技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物工程领域，尤其是一种抗生素对果蝇记忆认知影响用测定方法。
背景技术
[0002] 抗生素发现和使用始于20世纪，是一种能够杀死或者抑制细菌生长的抑菌药物，它可以被用来
治疗或者
预防因细菌引起的感染。抗生素的普遍使用几乎消灭了细菌感染引发的流行
疾病，也正因为抗生素的高效杀菌作用，带来了过度使用抗生素引发的新问题——抗生素滥用。
[0003] 由抗生素滥用而产生的问题主要包括三个方面：第一，抗生素的作用被夸大，导致不良医疗事故频发；第二，超级耐药菌的产生；第三，抗生素滥用会杀死正常的
益生菌。抗生素的发现和使用极大地提高了人类抵御
微生物侵扰的能
力，实现了对细菌感染的治疗，延长了患者的寿命，但同时也产生了抗生素滥用的全球性问题。
[0004] 在人类的医药研究过程中，果蝇作为一种模式生物被广泛应用于学习记忆、发育、节律等科学研究。在学习记忆方面，最早用果蝇来进行学习记忆的研究始于1983年的Tim Tully，他通过设计一种名为″T-Maze″的装置将电击与气味耦联，从而实现人为操作气味和电击分别对果蝇产生的条件刺激和非条件刺激，并使得果蝇在闻得伴随电击刺激的气味后，产生对于条件刺激的记忆。
[0005] 抗生素对被使用者记忆认知功能具有影响，一直以来，在本领域都无法提供直接客观的研究依据。严重制约人们对抗生素与被使用者大脑功能关系，尤其是对抗生素与被使用者记忆认知功能关系的研究。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供抗生素对被使用者记忆认知功能具有影响依据的抗生素对果蝇记忆认知影响用测定方法。
[0007] 为实现上述目的而采用的技术方案是这样的，即一种抗生素对果蝇记忆认知影响用测定方法，包括如下步骤：
[0008] A、选择测试对象，
[0009] 选择活体果蝇若干只；
[0010] B、设定抗生素的
给药时间和给药浓度，
[0011] 以果蝇给药后的存活率为评价原则；
[0012] 具体是将果蝇分组，预留参照组不给药；其余各组区分不同种类抗生素和不同给药浓度，观察在给药后不同时间之后果蝇的存活率，并进行记录；
[0013] 所述存活率为给药之后达到设定条件后果蝇存活数量与给药之前果蝇总数量比值的百分比；
[0014] C、
选定训练方法，对B步骤中各组存活的果蝇对应的采用气味、电击训练，[0015] 学习能力和记忆能力测试按照果蝇巴普洛夫嗅觉学习记忆检测方法进行测试，[0016] 具体是将果蝇装入带有可导电
铜网的训练管中，按照先后顺序通入至少两种明显有区别气味的气体，在通入相邻两种不同气味气体之间要通入设定时间的空气；
[0017] 以训练管通入两种不同气味气体为例，在通第一个气味时，训练管的铜网通电，果蝇被电击；在通入第二个气味时，铜网不通电，在训练之后立即测试果蝇对两种气味的选择计算得出果蝇的学习能力，在训练60分钟之后测试果蝇对两种气味的选择计算得出果蝇的记忆能力；
[0018] 运用灵活性测试时采用反转训练方法，
[0019] 在反转训练中包括两个连续的单次训练模
块，在第一个模块中气味1伴随电击，而气味2不伴随电击，该模块的训练会使果蝇产生对于气味1逃避的记忆；紧接着的第二个模块中气味2伴随电击，而气味1不伴随电击，该模块应使果蝇产生逃避气味2的趋向；
[0020] D、选定影响评价方法，
[0021] 选用蛋白印记法，
[0022] 将C步骤各组给药后设定时间的果蝇放入液氮预冷的离心试管中置入液氮罐中20秒，随后取出离心试管，震荡离心试管后将其倒入金属筛上提取果蝇大脑；按一定组分比例将果蝇大脑放入蛋白裂解液中，
研磨，取上清液保存在低温
冰箱中；采用生物学实验方法，测定参与学习功能的的蛋白PKC含量及其磷
酸化水平，以及测定参与主动遗忘调节的小G蛋白Rac1及其激活态的Rac1-GTP；
[0023] E、确定抗生素对记忆认知影响的量值，
[0024] 采用数理统计方法对测定结果进行分析评价；
[0025] 当抗生素造成PKC
磷酸化水平相比于对照组果蝇中PKC磷酸化水平在T检验中有显著性差异时评价为该抗生素对学习能力的影响是通过抑制了PKC磷酸化水平导致的；当抗生素造成Rac激活态水平与对照组果蝇中Rac激活态水平在T检验中具有显著性差异时，评价为该抗生素通过抑制主动遗忘达到延长60分钟记忆的效用。
[0026] 为提高测定
精度，上述方法中，优选地：所述步骤B中，参考选定果蝇品种的既有实验的SCI学术论文研究成果，假定一个合适的抗生素给药浓度CO，对测试果蝇样本给药后，记录Tm时刻果蝇的死亡数量Nm1，当刚出现Nm1/Nt≥10％时，确定Tm对应的给药时间为实验用理论给药时间；其中Tm为时间，一般不小于8小时；下标m为大于3的整数数字；测试果蝇样本总数为Nt，且不少于100只；
[0027] 对选定果蝇品种分组，每组不少于100只，测试不少于3种抗生素给药浓度C(C∈[C0/3，3＊C0])情况下，给药时间Tm时果蝇的死亡数量Nm2，选取Nm2/Nt≤10％且最大的给药浓度Cm作为实验用理论给药浓度；
[0028] 对选定的抗生素品种，在上述理论给药时间Tm和理论给药浓度Cm联合作用下，选取不少于100只同饲养培育同品种的果蝇进行测试，当存活率不低于95％时，选定给药时间Tm和给药浓度Cm为步骤C后续实验用给药时间和给药浓度。
[0029] 为保证学习能力测试、记忆能力测试和记忆灵活性测试的可行性，上述方法中，优选地：所述C步骤中，所述两种明显具有区别气味的气体1和气体2分别是3-octanol和4-methylcyclohexcanol，所述3-octanol缩写为OCT，所述4-methylcyclohexcanol缩写为MCH；
[0030] 在学习能力测试中，训练后的果蝇在训练5分钟后被迅速导入一个将电击与气味偶联的装置中，T-maze的两端分别同时通入气体1和气体2，果蝇对两种气味进行选择。
[0031] 在记忆能力测试中，训练后的果蝇在训练60分钟后被迅速导入T-maze中，T-maze的两端分别同时通入气体1和气体2，果蝇对两种气味进行选择。
[0032] 在记忆灵活性测试中，训练后的果蝇在两个反转不同的、且连续训练之后的5分钟后被迅速导入T-maze中，T-maze的两端分别同时通入气体1和气体2，果蝇对两种气味进行选择；
[0033] 定义果蝇的行为指数Performance Index是条件刺激“conditioned stimulation″下，选对的果蝇的数量(CS+)减去选错果蝇的数量(CS-)，除以两者总果蝇数量并乘以100；行为指数越高代表果蝇的学习、记忆和灵活性越高，反之则代表越差；
[0034] 果蝇的行为指数通过如下公式计算得出：
[0035]
[0036] 其中：
[0037] X为伴随电击的气味名称，是OCT或MCH；num[CS-]代表停留在不伴随电击气味中的果蝇数量；num[CS+]代表停留在伴随电击气味中的果蝇数量。
[0038] 为降低测定成本，上述方法中，优选地：所述电击与气味偶联的装置为市场销售的T-maze。市场销售的T-maze即是指市场销售的T-形迷宫。
[0039] 为提高统计精度，上述方法中，优选地：所述E步骤中，数理统计方法采用T检验，T检验又称studentt检验或student′s T-test；
[0040] 分析借助SAS、SPSS、Minitab、Statistica、EXCEL、MATLAB等商业
软件；
[0041] PKC指标、Rac指标采用
质量作为其物理量纲。
[0042] 为降低测定成本，上述方法中，优选地：所述B步骤中的离心试管采用EP管。
[0043] 为降低测定成本，上述方法中，优选地：所述果蝇采用易于饲养繁殖的
黑腹果蝇。
[0044] 为扩大测定范围，上述方法中，优选地：所述果蝇采用白鼠、猪等其它动物替代。
[0045] 本发明所述结构具有的优点是：利用果蝇探索常用抗生素对寿命的影响；用果蝇的嗅觉学习记忆范式检测抗生素对于果蝇学习能力、记忆能力和记忆灵活性的多
角度评价，并间接的揭示认知功能改变的分子机制，为抗生素对果蝇记忆认知具有影响提供了依据。
附图说明
[0046] 图1是本发明蛋白印记检测KS1和KS4给药24小时后对于果蝇大脑中参与学习和遗忘的关键蛋白——PKC和Rac的影响参照图。
具体实施方式
[0047] 下面结合
实施例对本发明作进一步说明：
[0048] 一种抗生素对果蝇记忆认知影响用测定方法，包括如下步骤：
[0049] A、选择测试对象，
[0050] 本实施例中选用黑腹果蝇为测试对象，初期测试选用一种等易于饲养繁殖的黑腹果蝇开展实验。黑腹果蝇的数量为若干只。
[0051] B、设定抗生素的给药时间和给药浓度。
[0052] 以果蝇给药后的存活率为评价原则；
[0053] 具体是将果蝇分组，预留参照组不给药。其余各组区分不同种类抗生素和不同给药浓度，观察在给药后不同时间之后果蝇的存活率，并进行记录；
[0054] 所述存活率为给药之后达到设定条件后果蝇存活数量与给药之前果蝇总数量比值的百分比。
[0055] 参考选定果蝇品种的既有实验的SCI学术论文研究成果，假定一个合适的抗生素给药浓度CO，对测试果蝇样本给药后，记录Tm时刻果蝇的死亡数量Nm1，当刚出现Nm1/Nt≥10％时，确定Tm对应的给药时间为实验用理论给药时间；其中Tm为时间，一般不小于8小时；
下标m为大于3的整数数字；测试果蝇样本总数为Nt，且不少于100只。
[0056] 对选定果蝇品种分组，每组不少于100只，测试不少于3种抗生素给药浓度C(C∈[C0/3，3＊C0])情况下，给药时间Tm时果蝇的死亡数量Nm2，选取Nm2/Nt≤10％且最大的给药浓度Cm作为实验用理论给药浓度。
[0057] 对选定的抗生素品种，在上述理论给药时间Tm和理论给药浓度Cm联合作用下，选取不少于100只同饲养培育同品种的果蝇进行测试，当存活率不低于95％时，选定给药时间Tm和给药浓度Cm为步骤C后续实验用给药时间和给药浓度。
[0058] 本实施例中经确定，实验用理论给药时间为24小时。理论给药浓度按如下配置：配制含有4％
蔗糖和0.5％Tween80的溶液作为药物
溶剂，
电子天平分别秤取125mg和250mg的四种抗生素并放置在8个2.0mL的EP管中，并分别加入1mL的溶剂。
[0059] 本实施例中，另取1000只果蝇，均分为10组，每组100只，1、2组作为参照组不给药，其余8组分别用以下四种抗生素：青霉素
钾(KS1)、利福平(KS2)、
盐酸多西环素(KS3)、庆大霉素(KS4)。8组分别放置于8个EP管中，1、2组作为参照组，只需加入4％蔗糖和0.5％Tween80的溶液作为药物溶剂于两个相同的EP管中。将所有EP管利用漩涡器混匀并保存于4度的环境中。十组果蝇在给药时，在10个5mL的塑料管中首先放入1cm×1cm的
滤纸，之后用微量移液器分别向每个塑料管中的滤纸上滴加200μL的药物溶液，待滤纸上充分浸润了溶液之后，将十组(每组约100只)果蝇导入塑料管中并用
棉花糖塞住管口。
[0060] 之后所有给药物及对照组果蝇(溶液中仅含有4％蔗糖和0.5％Tween80)均放回蝇房中，并在给药之后的24小时进行行为学测试。
[0061] C、选定训练方法，对B步骤中各组存活的果蝇对应的采用气味、电击训练。
[0062] 学习能力和记忆能力测试按照果蝇巴普洛夫嗅觉学习记忆检测方法进行测试，[0063] 具体是将果蝇装入带有可导电铜网的训练管中，按照先后顺序通入至少两种明显有区别气味的气体，在通入相邻两种不同气味气体之间要通入设定时间的空气；
[0064] 以训练管通入两种不同气味气体为例，在通第一个气味时，训练管的铜网通电，果蝇被电击；在通入第二个气味时，铜网不通电，在训练之后立即测试果蝇对两种气味的选择计算得出果蝇的学习能力，在训练60分钟之后测试果蝇对两种气味的选择计算得出果蝇的记忆能力。
[0065] 运用灵活性测试时采用反转训练方法，
[0066] 在反转训练中包括两个连续的单次训练模块，在第一个模块中气味1伴随电击，而气味2不伴随电击，该模块的训练会使果蝇产生对于气味1逃避的记忆；紧接着的第二个模块中气味2伴随电击，而气味1不伴随电击，该模块应使果蝇产生逃避气味2的趋向。
[0067] 所用的两种明显有别的气体1和气体2可以为3-octanol(OCT)和4-methylcyclohexcanol(MCH)。
[0068] 在学习能力测试中，训练后的果蝇在训练5分钟后被迅速导入一个将电击与气味偶联的装置(该装置简称T-maze)中，T-maze的两端分别同时通入气体1和气体2，果蝇对两种气味进行选择。
[0069] 在记忆能力测试中，训练后的果蝇在训练60分钟后被迅速导入T-maze中，T-maze的两端分别同时通入气体1和气体2，果蝇对两种气味进行选择。
[0070] 在记忆灵活性测试中，训练后的果蝇在两个反转不同的、且连续训练之后的5分钟后被迅速导入T-maze中，T-maze的两端分别同时通入气体1和气体2，果蝇对两种气味进行选择。
[0071] 定义果蝇的行为指数(Performance Index)是条件刺激“conditioned stimulation″下，选对的果蝇的数量(CS+)减去选错果蝇的数量(CS-)，除以两者总果蝇数量并乘以100；行为指数越高代表果蝇的学习、记忆和灵活性越高，反之则代表越差。果蝇的行为指数通过如下公式计算得出：
[0072]
[0073] 其中：
[0074] X为伴随电击的气味名称，是OCT或MCH；num[CS-]代表停留在不伴随电击气味中的果蝇数量；num[CS+]代表停留在伴随电击气味中的果蝇数量。
[0075] 将给药后的十组果蝇装入带有可导电铜网的训练管中，按照先后顺序通入气体13-octanol(OCT)和气体24-methylcyclohexcanol(MCH)，在通入两种气味之间通入45秒空气。在通第一个气味(CS+)时，训练管的铜网通电(US)，果蝇被电击；当通第二个气味(CS-)时，铜网不通电。在学习能力、1小时记忆能力和记忆灵活性评价测试中，训练后的果蝇分别在训练后5分钟、60分钟以及两个连续训练之后的5分钟后被迅速导入T-maze中，T-maze的两端分别同时通入OCT和MCH，果蝇对两种气味进行选择。根据达尔文的进化理论，适应环境变化的物种是得以生存的物种，所以进化后的生物应当是会根据最近发生的事件记忆，做出最适合自己决策的行为。
[0076] 以果蝇的行为指数为果蝇的学习、记忆和灵活性的判定指标。行为指数越高代表果蝇的学习、记忆和灵活性越高，反之则代表越差。
[0077] 运用灵活性测试可采用反转训练方法：在反转训练中包括两个连续的单次训练模块，在第一个模块中气味1伴随电击，而气味2不伴随电击，该模块的训练会使果蝇产生对于气味1逃避的记忆；紧接着的第二个模块中气味2伴随电击，而气味1不伴随电击，该模块应使果蝇产生逃避气味2的趋向。
[0078] D、选定影响评价方法，
[0079] 选用蛋白印记法，
[0080] 将C步骤中各组给药后设定时间的果蝇放入液氮预冷的离心试管中置入液氮罐中20秒，随后取出离心试管，震荡离心试管后将其倒入金属筛上提取果蝇大脑；按一定组分比例将果蝇大脑放入蛋白裂解液中，研磨，取上清液保存在低温冰箱中；采用生物学实验方法，测定参与学习功能的的蛋白PKC含量及其磷酸化水平，以及测定参与主动遗忘调节的小G蛋白Rac1及其激活态的Rac1-GTP；
[0081] 将各组给药后24小时的果蝇(每组约600只)收集到液氮预冷的EP管中，之后EP管放入液氮罐中20秒，之后取出EP管并轻轻震荡以便将果蝇的头部与身体分离。将震荡后的果蝇倒在特殊的金属筛上，轻微脑震荡得到果蝇的大脑。对得到的果蝇大脑称重(每组约为60mg)，并加入600mL的Ix蛋白裂解液并进行研磨。研磨液经过1200rmp离心12min(4℃)，取上清液并保存在-20℃冰箱中。采用生物学实验方法，测定调节学习的蛋白PKC含量和调节遗忘的蛋白Rac。
[0082] 配制15％的SDS-PAGE胶，取20μL的蛋白提取液并加入相同体积的上样缓冲液，在95℃上变性蛋白5mins。用10μL的微量移液器取9μL变性后的蛋白样品上样，之后按照60V恒压5mins，90V恒压5mins，120V恒压跑胶。跑胶结束后，进行转膜将蛋白转移到
硝酸纤维素膜上(200mA恒流120mins)，最后用3％的
脱脂牛奶封闭，并用1∶8000Anti-Actin mouse；1∶
2000PKC mouse；1∶2000p-PKC rabbit；1∶4000Total Rac mouse进行一抗封闭过夜。第二天用分别用Mouse-HRP和Rabbit-HRP二抗孵育并用ECL发光液反应并收集蛋白条带。
[0083] 本实施例中的分析采用student’s T-test，＊代表p＜0.05，＊＊代表p＜0.01，＊＊＊代表p＜0.001。n.s代表无统计学差异。采用Prism Graph pad软件作图和统计分析，采用Image J对蛋白印记实验得到的条带进行分析。得到蛋白印记检测KS1和KS4给药24小时后对于果蝇大脑中参与学习和遗忘的关键蛋白——PKC和Rac的影响参照图，即附图1，附图1中结果显示，增强60分钟果蝇记忆的KS1并没有显著的降低激活的Rac，说明KS1的作用不是通过抑制了主动遗忘而发挥作用的。同时实验也发现KS4也不影响激活态的Rac。
[0084] E、确定抗生素对记忆认知影响的量值，
[0085] 采用数理统计方法对测定结果进行分析评价；
[0086] 当抗生素造成PKC磷酸化水平相比于对照组果蝇中PKC磷酸化水平在T检验中有显著性差异时评价为该抗生素对学习能力的影响是通过抑制了PKC磷酸化水平导致的；当抗生素造成Rac激活态水平与对照组果蝇中Rac激活态水平在T检验中具有显著性差异时，评价为该抗生素通过抑制主动遗忘达到延长60分钟记忆的效用，即评价为该抗生素对记忆的遗忘能力有影响。
[0087] 采用的数理统计方法可以用T检验(又称student t检验，或student’s T-test)；分析可以借助SAS、SPSS、Minitab、Statistica、EXCEL、MATLAB商业软件。PKC指标、Rac指标可以用质量作为其物理量纲。
[0088] 本实施例中，通过以上的实验研究分析，得出抗生素对果蝇记忆认知影响的结果。经由分析发现，青霉素钾(125mg/mL)在给药24小时后能延长果蝇的60分钟记忆，而庆大霉素(125mg/mL)在给药24小时会造成果蝇学习能力的损伤。此外，利福平(250mg/mL和125mg/mL)对果蝇的寿命有延长作用，而盐酸多西环没有明显作用。通过进一步的分子实验发现，庆大霉素是通过抑制了PKC α/βII的磷酸化导致的学习损伤，而青霉素钾的记忆增强作用是遗忘蛋白Rac和学习关键激酶PKC α/β II非依赖的。本方法测定的结果对于未来探索抗生素对于大脑功能，特别是学习记忆的影响提供了数据支持。
