[0001] 本申请是申请日为2009年11月5日、发明名称为“杀虫剂的筛选测定法”的中国专利申请200980153714.3(国际申请号PCT/EP2009/064700)的分案申请。

[0002] 本发明涉及作为杀虫剂靶标的优选来自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的具有电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)活性的(DmShal)钾通道。在一个实施方案中，电压门控性钾通道Shal与其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)，优选地其假定的辅助蛋白CG5890，果蝇属KChIP(钾通道相互作用蛋白)直向同源物共表达。

[0003] 本发明提供具有优选来自黑腹果蝇(DmShal)昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)及其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)，优选其
假定的辅助蛋白CG5890，果蝇属KChIP(钾通道相互作用蛋白)直向同源物活性作为杀虫剂靶标的多肽，提供编码具有昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)及
其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性多肽的新核酸序列及其上述核酸序列的功
能等同物。

[0004] 本发明还涉及具有昆虫电压门控性钾通道Shal和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽，在鉴定降低昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或
Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的杀虫活性化合物的方
法和测定法中的用途。此外，本发明涉及通过上述方法鉴定的杀虫化合物和这些化合物用作杀虫剂的用途。

[0005] 在另一实施方案中，本发明涉及具有优选来自黑腹果蝇Shaker钾通道活性的作为杀虫剂靶标的钾通道。在一个实施方案中，Shaker通道与优选来自黑腹果蝇的
Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型共表达。

[0006] 本发明还提供在杀虫剂筛选测定法中使用的具有优选来自黑腹果蝇昆虫Shaker通道和Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活性 的多肽，提供编码具有昆
虫Shaker通道和Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活性的多肽的新核酸
序列及其上述核酸序列的功能等同物。

[0007] 本发明此外还涉及具有昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活性的多肽分别在鉴定分别降低昆虫Shaker通道和
Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活性的杀虫活性化合物中的方法和测定
中的用途。此外，本发明涉及通过上述方法鉴定的杀虫化合物和这些化合物用作杀虫剂的用途。

[0008] 在另一实施方案中，本发明涉及具有优选来自黑腹果蝇酚乙醇胺受体活性的作为杀虫剂靶标的G蛋白偶联受体(GPCR)。

[0009] 本发明还提供杀虫剂的筛选测定法中使用的具有优选来自黑腹果蝇酚乙醇胺受体活性的多肽，提供编码具有优选来自黑腹果蝇酚乙醇胺受体活性的多肽的新核酸序列及其上述核酸序列的功能等同物。

[0010] 本发明还涉及具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的多肽，在鉴定降低选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的杀虫活性化合物的方法和测定中的用途。此外，本发明涉及通过上述方法鉴定的杀虫化合物和这些化合物用作杀虫剂的用途。

[0011] 在另一实施方案中，本发明涉及作为杀虫剂靶标的SK-通道。

[0012] 本发明此外提供作为杀虫剂靶标的具有昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽，提供编码具有昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽的新核酸序列及其上述核酸序
列的功能等同物。

[0013] 本发明还涉及具有昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽，在鉴定降低昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的杀虫活性化合物的方法和测定中的用途。此外，本发明涉及通过上述方法鉴定的杀虫化合物和这些化合物用作杀虫剂的用途.

[0014] 昆虫引起许多人和动物疾病。昆虫还引起相当大的农业和财产损害，导致经济损失。尽管使用和滥用了所有的昆虫毒药，但是昆虫还是每年破 坏超过30％的全球粮食作物。

[0015] 已经开发出许多方法以限制由昆虫引起的破坏。

[0016] 一种方法是使用用于昆虫控制的化学药品。许多杀虫剂如DDT的问题在于它们需要高浓度应用和它们具有非特异的广谱活性的事实。化学杀虫剂通常影响有益和无益的物种。它们当中许多久存于环境中并且因此在食物链中积累。

[0017] 另一种方法是表达杀虫毒素，例如来自细菌苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)蛋白质毒素的转基因作物。

[0018] 昆虫害虫有获得对所有杀虫剂抗性的倾向，因为它们具有适应其环境的罕见能力，这是因为它们具有在昆虫群体中引起快速出现抗性的机制，如短生活周期、高繁殖率和长距离行进的能力。现在，表现出杀虫剂抗性的害虫在日益增加。

[0019] 因此，仍然有寻找具有对昆虫害虫极其特异作用的有效且经济的杀虫剂的需求。杀虫剂越有效，其造成的环境危险越小。

[0020] 这可以通过鉴定和分离编码将会控制昆虫发育和/或存活的蛋白质的基因实现。

[0021] 本发明提供昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)作为杀虫剂的新的靶标。本发明还提供用于鉴
定降低昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白
KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的杀虫活性化合物的方法和测定法。

[0022] 在许多果蝇属胚胎和幼体神经元中发现的外向电压依赖性K+电流源于Shaker家族成员Shaw、Shab和Shal产生的混合电流(Tsunoda，S.和L.Salkoll(1995)J
Neuroscience.March；15(3):1741-1754)。Shal产生这些宏观K+电流的瞬时部分(“A-型”电流)并且通过例如某些神经元中引起延缓的电流脉冲调整这些电流(Yu，D.，Feng，C.和A.Guo(1999)J Neurobiology.Aug；40(2):158-70)。选择性剪接、翻译后修饰和其他Shal 相关的加工可能部分地负责在这些神经元中观察到的广泛的调整(Choi，J.C.，Park，D.和L.C.Griffith(2004)J Neurophysiology.91:2353-2365)。

[0023] 已经证明Kv4.x(Shal)辅助蛋白KChIP可能通过促进四聚体通道组装急剧增加Shal向细胞膜的运输，和引起Shal通道门控特性的不同变化(Kunjilwar，K.，Strang，
C.，DeRubeis，D. 和 P.J.Pfaffinger(2004)J Biological Chemistry.Dec；279(52)：
54542-54551)。

[0024] 不管Shal在神经元传导中的作用如何，对于该靶标的确认案例仍有待确立。我们的原位数据表明在胚胎腹神经索和内脏肌肉组织中低水平表达。位于Berkeley的果蝇
属基因组计划显示在胚胎/幼体内脏肌肉、纵向内脏肌肉纤维、腹中线和胚胎中枢神经系统包括腹神经索中有染色。DmShal mRNA是在胚胎中期表达达到高峰的罕见转录物(内部
Lynx数据)。在哈佛医学院果蝇保藏中心有两个内含子转座子插入系，但是没有与此相关的生存力数据，并且也得不到其它的Shal突变体。在公众领域也没有微列阵或者northern数据。

[0025] 在市场上还没有已经鉴定具有Shal钾通道调节作为其主要作用方式的杀虫剂，这意味着化合物不仅仅通过杀虫活性的“副作用”起作用，而且其活性是关键的致死作用。

[0026] 在另一实施方案中，本发明提供分别作为杀虫剂新靶标的昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型。本发明还提供用于鉴定分别降低昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活性的杀虫活性化
合物的方法和测定法。

[0027] 果蝇Hyperkinetic(Hk)突变改变编码哺乳动物K+通道P亚基同系物的基因。Wang等(Biophysical Journal Volume71，December1996，3167-3176)已经证明，Hk P亚基调节大范围的Shaker(Sh)K+电流特性。从CHOUINARD等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，
Vol.92，pp.6763-6767，July1995Neurobiology)还可知道Hk与Sh在爪蟾卵母细胞中共表达，这证明该共表达增加电流波幅并且改变电压依赖性和活化与失活的动力学。

[0028] 令人惊奇地发现，Shaker通道和Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚 基A或B亚型的共表达导致产生新的杀虫剂筛选测定法。

[0029] 在市场上还没有已经鉴定具有Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型调节作为其主要作用方式的杀虫剂，这意味着化合物不仅仅通过杀
虫活性的“副作用”起作用，而且其活性是关键的致死作用。

[0030] 在另一实施方案中，本发明提供选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的昆虫酚乙醇胺受体作为杀虫剂的新靶标。本发明还提供用于鉴定降低选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的昆虫酚乙醇胺受体活性的杀虫活性化合物的方法和测定法。

[0031] 酚乙醇胺是结构上与去甲肾上腺素有关的生物源单胺，其是在脊椎动物外周和中枢神经系统中介导不同生理过程的主要神经递质、神经调质和神经激素。酚乙醇胺与酪胺一起仅是神经活性的非肽递质，其生理作用局限于脊椎动物。

[0032] 酚乙醇胺的作用通过多种受体类别像oa2、Oamb、Oct-β-2R或Oct-β-3R介导。

[0033] 酚乙醇胺受体仅仅/主要发现于无脊椎动物中这一事实使得它们成为杀虫剂的重要的靶标。因此，特异性调节酚乙醇胺受体的化合物将具有低的脊椎动物毒性。除了选择性之外，酚乙醇胺受体由于其在神经元中表达而成为杀虫剂的良好靶标。酚乙醇胺与酪胺一起仅是神经活性的非肽递质，其生理作用局限于无脊椎动物。

[0034] 虽然酚乙醇胺是昆虫中的主要神经介质，但是已经证明其受体难以克隆。目前，仅少数酚乙醇胺受体已经被克隆。

[0035] 本发明提供克隆章鱼碱受体并将其引入优选细胞的膜中的方法。优选地，额外连接的蛋白质引入到膜中。

[0036] 取决于受体同种型，酚乙醇胺受体可通过环AMP产生或细胞内钙释放调节它们的活性。酚乙醇胺受体，优选oa2内源性地通过cAMP传导信号。受体活性的检测是困难的。

[0037] 因此，本发明提供强制偶联至钙的方法，这导致当其活化时钙释放。 钙释放通过荧光的钙传感染料测量。

[0038] 令人惊奇地发现，选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体的表达和泛宿主性G-α蛋白的表达导致产生新的杀虫剂筛选测定法。

[0039] 当配体结合至GPCR细胞外部分时，GPCR介导跨细胞膜的信号转导。GPCR的细胞内部分与G-蛋白相互作用以调整从细胞外至细胞内部的信号传导。因此，GPCR被称作“偶联”至G-蛋白。G-蛋白由三个多肽亚基组成：结合和水解GTP的α亚基，和二聚体的βγ亚基。某些G-蛋白被认为是”泛宿主性”G-蛋白，因为它们的G亚基允许它们偶联至正常情况下与其它家族G-蛋白偶联的GPCR。

[0040] 在市场上还没有已经鉴定具有选自优选来自黑腹果蝇的oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体调节作为其主要作用方式的杀虫剂，这意味着化合物不仅仅通过杀虫活性的“副作用”起作用，而且其活性是关键的致死作用。

[0041] 在另一实施方案中，本发明提供作为杀虫剂的新靶标的小电导钙激活钾通道。本发明还提供用于鉴定降低昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的杀虫活性化合物的方法和测定法。

[0042] 钙激活钾通道是由细胞内钙增加所活化的功能多种多样的一组离子通道。在哺乳动物中，它们主要存在于神经细胞中，在其中它们促进动作电位的形成并调节神经元兴奋性。更加具体而言，它们的电流是动作电位后超极化的基础；它们还表现出参与神经元放电频率精度(对于综述见：Stocker等，Nature Reviews Neuroscience5，2004)。

[0043] 该类型钾通道基于单通道导电性存在于三大通用类型中。大、中和小电导通道分别被称作BK、IK和SK。在果蝇中，基因分别被称作slo、slack和SK。

[0044] 每一类型的钾离子通道表现出不同的药理学特性。钾离子通道与大量生理过程相关，包括心跳的调节、动脉的扩张、胰岛素的释放、神经细胞的兴奋和肾电解质运输的调节。因此，钾离子通道早已知作为治疗大量疾 病中的治疗靶标，如WO2005 099711和US2005
0239800中所公开。

[0045] 特别地，SK通道已经显示具有不同的药理学特性。如在WO2005 100349中所公开，使用膜片钳技术发现不同化合物具有临床相关的心理活性。所评价的化合物结构上与三环抗抑郁剂相关并且包括阿米替林、卡马西平、氯丙嗪、赛庚啶、丙咪嗪、他克林和三氟拉嗪。发现所测试的每一化合物以微摩尔亲和性封闭SK2通道电流。存在影响SK通道的大量神
经肌肉抑制剂，如蜂毒明肽、阿曲库铵、泮库溴铵和筒箭毒碱(Shah等，Br J Pharmacol129：
627-30(2000))。

[0046] 还描述了使用SK通道作为药物活性化合物靶标用于治疗疾病的测定法：

[0047] 重组大鼠脑SK2通道在HEK293哺乳动物细胞中表达以通过膜片钳技术研究中心作用性肌肉松弛剂化合物如氯唑沙宗的作用(Cao等，J.Pharmacol.Exp.Ther.296：
683-689，2001)。还使用转化的HEK293细胞通过膜片钳技术研究了金属离子对重组人SK4通道活化的影响(Cao等，FEBS，446：137-141，1999)。

[0048] 鉴定增加或降低经钙激活钾SK通道的钾离子流的化合物的方法描述于WO98/11139中。

[0049] 时至今日，典型的昆虫中的分子靶标是乙酰胆碱酯酶、电压依赖性钠通道、离子型受体例如烟碱型乙酸胆碱和GABA受体。Gautier等(J.Pharm.Exp.Therapeutics,jpet.107.128694,2007)已经得到了钙激活钾通道作为间接靶标参与杀虫剂神经毒性的证据。他们通过使用反义寡核苷酸处理蟑螂(美洲蟑螂(Periplaneta americana))DUM(背侧不成
对中线)神经元敲低DUM神经元BK通道，指出DMDS(二甲基二硫)抑制钙激活钾电流。

[0050] 抑制Ca2+激活钾通道活性的另外的特异毒素已经从几种生物中鉴定，最熟知的是如在US5,607,843中所述的来自蜂毒的蜂毒明肽。

[0051] 然而，目前在市场上还没有已经鉴定具有Ca2+激活钾通道，优选SK通道调节作为其主要作用方式的杀虫剂，这意味着化合物不仅仅通过杀虫活性的“副作用”起作用，而且其活性是关键的致死作用。

[0052] 通常，极大地需要检测可能组成杀虫剂新靶标的多肽。原因是上述抗性问题和不懈的努力以鉴定新的杀虫活性成分，其通过尽可能宽的作用谱、生态和毒理学可接受性和/或低应用率相区别。

[0053] 现在本发明提供昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)作为杀虫剂靶标和用于鉴定降低昆虫电压门
控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作
用蛋白)活性的杀虫活性化合物的方法和测定法。

[0054] 本发明还分别提供Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型作为杀虫剂靶标和用于鉴定分别降低Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，
优选H-kvβ亚基A或C亚型活性的杀虫活性化合物的方法和测定法。

[0055] 本发明还提供选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体作为杀虫剂靶标和用于鉴定降低选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的杀虫活性化合物的方法和测定法。

[0056] 本发明此外提供昆虫小电导Ca2+激活钾通道作为杀虫剂靶标和用于鉴定降低昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的杀虫活性化合物的方法和测定法。

[0057] 实际上，新靶标的检测具有极大困难，因为多肽活性的抑制经常对昆虫的存活无进一步的影响。这可归因于昆虫可以转变至替代的活性这一事实，由此编码蛋白质的基因的数量比微生物中的高至少3倍。

[0058] 此外，以SK-通道为例，关于在人医学中的研究结果，例如WO2005 100349，其教导甚至对经钾离子通道的钾离子流的抑制在治疗疾病中是有用的，令人惊奇的是本发明的SK通道是杀虫剂的靶标，因为它们影响其存活。

[0059] 本发明的目标是鉴定对于昆虫发育或存活必需的新靶标，和提供适宜鉴定杀虫活性化合物的方法。

[0060] 我们发现，该目标通过使用具有昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽实现。

[0061] 本发明的一个实施方案涉及用于鉴定降低具有昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活
性的多肽的杀虫活性化合物的方法，该方法包括：

[0062] a)在膜中装配最初不存在于所述膜中的、具有昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活
性的多肽，

[0063] b)在一侧膜上应用怀疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力的化合物，

[0064] c)检测所述多肽的活性，和

[0065] d)鉴定在(b)中应用的降低所述多肽活性的化合物。

[0066] 在另一实施方案中，我们发现，该目标通过分别使用具有昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选-kvβ亚基A或C亚型活性的多肽实现。

[0067] 本发明的一个实施方案涉及用于鉴定分别降低具有昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选-kvβ亚基A或C亚型活性的多肽活性的杀虫活性化合物的方
法，所述方法包括:

[0068] a)在膜中装配最初不存在于所述膜中的、分别具有昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选-kvβ亚基A或C亚型活性的多肽，

[0069] b)在一侧膜上应用怀疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力的化合物，

[0070] c)检测所述多肽的活性，和

[0071] d)鉴定在(b)中应用的降低所述多肽活性的化合物。

[0072] 在另一实施方案中，我们发现，该目标通过使用具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的昆虫酚乙醇胺受体活性的多肽实现。

[0073] 本发明的一个实施方案涉及用于鉴定降低具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的昆虫酚乙醇胺受体活性的多肽活性的杀虫活性化合物的方法，所述方法包括:

[0074] a)在膜中装配最初不存在于所述膜中的、具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的昆虫酚乙醇胺受体活性的多肽，

[0075] b)在一侧膜上应用怀疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力的化合物，

[0076] c)检测所述多肽的活性，和

[0077] d)鉴定在(b)中应用的降低所述多肽活性的化合物。

[0078] 在另一实施方案中，我们发现，该目标通过使用具有昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的的多肽实现。

[0079] 本发明的一个实施方案涉及鉴定降低昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的杀虫活性化合物的方法，所述方法包括:

[0080] a)在膜中装配最初不存在于所述膜中的、具有昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽，

[0081] b)在一侧膜上应用怀疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力的化合物，

[0082] c)检测所述多肽的活性，和

[0083] d)鉴定在(b)中应用的降低所述多肽活性的化合物。

[0084] 根据本发明，膜是类似于半渗透板或层的结构，其充当两相或溶液之间的屏障，因此膜是溶剂渗透性的，优选水渗透性的。在一个实施方案中，膜是生物的膜、生物膜或者脂质层或者脂质双层。膜优选由流体脂质双层组成。在一个实施方案中，膜是细胞的外表面、细胞腔室、泡、脂质体(由为两性分子的磷脂组成的泡)、聚合物囊泡或者合成体(synthosome)。

[0085] 聚合物囊泡常常称作“聚合物体”，其已经被详细研究并且进展已经在综述中总结[Discher等，Science2002，297；967973]。聚合物体或聚合物囊泡由自组装的二或三嵌段共聚物组成。

[0086] 合成体是功能化的纳米腔室系统，其已经被开发出用于推定的生物技术应用[Nardin等，Chem.Commun.2000，14331434]。合成体是中空球体，其由具有嵌段共聚物膜的机械稳定囊泡和充当选择性门的工程改造跨膜蛋白组成。

[0087] 本发明的优选昆虫的电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)被装配入或嵌入、植入或整合入膜中，这些术语是同义词并且可互换。

[0088] 本发明的优选昆虫的Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选-kvβ亚基A或C亚型被分别装配入或嵌入、植入或整合入膜中，这些术语是同义词并且可互换。

[0089] 本发明的优选昆虫的选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体被装配入或嵌入、植入或整合入膜中，这些术语是同义词并且可互换。

[0090] 昆虫小电导Ca2+激活钾通道被装配入或插入、植入或整合入膜中，这些术语是同义词并且可互换。

[0091] 为了本发明的目的，通常复数旨在包括单数，反之亦然。

[0092] 除非另外指出，术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文上下文中可互换。除非另外指出，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文上下文中可互换。术语“序列”将涉及多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白质，这取决于术语“序列”所使用的环境。如本文所使用的术语“一个或多个基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“一个或多个核酸分子”指任何长度的聚合形式的核苷酸，或者是核糖核苷酸或者是脱氧核糖核苷酸。
这些术语仅指分子的一级结构。

[0093] 因此，如本文所使用的术语“一个或多个基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“一个或多个核酸分子”包括双链和单链DNA和RNA。它们还包括已知类型的修饰，例如具有类似物的一个或一个以上天然存在核苷酸的甲基化作用、“加帽”、取代。优选地，DNA或RNA序列包含编码本文所定义多肽的编码序列。

[0094] “编码序列”是这样的核苷酸序列，当其置于适当的调节序列控制之下时被转录成RNA，例如调节RNA如miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、RNAi、核糖核酸酶等或者被转录成被翻译成多肽的mRNA。编码序列的边界通过位于5’-末端的翻译起始密码子和位于3’-末端的翻译终止密码子决定。编码序列可以包括，但不限于mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或基因组DNA，而在某些情况下也将出现内含子。

[0095] 如在本文上下文中所使用，核酸分子还可以包括位于编码基因区3’和5’端的非翻译序列，例如编码区5’端上游序列的至少500、优选200、特别优选100个核苷酸和编码基因区3’端下游序列的至少100、优选50、特别优选20个核苷酸。在例如反义核酸、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核糖核酸酶等技术的情况下，可有利地使用编码区以及5’-和/或3’-区。

[0096] 然而，仅选择编码区用于克隆和表达目的常常是有利的。

[0097] “多肽”指氨基酸的聚合物(氨基酸序列)并且不指特定长度的分子。因此，肽和寡肽被包括在多肽的定义之内。该术语还指或者包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等等。定义所包含的是例如包含一个或更多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽、具有取代连接的多肽，以及本领域已知的天然存在或者非天然存在的其他修饰。

[0098] 术语“包含”、其语法变体当在本说明书中使用时用于指其所述特征、整数、步骤或构成成分或基团的存在，但不排除其一种或更多种其他特征、整数、步骤、构成成分或基团的存在或加入。

[0099] 术语“减少”、“阻抑”、“降低”或“抑制”涉及生物、生物部分如组织或细胞内特性的相应改变。“特性的改变”应当理解为活性以相对于对照、参照或野生型相应容量或数量蛋白质的指定容量或指定数量蛋白质的改变。

[0100] 术语“减少”、“阻抑”、“降低”或“抑制”包括所述特性在仅本发明受试者的部分中的改变，例如修饰可以存在于细胞腔室如细胞器中或者生物的部分如组织、翼、腿、躯干等中。优选地，“减少”、“阻抑”、“降低”或“抑 制”被发现于细胞内的，因此术语“活性的减少、降低或抑制”涉及与野生型细胞或者对照细胞相比细胞内的减少、降低或抑制。

[0101] 因此，术语“减少”、“阻抑”、“降低”或“抑制”意思是指，基因产物蛋白质或者调节性RNA比活性以及化合物或如多肽、核酸分子代谢物、离子或编码mRNA或DNA的量可以在比容量内被减少、降低或抑制。术语“减少”、“阻抑”、“降低”或“抑制”包括，对于所述“减少”、“阻抑”、“降低”或“抑制”的理由可以是向生物或其部分施用的化学化合物。

[0102] 术语“减少”、“阻抑”或“降低”是可互换的。如果不另外指出的话，术语“减少”将包括术语“阻抑”，“降低”或“抑制”。

[0103] 减少还理解为意思是指活性的修饰。在该上下文中，功能或活性，如“功能性活性”或“生物学活性”与对照、参照或野生型相比减少至少10％、有利的20％、优选30％、特别优选40％、50％或60％、非常特别优选70％、80％、85％或90％或更多，非常特别优选的是95％，更优选地是99％或更高。最优选地，活性的减少、降低或缺失总计基本上100％。因此，特别有利的实施方案是失活，例如化合物如多肽或核酸分子功能的抑制。

[0104] 术语“野生型”、“对照”或“参照”可互换并且可以是没有根据本文所述方法修饰或处理的生物的细胞或部分，例如细胞器或组织，或者生物，特别是昆虫。因此，用作野生型、对照或参照的生物的细胞或部分，例如细胞器或组织，或者生物，特别是昆虫尽可能对应于其细胞、生物或部分并且除了本发明方法的结果，在任何其他性质中尽可能与本发明的主题相同。因此，野生型、对照或参照被同样地处理或者尽可能相同的处理，也就是说，仅条件或特性将不同，这不影响所测试特性的性质。

[0105] 优选地，任何比较在相似条件下开展。术语“相似条件”意思是指所有条件例如培养或生长条件、测定条件(例如缓冲液组成、温度、底物、病原体品种、浓度等等)在待比较的实验之间保持相同。

[0106] “参照”、“对照”或“野生型”优选没有用本发明所述方法修饰或处理的并且具有与本发明受试者尽可能相似的任何其他特性的受试者，例如细胞器、细胞、组织、生物、特别是昆虫。参照、对照或野生型在其基因组、 转录物组、蛋白质组或代谢物组上尽可能与本发明受试者相似。优选地，术语“参照”、“对照”或“野生型”细胞器、细胞、组织或生物涉及遗传上与本发明的细胞器、细胞、组织或者生物或其部分几乎相同，优选95％、更优选98％、甚至更优选99.00％、特别是99.10％、99.30％、99.50％、99.70％、99.90％、99.99％、99.999％或更高相同的细胞器、细胞、组织或者生物。最优选地，“参照”、“对照”或“野生型”是除了负责核酸分子活性赋予核酸分子或它们所编码的基因产物根据本发明的方法被修正、操作、交换或引入之外，与根据本发明方法使用的生物、细胞或细胞器遗传上相同的受试者，例如细胞器、细胞、组织、生物。

[0107] 优选地，参照、对照或野生型与本发明的受试者仅在本发明多肽或者本发明方法中所使用多肽的活性上不同。

[0108] “显著降低”：关于根据本发明的核酸序列所编码多肽的活性，其应理解为意思是指，与对照相比，例如与没有与测试化合物温育的多肽活性相比，以测试化合物处理的多肽以测量误差之外的量度降低。

[0109] 关于离子通道的“功能活性”应当理解为离子通道表现出或者参与的任何一个或更多个功能和/或特性。

[0110] 关于酚乙醇胺受体的“功能活性”应当理解为酚乙醇胺受体表现出或者参与的任何一个或更多个功能和/或特性。

[0111] 在一个实施方案中，术语具有昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽的“功能性活性”
或“生物学活性”通过钾离子的跨膜运输定义。

[0112] 在另一实施方案中，术语分别具有昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活性的多肽的“功能性活性”或“生物学活性”通过钾离子跨膜的运输定义。

[0113] 在另一实施方案中，术语具有选自优选来自黑腹果蝇的oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的多肽的“功能性活性”或“生物学活性”通过这样的事实定义，即酚乙醇胺受体被α-肾上腺素能拮抗剂选择性封闭和被α-肾上腺素能激动剂活化。

[0114] 在另一实施方案中，术语具有昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽的“功能性活性”或“生物学活性”通过钾离子跨膜的运输定义。该运输被钙离子以选自200-1000nM、300-900nM、300-800nM和400-800nM间隔的半最大活化或Ca2+敏感性K0.5活化。本发明
的SK通道具有选自2-20pS、3-20pS、4-15pS、5-12pS和5-10pS间隔的单通道电导。本发明多肽的生物学活性是蜂毒明肽不敏感性的。

[0115] 术语化合物的“活性”指生物系统中，例如细胞、器官或者生物内化合物的功能。例如，术语化合物的“活性”指化合物的酶功能、调节功能或其作为结合配偶体、转运体、调节物或者载体等的功能。

[0116] 化合物的杀虫活性指所述化合物杀死或者麻痹昆虫的能力，或者以昆虫提供较少损害的方式抑制昆虫发育或者生长的能力。具有杀虫活性的化合物也被称为对昆虫具有毒性。化合物的杀虫活性不只引起昆虫的死亡，还包括对昆虫的其它有害作用，例如疾病、抗饲育剂活性、生长迟缓、降低的繁殖能力和降低的生殖力。

[0117] 如本文所使用的具有杀虫活性的化合物是“杀虫剂”。术语“杀虫剂”通常指不利影响昆虫生存力的化学药品、生物学试剂和其他化合物，其例如杀死、麻痹农作物保护、人和动物健康区的昆虫物种、使其不育消灭或者致残。

[0118] 在一个实施方案中，本发明方法使用包含由选自下列的核酸分子编码的至少一种多肽的膜实现:

[0119] a)编码SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子；

[0120] b)SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29中所示核酸分子；

[0121] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30的多肽序列；

[0122] d)与包含SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0123] e)核酸分子，编码与核酸分子(a)至(c)所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且分别具有昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或
其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽；

[0124] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0125] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且分别具有昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽产生；

[0126] h)核酸分子，其编码包含SEQ ID NO：33和/或34中分别所述共有序列或SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70和/或71中分别所述一个或更多个基序的多肽；

[0127] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：3、4；7、8；11、12；15、16；19、20；23、24；27、28和/或31、32中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；

[0128] 和

[0129] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，探针包含(a)或(b)核酸分子的互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中所表征核酸分子序列
互补并编码分别具有昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或
其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、
30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。

[0130] 在一个实施方案中，本发明方法使用包含由选自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)或j)项所述核酸分子所编码多肽的至少一种功能等同物或同源物的膜实现，例如Shal_delN突变体，其具有2-40个氨基酸编码区的N末端缺失。

[0131] 在一个实施方案中，本发明方法使用包含具有SEQ ID NO：2、6、10、14、18和/或22所述电压门控性钾通道Shal或其同源物活性的多肽的至少一种功能等同物或同源物和
/或Shal_delN突变体的膜实现，Shal_delN突变体具有连接至具有SEQ ID NO：26和/或
30中所述其辅助蛋白KChIP或其同源物活性的多肽的2-40个氨基酸编码区的N末端缺失。

[0132] 在另一实施方案中，本发明方法使用包含由选自下列的核酸分子编码的至少一种多肽的膜实现:

[0133] a)编码包含SEQ ID NO：73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽的多肽的核酸分子；

[0134] b)包含SEQ ID NO：72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸分子的核酸分子；

[0135] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自包含根据SEQ ID NO：73、75、77、79、81、83、85和/或87的多肽序列的多肽；

[0136] d)与包含SEQ ID NO：72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0137] e)核酸分子，编码与(a)至(c)核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且分别具有昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或
C亚型活性的多肽；

[0138] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0139] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且分别具有昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活性的多肽产生；

[0140] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO：102和/或103中分别所述共有序列或者SEQID NO：104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、
121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128中分别所述一个或更多个基序的
多肽；

[0141] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：88、89；90、91；92、93；94、95；96、97；98、99和/或100、101中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；

[0142] 和

[0143] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中所表征核酸分子序列互补并编码分别具有昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或
C亚型活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。

[0144] 在一个实施方案中，本发明方法使用包含由选自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)或j)项所述核酸分子所编码多肽的至少一种功能等同物或同源物的膜实现，由此核酸分子包含Kozak序列(例如ACCATG)。

[0145] 在一个实施方案中，本发明方法使用包含由选自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)或j)项所述核酸分子所编码多肽的至少一种功能等同物或同源物的膜实现，由此核酸分子包含编码Shaker通道的400bp或500bp的5’-片段的序列，优选包含Shaker ATG密
码子，优选加上适当的Kozak，和/或Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型的1770bp片段。

[0146] 在一个实施方案中，本发明方法使用选自SEQ ID NO：73、75、77、79、81和83的至少一种多肽或其功能等同物或同源物和选自SEQ ID NO：85和87的多肽或其功能等同物或同源物的任意组合的膜实现。

[0147] 在另一实施方案中，本发明方法使用包含由选自下列的核酸分子编码的至少一种多肽的膜实现:

[0148] a)编码SEQ ID NO：130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174中所示多肽的核酸分子；

[0149] b)SEQ ID NO：129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173中所示核酸分子；

[0150] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO：130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174的多肽序列；

[0151] d)与包含SEQ ID NO：129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0152] e)核酸分子，编码与(a)至(c)核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且分别具有选自优选来自黑腹果蝇的oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的昆虫酚乙醇胺受体活性的多肽；

[0153] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0154] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的昆虫酚乙醇胺受体活性的多肽产生；

[0155] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO：177、178和/或179中分别所述共有序列或者SEQ ID NO：180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207和/或208、和/或209、
210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225和/或226中分别所述一个或更多个基序的多肽；

[0156] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：131、132；135、136；139、140；143、144；147、148；151、152；155、156、159、160；163、164；167、168；171、172和/或175、176中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；

[0157] 和

[0158] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中 所表征核酸分子序列互补并编码具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的昆虫酚乙醇胺受体活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。

[0159] 在一个实施方案中，本发明方法使用包含由选自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)或j)项所述核酸分子所编码多肽的至少一种功能等同物或同源物和另外的标记蛋白质如GFP的膜实现，由此其优选地与本发明的多肽，例如由选自a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)或j)项的核酸分子编码的多肽连接。

[0160] 在一个实施方案中，本发明方法使用包含由SEQ ID NO：173中所述核酸分子或其同源物编码的，SEQ ID NO：46中所示多肽的至少一种功能等同物或同源物的膜实现。

[0161] 在一个实施方案中，本发明方法使用包含由选自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)或j)项所述核酸分子所编码多肽的至少一种功能等同物或同源物和另外的”泛宿主性”G-蛋白的膜实现，其G亚基使得G-蛋白与正常情况下与其它家族G-蛋白偶联的GPCR偶联，由此”泛宿主性”G-蛋白优选地与本发明的多肽，例如由选自a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)或j)项的核酸分子编码的多肽连接。

[0162] 在一个实施方案中，本发明方法使用包含由选自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)或j)项所述核酸分子所编码多肽的至少一种功能等同物或同源物和另外的标记蛋白质如GFP，和/或另外的“泛宿主性”G-蛋白的膜实现，由此标记蛋白质和/或“泛宿主性”G-蛋白优选地与本发明的多肽，例如由选自a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)或j)项的核酸分子编码的多肽连接。

[0163] 在一个实施方案中，本发明方法使用包含由SEQ ID NO：173中所述核酸分子或其同源物编码的，SEQ ID NO：46中所示多肽至少一种功能等同物或同源物和另外的“泛宿主性”G-蛋白的膜实现，由此蛋白质优选地与其连接。

[0164] 在一个实施方案中，“泛宿主性”G-蛋白是泛宿主性G-α-16-蛋白质或其同源物。

[0165] 在另一实施方案中，本发明方法使用包含由选自下列的核酸分子编码的至少一种多肽的膜实现:

[0166] a)编码SEQ ID NO：228、230、232中所示多肽的核酸分子；

[0167] b)SEQ ID NO：227、229、231中所示核酸分子；

[0168] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO：228、230、232的多肽序列；

[0169] d)与包含SEQ ID NO：227、229、231所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0170] e)核酸分子，编码与(a)至(c)核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽；

[0171] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0172] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽产生；

[0173] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO：239中所述共有序列或选自SEQ ID NO：240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252和253的一个或更多个基序的多肽；

[0174] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：233、234、235、236；和237、238中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；

[0175] 和

[0176] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中所表征核酸分子序列互补并编码具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、
30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。

[0177] 在一个实施方案中，本发明方法使用包含由选自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)或j)项所述核酸分子所编码多肽的至少一种功能等同物或同源物的膜实现。

[0178] 术语如上所述多肽的“功能等同物”是基本上赋予如SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30中所述多肽活性的多肽，至于shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为
SEQ ID NO:73、75、77、79、81、83、85和/或87，至于G蛋白偶联受体为SEQ ID NO：130、134、
138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174并且至于SK-通道为SEQ ID NO：228、
230、232。

[0179] 术语如上所述核酸分子的“功能等同物”是基本上赋予如SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29中所述核酸分子活性的多核苷酸，至于shaker通道和/或
Hyperkineticβ亚基为SEQ ID NO：72、74、76、78、80、82、84和/或86，至于G蛋白偶联受体为SEQ ID NO：129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173并且至于SK-通道为SEQ ID NO：227、229、231。

[0180] 根据本发明，蛋白质或多肽具有如SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30中所述多肽的活性，至于shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为SEQ ID NO：73、75、77、79、81、83、85和/或87，至于G蛋白偶联受体为SEQ ID NO：130、134、138、142、146、150、154、
158、162、166、170和/或174并且至于SK-通道为SEQ ID NO:228、230、232，如果其活性的减少、阻抑、降低或抑制介导经膜的钾流降低的话。

[0181] 根据本发明，核酸分子或多核苷酸具有如SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29中所述核酸分子的活性，至于shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为SEQ ID NO：72、
74、76、78、80、82、84和/或86，至于G蛋白偶联受体为SEQ ID NO：129、133、137、141、145、
149、153、157、161、165、169和/或173并且至于SK-通道为SEQ ID NO：227、229、231如果其表达的减少、阻抑、降低或抑制介导经膜的钾流降低的话。

[0182] 本发明多肽的同源物(＝同源物)，特别是由如SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29中所示核酸分子编码或者包含其的多肽，或者包含含有SEQ ID NO：33和/或34中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、
48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、
70和/或71的一个或更多个基序的多肽的多肽的同源物，可以衍生自任何生物，只要同源物赋予本文所述活性即可，即其是所述分子的功能等同物。

[0183] 至于shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，本发明多肽的同源物(＝同源物)，特别是由如SEQ ID NO：72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸分子编码或者包含其的多肽，或者包含含有SEQ ID NO：102和/或103中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一个或更多个基序的多肽的多肽的
同源物，可以衍生自任何生物，只要同源物赋予本文所述活性即可，即其是所述分子的功能等同物。

[0184] 至于G蛋白偶联受体，本发明多肽的同源物(＝同源物)，特别是由如SEQ ID NO：129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173中所示核酸分子编码或者包含其的多肽，或者包含含有SEQ ID NO：177、178和/或179中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、
193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207和/或208、和/或
209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225和/或226的一个或更多个基序的多肽的多肽的同源物，可以衍生自任何生物，只要同源物赋予本文所述活性即可，即其是所述分子的功能等同物。

[0185] 至于SK-通道，本发明多肽的同源物(＝同源物)，特别是由如SEQ ID NO：227、229、231中所示核酸分子编码或者包含其的多肽，或者包含含有SEQ ID NO：239中所示共有序列或选自SEQ ID NO：240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252和
253的一个或更多个基序的多肽的多肽的同源物，可以衍生自任何生物，只要同源物赋予本文所述活性即可，即其是所述分子的功能等同物。

[0186] 此外，根据本发明，术语“同源物”涉及生物的、与所述生物的所有表达序列的本文所述或所列序列具有优选最高或者基本最高序列同源性的序列。

[0187] 本领域技术人员已知如何发现、鉴定和证实假定的同源物具有本文所述的相同活性。如果知道的话，生物中的生物学功能或活性基本上涉及或对应于如对于SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29中所述基因所述的活性或功能，至于shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为SEQ ID NO：72、74、76、78、80、82、84和/或86，至于G蛋白偶联受体为SEQ ID NO：129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173，并且至于SK-通道为SEQ ID NO：227、229、231。

[0188] 因此，在一个实施方案中，同源物或功能等同物包含由含有SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29中所指出序列的核酸分子编码的多肽的序列或者在SEQ ID NO：2、6、10、
14、18、22、26和/或30中所述的多肽序列、如分别在SEQ ID NO：33和/或34中所示的共有序列或分别选自SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、
52、53、54和/或55、和/或56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70和/或71的一个或更多个基序，或者其是包含SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30中所指出多核苷酸的核酸分子的表达产物。

[0189] 至于shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，因此，在一个实施方案中，同源物或功能等同物包含由含有SEQ ID NO：72、74、76、78、80、82、84和/或86所指出序列的核酸分子编码的多肽序列或者在SEQ ID NO：73、75、77、79、81、83、85和/或87中所述的多肽序列、如分别在SEQ ID NO：102和/或103中所示的共有序列或分别选自SEQ ID NO：104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、
124和/或125和/或126、127和/或128的一个或更多个基序，或者其是包含SEQ ID NO：
73、75、77、79、81、83、85和/或87中所指出多核苷酸的核酸分子的表达产物。

[0190] 至于G蛋白偶联受体，因此，在一个实施方案中，同源物或功能等同物包含由含有SEQ ID NO：129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173所指出序列的核酸分子编码的多肽序列或者在SEQ ID NO：130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174中所述的多肽序列、如分别在SEQ ID NO：177、178和/或179中所示的共
有序列或分别选自SEQ ID NO：180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207和/或208、和/或209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、
225和/或226的一个或更多个基序，或者其是包含SEQ ID NO：130、134、138、142、146、150、
154、158、162、166、170和/或174中所指出多核苷酸的核酸分子的表达产物。

[0191] 至于SK-通道，因此，在一个实施方案中，同源物或功能等同物包含由含有SEQ ID NO：227、229、231所指出序列的核酸分子编码的多肽序列或者在SEQ ID NO：228、230、232中所述的多肽序列、如在SEQ ID NO：239中所示的共有序列或选自SEQ ID NO：240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252和253的一个或更多个基序，或者其是包含SEQ ID NO：228、230、232中所指出多核苷酸的核酸分子的表达产物。

[0192] 本文所公开的关于序列、活性、共有序列、多肽基序和测试的信息将本领域技术人员引向生物中的各个同源或功能等效表达产物。

[0193] 在一个实施方案中，任何一个本发明多肽的同源物衍生自昆虫并且具有至少50％的序列同一性并且优选与昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)分别具有基本相同或者相似的活性。

[0194] 在另一实施方案中，任何一个本发明多肽的同源物衍生自昆虫并且具有至少50％的序列同一性并且优选与Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型分别具有基本相同或者相似的活性。

[0195] 在另一实施方案中，任何一个本发明多肽的同源物衍生自昆虫并且具有至少50％的序列同一性并且优选与选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体具有基本相同或者相似的活性。

[0196] 在进一步的实施方案中，任何一个本发明多肽的同源物衍生自昆虫并且具有至少50％的序列同一性并且优选与昆虫小电导Ca2+激活钾通道具有基本相同或者相似的活
性。

[0197] 在一个实施方案中，任何一个本发明多肽的同源物衍生自昆虫，优选来自选自有翅亚纲、新翅目、半翅目、鳞翅目、鞘翅目、双翅目、同翅目、拟步行虫总科、拟步行虫科、拟步行虫属、Sternorrhyncha、Aphidina、Brachycera、果蝇科、Drosophilinae和果蝇属的昆虫并且具有至少50％的序列同一性并且优选与

[0198] i)昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)，或

[0199] ii)Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型，或

[0200] iii)选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体，或

[0201] iv)昆虫小电导Ca2+激活钾通道

[0202] 分别具有基本相同或者相似的活性。

[0203] 在一个实施方案中，任何一个本发明多肽的同源物衍生自

[0204] i)黑腹果蝇、亚热带粘虫、拟谷盗属、褐稻飞虱，或者

[0205] ii)黑腹果蝇、亚热带粘虫、拟谷盗属、桃蚜、棉蚜和/或苜蓿蚜，或者

[0206] iii)黑腹果蝇、亚热带粘虫(Spodoptera eridania)、赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)、桃蚜(Myzus persicae)和银叶粉虱(Bemisia argentifolii)，或者

[0207] iv)昆虫，优选来自选自有翅亚纲、新翅目、半翅目、鳞翅目、鞘翅目、双翅目、同翅目、拟步行虫总科、拟步行虫科、拟步行虫属、Sternorrhyncha、Aphidina、Brachycera、果蝇科、Drosophilinae and果蝇属的昆虫并且具有至少50％的序列同一性并且优选与昆虫小电导Ca2+激活钾通道具有基本相同或者相似的活性。

[0208] 本发明多肽的功能等同物或者同源物分别具有

[0209] i)昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)，或

[0210] ii)昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型，或

[0211] iii)选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的昆虫酚乙醇胺受体，或

[0212] iv)昆虫小电导Ca2+激活钾通道

[0213] 的活性

[0214] 和与选自SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30的序列所示多肽具有至少55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％或63％、优选至少64％、65％、66％、67％、
68％或69％、更优选至少70％、71％、72％、73％、74％,75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％或85％、最优选86％、87％、88％、89％或90％、特别优选至少91％、
92％、93％,94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，至于shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基 为SEQ ID NO：73、75、77、79、81、83、85和/或87，至于G蛋白偶联受体为SEQ ID NO：130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174，并且至于SK-通道为SEQ ID NO：228、230、232。

[0215] “功能等同物”在本文上下文中描述在标准条件下与编码具有下列生物学活性的多肽的核酸序列杂交的核酸序列

[0216] i)昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)，或

[0217] ii)昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型，或

[0218] iii)选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体，或

[0219] iv)昆虫小电导Ca2+激活钾通道

[0220] 或上述核酸序列的部分，其能够在细胞或生物内引起具有下列生物学活性的多肽的表达

[0221] i)昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)，或

[0222] ii)昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型，或

[0223] iii)选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的昆虫酚乙醇胺受体，或

[0224] iv)昆虫小电导Ca2+激活钾通道。

[0225] 为了开展杂交，有利的是使用如保守区或其它区域长度约10-50bp、优选15-40bp的短寡核苷酸，其可以以技术人员熟悉的方式通过与其它相关基因的比较确定。然而，本发明核酸的长度100-500bp的较长片段或完整序列也可用于杂交。取决于所使用的核酸/寡核苷酸、片段或完整序列的长度或取决于什么类型核酸用于杂交，即DNA或RNA，这些标准条件可变化。因此，例如，对于DNA:DNA杂合体的解链温度比相同长度DNA:RNA杂合体的解链温度低大约10℃。

[0226] 标准杂交条件应理解为意思是指，取决于核酸，例如42和58℃之间的温度，在水性缓冲溶液中具有0.1至5x之间的SSC浓度(1X SSC＝0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.2)或者另外在50％甲酰胺存在下，例如42℃，5x SSC，50％甲酰胺。对于DNA:DNA杂合体的杂交条件有利的是0.1x SSC和约20℃和65℃之间的温度，优选约30℃和45℃之间的温度。以DNA:RNA杂合体为例，杂交条件有利的是0.1x SSC和约30℃和65℃之间的温度，优选约
45℃和55℃之间的温度。已经描述的这些杂交温度是解链温度值，其已经通过实例如在甲酰胺缺乏下长度约100个核苷酸和50％的G+C含量的核酸计算出。对于DNA杂交的实验条
件描述于遗传学的专业教科书中，例如在Sambrook等，"Molecular Cloning"，Cold Spring Harbor Laboratory，1989中，并且可以使用技术人员熟悉的公式，例如作为核酸长度、杂合体类型或G+C含量的函数计算。技术人员将在下列教科书中找到关于杂交的进一步的信
息：Ausubel等(eds)，1985，Current方案s in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York；Hames and Higgins(eds)，1985，Nucleic Acids Hybridization：A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford；Brown(ed)，1991，Essential Molecular Biology：A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford。

[0227] 此外，功能等同物还理解为意思是指，尤其是由根据本发明的核酸序列所编码蛋白质的各个核酸序列的天然或人工突变和来自其他生物的它们的同源物。

[0228] 因此，本发明还包括，例如，通过修饰SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29的核酸序列得到的那些核苷酸序列，至于shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为SEQ IDNO：72、74、76、78、80、82、84和/或86，至于G蛋白偶联受体为SEQ ID NO：129、133、137、
141、145、149、153、157、161、165、169和/或173，并且至于SK-通道为SEQ ID NO：227、229、
231。例如，此类修饰可以通过技术人员熟悉的技术，例如“定点诱变”、“易错PCR”、“DNA改组”(Nature370，1994， pp.389-391)或者“交错延伸方法”(Nature Biotechnol.16，1998，pp.258-261)产生。此种修饰的目的可以是，例如插入用于限制酶的更多的酶切位点、去除DNA以便将序列截短、替代核苷酸以优化密码子或加入更多的序列。由所修饰核酸序列编码的蛋白质必须保留预期的功能，尽管是有偏差的核酸序列，其是下列的生物学活性

[0229] i)昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)，或

[0230] ii)昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型，或

[0231] iii)选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的昆虫酚乙醇胺受体，或

[0232] iv)昆虫小电导Ca2+激活钾通道。

[0233] 因此功能等同物包括本文所述序列的天然存在变体和人工核酸序列，例如已经通过化学合成得到的那些和适应密码子选择以及从它们衍生的氨基酸序列的那些。

[0234] 对应于包含SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30，至于shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为SEQ ID NO：73、75、77、79、81、83、85和/或87，至于G蛋白偶联受体为SEQ ID NO：130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174，并且至于SK-通道为SEQ ID NO：228、230、232中所示多核苷酸的核酸分子的天然变体同源物的核酸分子，例如本发明的核酸分子和还可以是cDNA的核酸分子，可以基于它们与本文所公开核酸分子的同源性，使用SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29，至于shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为SEQ ID NO：72、74、76、78、80、82、84和/或86，至于G蛋白偶联受体为SEQ ID NO：129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173，并且至于SK-通道为SEQ ID NO：227、229、231中所示核酸分子，如本发明的核酸分子或其片段作为杂交探针，根据严格杂交条件下的标准杂交技术分离。

[0235] 有利地用于本发明方法的核酸分子可以基于它们与本文所公开核酸分子的同源性，使用序列或其部分作为杂交探针并在严格杂交条件下按照标准杂交技术分离。

[0236] 术语“同源性”意思是指，各个核酸分子或所编码的蛋白质是功能和/或结构等效的。与上述核酸分子同源和为所述核酸分子衍生物的核酸分子是，例如，核酸分子的变体，所述变体呈现出具有相同的生物学功能，特别是编码具有相同或者基本相同生物学功能的蛋白质的修饰。它们可以是天然存在的变体，例如来自其他植物品种或物种或突变的序列。这些突变可天然发生或者可通过诱变技术得到。等位基因变体可以是天然存在的等位基因变体以及合成产生的或遗传工程产生的变体。结构等同物可以通过例如测试所述多肽与抗体的结合或者基于计算机的预测鉴定。结构等同物具有相似的免疫学特性，例如包含相似的表位。

[0237] “杂交”意思是指，核酸分子在常规杂交条件，优选在严格杂交条件下，例如Sambrook(Molecular Cloning；A Laboratory Manual， 第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989))或Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中所述的条件下杂交。

[0238] 根据本发明，本发明核酸的DNA以及RNA分子可以用作探针。此外，作为用于鉴定功能同源物的模板，可以开展Northern印迹分析以及Southern印迹分析。Northern印迹分析有利地提供关于所表达基因产物的更多的信息：例如表达模式、加工步骤的出现，像剪接和加帽等。Southern印迹分析提供关于编码本发明核酸分子的基因的染色体定位和组织的附加信息。

[0239] 严格Southern印迹杂交条件的优选、非限定实例是，在6x氯化钠/柠檬酸钠(＝SSC)中于大约45℃下杂交，接着是在0.2x SSC，0.1％SDS中于50至65℃，例如在
50℃、55℃或60℃下开展一次或更多次的洗涤步骤。技术人员已知，这些杂交条件因核酸类型的不同而不同，并且例如 当存在有机溶剂时，关于温度和缓冲液的浓度的杂交条件因核酸类型的不同而不同。“标准杂交条件”下的温度因核酸类型的不同而不同，例如在具有0.1x、0.5x、1x、2x、3x、4x或5x SSC(pH7.2)浓度的水性缓冲液中在42℃和58℃之间，优选在45℃和50℃之间。如果在上述缓冲液中存在一种或多种有机溶剂，例如50％
甲酰胺，标准条件下的温度约40℃、42℃或45℃。对于DNA:DNA杂合体的杂交条件优选
的为例如0.1x SSC和20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃，优选在30℃和45℃之间。对于DNA:RNA杂合体的杂交条件优选的为例如0.1x SSC和30℃、35℃、40℃、45℃、50℃或
55℃，优选在45℃和55℃之间。对于例如在甲酰胺缺乏下长度约100bp(＝碱基对)和
50％的G+C含量的核酸确定了上述杂交温度。技术人员知道借助于教科书确定所需要的
杂交条件，例如上面提到的教科书或者下列教科书：Sambrook等，"Molecular Cloning"，Cold Spring Harbor Laboratory，1989；Hames 和 Higgins(Ed.)1985，"Nucleic Acids Hybridization：A Practical Approach"，IRL Press at Oxford University Press，
Oxford；Brown(Ed.)1991，"Essential Molecular Biology：A Practical Approach"，IRL Press at Oxford University Press，Oxford。

[0240] 一个此类严格杂交条件的其他实例是在4XSSC中于65℃下杂交，接着在0.1XSSC中于65℃下洗涤一小时。备选地，示例性的严格杂交条件是在50％甲酰胺，4XSSC中于42℃下杂交。此外，洗涤步骤过程中的条件可以选自由低严格条件(约2X SSC中于50℃下)和
高严格条件(约0.2XSSC中于50℃下，优选于65℃下)(20X SSC：0.3M柠檬酸钠，3M NaCl，pH7.0)所界定的条件范围。此外，洗涤步骤过程中的温度可以从室温约22℃的低严格条件升高约65℃的较高严格条件。

[0241] 盐浓度和温度参数两者可同时变化，或者两个参数之一可以保持恒定而仅另一个变化。在杂交过程中还可以使用变性剂，例如甲酰胺或SDS。在50％甲酰胺存在下，杂交优选地在42℃下实现。相关因素如i)处理长度、ii)盐浓度、iii)去污剂条件、iv)竞争DNA、v)温度和vi)探针选择可以 依情况组合以致于并非所有的可能性均在此提到。

[0242] 对于DNA杂交(Southern印迹分析)和洗涤步骤的条件的一些实例示于下面:

[0243] (1)可以从下列条件中选择杂交条件:

[0244] a)4X SSC，65℃,

[0245] b)6X SSC，45℃,

[0246] c)6X SSC，100mg/ml变性的片段化的鱼精DNA，68℃,

[0247] d)6X SSC，0.5％SDS，100mg/ml变性的鲑精DNA，68℃,

[0248] e)6X SSC，0.5％SDS，100mg/ml变性的片段化鲑精DNA，50％甲酰胺，42℃,

[0249] f)50％甲酰胺，4X SSC，42℃,

[0250] g)50％(vol/vol)甲酰胺，0.1％牛血清白蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，50mM磷酸钠缓冲液pH6.5，750mM NaCl，75mM柠檬酸钠，42℃,

[0251] h)2X或4X SSC，50℃(低严格条件)，或

[0252] i)30至40％甲酰胺，2X或4X SSC，42℃(低严格条件)。

[0253] (2)洗涤步骤可以从例如下列条件中选择:

[0254] a)0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS，50℃。

[0255] b)0.1X SSC，65℃。

[0256] c)0.1X SSC，0.5％SDS，68℃。

[0257] d)0.1X SSC，0.5％SDS，50％甲酰胺，42℃。

[0258] e)0.2X SSC，0.1％SDS，42℃。

[0259] f)2X SSC，65℃(低严格条件).

[0260] g)0,2XSSC，0,1％S DS，60℃(中高严格条件)，或

[0261] h)0,1XSSC，0,1％S DS，60℃(中高严格条件)，或

[0262] i)0,2XSSC，0,1％S DS，65℃(高严格条件)，或

[0263] h)0,1XSSC，0,1％S DS，65℃(高严格条件)。

[0264] 在一个实施方案中，术语“严格条件下的杂交”旨在描述对于这样的杂交和洗涤的条件，在该条件下彼此至少30％、40％、50％或65％同一性的核苷酸序列通常仍然彼此杂交。优选地，条件是这样的，以致于彼此至少约70％、更优选至少约75％或80％并且甚至更优选至少约85％、90％或95％或更高同一性的序列通常仍然保持彼此杂交。

[0265] 在一个实施方案中，本发明的核酸分子在严格条件下与SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29中所示序列，在shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基情况下SEQ ID
NO：72、74、76、78、80、82、84和/或86，在G蛋白偶联受体情况下SEQ ID NO：129、133、137、
141、145、149、153、157、161、165、169和/或173，并且在SK-通道情况下SEQ ID NO：227、
229、231中所示序列杂交，并且对应于天然存在的核酸分子。如本文所使用，“天然存在”核酸分子指具有自然出现的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如编码天然蛋白质)。

[0266] 除了在种群中存在的核酸或蛋白质序列的天然存在变体之外，技术人员将进一步地认识到，可通过向编码多肽的核酸分子的核苷酸序列中引入突变而引入改变，由此导致所编码多肽氨基酸序列中的改变并且由此改变多肽的功能能力，这意味着优选减少、降低或缺失所述活性。例如，导致“必需”氨基酸残基位置上氨基酸替代的核苷酸替代可以在本发明方法中待减少的核酸分子序列中进行，所述序列例如包含如SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29中所示对应核酸分子，在shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基情况下
SEQ ID NO：72、74、76、78、80、82、84和/或86，在G蛋白偶联受体情况下SEQ ID NO：129、
133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173，并且在SK-通道情况下SEQ ID NO：227、229、231。“必需”氨基酸残基是这样的残基，即如果来自一个多肽野生型序列的残基改变导致所述多肽活性改变，而“非必需”氨基酸残基对于蛋白质活性，例如对于作为酶或通道的活性而言是不需要的。“必需”残基的改变常常导致多肽活性减少、降低或缺失。
优选地，多肽氨基酸以如此方式改变以致于活性被减少、降低或缺失，这意味着优选 地必需氨基酸残基和/或更多非必需残基被改变并且由此在降低多肽的表达或活性之后活性
减少。然而，其它氨基酸残基(例如在具有所述活性的结构域中不保守的或仅半保守的那些)对于活性而言不是必需的，并且因此可以被改变而不改变所述活性，这是较不优选的。

[0267] 优选地，由核酸分子编码的蛋白质与SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示序列或者与包含SEQ ID NO：33和/或34中分别所示共有序列或分别选自SEQ IDNO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/ 或55、和 /或56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70和/或71的一个或更多个基序的序列至少约60％、70％或80％相同，更优选与SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30所示序列之一或者与包含SEQ ID NO：33和/或34中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID
NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或
56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70和/或71的一个或更多个基序的序列至少约85％同一，甚至更优选与SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示序列或者与包含SEQ ID NO：33和/或34中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：35、36、37、
38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或56、57、58、59、
60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70和/或71的一个或更多个基序的序列至少约90％、
91％、92％、93％、94％、95％同源，并且最优选与SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示序列或者与包含SEQ ID NO：33和/或34中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID
NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或
56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70和/或71的一个或更多个基序的序列至少约96％、97％、98％或99％同一。

[0268] 在shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基的情况下，优选地，由核酸分子编码的蛋白质与SEQ ID NO：73、75、77、79、81、83、85和/或87中所示序列或者与包含SEQ ID NO：102和/或103中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：104、105、106、107、108、109、
110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124和 / 或 125和 / 或
126、127和/或128的一个或更多个基序的序列至少约60％、70％或80％同一，更优选与
SEQ ID NO：73、75、77、79、81、83、85和/或87中所示序列或者与包含SEQ ID NO：102和/或103中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：104、105、106、107、108、109、110、111、
112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一个或更多个基序的序列至少约85％同一，甚至更优选与SEQ ID NO：73、75、77、
79、81、83、85和/或87中所示序列或者与包含SEQ ID NO：102和/或103中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、
117、118、119、120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一个或更多个基序的序列至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％同源，并且最优选与SEQ ID NO：73、
75、77、79、81、83、85和/或87中所示序列或者与包含SEQ ID NO：102和/或103中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、
115、116、117、118、119、120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一个或更多个基序的序列至少约96％、97％、98％或99％同一。

[0269] 在G蛋白偶联受体的情况下，优选地，由核酸分子编码的蛋白质与SEQ ID NO：130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174中所示序列或者与包含SEQ ID NO：177、178和/或179中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：180、181、182、183、
184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、194、195、 196、197、198、199、
200、201、202、203、204、205、206、207和/或208、和/或209、210、211、212、213、214、215、
216、217、218、219、220、221、222、223、224、225和/或226的一个或更多个基序的序列至少约60％、70％或80％同一，更优选与SEQ ID NO：130、134、138、142、146、150、154、158、162、
166、170和/或174中所示序列或者与包含SEQ ID NO：177、178和/或179中分别所示共
有序列或分别选自SEQ ID NO：180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207和/或208、和/或209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、
225和/或226的一个或更多个基序的序列至少约85％同一，甚至更优选与SEQ ID NO：
130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174中所示序列或者与包含SEQ ID NO：177、178和/或179中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：180、181、182、183、
184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、194、195、196、197、198、199、
200、201、202、203、204、205、206、207和/或208、和/或209、210、211、212、213、214、215、
216、217、218、219、220、221、222、223、224、225和/或226的一个或更多个基序的序列至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％同源，并且最优选与SEQ ID NO：130、134、138、142、
146、150、154、158、162、166、170和/或174中所示序列或者与包含SEQ ID NO：177、178和/或179中分别所示共有序列或者分别选自SEQ ID NO：180、181、182、183、184、185、186、
187、188、189和/或190、和/或191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、
203、204、205、206、207和/或208、和/或209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、
219、220、221、222、223、224、225和/或226的一个或更多个基序的序列至少约96％、97％、
98％或99％同一。

[0270] 在SK-通道的情况下，优选地，由核酸分子编码的蛋白质与SEQ ID NO：228、230、232中所示序列或者与包含SEQ ID NO：239所示共有序列或者选自SEQ ID NO：240、241、
242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252和253的一个或更多个基序的序列至少约60％、70％或80％同一，更优选与SEQ ID NO：228、230、232中所示序列或者与包含SEQ ID NO：239所示共有序列或者选自SEQ ID NO：240、241、242、243、244、245、246、247、248、
249、250、251、252和253的一个或更多个基序的序列至少约85％同一，甚至更优选与SEQ ID NO：228、230、232中所示序列或者与包含SEQ ID NO：239所示共有序列或者选自SEQ ID NO：240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252和253的一个或更多个基序的序列至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％同源，并且最优选与SEQ ID NO：228、
230、232所示序列或者与包含SEQ ID NO：239所示共有序列或者选自SEQ ID NO：240、241、
242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252和253的一个或更多个基序的序列至少约96％、97％、98％或99％同一。

[0271] 为了确定两个氨基酸序列或者两个核酸分子的同源性(＝同一性)百分数，将一个序列写在另一个序列的下方以便优化比较。可以向蛋白质或核酸分子序列中插入空位以便产生与另一蛋白质或者另一核酸的最佳比对。然后在两个聚合物之间比较对应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或者核苷酸。如果在一个序列中的一个位置被与另一序列对应位置上的相同的氨基酸残基或相同的核苷酸占据，则在该位置上分子是相同的。氨基酸或者核苷酸“同一性”，如在本文上下文中所使用，对应于氨基酸或者核酸“同源性”。通常，两个序列之间的同源性百分数是序列共享的相同位置数量的函数(即％同源性＝相同位置数量/总位置数量x100)。因此，术语“同源性”和“同一性”被认为对于本说明书是同义词。

[0272] 为了确定两个或更多个氨基酸序列或者两个或更多个核苷酸序列之间的同源性(＝同一性)百分数，已经开发出数个计算机软件程序。两个或更多 个序列的同源性可用软件fasta计算，其目前已经有版本fasta3在使用(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，
Improved Tools for Biological Sequence Comparison.PNAS85:2444-2448；
W.R.Pearson(1990)Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and
FASTA，Methods in Enzymology183:63-98；W.R.Pearson 和 D.J.Lipman(1988)Improved Tools for Biological Sequence Comparison.PNAS85:2444-2448；W.R.Pearson(1990)；
Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA Methods in
Enzymology183:63–98)。用于计算不同序列同源性的另一有用的程序是标准的blast程
序，其包含在Biomax pedant软件之中(Biomax，Munich，德意志联邦共和国)。不幸的是，这有时产生亚最佳的结果，因为blast不是经常把目标和查询序列的全部包括在内。虽然该序列极其有效，其可以用于比较极大数量的序列。对于此类序列比较有代表性地使用下列设置：-p程序名称[字符串]；-d数据库[字符串]；默认＝nr；-i查询文件[文件输
入]；默认＝stdin；-e期望值(E)[Real]；默认＝10.0；-m比对观察选项：0＝配对；1＝查询锚定的显示同一性；2＝查询锚定的无同一性；3＝平面查询锚定的，显示同一性；4＝平面查询锚定的，无同一性；5＝查询锚定的无同一性和平端；6＝平面查询锚定的，无同一性和平端；7＝XML Blast输出；8＝列表；9带有注解行的列表[整数]；默认＝0；-o BLAST报告输出文件[文件输出]可选；默认＝stdout；-F过滤查询序列(DUST具有blastn，
SEG具有其他)[字符串]；默认＝T；-G空位打开代价(零调用默认行为)[整数]；默认
＝0；-E空位延长代价(零调用默认行为)[整数]；默认＝0；-X对于有空位比对的X减少
(in bits)(零调用默认行为)；blastn30，megablast20，tblastx0，所有其他15[整数]；
默认＝0；-I Show GI's in deflines[T/F]；默认＝F；-q核苷酸错配罚分(仅blastn)
[整数]；默认＝-3；-r核苷酸匹配奖励(仅blastn)[整数]；默认＝1；-v对于(V)显示
一行描述的数据库序列数量[整数]；默认＝500；-b显示对于(B)比对的数据库序列数
量[整数]；默认＝250；-f对于延长命中的阈值，如果是零为默认；blastp11，blastn0， blastx12，tblastn13；tblastx13，megablast0[整数]；默认＝0；-g执行有缺口的比对(对于tblastx不可用)[T/F]；默认＝T；-Q使用的查询遗传密码子[整数]；默认＝1；-D DB
遗传密码子(仅对于tblast[nx])[整数]；默认＝1；-a使用的处理器数量[整数]；默认
＝1；-O SeqAlign文件[文件输出]可选；-J相信查询defline[T/F]；默认＝F；-M矩阵
[字符串]；默认＝BLOSUM62；-W字大小，如果是零为默认(blastn11，megablast28，所有其他3)[整数]；默认＝0；-z数据库的有效长度(对应真实大小使用零)[真]；默认＝0；-K
来自待保留区域的最佳命中数(默认为关，如果使用则数值100是推荐的)[整数]；默认
＝0；-P对于多次命中为0，对于一次命中为1[整数]；默认＝0；-Y搜索空间的有效长度
(对于真实大小使用零)[真]；默认＝0；-S针对数据库搜索的查询链(对于blast[nx]，
和tblastx)；3是两者，1是上面的，2是下面的[整数]；默认＝3；-T产生HTML输出[T/
F]；默认＝F；-l对数据库搜索限制于GI's列表[字符串]可选；-U使用小写过滤FASTA
序列[T/F]可选；默认＝F；-y在命中中对于非空位延伸的X减少值(0.0调用默认行为)；
blastn20，megablast10，所有其他7[真]；默认＝0.0；-Z在命中中对于最终缺口比对的X减少值(0.0调用默认行为)；blastn/megablast50，tblastx0，所有其他25[整数]；默
认＝0；-R PSI-TBLASTN检查点文件[文件输入]可选；-n MegaBlast搜索[T/F]；默认＝
F；-L查询序列上的位置[字符串]可选；-A多重命中窗口大小，如果是零为默认(blastn/megablast0，所有其他40[整数]；默认＝0；-w移码罚分(对blastx为OOF算法)[整数]；
默认＝0；-t用于连接HSPs的tblastn中允许的最大内含子长度(0不能连接)[整数]；
默认＝0。

[0273] 通过使用Needleman和Wunsch或者Smith和Waterman算法达到高质量的结果。因此基于所述算法的程序是优选的。有利的，序列比较可以用程序PileUp(J.Mol.
Evolution.，25，351-360，1987，Higgins等，CABIOS，51989：151–153)或优选用程序Gap和BestFit进行，它们分别基于Needleman和Wunsch[J.Mol.Biol.48；443-453(1970)]
以及Smith和 Waterman[Adv.Appl.Math.2；482-489(1981)]的算法。两个程序是GCG
软件包的一部分[Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711(1991)；Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25:3389以及下列等等]。因
此，优选地使用Gap程序在序列的整个范围上开展计算以确定序列同源性百分数。对于核酸序列比较使用下列标准调整：空位加权：50，长度加权：3，平均匹配：10.000，平均错配：
0.000。

[0274] 例如在核酸水平与SEQ ID NO.：1所示序列具有80％同源性的序列理解为意思是指，当通过上述Gap程序算法应用上述参数设置与SEQ ID NO：1的序列比较时序列具有
80％同源性。

[0275] 两个多肽之间的同源性理解为意思是指，通过借助于程序算法Gap(WisconsinPackage Version10.0，University of Wisconsin，Genetics Computer Group(GCG)，
Madison，USA)，设置以下参数：空位加权：8；长度加权：2；平均匹配：2.912；平均错配：-2.003经比较计算的，每一情况下整个序列长度上的氨基酸序列的同一性。

[0276] 例如在蛋白质水平与SEQ ID NO：2的序列具有80％同源性的序列理解为意思是指，当通过上述Gap程序算法应用上述参数设置与SEQ ID NO：2的序列比较时序列具有
80％同源性。

[0277] 根据本发明通过取代、插入或者缺失，从SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30所示多肽之一或者包含SEQ ID NO：33和/或34中分别所示共有序列或分别选自SEQ
ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70和/或71的一个或更多个基序的序列之一衍生的功能等同物，与SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30所示多肽之一或者包含SEQ ID NO：33和/或34中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：35、36、37、
38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或56、57、58、59、
60、61、62、63、64、 65、66、67、68、69、70和/或71的一个或更多个基序的多肽之一具有至少
30％、35％、40％、45％或50％，优选至少55％、60％、65％或70％，优选至少80％，特别优选至少85％或90％、91％、92％、93％或94％，非常特别优选至少95％、97％、98％或99％同源性，并且通过与SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽具有基本相同的特性相区别。

[0278] 根据本发明通过取代、插入或者缺失，从SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29所示核酸序列衍生的功能等同物与SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29中所示的根据本发明的核酸具有至少30％、35％、40％、45％或50％，优选至少55％、60％、65％或70％优选至少80％，特别优选至少85％或90％、91％、92％、93％或94％，非常特别优选至少95％、97％、98％或99％同源性，并且编码与SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽具有基本相同特性的多肽。

[0279] 以shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为例，根据本发明通过取代、插入或者缺失，从SEQ ID NO：73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽之一或者包含SEQ ID NO：102和/或103中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：104、105、106、107、108、109、
110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124和 / 或 125和 / 或
126、127和/或128的一个或更多个基序的多肽之一衍生的功能等同物，与SEQ ID NO：73、
75、77、79、81、83、85和/或87中所示多肽之一或者包含SEQ ID NO：102和/或103中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、
115、116、117、118、119、120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一个或更多个基序的多肽之一具有至少30％、35％、40％、45％或50％，优选至少55％、60％、
65％或70％，优选至少80％，特别优选至少85％或90％、91％、92％、93％或94％，非常特别优选至少95％、97％、98％或99％同源性，并且通过与SEQ ID NO：73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽具有基本相同的特性相区别。

[0280] 以shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为例，根据本发明通过取代、插入或者缺失，从SEQ ID NO：72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸序列衍生的功能等同物，与根据本发明的SEQ ID NO：72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸之一具有至少30％、35％、40％、45％或50％，优选至少55％、60％、65％或70％，优选至少80％，特别优选至少85％或90％、91％、92％、93％或94％，非常特别优选至少95％、97％、98％或99％同源性，并且编码与SEQ ID NO：73、75、77、79、81、83、85和/或87中所示多肽具有基本相同特性的多肽。

[0281] 以G蛋白偶联受体为例，根据本发明通过取代、插入或者缺失，从SEQ ID NO：130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174中所示多肽之一或者包含SEQ ID NO：177、178和/或179中分别所示共有序列或者分别选自SEQ ID NO：180、181、182、183、
184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、194、195、196、197、198、199、
200、201、202、203、204、205、206、207和/或208、和/或209、210、211、212、213、214、215、
216、217、218、219、220、221、222、223、224、225和/或226的一个或更多个基序的多肽之一衍生的功能等同物，与SEQ ID NO：130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174中所示多肽之一或者包含SEQ ID NO：177、178和/或179中分别所示共有序列
或分别选自SEQ ID NO：180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或
191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207和/或208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和/或226的一个或更多个基序的多肽之一具有至少30％、35％、40％、45％或50％，优选至少55％、60％、65％或70％，优选至少80％，特别优选至少85％或90％、91％、92％、93％或
94％，非常特别优选至少 95％、97％、98％或99％同源性，并且通过与SEQ ID NO：130、134、
138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174所示多肽具有基本相同的特性相区别。

[0282] 以G蛋白偶联受体为例，根据本发明通过取代、插入或者缺失，从SEQ ID NO：129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173中所示核酸序列衍生的功能等同物，与根据本发明的SEQ ID NO：129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或
173中所示核酸之一具有至少30％、35％、40％、45％或50％，优选至少55％、60％、65％或
70％，优选至少80％，特别优选至少85％或90％、91％、92％、93％或94％，非常特别优选至少95％、97％、98％或99％同源性，并且编码与SEQ ID NO：130、134、138、142、146、150、
154、158、162、166、170和/或174中所示多肽具有基本相同特性的多肽。

[0283] 以SK-通道为例，根据本发明通过取代、插入或者缺失，从SEQ ID NO：228、230、232所示多肽之一或者包含SEQ ID NO：239中所示共有序列或选自SEQ ID NO：240、241、
242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252和253的一个或更多个基序的多肽之一衍生的功能等同物，与SEQ ID NO：228、230、232中所示多肽之一或者包含SEQ ID NO：239所示共有序列或选自SEQ ID NO：240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、
252和253的一个或更多个基序的多肽之一具有至少30％、35％、40％、45％或50％，优选至少55％、60％、65％或70％，优选至少80％，特别优选至少85％或90％、91％、92％、93％或
94％，非常特别优选至少95％、97％、98％或99％同源性，并且通过与SEQ ID NO：228、230、
232所示多肽具有基本相同的特性相区别。

[0284] 以SK-通道为例，根据本发明通过取代、插入或者缺失，从SEQ ID NO：227、229、231中所示核酸序列衍生的功能等同物，与根据本发明的SEQ ID NO：227、229、231中所示核酸之一具有至少30％、35％、 40％、45％或50％，优选至少55％、60％、65％或70％，优选至少80％，特别优选至少85％或90％、91％、92％、93％或94％，非常特别优选至少95％、
97％、98％或99％同源性，并且编码与SEQ ID NO：228、230、232中所示多肽具有基本相同特性的多肽。

[0285] 在一个实施方案中，两个核酸序列或多肽序列之间的“同源性”或“同一性”通过每一情况中核酸序列/多肽序列整个序列长度上的同一性定义，同一性通过借助于设置如下参数:空位加权：8；长度加权：2；平均匹配：2,912；平均错配:-2,003以程序算法GAP(Wisconsin Package Version10.0，University of Wisconsin，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，USA)进行的比对计算。

[0286] 在下文中，术语同一性也代替术语“同源的”或“同源性”同义地使用。

[0287] “突变”包括取代、添加、缺失、倒位或插入一个或更多个核苷酸残基，这也可通过取代、插入或者缺失一个或更多个氨基酸带来靶标蛋白质对应氨基酸序列的改变。

[0288] 在一个实施方案中，本发明涉及选自下列的分离的核酸分子：

[0289] a)编码SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子；

[0290] b)SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29中所示核酸分子；

[0291] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30的多肽序列；

[0292] d)与包含SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0293] e)核酸分子，编码与(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且分别具有电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或
其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽；

[0294] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0295] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且分别具有电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽产生；

[0296] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO：33和/或34中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或
55、和/或56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70和/或71的一个或更多个基序的多肽；

[0297] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：7、8；9、10；11、12中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；

[0298] 和

[0299] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中所表征核酸分子序列互补并编码分别具有电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助
蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、
50nt、100nt、200nt或500nt。

[0300] 以shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为例，在一个实施方案中，本发明涉及选自下列的分离的核酸分子：

[0301] a)编码包含SEQ ID NO：73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽的多肽的核酸分子；

[0302] b)包含SEQ ID NO：72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸分子的核酸分子；

[0303] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自包含根据SEQ ID NO：73、75、77、79、81、83、85和/或87的多肽序列的多肽；

[0304] d)与包含SEQ ID NO：72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0305] e)核酸分子，编码与(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且分别具有Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或
C亚型活性的多肽；

[0306] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0307] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且分别具有Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活性的多肽产生；

[0308] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO：102和/或103中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、
120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一个或更多个基序的多肽；

[0309] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：88、89；90、91；92、93；94、95；96、97；98、99和/或100、101中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到

[0310] 和

[0311] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中所表征核酸分子序列互补并编码分别具有Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚
型活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。

[0312] 以G蛋白偶联受体为例，在一个实施方案中，本发明涉及选自下列的分离的核酸分子：

[0313] a)编码SEQ ID NO：130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174中所示多肽的核酸分子；

[0314] b)SEQ ID NO：129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173中所示核酸分子；

[0315] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自包含根据SEQ ID NO：130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174的多肽序列的多肽；

[0316] d)与包含SEQ ID NO：129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0317] e)核酸分子，编码与(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的多肽；

[0318] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0319] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且具有选自优选来自黑腹果蝇的oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的多肽产生；

[0320] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO：177、178和/或179中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207和/或208、和/或209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225和/或
226的一个或更多个基序的多肽；

[0321] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：131、132；135、136；139、140；143、144；147、148；151、152；155、156、159、160；163、164；167、168；171、172和/或175、176中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到

[0322] 和

[0323] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中所表征核酸分子序列互补并编码具有选自优选来自黑腹果蝇的oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。

[0324] 以SK-通道为例，在一个实施方案中，本发明涉及选自下列的分离的核酸分子：

[0325] a)编码SEQ ID NO：230、232中所示多肽的核酸分子；

[0326] b)SEQ ID NO：229、231中所示核酸分子；

[0327] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO：230、232的多肽序列；

[0328] d)与包含SEQ ID NO：229、231所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0329] e)核酸分子，编码与(a)至(c)核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽；

[0330] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0331] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽产生；

[0332] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO：239中所述共有序列或选自SEQ ID NO：240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252和253的一个或更多个基序的多肽；

[0333] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：233、234、235、236；和237、238中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到

[0334] 和

[0335] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中所表征核酸分子序列互补并编码具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、
30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。

[0336] 在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明分离的核酸分子的核酸构建体。

[0337] 在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明核酸构建体或者分离的核酸分子的载体。

[0338] 在一个实施方案中，本发明涉及通过转染/转化方式包含本发明的载体、核酸构建体或者分离的核酸分子的转基因宿主细胞。

[0339] “分离的”多核苷酸或者核酸分子与存在于该核酸分子天然来源的其它多核苷酸或者核酸分子分离。分离的核酸分子可以是数kb的染色体片段，或者优选地仅包含基因编码区的分子。因此，分离的核酸分子可包含临近5’和3’的染色体区或者进一步临近染色体区，但是优选地不包含如此的序列，即其天然位于在核酸分子所来源生物基因组或染色体背景中核酸分子的侧翼(例如临近编码核酸分子5’-和3’-UTR区的序列)。在多种实施方案中，在根据本发明的方法中使用的分离的核酸分子可以例如包含小于约5kb、4kb、3kb、
2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，这些核苷酸序列天然位于核酸分子所来源细胞基因组DNA中核酸分子的侧翼。

[0340] 在方法中使用的核酸分子或其部分可以使用分子生物学标准技术和本文提供的序列信息分离。同样，例如在DNA或者氨基酸水平同源的序列或者同源、保守序列区可以借助于比较算法鉴定。前者可以用作标准杂交技术(例如Sambrook等，Molecular Cloning：
A Laboratory Manual.2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中描述的那些)下的杂交探针用于分离在该方法中有用的更多的核酸序列。

[0341] 包含其活性待在本发明方法中降低的分子的整个序列或其部分的核酸分子，可额外地通过聚合酶链式反应、基于被使用的该序列或其部分的寡核苷酸引物分
离。例如，包含完整序列或其部分的核酸分子可以通过聚合酶链式反应使用已经基于
该每一序列产生的寡核苷酸引物分离。例如，mRNA可以通过例如Chirgwin等(1979)
Biochemistry18:5294-5299的硫氰酸胍提取法从细胞分离，并且cDNA可通过逆转录酶
(例如Moloney MLV逆转录酶，可从Gibco/BRL，Bethesda，MD得到，或AMV逆转录酶，可从Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL得到)产生。

[0342] 用于通过聚合酶链式反应扩增的合成的寡核苷酸引物可以基于本文所示序列产生。此类引物可以用于从cDNA文库或者从基因组文库扩增核酸序列和鉴定在本发明方法
中有用的核酸分子。

[0343] 此外，通过与根据本发明方法待减少的核酸分子所编码蛋白质，特别是SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29中所示核酸分子，在shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基情况下，SEQ ID NO：72、74、76、78、80、82、84和/或86，在G蛋白偶联受体情况下，SEQ ID NO：129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173，并且在SK-通道情况下，SEQ ID NO：227、229、231所编码的序列开展蛋白质序列比对，可以鉴定来自不同生物的保守区，并且反过来从这些保守区可以衍生简并引物。

[0344] 保守区是在来自不同来源的数个同源物的一个特定位置中的氨基酸极少变异的那些区。本文所示的共有序列和多肽基序衍生自所述比对。此外，通过与根据本发明方法待减少的核酸分子所编码蛋白质，特别是由SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30所示多肽分子编码的序列，至于shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为SEQ ID NO：73、
75、77、79、81、83、85和/或87，至于G蛋白偶联受体为SEQ ID NO：130、134、138、142、146、
150、154、158、162、166、170和/或174，并且至于SK-通道为SEQ ID NO：228、230、232开展蛋白质序列比对，可以鉴定来自多种生物的保守区，并且反过来从这些保守区可以衍生简并引物。

[0345] 保守区是在来自不同来源的数个同源物的一个特定位置中的氨基酸极少变异的那些区。本文所示的共有序列和多肽基序衍生自所述比对。在一个有利的实施方案中，在本发明方法中，包含SEQ ID NO：33和/或34，至于shaker通道和/或Hyperkineticβ亚
基为SEQ ID NO：102和/或103，至于G蛋白偶联受体为SEQ ID NO：177、178和/或179，
并且至于SK-通道为SEQ ID NO：239所示共有序列或者选自SEQ ID NO：35、36、37、38、39、
40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或56、57、58、59、60、61、
62、63、64、65、66、67、68、69、70和/或71，至于shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为SEQ ID NO：104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、
120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128，至于G蛋白偶联受体为SEQ ID NO：180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、194、
195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207和/或208、和/或209、210、
211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225和/或226，并且至于SK-通道为SEQ ID NO：240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252和253的一个或更多个基序的多肽或者由它们组成的多肽的活性被降低，并且在另一个实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID NO：33和/或34，至于shaker通道和/或Hyperkineticβ亚
基为SEQ ID NO：102和/或103，至于G蛋白偶联受体为SEQ ID NO：177、178和/或179，
并且至于SK-通道为SEQ ID NO：239所示共有序列或者选自SEQ ID NO：35、36、37、38、39、
40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或56、57、58、59、60、61、
62、63、64、65、66、67、68、69、70和/或71，至于shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为SEQ ID NO：104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、
120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128，至于G蛋白偶 联受体为SEQ ID NO：180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、194、
195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207和/或208、和/或209、210、
211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225和/或226，并且至于SK-通道为SEQ ID NO：240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252和253的一个或更多个基序的多肽或者由它们组成的多肽，由此所指定的20或更少、优选15或
10、优选9、8、7或6、更优选5或4、甚至更优选3、甚至更优选2、甚至更优选1、最优选0个氨基酸位置被任意氨基酸代替。在一个实施方案中，由字母指定的不大于15％、优选10％、甚至更优选5％、4％、3％或2％、最优选1％或0％的氨基酸位置被另一氨基酸代替。在一个实施方案中，20或更少、优选15或10、优选9、8、7或6、更优选5或4、甚至更优选3、甚至更优选2、甚至更优选1、最优选0个氨基酸被插入至共有序列或蛋白质基序中。

[0346] 共有序列衍生自如SEQ ID NO:2、6、10、14、18、22、26和/或30，至于shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为SEQ ID NO73、75、77、79、81、83、85和/或87，至于G蛋白偶联受体为SEQ ID NO130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174，并且至于SK-通道为SEQ ID NO228、230、232所示序列的多重比对。字母表示单字母氨基酸密码子并且表明氨基酸在所有比对的蛋白质中是保守的。字母X代表在所有序列中不保守的氨基酸。

[0347] 保守结构域从所有序列鉴定并且使用亚类标准Prosite标记法描述，例如模式Y-x(21,23)-[FW]意思是指，保守酪氨酸被来自苯丙氨酸或色氨酸的最小21和最大23个氨基酸残基分隔开。

[0348] 保守模式使用软件工具MEME版本3.5.1或者手工鉴定。MEME由TimothyL.Bailey和Charles Elkan，Dept.of Computer Science and Engeneering，University of California，San Diego，USA开发并且由Timothy L.Bailey和Charles Elkan[Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in
biopolymers,Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology,pp.28-36,AAAI Press,Menlo Park,California,1994]描述。独立程序的源代码可以从San Diego Supercomputer center(http://meme.sdsc.
edu)公开获得。

[0349] 为了用软件工具MEME鉴定所有序列中的共同基序，使用下列设置：-maxsize500000，-nmotifs15，-evt0.001，-maxw60，-距离1e-3，-minsites用于分析的序列数。对于MEME的输入序列是Fasta格式的非对齐的序列。其它参数在该软件版本中使用默认设置。

[0350] 对于保守结构域的Prosite模式使用软件工具Pratt版本2.1或手工产生。Pratt由Inge Jonassen，Dept.of Informatics，University of Bergen，Norway开发
并 由 Jonassen 等 .[I.Jonassen，J.F.Collins and D.G.Higgins，Finding flexible patterns in unaligned protein sequences,Protein Science4(1995),pp.1587-1595；
I.Jonassen,Efficient discovery of conserved patterns using a pattern
graph,Submitted to CABIOS Febr.1997]描述。对于独立程序的源代码(ANSI C)在例如
建立的生物信息中心像EBI(European Bioinformatics Institute)中公开得到。

[0351] 为了使用软件工具Pratt产生模式，使用下列设置：PL(max Pattern Length)：100，PN(max Nr of Pattern Symbols)：100，PX(max Nr of consecutive x's)：30，FN(max Nr of flexible spacers)：5，FL(max Flexibility)：30，FP(max Flex.Product)：10，ON(max number patterns)：50。对于Pratt的输入序列是如从软件工具MEME所鉴定的表
现出高相似性的蛋白质序列的不同区。不得不匹配所产生模式的序列的最低数量(CM，min Nr of Seqs to Match)被设置成是所提供序列的至少80％。本文未提到的参数使用它们
的默认设置。

[0352] 保守结构域的Prosite模式可以用于搜寻匹配该模式的蛋白质序列。多个建立的生物信息中心提供公开的英特网入口用于在数据库搜索中使用那些模式(例如PIR[蛋白质信息资源，位于Georgetown University Medical Center]或ExPASy[Expert Protein Analysis System])。备选地，可利用独立软件，像程序Fuzzpro，它是EMBOSS软件包的部分。例如，程序Fuzzpro不但允许搜索精确的模式-蛋白质匹配，而且还允许在开展的搜索中设置不同的模糊。

[0353] 比对使用软件ClustalW(版本1.83)开展并描述于Thompson等.[Thompson，J.D.，Higgins，D.G.and Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting，
positions-specific gap penalties and weight matrix choice.Nucleic Acids
Research,22:4673-4680]。 对 立 程 序 的 源 代 码 从European Molecular Biology Laboratory；Heidelberg，Germany公开获得。分析使用ClustalW v1.83默认参数(空位
开口罚分：10.0；空位延长罚分：0.2；蛋白质矩阵：Gonnet；pprotein/DNA endgap：-1；蛋白质/DNA gapdist：4)开展。

[0354] 然后，如上述设计的简并引物可被PCR采用用于扩增编码具有上述活性的蛋白质的新编码区片段。

[0355] 然后，这些片段可用作杂交探针用于分离完整的基因序列。备选地，缺失的5’和3’序列可以通过RACE-PCR手段分离。根据本发明的核酸分子可以使用cDNA，备选地使用基因组DNA作为模板和适宜寡核苷酸引物，按照标准PCR扩增技术扩增。因此，扩增的核酸分子可以被克隆入适宜的载体中并通过DNA序列分析的方式表征。对应于用于本发明方法的核酸分子之一的寡核苷酸可以通过标准合成方法，例如使用自动DNA合成仪产生。

[0356] 有利地用于根据本发明方法的核酸分子可以基于它们与本文所公开核酸分子的同源性，使用序列或其部分作为杂交探针并且按照严格杂交条件下的标准杂交技术分离。

[0357] 在一个实施方案中，本发明涉及由选自下列的核酸分子编码的多肽:

[0358] a)编码SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子；

[0359] b)SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29中所示核酸分子；

[0360] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30的多肽序列；

[0361] d)与包含SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0362] e)核酸分子，编码与(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且分别具有电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或
其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽；

[0363] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0364] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且分别具有电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽产生；

[0365] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO：33和/或34中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或
55、和/或56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70和/或71的一个或更多个基序的多肽；

[0366] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：7、8；9、10；11、12中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到

[0367] 和

[0368] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中所表征核酸分子序列互补并编码分别具有电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助
蛋白KChIP(钾通道相互作 用蛋白)活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、
50nt、100nt、200nt或500nt。

[0369] 以shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为例，在一个实施方案中，本发明涉及由选自下列的核酸分子编码的多肽:

[0370] a)编码SEQ ID NO：73、75、77、79、81、83、85和/或87中所示多肽的核酸分子；

[0371] b)SEQ ID NO：72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子；

[0372] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO：73、75、77、79、81、83、85和/或87的多肽序列；

[0373] d)与包含SEQ ID NO：72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0374] e)核酸分子，编码与(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且分别具有Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或
C亚型活性的多肽；

[0375] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0376] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且分别具有Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活性的多肽产生；

[0377] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO：102和/或103中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、
120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一个或更多个基序的多肽；

[0378] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：88、89；90、91；92、93；94、95；96、97；98、99和/或100、101中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到

[0379] 和

[0380] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分 子，所述探针包含(a)或(b)核酸分子的互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中所表征核酸分子序列互补并编码分别具有Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或
C亚型活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。

[0381] 以G蛋白偶联受体为例，在一个实施方案中，本发明涉及由选自下列的核酸分子编码的多肽:

[0382] a)编码SEQ ID NO：130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174中所示多肽的核酸分子；

[0383] b)SEQ ID NO：129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173中所示核酸分子；

[0384] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO：130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174的多肽序列；

[0385] d)与包含SEQ ID NO：129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0386] e)核酸分子，编码与核酸分子(a)至(c)所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且具有选自优选来自黑腹果蝇的oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的多肽；

[0387] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0388] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的多肽产生；

[0389] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO：177、178和/或179中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207和/或208、和/或209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、 222、223、224、225和/或
226的一个或更多个基序的多肽；

[0390] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：131、132；135、136；139、140；143、144；147、148；151、152；155、156、159、160；163、164；167、168；171、172和/或175、176中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到

[0391] 和

[0392] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中所表征核酸分子序列互补并编码具有选自优选来自黑腹果蝇的oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。

[0393] 以SK-通道为例，在一个实施方案中，本发明涉及由选自下列的核酸分子编码的多肽:

[0394] a)编码SEQ ID NO：230、232中所示多肽的核酸分子；

[0395] b)SEQ ID NO：229、231中所示核酸分子；

[0396] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO：230、232的多肽序列；

[0397] d)与包含SEQ ID NO：229、231所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0398] e)核酸分子，编码与(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽；

[0399] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0400] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽产生；

[0401] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO：239中所述共有序列或选自SEQ ID NO：240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252和253的一个或更多个基序的多肽；

[0402] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：233、234、235、236；和237、238中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到

[0403] 和

[0404] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中所表征核酸分子序列互补并编码具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、
30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。

[0405] 在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明多肽的膜，由此膜不具有本发明多肽的内源活性。

[0406] 在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明多肽的宿主细胞，由此宿主的膜不显示本发明多肽的内源活性。

[0407] 措辞“膜不具有本发明多肽的最初活性”意思是指，本发明的多肽不是天然存在膜的部分，但是其被装配入根据本发明方法的膜中。

[0408] 在一个实施方案中，本发明方法包括编码分别具有下列活性的多肽的基因的表达[0409] i)在宿主膜中的昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)，或

[0410] ii)在宿主膜中的昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型，或

[0411] iii)在宿主膜中的选自优选来自黑腹果蝇的oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的昆虫酚乙醇胺受体，或

[0412] iv)在宿主膜中的昆虫小电导Ca2+激活钾通道。

[0413] 在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。

[0414] 在一个实施方案中，宿主细胞是在其天然状态下具有低或者无兴趣的电活性的细胞。与此相比，表达本发明多肽的宿主细胞显示选自2-20pS、3-20pS、4-15pS、5-12pS和5-10pS间隔的电导。

[0415] 在一个实施方案中，宿主细胞选自CHO细胞、HEK293、COS、HeLa、NIH3T3、BAK21、Jurkat、CV-1、HepC-2-、爪蟾卵母细胞；Sf9、S2、Sf21、Hi5、Pc12、U2OS。

[0416] 为了产生包含具有下列活性的本发明多肽的本发明宿主细胞

[0417] i)离子通道和/或其辅助蛋白，编码多肽的核苷酸序列，或

[0418] ii)离子通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型，编码多肽的核苷酸序列，或

[0419] iii)酚乙醇胺受体和优选额外的标记蛋白质，如GFP，和/或额外的“泛宿主性”G-蛋白，编码多肽的至少一个核苷酸序列，或

[0420] iv)离子通道，编码多肽的核苷酸序列被引入其被重组产生的宿主细胞中。

[0421] 在一个实施方案中，宿主细胞是微生物，其中编码具有下列活性的多肽的核苷酸序列被根据描述于例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，"Molecular Cloning：A Laboratory Manual"，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)的一般克隆技术引入以增殖所述核苷酸序列

[0422] i)本发明的钾离子通道和/或其辅助蛋白，或

[0423] ii)本发明的钾离子通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型，或

[0424] iii)本发明的酚乙醇胺受体和优选额外标记蛋白质，如GFP，和/或额外的“泛宿主性”G-蛋白，或

[0425] iv)本发明的通道。

[0426] 上述核酸分子可以与更多的基因一起被克隆入根据本发明的核酸构建体或者载体中，或者不同的基因通过将数个核酸构建体或载体(包括质粒)转化入宿主细胞中而引
入。

[0427] 因此，本发明还涉及包含功能性连接至一个或更多个调节元件或信号的用于本发明方法中的一个或多个核酸分子或其片段的核酸构建体，优选 表达构建体。此外，本发明还涉及用于产生同源重组事件的包含用于本发明方法的核酸分子或其部分的核酸构建体。

[0428] 核酸构建体还可以包含待引入宿主细胞内的更多的基因。

[0429] 如本文所述，调节序列或因子可对优选引入的构建体的表达具有正作用，因此增加构建体的表达。因此，通过使用强转录信号例如启动子和/或增强子可有利地在转录水平发生调节元件的增强。此外，然而，转录的增强也可通过例如增加RNA稳定性实现。

[0430] 因此，本发明的核酸构建体可以用作表达盒并且因此可以用于直接引入至宿主细胞中，或者它们可以被引入至载体中。因此，在一个实施方案中，核酸构建体是包含微生物启动子或微生物终止子或者两者的表达盒。在另一实施方案中，表达盒包含真核启动子或者真核终止子或者两者。

[0431] 如果预期以数个构建体或者载体转化宿主细胞，则上述转化的标记必须去除或者在后续转化中采用另外的标记。可以通过本领域技术人员的方法如现有技术中所述将标记从宿主细胞中去除。

[0432] 在一个实施方案中，用于根据本发明方法的核酸序列可有利的有效连接至一个或更多个调节信号以便增加基因表达。

[0433] 这些调节序列旨在使核酸分子，例如用于本发明方法的基因或基因片段或基因产物或核酸的特异表达成为可能。取决于宿主生物，例如真核细胞或微生物，这将意味着例如基因或基因构建体仅在诱导后表达和/或过表达，或其组成型表达和/或过表达。这些调节序列为例如诱导子或阻抑物结合并因此调节核酸表达的序列。此外，基因构建体还可有利的包含一个或更多个与启动子有效连接的称作增强子序列的序列，并且它们使核酸序列增强表达。同样，可以在DNA序列3’端插入另外有利的序列，例如其他的调节元件或终止子。

[0434] 术语“增加的表达”或“过表达”，如本文所使用，意思是指原始野生型表达水平之外的任何形式的表达。

[0435] 用于增加基因或基因产物表达的方法在本领域中广泛记录并且包括例如由适当启动子驱动的过表达、转录增强子或翻译增强子的使用。充当启 动子或增强子元件的分离的核酸可以引入至非异源形式多核苷酸的适当位置中(通常是上游)，以致于上调编码目
的多肽的核酸的表达。

[0436] 以shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为例，在本发明的一个实施方案中使用Kozak序列。

[0437] 编码根据本发明蛋白质的核酸分子和编码另外的多肽的核酸分子可以存在于一个核酸构建体或载体中或者存在于数个核酸构建体或载体中。在一个实施方案中，仅用于本发明方法的核酸分子或其编码基因的一个拷贝存在于核酸构建体或载体中。数个载体或核酸构建体或载体可以在宿主生物中一起表达。根据本发明的核酸分子或核酸构建体可以插入在载体中并以自由形式存在于细胞中。如果优选稳定转化，则使用超过数个世代稳定复制或者它们或它们的部分被插入至基因组中的载体。以哺乳动物细胞为例，可以发生向细胞核基因组中的整合。为了向宿主基因组中插入一个以上的构建体，待表达的构建体将一起存在于一个载体中，例如在携带多个构建体的上述载体中。

[0438] 通常，用于构建体表达率的调节序列位于与待调节核酸分子序列相对而言的上游(5’)、当中和/或下游(3’)。它们特别是控制转录和/或翻译和/或转录稳定性。表达水平依赖于更多细胞调节系统，例如细胞的蛋白质生物合成和降解系统的结合。

[0439] 调节序列包括转录和翻译调节序列或信号，例如尤其与转录或翻译起始调节有关的位于上游(5’)的序列，如启动子或起始密码子，和尤其与转录或翻译终止和转录物稳定性有关的位于下游(3’)的序列，如多腺苷化信号或终止密码子。

[0440] 特别有利的启动子是组成型启动子、组织或区室特异启动子和可诱导启动子。通常，“启动子”在本文上下文中被理解为意思是指核酸分子中的介导核酸分子的编码序列片段表达的调节序列。原则上，可以使用天然启动子和它们的调节序列。用于哺乳动物细胞的一些启动子是例如CMV、SV40、TK、β-肌动蛋白。

[0441] 核酸构建体有利地如此构建，以致于启动子之后是用于插入待表达核酸的适宜切割位点，有利地在多接头中，如果合适，之后是位于多接头后面的终止子。如果合适，该次序被重复数次以致于数个基因被组合在一个构建体中，并且因此可以被引入至转基因植物中以便被表达。序列被重复如直至三次。为了表达，核酸序列通过适宜的切割位点插入在例如启动子后面的多接头中。对于每一核酸序列，有利的是具有其自身的启动子，并且，如果合适，具有其自身的终止子，如上面所提到。然而，还可以在启动子后面并且如果合适在终止子之前插入数个核酸序列，特别是当在宿主或靶细胞中多顺反子转录可能时。在该上下文中，插入位点或者插入至核酸构建体中的核酸分子序列不是决定性的，也就是说核酸分子可以插入至盒的第一个或最后一个位置而对表达没有实质性的影响。然而，还可以在构建体中仅使用一个启动子类型。

[0442] 本发明的一个实施方案还涉及产生载体的方法，包括将本文表征的核酸分子、根据本发明的核酸分子或根据本发明的表达盒插入至载体中。载体可以例如引入至细胞，如微生物或哺乳动物细胞中，如本文对于核酸构建体或下面转化或转染所述或实施例所示。宿主或靶细胞可以瞬时或稳定转化，然而，优选稳定转化。

[0443] 根据本发明的载体优选是适宜在细胞中、优选哺乳动物细胞中表达根据本发明多肽的载体。因此，方法还包括用于将调节信号，特别是介导在生物如微生物或哺乳动物细胞中表达的信号整合入载体的一个或更多个步骤。

[0444] 因此，本发明还涉及包含本文所表征核酸分子作为适于根据本发明核酸分子的植物表达的核酸构建体部分的载体。

[0445] 用于本发明方法的有利的载体，如本发明的载体包含编码用于本发明方法的核酸分子的核酸分子，或适用于在细胞中表达的包含如上所述适用于本发明方法的核酸分子的核酸构建体，或者单独或者与更多的基因如标记或者选择基因一起。

[0446] 因此，有利的用于本发明方法的重组表达载体包含用于本发明方法的核酸分子或者根据本发明的核酸构建体，其为这样的形式，即适于在宿主细胞中表达包含SEQ ID NO2、6、10、14、18、22、26和/或30，至于shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为SEQ ID NO73、
75、77、79、81、83、85和/或87，至于G蛋白偶联受体为SEQ ID NO130、134、138、142、146、
150、154、158、162、166、170和/或174，并且至于SK-通道为SEQ ID NO228、230、232中所示多核苷酸的核酸分子或其同源物和/或同时表达与根据本发明的核酸分子伴随的或本
文所述的另外的基因。因此，重组表达载体包含与待表达核酸序列有效连接的、基于待用于表达的宿主细胞选择的一个或更多个调节信号。

[0447] 根据本发明，术语“载体”指能够运输与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其意思是指可以向其中连接另外的DNA片段的环形双链DNA环。更多类型的载体是病毒载体，其可以将额外的DNA片段连接入病毒基因组中。某些载体能够在它们所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起始点的细菌载体)。其它优选的载体当它们被引入至宿主细胞中时有利地全部或部分整合入宿主细胞的基因组中，并因此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够控制与它们有效连接的基因的表达。在本文上下文中，这些载体被称为“表达载体”。如上面所提到，它们能够自主复制或者可以部分或全部整合入宿主基因组中。适用于DNA重组技术的表达载体通常采用质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最频繁使用形式的载体。然而，本发明还旨在包括发挥相似功能的其它形式的表达载体，例如病毒载体。此外，术语载体还包括技术人员已知的其他载体，例如噬菌体、病毒例如SV40、CMV、TMV、转座子、IS元件、噬粒、噬菌粒、粘粒和线性或环状DNA。

[0448] 在重组表达载体中，“有效连接”意思是指目的核酸分子以基因表达成为可能的方式连接至调节信号：它们彼此如此连接以致于两个序列实现对于序列所指定的预期功能(例如在体外转录/翻译系统中，或在宿主细胞中，如果载体被引入宿主细胞中的话)。

[0449] 术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多腺苷化信号)。这些调节序列描述于例如Goeddel：Gene Expression Technology：Methods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，CA(1990)，或参见：Gruber和Crosby，in：Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy，CRC Press，Boca Raton，
Florida，Ed.：Glick和Thompson，第7章，89-108中，包括它们当中所引用的文献。调节序列包括控制核苷酸序列在许多类型宿主细胞中组成型表达的那些，和控制核苷酸序列仅在特定细胞中和在特定条件下直接表达的那些。技术人员知道，表达载体的设计将取决于多种因素如待转化宿主细胞的选择、蛋白质量减少的程度等等。对调节序列的优选选择描述于上面，例如启动子、终止子、增强子等等。术语调节序列被认为包含在术语调节信号之内。
数个有利的调节序列，尤其是启动子和终止子在上面描述。通常，作为适宜表达的有利核酸构建体描述的调节序列也适用于载体。

[0450] 备选地，核酸序列可以使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达。可用于在所培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列
(Smith等(1983)Mol.Cell Biol.3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)
Virology170:31-39)。上面提到的载体仅是可能的适宜载体的小的概述。更多的质粒
是技术人员已知的并且描述于例如Cloning Vectors(Ed.Pouwels，P.H.等，Elsevier，
Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN0444904018)。用于原核细胞和真核细胞的更多的适宜表达系统见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中的第16和17章。

[0451] 因此，本发明的一个实施方案涉及包含用于根据本发明方法中的核酸分子或用于本发明方法中的核酸构建体，例如本发明的核酸分子或核酸构建体的载体。所述载体可用于转染或转化宿主细胞以便提供根据本发明多肽的表达。有利地，所述核酸分子与用于在原核或真核宿主中或者在原核 和真核宿主中表达的调节序列有效连接。此外，适宜同源重组的载体也处于本发明范围之内。

[0452] 因此，本发明的一个实施方案涉及已经用适宜本发明方法的载体，特别是用根据本发明的载体或根据本发明的核酸分子或根据本发明的核酸构建体稳定或瞬时转化的宿主细胞，由此宿主的膜不内源显示本发明多肽的活性。

[0453] 本发明的更多实施方案还涉及产生转基因宿主细胞，例如真核或原核宿主或宿主细胞，优选转基因哺乳动物细胞的方法，包括向宿主细胞中引入根据本发明的核酸构建体、根据本发明的载体或根据本发明的核酸分子，由此宿主的膜不内源显示本发明多肽的活性。

[0454] 载体DNA可以通过常规转化或转染技术引入至原核或真核细胞中。术语“转化”和“转染”包括接合和转导，并且如在本文上下文中所使用，旨在包括用于将外来核酸分子(例如DNA)引入宿主细胞内的多种多样的现有技术方法，包括磷酸钙共沉淀或
氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、PEG-介导的转染、脂转染、天然感受态、化学介导的转移、电穿孔或粒子轰击。用于宿主细胞包括植物细胞转化或转染的适宜方法可
nd
以 在 Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.，2 Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，
1989)和其它实验室手册如Methods in Molecular Biology,1995,Vol.44,Agrobacterium protocols,Ed.:Gartland and Davey,Humana Press,Totowa,New Jersey中找到。

[0455] 为了选择核酸分子、载体或核酸构建体向宿主生物内的成功转移，有利的是使用已经在上面详细描述的标记基因。对于核酸向植物细胞内的稳定或瞬时整合，已知仅少数细胞摄入外来DNA并且如果预期的话，将其整合入其基因组中，这取决于所使用的表达载体和所使用的转染技术。为了鉴定和选择这些整合体，通常将编码可选择标记的基因(如上所述，例如对抗生素的抗性)与目的基因一起引入到宿主细胞内。优选的可选择标记是例如编码参与抗性的基因的标记，优选抗生素抗性基因或者如糖或氨基酸 生物合成途径中的基因，例如β-半乳糖苷酶、ura3或ilv2。编码基因如萤光素酶、gfp或其他荧光基因的标记同样适用。这些标记和上述标记可以用于突变体中，在所述突变体中这些基因不具有功能，因为它们已经通过常规方法被缺失。此外，编码可选择标记的核酸分子可以与编码本方法所用核苷酸分子在同一载体上引入至宿主细胞中，或者在分开的载体上引入至宿主细胞中。已经以所引入核酸分子稳定转染的细胞可以通过例如选择来鉴定(例如，已经整合入可选择标记的细胞存活而其它细胞死亡)。

[0456] “报告基因”编码容易定量的蛋白质，如上述标记基因一样。转化效率或表达位点或时限可通过这些基因经生长测定、荧光测定、化学发光测定、生物发光测定或抗性测定或光度测量(内在颜色)或酶活性评价。在该上下文中，极其特别优选的是报告蛋白质(Schenborn E，Groskreutz D.Mol Biotechnol.1999；13(1):29-44)例如“绿色荧光蛋白”(GFP)(Gerdes HH和Kaether C，FEBS Lett.1996；389(1):44-47；Chui WL 等，Curr Biol 1996，6:325-330；Leffel SM等，Biotechniques.23(5):912-8，1997)、氯霉素乙酰转移酶、萤光素酶(Giacomin，Plant Sci1996，116:59-72；Scikantha，J Bact1996，178:121；
Millar等，Plant Mol Biol Rep199210:324-414)和一般的萤光素酶基因、β-半乳糖苷酶或β-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson等，EMBO J.1987，6，3901-3907)或Ura3基因。

[0457] “选择标记”赋予对抗生素或其他毒性化合物的抗性：在该上下文中可以提到的实例是新霉素磷酸转移酶基因，其赋予对氨基葡糖苷抗生素新霉素(G418)、卡那霉
素、巴龙霉素的抗性(Deshayes A等，EMBO J.4(1985)2731-2737)，编码突变的二氢蝶
酸合酶的sul基因(Guerineau F等，Plant Mol Biol.1990；15(1):127-136)，潮霉素
B磷酸转移酶基因(Gen Bank登录号：K01193)和she ble抗性基因，其赋予对博来霉
素抗生素如zeocin的抗性。选择标记基因的更多实例是赋予对2-脱氧葡萄糖-6-磷
酸(WO98/45456)或膦丝菌素等等抗性的基因，或赋予对抗代谢物抗性的那些基因，例
如dhfr基因(Reiss，Plant Physiol.(Life Sci.Adv.)13(1994)142-149)。其他适宜
的基因实例是trpB或hisD(Hartman SC and Mulligan RC，Proc Natl Acad Sci U S
A.85(1988)8047-8051)。另一适宜基因是甘露糖磷酸异构酶基因(WO94/20627)，ODC(鸟氨酸脱羧酶)基因(McConlogue，1987in：Current Communications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed.)或土曲霉脱氨酶(Tamura K等，Biosci Biotechnol Biochem.59(1995)2336-2338)。

[0458] 在一个实施方案中，本发明的载体或核酸构建体包括编码亲和标记的核酸序列。“亲和标记”：指肽或多肽，其编码核酸序列可使用惯常克隆技术直接或通过连接体方式与编码本发明多肽的核酸序列融合。亲和标记用于通过亲和层析从总细胞提取物中分离、浓缩和/或特异纯化重组靶蛋白质。上述连接体可有利的包含蛋白酶切割位点(例如凝血酶
或因子Xa的切割位点)，由此当需要时可从靶蛋白质上将亲和标记切割下来。常用的亲和标记的实例为来自Quiagen的“His标记”、Hilden、“Strep标记”、“Myc标记”(Invitrogen，Carlsberg)、来自New England Biolabs的由壳多糖-结合结构域和内含肽组成的标记、来自New England Biolabs的麦芽糖结合蛋白质(pMal)和来自Novagen的称作CBD的标记。
在该上下文中，亲和标记可以连接至编码靶蛋白质的编码核酸序列的5’或3’端。

[0459] 本发明的核酸分子可以用于产生杂交探针，通过杂交探针可以分离根据本发明的核酸序列的功能等同物。这些探针的产生和实验步骤是已知的。例如，这涉及通过PCR特异性产生放射性或非放射性探针和适宜标记的寡核苷酸的使用和之后的杂交实验。对于此目的所需要的技术在例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)中提到。此外，所讨论的探针可以通过标准技术(Lit.SDM或随机诱变)以如此方式修饰，以致于它们能够用于更多目的，例如用作与mRNA和相应编码序列特异性杂交的探针以便
分析其它生物中的相应序列。探针可以用于例如筛选所述昆虫的基因组文库或cDNA文库
或者在电子数据库中计算机搜索类似序列。

[0460] “遗传控制序列”：术语“遗传控制序列”被认为与术语“调节序列”等同，并且描述对根据本发明的核酸在原核或真核生物中的转录并且如果合适对翻译具有影响的序列。实例是启动子、终止子或称作“增强子”的序列。除了这些控制序列外或者代替这些序列，这些序列的天然调节可仍存在于实际结构基因之前，并且如果合适，会以如此方式进行遗传修饰以致于关闭天然调节并且靶标基因的表达已经被修饰，也就是说增加了或者减少了。控制序列的选择取决于宿主生物或起始生物。此外，遗传控制序列还包括基因的5’-非翻译区、内含子或非编码3’区。此外，控制序列理解为意思是指允许向宿主生物基因组中进行同源重组或插入的那些或者允许从基因组去除的那些。

[0461] “敲除转化体”指在其中特定基因已经通过转化手段以定向方式被分别失活，特定基因的活性已经被降低、下调、减少或缺失的个体转基因生物。

[0462] “天然遗传环境”指原来生物中的天然染色体基因座。以基因组文库为例，核酸序列的天然遗传环境优选地至少部分保留。该环境至少在核酸序列5’或3’侧面，并且具有至少50bp、优选至少100bp、特别优选至少500bp、非常特别优选至少1000bp和最优选至少5000bp的序列长度。

[0463] “反应时间”指开展活性测定直至得到关于活性的重要发现所需要的时间；它取决于在测定法中所采用蛋白质的比活性和所使用方法以及所用设备的灵敏度。技术人员熟悉反应时间的确定。以基于光度鉴定杀真菌活性化合物的方法为例，反应时间通常在>0和360分钟之间。

[0464] “重组DNA”描述可通过重组DNA技术产生的DNA序列的组合。

[0465] “重组DNA技术”：是用于融合DNA序列的通常已知的技术(例如描述于Sambrook等，1989，Cold Spring Harbor，NY，Cold Spring Harbor Laboratory Press中)。

[0466] “复制起点”保证了根据本发明的表达盒或载体在微生物和酵母中的繁殖，例如大肠杆菌(E.coli)中的pBR322ori、ColE1或P15A ori(Sambrook等.：Molecular
Cloning.A Laboratory Manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)和酵母中的ARS1ori(Nucleic Acids Research，2000，28(10)：
2060-2068)。

[0467] “靶标/靶标蛋白质”：具有下列活性的本发明的多肽、蛋白质

[0468] i)钾离子通道和/或其辅助蛋白，或

[0469] ii)钾离子通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型，或

[0470] iii)具有酚乙醇胺受体活性的蛋白质，或

[0471] iv)钾离子通道。

[0472] 所有的靶标或作用位点共有特征，即靶标蛋白质功能的存在是昆虫存活所必须的。

[0473] “转化”描述向原核或真核细胞内引入异源性DNA的过程。所转化细胞不仅描述了转化过程本身的产物，还描述了通过转过过程所产生转基因生物的所有转基因后代。

[0474] “转基因的”：指包含根据本发明的核酸序列的核酸序列、表达盒或载体或者以根据本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物，术语转基因描述已经通过遗传工程方法产生的所有那些构建体，其中靶标蛋白质的核酸序列，或者有效连接至靶标蛋白质的核酸序列的遗传控制序列，或者上述可能性的组合不在它们的天然遗传环境中或者已经通过重组方法修饰。在该上下文中，修饰可以通过例如将所述核酸序列的一个或更多个核苷酸残基突变实现。

[0475] 在一个实施方案中，本发明涉及本发明的多肽、膜或宿主细胞用作杀虫靶标的用途。

[0476] 编码黑腹果蝇昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)的基因的缺失，或电压门控性钾通道
Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活
性的抑制对黑腹果蝇而言是致死性的。

[0477] 因此，在一个实施方案中，本发明涉及由选自下列的核酸分子编码的多肽:

[0478] a)编码SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子；

[0479] b)SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29中所示核酸分子；

[0480] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30的多肽序列；

[0481] d)与包含SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0482] e)核酸分子，编码与(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且分别具有电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或
其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽；

[0483] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0484] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且分别具有电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽产生；

[0485] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO：33和/或34中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或
55、和/或56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70和/或71的一个或更多个基序的多肽；

[0486] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：7、8；9、10；11、12中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；

[0487] 和

[0488] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，探针包含(a)或(b)的核酸分子互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中所表征核酸分子序列互
补并编码分别具有电压门控性钾通道 Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助
蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、
50nt、100nt、200nt或500nt,

[0489] 或其同源物用作杀虫靶标的用途。

[0490] 以shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为例，黑腹果蝇中编码昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型的基因的缺失，或Shaker通
道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活性的抑制对黑腹果蝇而言
是致命性的。

[0491] 因此，在一个实施方案中，本发明涉及由选自下列的核酸分子编码的多肽:

[0492] a)编码包含SEQ ID NO：73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽的多肽的核酸分子；

[0493] b)包含SEQ ID NO：72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸分子的核酸分子；

[0494] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自包含根据SEQ ID NO：73、75、77、79、81、83、85和/或87的多肽序列的多肽；

[0495] d)与包含SEQ ID NO：73、75、77、79、81、83、85和/或87所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0496] e)核酸分子，编码与(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且分别具有Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或
C亚型活性的多肽；

[0497] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0498] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且分别具有Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活性的多肽产生；

[0499] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO：102和/或103中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、
120、121、122、123、124 和/或125和/或126、127和/或128的一个或更多个基序的多
肽；

[0500] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：88、89；90、91；92、93；94、95；96、97；98、99和/或100、101中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；

[0501] 和

[0502] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，探针包含(a)或(b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中所表征核酸分子序列互补
并编码分别具有Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活
性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt,

[0503] 或其同源物用作杀虫靶标的用途。

[0504] 以G蛋白偶联受体为例，黑腹果蝇或其他昆虫中编码选自优选来自黑腹果蝇的oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的昆虫酚乙醇胺受体的基因的缺失，或选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的抑制对黑腹果蝇或其它昆虫而言是致命性的。

[0505] 因此，在一个实施方案中，本发明涉及由选自下列的核酸分子编码的多肽:

[0506] a)编码SEQ ID NO：130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174中所示多肽的核酸分子；

[0507] b)SEQ ID NO：129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173中所示核酸分子；

[0508] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自包含根据SEQ ID NO：130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174的多肽序列的多肽；

[0509] d)与包含SEQ ID NO：130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0510] e)核酸分子，编码与(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具 有至少50％同一性并且具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的多肽；

[0511] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0512] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的多肽产生；

[0513] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO：177、178和/或179中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207和/或208、和/或209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225和/或
226的一个或更多个基序的多肽；

[0514] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：131、132；135、136；139、140；143、144；147、148；151、152；155、156、159、160；163、164；167、168；171、172和/或175、176中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；

[0515] 和

[0516] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中所表征核酸分子序列互补并编码具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt,

[0517] 或其同源物用作杀虫靶标的用途。

[0518] 以SK-通道为例，黑腹果蝇中编码昆虫小电导Ca2+激活钾通道基因的缺失，或昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的抑制对黑腹果蝇而言是致命性的。

[0519] 因此，在一个实施方案中，本发明涉及由选自下列的核酸分子编码的多肽:

[0520] a)编码SEQ ID NO：228、230、232中所示多肽的核酸分子；

[0521] b)SEQ ID NO：227、229、231中所示核酸分子；

[0522] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO：228、230、232的多肽序列；

[0523] d)与包含SEQ ID NO：228、230、232所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0524] e)核酸分子，其编码与(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽；

[0525] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0526] g)核酸分子，其编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽产生；

[0527] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO：239中所述共有序列或选自SEQ ID NO：240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252和253的一个或更多个基序的多肽；

[0528] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：233、234、235、236；和237、238中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；

[0529] 和

[0530] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)核酸分子的互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中所表征核酸分子序列互补并编码具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、
30nt、50nt、100nt、200nt或500nt,

[0531] 或其同源物用作杀虫靶标的用途。

[0532] 本发明此外涉及包含下列的核酸构建体或表达盒

[0533] a)与包含下列的核酸序列有效连接的遗传控制序列

[0534] i)具有SEQ ID NO1、5、9、13、17、21、25和/或29，至于shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为SEQ ID NO72，74，76，78，80，82，84和/或86，至于G蛋白偶联受体为SEQ ID NO129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173，并且至于SK-通道为SEQ ID NO227、229、231中所示核酸序列的核酸序列；或

[0535] ii)基于遗传密码子简并性，可以通过回译从SEQ ID NO2、6、10、14、18、22、26和/或30，至于shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为SEQ ID NO73、75、77、79、81、83、85和/或87，至于G蛋白偶联受体为SEQ ID NO130、134、138、142、146、150、154、158、162、
166、170和/或174，并且至于SK-通道为SEQ ID NO228、230、232所示氨基酸序列衍生的核酸序列；或

[0536] iii)核酸序列SEQ ID NO1、5、9、13、17、21、25和/或29，至于shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为SEQ ID NO72，74，76，78，80，82，84和/或86，至于G蛋白偶联受体为SEQ ID NO129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173，并且至于SK-通道为SEQ ID NO227、229、231的功能等同物；

[0537] 和

[0538] b)额外的功能元件；或

[0539] c)a)和b)的组合

[0540] 并且涉及包含下列的核酸构建体或表达盒

[0541] a)与根据本发明的核酸序列有效连接的遗传控制序列；

[0542] b)额外的功能元件；或

[0543] c)a)和b)的组合

[0544] 在“体外”或“体内”测定系统中的用途。

[0545] 本发明此外涉及核酸构建体或表达盒的上述实施方案用于在体外或体内测定系统中表达本发明多肽的用途。

[0546] 在一个实施方案中，本发明涉及本发明的多肽、膜或宿主细胞用于鉴定具有杀虫活性的化合物的用途。

[0547] 本发明此外涉及本发明的多肽在用于鉴定杀虫化合物的方法中的用途。

[0548] 根据本发明方法的优选实施方案包括下列步骤:

[0549] i.将本发明的多肽在允许一种或更多种测试化合物与本发明多肽结合的条件下与一种或更多种测试化合物接触,

[0550] ii.检测测试化合物是否结合在i)中所述本发明的多肽；或

[0551] iii.检测测试化合物是否减少或抑制或封闭在i)中所述本发明多肽的活性；或

[0552] iv.检测测试化合物是否减少或抑制或封闭具有下列活性的多肽的转录、翻译或表达

[0553] 1.在i)中所述电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)，或

[0554] 2.在i)中所述Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型，或

[0555] 3.在i)中所述选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体，或

[0556] 4.在i)中所述昆虫小电导Ca2+激活钾通道。

[0557] 按照上述方法步骤ii或iii对本发明多肽活性的检测，可以使用多种体外和体内测定法评价，例如测量电流、测量膜电位、测量离子流如钾或铷、测量钾浓度、测量第二信使和转录水平、使用钾依赖性酵母生长测定法和使用如电压敏感染料、放射性示踪剂和膜片钳电生理学。

[0558] 以G蛋白偶联受体为例，按照上述方法步骤ii或iii对本发明多肽活性的检测，可以使用多种体外和体内测定法评价，例如测量电流、测量膜电位、测量离子流如钙、优选测量钙浓度、测量第二信使和转录水平、使用钾依赖性酵母生长测定法和使用如钙浓度敏感染料或放射性示踪剂。

[0559] 按照上述方法步骤ii或iii的检测可使用鉴定蛋白质和配体之间相互作用的技术实现。在该上下文中，测试化合物或者多肽可包含可检测标记例如荧光标记、放射性同位素、化学发光标记或膜或电位标记。标记的实例 选自来自Molecular Devices的
蓝色膜电位染料、ANEP(氨基萘基乙烯基吡啶 )染料像di-4-ANEPPS、di-8-ANEPPS、
di-2-ANEPEQ+、di-8-ANEPPQ、di-12-ANEPPQ；RH 染 料 ( 最 初 由 Rina Hildesheim 合成)，包括来自Molecular Probes的一系列的二烷基氨基苯基多烯基吡啶 染料像
RH414(T-1111)、RH795(R-649) 和 RH237(S-1109)。RH421(S-1108) 或 来 自 Molecular Probes的基于羰花青和氧杂菁的其它染料，如在1999年出版的第七版Molecular
Probes'Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals中所述。

[0560] 以shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为例，在本发明的一个实施方案中，检测测试化合物是否减少、抑制或封闭本发明多肽活性的方法包括以优选选自SEQ ID NO：
72，74，76，78，80，82，84和/或86的昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优
选H-kvβ亚基A或C亚型稳定转染的CHO细胞经受加载至少一种上述染料，优选来自
Molecular Devices的蓝色膜电位染料，达0.1-3小时、优选0.5-1小时、优选0.45小时,

[0561] 通过以1-120mM、优选10-60mM、更优选50mM KCl的EC50值浓度增加KCl的细胞外水平活化Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型,

[0562] 优选以1μM–100mM、10-10000μM、优选100-1000μM的浓度加入怀疑具有抑制通道活性能力的化合物，

[0563] 测量发光、荧光,

[0564] 与对照比较染料的发光/荧光数据

[0565] 和确定所测试化合物是否具有抑制通道活性的能力。

[0566] 以G蛋白偶联受体为例，按照上述方法步骤ii或iii的检测可使用鉴定蛋白质和配体之间相互作用的技术实现。在该上下文中，测试化合物或者多肽可包含可检测标记例如荧光标记、放射性同位素、化学发光标记或膜或电位标记。标记的实例可以选自钙浓度TM TM TM
敏感性染料，例如Fluo-4Calcium Crimson 、Calcium Green 、Calcium Orange 、Calcium TM TM
Yellow 、Fura Red 、Oregon Rhod-3、X-rhod-5F、Fura-2、bis-fura-2、fluo-5F、
fluo-5N、fura dextran、fura-4F、fura-5F、fura-6F、fura-FF、fura-FF、quin-2、rhod dextran、rhod-2、rhod-5N或rhod-FF或来自Molecular Probes的基于羰花青和氧杂菁
的其它染料，如在1999年出版的第七版Molecular Probes'Handbook of Fluorescent
Probes and Research Chemicals中所述。

[0567] 以SK-通道为例，在本发明的一个实施方案中检测测试化合物是否减少、抑制或封闭本发明多肽活性的方法包括以优选选自SEQ ID NO：227、229、231的昆虫小电导Ca2+激活钾通道稳定转染的CHO细胞经受

[0568] 加载至少一种上述染料，优选来自Molecular Devices的蓝色膜电位染料，达2-6小时、优选-5小时、优选4小时,

[0569] 以100-500nM、更优选200nM的EC50值浓度的离子载体，优选离子霉素活化小电导Ca2+激活钾通道，意思是指以1-5μM的浓度温育细胞,

[0570] 以5-50μM、5-20μM、优选10μM的浓度加入怀疑具有抑制通道活性能力的化合物

[0571] 测量发光、荧光

[0572] 与对照比较染料的发光/荧光数据

[0573] 和确定所测试化合物是否具有抑制通道活性的能力。

[0574] 在本发明的一个实施方案中检测测试化合物是否减少、抑制或封闭本发明多肽活性的方法包括以优选选自SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29的昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)稳定转染的CHO细胞经受，

[0575] 加载至少一种上述染料，优选来自Molecular Devices的蓝色膜电位染料，达0.5-3小时、优选1.5小时、优选2-2.5小时,

[0576] 通过以10-120mM、优选10-60mM、更优选30mM EC50值的KCl浓度增加KCl的细胞外水平活化电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白
KChIP(钾通道相互作用蛋白),

[0577] 以1-200μM、5-100μM、优选25-30μM的浓度加入怀疑具有抑制通道活性能力的化合物，

[0578] 测量发光、荧光

[0579] 与对照比较染料的发光/荧光数据

[0580] 和确定所测试化合物是否具有抑制通道活性的能力。

[0581] 怀疑具有抑制本发明多肽活性的化合物直接加入至槽溶液中。

[0582] 备选地，按照上述方法步骤ii或iii的检测可使用膜片钳技术实现。

[0583] 可使用基本技术的一些变型选自内部-外、外部-外、细胞连接的、双切割膜片、全细胞膜片和穿孔膜片技术。

[0584] 随后的测定取决于标记并且是技术人员已知的。

[0585] 在本发明的一个实施方案中，检测测试化合物是否减少、抑制或封闭本发明多肽活性的方法包括以优选选自SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30的昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)稳定转染的CHO细胞在室温(22-25℃)下经受全细胞结构的膜片钳技术，使用当充满
吸管溶液时具有2-3MOhm电阻的硼硅玻璃毛细管并且在槽溶液中测量，优选补偿槽和吸管溶液之间的液体接头电位，在全细胞钳下测量膜电流，以2kHz取样并以1kHz过滤，将细胞保持在–70mV下并以每2秒10mV的增量应用从–100至+130mV的一系列400ms测试电
压脉冲，测量波幅，如测量电流-电压相互关系一样，并且定义为在给定去极化电位下的最大外向电流。

[0586] 以shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为例，在本发明的一个实施方案中，检测测试化合物是否减少、抑制或封闭本发明多肽活性的方法包括以优选选自SEQ ID NO：
73、75、77、79、81、83、85和/或87的昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型稳定转染的CHO细胞在室温(22-25℃)下经受全细胞结构的膜片钳
技术。本发明的全细胞电压钳方法包括使用EPC10数字控制的放大器与PATCHMASTER软件
(HEKA Electronics，Lambrect，Germany)组合进 行数据采集和进一步的分析。EPC10通过前脉冲手段提供电容和泄漏电流的自动扣除。数据以66.7KHz过滤(-3dB，8-pole Bessel低通滤波器)并以每个点5μs数字化。膜片吸管的输入电阻是2.0-4.0MΩ并且细胞的电
容是15.3±2.1pF(n＝45)；残留系列电阻(在直到80％补偿之后)是4.2±0.4MΩ。常规
应用对液体接头电位的修正。膜电位固定在-100mV并且电流通过从-60mV至+100mV(或
+60mV)的50ms去极化脉冲(0.1Hz)引出。

[0587] 怀疑具有抑制本发明多肽活性的化合物直接加入至槽溶液中。

[0588] 在一个实施方案中，剩余电容和泄漏电流的扣除使用pClamp的在线P/4方案开展。

[0589] 以G蛋白偶联受体为例，在本发明的一个实施方案中，检测测试化合物是否减少、抑制或封闭本发明多肽活性的方法包括使稳定表达G-α-16泛宿主性G蛋白质和稳定或瞬时表达优选选自SEQ ID NO：129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173的选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体的CHO细胞
进行

[0590] 加载至少一种上述染料，优选Fluo-4，达0.1-3小时、优选0.5-2小时、优选1小时,

[0591] 置于FLIPR中并使用两次添加方案运行，由此测试化合物，怀疑具有封闭或活化酚乙醇胺受体能力的化合物在第一次添加中加入并温育3分钟,

[0592] 然后激活剂酚乙醇胺在第二次添加中以EC80浓度引入并且读取荧光2分钟。对于两次添加均运行对照。在第一次添加中高于基线的荧光增加将表明是可能的激活剂并且在第二次添加中反应降低或者没有增加可表明是可能的抑制剂。

[0593] 随后的检测依赖于标记并且是技术人员已知的。

[0594] 以SK-通道为例，在本发明的一个实施方案中，检测测试化合物是否减少、抑制或封闭本发明多肽活性的方法包括以优选选自SEQ ID NO：228、230、232的昆虫小电导Ca2+激活钾通道稳定转染的CHO细胞在室 温(22-25℃)下经受全细胞结构的膜片钳技术，使用当充满电极溶液时具有2-3MOhm抗性的硼硅玻璃毛细管并且在槽溶液中测量，优选补偿槽和电极溶液之间的液体接头电位，在全细胞钳下测量膜电流，以2kHz取样并以1kHz过滤，将细胞保持在–70mV下并以每2秒10mV的增量应用从–100至+130mV的一系列400ms测试电压脉冲，测量波幅，如测量电流-电压相互关系，并且定义为在给定去极化电位下的最大外向电流。

[0595] 在根据本发明的方法中，还可以采用多个测试化合物。如果一组测试化合物影响靶标，则可直接分离各个测试化合物或者可以将测试化合物组分成许多亚组，例如当其由数个不同成分组成时，以便减少根据本发明的方法中的不同测试化合物的数量。然后，根据本发明的方法以各个测试化合物重复或者相关亚组的测试化合物重复。取决于样品的复杂性，上述步骤可以重复开展，优选地直到依照根据本发明方法鉴定的亚组仅包含小数量的测试化合物或者实际上仅一种测试化合物。

[0596] 根据本发明的方法可有利的作为HTS步骤开展。

[0597] HTS使得同时测试大量不同化合物成为可能。

[0598] 高通量筛选的质量由两种因素确定，即测定窗口的相对大小和该测定窗口在从对照实验到对照实验间的稳定性(即～20个测定筛选板对照中的测定信号稳定性)。这表示为筛选的z’因子并且等式为:

[0599] Z’＝1-((3σmax+3σmin)/(Iμmax–μminI))。

[0600] 以SK-通道外例，高通量筛选的质量由两种因素确定，即测定窗口的相对大小，在该例中来自完全活化通道的信号减去来自非活化通道的信号(通常表示成任意单位)。第二个因素是该测定窗口在从对照实验到对照实验间的稳定性(即～20个测定筛选板对照
中的测定信号稳定性)。这表示为筛选的z’因子并且等式为:

[0601] Z’＝1-[3*(σmax+σmin)/Abs(Ave(MAX)-Ave(MIN))]。

[0602] 所计算的Z’>0.5被认为是极佳的测定。

[0603] 以shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为例，备选地为了计算Z’因子使用下列公式:

[0604] 3*(ST.DEV激动剂+ST.DEV Tyrode

[0605] Z’＝1–(--------------------------------------------------------------)

[0606] MEAN激动剂–MEAN Tyrode

[0607] 在该上下文中，也适用于与本发明相结合的高通量筛选方法(HTS)的优选实施方案必须提到，尤其是:

[0608] 1.依照优选的实施方案，根据本发明方法的步骤ii的检测(并且以SK-通道为例，变体3)包括下列步骤：荧光共振能量转移(FRET)基于适宜条件下两个空间邻近的
荧光分子之间的无辐射的能量转移。前提是供体分子的发射光谱与受体分子的激发光谱
重叠。使用荧光标记的UGP和测试化合物，通过FRET手段可以测量结合(Cytometry34，
1998，pp.159-179)。备选地，根据本发明的方法也可采用在1下面描述的“置换测定”形式。
FRET技术的特别适合的实施方案是可以从Packard BioScience得到的“均一时间解析荧
光”(HTRF)。以该方式鉴定的化合物可适宜用作抑制剂。

[0609] 2.依照优选的实施方案，根据本发明方法的步骤ii的检测(并且以SK-通道为例，变体3)包括下列步骤：表面等离振子共振的测量基于当化学化合物结合至已固定至
表面的蛋白质时在所述表面上的折光指数。由于折光指数的变化与几乎所有蛋白质和多
肽在表面上质量浓度的确定变化相同，所以该方法原则上可应用于任何蛋白质(Lindberg等.Sensor Actuators4(1983)299-304；Malmquist Nature361(1993)186-187)。测量可以使用例如从Biacore(Freiburg)可得到的基于表面等离振子共振的自动分析仪以当前每
天高达384个样品的通量开展。根据本发明的方法可以设计成直接测量测试化合物与UGP
的结合。备选地，根据本发明的方法也可采用在1下面描述的“置换测定”形式。以该方式鉴定的化合物可适宜用作抑制剂。

[0610] 3.依照优选的实施方案，根据本发明方法的步骤ii的检测包括来自MolecularDevices的FLIPR膜电位测定试剂盒的使用，如在实施例中所公开。该方法基于电压敏感性染料在FLIPR荧光测量成像平板读取仪系统上的应用，显示与手工膜片钳数据良好相关。

[0611] 4.依照优选的实施方案，根据本发明方法的步骤ii的检测包括 BIOMOL化合物筛选或BioFocus化合物筛选的应用，使用两次流体添加方法以允许在单次实验中检测激活剂和拮抗剂，或随后的BIOMOL和BioFocus验证筛选，如在实施例中所公开。

[0612] 以shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为例，本发明方法提供对黑腹果蝇Shaker通道的基于功能细胞的测定法，优选在CHO-K1细胞中通过稳定纯克隆的选择和用
膜电位敏感性染料在FLIPR上，优选FLIPR384和/或FLIPRTETRA或者两个实验上和电生
理学技术进行功能表征而开发。

[0613] 所产生的测定法完全符合HTS需要，显示出极高的信号质量和再现性。

[0614] 为了高通量筛选的目的，下列参数应该提到:

[0615] ·激活剂KCl浓度：在活化缓冲液中50mM(～EC80)

[0616] ·参照Z’：0.60

[0617] ·对于单一测定板的最低可接受Z’：0.45

[0618] ·对于命中的％抑制阈值：40％

[0619] 通过上述方法鉴定的所有物质可以随后在根据本发明方法的另一实施方案中检查它们的杀虫作用。

[0620] 此外，通过使用通过x射线结构分析阐明本发明多肽的三维结构的分子建模，存在检测用于杀虫活性成分的更多候选物的可能性。对于x射线结构分析所必需的蛋白质晶体的制备、和相关测量和这些测量的随后评价、蛋白质中结合位点的检测和潜在抑制剂结构的预测是技术人员已知的。原则上，通过分子建模也可以对通过上述方法鉴定的活性化合物进行优化。

[0621] 在一个实施方案中，与测试化合物温育的本发明多肽的活性与野生型细胞对照的活性或者在步骤iii中不与测试化合物温育的本发明多肽的活性相比较。

[0622] 在该上下文中，在步骤(iii)中选择化合物，其导致实现本发明多肽活性显著降低，至少10％减少，有利的至少20％、25％、29％、优选至少30％、 特别优选至少50％和非常特别优选至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％减少(抑制)。

[0623] 本发明此外涉及通过根据本发明方法鉴定的化合物。这些化合物在下文被称为“选择的化合物”。它们具有小于1000g/mol、有利的小于500g/mol、优选的小于400g/mol、特别优选小于300g/mol的分子量。杀虫活性化合物具有小于1μM、优选小于1μM、特别优选小于0.1μM、非常特别优选小于0.01μM的Ki值。

[0624] 通过上述方法鉴定和/或在实施例中所示的物质描述于表I中:

[0625]

[0626] 阿米洛利，3,5-二氨基-6-氯-N-(二氨基亚甲基)吡嗪-2-氨甲酰

[0627] CAS号2016-88-8

[0628]

[0629] Bay K8644

[0630]

[0631] 尼卡地平

[0632]

[0633]

[0634] 奎尼丁，同义词(2-乙烯基-4-氮杂双环[2.2.2]辛-5-基)-(6-甲氧基喹啉-4-基)-甲醇6'-甲氧基辛可-9-醇6'-甲氧基-a-(5-乙烯基-2-奎宁环基)-4-喹
啉甲醇

[0635]

[0636] 尼氟灭酸

[0637]

[0638]

[0639]

[0640]

[0641] 所选择的化合物适于控制昆虫害虫，如上面提到的那些。这些昆虫的实例选自有翅亚纲、新翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目、同翅目、拟步行虫总科、拟步行虫科、拟步行虫属、Sternorrhyncha、Aphidina、Brachycera、果蝇科、Drosophilinae和果蝇属，优选地以SK-通道为例是桃蚜(Myzus persica)和/或赤拟谷盗(red flower beetle)(赤拟谷盗)。

[0642] 所选择的化合物适宜控制农业昆虫害虫，用于保护作物、森林、城市树木、牧场、采后系统(例如储存的谷物)和天然区域不被昆虫害虫侵害以及用于谷物和/或食品的储藏。

[0643] 所选择的化合物适于防止感染，意思是指阻碍害虫群体的生长，所述害虫变得如此巨大以致于它们变成有害的或者令人讨厌的。

[0644] 根据本发明，昆虫害虫是令人讨厌的或者对人、财产或环境有害的任何昆虫。生物在一个地方可能是害虫，而在另一个地方则不是；例如房屋中的白蚁相对于在森林中将死树再利用的那些白蚁。

[0645] 所选择的化合物还可以以它们的有用盐的形式存在。适宜的有用盐主要是那些阳离子的盐，或那些酸的酸加成盐，它们的阳离子或阴离子没有对通过根据本发明的方法所鉴定的杀虫活性化合物产生不利的影响。

[0646] 通过上述方法鉴定的所有化合物如果包含手性中心的话可以是纯对映异构体或非对映异构体形式或它们混合物的形式和作为外消旋物的本发明主题。

[0647] 所选择化合物可以是化学合成的物质或者由微生物产生的物质，并且可以在例如植物、动物或微生物的如细胞提取物中找到。反应混合物可以是无细胞提取物或者包括细胞或细胞培养物。适宜的方法是技术人员已知的并且一般描述于例如Alberts，Molecular rdBiology the cell，3 Edition(1994)，例如第17章中。

[0648] 可能的测试化合物可以是表达文库，例如cDNA表达文库、肽、蛋白质、核酸、抗体、小的有机物质、激素、PNA等(Milner，Nature Medicin1(1995)，879–880；Hupp，Cell.83(1995)，237–245；Gibbs，Cell.79(1994)，193–198和其中引用的参考文献)。

[0649] 具有根据本发明的杀虫活性的化合物选自TMB-8、硝苯地平、尼群地平、粉防己碱、维拉帕米、甲氧基维拉帕米、YS035、普罗帕酮、奎尼丁、磺胺类、噻唑啉酮、吲哚酮、异 唑基酰胺类。

[0650] 为了在根据本发明的方法中使用，化合物可以制成常规制剂，例如溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、散剂、糊剂、颗粒剂和可直接喷雾溶液。使用形式取决于特定的目的和应用方法。选择制剂和应用方法以保证在每一情况下根据本发明的式I的化合物精细和均匀分布。

[0651] 制剂以已知方式制备(对于综述见例如US3,060,084，EP-A707445(用于液体浓缩物)，Browning，"Agglomeration"，Chemical Engineering，Dec.4，1967，147-48，Perry's Chemical Engineer's Handbook，4th Ed.，McGraw-Hill，New York，1963，pages8-57and 以及 下列 等等 WO91/13546，US4,172,714，US4,144,050，US3,920,442，US5,180,587，US5,232,701，US5,208,030，GB2,095,558，US3,299,566，Klingman，Weed Control as a Science，John Wiley and Sons，Inc.，New York，1961，Hance等，Weed Control Handbook，8th Ed.，Blackwell Scientific Publications，Oxford，1989and Mollet，H.，Grubemann，A.，Formulation technology，Wiley VCH Verlag GmbH，Weinheim(Germany)，2001，
2.D.A.Knowles，Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，1998(ISBN0-7514-0443-8)，例如通过用适宜农业化学品制剂的辅助物，例如溶剂和/或载体，恰当的乳化剂、表面活性剂和分散剂、防腐剂、消泡剂、防冻剂，对于种子处理制剂还任选着色剂和/或粘合剂和/或胶凝剂将活性化合物分散开。

[0652] 适宜的溶剂/载体是例如:

[0653] -溶剂例如水、芳香族溶剂(例如Solvesso产品，二甲苯等等)、石蜡(例如矿物级分)、醇(例如甲醇、丁醇、戊醇、苯甲醇)、酮(例如环己酮、γ-丁内酯)、吡咯烷酮(N-甲基-吡咯烷酮(NMP)、N-辛基吡咯烷酮NOP)、乙酸酯(乙二醇二乙酸酯)、烷基乳酸酯、内酯例如g-丁内酯、二 醇、脂肪酸二甲基酰胺、脂肪酸和脂肪酸酯、甘油三酯、植物或动物来源的油和改性油如烷基化植物油。原则上，还可使用溶剂混合物。

[0654] -载体例如磨碎的天然矿物质和磨碎的合成矿物质，例如二氧化硅凝胶、细分的硅酸、硅酸盐、滑石、高岭土、镁质粘土、石灰石、石灰、白垩、红玄武土、黄土、粘土、白云石、硅藻土、硫酸钙和硫酸镁、氧化镁、磨碎的合成矿物质、肥料、例如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、尿素和植物来源的产物，例如谷物粉、树皮粉、木粉和坚果壳粉、纤维素粉末和其他固体载体。

[0655] 适宜的乳化剂是非离子和阴离子乳化剂(例如聚氧乙烯脂肪醇醚、烷基磺酸酯和芳基磺酸酯)。

[0656] 分散剂的实例是木质素-亚硫酸盐废液和甲基纤维素。

[0657] 适宜的表面活性剂是碱金属、碱土金属和木质磺酸铵盐、萘磺酸、酚磺酸、二丁萘磺酸、烷基芳基磺酸盐、烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、脂肪醇硫酸酯、脂肪酸和硫酸化脂肪醇二乙醇醚，此外还有磺酸化萘和萘衍生物与甲醛的缩合物、萘或萘磺酸与苯酚和甲醛的缩合物、聚氧乙烯辛基苯基醚、乙氧基化异辛基苯酚、辛基苯酚、壬基苯酚、烷基苯基聚二醇醚、三丁基苯基聚二醇醚、三(十八烷基)苯基聚二醇醚、烷芳基聚醚醇、醇和脂肪醇/环氧乙烷缩合物、乙氧基化蓖麻油、聚氧乙烯烷基醚、乙氧基化聚氧化丙烯、月桂醇聚二醇醚乙缩醛、山梨糖醇酯。

[0658] 同样，也可向制剂中加入防冻剂，例如丙三醇、乙二醇、丙二醇和杀菌剂。

[0659] 适宜的消泡剂是例如基于硅或硬脂酸镁的消泡剂。

[0660] 适宜的防腐剂是例如双氯酚和苯甲醇半缩甲醛。

[0661] 适宜的增稠剂是赋予制剂假塑性流动行为即静止时高粘度和搅动时低粘度的化合物。在该上下文中必需提到的是例如基于多糖的商业增稠剂，例如Xanthan
(来自Kelco的 )、 23(Rhone Poulenc)或 (来
自R.T.Vanderbilt)，或有机层状硅酸盐，例如 (来自Engelhardt)。本
发明分散剂的适宜消泡剂是例如，硅酮乳 化剂(例如来自Rhodia的 SRE、
Wacker或 )、长链醇、脂肪酸或有机氟化合物或其混合物。可加入杀生物剂
以稳定根据本发明的组合物对抗微生物的攻击。适宜的杀生物剂基于例如异噻唑酮，例
如来自Avecia(或Arch)的以商标 投放市场的或来自Thor Chemie的以商标
RS投放市场的和来自Rohm&Haas的以商标 MK投放市场的化合物。
适宜的防冻剂是有机多元醇，例如乙二醇、丙二醇或甘油。这些通常以基于活性化合物组合物总重量不大于10％重量的量使用。如果合适，根据本发明的活性化合物组合物可包含基于所制备制剂的总量1至5％重量的缓冲液以调节pH，所使用的缓冲液的量和类型取决于
一种或多种活性化合物的化学特性。缓冲液的实例是弱无机或有机酸，例如磷酸、硼酸、乙酸、丙酸、柠檬酸、富马酸、酒石酸、草酸和琥珀酸的碱金属盐。

[0662] 适宜制备可直接喷雾溶液剂、乳化剂、糊剂或油分散剂的物质是中至高沸点的矿物油级分，例如煤油或柴油，此外还有煤焦油和植物或动物来源的油、脂肪族、环状和芳香族烃，例如甲苯、二甲苯、石蜡、四氢化萘、烷基化萘或它们的衍生物、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、环己醇、环己酮、异佛尔酮、强极性溶剂例如二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮和水。

[0663] 可通过将活性物质与固体载体混合或同时碾碎制备散剂、用于分散的材料和粉尘。

[0664] 可以通过将活性成分与固体载体结合制备颗粒剂，例如包衣颗粒剂、浸渍颗粒剂和均一颗粒剂。固体载体的实例是矿物土，例如硅胶、硅酸盐、滑石、高岭土、镁质粘土、石灰石、石灰、白垩、红玄武土、黄土、粘土、白云石、硅藻土、硫酸钙、硫酸镁、氧化镁、磨碎的合成矿物质、肥料、例如、例如、硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、尿素、和植物来源的产物例如谷物粉、树皮粉、木粉和坚果壳粉、纤维素散剂和其它固体载体。

[0665] 通常，制剂包含从0.01至95％重量、优选从0.1至90％重量的活性成分。活性成分以从90％至100％、优选从95％至100％(根据NMR光谱)的纯度使用。

[0666] 对于种子处理的目的，各个制剂可以稀释2-10倍，产生0.01至60％重量、优选0.1至40％重量活性化合物的现成制剂浓缩物。

[0667] 根据本发明方法鉴定的化合物可以如此使用，即以它们的制剂的形式或者从它们制备的使用形式，例如以可直接喷雾溶液剂、散剂、混悬剂或分散剂、乳化剂、油分散剂、糊剂、可粉化产品、用于分散的材料、或颗粒剂的形式通过喷雾、雾化、粉化、分散或倾注手段使用。使用形式完全依赖于预期目的；它们旨在保证在每一情况下根据本发明的活性化合物最佳可能的分布。

[0668] 以下是制剂的实例：

[0669] 1.用于用水稀释的产品。为了种子处理目的，此类产品可以应用于稀释的种子或未稀释的种子。

[0670] A)水溶性浓缩剂(SL，LS)

[0671] 按重量计10份活性化合物溶解于按重量计90份水或者水溶性溶剂。作为备选，加入湿润剂或其他辅料。用水稀释后活性化合物溶解，从而得到含有10％(w/w)活性化合物的制剂。

[0672] B)可分散的浓缩剂(DC)

[0673] 按重量计20份活性化合物溶解于按重量计70份环己酮，另外加入按重量计10份分散剂，例如聚乙烯吡咯烷酮。用水稀释得到分散相，从而获得含有20％(w/w)活性化合物的制剂。

[0674] C)可乳化的浓缩剂(EC)

[0675] 按重量计15份活性化合物溶解于按重量计7份二甲苯，并添加十二烷基苯磺酸钙和蓖麻油乙氧基化物(各自按重量计5份)。用水稀释得到乳液，从而获得含有15％(w/w)活性化合物的制剂。

[0676] D)乳化剂(EW，EO，ES)

[0677] 按重量计25份活性化合物溶解于按重量计35份二甲苯，并添加十二烷基苯磺酸钙和蓖麻油乙氧基化物(各自按重量计5份)。利用乳化机器(例如Ultraturrax)将该混
合物导入按重量计30份水中制备成均匀的乳液。用水稀释得到乳剂，从而获得含有25％
(w/w)活性化合物的制剂。

[0678] E)悬浮液(SC，OD，FS)

[0679] 在搅动的球形研磨机中，按重量计20份活性化合物被研磨，并添加按重量计10份分散剂、湿润剂和按重量计70份水或有机溶剂以得到精制的活性化合物悬浮液。用水稀释得到稳定的活性化合物悬浮液，从而获得含有20％(w/w)活性化合物的制剂。

[0680] F)水可分散的颗粒剂和水溶性的颗粒剂(WG，SG)

[0681] 按重量计50份活性化合物精细研磨，添加按重量计50份分散剂和湿润剂，并利用专业器具(例如挤压、喷淋塔、流化床)制成水可分散的或水溶性的颗粒剂。用水稀释得到稳定的分散剂或活性化合物溶液，从而获得含有50％(w/w)活性化合物的制剂。

[0682] G)水可分散的散剂和水溶性散剂(WP，SP，SS，WS)

[0683] 按重量计75份活性化合物在转子-定子研磨器中研磨，添加按重量计25份分散剂、湿润剂和硅胶。用水稀释得到稳定的分散剂或活性化合物溶液，从而获得含有75％(w/w)活性化合物的制剂。

[0684] H)凝胶制剂(GF)

[0685] 在搅动的球形研磨机中，按重量计20份活性化合物被研细，并添加按重量计10份分散剂，按重量计1胶凝剂湿润剂和按重量计70份水或有机溶剂以得到精制的活性化合物悬浮液。用水稀释得到稳定的活性化合物悬浮液，从而获得含有20％(w/w)活性化合物的制剂。

[0686] 2.未稀释的产物应用于叶敷。为了种子处理目的，此类产物可以应用于稀释的种子或未稀释的种子。

[0687] I)粉尘化散剂(DP，DS)

[0688] 按重量计5份活性化合物精细研磨并与按重量计95份细碎的高岭土紧密混合。这样得到含有5％(w/w)活性化合物的粉尘化的产物。

[0689] J)颗粒剂(GR，FG，GG，MG)

[0690] 按重量计0.5份活性化合物精细研磨并与按重量计95.5份载体相结合,从而获得含有0.5％(w/w)活性化合物的制剂。通用的方法是挤压、喷雾-干燥或者流化床。这样产生颗粒剂可以不稀释用于叶敷。

[0691] K)ULV溶液(UL)

[0692] 按重量计10份活性化合物溶解于按重量计90份有机溶剂，例如二甲苯。这样得到含有10％(w/w)活性化合物的产物，该产物可以不稀释用于叶敷。

[0693] 通过加入水能够从乳化剂浓缩物、糊剂或可湿润散剂(喷雾型散剂、油分散剂)制备水性使用形式。为了制备乳化剂，糊剂或油分散剂，可以使用湿润剂、增粘剂、分散剂或乳化剂将物质(原样或者溶于油或溶剂)在水中匀浆。备选地，还可能制备由活性物质、湿润剂、增粘剂、分散剂或乳化剂以及，如果适当，溶剂或油组成的浓缩物，并且此类浓缩物适宜用水进行稀释。

[0694] 即用型产物中的活性成分浓度可以在相对宽的范围内变化。通常，活性成分浓度为从0.0001至10％，优选为从0.01至1％。

[0695] 活性成分还可以成功地用于超低容量(ULV)工序，使得施用包含按重量计超过95％活性成分的制剂，或者甚至施用不含添加剂的活性成分成为可能。

[0696] 在本发明的方法中，根据本发明方法所鉴定的化合物可以与其它活性成分一起施用，例如与其它农药、杀虫剂、除草剂、肥料如硝酸铵、尿素、钾碱和过磷酸钙、植物毒素和植物生长调节剂、安全剂和杀线虫药一起使用。这些附加的成分可以相继使用或者与上述组合物结合使用，如果适当还可以在使用前立即加入(灌混合)。例如，植物可以用本发明的组合物进行喷雾或之前或之后用其它活性成分处理。

[0697] 可以与根据本发明的化合物一起使用和可产生潜在协同效应的下列杀虫剂目录旨在描述可能的组合，但不强加任何限制：

[0698] M.1.有机(硫代)磷酸：高灭磷、甲基吡恶磷、乙基谷硫磷、甲基谷硫磷、氯氧磷、氯芬磷、氯甲磷、毒死蜱、甲基毒死蜱、库马磷、杀螟睛、内吸磷-S-甲基、二嗪农、敌敌畏/DDVP、百治磷、乐果、甲基毒虫畏、乙拌磷、EPN、乙硫磷、灭线磷、氨磺磷、苯线磷、杀螟松、倍硫磷、吡氟硫磷、噻唑磷、庚烯磷、恶唑磷、马拉硫磷、灭蚜蜱、甲胺磷、 杀扑磷、速灭磷、久效磷、三溴磷、氧乐果、砜吸磷、对硫磷、甲基对硫磷、稻丰散、甲拌磷、伏杀磷、亚胺硫磷、磷胺、肟硫磷、甲基司替罗磷、丙溴磷、异丙氧磷、丙硫磷、吡唑硫磷、哒嗪硫磷、硫磷、治螟磷、丁基嘧啶磷、双硫磷、特丁硫磷、四氯乙烯磷、甲基乙拌磷、三唑磷、敌百虫、蚜灭磷；

[0699] M.2.氨基甲酸酯：涕灭威、棉铃威、恶虫威、丙硫克百威、丁酮威、丁酮砜威、胺甲奈、虫螨威、丁硫克百威、乙硫苯威、仲丁威、伐虫脒、呋线威、异丙威、灭虫威、灭多虫、速灭威、杀线威、抗蚜威、残杀威、硫双威、久效威、三甲威、XMC、灭杀威、唑蚜威；

[0700] M.3.除虫菊素类：氟丙菊酯、丙烯除虫菊、d-顺-反式丙烯除虫菊、d-反式丙烯除虫菊、联苯菊酯、生物烯丙菊酯、生物烯丙菊酯S-环戊烯基、除虫菊酯、乙氰菊酯、氟氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、功夫菊酯、λ-功夫菊酯、γ-功夫菊酯、氯氰菊酯、α-氯氰菊酯、β-氯氰菊酯、θ-氯氰菊酯、δ-氯氰菊酯、苯醚氰菊酯、溴氰菊酯、烯炔菊酯、杀灭阿菊酯、依芬普司、甲氰菊酯、氰戊菊酯、氟氰戊菊酯、氟氯苯菊酯、氟胺氰菊酯、苄螨醚、炔咪菊酯、扑灭司林、苯氧司林、炔丙菊酯、苄呋菊酯、RU15525、硅白灵、七氟菊酯、四甲司林、四溴菊酯、四氟苯菊酯、ZXI8901；

[0701] M.4.保幼激素模拟物：烯虫乙酯、烯虫炔酯、烯虫酯、苯氧威、吡丙醚；

[0702] M.5.烟碱受体激动剂/拮抗剂化合物：啶虫脒、杀虫磺、杀螟丹盐酸盐、噻虫胺、呋虫胺、吡虫啉、噻虫嗪、烯啶虫胺、烟碱、多杀菌素(变构效应激动剂)、噻虫啉、杀虫环、杀虫双和AKD1022。

[0703] M.6.GABA门控氯化物通道拮抗剂化合物：氯丹、硫丹、γ-HCH(林旦)；acetoprole、乙虫腈、氟虫腈、pyrafluprole、pyriprole、vaniliprole、式M6.1的苯基吡唑化合物

[0704]

[0705] M.7.氯化物通道激活剂：阿巴克丁、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、弥拜菌素、lepimectin；

[0706] M.8.METI I化合物：喹螨醚、唑螨酯、嘧螨醚、哒螨灵、吡螨胺、唑虫酰胺、嘧虫胺、鱼藤酮；

[0707] M.9.METI II和III化合物：灭螨醌、fluacyprim、氟蚁腙；

[0708] M.10.氧化磷酸化解偶联剂：虫螨腈、DNOC；

[0709] M.11.氧化磷酸化抑制剂：三唑锡、三环锡、丁醚脲、苯丁锡、快螨特、三氯杀螨砜；

[0710] M.12.蜕皮破坏剂：环丙氨嗪、环虫酰肼、氯虫酰肼、甲氧虫酰肼、虫酰肼；

[0711] M.13.协同剂：胡椒基丁醚、脱叶磷；

[0712] M.14.钠通道封闭剂化合物：茚虫威、metaflumizone；

[0713] M.15.熏蒸剂：甲基溴、氯化苦、硫酰氟；

[0714] M.16.选择性进食阻断剂：crylotie、吡蚜酮、氟啶虫酰胺；

[0715] M.17.螨生长抑制剂：四螨嗪、噻螨酮、乙螨唑；

[0716] M.18.壳多糖合成抑制剂：噻嗪酮、双三氟虫脲、氟啶脲、二氟苯隆、氟环脲、氟虫脲、氟铃脲、氯芬奴隆、双苯氟脲、多氟脲、氟苯脲、杀铃脲；

[0717] M.19.脂质生物合成抑制剂：螺螨酯、螺甲螨酯、螺虫乙酯；

[0718] M.20.酚乙醇胺能激动剂：阿米曲士；

[0719] M.21.兰诺定受体调节剂：氟虫酰胺；

[0720] M.22.多种：磷化铝、amidoflumet、benclothiaz、苯螨特、联苯肼酯、硼砂、溴螨酯、氰化物、cyenopyrafen、丁氟螨酯、灭螨猛、开乐散、氟乙酸盐或酯、磷化氢、啶虫丙醚、22.1
pyrifluquinazon、硫磺、酒石酸锑钾；嘧啶基炔基醚化合物M 或噻二唑基炔基醚化合物
22.2
M :

[0721]

[0722] 其中RM-22是甲基或乙基并且Het*是3,3-二甲基吡咯烷-1-基、3-甲基哌啶-1-基、3,5-二甲基哌啶-1-基、3-三氟甲基哌啶-1-基、六氢氮杂 -1-基、2,6-二甲
基六氢氮杂 -1-基或2,6-二甲基吗啉-4-基。

[0723] M.23.N-R’-2,2-二 卤 -1-R”环 丙 烷 氨 甲 酰 -2-(2,6-二 氯 -α,α,-三-氟-对-甲苯基)腙或N-R’-2,2-二(R”’)丙酰胺-2-(2,6-二氯-α,α,α-三
氟-对-甲苯基)-腙，其中R’是甲基或乙基，卤是氯或溴，R”是氢或甲基并且R”’是甲基或乙基；

[0724] M.24.邻氨基苯甲酰胺：氯虫苯甲酰胺、式M241化合物

[0725]

[0726] M.25. 丙 二 腈 化 合 物 ：CF3(CH2)2C(CN)2CH2(CF2)3CF2H、CF3(CH2)2C(CN)2CH2(CF2)5CF2H、CF3(CH2)2C(CN)2(CH2)2C(CF3)2F、
CF3(CH2)2C(CN)2(CH2)2(CF2)3CF3、CF2H(CF2)3CH2C(CN)2CH2(CF2)3CF2
H、CF3(CH2)2C(CN)2CH2(CF2)3CF3、CF3(CF2)2CH2C(CN)2CH2(CF2)3CF2H、
CF3CF2CH2C(CN)2CH2(CF2)3CF2H、2-(2,2,3,3,4,4,5,5-八氟戊基)-2-(3,3,4,4,4-五氟丁基)-丙二腈和CF2HCF2CF2CF2CH2C(CN)2CH2CH2CF2CF3；

[0727] M.26.微生物干扰剂：苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensissubsp.Israelensi)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、苏云金芽孢杆菌鲇泽
亚种(Bacillus thuringiensis subsp.Aizawai)、苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种
(Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki)、苏云金芽孢杆菌拟步行甲亚种(Bacillus thuringiensis subsp.Tenebrionis)；

[0728] A组的商业可利用化合物尤其可以在The Pesticide Manual，13thEdition，British Crop Protection Council(2003)中找到。

[0729] 式M6.1的硫代酰胺及其制备已经描述于WO98/28279中。Lepimectin来自Agro Project，PJB Publications Ltd，November2004。Benclothiaz及其制备已经描述于EP-A1454621中。杀扑磷和对氧磷及其制备已经描述于Farm Chemicals Handbook，
Volume88，Meister Publishing Company，2001中。Acetoprole及其制备已经描述于
WO98/28277中。Metaflumizone及其制备已经描述于EP-A1462456中。吡氟硫磷已经描
述于Pesticide Science54，1988，p.237-243和US4822779中。Pyrafluprole及其制备已经描述于JP2002193709和WO01/00614中。Pyriprole及其制备已经描述于WO98/45274
和US6335357中。amidoflumet及其制备已经描述于US6221890和JP21010907中。嘧虫
胺及其制备已经描述于WO03/007717和WO03/007718中。AKD1022及其制备已经描述于
US6300348中。氯虫苯甲酰胺已经描述于WO01/70671、WO03/015519和WO05/118552中。
式M24.1的邻氨基苯甲酰胺衍生物已经描述于WO01/70671、WO04/067528和WO05/118552
中。丁氟螨酯及其制备已经描述于WO04/080180中。氨基喹唑酮化合物pyrifluquinazon
已经描述于EP A1097932中。炔基醚化合物M22.1和M22.2描述于例如JP2006131529
中。 丙 二 腈 化 合 物 CF3(CH2)2C(CN)2CH2(CF2)3CF2H、CF3(CH2)2C(CN)2CH2(CF2)5CF2H、CF3(CH2)2C(CN)2(CH2)2C(CF3)2F、CF3(CH2)2C(CN)2(CH2)2(CF2)3CF3、CF2H(CF2)3CH2C(CN)2CH2(CF2)3CF2H、CF3(CH2)2C(CN)2CH2(CF2)3CF3、CF3(CF2)2CH2C(CN)2CH2(CF2)3CF2H、 CF3CF2CH2C(CN)2CH2(CF2)3CF2H、2-(2,2,3,3,4,4,5,5-八氟戊基)-2-(3,3,4,4,4-五氟丁基)-丙二腈和CF2HCF2CF2CF2CH2C(CN)2CH2CH2CF2CF3已经描述于WO05/63694中。

[0730] 杀真菌混合配偶体是选自由下列组成的F组的那些

[0731] F.1 酰基丙氨酸例如苯霜灵、甲霜灵、甲呋酰胺、恶霜灵；

[0732] F.2 胺衍生物例如aldimorph、多果定、十二环吗啉、丁苯吗啉、苯锈啶、双胍辛胺、双胍辛胺、螺环菌胺、十三吗啉；

[0733] F.3 苯胺基3嘧啶类，例如二甲嘧菌胺、嘧菌胺或嘧菌环胺；

[0734] F.4 抗生素例如放线菌酮、灰黄霉素、春雷霉素、纳他霉素、多抗霉素或链霉素；

[0735] F.5 吡咯类，例如联苯三唑醇、糠菌唑、环丙唑醇、苯醚甲环唑、烯唑醇、氟环唑、分菌氰唑、氟喹唑、氟硅唑、己唑醇、抑霉唑、叶菌唑、腈菌唑、配那唑、丙环唑、丙氯灵、丙硫菌唑、戊唑醇、三唑酮、三唑醇、氟菌唑、灭菌唑、粉唑醇；

[0736] F.6 二羧酰亚胺例如异菌脲、甲菌利、腐霉利、乙烯菌核利；

[0737] F.7 二硫代氨基甲酸酯例如福美铁、代森钠、代森锰、代森锰锌、威百亩、代森联、丙森锌、代森福美锌、福美双、福美锌、乙硫锌；

[0738] F.8 杂环化合物例如敌菌灵、苯菌灵、啶酰菌胺、多菌灵、萎锈灵、氧化萎锈灵、氰霜唑、棉隆、二噻农、恶唑酮菌、咪唑菌酮、氯苯嘧啶醇、麦穗宁、氟酰胺、福拉比、稻瘟灵、灭锈胺、氟苯嘧啶醇、烯丙苯噻唑、丙氧喹啉、啶斑肟、咯喹酮、喹氧灵、硅噻菌胺、噻苯哒唑、噻氟菌胺、甲基硫菌灵、噻酰菌胺、三环唑、嗪氨灵；

[0739] F.9 铜杀真菌剂例如波尔多液、醋酸铜、氧氯化铜、碱式硫酸铜；

[0740] F.10 硝基苯基衍生物例如乐杀螨、消螨普、敌螨通、nitrophthalisopropyl；

[0741] F.11 苯基吡咯例如拌种咯或咯菌腈；

[0742] F.12 strobilurins例如腈嘧菌酯、醚菌胺、氟嘧菌酯、醚菌酯、苯氧菌胺、肟醚菌胺、啶氧菌酯或肟菌酯；

[0743] F.13 次磺酸衍生物例如敌菌丹、克菌丹、苯氟磺胺、灭菌丹、对甲抑菌灵；

[0744] F.14 肉桂酰胺和类似物例如烯酰吗啉、氟酰菌胺或氟吗啉；

[0745] F.15 硫磺和其它杀真菌剂例如阿拉酸式苯-S-甲基、苯噻菌胺、环丙酰菌胺、百菌清、环氟菌胺、霜脲氰、棉隆、哒菌酮、双氯氰菌胺、乙硫甲威、敌瘟磷、噻唑菌胺、环酰菌胺、三苯基乙酸锡、氰菌胺、嘧菌腙、氟啶胺、三乙膦酸、三乙膦酸铝、丙森锌、六氯苯、苯菌酮、戊菌隆、霜霉威、四氯苯酞、甲基立枯磷、五氯硝苯、苯酰菌胺。

[0746] 应用

[0747] 动物害虫即昆虫、植物、植物在其中生长的土壤或水可以通过本领域已知的任何应用方法与根据本发明鉴定的一种或多种化合物或者包含的它们的一种或多种组合物接触。如此，“接触”包括直接接触(直接在动物害虫或植物，有代表性地植物叶子、茎或根上应用化合物/组合物)和间接接触(向动物害虫或植物所在部位应用化合物/组合物)两
者。

[0748] 根据本发明方法鉴定的通式化合物或包含它们的杀虫组合物可用于通过将植物/作物与杀昆虫有效量的根据本发明方法鉴定的化合物接触，保护生长的植物和作物不被动物害虫，特别是昆虫、螨或蜘蛛攻击或侵袭。术语“作物”指生长着的作物和收获后的作物。

[0749] 此外，通过将靶标昆虫、其食物供应、栖息地、繁殖地或其所在场所与杀昆虫有效量的根据本发明方法鉴定的化合物接触可以控制动物害虫。如此，可以在害虫侵袭所在场所、生长着的作物或收获的作物之前或之后开展应用。

[0750] 本发明的化合物还可以向预期害虫出现的地方预防性应用。

[0751] 根据本发明方法鉴定的化合物还可以通过将植物与杀昆虫有效量的根据本发明方法鉴定的化合物接触保护生长着的植物不被害虫攻击或侵袭。如此，“接触”包括直接接触(直接在害虫和/或植物，有代表性地植物的叶 子、茎或跟上应用化合物/组合物)和
间接接触(向害虫和/或植物所在场所应用化合物/组合物)两者。

[0752] “所在场所”意思是指害虫或寄生虫生长或将会生长的栖息地、繁殖地、植物、种子、土壤、区域、材料或环境。

[0753] 通常，“杀昆虫有效量”意思是指实现对生长、死亡、妨碍、阻止或去除、破坏或缩小靶标生物出现和活动可观察效果所需要的活性成分的量。杀昆虫有效量对于本发明中使用的不同化合物/组合物而言可以变化。组合物的杀昆虫有效量也可根据优势条件，如预期的杀虫效果和持续时间、天气、靶标物种、所在场所、应用模式等等而变化。

[0754] 以土壤处理或向害虫住处或巢穴应用为例，活性成分的量的范围从0.0001至2 2
500g每100m，优选从0.001至20g每100m。

[0755] 保护材料中的常规应用率为例如从0.01g至1000g活性化合物每m2处理的材料，2
期望从0.1g至50g每m。

[0756] 在材料浸渍中使用的杀虫组合物有代表性地包含从0.001至95重量％、优选从0.1至45重量％、并且优选从1至25重量％的至少一种驱虫剂和/或杀虫剂。

[0757] 对于在处理作物植物中的使用，本发明的活性成分的应用率可在0.1g至4000g每公顷、期望从25g至600g每公顷、更期望从50g至500g每公顷范围内。

[0758] 式I化合物通过接触(通过土壤、玻璃、墙、床网、地毯、植物部分或动物部分)和摄入(诱饵或植物部分)均有效。

[0759] 本发明化合物还可以对非作物昆虫害虫应用，例如蚂蚁、白蚁、黄蜂、苍蝇、蚊子、蟋蟀或蟑螂。对于针对所述非作物害虫的使用，式I化合物优选地在诱饵组合物中使用。

[0760] 诱饵可以是液体、固体或半固体制剂(例如凝胶)。固体诱饵可以制成多种形状并且制成适宜各自的应用例如颗粒、块、棒、盘。液体诱饵可以充满在不同装置中以保证正确应用，例如敞开的容器、喷雾装置、微滴源 或蒸发源。凝胶可以基于水性或油性基质并且可以被配制成根据粘度、保水性或老化特性的特定必需品。

[0761] 在组合物中采用的诱饵是足以吸引昆虫例如蚂蚁、白蚁、黄蜂、苍蝇、蚊子、蟋蟀等或蟑螂食用它的产物。吸引力可通过使用取食刺激剂或性信息素操纵。食物刺激剂选自例如，但不排除，动物和/或植物蛋白质(肉粉、鱼粉或血粉、昆虫部分、卵黄)、动物和/或植物来源的脂肪和油，或单糖、寡糖或多糖，特别是选自蔗糖、乳糖、果糖、右旋糖、葡萄糖、淀粉、果胶或者甚至糖蜜或蜂蜜。水果、作物、植物、动物、昆虫的新鲜或腐烂部分或其特定部分也可以充当取食刺激剂。性信息素已知是昆虫特异性更高的。特定的信息素描述于文献中并且为本领域技术人员所知。

[0762] 对于在诱饵组合物中的应用，活性成分的典型含量是从0.001重量％至15重量％、预期从0.001重量％至5％重量％的活性化合物。

[0763] 根据本发明方法鉴定的化合物作为气溶胶(例如在喷雾罐)、油喷雾剂或泵喷雾剂的制剂极其适用于非专业使用者来控制害虫例如苍蝇、蚤、蜱、蚊子或蟑螂。气溶胶配方优选地由活性化合物、溶剂如低级醇(例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇)、酮(例如丙酮、丁酮)、具有约50至250℃沸点范围的石蜡烃(例如煤油)、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、芳香族烃例如甲苯、二甲苯、水，此外还有辅助物例如乳化剂如山梨醇单油酸酯、具有3-7mol环氧乙烷的油基乙氧基化物、脂肪醇乙氧基化物、芳香油例如精油、中链脂肪酸与低级醇的酯、芳香族羰基化合物，如果合适还有稳定剂如苯甲酸钠、兼性表面活性剂、低级环氧化物、原甲酸三乙酯和如果需要还有推进剂如丙烷、丁烷、氮、压缩空气、二甲醚、二氧化碳、一氧化二氮或这些气体的混合物组成。

[0764] 油喷雾剂制剂与气溶胶配方不同之处在于不使用推进剂。

[0765] 对于在喷雾剂组合物中使用，活性成分含量为从0.001至80重量％、优选从0.01至50重量％并最优选从0.01至15重量％。

[0766] 根据本发明方法鉴定的化合物及其各自的组合物也可以用于蚊子和熏香、烟筒、汽化器盘或长时间汽化器，并且也可用于防虫纸、防虫垫或其他不依赖热的汽化器系统。

[0767] 用式I化合物及其各自的组合物控制由昆虫传播的传染性疾病(例如疟疾、登革热和黄热病、淋巴性丝虫病和利什曼病)的方法还包括处理茅舍和房子表面，空气喷洒和浸渍窗帘、帐篷、衣服、床网、舌蝇陷阱等。应用于纤维、织物、针织品、无纺布、网材料或箔和防水油布的杀虫组合物优选包括包含杀虫剂、任选驱虫剂和至少一种粘合剂的混
合物。适宜的驱虫剂为例如N,N-二乙基-间甲苯甲酰胺(DEET)、N,N-二乙基苯乙酰胺
(DEPA)、1-(3-环己烷-1-基-羰基)-2-甲基胡椒碱、(2-羟基甲基环己基)乙酸内酯、
2-乙基-1,3-己二醇、避蚊酮、Methylneodecanamide(MNDA)、不用于昆虫控制的除虫菊
酯如{(+/-)-3-烯丙基-2-甲基-4-氧环戊-2-(+)-烯基-(+)-反-菊酸酯(杀蚊灵)、
源自植物提取物或者与植物提取物相同的驱虫剂如柠檬烯、丁香酚、(+)-Eucamalol(1)、(-)-1-epi-eucamalol或者来自植物如斑皮桉(Eucalyptus maculata)、单叶蔓荆(Vitex rotundifolia)、玫瑰草(Cymbopogan martini)、柠檬香茅(Cymbopogan citratus)(柠檬草)、亚香茅(Cymopogan nartdus)(香茅)的粗植物提取物。适宜的粘合剂选自例如脂族
酸乙烯酯的聚合物和共聚物(例如诸如乙酸乙烯酯和叔碳酸乙烯酯)、醇的丙烯酸酯和甲
基丙烯酸酯如丙烯酸丁酯、丙烯酸2-乙基己酯和丙烯酸甲酯、单和双烯属不饱和烃例如苯乙烯和脂肪族双烯如丁二烯。

[0768] 窗帘和床网的浸渍通常通过将织物材料浸入在杀虫剂乳化剂或分散剂中或者将杀虫剂乳化剂或分散剂喷在网上面进行。

[0769] 根据本发明方法鉴定的化合物及其组合物可以用于保护木制材料例如树、木板栅栏、枕木等以及建筑物例如房子、库房、工厂，还有建筑材料、家具、皮革制品、纤维制品、乙烯基物品、电线和电缆等抗蚂蚁和/或白蚁，并且用于控制蚂蚁和白蚁不损害作物或人(例如当害虫侵入到房子和公共设施内时)。根据本发明方法鉴定的化合物不但适用于周围的土壤表面或者地面下的土壤以保护木制材料，并且还可以适用于废旧物品例如地面下混 凝土、隔扇、横梁、层板、家具等表面，木制物品例如颗粒板、half boards等和乙烯基物品例如涂布的电线、乙烯树脂片、热绝缘材料例如苯乙烯泡沫等。以针对损害作物或人的蚂蚁应用为例，本发明的蚂蚁控制剂应用于作物或者环境土壤，或者直接应用于蚂蚁巢穴等。

[0770] 种子处理

[0771] 根据本发明方法鉴定的化合物也适用于处理种子以便保护种子抗昆虫害虫，特别是抗土壤中生存的昆虫害虫，以及保护所产生植物根和苗抗土壤害虫和叶昆虫。

[0772] 根据本发明方法鉴定的化合物特别用于保护种子抗土壤害虫，并且保护由此产生的植物根和苗抗土壤害虫和叶昆虫。对所产生植物根和苗的保护是优选的。更优选的
是保护所产生的植物苗抗穿刺和吮吸昆虫，其中最优选的是抗蚜虫，特别是桃蚜(Myzus persica)和/或赤拟谷盗(Tribolium castaneum)。

[0773] 因此，本发明包括用于保护种子抗昆虫，特别是抗土壤昆虫的方法，以及保护幼苗的根和苗抗昆虫，特别是抗土壤和叶昆虫的方法，所述方法包括在播种之前和/或催芽之后将种子与根据本发明方法鉴定的化合物接触。特别优选其中植物的根和苗被保护的方法，更优选其中保护植物苗抗穿刺和吮吸昆虫的方法，最优选其中保护植物苗抗蚜虫的方法。

[0774] 术语种子包括种子和所有类型的植物繁殖体，包括但不限于真正的种子、种子片、吸根、球根、球茎、果实、块茎、谷物、插条、茎切段等等，并且在优选实施方案中意思是指真正的种子。

[0775] 术语种子处理包括本领域已知的所有适宜的种子处理技术，例如拌种、种子涂布、种子喷粉、浸种和种子制丸。

[0776] 本发明还包括用活性化合物包衣的种子或包含活性化合物的种子。

[0777] 术语“涂布或包含”一般表示在应用时活性成分通常在繁殖物的表面上，虽然取决于应用方法更大或更小部分的成分将穿透进入繁殖物中。当所述繁殖物被种植或再种植时，其吸收活性成分。

[0778] 适用的种子是谷物、块根作物、油料作物、蔬菜、香料作物或观赏植物的种子，例如硬粒小麦和其它小麦、大麦、燕麦、黑麦、玉米(饲料玉米和甜玉蜀黍/甜玉米和田玉米)、大豆、油料作物、十字花科植物、棉花、向日葵、香蕉、稻、油菜、芜菁、甜菜、饲料甜菜、茄子、马铃薯、草、草坪草、草地草、饲料草、番茄、韭、西葫芦/南瓜、卷心菜、冰山形莴苣、胡椒、黄瓜、甜瓜、芸苔属种类、甜瓜、豆类、豌豆、大蒜、洋葱、胡萝卜、块茎类植物例如马铃薯、甘蔗、烟草、葡萄、喇叭花、老鹳草/天竺葵属、三色堇和凤仙花属的种子。

[0779] 此外，活性化合物还可以用于处理植物的种子，所述植物因培育方法包括基因工程方法而耐受除草剂或杀真菌剂或杀虫剂。

[0780] 例如，可采用活性化合物处理对选自磺酰脲、咪唑啉酮、草铵膦或草甘膦异丙铵和类似活性物质(见例如EP-A-0242236、EP-A-242246)(WO92/00377)(EP-A-0257993，美国专利号5,013,659)的除草剂具有抗性的植物的种子，或者转基因植物如棉花的种子，
所述转基因植物具有产生使植物抗某些害虫的苏云金芽孢杆菌毒素(Bt毒素)的能力
(EP-A-0142924、EP-A-0193259)。

[0781] 此外，活性化合物还可用于处理通过常规育种方法/或突变体产生或通过重组过程产生的具有与现存植物相比修饰的特性的植物的种子。例如，已经描述了为了修饰植物所合成淀粉的目的的作物植物的重组修饰(例如WO92/11376、WO92/14827、WO91/19806)或者具有修饰的氨基酸组成的转基因作物植物(WO91/13972)。

[0782] 活性化合物的种子处理应用通过在植物播种之前和植物出现之前喷雾或粉末拌种进行。

[0783] 尤其用于种子处理的组合物是例如:

[0784] A可溶性浓缩物(SL，LS)

[0785] D乳化剂(EW，EO，ES)

[0786] E悬浮剂(SC，OD，FS)

[0787] F水可分散颗粒和水可溶性颗粒(WG，SG)

[0788] G水可分散散剂和水可溶性散剂(WP，SP，WS)

[0789] H凝胶制剂(GF)

[0790] I粉尘化散剂(DP，DS)

[0791] 常规的种子处理制剂包括例如可流动浓缩物FS、溶液剂LS、用于干燥处理的散剂DS、用于浆体处理的水可分散散剂WS、水可溶性散剂SS和乳化剂ES和EC和凝胶制剂GF。这些制剂可经稀释或不经稀释应用于种子。向种子的应用在播种之前直接在种子上或者在催芽之后进行。

[0792] 在优选的实施方案中，FS制剂用于种子处理。通常情况下，FS制剂可包含1-800g/l的活性成分、1-200g/l的表面活性剂、0至200g/l的防冻剂、0至400g/l的粘合剂、0至200g/l的色素和直到1升的溶剂，优选水。

[0793] 用于种子处理的、根据本发明方法所鉴定化合物的特别优选的FS制剂通常包含从0.1至80％重量(1至800g/l)的活性成分、从0.1至20％重量(1至200g/l)的至少一
种表面活性剂，如0.05至5％重量的湿润剂和从0.5至15％重量的分散剂、直至20％重量，例如从5至20％的抗冻剂、从0至15％重量，例如1至15％重量的色素和/或染料、从0至
40％重量，例如1至40％重量的粘合剂(粘着剂/粘附剂)、任选直至5％重量，例如从0.1
至5％重量的增稠剂，任选从0.1至2％的消泡剂，和任选防腐剂例如从0.01至1％重量的
杀生物剂、抗氧化剂等和直至100％重量的填充剂/媒介物。

[0794] 种子处理制剂还可额外包含粘合剂和任选地着色剂。

[0795] 可加入粘合剂以改善活性材料在处理后的种子上的粘附。适宜的粘合剂是来自氧化烯的均聚物和共聚物，如环氧乙烷或环氧丙烷、聚乙烯乙酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮及其它们的共聚物、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、丙烯酸均聚物和共聚物、聚乙烯胺、聚乙烯酰胺和聚乙烯亚胺、多糖如纤维素、甲基纤维素和淀粉、聚烯烃均聚物和共聚物如烯烃/马来酐共聚物、聚氨基甲酸酯、聚酯、聚苯乙烯均聚物和共聚物。

[0796] 任选地，在制剂中还包括着色剂。用于种子处理制剂的适宜着色剂或染料是罗丹明B、C.I.色素红112、C.I.溶剂红1、色素蓝15:4、色素蓝 15:3、色素蓝15:2、色素蓝15:1、色素蓝80、色素黄1、色素黄13、色素红112、色素红48:2、色素红48:1、色素红57:1、色素红53:1、色素橙43、色素橙34、色素橙5、色素绿36、色素绿7、色素白6、色素褐25、碱性紫10、碱性紫49、酸性红51、酸性红52、酸性红14、酸性蓝9、酸性黄23、碱性红10、碱性红108。

[0797] 胶凝剂实例是鹿角菜

[0798] 在种子处理中，化合物I的应用比率通常从0.1g至10kg每100kg种子、优选从1g至5kg每100kg种子、更优选从1g至1000g每100kg种子并且特别是从1g至200g每
100kg种子。

[0799] 因此，本发明还涉及包含根据本发明方法鉴定的化合物的种子或如本文所定义的I的农业可用盐。根据本发明方法鉴定的化合物或其农业可用盐的量范围通常从0.1g至10kg每100kg种子，优选从1g至5kg每100kg种子，特别是从1g至1000g每100kg种子。
对于特定的作物如莴苣，比率将会更高。

[0800] 在一个实施方案中，本发明涉及如下总结的主题:

[0801] 第a1项用于鉴定降低昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的杀虫活性化合物的方法，所述方法
包括:

[0802] a)在膜中装配最初不存在于所述膜中的、具有昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活
性的多肽，

[0803] b)在一侧膜上应用怀疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力的化合物，

[0804] c)检测所述多肽的活性，和

[0805] 鉴定在(b)中应用的降低所述多肽活性的化合物。

[0806] 第a2项根据第a1项的方法，由此编码具有昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽的基
因表达于宿主细胞的膜中。

[0807] 第a3项第1或2项中任意一项的方法，其中膜包含由选自下列的核酸分子编码的至少一种多肽:

[0808] a)编码SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29中所示多肽的核酸分子；

[0809] b)SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29中所示核酸分子；

[0810] c)核酸分子，其因遗传密码的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30的多肽序列；

[0811] d)与包含SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0812] e)核酸分子，编码与(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且分别具有电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或
其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽；

[0813] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0814] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且分别具有电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽产生；

[0815] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO：33和/或34中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或
55、和/或56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70和/或71的一个或更多个基序的多肽；

[0816] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：3、4；7、8；11、12；15、16、19、20；23、24；27、28和/或31、32中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；和

[0817] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e) 中所表征核酸分子序列互补并编码分别具有电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助
蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、
50nt、100nt、200nt或500nt。

[0818] 第a4项第a1项的方法，由此具有昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的所述多肽的活性通
过电生理学检测。

[0819] 第a5项第a4项的方法，由此具有昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的所述多肽的活性通
过膜片钳测定或在HTS测定法中测定。

[0820] 第a6项第a2项的方法，由此编码具有昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽的基因在
哺乳动物细胞中表达。

[0821] 第a7项第a2项的方法，由此编码具有昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽的基因在
选自CHO细胞和HEK293的哺乳动物细胞中表达。

[0822] 第a8项第a1项的方法，包括:

[0823] a)e)向昆虫、昆虫群体或所在场所应用，其中所述昆虫将以昆虫控制量的根据第a1d)项鉴定的化合物控制，和

[0824] b)f)测定所处理昆虫或昆虫群体或所述场所上的昆虫群体和未处理昆虫、昆虫群体或场所的生长或生存力，和

[0825] c)g)选择在应用步骤e)的化合物后降低所处理昆虫或昆虫群体或所述场作上昆虫群体生长或生存力的化合物。

[0826] 第a9项用于鉴定分别降低昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的杀虫活性化合物的测
定系统，其包含宿主生物、组织、细胞或其细胞消化物或膜，其已经包埋入、装配入、插入或整合入选自如第a3a)至3j)项中所 述核酸分子的核酸分子并且基于该核酸分子的表达，
分别具有昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白
KChIP(钾通道相互作用蛋白)的生物学活性的多肽。

[0827] 第a10项 第a9项的测定系统，其中宿主细胞是表达选自第a3a)至3j)项中所述核酸分子的核酸分子的稳定转染的哺乳动物细胞。

[0828] 第a11项 第a10项的测定系统，其中哺乳动物细胞选自：CHO细胞、HEK293、COS、HeLa、NIH3T3、BAK21、Jurkat、CV-1、HepC-2-、爪蟾卵母细胞、Sf9、S2、Sf21、Hi5、Pc12和U2OS。

[0829] 第a12项 杀死昆虫或者抑制昆虫生长或生存力的方法，包括向昆虫应用根据第a1项的方法鉴定的化合物。

[0830] 第a13项 核酸分子，选自：

[0831] a)编码在SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子；

[0832] b)SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29中所示核酸分子；

[0833] c)核酸分子，其因遗传密码的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26和/或30的多肽序列；

[0834] d)与包含SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25和/或29所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0835] e)核酸分子，编码与(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且分别具有电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或
其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽；

[0836] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0837] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且分别具有电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽产生；

[0838] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO：33和/或34中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或
55、和/或56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70和/或71的一个或更多个基序的多肽；

[0839] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：3、4；7、8；11、12；15、16；19、20；23、24；27、28和/或31、32中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；

[0840] 和

[0841] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中所表征核酸分子序
列互补并编码分别具有钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白
KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、
100nt、200nt或500nt。

[0842] 第a14项 包含根据第a13项的核酸分子的核酸构建体。

[0843] 第a15项 包含根据第a14项的核酸构建体或者根据第a13项的核酸分子的载体。

[0844] 第a16项 包含根据第a15项的载体、根据第a14项的核酸构建体或根据第a13项的核酸分子的转基因细胞。

[0845] 第a17项 由根据第a13项的核酸分子编码的多肽。

[0846] 第a18项 分别具有昆虫电压门控性钾通道Shal(Shaker同族物l或Shaker样)和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白)活性的多肽用作杀虫靶标的用途。

[0847] 第a19项 由选自如第a3a)至3j)项中所述核酸分子编码的多肽用作杀虫靶标的用途。

[0848] 第a20项 控制杀虫害虫的方法，包括应用含有至少一种如表I所示化合物或其衍生物作为杀虫活性成分的组合物。

[0849] 第b1项.用于鉴定分别降低昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活性的杀虫活性化合物的方法，所述方法包括:

[0850] a)在膜中装配最初不存在于所述膜中的、分别具有昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活性的多肽，

[0851] b)在一侧膜上应用怀疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力的化合物，

[0852] c)检测所述多肽的活性，和

[0853] d)鉴定在(b)中应用的降低所述多肽活性的化合物。

[0854] 第b2项.根据第b1项的方法，由此编码分别具有昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活性的多肽的基因表达于宿主细胞的膜
中。

[0855] 第b3项.第b1或b2项中任意一项的方法，其中膜包含由选自下列的核酸分子编码的至少一种多肽:

[0856] a)编码包含SEQ ID NO：73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽的多肽的核酸分子；

[0857] b)包含SEQ ID NO：72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的核酸分子；

[0858] c)核酸分子，其因遗传密码的简并性可以衍生自包含根据SEQ ID NO：73、75、77、79、81、83、85和/或87的多肽序列的多肽；

[0859] d)与包含SEQ ID NO：72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0860] e)核酸分子，其编码与(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且分别具有Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或
C亚型活性的多肽；

[0861] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0862] g)核酸分子，其编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且分别具有Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活性的多肽产生；

[0863] h)核酸分子，其编码包含SEQ ID NO：102和/或103中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、
119、120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一个或更多个基序的多肽；

[0864] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：88、89；90、91；92、93；94、95；96、97；98、99和/或100、101中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；

[0865] 和

[0866] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中所表征核酸分子序列互补并编码分别具有Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚
型活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。

[0867] 第b4项.第b1项的方法，由此分别具有昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活性的所述多肽的活性通过电生理学方法检测。

[0868] 第b5项.第b4项的方法，由此分别具有昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活性的所述多肽的活性通过膜片钳测定或FLIPR测定。

[0869] 第b6项.第b2项的方法，由此编码分别具有昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活性的多肽的基因在哺乳动物细胞中表
达。

[0870] 第b7项.第b2项的方法，由此编码分别具有昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活性的多肽的基因在选自CHO细胞、
HEK293的哺乳动物细胞中表达。

[0871] 第b8项.第b1项的方法，其包括:

[0872] e)向昆虫、昆虫群体或所在场所应用，其中所述昆虫以昆虫控制量的根据第b1d)项鉴定的化合物控制，和

[0873] f)检测所处理昆虫或昆虫群体或所述场所上的昆虫群体和未处理昆虫、昆虫群体或场所的生长或生存力，和

[0874] g)选择在应用步骤e)的化合物后降低所处理昆虫或昆虫群体或所述场作上昆虫群体生长或生存力的化合物。

[0875] 第b9项.用于鉴定分别降低昆虫Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活性的杀虫活性化合物的测定系统，包含宿主生物、组织、细胞
或其细胞消化物或膜，其已经包埋入、装配入、插入或整合入选自如第b3a)至b3j)项中
所述核酸分子的核酸分子并且基于该核酸分子的表达，分别具有昆虫Shaker通道和/或
Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型的生物学活性的多肽。

[0876] 第b10项.第b9项的测定系统，其中宿主细胞是表达选自第b3a)至b3j)项中所述核酸分子的核酸分子的稳定转染哺乳动物细胞。

[0877] 第b11项.第b10项的测定系统，其中哺乳动物细胞选自：CHO细胞、HEK293、COS、HeLa、NIH3T3、BAK21、Jurkat、CV-1、HepC-2-、爪蟾卵母细胞、Sf9、S2、Sf21、Hi5、Pc12、U2OS。

[0878] 第b12项.杀死昆虫或者抑制昆虫生长或生存力的方法，包括向昆虫应用根据第b1项的方法鉴定的化合物。

[0879] 第b13项.核酸分子，选自：

[0880] a)编码包含SEQ ID NO：73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽的多肽的核酸分子；

[0881] b)包含SEQ ID NO：72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的核酸分子；

[0882] c)核酸分子，其因遗传密码的简并性可以衍生自包含根据SEQ ID NO：73、75、77、79、81、83、85和/或87的多肽序列的多肽；

[0883] d)与包含SEQ ID NO：72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0884] e)核酸分子，其编码与(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且分别具有Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或
C亚型活性的多肽；

[0885] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0886] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且分别具有Shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活性的多肽产生；

[0887] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO：102和/或103中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、
120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一个或更多个基序的多肽；

[0888] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：88、89；90、91；92、93；94、95；96、97；98、99和/或100、101中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；

[0889] 和

[0890] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中所表征核酸分子序列互补并编码分别具有Shaker通道和Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活
性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。

[0891] 第b14项.包含根据第b13项的核酸分子的核酸构建体。

[0892] 第b15项.包含根据第b14项的核酸构建体或根据第b13项的核酸分子的载体。

[0893] 第b16项.包含根据的第b15项的载体、根据第b14项的核酸构建体或根据第b13项的核酸分子的转基因细胞。

[0894] 第b17项.由根据第b13项的核酸分子编码的多肽。

[0895] 第b18项.分别具有昆虫Shaker通道和Hyperkineticβ亚基，优选H-kvβ亚基A或C亚型活性的多肽用作杀虫靶标的用途。

[0896] 第b19项.由选自如第b3a)至b3j)项中所述核酸分子的核酸分子编码的多肽用作杀虫靶标的用途。

[0897] 第c1项.鉴定杀虫活性化合物的方法，所述化合物降低选自优选来自黑腹果蝇的oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体的活性，所述方法包括:

[0898] a)在膜中装配最初不存在于所述膜中的、具有选自优选来自黑腹果蝇的oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的多肽，

[0899] b)在一侧膜上应用怀疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力的化合物，

[0900] c)检测所述多肽的活性，和

[0901] d)鉴定在(b)中应用的降低所述多肽活性的化合物。

[0902] 第c2项.根据第c1项的方法，由此编码具有选自优选来自黑腹果蝇的oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的多肽的基因表达于宿主细胞的膜中。

[0903] 第c3项.第c1或c2项中任意一项的方法，其中膜包含由选自下列的核酸分子编码的至少一种多肽:

[0904] a)编码SEQ ID NO：130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174中所示多肽的核酸分子；

[0905] b)SEQ ID NO：129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173中所示核酸分子；

[0906] c)核酸分子，其因遗传密码的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO：130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174的多肽序列

[0907] d)与包含SEQ ID NO：129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0908] e)核酸分子，编码与(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且分别具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的多肽；

[0909] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0910] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的多肽产生；

[0911] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO：177、178和/或179中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207和/或208、和/或209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225和/或
226的一个或更多个基序的多肽；

[0912] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：131、132；135、136；139、140；143、144；147、148；151、152；155、156；159、160；163、164；167、168；171、172和/或175、176中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；

[0913] 和

[0914] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中所表征核酸分子序列互补并编码具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、 Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。

[0915] 第c4项.第c1项的方法，由此具有选自优选来自黑腹果蝇的oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的所述多肽的活性通过荧光测定法测定。

[0916] 第c5项.第c2项的方法，由此具有选自优选来自黑腹果蝇的oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的所述多肽的活性使用钙浓度敏感染料测
定。

[0917] 第c6项.第c2项的方法，由此编码具有选自优选来自黑腹果蝇的oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的多肽的基因在哺乳动物细胞中表达。

[0918] 第c7项.第c2项的方法，由此编码具有选自优选来自黑腹果蝇的oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的多肽的基因在选自CHO细胞、HEK293的哺
乳动物细胞中表达。

[0919] 第c8项.第c1项的方法，包括:

[0920] e)向昆虫、昆虫群体或所在场所应用，其中所述昆虫以昆虫控制量的根据第c1d)项鉴定的化合物控制，和

[0921] f)检测所处理昆虫或昆虫群体或所述场所上的昆虫群体和未处理昆虫、昆虫群体或场所的生长或生存力和

[0922] g)选择在应用步骤e)的化合物后降低所处理昆虫或昆虫群体或所述场作上昆虫群体生长或生存力的化合物。

[0923] 第c9项.用于鉴定降低选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的杀虫活性化合物的测定系统，包含宿主生物、组织、细胞或其细胞消化物或膜，其已经包埋入、装配入、插入或整合入选自如第c3a)至c3j)项中
所述核酸分子的核酸分子并且基于该核酸分子的表达，具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体的生物学活性的多肽。

[0924] 第c10项.第c9项的测定系统，其中宿主细胞是表达选自第c3a)至c3j)项中所述核酸分子的核酸分子的稳定转染的哺乳动物细胞。

[0925] 第c11项.第c10项的测定系统，其中哺乳动物细胞选自：CHO细胞、HEK293、COS、HeLa、NIH3T3、BAK21、Jurkat、CV-1、HepC-2-、爪蟾卵母细胞、Sf9、S2、Sf21、Hi5、Pc12、U2OS。

[0926] 第c12项.杀死昆虫或者抑制昆虫生长或生存力的方法，包括向昆虫应用根据第c1项的方法鉴定的化合物。

[0927] 第c13项.核酸分子，其选自：

[0928] a)编码在SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42和/或46中所示多肽的核酸分子；

[0929] b)SEQ ID NO：129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173中所示核酸分子；

[0930] c)核酸分子，其因遗传密码的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO：130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174的多肽序列；

[0931] d)与包含SEQ ID NO：129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0932] e)核酸分子，编码与(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且分别具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的多肽；

[0933] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0934] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的多肽产生；

[0935] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO：177、178和/或179中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO：180、181、182、183、184、185、 186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207和/或208、和/或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或
226的一个或更多个基序的多肽；

[0936] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：131、132；135、136；139、140；143、144；147、148；151、152；155、156；159、160；163、164；167、168；171、172和/或175、176中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；

[0937] 和

[0938] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中所表征核酸分子序列互补并编码具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。

[0939] 第c14项.包含根据第c13项的核酸分子的核酸构建体。

[0940] 第c15项.包含根据第c14项的核酸构建体或根据第c13项的核酸分子的载体。

[0941] 第c16项.包含根据第c15项的载体、根据第c14项的核酸构建体或根据第c13项的核酸分子的转基因细胞。

[0942] 第c17项.编码根据第c13项的核酸分子的多肽。

[0943] 第c18项.具有选自优选来自黑腹果蝇的oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的多肽用作杀虫靶标的用途。

[0944] 第c19项.由选自第c3a)至c3j)项所述核酸分子的核酸分子编码的多肽用作杀虫靶标的用途。

[0945] 第c20项.米安色林和/或赛庚啶用作杀虫活性成分的用途。

[0946] 第d1项.用于鉴定降低昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的杀虫活性化合物的方法，所述方法包括:

[0947] a)在膜中装配最初不存在于所述膜中的、具有昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽，

[0948] b)在一侧膜上应用怀疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力的化合物，

[0949] c)检测所述多肽的活性，和

[0950] d)鉴定在(b)中应用的降低所述多肽活性的化合物。

[0951] 第d2项.根据第d1项的方法，由此编码具有昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽的基因表达于宿主细胞的膜中。

[0952] 第d3项.第d1或d2项任意一项的方法，其中膜包含由选自下列的核酸分子编码的至少一种多肽:

[0953] a)编码SEQ ID NO：228、230、232中所示多肽的核酸分子；

[0954] b)SEQ ID NO：227、229、231中所示核酸分子；

[0955] c)核酸分子，其因遗传密码的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO：228、230、232的多肽序列；

[0956] d)与包含SEQ ID NO：227、229、231所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0957] e)核酸分子，编码与(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽；

[0958] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0959] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽产生；

[0960] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO：239中所述共有序列或选自SEQ ID NO：240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252和253的一个或更多个基序的多肽；

[0961] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：233、234；235、236；237、238中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；

[0962] 和

[0963] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中所表征核酸分子序列互补并编码具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、
30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。

[0964] 第d4项.第d1项的方法，由此具有昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的所述多肽的活性通过电生理学测定。

[0965] 第d5项.第d4项的方法，由此具有昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的所述多肽的活性通过膜片钳测定。

[0966] 第d6项.第d2项的方法，由此编码具有昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽的基因在哺乳动物细胞中表达。

[0967] 第d7项.第d2项的方法，由此编码具有昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽的基因在选自CHO细胞、HEK293的哺乳动物细胞中表达。

[0968] 第d8项.第d1项的方法，包括:

[0969] e)向昆虫、昆虫群体或所在场所应用，其中所述昆虫以昆虫控制量的根据第d1d)项鉴定的化合物控制，

[0970] f)检测所处理昆虫或昆虫群体或所述场所上的昆虫群体和未处理昆虫、昆虫群体或场所的生长或生存力，和

[0971] g)选择在应用步骤e)的化合物后降低所处理昆虫或昆虫群体或所述场作上昆虫群体生长或生存力的化合物。

[0972] 第d9项.用于鉴定降低昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的杀虫活性化合物的测定系统，包含宿主生物、组织、细胞或其细胞消化物或膜，其已经包埋入、装配入、插入或掺入选自如第d3a)至d3j)项中所述核酸分子的核酸分子并且基于该核酸分子的表达，具有
昆虫小电导Ca2+激活钾通道的生物学活性的多肽。

[0973] 第d10项.第d9项的测定系统，其中宿主生物是表达选自第d3a)至d3j)项中所述核酸分子的核酸分子的稳定转染的哺乳动物细胞。

[0974] 第d11项.第d10项的测定系统，其中哺乳动物细胞选自：CHO细胞、HEK293、COS、HeLa、NIH3T3、BAK21、Jurkat、CV-1、HepC-2-、爪蟾卵母细胞、Sf9、S2、Sf21、Hi5、Pc12、U2OS。

[0975] 第d12项.杀死昆虫或者抑制昆虫生长或生存力的方法，包括向昆虫应用根据第d1项的方法鉴定的化合物。

[0976] 第d13项.核酸分子，选自：

[0977] a)编码SEQ ID NO：230、232中所示多肽的核酸分子；

[0978] b)SEQ ID NO：229、231中所示核酸分子；

[0979] c)核酸分子，其因遗传密码的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO：230、232的多肽序列；

[0980] d)与包含SEQ ID NO：229、231所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50％同一性的核酸分子；

[0981] e)核酸分子，编码与(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽；

[0982] f)在严格杂交条件下与(a)至(c)的核酸分子杂交的核酸分子；

[0983] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对(a)至(e)之一的核酸分子所编码并且具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽产生；

[0984] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO：239中所述共有序列或选自SEQ ID NO：240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252和253的一个或更多个基序的多肽；

[0985] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO：233、234；235、236；237、238中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；

[0986] 和

[0987] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含(a)或(b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与(a)至(e)中所表征核酸分子序列互补并编码具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽 的核酸分子的至少15nt、优选20nt、
30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。

[0988] 第d14项.包含根据第d13项的核酸分子的核酸构建体。

[0989] 第d15项.包含根据第d14项的核酸构建体或根据第d13项的核酸分子的载体。

[0990] 第d16项.包含根据第d15项的载体、根据第d14项的核酸构建体或根据第d13项的核酸分子的转基因细胞。

[0991] 第d17项.由根据第d13项的核酸分子编码的多肽。

[0992] 第d18项.具有昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽用作杀虫靶标的用途。

[0993] 第d19项.由选自如第d3a)至d3j)项中所述核酸分子的核酸分子编码的多肽用作杀虫靶标的用途。
实施例

[0994] 细胞生物学

[0995] 分子生物学：利用EcoR1限制性酶切位点将全长Shal CDS(编码序列)亚克隆入pcDNA3/Neo(-)表达载体。Shal_delN突变体N-末端缺失2-40aa编码区。使用Shal_
del_2-4aa_fwd(5’gcagaattcgcccttgccaccatggagaagctcctga tcaacgtctccgg-3’) 和
Shal_del_2-4aa_rev(5’-ccggagacgttgatcaggagcttctccatggtggcaagggc gaattctgc-3’)引物和XL位点定向诱变试剂盒(Stratagene)将缺失突变插入pcDNA3_Shal构建体。通过
位点定向诱变将单独一个AscI限制性酶切位点插入到pcDNA_Shal和pcDNA_Shal_delN构
建体的ATG起始密码子前面。将全长Shal和Shal_delN插入片段亚克隆入pcDNA3_AcGFPC1
载体(AscI和HindIII限制性酶切位点)获得AcGFP嵌合体(图1)。如此将AcGFP标记到
这两个构建体的N-末端。将全部构建体进行Shal编码区的双链测序以确保序列的完整性。
通过将孔区内362位的色氨酸(W)变更为苯丙氨酸(F)制备显性失活的Shal_DelNW362F
突变体。从果蝇克隆Shal辅助蛋白KChIP并亚克隆入pcDNA3.1/Zeo载体。

[0996] 图1：基本的Shal克隆。载体NTI产生的基本Shal克隆图谱，显示了构建体主要的特征。Shal编码区域长度为1473bp。

[0997] 图2：基本的KChIP克隆。载体NTI产生的基本KChIP克隆图谱，显示了构建体主要的特征。KChIP编码区域长度为621bp。表达载体pcDNA3.1-Zeo-KChIP-intron1(数据
未显示，注释本1049294#5)包含～700bp内含子以辅助克隆，并且将KChIP ORF放置于CMV启动子的下游。

[0998] 图 3：Shal 和 KChIP 表 达 构 建 体。pcDNA3/AcGFP-Shal 和 pcDNA3/AcGFP-ShaldelN2-40aa图谱，且连接载体NTI pcDNA3_ShalDelN和pcDNA3_Zeo_KCHiP_
intron1构建体。

[0999] 图4：当与AmCyan和AcGFP标记版本(上面)共表达时全长和截短的构建体的膜片钳数据。GFP-Shal孔突变体以及野生型和孔突变体的膜片钳数据的图示，表明所测量的电流确实源于Shal过表达而不是上调的内源电流(下面)。

[1000] 在哺乳动物细胞中的表达：将野生型和突变体Shal通道在CHO细胞中瞬时表达并在48小时时通过全细胞电压钳记录仪对功能进行测试。未标记的Shal构建体与pcDNA3_AmCyan共转染。全长Shal和Shal_delN突变体介导功能性通道活性。氨基末端的GFP标
记不改变通道功能。Shal_delN-W362F突变体不形成功能通道。

[1001] 稳定细胞系产生：采用FuGene转染试剂(Roche)用AcGFP-Shal和AcGFP-Shal_delN DNA转染野生型CHO细胞。通过在转染后24小时用G418(900ug/ml)筛选细胞产生稳
定的克隆细胞系。每个构建体挑取25个集落并利用荧光显微镜评价GFP表达。70-75％的
克隆细胞系表达非常弱或者无GFP表达。基于荧光等级，对一些高度和中度GFP表达克隆
细胞系用膜片钳测试Shal活性(表1)。Shal_delN克隆(克隆10和15)具有比全长Shal
克隆更高的电流密度。因此，测定的开展用这2个克隆进行。

[1002]

[1003]

[1004] 表1：Shal克隆筛选概述，显示相对荧光反应和电流密度。

[1005] 使用Molecular Devices的蓝色膜电位染料测试Shal_DelN C10和C15在FLIPR上的功能。将在完全培养基中的细胞以60K细胞/孔接种于96-孔Costar培养板并在24
小时时测定功能。与pcDNA对照细胞系相比，用15–60mM KCl去极化导致克隆细胞系中
2-2.8倍升高活性(图5)。克隆10具有比克隆15略高的活性。

[1006] 图5：用KCl去极化在FLIPR上测试Shal_DelN克隆。

[1007] 我们在FLIPR上还测试了一些已知的K-通道阻断剂对通道活性的影响(图6)。在Shal_delN克隆细胞系和对照pcDNA3细胞系中，Bay K8644、尼卡地平、奎尼丁和尼氟灭酸都显示出对KCl去极化的剂量依赖性抑制作用。测试的浓度下，氟卡尼未显示出对克隆和对照细胞系的任何抑制作用。随着细胞传代，Shal_delN克隆细胞系丢失了它们的GFP表达和测定窗口。在第12代时，细胞群中仅10-15％是GFP阳性的。

[1008] 图6：在FLIPR上测试的K通道阻断剂抑制曲线。

[1009] 通过流式分选将Shal_delN C10细胞进行亚克隆。将细胞流式分选入96孔组织培养板以获得GFP阳性的单个细胞。几个克隆细胞系被扩增放大并在FLIPR上利用KCl去
极化测试功能(图7)。

[1010] 图7：在FLIPR上通过KCl去极化筛选Shal_delN Clone10亚克隆。 基于FLIPR的数据，通过膜片钳进一步测试克隆10-2、10-3和10-6(图8)。克隆10-3和10-6在全细
胞膜片钳研究中具有高电流。

[1011] 图8：克隆10-2、10-3和10-6的膜片钳数据。IV曲线显示施加的电压对电流的关系。

[1012] Shal-delN克隆10-3亚克隆在几个细胞传代中都保持了GFP表达。在第12代时，细胞群中大约80-85％为GFP阳性的(图9)。

[1013] 图9：在第12代时Shal_DelN C10-3细胞显示出荧光随着时间的稳定性。左图-荧光激发，右图-正常光。

[1014] 测定窗口的增加：

[1015] 测试了钡(Ba2+)对Shal_delN功能的影响。已知钡可以抑制一些开放整流器和向内整流器的K-通道活性。室温下将细胞在存在BaCl2下加载染料1小时并利用KCl去
极化在FLIPR上测定通道活化。4-5mM浓度的Ba2+显著降低CHO_pcDNA3对照细胞中的荧
光反应，而用KCl去极化的Shal_delN通道活性没有任何显著减少(图10)。

[1016] 图10：在FLIPR上BaCl2对Shal通道活性的影响。

[1017] 当存在Ba2+时，在FLIPR上克隆10-3具有比克隆10-6更高的测定窗口。如通过电生理学所示，Shal外向电流不受Ba2+的抑制。想法是在pcDNA3细胞中，Ba2+抑制内源
外向K+电流，导致细胞内钾积累从而导致细胞的去极化。因此，当外部溶液含有0.5mM KCl并随着Ba2+浓度增加，随着在5mM BaCl2野生型细胞测定窗口完全崩落，膜电位增加。相比，Shal_delN克隆10-3细胞系在5mM Ba2+处仍然具有显著的Shal外向K+电流活性，导
致测定窗口。Shal_delN克隆10-3细胞在FLIPR上测试功能，一直到传代20(P20，图11)。
在P20的传代窗口细胞仍然有显著的测定窗口。然而，窗口的大小随着细胞代数的增加而缩小。

[1018] 图11：第20代时在FLIPR上Shal_delN C10-3的功能。

[1019] 通过共表达辅助蛋白增加的电流：对于一些离子通道，通过共表达辅助蛋白能够增加电流，显示于图12。

[1020] 图12：稳定表达Shal_delN的CHO-K1细胞或模拟转染(红色迹线， 较低的线)或用KChIP共转染(蓝色迹线，较高的线)。

[1021] 附加的电生理学

[1022] 用(a)果蝇属Shal基因、(b)果蝇属Shal孔突变体基因和(c)果蝇属Shal+KChIP基因转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用于全部测量。实验前2-6小时将细胞铺在35mm
Petri培养皿中。

[1023] 获取数据并使用pClamp软件(version9.0.1.16)进行分析。全细胞结构膜片钳技术在室温(22-25℃)用于电压钳细胞。利用DMZ Universal Puller(Zeitz，Munich，
Germany)从硼硅玻璃毛细管(#8250，Garner Glass，Claremont，CA)牵拉制备吸液管，当充满吸液管溶液并在水槽溶液中进行测量时这些吸液管具有1-2MOhm的电阻。形成吉欧姆阻抗封接(gigaohm seal)之前，水槽与吸管溶液之间的液体接头电位总是代偿的。

[1024] 膜电流通过Axoclamp200B(Axon Instruments)在全细胞钳下以2kHz取样和以1kHz过滤测量。在每一实验开始时电容电流被电子代偿。应用P/4漏减修正。

[1025] 为了研究CHO细胞上的Shal电流，将细胞保持于–70mV下并且以10mV的增量应用从–70至+70mV，或+100mV的一系列500ms测试电压脉冲。如测量电流-电压相互关
系，测量波幅并且定义为在给定膜电位下的最大电流。

[1026] 槽 溶 液：NaCl(160mM)，KCl(2.5mM)，MgCl2(1mM)，CaCl2(2mM)，HEPES(10mM)pH7.4(用NaOH调节)

[1027] 吸管溶液:KCl(160mM)，MgCl2(5mM)，EGTA(1mM)，CaCl2(0.1mM)，NaGTP(0.1mM)，K2ATP(3mM)，HEPES(5mM)

[1028] pH7.4(用NaOH调节)

[1029] 额外的电生理学

[1030] 通过进一步测定验证，在Shal/KChIP20细胞上测试了假定的Shal封闭剂花生四烯酸(J.Neurosci.1996，16:2522)(图13)。

[1031] 图13：由花生四烯酸抑制的Shal/KChIP。用槽溶液中100uM花生四烯酸[终]溶液充满Shal/KChIP20细胞。在全细胞钳下测量之前和之后的 化合物电流。左图：曲线下面积的积分(全电流)。右图：峰值电流波幅。

[1032] 结果和结论：与花生四烯酸温育5分钟后获得全Shal/KChIP电流的完全抑制作用，从而证实了该通道的关键指示剂。

[1033] CHO细胞系中的ShIP_GFP稳定克隆，显示于图14。

[1034] 图14：克隆18-13-6和18-13-20的I/V曲线。

[1035] 缓冲液：KCNQ Int/Ext溶液

[1036] 方 案：C:\FJB\ 膜 片 钳\Patch_parmeters\CHO细 胞 _Shal_IV500ms_to70mV_Whole_cell.pro

[1037] 克隆世代与选择

[1038] 转染：将Shal_delN10-3细胞以2.5x105细胞/孔铺在35mm6-孔板中并且6小时后使用FuGENE转染试剂(Roche)并按照制造商的建议用1ug pcDNA3.1/Zeo(+)KChIP DNA
转染各个孔。同样进行无KChIP DNA的模拟转化以监测抗生素筛选。对于"Neo/Zeo"对照
细胞系，用1ug pcDNA3.1/Zeo DNA转染传代44代的pcDNA3.1/Neo CHO细胞。24小时后将
2
细胞以750K细胞/瓶传代至175cm 的培养瓶并进行抗生素筛选(900ug/ml G418；1mg/ml
Zeocin)。对于Shal/KChIP转染，一旦筛选完成(4天)，将细胞用完全培养基稀释至12细
胞/ml并将250ul分配到96孔培养板的各孔。生长一周之后鉴定含有单一集落的孔，挑取
这些孔进行放大扩增并在额外培养一周之后进行测试。Neo/Zeo对照细胞以多克隆库形式进行增殖。

[1039] 克隆筛选：19个单个Shal/KChIP克隆用于筛选功能(图15)。应答用KCl去极化的波幅和动力学谱用于筛选克隆进一步进行评定。

[1040] 图15：Shal/KChIP克隆筛选和Neo/Zeo对照细胞系。ScreenWorks屏幕截图显示19个克隆和Neo/Zeo库(中间图，孔H4-6)的主要FLIPR数据和简化的数据表。将细胞以
4
估计5x10 细胞/孔铺于96孔测定板(TC-处理的，BD Biosciences)并在37℃/5％CO2
温育过夜。去除培养基并替换为含有1x蓝色膜电位染料的测定缓冲液并在25℃温育0.5
小时。通过记录基线荧光20秒，并记录用等容积替换的KCl(60mM[终]，柱1、2、4 和5)活化后额外的180秒在FLIPR Tetra上读取测定。柱3和6显示对正常测定缓冲液(0.5mM
KCl[终])的反应。扣除偏差设置为1且阴性对照校正设置为OFF。对于数据表，扣除偏差
设置为1且阴性对照校正(从柱3和6)设置为ON。

[1041] 结果和结论：7个Shal/KChIP克隆鉴定用于进一步测试(数据表中蓝色的行)。为了稳定反应并降低异质性，克隆18(左图，C行)最终选择用于2轮亚克隆。重要的是，
由于发现Neo/Zeo细胞系基本上对所使用的活化方法没有反应(中间图，孔H4和5)，其作
为对照细胞系的必要条件被有效消除了。

[1042] 中间亚克隆的产生：如先前所述将Shal/KChIP克隆17和18铺板进行亚克隆。总共筛选了66个亚克隆，且选择编号18-13作为最终亚克隆世代的来源(数据未显示，记录
本1050115#8)。

[1043] 最终亚克隆筛选与选择：如先前所述将Shal/KChIP亚克隆18-13铺板进行最终亚克隆化。评价了34个亚克隆对KCl去极化的反应(图16)。

[1044] 图16：Shal/KChIP最终亚克隆筛选。来自产生最终细胞系的亚克隆筛选的简4
化的FLIPR数据。将细胞以估计的5x10 细胞/孔铺于96-孔测定板(TC-处理的，BD
Biosciences)并在37℃/5％CO2温育过夜。吸出培养基并替换为含1x蓝色膜电位染料
的测定缓冲液并在25℃温育0.5小时。通过记录基线荧光20秒，并记录用等容积替换的
KCl(60mM[终])活化后额外的60秒在FLIPR Tetra上读取测定。数据输出过程中不使用
数据简化。显示了原始反应(RFU，相对荧光单位，蓝色棒)和比率化反应(菱形)。比率化反应等于原始反应除以信号测试(即，基线荧光)–这样做是为了补偿每个克隆铺板细胞
数的变化。“比率”柱中的绿色细胞指示原始/基线比值>1的克隆。通过考虑一种和/或
两种都减少(通过标线指示)来选择用于进一步评定的克隆。

[1045] 结果和结论：7个细胞系选择用于进一步在FLIPR上(数据未显示)和电生理学实验(见例如"额外的电生理学")进行评定(标记于图15)。通过常规膜片钳测试克隆
之后，决定用Shal/KChIP18-13-20继续进行实验。除 非另外指明，该细胞系，称作Shal/KChIP20(或ShIP20)，用于全部以后的HTS测定和筛选开发。

[1046] 测定和筛选开发

[1047] HTS筛选策略

[1048] 该测定使用两种液体添加以便能够在单个实验中进行激活剂和拮抗剂的检测(图17)。在筛选中，将测试化合物加入到第一个添加中并允许温育3分钟。然后将活化剂量的KCl加入第二次添加中并且额外进行3分钟荧光读数。对照同样应用这两种添加。反
应(荧光上升)显著高于在第一次添加中加入缓冲液/DMSO的反应表明化合物可能是激活
剂(绿色迹线)。第二次添加后反映降低表明化合物可能是拮抗剂(蓝色迹线)。

[1049] 图17：Shal/KChIP测定FLIPR反应图谱。来自BioFocus化合物筛选的样品对照组平均值显示第一和第二次添加测定窗口，以及有效的激活剂和拮抗剂图谱。

[1050] 基本测试方案

[1051] 使用Multidrop384分注器将细胞以50μl体积包含7,500个细胞的密度分散至384-孔TC clear/black测定板(Greiner781091)，室温温育1小时(以降低边缘效应)，并
在37℃/5％CO2温育过夜。在接种后18-24小时，即孔中的细胞即将汇合的时间点，测定
细胞。通过轻弹和轻打将培养基从板中去除，并将细胞装入20ul/孔含有1x蓝色膜电位染料的测定缓冲液中25℃30分钟。30分钟后，将测定板放置于FLIPR内并使用两种附加方
案运行。第一次添加(5x，5ul)在测定缓冲液中包含2.5％DMSO。吸液高度设置为15且速
度为20。该添加之后将平板读数3分钟。第二次添加(2x，25ul)或者为测定缓冲液或者为
120mM等体积替代的KCl(即，基于1:1的摩尔比用KCl代替NaCl)。高度设置为20且速度
为25。抽出速度设置为最低值且不应用持有或排出体积。该第二次添加后将平板额外读数
3分钟。所输出的统计数据有代表性地配置为stat1＝190-200的平均值(间隔仅仅在第
一次添加之前)且stat2＝260-所允许的最大值的最大值。扣除偏性设置为1且阴性对
照校正为OFF。利用以下公式计算Z’统计学("筛选性"的指数， Z’>0.5＝单遍筛选)：

[1052] Z’＝1-((3σmax+3σmin)/(Iμmax–μminI))。

[1053] 测定中膜电位染料的用途

[1054] Shal细胞系测定利用在活化缓冲液中添加膜电位染料以增加测定窗口的大小(数据未显示)。将KChIP添加至Shal细胞系之后，我们检测了对染料的需求是否能够降
低以便简化方案并降低用于开发和HTS的测定成本(图18)。

[1055] 图18：活化缓冲液中染料的用途。以5x104细胞/孔将Shal/KChIP(ShIP)、Shal和Neo(Shal对照)细胞系铺于96孔测定板(TC-处理的，BD Biosciences)并在37℃/5％
CO2温育过夜。吸出培养基并替换为含50ul1x蓝色膜电位的测定缓冲液并在25℃温育0.5
小时。通过记录基线荧光20秒并在添加50ul含有和不含有膜电位染料的等体积替代的
KCl(60mM[终])之后记录额外的60秒，在FLIPR Tetra对测定读数。对于数据输出，扣除
偏性设置为1。误差线为+/-1SD。

[1056] 结果和结论：从活化缓冲液中去除膜电位染料导致KCl活化之后所有三种细胞系立刻出现显著降低的荧光的变化。Shal/KChIP的Z’统计值从0.77降低为0.59，比较好的是其数值仍然在单遍筛选截断值0.5之上(数据未显示)。由于添加染料至活化缓冲液将使HTS方案复杂化，并且因为所估计的整个开发和筛选过程的可能费用节省相当大，决定以后在活化缓冲液中不使用染料。Z’统计值的减少在随后的开发过程中大量恢复。

[1057] 测定板选择

[1058] 进行一个实验以便比较我们的标准BD Falcon353962板和稍微便宜一些的Greiner781091384孔组织培养处理的测定板的测定性能(图19)。注意：Greiner是BD
Falcon板的制造商。

[1059] 图19：BD和Greiner384-孔测定板的比较：将Shal/KChIP20细胞以7500细胞/孔铺于BD和Greiner384-孔测定板并在37℃/5％CO2温育过夜。弹出培养基并替换为20ul
含有1x蓝色膜电位染料的测定缓冲液并在25℃温育0.5小时。将测定在FLIPR Tetra上
读数。第一次添加(5x， 5ul)在测定缓冲液中包含2.5％DMSO，并读数3分钟。第二次添
加(2x，25ul)包含剂量上等体积替换的KCl，并且也读数3分钟。每种条件2x48重复测量
以允许计算Z’s。输出的统计表配置为stat1＝190-200的平均值且stat2＝260-所允
许的最大值的最大值。扣除偏性设置为1。左图：窗口大小(计算为stat2-stat1)，作为两种板型的[KCl]函数。右图：计算作为两种板型的[KCl]函数的Z’统计值。

[1060] 结果和结论：当在测定中使用Greiner测定板时，在测定窗口大小中出现微弱但持续的降低(～200RFU)。然而，由于Greiner板上略低的CV值，Z’统计值几乎是相同的。由于在开发和筛选过程中估计的可能费用节省是重要的，所以决定在持续开发中使用Greiner板，并且全部后续工作都使用Greiner板进行。

[1061] 测定缓冲液制备方法测试

[1062] 虽然在早期测定开发过程的实验结果表明使用新鲜制备的测定缓冲液，这种需求最终在筛选开发过程中降低了(数据未显示)。制备方法(添加KCl、NaCl和DMSO母液至基础缓冲液)仍然使用，然而在该份文件中包含了体积代偿缓冲液制备计算值。

[1063] 细胞密度最适化

[1064] 检测了从5,000-15,000细胞/孔铺板密度的平均反应和标准差，并且计算了Z’统计值(图20)。

[1065] 图20：细胞密度优化。简化的FLIPR数据显示使用Z’统计学对于指定细胞密度时全部板的统计学。以低于5000个细胞/孔铺板在第二天时没有得到单层并且不进行测试。Shal/KChIP细胞以指定的密度铺板并在37℃/5％CO2下温育，在第二天测定。以20ul1x
染料/孔于25℃加载细胞0.5小时。使用两次添加方案。第一次添加(5x)是5ul的测定
缓冲液中的2.5％DMSO(0.5％[终])读数180秒，并且第二次添加(2x)是25ul的测定缓
冲液中的等容积取代的KCl(60mM[终])再读数180秒。使用读数190-200(最小响应)的
平均值和读数260-结束(最大响应)的最大值计算统计学。空间均一性修正为ON。柱显
示对活化的反应，并且线显示Z’统计学 中的趋势。

[1066] 结果和结论：该测定倾向在较低细胞密度时表现较佳。决定以7500细胞/孔(而不是以5000个细胞/孔，这将被标明)向前进行开发以避免因细胞计数和铺板的差异导致
的潜在问题。

[1067] 染料浓度

[1068] 使用0.4x膜电位染料(相对于1x)作为可能的节省费用的度量检查Shal/KChIP中间亚克隆18-13和18-28的表现(图21)。

[1069] 图21：染料浓度评价。Shal/KChIP克隆18-13和18-28以5x104个细胞/孔的密度铺于96孔测定板中(TC-处理的，BD Biosciences)并在37℃/5％CO2下培养过夜。去除
培养基并换成50ul1x或0.4x测定缓冲液中的蓝色膜电位染料，并且于25℃下培养0.5小
时。在FLIPR Tetra上记录基线荧光20秒并且在加入50ul等容积取代的KCl(60mM[终])
后再测定60秒来读取测定值。显示最大RFU值。对于数据输出，扣除偏好设定为1并且阴
性对照修正为ON。误差线是+/-1SD。

[1070] 结果和结论：对于所测试的两个克隆而言，以0.4x使用的染料导致测定窗口减少至使用全(1x)染料所得到的大小的70％。为了维持全部测定窗口，决定使用1x染料开展随后所有的开发。

[1071] DMSO耐受

[1072] 计算中第一次添加因素中基于细胞的测定法对DMSO的敏感性决定了从特定DMSO母液浓度筛选预期水平化合物的能力。检查了第一次添加DMSO对测定窗口和差异性以及
所产生的Z’统计学的影响(图22)。

[1073] 图22：Shal/KChIP测定窗口大小、标准差和Z’统计学。Shal/KChIP18-13细胞以7500个细胞/孔铺于Greiner384-孔测定板中并于37℃/5％CO2下培养过夜。轻弹出培
养基并换成20ul的测定缓冲液中的1x蓝色膜电位染料并于25℃下温育0.5小时。测定
在FLIPR Tetra上使用下列条件运行：包含测定缓冲液中5x[终]DMSO的第一次添加(5x，
5ul)，并且读数3分钟。第二次添加(2x，25ul)由等容积取代的KCl(120mM)构成，并且再读数3分钟。每一条件从64个重复中测量允许计算Z’s。输出统计 学设置为stat1＝
180-200的平均并且stat2＝260-380的最大值。扣除偏好设置为1并且阴性对照修正为
OFF。蓝色柱(stat2-stat1)显示对活化的反应并且红色线显示Z’统计学中的趋势。误差线是+/-1SD。

[1074] 结果和结论：虽然标准差保持相对恒定，但是除了1％DMSO[终]之外，窗口大小随着DMSO的增加而降低并且必然地发生Z’统计学中的相应降低。因为实际的原因，考虑到我们可利用化合物DMSO母液的浓度(通常2或10mM)，我们可限制细胞暴露至0.5％DMSO[终]。在该实验中，该条件得到了>2000RFU的测定窗口和0.73的Z’统计学。

[1075] 染料加载时间

[1076] 检查了进行性更长的染料加载时间对测定窗口大小、标准差和所得到的Z’统计学的影响(图23)。

[1077] 图23：染料加载时间对测定统计学的影响。过滤的全板统计学显示了0.5和3小时之间的染料加载时间对窗口大小、标准差和Z’统计学的影响。Shal/KChIP18-13细胞以
7500个细胞/孔铺于384-孔测定板中并在第二天测试。通过轻弹平板去除培养基并且细胞以20ul1x膜电位染料每孔于25℃加载0.5-3小时。使用两次添加方案。第一次添加(5x)
是5ul测定缓冲液中的2.5％DMSO(0.5％[终])读数180秒，并且第二次添加(2x)是25ul
测定缓冲液中的120mM等容积取代KCl(60mM[终])再读数180秒。使用读数190-200的
平均值(最小响应)和读数260-结束的最大值(最大响应)计算统计学。扣除偏好设置
为1并且阴性对照修正为OFF。绿色柱(stat2-stat1)显示对活化的反应，并且蓝色线显示Z’统计学中的趋势。误差线是+/-1SD。数据最低限度校正系统假象。

[1078] 结果和结论：0.5和3小时之间的染料加载时间均产生高于0.7的Z’统计学。在1.5小时时出现测定窗口最大值并在2-2.5小时出现Z’最大值。在3小时时目检细胞，显
示它们处于良好状态。结论是0.5-3小时的染料加载时间均使测定法表现良好。

[1079] 染料加载的细胞温度

[1080] 比较允许室温冷却(25℃)1小时的细胞板与直接从37℃温育加载染料 的那些板之间的染料加载温度(图24)。

[1081] 图24：在染料加载前将细胞预冷至室温的影响。Shal/KChIP(ShIP)、Shal4
和Neo(Shal对照)细胞系以5x10 细胞/孔铺于96-孔测定板中(TC-处理的，BD
Biosciences)并于37℃/5％CO2下培养过夜，用于第二天测试。去除培养基并换成50ul
的测定缓冲液中的1x蓝色膜电位染料并于25℃温育0.5小时。在FLIPR Tetra上通过记
录基线荧光20秒并在加入50ul等容积取代120mM KCl(60mM[终])再记录60秒，读取测
定值。对于数据输出，扣除偏好设置为1并且阴性对照修正为ON。误差线是+/-1SD。

[1082] 结果和结论：对于Shal/KChIP，在冷却和加热细胞之间存在统计学上可忽略的差异，对于Shal没有差异，并且响应于预冷的Neo对照系显著减少。决定随后的开发将通过已经在室温下平衡1小时的染料加载测定板进行，因为背景反应的减少(如在对照系中所见)是想得到的结果。对于预冷测定板的需求对HTS方案仅有小的负担。

[1083] 激活剂EC50

[1084] 通过等容积KCl活化确立了对于Shal/KChIP18-13的剂量反应(图25)。

[1085] 图25：组平均的原始FLIPR数据和初步的EC50。Shal/KChIP18-13细胞以7500个细胞/孔铺于384-孔测定板中并在第二天测试。通过轻弹板去除培养基并且于25℃以
20ul1x膜电位染料每孔加载细胞0.5小时。使用两次添加方案。第一次添加(5x)是5ul
测定缓冲液中的2.5％DMSO(0.5％[终])读数180秒，并且第二次添加(2x)是25ul测定
缓冲液中的等容积取代KCl剂量(0-60mM[终])再读数180秒。使用读数180-200的平均
值和读数260-所允许最大值的最大值计算统计学。扣除偏好设置为1并且阴性对照修正
为OFF。上图：简化FLIPR数据的ScreenWorks屏幕截图，显示对KCl剂量的组平均反应。
下图：非线性回归/S形剂量反应显示所计算的Hill斜率和EC50。

[1086] 结果和结论：通过增加等容积取代KCl的水平，Shal/KChIP细胞系进行性反应并对活化具有低差异性。使用该方法可达到的最高KCl浓度是 60mM[终]。在该实验中使用固定顶反应计算的EC50为30mM KCl。

[1087] MDC对Axygen FLIPR384吸头

[1088] 比较了由Molecular Devices Corporation(MDC)供应的FLIPR384吸头和Axygen Scientific供应的那些吸头(图26)。注意：Axygen是向MDC供应FLIPR384吸头的以前的供应商。在RTP中对于Axygen吸头的费用是MDC吸头费用的2/3。

[1089] 图26：MDC和Axygen FLIPR384吸头比较。GraphPad Prism散点图显示带有Shal/KChIP测定统计表的最大和最小反应。Shal/KChIP18-13细胞以7500个细胞/孔铺
于384-孔测定板中并且第二天测试。通过轻弹板去除培养基并且细胞以20ul1x膜电位染
料每孔于25℃加载细胞0.5小时。使用两次添加方案。第一次添加(5x)是5ul测定缓冲
液中的2.5％DMSO(0.5％[终])读数180秒，并且第二次添加(2x)是25ul测定缓冲液
中120mM等容积取代KCl(60mM[终])再读数180秒。使用读数180-200的平均值和读数
260-所允许最大值的最大值输出统计数字。扣除偏好设置为1并且阴性对照修正为OFF。
左图：Molecular Devices FLIPR384吸头。右图：Axygen FLIPR384吸头。

[1090] 结果和结论：使用MDC或Axygen吸头的Shal/KChIP测定的表现是相同的。由于通过计算在测定法开发和HTS整个过程中节省的费用相当可观，所以所有以后的方案使用Axygen Scientific FLIPR384吸头。

[1091] 测定缓冲液和其它试剂的稳定性

[1092] 对在Shal/KChIP测定法中所用的试剂的稳定性作了评价，即第一次添加测定缓冲液/DMSO，重构染料和活化缓冲液(图27)。

[1093] 图27：试剂稳定性。Shal/KChIP18-13细胞以7500个细胞/孔铺于384-孔测定板中并且第二天测试。通过轻弹板去除培养基并且细胞以20ul1x膜电位染料每孔于25℃
加载细胞0.5小时。使用两次添加方案。第一次添加(5x)是5ul测定缓冲液中的2.5％
DMSO(0.5％[终])读数180秒，并且第二次添加(2x)是25ul的测定缓冲液中的120mM等
容积取代的KCl(60mM[终])再读数180秒。使用读数180-200的平均值和读数260-所允
许最大值 的最大值输出统计数字。扣除偏好设置为1并且阴性对照修正为OFF。对于每
一实验，Shal/KChIP测定的所有试剂在先前前一天(染料除外)、工作日早些时候和新鲜制备。使用先前制备和新鲜制备的试剂在时间点0、4和8小时和过夜(O/N)开展测定。

[1094] 结果和结论：在一天过程中，Shal/KChIP测定的表现仅表现出较小的波动。结论是试剂在至少一整天内是稳定的。随后，发现测定和活化缓冲液在至少一周的过程中是稳定的(数据未显示)。

[1095] FLIPR Tetra吸液优化

[1096] 开展许多实验(数据未显示)检查吸液高度、速度和保持和排出体积的变化对测定统计学的影响(表2)。

[1097] 结果和结论：下表显示一致性得出最佳结果的设置，如通过Z’统计学所测量:

[1098]

[1099] 表2：吸液优化。一贯导致0.5或更佳Z’统计学的第一次和第二次添加吸液吸头高度、速度和排出体积。使用基本的测试方案确定参数。注意：在吸取过程中不使用保持体积并且分配时不暂停或混合。

[1100] 3-天最小/中点/最大反应

[1101] 在5天过程中三次检查Shal/KChIP20细胞的反应稳定性以评价在筛选中期望的差异性(图28)。

[1102] 图28：三天最小、中点和最大统计学。GraphPad Prism散点图显示带有所得到的窗口、CV和Z’统计学的三天的一式两份半板测定数据。Shal/KChIP20细胞以7500个细胞/孔铺于384-孔测定板中并且第二天测试。通过轻弹板去除培养基并且细胞以20ul1x膜电位染料每孔于25℃加 载0.5+小时。使用两次添加方案。第一次添加(5x)是5ul测定缓
冲液中的2.5％DMSO(0.5％[终])读数180秒，并且第二次添加(2x)是25ul测定缓冲液
中的60mM(左半板)或120mM(右半板)等容积取代KCl(分别是30和60mM[终])再读数
180秒。使用读数180-200的平均值和读数260-所允许最大值的最大值输出统计学。扣除
偏好设置为1并且阴性对照修正为OFF。统计学如下汇总：左半板最小n001stat1&右半板
最小n002stat1；左半板中点n001stat2&左半板中点n002stat2；右半板最大n001stat2&
右半板最大n002stat2。对于系统假象最低限度校正数据。

[1103] 结果和结论：该测定在整个5天过程中表现良好，最大值Z’统计范围为0.73至0.80，平均为0.77，并且标准差为0.03。注意：还开展了三天单一的全板(3个板/天)实
验，得到良好结果(数据未显示)。测定在6天的整个过程中表现良好最大值Z’统计学范
围为0.69至0.74，平均值为0.72，并且标准差为0.03。综合在一起，该测定将预期在整个筛选过程中表现良好。

[1104] 3-天激活剂量反应曲线和EC50

[1105] 在6天中三次测量Shal/KChIP20对等容积取代的KCl剂量法的反应稳定性(图29)。

[1106] 图29：三天KCl剂量反应曲线和EC50。Shal/KChIP20细胞以7500个细胞/孔铺于384-孔测定板中并且第二天测试。通过轻弹板去除培养基并且细胞以20ul1x膜电位染
料每孔于25℃加载0.5小时。使用两次添加方案。第一次添加(5x)是5ul测定缓冲液中
的2.5％DMSO(0.5％[终])读数180秒，并且第二次添加是25ul测定缓冲液中2x等容积
取代的KCl剂量(0-60mM[终])再读数180秒。使用读数180-200的平均值和读数260-所
允许最大值的最大值输出统计学。扣除偏好设置为1并且阴性对照修正为OFF。分析非线
性回归、S形剂量反应、顶常数。数据来自对于每一剂量具有48份的单个板。

[1107] 结果和结论：在3天中，测定对KCl剂量法相当一致的反应，EC50范围为32至42mM KCl，平均值为36mM，并且标准差为5mM。

[1108] 3-天拮抗剂剂量反应曲线和IC50

[1109] 使用25uM的在BIOMOL化合物筛选中鉴定的假定的Shal/KChIP拮抗剂阿米洛利产生在连续3天中的一式两份剂量反应(图30)。

[1110] 图30：三天阿米洛利剂量反应。Shal/KChIP20细胞以7500个细胞/孔铺于384-孔测定板中并且第二天测试。通过轻弹板去除培养基并且以20ul1x膜电位染料每孔于25℃加载细胞0.5小时。使用两次添加方案。第一次添加(5x)是5ul测定缓冲液中的2.5％
DMSO(0.5％[终])读数180秒，并且第二次添加是25ul测定缓冲液中2x等容积取代KCl
剂量(0-60mM[终])再读数180秒。使用读数180-200的平均值和读数260-所允许最大
值的最大值输出统计学。扣除偏好设置为1并且阴性对照修正为OFF。分析非线性回归，S形剂量反应。将数据拟合外推至55mM KCl的点以补偿如见到的抑制近似100％的第一次添加假象。数据来自每一天的一式两份板，对于每一剂量具有48份/板。

[1111] 结果和结论：在连续3天内测定一贯地被阿米洛利抑制，IC50范围为20至29uM阿米洛利，平均值为24uM，标准差为3uM。结论是该化合物作为HTS抑制对照将合理地预期表现良好。

[1112] 直接至板测定

[1113] 开展实验以测定将细胞从液氮储存中直接铺于测定板中而不进行任何介入的细胞培养的可行性(图31)。

[1114] 图31：直接至板测定。将冷冻的Shal/KChIP20细胞(2ml x106/ml)解冻，加入至4
82ml完全培养基中，并且铺于384-孔板中的50ul体积中(1.2x10 细胞/孔)以便在第二
天测试。通过轻弹板去除培养基并且以20ul1x膜电位染料每孔于25℃加载细胞0.5小时。
使用两次添加方案。第一次添加(5x)是5ul测定缓冲液中的2.5％DMSO(0.5％[终])读
数180秒，并且第二次添加是25ul测定缓冲液中的60mM或120mM等容积取代的KCl(分别
是30mM或60mM[终])再读数180秒。使用读数180-200的平均值和读数260-所允许最
大值的最大值输出统计学。扣除偏好设置为1并且阴性对照修正为OFF。

[1115] 该策略在前导开发部分广泛采用并且常常降低测定差异性、显著节省时间和降低劳动成本。

[1116] 结果和结论：当直接从液氮储存中铺板时，Shal/KChI测定反应良好。从最大响应得到的Z’是0.73。虽然该策略在当前不采用，但是将考虑在以后的筛选开发中使用。

[1117] BIOMOL化合物筛选

[1118] 包含涵盖主要离子通道类型的71个激活剂和抑制剂的离子通道配体文库(BIOMOL#2805)，在384-孔四点模式中以25uM两次针对Shal/KChIP20活性测定(图32和
33)。

[1119] 图32：BIOMOL化合物–原始筛选数据。ScreenWork屏幕截图显示对于BIOMOL化合物筛选的原始FLIPR数据。Shal/KChIP20细胞以7500个细胞/孔铺于384-孔测定板中
并且在第二天筛选。通过轻弹板去除培养基并且以20ul1x膜电位染料每孔于25℃加载细
胞0.5小时。使用两次添加方案。第一次添加是5ul测定缓冲液2.5％DMSO中的5x对照
或化合物(0.5％[终])读数180秒，并且第二次添加是25ul测定缓冲液中的2x对照或
120mM等容积取代的KCl(0-60mM[终])再读数180秒。使用读数180-200的平均值和读数
260-所允许最大值的最大值输出统计学。扣除偏好设置为1并且阴性对照修正为OFF。对
照栏1/2和23/24从该文件第53页开始描述。插图：对于对照和在最初数据筛选显示中突
出显示的化合物的组平均值的屏幕截图。

[1120] 图33：BIOMOL化合物–简化的筛选数据。测定平板图显示Shal/KChIP对BIOMOL化合物反应的抑制百分数。实验条件描述于前图图例中。

[1121] 结果和结论：使用55％抑制的任意截断值，三个化合物表现出对Shal/KChIP反应的重现性抑制活性。阿米洛利(B8)是已知的钙通道封闭剂。已知NS-1619(E7)和氟灭酸(F6)均刺激KCa2+通道活性。这些化合物不可能是Shal的直接抑制剂，并且膜片钳测量将此排除(数据未显示)。为了筛选的目的，证明阿米洛利在该作用中是一致的，并且因此用于随后的 BIOMOL和BioFocus验证筛选，并推荐用于HTS。

[1122] BioFocus化合物筛选

[1123] 图34：用于BioFocus筛选的化合物制备方案。在FLIPR Tetra上开展化合物制备。2mM的文库平板在测定缓冲液中以40x稀释并且分散在384-孔筛选的象限中。

[1124] 在组合的激活剂和拮抗剂筛选中，BioFocus SoftFocus离子通道文库#1-4(#SF101-04)的3222个独特成员，在384-孔四点模式中针对10uMShal/KChIP筛选。
与FLIPR方案相同的方案用于BIOMOL筛选并且在非连续的4天中开展。使用下列化合物
制备方案制备筛选平板:简言之，Shal-KChIP细胞以7500个细胞/孔接种于384-孔板中
的50μl中并且于37℃/5％CO2下培养过夜。第二天去除培养基，加入20μl的1x FMP染
料并将细胞平板于27℃温育30分钟。温育之后，将细胞平板置于Tetra中并且使用两次添加方案。第一次添加是5μl的5x化合物(50μM)读数3分钟。如果化合物在第一次添加
中显示有反应，将其其标记为激活剂。第二次添加是25μl的2x活化缓冲液(120mM的代
替NaCl的等容积KCl)并且再读数2分钟。KCl反应的抑制表明化合物是拮抗剂。所有数
据输出为统计学文件。对于第一次添加，使用来自读数190–200的平均值，并且对于第二次添加使用来自260-所允许最大值的最大值。

[1125] 通过下列公式计算活化和抑制百分数并且所有结果基于对照计算:

[1126] ％活化(第一次添加统计值)＝(测试样品–μminA)/(μmaxA–μminA)x100

[1127] 其中μmaxA＝平均的100％活化，并且μminA＝平均的0％活化。

[1128] ％抑制(第二次添加统计值)＝(μminI–测试样品)/(μminI–μmaxI)x100

[1129] 其中μmaxI＝平均的100％抑制，并且μminI＝平均的0％抑制。

[1130] 对于活化和抑制的Z’统计学使用下式计算:

[1131] Z’＝1-((3σmax+3σmin)/(Iμmax–μminI))

[1132] BioFocus 离子通道集中文库#1-4：1°筛选激活剂命中数

[1133] 相对于对照的活性百分数绘制成BioFocus离子通道文库激活剂筛选的柱形图(图35)。

[1134] 图35：Shal/KChIP FLIPR BioFocus1°筛选–活化。在Shal/KChIP上的活性分布。

[1135] 活性基于化合物集合的平均值和标准差(阴性对照和异常值，例如荧光的化合物)。由于平均值和标准差如此低，我们选择使用12％活化的6σ截断值选择化合物用于
追踪观察。如表3中所示，没有化合物显示超过12％的6σ截断值的活化。

[1136]Shal-KChIP活化
总化合物 3222
数据集的平均值 -0.3
数据集的SD 1.98
6σ 12％
总活性物 0
％命中率 0.00％

[1137] 表3：Shal/KChIP活化的总结。总结表显示来自Shal/KChIP激活剂筛选的结果。

[1138] BioFocus 离子通道集中文库#1-4：1°筛选拮抗剂命中数

[1139] 相对于对照的活性百分数绘制成BioFocus离子通道文库拮抗剂筛选的柱形图。活性基于化合物集合的平均值和标准差计算(阴性对照和异常值，例如荧光的化合物)。拮抗剂活性的分布显示正态分布；然而，其集中于10-15％的抑制，这在先前使用该化合物集合已经看到。我们选择使用29％抑制的3σ截断值用于选择化合物用于追踪(表4)。由
于在FLIPR筛选中一式四份测试化合物并且在10μM时没有显示强抑制，并且由于可利用
的化合物的数量有限，在FLIPR上未开展IC50。对于命中的拮抗剂的所有追踪均在QPatch上开展。表I详细描述具有>/＝29％抑制的拮抗剂活性物。

[1140]Shal-KChIP拮抗剂
总化合物 3222
数据集的平均值 5.9
数据集的SD 8.5
3-σ 29％
总活性物 53
％命中率 1.60％

[1141] 表4：Shal/KChIP抑制总结。总结表显示来自Shal/KChIP抑制剂筛选的结果。

[1142] Shal/KChIP细胞系的分子验证

[1143] 开展实验评价掺入Shal/KChIP稳定细胞系内的Shal和KChIP编码序列的完整性(表A1)。所采用的策略是从Shal/KChIP20和对照细胞系分离基因组DNA(gDNA)并且使
用这些DNA作为模板用于信息性PCR(聚合酶链式反应)。选择扩增引物以产生跨Shal和
KChIP编码区5’和3’端的产物。选择额外的引物以验证每一编码区的总长度。

[1144]

[1145]

[1146]循环参数 末端 全长
起始变性 94 2’ 94 2’
变性 94 30” 94 30”
递降退火 10x65,55；20x45 30” 10x65,55；20x50 30”
延伸 72 30” 72 30”
最终延伸 72 5’ 72 5’
保持 4结束 4结束

[1147] 表A1：在Shal/KChIP细胞系的分子验证中使用的引物对和PCR参数总结。跨Shal和KChIP的5’和3’末端以及全长编码序列产生PCR产物。标出了引物名称、靶区域、Tm(退火温度)和预期的片段大小。如在50ul反应设置中所描述制备Shal/KChIP 20 gDNA。循环参数包括改良的“递降”方案以减少非特异性产物的产生，并且被设计成适应不同预期的最佳退火温度。

[1148] 结果和结论：除了反应#3产生大约300bp(图35A，第3道)的较小产物外，所有反应得到正确的预期大小的单一产物(图35A)。该产物在扩增对照细胞系gDNA时也产生
(数据未显示)并且推测是所使用特定引物对的假象。总之，使用该类型的分子检查，Shal和KChIP的编码序列是完整的。

[1149] 图35A：来自表A1中所述反应的PCR产物。每一泳道包含20ul的每种50ul扩增反应，在1％琼脂糖凝胶上电泳并用溴化乙锭染色。M1：BenchTop1kb DNA序列梯(Promega)，M2：BenchTop PCR标准(Promega)，1：Shal5’端(180bp)，2：Shal3’端(1.1kb)，3：Shal全长(2.1kb)，4：KChIP5’端(1.4kb)，5：KChIP3’端(260bp)，6：KChIP全长(1.3kb)。

[1150] 下列实例与shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基有关:

[1151] 分子克隆和载体作图

[1152] 我们开始使用的pTriEx/Shaker质粒包含位于5’额外N末端氨基酸(MAISR)上游的Kozak序列。为了克隆Shaker全长cDNA进入不同的表达载体中，开展下列策略:

[1153] o500bp5’-片段扩增：已经设计两个寡核苷酸以扩增Shaker ATG密码子以及正确的Kozak序列而不带有额外的5’末端氨基酸。

[1154] 寡核苷酸SH-UPP，5’-CCGGTACCATGGCCGCCGTTGCC-3’

[1155] 寡核苷酸SH-LOW，5’-CCGGTCTCCGTAGTCGGCCACC-3’

[1156] KpnI限制位点以粗体表示；Kozak序列粗体加下划线表示；Shaker退火序列加下划线表示。

[1157] SH-LOW寡核苷酸位于Shaker序列上独特的Sall限制位点的下游。

[1158] PCR片段已经克隆入pCR-Blunt载体中并且序列已经经过验证。

[1159] pCR-Blunt/5’-PCR克隆已经用KpnI(在SH-UPP寡核苷酸中)和SalI(在Shaker序列中)消化并且纯化400bp的5’-片段。

[1160] o1770bp3’-片段克隆：pTriEx/Shaker质粒以SalI和EcoRI限制酶消化并纯化1770bp片段。

[1161] o Shaker wt通过pcDNA3.1(+)载体克隆入pExSelect和pIRES2EGFP表达载体中：如上所述得到的400bp KpnI-SalI5’-片段和1770bpSalI-EcoRI3’-片段已经克隆入pcDNA3.1(+)载体中。该构建体的NheI-EcoRI Shaker片段被切下，然后克隆入先前已经用NheI和EcoRI消化的pExSelect和pIRES2EGFP中。

[1162] 最终pExSelect_Shaker构建体的VectorNTi图谱示于图36中。

[1163] 细胞培养条件和转染

[1164] CHO-K1细胞维持于补充有1.6mM丙酮酸钠(100mM溶液，Euroclone目录号ECM0542D)、13mM Hepes(1M溶液，Euroclone目录号ECM0180D)、0.2％碳酸氢钠(7,5％溶液，Euroclone目录号ECM0980D)、2mM Ultraglutamine(BioWhittaker目录号BE17-605E/U1)、10％FBS(胎牛血清，Euroclone目录号ECS0180L)和1％青霉素/链霉素(100x溶液
Euroclone目录号B3001D)的Dulbecco’s MEM/Nutrient Mix F12(1:1)(DME-F12Euroclone目录号ECM0090L)中。

[1165] 繁殖条件包括每周两次接种大约6X105个细胞/T75烧瓶。回收大约10-13x106细胞/T75烧瓶。

[1166] 通过在10μg DNA存在下以300mV和950μF对1.0x106个细胞进行电穿孔开展转染。然后使用包含2mg/ml G418或1mg/ml Zeocin的培养基选择细胞10-15天。在
抗生素选择之后，抗性克隆维持于1mg/ml G418(Calbiochem目录号345812)或0.5mg/ml
Zeocin(InvivoGen目录号ant-zn-5)培养基中。

[1167] 对于FLIPR实验，所有细胞系置于不含抗生素的完全培养基中。

[1168] 通过FLIPR的细胞膜电压测量

[1169] 为了检测由KCl注射所引起的膜去极化，膜电位敏感性染料用于FLIPR384和FLIPRTETRA实验。通过在实验前24小时以5000、7500、10000个细胞/孔接种于384透明
底黑色MPT(MATRIX目录号4324)中分析细胞。平板与40μl/w的0.625x膜电位染料于
37℃或室温温育45-60分钟，并且在FLIPR仪器上通过注射10μl/w的5x拮抗剂(在0.5％
DMSO存在下，如所指出)并荧光读数3-5分钟，接着开展第二次注射25μl/w的标准Tyrode溶液中的3x KCl并在此测量荧光3-4分钟来测量。在单次注射(激动剂)的实验中，板与
20μl/w的1x染料温育并注射20μl/w的标准Tyrode溶液中的2x KCl。

[1170] 从不同细胞重复得到的动力学数据用FLIPR、Excel和Spotfire软件通过计算注射后积分或最大-最小RFU值，分析所得到的平均值和标准差 用于通过
GraphPad 或Spotfire软件产生S形剂量-反应拟合并计算EC50-IC50值和Z’
因子。

[1171] EC80值根据下式计算:

[1172] ECx＝(x/100-x)1/Hill斜率*EC50

[1173] 为了计算Z’因子，使用下式:

[1174] 3*(ST.DEV激动剂+ST.DEV Tyrode

[1175] Z’＝1–---------------------------------------------

[1176] MEAN激动剂–MEAN Tyrode

[1177] 通过膜片钳的电流测定

[1178] 电生理记录

[1179] 在室温开展标准的全细胞电压钳实验。为了进行数据采集和进一步的分析，我们使用EPC10数字控制放大器和PATCHMASTER软件(HEKA Electronics，Lambrect，Germany)组合。EPC10通过预脉冲方式提供电容和漏泄电流的自动扣除。数据以66.7KHz(-3dB，8-极Bessel低通滤波器)过滤并且以每个点5μs数字化。膜片吸管的输入电阻是2.0-4.0MΩ并且细胞的电容是15.3±2.1pF(n＝45)；残留系列电阻(在高达80％补偿之后)是
4.2±0.4MΩ。

[1180] 对于液体接头电位常规应用校正。膜电位在-100mV下固定并且通过从-60mV至+100mV(或+60mV)的50ms去极化脉冲(0.1Hz)引出电流。

[1181] 细胞培养

[1182] 对于电生理学实验，以上述的标准方案处理CHO-K1/DmShaker细胞并维持培养。实验前24小时(或者在第二次有限稀释测试中4至6小时)，CHO-K1/DmShaker细胞接种
在聚D-赖氨酸包被的玻璃上(每个玻璃200000个细胞)并且置于六孔板的无抗生素培养
基中。在即将实验前，带有所接种细胞的经包被玻璃用膜片钳细胞外液洗涤5次然后置于记录室中。

[1183] 溶液

[1184] 电极溶液包含(mM)：KMeSO3128、HEPES10、EGTA12、MgCl23、CaCl20.7、K2ATP5、用KOH调节至pH7.2。

[1185] 槽溶液包含(mM)：NaCl145、KCl5、MgCl21、CaCl22、HEPES10、葡萄糖10、用NaOH调节至pH7.4。

[1186] 配体保存

[1187] ·DMSO(二甲基亚砜SIGMA目录号D-5879)购自

[1188] ·KCl购自 并且在水中制备3M母液。

[1189] ·TEA购自 并且在水中制备1M的母液。

[1190] 工作溶液在标准Tyrode缓冲液(pH7.4)中制备:

[1191] NaCl130mM、KCl5mM、CaCl2-2H2O2mM、MgCl21mM、NaHCO35mM、HEPES20mM。

[1192] 软件

[1193] 数 据 使 用 Excel、GraphPad Prism4、FLIPR384Control Software、ScreenWorks1.2.0分析。

[1194] 稳定细胞系产生

[1195] CHO-K1细胞已经稳定转染有pExSelect_Shaker或仅pExSelect载体(作为模拟物对照)。转染后48小时，将细胞培养于添加2mg/ml G418的完全培养基中以选择抗性细
胞群。

[1196] 抗生素抗性的DmShaker转染细胞(未经FACS筛选的)进一步以来自BASF的H-kvβ亚基A或B亚型载体转染，并且在48小时后细胞用1mg/ml Zeocin选择。

[1197] 第一次有限稀释克隆选择

[1198] 为了得到纯的Shaker和H-kvβ克隆，通过将稳定的模拟物或Shaker转染的混合细胞在96孔板中以1个细胞/孔的细胞密度稀释开展第一次有限稀释步骤(对于每一亚
基，5x96孔板模拟物和5x96孔板Shaker加H-kvβ)。汇合的克隆重复加入透明底384孔
板中并在24小时后通过注射100mM KCl在FLIPR384上分析。如图37中所示，模拟物克隆
显示当注射KCl时超极化而一些Shaker和HkvβA和C两者的克隆表现出KCl反应，记录
为持续的去极化，如图38中所示。

[1199] 图37.在FLIPR384上的模拟物I有限稀释平板选择：一个板的实例

[1200] 图38.在FLIPR384上的Shaker+HkvβA或C亚基I有限稀释克隆选择

[1201] 使用激活剂注射后总积分的RFU值分析数据。在该数据分析基础上，两个模拟物克隆和六个克隆，每一个来自Shaker加A或B亚型两者，被选择用于在所计数细胞实验中再次测试：以10000个细胞/孔铺板并在24小时后在FLIPR384上开展KCl剂量-反应。
所得到的最佳克隆示于图39。

[1202] 图39.I有限稀释克隆作为计数的细胞在FLIPR384上再测试

[1203] 方案：10000个细胞/孔-24h；MEM丢弃；根据所述的步骤与40μl蓝色MP染料于37℃下温育45’；在FLIPR384上20μl/孔注射KCl(3xTyrode溶液)。

[1204] 培养中和冻/融后不同传代次数的克隆稳定性

[1205] 已经选择A-3A10作为最佳反应克隆并且维持培养大于2个月。A-3A10在FLIPR384上分析不同细胞传代和冻/融后的KCl反应稳定性，如图40和41中所示。

[1206] 图40.不同细胞传代次数的A-3A10信号稳定性：10000个细胞/孔-24h；MEM丢弃；依照所描述的步骤于37℃与40μl的蓝色MP染料温育45’；10μl/孔0.5％DMSO注
射作为5x tyrode溶液；3’后，FLIPR384上(3x tyrode溶液)以1.5、3.7、7.5、15、30、60、
90、120mM进行25μl/孔的KCl注射。

[1207] 图41.在冻融后A-3A10信号稳定性：10000个细胞/孔-24h；MEM丢弃；依照所描述的步骤于37℃与40μl的蓝色MP染料温育45’；10μl/孔0.5％DMSO注射5x Tyrode
溶液；3’后，在FLIPR384上(3x Tyrode溶液)以1.5、3.7、7.5、15、30、60、90、120mM进行
25μl/孔的KCl注射。

[1208] TEA对A-3A10克隆的影响

[1209] 通过FLIPR384预注射30、60或90mM TEA时的KCl刺激分析TEA对A-3A10克隆的影响。如图42中所示，特别是在30mM KCl刺激时可见到TEA的封闭影响。

[1210] 图42.TEA对A-3A10克隆的影响：10000个细胞/孔-24h；MEM丢弃；依照所描述的步骤于37℃与40μl的蓝色MP染料温育45’；在30、60或 90mM TEA5x Tyrode溶液存在下10μl/孔0.5％DMSO注射；3’后，在FLIPR384上(3x Tyrode溶液)以1.5、3.7、7.5、
15、30、60、90、120mM进行25μl/孔的KCl注射。

[1211] KCl高渗或等渗溶液分析

[1212] 分析KCl高渗或等渗溶液对A-3A10克隆的影响。通过加入所需要体积的KCl母液从标准Tyrode缓冲液(135mM NaCl+KCl)开始制备高渗溶液(标准方案)。等渗溶液从
“Tyrode碱”(0M NaCl+KCl)开始制备并且保持NaCl+KCl盐浓度在135mM。如图43中所示，当使用两种溶液时，没有观察到所测试克隆的应答中存在差异，如RFU和动力学形状。因此所有验证实验在标准Tyrode中开展。

[1213] 图43.高渗和等渗溶液分析：10000个细胞/孔-24h；MEM丢弃；依照所描述的步骤于37℃与40μl的蓝色MP染料温育45’；10μl/孔0.5％DMSO inj.5x tyrode溶液；3’后，在FLIPR384上(3x Tyrode溶液)以1.5、3.7、7.5、15、30、60、90、120mM进行25μl/孔的KCl注射。

[1214] 第二次有限稀释克隆选择

[1215] 在第二次有限稀释中将Shaker/H-kvβA亚基最佳克隆A-3A10以1个细胞/孔的细胞密度置于3x96孔板中。挑取30个克隆并生长用于测试。十个克隆作为计数的细胞使
用标准加载和实验方案首先测试。最佳克隆的KCl反应示于图44中。

[1216] 图44.在FLIPR384上的A-3A10II有限稀释克隆选择

[1217] 最佳克隆实例：10000个细胞/孔-24h；MEM丢弃；依照所描述的步骤于37℃与40μl的蓝色MP染料温育45’；10μl/孔0.5％DMSO注射5x Tyrode溶液；3’后，在
FLIPR384上(3x Tyrode溶液)以1.5、3.7、7.5、15、30、60、90、120mM进行25μl/孔的KCl注射。

[1218] 选择第1和9号两个克隆作为最佳反应克隆用于在FLIPRTETRA上进一步分析。在实验前24小时以10000、7500、5000和2500个细胞/孔铺板并开展KCl剂量-反应分析。
所得到的数据示于图45。

[1219] 图45.在FLIPRTETRA上分析的第1和9号II有限稀释克隆：10000 个细胞/孔-24h；MEM丢弃；依照所描述的步骤于37℃与40μl的蓝色MP染料温育45’；10μl/孔
0.5％DMSO注射5x Tyrode溶液；3’后，在FLIPR384上(3x Tyrode溶液)以1.5、3.7、7.5、
15、30、60、90、120mM进行25μl/孔的KCl注射。

[1220] 最终克隆优化

[1221] 选择Shaker的第一号克隆用于进一步表征和最终的克隆优化。

[1222] 细胞密度依赖性

[1223] 在实验前24小时将Shaker第1号克隆以10000、7500和5000个细胞/孔接种以测定最佳细胞密度。实验当天，在FLIPRTETRA分析KCl剂量-反应并计算EC50。结果示于
图46中。

[1224] 图46.细胞密度依赖性，KCl剂量-反应：10000、7500、5000个细胞/孔-24h；MEM丢弃；依照所描述的步骤于室温与40μl的蓝色MP染料温育45’；10μl/孔Tyrode注射；3’后，在FLIPR384上(3x Tyrode溶液)以1.5、3.7、7.5、15、30、60、90、120mM进行25μl/孔的KCl注射。

[1225] 为了描绘曲线，考虑了KCl注射后的最大-最小值。

[1226] DMSO敏感性

[1227] 为了测定DMSO是否引起对激动剂反应的任何影响，将第1号克隆以10000、7500或5000个细胞/孔的细胞密度铺板，并在24小时后通过0.5-1-1.5-3％DMSO的仪器预注
射后注射KCl剂量-反应在FLIPRTETRA上分析。

[1228] 如图47-48-49中所示，直到1.5％的DMSO浓度对KCl反应没有显著影响；3％DMSO引起KCl依赖反应的降低。

[1229] 图47DMSO敏感性：10000个细胞/孔-24h；MEM丢弃；依照所描述的步骤于室温与40μl的蓝色MP染料温育45’；10μl/孔0.5、1、1.5、3％DMSO注射5x Tyrode溶液；3’后，在FLIPRTETRA上(3x Tyrode溶液)以1.5、3.7、7.5、15、30、60、90、120mM进行25μl/孔的KCl注射。

[1230] 为了描绘曲线，考虑了KCl注射后的最大-最小值。

[1231] 图48DMSO敏感性：7500个细胞/孔-24h；MEM丢弃；依照所描述 的步骤于室温与40μl的蓝色MP染料温育45’；10μl/孔0.5、1、1.5、3％DMSO注射5x Tyrode溶液；3’后，在FLIPRTETRA上(3x Tyrode溶液)以1.5、3.7、7.5、15、30、60、90、120mM进行25μl/孔的KCl注射。

[1232] 为了描绘曲线，考虑了KCl注射后的最大-最小值。

[1233] 图49DMSO敏感性：5000个细胞/孔-24h；MEM丢弃；依照所描述的步骤于室温与40μl的蓝色MP染料温育45’；10μl/孔0.5、1、1.5、3％DMSO注射5x Tyrode溶液；3’后，在FLIPRTETRA上(3x Tyrode溶液)以1.5、3.7、7.5、15、30、60、90、120mM进行25μl/孔的KCl注射。

[1234] 为了描绘曲线，考虑了KCl注射后的最大-最小值。

[1235] 冻/融后的克隆稳定性

[1236] 在培养(第6次传代)和冻/融后分析第一号克隆：将细胞以10000、7500或5000个细胞/孔的细胞密度铺板，并在0.5％DMSO存在下注射KCl剂量-反应24小时后在
FLIPRTETRA上分析。

[1237] 结果示于图50。

[1238] 图50培养中和冻/融后的克隆稳定性：10000、7500、5000个细胞/孔-24h；MEM丢弃；依照所描述的步骤于室温与40μl的蓝色MP染料温育45’；10μl/孔0.5％DMSO注
射5x Tyrode溶液；3’后，在FLIPRTETRA上(3x Tyrode溶液)以1.5、3.7、7.5、15、30、60、
90、120mM进行25μl/孔的KCl注射。

[1239] 为了描绘曲线，考虑了KCl注射后的最大-最小值。

[1240] 在单独三天时的EC50稳定性

[1241] 为了验证整个实验的不同天内KCl反应的稳定性，在单独的三天通过注射KCl剂量反应在FLIPR384上测试最终的克隆，如图51中所示。

[1242] 图51.在3个不同天数中的EC50再现性

[1243] 方案：10000个细胞/孔-24h；MEM丢弃；依照所描述的步骤于37℃与40μl的蓝色MP染料温育30’；在FLIPR384上以10μl/孔Tyrode0.5％DMSO注射；读数2’；在
FLIPR384(3x Tyrode溶液)上以25μl/孔的KCl注射。图中的数值指KCl注射后的最大
值-最小值。

[1244] 膜片钳分析

[1245] 来自第一次有限稀释的两个最佳克隆通过全细胞膜片钳技术测试。如所示(图52a和b)，高达+100mV的去极化脉冲的应用引起带有典型快速活化和快速失活特征的
Dm-Shaker电流。在一些实验中，存在TTX敏感性内向电流，如图52b中所示。

[1246] 对于每一克隆，开展6次实验并且得到极有希望的结果：100％的克隆3a10细胞显示具有56.3±36pA/pF的平均电流密度(在+60mV时)的Dm-Shaker电流特征，而5个细胞显示有钾流，对于克隆4d1平均电流密度为13.4±18pA/pF。

[1247] 因为从Dm-Shaker A-亚型克隆得到了最佳电生理学结果，因此决定仅对以Shaker通道加H-kvβA亚基转染的细胞进行有限稀释。与此同时，3a10克隆的活性每两个星期常规检查一次；此外还检查了细胞解冻后的克隆表达稳定性。

[1248] 在图53中，我们可以看到，直至+60mV(b)或直至+100mV(a和c)的去极化脉冲引起Dm-Shaker活化。具体而言，当细胞维持培养长达5至6周时(图53a)和细胞解冻后
(图53c)，功能性的通道表达稳定性仍然非常高。在该实验中，分别有83.3％和100％的细胞表现出Dm-Shaker电流(n＝6和7)。

[1249] 在亚培养克隆3a10至少2个月后(传代17-20次)，通道的表达降低并且细胞显示Dm-Shaker电流为50％(n＝8)。为了取得关于Dm-Shaker活性的电压依赖性的动力学
信息，绘制了I-V关系(图54)。通过测量峰电流并将归一化的数值针对膜电位作图构建
I-V图(n＝8±SD)。

[1250] 来自第二次有限稀释的克隆1然后用于电生理学分析并且针对所选择的克隆也测试了两种化合物。两种化合物影响Dm-Shaker活性。

[1251] 筛选方案

[1252] 在最终采用的用于筛选的测定法中，对方案进行若干修改。这些改变中最重要的是:

[1253] ·用于染料加载的自动化步骤的实现

[1254] ·50mM KCl：用于筛选的最终浓度(活化缓冲液的1:3稀释)

[1255] ·自动化方法

[1256] 其中活化缓冲液如下制备:

[1257] 150mM KCl、2mM CaCl2*2H2O、1mM MgCl2、5mM NaHCO3、20mM HEPES、pH7.4

[1258] 活化缓冲液的组成代表着在渗透性方面与生理条件尽可能接近的溶液。这是为什么决定开展筛选适应性改变和使用该缓冲液代替标准tyrode的全部筛选的原因。

[1259] 用于筛选的最终FLIPR方案

[1260] 最终的FLIPR方案具有该设置:

[1261] ·来源板1：化合物稀释板

[1262] ·来源板2：激活剂板

[1263] ·读数位置：测定板

[1264] ·来源板3/吸头：未使用(吸头盒)

[1265] ·滤光片：激发：510-545；发射：565-625

[1266] ·读数设置(典型的)：获得60.期望时间0.6；激发60

[1267] ·洗涤缓冲液A：水

[1268] ·洗涤缓冲液B：含2.5％DMSO的水

[1269] 方案(其在上面以图表方式显示)包括三个步骤:

[1270] ·混合化合物稀释板

[1271] ·从化合物稀释板向测定板转移10μL

[1272] ·开始读数3.0分钟

[1273] ·在30秒之后，混合测定孔

[1274] ·洗涤吸头(同时读数)

[1275] ·从激活剂板向测定板转移25μL，立即混合

[1276] ·读数4.0分钟

[1277] ·洗涤吸头(同时读数)

[1278] 相对于手工操作而言，自动化操作中板的物理过程中仅有的实质变化 是染料加载。在手工操作中，这通过首先通过“轻弹”使液体进入槽中而将培养基倒出孔外，然后将染料等分于孔中实现。

[1279] 在自动化操作中，染料加载通过我们的筛选系统的自动化384-孔移液器实现。为了移出培养基而不扰动细胞单层，我们开展吸取/分配缓冲液/吸取循环以实现细胞的“洗涤”。实际上，我们的吸液操作导致孔中残留5％的培养基与染料在一起。最终的染料加载步骤涉及去除洗涤缓冲液，孔中留下10μL，然后加入30μL的0.666X染料，最终是40μL的0.5X染料。我们发现这产生与手工排空孔相比相同(甚至更好的)的测定表现。

[1280] 为了运行自动化操作，计算优化的方案以使板通量最大化。对于许多板的优化方案的实例示于图54。该预定过程的通量是每13分钟一个板。这允许我们每天处理50-60个板。

[1281] 自动化调度方法概述

[1282] 所给出的步骤代表着单个实验处理。调度系统照顾到交错的多重测定以便优化通量(见图86)。

[1283]

[1284] 下列实例与G蛋白偶联受体有关:

[1285] 取决于受体同种型，酚乙醇胺受体可通过环AMP产生或细胞内钙释放调节它们的作用。虽然Oa2内源性地通过cAMP发信号，我们可通过将受体转染入表达泛宿主性
G-α-16-蛋白质的细胞系中强制偶联至钙，当其活化 时导致钙释放。钙释放通过荧光的钙传感染料(在本例中是Fluo-4)测量(图55A)。

[1286] 细胞生物学

[1287] 细胞系构建

[1288] 产生OctR-pcDNA3.1(+)_zeo表达载体。该构建体用作产生荧光标记的pcDNA3.1-OctR-GFP质粒的模板。使用大引物策略将pAcGFP序列插入到未标记的OctR表达载体中。该策略的第一步是使用PCR从pAcGFP-N1-Asc1质粒产生基因片段，使用对pAcGFP载体特异的引物，具有对OctR-pcDNA3.1载体特异的约20个碱基对的额外的突出端。

[1289] 在该步骤中所使用的引物是6919-For(5’ctgcatcccctgtacaccaacggcgcgcccatggtgagcaag3’)和6919-Rev2(5’ggatatctgcagaattcgcccttcacttgtacagctcatccatgc3’)。然后从琼脂糖凝胶纯化该771碱基对的基因片段，测定浓度，并且125ng的纯化PCR产物
用作大引物用于第二次PCR反应，使用OctR-pcDNA3.1(+)_neo表达载体作为模板并使用
QuickChange XL位点定向诱变试剂盒方案。该PCR反应产生pcDNA3.1-OctR-pAcGFP，它是CG6919dmOa2酚乙醇胺受体序列，具有连接至基因C末端的AcGFP序列。对构建体的编码区测序以证实双链序列的完整性(图55B)。

[1290] 在共表达G-α-16的哺乳动物CHO细胞中的瞬时表达

[1291] 未标记和GFP标记的天然偶联至cAMP的OctR在CHO细胞中瞬时表达，所述细胞稳定表达通过钙传导信号的G-α-16泛宿主性G蛋白质。这使得受体的活性可通过钙传感
荧光染料测量。

[1292] 在图55A中，将不同量的未标记OctR-pcDNA3.1DNA转染入CHO细胞中(6孔皿，300,000个细胞/孔)并且在48小时时在Discovery显微镜上使用Fluo-4染料测试功
能。下面所示的图代表着来自表达cyan载体的细胞的所有单细胞读数的平均值。假设表
达cyan载体的大多数细胞也表达OctR。该实验证明，OctR-pcDNA3.1表达载体是完全功
能性的，OctR受体将偶联至G-α16，并且当添加最大剂量的酚乙醇胺时大量的测定窗口存 在上面对照转染的细胞。此外，证明OctR对CHO细胞没有毒性，并且DNA量增加则产生更
大的表达和更大的信号。

[1293] 在图55B中，显示了使用GFP标记的OctR表达载体的相似实验。再次，实验证明构建体是完全功能性的并且测定法能够测量特别响应于酚乙醇胺刺激的钙释放。图55C显示，酚乙醇胺受体也被酪胺活化。未开展剂量曲线和竞争研究，但是初步的数据和公布的报导表明，与酚乙醇胺相比，酪胺对OctR的有效性仅稍差并且具有相似的潜能。

[1294] 图55.在稳定表达G-α-16和瞬时表达增加量的未标记或GFP标记OctR-pcDNA3.1的CHO细胞中，对酚乙醇胺或酪胺刺激的钙传感Fluo-4荧光染料反应。以
作为转染细胞标志的pAmCyan载体共转染的细胞以最大剂量的酚乙醇胺或亚最大剂量的
酪胺刺激。在上面图中显示了在Discovery显微镜上测量到的单细胞反应的孔平均值。

[1295] 共表达G-α-16的哺乳动物CHO细胞的稳定细胞系产生

[1296] 产生稳定共表达pcDNA3(+)-OctR-AcGFP和G-α-16A的CHO细胞系。稳定表达G(16构建体的CHO细胞(传代20次)以1.5ug的pcDNA3(+)-OctR-AcGFP瞬时转染，这是
在图55中测定的DNA的最佳量。转染后48小时，细胞(已经在4ug/ml潮霉素选择下维
持)经历Zeocin选择(300ug/ml)。细胞在选择下生长和传代3周，然后在Duke大学完成
单细胞流式细胞术荧光分选以产生单克隆的稳定细胞系。图56显示细胞分选前刚完成的
实验，证明约10％的稳定混合群体对酚乙醇胺响应。在分选时，G-α-16CHO细胞系处于第
22次传代。

[1297] 图56。在Zeocin选择三周之后，存在稳定的Zeocin抗性混合CHO-G-α-16细胞。大约10％的稳定混合细胞以可测量水平对酚乙醇胺响应。该混合细胞随后分选得到单细胞的单克隆集落。

[1298] 单克隆集落可通过肉眼评价绿色荧光蛋白的表达并且因此推断出融合的OctR受体的表达。将绿色荧光蛋白表达阳性的集落扩大并测试对酚乙醇胺的反应。

[1299] 在FLIPR Tetra上测试了对绿色荧光蛋白表达阳性的大约30个单克 隆细胞系对酚乙醇胺的反应(图57)。所有克隆经作为阳性对照的UTP、两种剂量的酚乙醇胺和作为阴性对照的缓冲液刺激并测量最大的钙反应。细胞以20,000个细胞/孔的细胞密度接种。在大约30个细胞系中，仅2个克隆细胞系(13号和30号)表明对酚乙醇胺有可测量的反应
(图58)。选择该两个细胞系用于进一步测试。

[1300] 图57.对酚乙醇胺反应的所有GFP阳性单克隆细胞系的筛选。所有细胞系对阳性对照(10μM UTP)反应，对阴性对照(添加缓冲液)不反应，但仅13号和30号克隆对最大
剂量的酚乙醇胺具有可测量的反应。

[1301] 图58。在FLIPR Tetra上13号和30号克隆的反应。在每一图中，顶部的两个细胞系对最大剂量的UTP反应，以下降的次序接着是10uM酚乙醇胺、50nM酚乙醇胺和缓冲液对照。

[1302] 稳定细胞系13号和30号显示对酚乙醇胺的最佳反应

[1303] 在评价了大约30个GFP阳性单克隆细胞系之后，选择13号和30号克隆用于进一步的分析，这是因为它们对酚乙醇胺具有可测量的反应。通过评价对酚乙醇胺的单细胞反应，测试了这些克隆细胞系中每一个的均一性。使用Fura-2荧光染料在钙成像系统上评价
13号克隆，并且使用Fluo-4荧光染料在Discovery显微镜上检查30号克隆。图59显示这
些测试的结果。如通过它们对酚乙醇胺的反应所示，两个克隆均表现出完全包含表达OctR的细胞。然而，显著的描述存在于强效应器和弱效应器之间。这是因为细胞与细胞之间受体表达或G16表达水平的差异。这些实验在流式分选成单克隆细胞系后传代第7次后开展。

[1304] 图59.13号和30号克隆对酚乙醇胺的单细胞反应。通过Fura-2荧光染料在钙成像系统上评价13号克隆(A)，并且在Discovery显微镜上通过Fluo-4荧光染料评价30号
克隆(B)。

[1305] 由于在FLIPR中随着时间的推移信号减弱，所以对13号和30号两个细胞系开展进一步的亚克隆。在Duke大学完成单细胞的荧光流式细胞术分选以产生共表达OctR-GFP
和G(16的进一步亚克隆的单克隆稳定细胞系。将具有中或高表达绿色荧光蛋白(并且通
过推断融合的OctR)的单细胞 分选在96孔皿中并置于潮霉素和Zeocin选择之下。

[1306] 稳定细胞系产生和克隆选择

[1307] 来自最初30号克隆细胞系的超过50个亚克隆在FLIPR上评价数周以寻找高于基线的最大酚乙醇胺反应。由于克隆55在FLIPR中具有良好的动力学范围(图60：OCTR克
隆55选择)并且在Discovery显微镜中具有超过82％同质性(图61：OCTR克隆55的同
质性)，所以选择克隆55用于进一步的测定法开发。

[1308] 图60.OCTR克隆55选择。OCTR克隆以20000个细胞/孔铺于黑色96孔板中并在第二天测定。去除培养基并于25℃以每孔50ul的2μM含丙磺舒的Fluo-4加载细胞1小
时。去除染料并且加入50μl的含丙磺舒的缓冲液。在Tetra中开展单次添加。将50μL
缓冲液或(2X)200μM酚乙醇胺加入至细胞中，而10μM UTP用作最大细胞内钙信号的对
照。

[1309] 图61.OCTR克隆55的同质性。OCTR细胞以6000个细胞/孔铺于黑色96孔板中并于第二天测定。去除培养基并于25℃以每孔50ul Fluo-4加载细胞1小时。去除染料并
加入50μl含丙磺舒的缓冲液。加入50μl的10μM酚乙醇胺或缓冲液并使用Discovery
显微镜记录信号。在上图中显示在Discovery显微镜上测量的单细胞反应的孔平均值。

[1310] 药理学

[1311] 基于cAMP读数评价克隆55的正确药理学并与所公布结果比较。如在图62A和B中所示，激动剂和拮抗剂显示与所公布数据具有相同级别的潜能，在所公布数据中对于激动剂而言，萘甲唑啉>酚乙醇胺>阿米曲士>可乐定>妥拉唑啉(Evans P，等.2005.
Invertebrate Neuroscience5：111-118)。在图62C中，这些相同的化合物对亲本细胞系没有效果，表明配体对酚乙醇胺受体的特异性。

[1312] 图62.细胞以10000个细胞/孔铺于384孔板中并于37℃下培养过夜。在接种8-24小时后测定细胞。去除培养基并以2μM Fluo-4的染料加载细胞60分钟。1小时后，
去除染料并向板中加入20μl缓冲液并置于FLIPR中。第一次添加是拮抗剂剂量反应曲线
并且第二次添加是激动剂剂量反应 曲线。拮抗剂以100nM酚乙醇胺攻击。此外，在亲本细胞系CHO-Gα16中测试这些化合物。

[1313] 测定法开发

[1314] HTS筛选策略

[1315] 该测定使用两次流体添加以允许在单一实验中检测激活剂和抑制剂。在筛选中，测试化合物将在第一次添加中加入并温育3分钟。然后在第二次添加中以EC80浓度引入激活剂酚乙醇胺并且荧光读数2分钟。对于两次添加均运行对照。在第一次添加中荧光高于基线的增加将表明是可能的激活剂并且在第二次添加中降低反应或无增加将表明是可
能的抑制剂。图55C。

[1316] 基础测试方案

[1317] 细胞以10,000个细胞/孔铺于384-孔黑色TC板的50μl中并于37℃/5％CO2下培养过夜。在接种18-24小时后测定细胞。通过轻弹去除培养基并且以20ul的测定缓
冲液中的2μM Fluo-4加丙磺舒的染料于25℃加载细胞60分钟。1小时后通过轻弹去除
染料并加入20μL的测定缓冲液，等待5分钟然后置于FLIPR中并使用两次添加方案运行。
第一次添加(20ul，2x)是测定缓冲液中终浓度0.5％的DMSO。第二次添加(20ul，3x)是测定缓冲液或终浓度100nM的酚乙醇胺。

[1318] 细胞铺板方法

[1319] 开展实验以检查手工相对于multidrop向测定板中的细胞加入(数据未显示)。数据表明，multidrop铺板相对于手工铺板更具有再现性。当使用multidrop铺细胞时需
要记住两个关键点:

[1320] 1.在细胞铺板过程中需要细胞维持在悬浮状态。我们使用旋转板或者连接固定器的旋转混合器，其中我们可以放置500ml的包含细胞的圆锥形底的管。

[1321] 2.不要将细胞留在板之间的multidrop管道中。细胞留在管道中将导致数据的条纹模式。如果细胞留在管道中，你需要将管道排空并重新预充(reprime)。

[1322] DMSO耐受研究

[1323] 在第一次和第二次添加中开展完全的酚乙醇胺剂量反应曲线以测试该测定法对不同浓度DMSO的灵敏性。如图63A中所示，在2％DMSO(终浓度)下酚乙醇胺的EC50显著
移动。对于第二次添加(图63B)，大于0.67％的最终DMSO浓度显示EC50显著移动。对于
该测定法，我们将在第一次添加中使用0.5％DMSO的终浓度并在第二次添加中使用0.33％的终浓度，这将对酚乙醇胺EC50具有最小的影响。

[1324] 图63：在第一次和第二次添加中不同DMSO浓度的酚乙醇胺EC50曲线。OctR细胞以10000个细胞/孔铺板并于第二天测定。去除培养基并以每孔20ul的2μM Fluo-4加丙
磺舒于25℃加载细胞1小时。1小时后，去除染料并向板中加入20μl的缓冲液加丙磺舒
并置于Tetra中。使用两次添加方案。第一次添加(2x)是20ul指定百分比的DMSO+酚乙
醇胺DRC(图63A)或20ul的测定缓冲液中指定百分比的DMSO(图63B)，然后读数180秒。
对于图63B，第二次添加(2x)是20μl的酚乙醇胺DRC并再读数180秒。使用读数20-180
的最大值(第一次添加)和读数200-360的最大值(第二次添加)计算统计学。

[1325] 细胞密度优化

[1326] 检查每孔7000、10000和14000个细胞的铺板密度的差异性和Z’统计学并且数据示于图64中。所测试的所有密度产生极佳的Z’统计学。基于低差异性和费用减少决定使用10000个细胞/孔继续开发。

[1327] 图64：细胞密度优化。FLIPR数据显示了对于所指定密度的全部板的最大和最小统计学以及所得到的CV和Z’统计学。低于4000个细胞/孔铺板在第二天没有得到汇合的单层并且没有测试。OCTR细胞通过手工以适当的密度铺板并在第二天测定。去除培养基并以20ul/孔的2μM Fluo-4加丙磺舒加载细胞并于25℃温育1小时。1小时后，去除染
料并加入20μl/孔的缓冲液加丙磺舒并置于Tetra中。使用两次添加方案。第一次添加
(2x)是20ul的测定缓冲液中1％DMSO(0.5％[终])读数180秒，并且第二次添加(3x)是
20ul的测定缓冲液中的300nM酚乙醇胺(100nM[终])再读数180 秒。使用读数20-180
的最大值(最小响应)和读数200-360的最大值(最大响应)计算统计学。

[1328] 染料浓度

[1329] 在 图65 中 显 示 了 比 较 以 1μM、2μM和 4μM Fluo-4染 料 (笔 记 本1052125#1p.102)加载细胞1小时的反应的实验。所测试的所有浓度的Fluo-4产生可接受
的窗口大小和Z’统计学。基于良好的动力学范围和花费的显著降低决定用2μM Fluo-4
向前开发。

[1330] 图65：染料浓度。最大统计学显示染料浓度对窗口大小的影响。OCTR细胞以10000个细胞/孔铺板并于第二天测定。去除培养基并且细胞以每孔20ul的1μM、2μM或4μMFluo-4于25℃加载1小时。1小时后，去除染料并向板中加入20μl的缓冲液并置于Tetra
中。使用两次添加方案。第一次添加(2x)是20ul的测定缓冲液中的1％DMSO(0.5％[终])
读数180秒，并且第二次添加(3x)是20ul的测定缓冲液中的300nM酚乙醇胺(100nM[终])
再读数180秒。使用读数20-180的最大值(最小响应)和读数200-360的最大值(最大
响应)计算统计学。(未显示对于1μM Fluo-4的Z’＝0.73，2μM Fluo-4的Z’＝0.70，
和4μM Fluo-4的Z’＝0.80)

[1331] 染料加载时间

[1332] 在图66中检查了染料加载时间对差异性和Z’统计学的影响。此外，我们比较了MDC吸头和Axygen Tetra吸头。结果显示，1.0和3.0小时之间的染料加载时间对EC50、窗口大小没有显著影响，因此对Z’统计学没有影响。在MDC或Axygen吸头之间没有差异。

[1333] 图66：染料加载时间。OctR细胞加载1小时、2小时和3小时以确定酚乙醇胺EC50是否随着染料加载时间的增加而移动。此外，我们比较了相同量时间内的MDC吸头与Axygen吸头。OctR细胞以10000个细胞/孔铺板并在第二天测定。去除培养基并且细胞
以每孔20ul的2μM Fluo-4/丙磺舒于25℃加载。在1、2和3小时后，去除染料并向板中
加入20μl的缓冲液并置于Tetra中。使用两次添加方案。第一次添加(2x)是20ul的测
定缓冲液中的DMSO(0.5％终浓度)读数180秒，并且第二次添加(3x)是 20μl的测定缓
冲液中的给定剂量的酚乙醇胺再读数180秒。使用读数20-180的最大值(最小响应)和
读数200-360的最大值(最大响应)计算统计学。

[1334] 染料加载温度

[1335] OctR细胞于室温加载良好，因此没有检查37℃。

[1336] 测定缓冲液pH优化

[1337] 在整个测定法开发中使用pH7.4的标准HBSS缓冲液。

[1338] 测定缓冲液的稳定性

[1339] 测试于4℃储存的测定缓冲液一周(数据未显示)，表现无显著差异。

[1340] 酚乙醇胺的稳定性

[1341] 比较测试新鲜稀释的酚乙醇胺和24小时溶液的酚乙醇胺(数据未显示)。使用于室温储存24小时的溶液得到的反应与使用新鲜稀释溶液得到结果相同。我们使用重复冻
融的4℃10mM酚乙醇胺的DMSO母液没有减少活性。

[1342] 吸液管洗涤和酚乙醇胺携带评价

[1343] 为了降低筛选费用，开展吸头洗涤实验以评价从吸头去除酚乙醇胺的能力，以致于吸头可以多次使用。酚乙醇胺极其粘稠并容易地在吸头上携带下一板上。评估下列DMSO洗涤方案:

[1344] 4循环次数的2次吸放@28μL的2.5％DMSO中

[1345] 混合的10次吸放@25μL的100％DMSO

[1346] 1循环次数的2次吸放@28μL的2.5％DMSO

[1347] 1循环次数的2次吸放@28μL的水

[1348] 基于图67A和B所示数据，DMSO洗涤方案没有消除吸头上的酚乙醇胺并且导致显著携带进入第二块板中(图67B)。此外，应该注意的是，测定长度增加至超过11分钟，这明显影响了每天可运行的板的数量(笔记本1052125#1p124)。也测试了丙酮一次并且极好地消除携带(数据未显示)，但是由于闪点低，在Tetra仪器中使用丙酮是危险的。对于该筛选，吸头将在板之间更换。

[1349] 图67：吸头洗涤评价。FLIPR数据显示了所有板的最大和最小统计学，具有所得到的CV和Z’统计学。OCTR细胞以10000个细胞/孔铺板并于第二天测定。去除培养基并且细胞以每孔20ul的2μM Fluo-4加丙磺舒于25℃加载1小时。1小时后，去除染料并向
板中加入20μ的缓冲液加丙磺舒并置于Tetra中。使用两次添加洗涤方案。第一次添加
(2x)是20ul的测定缓冲液中的1％DMSO(0.5％[终])读数180秒，并且第二次添加(3x)
是20ul的测定缓冲液中的300nM酚乙醇胺(100nM[终])再读数180秒。使用读数20-180
的最大值(最小响应)和读数200-360的最大值(最大响应)计算统计学。

[1350] 3-天差异性评价

[1351] 在不同的3天开展3个独立的测定以验证筛选过程中使用的激动剂(酚乙醇胺)或拮抗剂(米安色林)适宜的浓度，和验证测定的板间和板内差异。在每一天，对于每一条件运行一式两份板。测定方案如下：OctR细胞以10000个细胞/孔铺于50μl培养基中并于
37℃/5％CO2下培养18-24小时，然后在Tetra中运行。在测定当天，细胞以2μl Fluo-4
的染料于25℃加载1小时，去除染料，向板中加入20μl的缓冲液，在室温温育5分钟，然后在Tetra中运行。

[1352] 对于3天的差异性评价，使用下列浓度的激动剂和拮抗剂:

[1353] 100％激动剂＝100nM(第1天)和1μM(第2和3天)

[1354] 80％激动剂＝40nM(第1天)和100nM(第2和3天)

[1355] 50％激动剂＝5nM(所有天)

[1356] 50％拮抗剂＝40nM(所有天)

[1357] 时间段:

[1358] 读数1＝20-180max stat

[1359] 读数2＝200-360max stat

[1360] 1)缓冲液+50％激动剂+100％激动剂。下列散点图显示3天的一式两份板以便验证测定法鉴定激动剂的能力。在第2和3天达到50％剂量的酚乙醇胺。

[1361] 2)缓冲液+80％激动剂+100％激动剂。下列散点图显示3天的一式两份板以便验证将在第二次添加中使用的80％剂量的酚乙醇胺。如所示，在所有的三天达到80％的剂量。

[1362] 3)缓冲液+50％拮抗剂+80％激动剂。下列散点图显示3天的一式两份板以便验证测定法鉴定拮抗剂的能力。不幸的是，对于所有的三天使用了不正确剂量的米安色林；然而，在20-板的DMSO测试运行过程中得到了正确剂量(图69B)。

[1363] 3-天激动剂和拮抗剂剂量反应曲线

[1364] 在单独的三天运行酚乙醇胺和米安色林剂量反应曲线以分析整个时间中的EC50移动。在图68A和B中的数据显示，对于酚乙醇胺的EC50和对于米安色林的IC50在整个
三天中具有极好的再现性。

[1365] 图68.OCTR细胞以10000个细胞/孔铺板并在第二天测定。去除培养基并且细胞以每孔20ul的2μM Fluo-4加丙磺舒于25℃加载1小时。1小时后，去除染料并向板中加
入20μl的缓冲液加丙磺舒并置于Tetra中。使用两次添加洗涤方案。第一次添加(2x)
是20ul的测定缓冲液中的给定剂量的DMSO或米安色林，读数180秒，并且第二次添加(3x)是20μl的给定剂量的酚乙醇胺(图55A)或100nM终浓度的酚乙醇胺(图55B)并再读数
180秒。使用读数20-180的最大值(最小响应)和读数200-360的最大值(最大响应)计
算统计学。

[1366] 20-板DMSO测试运行

[1367] 开展20板的DMSO测试运行以测试下列:

[1368] 化合物稀释方案(30页)

[1369] 对于20-板运行的试剂制备体积(SOP30-31页)

[1370] 运行动力学：时限，仪器问题等。

[1371] 表5显示对于所有20个板的Z’。所有板具有可接受的Z’，除了板6之外，其具有multidrop吸液误差，导致在板中加入了不定体积的液体。板2在第一次添加(活化)中具有一个对照孔，其是低的。从计算中去除那个点导致Z’活化＝0.60。

[1372] 表5

[1373]平板 Z’活化 Z’抑制
平板01 0.60 0.79
平板02 0.47 0.65
平板03 0.60 0.59
平板04 0.64 0.81
平板05 0.59 0.72
平板06 0.20 0.29
平板07 0.70 0.79
平板08 0.66 0.76
平板09 0.65 0.68
平板10 0.68 0.69
平板11 0.57 0.70
平板12 0.64 0.74
平板13 0.61 0.72
平板14 0.71 0.76
平板15 0.63 0.74
平板16 0.63 0.74
平板17 0.64 0.76
平板18 0.60 0.73
平板19 0.66 0.78
平板20 0.53 0.78

[1374] 图69A是第7号板的散点图，显示对于筛选的激动剂部分的对照和测试孔。绿色正方形是100％(1μM)酚乙醇胺对照，蓝色正方形是0％或缓冲液对照，并且黑色菱形是测试样品，在该例中为0.5％终浓度的DMSO。

[1375] 图69B是第7号板的散点图，显示对于筛选的拮抗剂部分的对照和测 试孔。绿色正方形是80％(100nM)酚乙醇胺对照，蓝色正方形是0％或缓冲液对照，并且黑色菱形是测试样品，在该例中为100nM酚乙醇胺+0.33％终浓度DMSO。具有比绿色正方形更大数值的蓝色菱形是100％剂量的酚乙醇胺(1μM)。这些孔未用于数据计算，但是包括于测定中以验证80％剂量的酚乙醇胺。具有比绿色正方形更低数值的黑色菱形是来自第一次添加的
100％对照，其随着时间而降低。它们不包括在任何数据计算中。红色正方形是50％的拮抗剂对照(267nM米安色林)并包括在内以保证细胞适当地响应。

[1376] 数据计算

[1377] 通过下式计算％活化和％抑制:

[1378] ％活化＝((测试样品–平均的0％活化)/(平均的100％活化–平均的0％活化))x100

[1379] ％抑制＝((测试样品–平均的0％抑制)/(平均的80％抑制–平均的0％抑制))x100

[1380] 对于活化的Z’统计学使用下式计算

[1381] 1–((3x平均的STDEV最小+3x平均的STDEV最大)/(abs平均的100％-平均的0％))

[1382] 其中最小＝0％活化并且最大＝100％活化

[1383] 对于活化的Z’统计学使用下式计算:

[1384] 1–((3x平均的STDEV最小+3x平均的STDEV最大)/(abs平均的80％-平均的0％))

[1385] 其中最小＝0％活化并且最大＝80％活化

[1386] HTS SOP

[1387] 1)材料

[1388]基本的培养基类型 销售商 目录号
Ham‘s F-12 Mediatech 010-080-cv
FBS Hyclone Sh30071.02
胰蛋白酶-EDTA(高浓度) Mediatech 15400-054
潮霉素(每50ml瓶) Calbiochem 400052
Zeocin(每1g-10ml-8管/盒) Invitrogen 46-0509
Pen/Strep(P/S/抗真菌的) Mediatech bw17602e
PBS Mediatech bw17512q

处理的组织培养消耗品(塑料的) 销售商 目录号
烧瓶(T175) Nunc 159910
板(黑色/透明，384孔) bd falcon 353962
化合物板 NUNC 264573
Tetra吸头 axygen

[1389]

[1390] 测定缓冲液(HBSS):

[1391] 20mM Hepes；11.1mM葡萄糖；1.8mM CaCl2；1mM MgCl2；125mM NaCl；2.5mM KCl；5mM丙磺舒；pH至7.4Osm290

[1392] 为制备1L HBSS，加入20ml1M Hepes、11.1ml1M葡萄糖、1.8ml1M CaCl2、31.25ml4M NaCl、1ml1M MgCl2和0.83ml3M KC至935ml dH2O中。用NaOH调至pH7.4。于4℃下储存。

[1393] 丙磺舒:

[1394] MW＝285.4；ICN Biomedical(156370)

[1395] 加入14.2g粉末至100ml1M NaOH中＝500mM

[1396] 加入10ml500mM母液至1L HBSS中并用HCL调至pH7.4。在室温下保存。

[1397] Fluo-4AM:

[1398] MW＝1096.95；Molecular Probes(F-14202)

[1399] 加入912μl100％DMSO至1mg小瓶＝1mM母液

[1400] 20％Pluronic F-127:

[1401] MW～12500；Invitrogen(P3000MP)

[1402] DMSO中20％溶液

[1403] 酚乙醇胺:

[1404] MW＝189.64；Sigma(O-0250)

[1405] 在100％DMSO中制备10mM母液

[1406] 米安色林:

[1407] MW＝300.8；Sigma(M-2525)

[1408] 在100％DMSO中制备10mM母液

[1409] 2)细胞培养

[1410] A)细胞培养方案

[1411] 该测定使用一种细胞系：OCTR克隆55

[1412] 完全培养基：在生物安全厨/层流通风厨中制备。

[1413] 1.500ml Dulbecco's Modified Eagle’s Medium/Ham’s Nutrient Mixture F-12。

[1414] 2.加入50ml ml胎牛血清。

[1415] 3.加入5ml青霉素-链霉素溶液。

[1416] 4.加入2.2ml潮霉素

[1417] 5.加入1.5ml Zeocin

[1418] 6.经0.2um滤膜过滤除菌并储存于4℃。

[1419] 冷冻细胞的解冻：在星期一早上开始解冻细胞最佳，以致于可以在整个周中监测细胞生长和调整数量。下面所列的细胞数可以仅看作是大致的指导，因为细胞可以在你的培养基中以不同速率生长。

[1420] 1.从液氮罐中取出小瓶并且立即置于37℃水浴并轻轻振荡以快速解冻细胞。使O环和帽不接触水以减少污染的可能性。

[1421] 2.当内容物完全解冻后，从水浴中取出小瓶，颠倒混合，并通过以70％乙醇喷雾消毒。从该点开始的所有操作在无菌条件下开展。

[1422] 3.转移1ml解冻的细胞悬液至包含30ml完全培养基的50ml的圆锥形 底离心管中。

[1423] 4.在150g下离心细胞5-7分钟。

[1424] 5.离心后，通过吸取去除培养基并将沉淀块悬浮于5ml完全培养基中。

[1425] 6.转移5ml重悬的细胞至包含25ml完全培养基的25cm2烧瓶中。

[1426] 7.在第二天早晨检查培养烧瓶并且分传扩大培养或者替换培养基以进一步生长。

[1427] B)细胞传代培养/收获方案

[1428] 1.从培养箱中取出烧瓶。

[1429] 2.在通风厨内从烧瓶中无菌性抽吸旧培养基。

[1430] 3.每一烧瓶中加入5-10ml PBS

[1431] 4.用PBS短暂清洗烧瓶

[1432] 5.抽出PBS

[1433] 6.加入3-5ml RT胰蛋白酶。

[1434] 7.短暂地将胰蛋白酶溅泼细胞。

[1435] 8.抽出胰蛋白酶。

[1436] 9.使细胞脱壁3分钟并且轻打烧瓶使细胞松散。

[1437] 10.向烧瓶中加入8ml培养基。

[1438] 11.用移液管上下吹吸几次以打散任何团块并且将细胞从烧瓶底部洗下来。使烧瓶竖立直到下面的步骤完成。

[1439] 12.如果收获多个烧瓶，那么将来自所有烧瓶的细胞混合到一个烧瓶中并充分混合。

[1440] 13.从烧瓶中取出20ul细胞悬浮液并置于管中用于计数。

[1441] 14.前进至下面的步骤C。

[1442] C)开展细胞和生存力计数/接种烧瓶和板:

[1443] 1.在收获细胞后，通过在锥虫蓝和PBS中以1：1稀释，即20μl细胞悬液+20μl0.4％锥虫蓝溶液，制备细胞用于计数。

[1444] 注意：锥虫蓝可作为0.4％溶液得到并且以0.02％-0.04％的工作浓度使 用，但是在0.2％时工作良好。在用锥虫蓝染色之后，在3分钟内计数细胞；在该时间之后活细胞开始摄取染料。

[1445] 2.使用吸液器，吸取小量的染色细胞悬液并将吸液器的吸头置于带有盖玻片的清洁的血球计数器的槽上。细胞悬液将通过毛细作用在盖玻片下通过。充满对面的室。不要过满。细胞分布在两个室中将是均匀的。

[1446] 3.将血球计数器置于显微镜的载物台上并观察由三条线所限定的四个大的角正方形中的一个。活细胞为稍稍的乳白色、圆形和苍白色并具有较暗的轮廓。非活细胞将是暗的，不透明蓝色。

[1447] 4.计数四个正方形中的活细胞。计数与正方形外边重叠的细胞但不计数与正方形内边重叠的细胞。计算每一正方形中活细胞的平均数(在四个正方形中的活细胞总数除以4)。

[1448] 5.记录来自两个室的细胞计数。如果计数差别大于20％，则制备第三个样品以验证计数。

[1449] 6.使用下式计算活细胞数:

[1450] 活细胞数/ml＝活细胞的平均数x104x稀释因子

[1451] ％生存力＝计数的活细胞数/总的细胞数x100

[1452] 对于接种的烧瓶，计算所需要的细胞/ml悬浮液和体积的细胞。

[1453] 例如，

[1454] ·使用2.5e6个细胞/ml的细胞悬液以8.5e6个细胞/烧瓶接种10个烧瓶。

[1455] ·向每一烧瓶中吸取25ml完全培养基。

[1456] ·计算需要加入至每一烧瓶的细胞悬液的体积。

[1457] ·8.5e6/2.5e6＝向每一烧瓶中加入3.4ml细胞。

[1458] ·将细胞吸取到每一烧瓶中。

[1459] ·轻轻旋转烧瓶至以细胞和培养基均匀覆盖烧瓶。

[1460] ·将烧瓶置于37℃/5％CO2培养箱中。

[1461] ·下表显示对于T175烧瓶的接种方案和密度。

[1462] 对于20板/天，4天/周的细胞培养方案

[1463]

[1464] 分传方案

[1465] 过夜 10e6c/f

[1466] 第二天 8.5e6c/f在第二天需要重新喂饲的细胞即RF Th

[1467] 第三天 5e6c/f

[1468] 第四天 2-2.5e6c/f

[1469] 对于接种板，计算每板需要的细胞数。

[1470] 例如,

[1471] ·使用2.5e6细胞/ml的细胞悬液以10000个细胞/孔接种20个板。

[1472] ·计算你将需要的细胞悬液体积。

[1473] ·10,000个细胞/孔x384孔/板＝3.84e6个细胞/板

[1474] ·3.84e6个细胞/板x23个板＝总共8.832e7个细胞

[1475] ·(注意：计算使用23个板以致于对于multidrop存在死体积)

[1476] ·总共8.83e7个细胞/2.5e6个细胞/ml＝35.3ml细胞悬液

[1477] ·计算将会将细胞悬浮液加入的总体积:

[1478] ·50μl/孔x384孔/板＝19.2ml/板

[1479] ·19.2ml/板x23个板＝总数442ml

[1480] ·向35.3ml细胞混悬液中加入406.3ml培养基。

[1481] ·充分混匀并取出一个样品计数。

[1482] ·细胞计数应该是5e5个细胞/ml或2.5e4个细胞/50μl

[1483] ·使用multidrop将细胞分散于板中:

[1484] ○将multidrop头部置于分配器中

[1485] ○用50ml70％EtOH漂洗头部

[1486] ○用70ml无菌PBS漂洗

[1487] ○将500ml圆锥形底管中的细胞悬液置于旋转混合台上并将multidrop管道置于细胞悬液中。

[1488] ○将细胞悬液吸入头中。

[1489] ○以50μl/孔加入每一板中。保证加入时细胞悬浮并且细胞不留在管道中。这两种情况均导致数据差错。

[1490] ○将板于室温单层放置至少30分钟，然后置于37℃/5％CO2培养箱中。

[1491] ○确保板在培养箱中为单层。

[1492] ○通过用70ml的70％EtOH冲洗然后用70ml的dH2O冲洗来清洁multidrop管道。

[1493] 3)HTS20板筛选测定法

[1494] A)测定前一天:

[1495] ○从烧瓶收获细胞。以10000个细胞/孔，50μl/孔接种20个384孔板。将板室温放置至少30分钟以减少边缘效应(细节见29页)。

[1496] ○在37℃/5％CO2下培养过夜(16-24小时，叠加不超过1个板的高度)。

[1497] B)测定当天:

[1498] 1.制备Tripos读数1:

[1499] ○将45μL2mM母液板置于Tetra上的来源位置#1

[1500] ○将在3-22列含45μl HBSS(无DMSO)的新384-孔板置于来源位置#2

[1501] ○将在3-22列含90μl HBSS(无DMSO)的新384-孔板置于读数位置

[1502] o运行Tripos化合物稀释控制文件

[1503] 或,

[1504] 1.制备Divpick读数1:

[1505] o使用multidrop，向包含5μl化合物的母液板中加入45μl HBSS，最终母液为200μM。

[1506] o将50μL 200μM母液板置于Tetra的来源位置#2

[1507] o将在3-22列中含90μl HBSS(无DMSO)的新384-孔板置于读数位置

[1508] o运行Divpick化合物稀释控制文件(见图88)

[1509]

[1510]

[1511] 2.制备读数板1对照。

[1512] ○通过向75ml HBSS中加入750μl100％DMSO制备HBSS1％DMSO缓冲液。向下图中的读数1板的正确孔中加入60μl。

[1513] ○通过向2μM(2X)浓度的25ml HBSS中加入5μL10mM母液制备100％酚乙醇胺。向下图中的读数1板的正确孔中加入60μl。

[1514] o通过向800nM(2X)浓度的6.25ml HBSS中加入50μL 100μM母液制备50％米安色林。向下图(图89)中的根据读数1板的正确孔中加入60μl。

[1515]

[1516] 3.制备读数2板

[1517] ○通过向300nM(3X)浓度的550ml HBSS中加入165μL1mM母液制备80％酚乙醇胺。向下图中的读数2板的合适孔中加入60μl。

[1518] ○通过向3μM(3X)浓度的12.5ml HBSS中加入37.5μL1mM母液制备100％酚乙醇胺。向下图中的读数2板的正确孔中加入60μl。

[1519] o向下图(图90)中的读数2板的正确孔中加入60μl HBSS(无DMSO)。

[1520]

[1521] 4.染料加载

[1522] ○通过向管中加入0.5ml1mM Fluo-4与0.5ml20％pluronic，混合，然后将混合液加入至250ml HBSS/丙磺舒中制备染料。

[1523] ○通过将板在包含Clorox的槽中轻弹去除细胞板中的培养基，在kimwipes纸巾上轻打去除多余的培养基，并使用multidrop加入20μl/孔染料。

[1524] ○置于RT培养箱中60分钟。

[1525] 5.运行测定

[1526] ○通过在包含漂白剂的槽中轻弹去除细胞板中的染料；在Kimwipes纸巾上轻打以去除多余的染料。

[1527] ○使用multidrop向细胞板中加入20μl HBSS；置于FLIPR中的读数位置并在FLIPR运行前等待5分钟。(***不等到5分钟将会增加板中的差异性)

[1528] ○将读数1化合物板置于来源#1中

[1529] ○将读数2化合物板置于来源#2中

[1530] ○运行方案：在Tetra上的OCTR HTS筛选

[1531] ○FLIPR读数设置:

[1532] 第一次添加＝在10次基线读数后添加20μl的以1秒为间隔的180次读数

[1533] 第二次添加＝在10次基线读数后添加20μl的以1秒为间隔的120次读数

[1534] 7.数据输出

[1535] 在20个板已经运行后，手工批量输出来自读数1-180的最大值统计数据作为stat1和来自读数200-300的最大值统计数据作为stat2。然后可将这些统计数据拷贝到
excel电子表格中以计算抑制和活化的控制百分数(见图91)。

[1536]

[1537] 以下实施例与SK-通道相关：

[1538] 1.

[1539] 钾通道负责Dm的存活。在瞬时RNAi实验中证明钾通道在Dm中诱导了降低的生存力和致死性效应。与缓冲液对照以及注射已知的非致死性RNAi相比，源自SEQ ID NO：
227的RNAi在Dm中显示出可以测量的降低的生存力。

[1540]

[1541] 2.果蝇属SK基因在CHO细胞中的表达

[1542] 基因名称 小电导钙激活钾通道

[1543] 同义词 CG10706

[1544] 物种 黑腹果蝇

[1545] 最终克隆名称 pCRII-SK2+4D(仅编码区)图70

[1546] 基础载体 pCRII-TOPO(Invitrogen)

[1547] 引物

[1548] 正向：SK5'15’ATGAAAACACCTTCCATTGC3’(SEQ ID NO：233)

[1549] 反向：SK3'25’TCAGCTGCCGTATTTGTTGG3’(SEQ ID NO：224)

[1550] 克隆策略：使用上述引物从混合的fs-cDNA(头和第二龄虫)PCR扩增编码序列，并克隆入pCRII-TOPO载体。选择2个独立的克隆用于测序，2和4D，并且通过将AvrI/
NdeI498bp片段从2亚克隆入4D的AvrI/NdeI5233bp载体片段产生完美的序列。

[1551] 表达构建体

[1552] 通过将来自pCRII-SK2+4D的1.8kb EcoRV/BamHI片段连接至pTriEx3-Neo的EcoRV和BamHI位点构建pTriEx3Neo SK。所得到的构建体包含CMV启动子下游的SK CDS
并在5’末端增加9个密码子，结果与Kozak翻译起始共有序列符合读框。图71转染：将
4
CHO-K1细胞以2.5x10 细胞/孔铺于35mm6-孔板并在次日利用FuGENE6转染试剂(Roche
Diagnostics Corporation)按照制造商的建议用分别来自3种不同的细菌克隆的1ug
pTriEx3Neo SK DNA进行转染。24小时后将细胞传代于75cm2烧瓶并置于抗生素筛选下
(400ug/ml G-418，Calbiochem)。

[1553] 3.测试功能性4

[1554] 基本测试方案：将细胞以5x10/孔铺于96孔多聚-D-赖氨酸测定板(BDBiosciences)并在测试前当天放置于37C/5％CO2。吸出培养基，换成含有0.4x蓝色膜电
位染料(Molecular Devices Corporation)的测定缓冲液并在室温温育1小时。通过读取
基线荧光20秒并在活化后读取额外的60或180秒运行测定。

[1555] 槽测试：一旦筛选完成(大约10天)，将细胞重新传代于测定板和培养瓶进行扩增。利用1uM[终]离子霉素(Ca2+离子载体)作为激活剂测试了三个转染库的功能。库
3(克隆SK3)对假定的Ca2+内向通量反应出预期的超极化。图72

[1556] 4.测定方案

[1557] 测定缓冲液(每天新鲜制备的):

[1558]

[1559] 贮存液可以是无菌过滤的并无定期地保存于室温，除了葡萄糖以外，其保存于4℃。通过首先将母液成分加入0.8体积高质量水至终浓度并调整体积制备测定缓冲液。将溶液无菌过滤并用1N NaOH调整pH至7.4。

[1560] 通过将散剂溶解于DMSO至终浓度7.1mg/ml制备10mM离子霉素(MW＝709)原液。该溶液保存于4℃并可以稳定1年。

[1561] 通过将10mM离子霉素加入测定缓冲液至终浓度5uM(1:2000稀释)制备活化溶液(5x)。该溶液应该是每天新鲜制备。我们曾听说过离子霉素吸附于某些类型聚丙烯，但是我们使用的尖底板(tips)、试管和复合板没有观察到这种现象，除了黑色FLIPR Tetra96-孔尖底板。

[1562] 使用Molecular Devices蓝色膜电位染料以0.4x正常浓度进行测定。重要的是水化并重复漂洗小瓶后立即涡旋振荡染料以保证全部染料已经被回收于溶液中。染料可
以在当天中储存于4°。染料加载如下开展，即从96-孔聚-D-赖氨酸板中轻弹培养基，
在kimwipes纸巾上轻打板以去除多余培养基，以每孔180ul的0.4x染料代替它并于室温
(25℃-28℃)黑暗温育3-5小时。测定板现在准备测定，其包括20ul(10x)第一次添加和
50ul(5x)第二次添加。50uM普罗帕酮[终]用作对照抑制剂。测定是活化后3分钟的读
数以允许相对于对照最大窗口发展。

[1563] 专门试剂:离子霉素，游离酸(Calbiochem#407950)

[1564] 盐酸普罗帕酮(Sigma#P4670)

[1565] 5.克隆：

[1566] 将来自库3的细胞稀释成12个细胞/ml并且将250ul分散于2个96孔培养板的每一孔中。在一周的生长后鉴定包含单一克隆的孔并挑取用于扩大和下一周的测试。

[1567] 克隆筛选：使用与库测试相同的条件筛选15个各自的克隆的功能。最大超极化的时间和程度以及超极化持续性的测量用于选择最佳表现的克隆用于进一步的评价。

[1568] 6.功能验证

[1569] 开展实验以检查去除外部Ca2+的反应。如果通道的确被由离子霉素输入Ca2+活化，则去除细胞外的Ca2+将减少区别反应。图73

[1570] 结论：消除测定缓冲液中的Ca2+减少最大超极化至野生型的20％之内并且消除了区别反应总共120秒的时间点。因此，表达SK的细胞需要Ca2+才能完全反应，表明是
Ca2+依赖性活化。

[1571] 7.活化优化/EC50

[1572] 开展测试以确定产生具有相对于对照的大反应窗口的强大信号所需要的活化缓冲液中的离子霉素的最佳浓度。在三个分开的实验中计算离子霉素对SK3的EC50，得到的数值为200nM(SD＝10)。相对于对照，高于800nM离子霉素没有增加反应窗口大小。这
些结果相应于文献报道的完全活化 Ca2+依赖性通道的数值1uM(Terstappen等，2001.
Neuropharmacology40)。

[1573] 样品数据：图74

[1574] pTX-CHO是模拟物转染的细胞系，即以不包含目的基因的载体转染的细胞系，在筛选中显示的任何活性是因为目的基因，而不是载体。

[1575] 8.与染料加载时间有关的差异性

[1576] 开展测试以检查相对于染料加载时间的测定窗口大小。每一SK3-9和pTx-CHO的24孔于室温加载在下面图表中指出的时间，直至几乎5小时：图75

[1577] 在3小时后稳定在最大值的窗口大小和孔之间的差异性降低了(数据未显示)。基于这些结果，推荐3-5小时的染料加载时间用于筛选。

[1578] 9.DMSO耐受

[1579] 细胞对第一次(10x)添加中DMSO水平的增加可预测性反应，不稳定性增加并且测定窗口变窄。导致DMSO水平高于0.2％的添加显示在离子霉素活化后严重干扰。图76

[1580] 10.离子霉素稳定性

[1581] 开展实验(数据未显示)以检查溶液中离子霉素的稳定性。离子霉素在测定缓冲液中稀释至5uM，加载在复合板中并在第二天与新鲜制备的离子霉素比较SK的活化。新鲜制备的离子霉素导致测定窗口大小6％的统计学显著增加，因此我们推荐新鲜制备的离子霉素。

[1582] 11.统计学检验

[1583] 使用具有80秒滞后时间的零基线，下列半板数据(图77)用于计算来自时间点260秒的两个统计学参数。

[1584] t-检验：双尾P值小于0.0001。因此，偶然发生差异反应的概率基本上为零。

[1585] Z’-因子数据表(单位为–K RFUs，n＝24):

[1586]

[1587] 该统计将测定法归为“极佳测定法”一类。

[1588] (Zhang等，1999.Journal of Biomolecular Screening4.A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput ScreeningAssays)。

[1589] 12.离子通道文库测试

[1590] 在包含涵盖大多数离子通道类型的已知激活剂、激动剂和抑制剂的一组71个化合物(BIOMOL#2805，离子通道配体文库)中，以10uM测试DmSK3克隆。在通过1uM离子霉
素活化前，细胞与化合物温育1分钟。

[1591] 结果总结

[1592] 71个化合物中17个(24％)对细胞对离子霉素的反应有明确的影响。它们当中，9个(13％)表现出是超极化的抑制并且8个(11％)对反应有激活剂/激动剂作用。概括
地说，DmSK3倾向于对Ca2+移动中涉及的化合物反应并且对K+和Na+通道调节物相对不
敏感(有一些例外)。

[1593] 选择的结果(来自SK3测试)

[1594] BAY K-8644 L-型Ca2+通道激动剂图78

[1595] 普罗帕酮 有效的钾通道封闭剂.图79

[1596] TEA(SK3)(四乙基铵)图80

[1597] 4-AP(SK3-4)(4-氨基吡啶)图81

[1598] 普罗帕酮(SK3)图82

[1599] 13.蜂毒明肽敏感性

[1600] 哺乳动物SK通道通过它们对来自蜂毒的肽毒素蜂毒明肽的敏感性表征。我们发现DmSK是蜂毒明肽不敏感性的，甚至在高剂量时也如此(10uM，数据未显示)。

[1601] 14.使用膜片钳技术测试CHO细胞中SK表达

[1602] 材料和方法

[1603] 细胞：

[1604] 以果蝇属SK基因稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用于所有的测量中。在实验前18-22小时将细胞铺于35mm培养皿中。

[1605] 电生理学:

[1606] 使用pClamp软件(版本9.0.1.16)采集和分析数据。膜片钳技术的全细胞结构用于在室温(22-25℃)下电压钳细胞。吸管使用DMZ Universal Puller(Zeitz，Munich，Germany)从硼硅玻璃毛细管(8250，Garner Glass，Claremont，CA)拉出并且当充满吸管溶液并在槽溶液中测量时具有2-3MOhm的电阻。在槽和吸管溶液之间的液体接头电位常常在形成吉欧姆电阻封接之前补偿。

[1607] 膜电流在全细胞钳下测量，通过Axoclamp200B(Axon Instruments)以2kHz取样和以1kHz过滤。电容电流在每一实验开始时电补充。由于IV-曲线的线性性质，不应用漏减修正。

[1608] 为了研究CHO细胞上的SK电流，将细胞保持在–40mV下并将以每2秒10mV的增量应用从–100至+130mV的一组200ms测试电压脉冲。如对电流-电压关系所测量，波幅
定义为给定去极化电势下的最大外向电流。

[1609] 抑制剂直接加入至槽溶液中。

[1610]

[1611] 结果

[1612] 实验：CHO细胞(克隆SK)中DmSK表达的测试。图83

[1613] 结论:

[1614] 以DmSK基因转染的CHO细胞(克隆SK)显示通道的功能性表达。

[1615] 实验：普罗帕酮对表达DmSK的CHO细胞(克隆SK)的影响

[1616] 目的：为了证实使用基于板的FlexStation II和FLIPR实验方法所得到的结果，将细胞在全细胞钳条件下接触70uM普罗帕酮。图85

[1617] 结论:

[1618] DmSK-A2通道被加入的70uM普罗帕酮完全封闭。

[1619] 15.DmSK钾通道在非洲爪蟾卵母细胞中的表达

[1620] 目的：利用卵母细胞双电极电压钳表达系统测定电压门控黑腹果蝇小电导钙激活钾通道(SK)在非洲爪蟾卵母细胞内的功能性表达。

[1621] 从NASCO(Fort Atkinson,WI)订购从非洲爪蟾新鲜获得的卵巢叶。

[1622] 用20ml的无钙OR-2卵母细胞缓冲液中的1.5mg/ml1A型胶原酶于室温下分离卵母细胞。

[1623] 使用Drummond Nanoject注射器向V-VI期卵母细胞注射50nl体外转录的DmSKRNA(1ug/ul)(pCRII-SK2+4D质粒用HindIII线性化并使用Ambion T7mMessage mMachine
转录试剂盒转录)。

[1624] 卵母细胞在补充的ND-96中于18℃温育2小时。

[1625] 使用双电极电压钳(硼硅玻璃1.5mm x1.12mm，充满3M KCl)通过经由ADInstruments PowerLab系统连接至Apple PowerMac G3的Turbo Tec10C放大器(NPI
Instruments)测定通道的表达。

[1626] 具有大于–30mV静息电位的注射的卵母细胞在+5mV下钳夹并充满ND-96槽溶液(96mM NaCl，2mM KCl，1mM MgCl2，0.3mM CaCl2，5mM HEPES，pH7.5和230mOsm)。所测定的电流使用50/60Hz HumBug消声器以2kHz过滤。

[1627] 在钳夹的同时使用nanoject细胞内注射100mM氯化镉(9.2nl)活化SK通道。所测量的电流与卵母细胞内SK活化的所公布的结果相比较(图85)。

[1628] 结果:

[1629] 在卵母细胞表达系统中对DmSK通道功能性表达的最初评价得出，外向电流被至少三次9.2nl的卵母细胞内氯化镉注射活化。与使用大鼠SK的表达检查(ref.4)的结果
(见图92)相比，该昆虫SK通道表现出更多的钙样活化(28nl的100mM CdCl2)。

[1630] 图1：基本的Shal克隆。载体NTI产生的基本Shal克隆图谱，显示了构建体主要的特征。Shal编码区域长度为1473bp。

[1631] 图2：基本的KChIP克隆。载体NTI产生的基本KChIP克隆图谱， 显示了构建体主要的特征。KChIP编码区域长度为621bp。表达载体pcDNA3.1-Zeo-KChIP-intron1(数
据未显示，注释本1049294#5)包含～700bp内含子以辅助克隆，并且将KChIP ORF放置于
CMV启动子的下游。
图 3：Shal 和 KChIP 表 达 构 建 体。pcDNA3/AcGFP-Shal 和 pcDNA3/
AcGFP-ShaldelN2-40aa图谱，且连接载体NTI pcDNA3_ShalDelN和pcDNA3_Zeo_KCHiP_
intron1构建体。
图4：当与AmCyan和AcGFP标记版本(上面)共表达时全长和截短的构建体的膜片钳
数据。
图5：用KCl去极化在FLIPR上测试Shal_DelN克隆。
图6：在FLIPR上测试的K通道阻断剂抑制曲线。
图7：在FLIPR上通过KCl去极化筛选Shal_delN Clone10亚克隆。
图8：克隆10-2、10-3和10-6的膜片钳数据。
图9：在第12代时Shal_DelN C10-3细胞显示出荧光随着时间的稳定性。左图-荧光
激发，右图-正常光。
图10：在FLIPR上BaCl2对Shal通道活性的影响。
图11：第20代时在FLIPR上Shal_delN C10-3的功能。
图12：稳定表达Shal_delN的CHO-K1细胞或模拟转染(红色迹线，较低的线)或用
KChIP共转染(蓝色迹线，较高的线)。
图13：由花生四烯酸抑制的Shal/KChIP。用槽溶液中100uM花生四烯酸[终]溶液充
满Shal/KChIP 20细胞。在全细胞钳下测量之前和之后的化合物电流。左图：曲线下面积的积分(全电流)。右图：峰值电流波幅。
图14：克隆18-13-6和18-13-20的I/V曲线。
图15：Shal/KChIP克隆筛选和Neo/Zeo对照细胞系。
图16：Shal/KChIP最终亚克隆筛选。
图17：Shal/KChIP测定FLIPR反应图谱。来自BioFocus化合物筛选的样品对照组平
均值显示第一和第二次添加测定窗口，以及有效的激活剂和拮抗剂图谱。
图18：活化缓冲液中染料的用途。
图19：BD和Greiner 384-孔测定板的比较。
图20：细胞密度优化。
图21：染料浓度评价。
图22：Shal/KChIP测定窗口大小、标准差和Z’统计学。
图23：染料加载时间对测定统计学的影响。
图24：在染料加载前将细胞预冷至室温的影响。
图25：组平均的原始FLIPR数据和初步的EC50。上图：简化FLIPR数据的ScreenWorks
屏幕截图，显示对KCl剂量的组平均反应。下图：非线性回归/S形剂量反应显示所计算的Hill斜率和EC50。
图26：MDC和Axygen FLIPR 384吸头比较。左图：Molecular Devices FLIPR 384吸
头。右图：Axygen FLIPR 384吸头。
图27：试剂稳定性。Shal/KChIP 18-13细胞以7500个细胞/孔铺于384-孔测定板中
并且第二天测试。
图28：三天最小、中点和最大统计学。
图29：三天KCl剂量反应曲线和EC50。
图30：三天阿米洛利剂量反应。
图31：直接至板测定。
图32：BIOMOL化合物–原始筛选数据。
图33：BIOMOL化合物–简化的筛选数据。
图34：用于BioFocus筛选的化合物制备方案。
图35：Shal/KChIP FLIPR BioFocus 1°筛选–活化。
图36：最终pExSelect_Shaker构建体的VectorNTi图谱。
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图37：在FLIPR 上的模拟物I有限稀释平板选择。
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图38：在FLIPR 上的Shaker+HkvβA或C亚基I有限稀释克隆选择。
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图39：有限稀释克隆作为计数的细胞在FLIPR 上再测试。
图40：不同细胞传代次数的A-3A10信号稳定性。
图41.TEA对A-3A10克隆的影响：10000个细胞/孔-24h；MEM丢弃；依照所描述的步
骤于37℃与40μl的蓝色MP染料温育45’；在30、60或90mM TEA 5x Tyrode溶液存在下
10μl/孔0.5％DMSO注射；3’后，在FLIPR384上(3x Tyrode溶液)以1.5、3.7、7.5、15、
30、60、90、120mM进行25μl/孔的KCl注射。
图42.TEA对A-3A10克隆的影响：10000个细胞/孔-24h；MEM丢弃；依照所描述的步
骤于37℃与40μl的蓝色MP染料温育45’；在30、60或90mM TEA 5x Tyrode溶液存在下
10μl/孔0.5％DMSO注射；3’后，在FLIPR384上(3x Tyrode溶液)以1.5、3.7、7.5、15、
30、60、90、120mM进行25μl/孔的KCl注射。
图43.高渗和等渗溶液分析：10000个细胞/孔-24h；MEM丢弃；依照所描述的步骤于
37℃与40μl的蓝色MP染料温育45’；10μl/孔0.5％DMSO inj.5x tyrode溶液；3’后，在FLIPR384上(3x Tyrode溶液)以1.5、3.7、7.5、15、30、60、90、120mM进行25μl/孔的KCl注射。
图44.在FLIPR384上的A-3A10II有限稀释克隆选择。
图45.在FLIPRTETRA上分析的第1和9号II有限稀释克隆：10000个细胞/孔-24h；
MEM丢弃；依照所描述的步骤于37℃与40μl的蓝色MP染料温育45’；10μl/孔0.5％DMSO注射5x Tyrode溶液；3’后，在FLIPR384上(3x Tyrode溶液)以1.5、3.7、7.5、15、30、60、
90、120mM进行25μl/孔的KCl注射。
图46.细胞密度依赖性，KCl剂量-反应：10000、7500、5000个细胞/孔-24h；MEM丢
弃；依照所描述的步骤于室温与40μl的蓝色MP染料温育45’；10μl/孔Tyrode注射；3’后，在FLIPR384上(3x Tyrode溶液)以1.5、3.7、7.5、15、30、60、90、120mM进行25μl/孔的KCl注射。
图47：DMSO敏感性：10000个细胞/孔-24h；MEM丢弃；依照所描述的步骤于室温与
40μl的蓝色MP染料温育45’；10μl/孔0.5、1、1.5、3％DMSO注射5x Tyrode溶液；3’后，在FLIPRTETRA上(3x Tyrode 溶液)以1.5、3.7、7.5、15、30、60、90、120mM进行25μl/孔的KCl注射。
图48：DMSO敏感性：7500个细胞/孔-24h；MEM丢弃；依照所描述的步骤于室温与
40μl的蓝色MP染料温育45’；10μl/孔0.5、1、1.5、3％DMSO注射5x Tyrode溶液；3’后，在FLIPRTETRA上(3x Tyrode溶液)以1.5、3.7、7.5、15、30、60、90、120mM进行25μl/孔的KCl注射。
图49：DMSO敏感性：5000个细胞/孔-24h；MEM丢弃；依照所描述的步骤于室温与
40μl的蓝色MP染料温育45’；10μl/孔0.5、1、1.5、3％DMSO注射5x Tyrode溶液；3’后，在FLIPRTETRA上(3x Tyrode溶液)以1.5、3.7、7.5、15、30、60、90、120mM进行25μl/孔的KCl注射。
图50：培养中和冻/融后的克隆稳定性：10000、7500、5000个细胞/孔-24h；MEM丢弃；
依照所描述的步骤于室温与40μl的蓝色MP染料温育45’；10μl/孔0.5％DMSO注射5x
Tyrode溶液；3’后，在FLIPRTETRA上(3x Tyrode溶液)以1.5、3.7、7.5、15、30、60、90、
120mM进行25μl/孔的KCl注射。
图51.在3个不同天数中的EC50再现性。如所示(图52a和b)，高达+100mV的去极
化脉冲的应用引起带有典型快速活化和快速失活特征的Dm-Shaker电流。在一些实验中，存在TTX敏感性内向电流，如图52b中所示。
图52：来自第一次有限稀释的两个最佳克隆通过全细胞膜片钳技术测试。
图53：直至+60mV(b)或直至+100mV(a和c)的去极化脉冲引起Dm-Shaker活化。具
体而言，当细胞维持培养长达5至6周时(图53a)和细胞解冻后(图53c)，功能性的通道
表达稳定性仍然非常高。在该实验中，分别有83.3％和100％的细胞表现出Dm-Shaker电
流(n＝6和7)。
图54：绘制了I-V关系。通过测量峰电流并将归一化的数值针对膜电位作图构建I-V
图(n＝8±SD)。
图55A：钙释放通过荧光的钙传感染料(在本例中是Fluo-4)测量。
图55B:pcDNA3.1-OctR for和pcDNA3.1-OctR-GFP的质粒图。
图55.在稳定表达G-α-16和瞬时表达增加量的未标记或GFP标记OctR-pcDNA3.1的
CHO细胞中，对酚乙醇胺或酪胺刺激的钙传感Fluo-4荧光染料反应。
图56：显示细胞分选前刚完成的实验，证明约10％的稳定混合群体对酚乙醇胺响应。
图57.对酚乙醇胺反应的所有GFP阳性单克隆细胞系的筛选。所有细胞系对阳性对照
(10μM UTP)反应，对阴性对照(添加缓冲液)不反应，但仅13号和30号克隆对最大剂量
的酚乙醇胺具有可测量的反应。
图58.在FLIPR Tetra上13号和30号克隆的反应。在每一图中，顶部的两个细胞系
对最大剂量的UTP反应，以下降的次序接着是10uM酚乙醇胺、50nM酚乙醇胺和缓冲液对照。
图59.13号和30号克隆对酚乙醇胺的单细胞反应。通过Fura-2荧光染料在钙成像系
统上评价13号克隆(A)，并且在Discovery显微镜上通过Fluo-4荧光染料评价30号克隆
(B)。
图60.OCTR克隆55选择。
图61.OCTR克隆55的同质性。
图62.细胞以10000个细胞/孔铺于384孔板中并于37℃下培养过夜。在接种8-24
小时后测定细胞。去除培养基并以2μM Fluo-4的染料加载细胞60分钟。1小时后，去除
染料并向板中加入20μl缓冲液并置于FLIPR中。第一次添加是拮抗剂剂量反应曲线并且
第二次添加是激动剂剂量反应曲线。拮抗剂以100nM酚乙醇胺攻击。此外，在亲本细胞系CHO-Gα16中测试这些化合物。
图63：在第一次和第二次添加中不同DMSO浓度的酚乙醇胺EC50曲线。
图64：细胞密度优化。FLIPR数据显示了对于所指定密度的全部板的最大和最小统计
学以及所得到的CV和Z’统计学。低于4000个细胞/孔铺板在第二天没有得到汇合的单
层并且没有测试。OCTR细胞通过手工以适 当的密度铺板并在第二天测定。去除培养基并以20ul/孔的2μM Fluo-4加丙磺舒加载细胞并于25℃温育1小时。1小时后，去除染料并
加入20μl/孔的缓冲液加丙磺舒并置于Tetra中。使用两次添加方案。第一次添加(2x)
是20ul的测定缓冲液中1％DMSO(0.5％[终])读数180秒，并且第二次添加(3x)是20ul
的测定缓冲液中的300nM酚乙醇胺(100nM[终])再读数180秒。使用读数20-180的最大
值(最小响应)和读数200-360的最大值(最大响应)计算统计学。
图65：染料浓度。最大统计学显示染料浓度对窗口大小的影响。OCTR细胞以10000
个细胞/孔铺板并于第二天测定。去除培养基并且细胞以每孔20ul的1μM、2μM或4μM
Fluo-4于25℃加载1小时。1小时后，去除染料并向板中加入20μl的缓冲液并置于Tetra
中。使用两次添加方案。第一次添加(2x)是20ul的测定缓冲液中的1％DMSO(0.5％[终])
读数180秒，并且第二次添加(3x)是20ul的测定缓冲液中的300nM酚乙醇胺(100nM[终])
再读数180秒。使用读数20-180的最大值(最小响应)和读数200-360的最大值(最大
响应)计算统计学。(未显示对于1μM Fluo-4的Z’＝0.73，2μM Fluo-4的Z’＝0.70，
和4μM Fluo-4的Z’＝0.80)
图66：染料加载时间。OctR细胞加载1小时、2小时和3小时以确定酚乙醇胺EC50是
否随着染料加载时间的增加而移动。
图67：吸头洗涤评价。FLIPR数据显示了所有板的最大和最小统计学，具有所得到的
CV和Z’统计学。基于图67A和B所示数据，DMSO洗涤方案没有消除吸头上的酚乙醇胺并
且导致显著携带进入第二块板中(图67B)。
图68：三天酚乙醇胺和米安色林剂量反应曲线。在图68A和B中的数据显示，对于酚
乙醇胺的EC50和对于米安色林的IC50在整个三天中具有极好的再现性。
图69：图69A是第7号板的散点图，显示对于筛选的激动剂部分的对照和测试孔。图
69B是第7号板的散点图。
图70:pCRII-SK2+4D的质粒图。
图71:pTriEx3Neo SK的质粒图。
图72：库3(克隆SK3)对假定的Ca2+内向通量反应出预期的超极化。
图73：功能验证图。开展实验以检查去除外部Ca2+的反应。如果通道的确被由离子
霉素输入Ca2+活化，则去除细胞外的Ca2+将减少区别反应。
图74：样品数据。pTX-CHO是模拟物转染的细胞系，即以不包含目的基因的载体转染的
细胞系，在筛选中显示的任何活性是因为目的基因，而不是载体。
图75：相对于染料加载时间的测定窗口大小。每一SK3-9和pTx-CHO的24孔于室温
加载在下面图表中指出的时间，直至几乎5小时。
图76：细胞对第一次(10x)添加中DMSO水平的增加可预测性反应，不稳定性增加并且
测定窗口变窄。导致DMSO水平高于0.2％的添加显示在离子霉素活化后严重干扰。
图77：离子霉素稳定性测试图。
图78：BAY K-8644——L-型Ca2+通道激动剂对离子霉素的反应图。
图79：普罗帕酮——有效的钾通道封闭剂对离子霉素的反应图。
图80：TEA(SK3)(四乙基铵)对离子霉素的反应图。
图81：4-AP(SK3-4)(4-氨基吡啶)对离子霉素的反应图。
图82：普罗帕酮(SK3)对离子霉素的反应图。
图83：CHO细胞(克隆SK)中DmSK表达的测试图。
图84：膜片钳技术测试CHO细胞中SK表达。
图85：在钳夹的同时使用nanoject细胞内注射100mM氯化镉(9.2nl)活化SK通道。
所测量的电流与卵母细胞内SK活化的所公布的结果相比较的图。
图86：自动化调度方法的步骤。
图87：制备Tripos读数1示意图。
图88：制备Divpick读数1示意图。
图89：读数板1对照。
图90：读数2板。
图91：数据输入软件界面。
图92：使用大鼠SK的表达检查(ref.4)的结果。