和共刺激抗人CD28单克隆
抗体组成的混合物。
[0020] 此外，在本发明的任意一个方面，上述细胞因子分泌抑制剂优选包括布雷菲德菌素A。
[0021] 此外，在本发明的任意一个方面，上述固定剂优选含有低聚甲
醛。更优选的是上述固定剂含有低聚甲醛和氯化铬的混合物。固定有益于中止细胞内外的
生物学活性，包括细胞程序死亡，这样将改善细胞在冷冻干燥过程中生物学和结构的完整性。
[0022] 此外，在本发明的任意一个方面，本方法在上述细胞固定之后、保藏之前另外还包括一个去除剩余固定剂的步骤。这使得细胞能够立即复原得到使用，而不需要额外的清洗步骤来去除固定剂。这个步骤的一个好处是使得细胞的体积变化达到最小。过量的固定剂可以引起非特异性染色，并且妨碍酶联免疫斑点法分析(ELISPOT)中细胞因子的释放。
[0023] 此外，在本发明的任意一个方面，本方法在保存上述细胞之前另外还包括一个将上述固定化细胞暴露于高渗环境的步骤。通过该步骤，细胞处于体内缺水状态，使细胞完全地变得更加有弹性，并且这些方面也使参考材料的整体产量得到了增加。
[0024] 此外，在本发明的任意一个方面，本方法在冷冻干燥上述细胞之前另外还包括一个添加
冷冻保护剂的步骤。冷冻保护剂的添加有益于在冷冻干燥过程中改善细胞结构的完整性。
[0025] 总体而言，通过本发明所带来的好处有：
[0026] (i)尽管这样产生的参考细胞最宜稳定在+4℃，但该细胞能够在环境
温度下运送也不会降解；
[0027] (ii)该细胞可轻易地用蒸馏水还原；
[0028] (iii)这些细胞可以在流式细胞术分析和酶联免疫斑点法分析(ELISPOT)中发挥作用，这些细胞释放细胞因子到周围环境，特别是在高温度，37℃左右保持时。
[0029] 此外，本发明的范围还包括一个制备细胞参考材料的方法，其由以下步骤组成：获取多个分离自多个个体的细胞样品；针对各个细胞样品实施上述所描述方法；在保藏上述细胞之前，另外还包括一个使从上述多数样品所衍生的固定细胞相结合的步骤。这有一个额外的好处，允许来自于混合供体的大批量样品进行制备和贮藏，根据本文所描述的方法避免了任何的混合淋巴细胞反应，否则这些混合集中活细胞将会发生该反应。因此，可以产生大量的标准化的参考材料，这是以往不能做到的。
[0030] 此外，本发明的范围还包括一个制备细胞参考材料的方法，包括以下步骤：获得分离于多个个体的多个混合细胞群；实施如以上所描述的方法，各个混合细胞群按照本发明第二个方面进行处理，另外，在保存上述细胞之前还包括一个将固定的来源于多个上述混合细胞群的细胞进行合并的步骤。这有一个额外的好处，定量和定性模仿混合淋巴细胞群合成/生产，并通过此混合淋巴细胞群来发现各种疾病状态。例如，当格雷夫斯病发病时，甲状腺细胞表达细胞因子，正常情况下一般不会，如TNF-α、IFN-γ、IL-I和IL-6。
[0031] 此外，本发明的范围还包括一个制备细胞参考材料的方法，包括以下步骤：制备未刺激固定细胞，按照前文任意一个方面的方法步骤，但省略掉刺激步骤(b)或(iii)；上述未刺激固定细胞与按照前文任意一个方面的方法步骤制备的刺激固定细胞合并；用冷冻干燥或超低温法保存上述合并的细胞。这有一个额外的好处，提供模仿非患病状态的混合淋巴细胞群，并与患病状态群进行比较，也就是作为阴性对照。
[0032] 在另外的独立方面，本发明也提供了另一个制备细胞参考材料的方法，其包括以下步骤(i)从人体或动物体分离获取混合细胞群，上述混合细胞群包括的多个细胞类型从以下类群中选取：外周血单核细胞、凝血细胞；(ii)分级分离上述混合细胞群以制备一个组分，上述馏分以单一细胞类型为优势；(iii)标记上述组分的细胞；(iv)通过添加固定剂对上述组分中的已标记细胞进行固定；(v)利用冷冻干燥保存上述已标记细胞。
[0033] 例如，CD4+细胞可以使用免疫
磁珠分选分离于PBMC，用FITC(异硫氰酸荧光素)染色标记anti-CD4抗体，按照本文所描述的进行固定并冷冻干燥保存。这些细胞可以用作参考标准样品，例如用作校准流式细胞术装置的荧光。
[0034] 在另一方面，本发明提供了一种制备细胞参考材料的方法，其包括步骤如下：(a)从人体或动物体分离获得增殖感受态哺乳动物细胞；(b)标记上述细胞以区分细胞增殖过程中的子代细胞；(c)刺激上述标记的细胞增殖；(d)让上述细胞增殖；(d)通过添加固定剂固定上述增殖的细胞；(e)用冷冻干燥或超低温保存生成的细胞。
[0035] 优选的是上述细胞用冷冻干燥保存。尽管有效，但冷藏保存的细胞需要专门的贮藏，例如使用液氮或干冰装运，这样增加了成本。冷冻装置也可能会发生停电事故，在装运期间发生融化和二次冷冻的风险，导致材料变质，因此使得参考标准样品失去作用。而且，冷藏保存的细胞一定要小心地使之融化以保证反应的一致性。固定有益于中止细胞内外的生物学活性，包括细胞程序死亡，这样将提高细胞在冷冻干燥过程中生物学和结构的完整性。
[0036] 优选的是上述细胞分离自哺乳动物，更优选的是上述细胞分离自人体。
[0037] 在本发明的任意方面中所提及的细胞均包括增殖感受态哺乳动物细胞，优选的是上述细胞通过添加促细胞分裂剂进行了刺激。优选的是，上述促细胞分裂剂含有PMA(12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐)。同样优选的是上述促细胞分裂剂含有离子霉素。更优选的是上述促细胞分裂剂含有PMA(12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐)和离子霉素的混合。在可替代实施例中，增殖的刺激可以通过添加促细胞分裂单克隆抗体如UCHT1来实施。
[0038] 此外，在本发明的任意一个方面，上述细胞包括增殖感受态哺乳动物细胞，优选的是上述固定剂由低聚甲醛组成。更优选的是上述固定剂由低聚甲醛和氯化铬混合组成。
[0039] 此外，在本发明的任意一个方面，上述细胞包括增殖感受态哺乳动物细胞，优选的是在固定上述细胞之后、保存细胞之前，该方法包括一个额外的去除剩余固定剂的步骤。这使得细胞能够立即复原得到使用，而不需要额外的清洗步骤来去除固定剂。这个步骤的一个好处是使得细胞的体积变化达到最小。过量的固定剂会引起细胞悬液的非特异性染色。
[0040] 此外，在本发明的任意一个方面，上述细胞包括增殖感受态哺乳动物细胞，优选的是本方法在保存上述细胞之前另外还包括一个将上述固定化细胞暴露于高渗环境的步骤。通过该步骤，细胞处于体内缺水状态，使细胞完全地变得更加有弹性，并且这些方面的加强也使参考材料的整体产量得到了增加。
[0041] 此外，在本发明的任意一个方面，上述细胞包括增殖感受态哺乳动物细胞，优选的是本方法在保存上述细胞之前另外还包括一个添加冷冻保护剂的步骤。冷冻保护剂的添加有益于在冷冻干燥或超低温保存过程中提高细胞结构的完整性。
[0042] 此外，在本发明的任意一个方面，上述细胞包括增殖感受态哺乳动物细胞，优选的是上述细胞利用荧
光标记物进行标记。更优选的是上述荧光标记物含有CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)。
[0043] 本文也充分描述了本发明范围所包括的一种制备细胞参考材料的方法。
具体实施方式
[0044] 实施例1刺激细胞标准样品的生产
[0045] 在本发明的一个实施例中，“血沉棕黄层”是从诸如静脉血捐献者或国家
采血机构获得。该血液的血沉棕黄层组分是血液的一部分，通过离心获得，包含大部分的白血球和血小板。所有获得的这些血沉棕黄层在使用之前都要进行常规的测试试验，以保证在使用前用于梅毒螺旋体血球凝集试验(“TPHA”)、乙型
肝炎表面
抗原检测(“HbsAg”)、抗人类免疫
缺陷病毒1(“anti-HIV1”)、抗人类免疫缺陷病毒2(“anti-HIV2”)和抗丙型肝炎病毒(“anti-HCV”)呈阴性。
[0046] 存在于血沉棕黄层的残余红细胞可以通过任意标准方法去除，应用市售的淋巴细胞
密度梯度制剂，例如淋巴细胞分离剂，之后分离/收集外周血单核细胞(“PBMC”)，然后再次应用淋巴细胞密度梯度制剂。之后该PBMC用哺乳动物细胞培养基如RPMI 1640培养基进行冲洗。
[0047] 为了生产受刺激的参考标准样品(与未受刺激的阴性对照样品形成对比)，通常在环境中二氧化
碳的含量为4-6％、温度36-38℃的情况下，用T细胞刺激促细胞分裂剂，使该PMBC受到免疫刺激。在优选的实施例中，使用的是免疫刺激剂的混合物，上述刺激剂包括(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸盐(PMA)(使用浓度为每毫升0.01-0.03μg/ml，如0.02μg/ml)和离子霉素(使用浓度为0.125-0.165μg/mg，如0.145μg/mg)。该刺激技术适宜产生细胞因子，而且如果免疫刺激46小时，可在PMBC细胞中检测到细胞因子的产生。
[0048] 该PMBC同时与市售的胞外蛋白运输抑制剂进行结合，如布雷菲德菌素A或莫能菌素，这导致细胞因子积累于上述PMBC中。如果使用的是布雷菲德菌素A，其通常使用的浓度为9.0-11.0μg/ml，如10μg/ml。
[0049] 接着，将该刺激的PBMC在胎
牛血清(“FCS”)和
磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)的
混合液中进行清洗，该FCS通常使用的浓度为9-12％v/v，如10％，而PBS通常是FCS浓度的两倍。
[0050] 该清洗过的PBMS之后在缓冲培养液中(同样包括两倍浓度的PBS和9-12％的FCS)进行再次悬浮，其中还要添加0.1-20％(v/v)的市售运输固定剂，在0.85％(w/v)的PBS中混合有低聚甲醛(0.1-0.2％w/v)和氯化铬(0.5％w/v)。一个已知的例子是使用商6
品名为“TransFix”的固定剂。该缓冲培养液和固定剂用于上述PBMC的比例为每ml 8×10个PBMC。
[0051] 至于生产未刺激的阴性对照细胞，按照如上描述的将PBMC固定后立即从低聚甲醛和氯化铬中分离出，同时要求于4℃下保藏。
[0052] 在刺激并固定后PBMC(或仅进行固定的，用于阴性对照的标准样品)经清洗后冷却(+4℃)，并冷冻干燥于缓冲剂中(冷冻保护剂)。一个通常使用的缓冲剂包括两倍量的10％的
蛋白质，该蛋白质通常为胎牛血清或
白蛋白溶于双倍浓度的PBS中。该冷冻干燥缓冲液的使用有助于在冷冻干燥过程中改善PBS的
稳定性。这些细胞在冷冻干燥之前可以在低温下保存(通常为+4℃)。为了使参考标准样品质量最优且保持一致性，
冷冻干燥机的架子要进行预冷，以便在装载过程中是温度保持在+4℃。
[0053] 固定之后，来自多个供体的细胞可以混合在一起，以提高参考材料的总产生量。在固定过程中允许来自不同供体的细胞混合在一起，而又不引起淋巴细胞交叉反应。此外，已固定的刺激细胞可以与已固定的未刺激细胞混合(其也可以用了作为阴性对照)，以便所生产的细胞群证明细胞因子刺激的一般水平或最低限度效力的阳性对照。
[0054] 该刺激的(或未刺激)固定细胞装载于分装/具盖瓶中。一种市售的商品名为Paxal的装料机适合用于处理大量样品。
[0055] 放入冷冻干燥机中之后，该PBMC通常5天为一个冷冻干燥周期。冷冻干燥之后剩余
含水量一般为0.35％。
[0056] 一旦固定剂从刺激细胞上被洗掉，该PBMC就开始漏出细胞因子，虽然在低温下
泄漏缓慢。因此，PBMC进行分装和冷冻干燥要在固定剂去除的几个小时内完成。
[0057] 冷冻干燥后，该冻干的参考材料可以保存更长的时间而不降解。该冻干的样品可以在两倍初始量的蒸馏水中复原。这通常提供给细胞的是单倍浓度的磷酸盐缓冲盐水。
[0058] 在本发明的另一实例中，自PMBC混合群中分离出富含有特定细胞类型的细胞组分，该细胞组分在与固定的未刺激细胞再次混合之前要经受如上所述的刺激和固定处理。
[0059] 用这种方法，在特定细胞类型中可以产生不同水平细胞因子的细胞群，该细胞群可以模仿特定的疾病状态。特定细胞类型可以通过多种方法分离，例如流式细胞术和细胞分选，或者使用已在商业上应用的抗体连接磁珠技术。可以使用这些分离技术分离如B细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、血小板等等，以及特定的亚型，如CD4和CD8T细胞。此外，这些差异刺激的细胞群可以用固定的未刺激细胞进行稀释，由此产生的细胞群模拟那些已发现特定的疾病状态。
[0060] 按照本发明的方法所制备的细胞参考标准样品可以通过加水进行复原，并用作细胞因子的分析。这些细胞保留了表面抗原以及胞内细胞因子。因此，这些细胞可以经过染色技术处理之后用于其它分析技术中，并将其用作如流式细胞术分析中的参考标准样品。此外，这些细胞保持完好，同时仍具有向它们的直接环境中释放细胞因子的能力，特别是当保持在如37℃的较高温度下时，通常用于酶联免疫斑点法(ELISPOT)。因此，在这种类型的分析当中，它们可以被用作参考标准样品。
[0061] 贮藏试验表明这些冻干的细胞在保存5个月之后仍能保持它们的性质，有迹象显示它们具有长达多年的保存期限，因而允许它们作为可重复的标准样品用于长期研究和诊断。
[0062] 除了用作参考标准样品之外，通过本文所述方法制备的冷冻干燥细胞也可以用作
疫苗，其细胞表面抗原通过固定和冷冻干燥处理保持了其完整状态。
[0063] 实施例2-细胞增殖标准样品的生产
[0064] 通过一个例子，利用本文所公开的方法可以生产用于外周血单核细胞(PBMC)增殖分析的参考标准样品。在本发明的一个实施例中，“血沉棕黄层”是从诸如静脉血捐献者或国家采血机构获得。该血液的血沉棕黄层组分是血液的一部分，通过离心获得，包含大部分的白血球和血小板。所有获得的这些血沉棕黄层在使用之前都要进行常规的测试试验，以保证在使用前用于梅毒螺旋体血球凝集试验(“TPHA”)、乙型肝炎表面抗原检测(“HbsAg”)、抗人类免疫缺陷病毒1(“anti-HIV1”)、抗人类免疫缺陷病毒2(“anti-HIV2”)和抗丙型肝炎病毒(“anti-HCV”)呈阴性。
[0065] 存在于血沉棕黄层的残余红细胞可以通过任意标准方法去除，应用市售的淋巴细胞密度梯度制剂，例如淋巴细胞分离剂，之后分离/收集外周血单核细胞(“PBMC”)，然后再次应用淋巴细胞密度梯度制剂。之后该PBMC在哺乳动物细胞培养基中冲洗如RPMI 1640培养基。
[0066] 这些PBMC然后用如市售的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(“CFSE”)或羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(“CFDA-SE”)等染料标记。一个已知的染料例子是商品名为CellTrace CFSE Cell proliferation Kit的染料。标记后的细胞在用固定剂稳定和冷冻干燥或冷藏保存之前，用单克隆抗体UCHT1刺激70-74个小时以诱导增殖。刺激作用通常在环境二氧化碳含量为4-6％和温度为3638℃的条件下进行。该刺激作用诱导细胞增殖。在另一个实例中，使用的是免疫刺激剂的混合物，上述刺激剂通常包括(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸盐(PMA)(使用浓度为每毫升0.01-0.03μg/ml，如0.02μg/ml)和离子霉素(使用浓度为0.125-0.165μg/mg，如0.145μg/mg)。随着这样刺激，增殖通常在70-74个小时以内即可发生。
[0067] 接着，按照所需增殖的程度(根据所要生产的参考材料)，PBMC在胎牛血清(“FCS”)和磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)的混合液中进行清洗，该FCS通常使用的浓度为9-12％v/v，如10％，而PBS通常是FCS浓度的两倍。
[0068] 该清洗过的PBMS之后在缓冲培养液中(同样包括两倍浓度的PBS和9-12％的FCS)进行再次悬浮，其中还要添加0.1-20％(v/v)的市售运输固定剂，在0.85％(w/v)的PBS中混合有低聚甲醛(0.1-0.2％w/v)和氯化铬(0.5％w/v)。一个已知的例子是使用商品名为“TransFix”的固定剂。该缓冲培养液和固定剂用于上述的PBMC中的比例为每6
8×10 个PBMC使用1ml。
[0069] 固定之后，PBMC经清洗后冷却(+4℃)，并冷冻干燥于缓冲剂中(冷冻保护剂)。通常使用的缓冲剂包括两倍量的10％的蛋白质，该蛋白质通常为胎牛血清或白蛋白溶于双
